專(zhuān)利名稱(chēng)：嗜酸性粒細(xì)胞疾病的治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑或治療方法或其它相關(guān)手段，所述嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病是由外周血或組織中增加的嗜酸性粒細(xì)胞引起的，所述治療劑包含通過(guò)CD30和/或參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子而誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的物質(zhì)作為活性成分。
背景技術(shù)：
炎癥是一種病理狀態(tài)，其中多種炎癥細(xì)胞如肥大細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞通過(guò)多種介質(zhì)形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)而引起組織損傷。對(duì)炎癥特別是過(guò)敏性炎癥的傳統(tǒng)療法集中于抑制組織反應(yīng)，即炎癥細(xì)胞的趨化、浸潤(rùn)和活化，所述組織反應(yīng)是由特異性IgE介導(dǎo)的肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒/釋放化學(xué)介質(zhì)而引起的。脫敏治療、脫顆粒抑制劑/化學(xué)介質(zhì)釋放抑制劑和化學(xué)介質(zhì)拮抗劑非常有助于治療過(guò)敏性炎癥。過(guò)敏治療集中于抑制該IgE依賴(lài)性機(jī)制，新的化學(xué)介質(zhì)，特別是類(lèi)花生酸物質(zhì)合成抑制劑/拮抗劑現(xiàn)仍處于廣泛開(kāi)發(fā)之中。
另一方面，近來(lái)的研究顯示嗜酸性粒細(xì)胞顆粒蛋白直接誘導(dǎo)組織損傷或炎癥，表明嗜酸性粒細(xì)胞在炎癥反應(yīng)特別是過(guò)敏性炎癥中起著關(guān)鍵作用。在炎癥的病理學(xué)中，已知嗜酸性粒細(xì)胞表現(xiàn)出“在骨髓中產(chǎn)生增加”，“選擇性浸潤(rùn)進(jìn)入炎癥區(qū)域并活化”和“存活延長(zhǎng)”。結(jié)果存活的活化的嗜酸性粒細(xì)胞增多，通過(guò)持續(xù)釋放細(xì)胞毒性嗜酸性粒細(xì)胞顆粒蛋白而導(dǎo)致嚴(yán)重的組織損傷。臨床發(fā)現(xiàn)還顯示在例如慢性支氣管哮喘患者中外周血嗜酸性粒細(xì)胞增加。還已報(bào)道了外周血嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)目或支氣管肺泡灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)目與支氣管過(guò)敏性相關(guān)，并且隨著病情改善，外周血嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)目恢復(fù)正常。因此，調(diào)節(jié)嗜酸性粒細(xì)胞也是炎癥治療的重要目標(biāo)之一，因?yàn)槎喾N疾病如過(guò)敏性疾病、寄生蟲(chóng)感染和自身免疫病的一個(gè)主要癥狀就是炎癥反應(yīng)。
對(duì)靶向嗜酸性粒細(xì)胞的炎癥治療的研究迄今為止針對(duì) “抑制骨髓中產(chǎn)生增加”，“抑制選擇性浸潤(rùn)進(jìn)入組織”，“抑制趨化作用”，“抑制活化(脫顆粒)”，“滅活顆粒蛋白(MBP，EPO，ECP，EDN)或活性氧”等，阻斷由促嗜酸性粒細(xì)胞生成的細(xì)胞因子IL-5介導(dǎo)的信號(hào)途徑(抗IL-5R抗體，可溶性IL-5R或抗IL-5抗體)臨床應(yīng)用于過(guò)敏性炎癥目前正在研發(fā)之中。但是，迄今為止臨床上尚未確立任何靶向嗜酸性粒細(xì)胞的療法。
在嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡在終止炎癥信號(hào)作用方面非常有效，因?yàn)槭人嵝粤＜?xì)胞的存活通過(guò)抑制凋亡而得以延長(zhǎng)，增加的活化的嗜酸性粒細(xì)胞經(jīng)歷壞死而通過(guò)在發(fā)炎部位分泌顆粒蛋白來(lái)延長(zhǎng)炎癥，通過(guò)去除促進(jìn)存活的細(xì)胞因子(IL-3，IL-5，GM-CSF，IFN-γ等)，容易導(dǎo)致幾乎不表達(dá)負(fù)責(zé)凋亡抑制的Bcl-2的嗜酸性粒細(xì)胞凋亡。換句話(huà)說(shuō)，誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡對(duì)于終止炎癥是很重要的。
已提出了能在嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的因子如TGF-β、抗-Fas抗體和FasL的治療應(yīng)用。已提示在嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡是甾體類(lèi)抗炎效應(yīng)的一部分(J.Clin.Invest.881982-1987，1991)。然而，一些報(bào)道顯示施用抗Fas抗體具有副作用的問(wèn)題，因?yàn)樗鼈冋T導(dǎo)暴發(fā)性肝炎(Cell，88355-365，1997)，或者IL-5或類(lèi)似物減少甾體類(lèi)在嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡(J.Clin.Invest.881982-1987，1991)。因此，迄今為止還不存在任何通過(guò)在嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡而對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病有效的治療劑或治療方法。
另一方面，CD30被鑒定為由單克隆抗體Ki-1識(shí)別的細(xì)胞表面分子，所述單克隆抗體Ki-1是針對(duì)源自霍奇金病的Reed-Sternberg細(xì)胞系L428作為抗原在1982年制備的，并且該分子被報(bào)道為霍奇金病細(xì)胞特異性的抗原(Nature，29965，1982)。隨后，顯示該分子在某些非霍奇金淋巴瘤、退行性大細(xì)胞淋巴瘤、腫瘤細(xì)胞如惡性黑素瘤和間質(zhì)性軟骨肉瘤細(xì)胞、多種細(xì)胞系、促分裂原活化的T和B細(xì)胞、被病毒(HIV，HTLV-I，-II，EBV)轉(zhuǎn)化的T和B細(xì)胞、活化的巨噬細(xì)胞、活化的NK細(xì)胞、子宮蛻膜等中表達(dá)。先前的分析報(bào)道，來(lái)自CD30的信號(hào)顯示出廣泛的效應(yīng)，如T細(xì)胞的生長(zhǎng)和細(xì)胞死亡以及細(xì)胞因子產(chǎn)生增加(Blood，832045，1994)，但其機(jī)制大部分未知。在CD30缺陷小鼠中，觀察到CD4+8+雙陽(yáng)性胸腺細(xì)胞數(shù)目的顯著增加，提示抑制對(duì)胸腺細(xì)胞(自身反應(yīng)性T細(xì)胞)的負(fù)選擇(J.Exp.Med.，187427-432，1998)。另一報(bào)道顯示，某些識(shí)別CD30配體結(jié)合部位的單克隆抗體本身具有對(duì)抗退行性大細(xì)胞淋巴瘤的抗腫瘤效應(yīng)。這提示CD30介導(dǎo)的信號(hào)作用在某些細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡(Clinical Immunology，3467-71，2000)。基于其胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)，CD30分子顯示出是TNF受體(TNFR)超家族的成員，一種CD30配體(CD153)顯示出是TNF超家族的成員。還報(bào)道，CD30的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域沒(méi)有在Fas中發(fā)現(xiàn)的死亡結(jié)構(gòu)域但包括兩個(gè)TNFR-相關(guān)因子(TRAF)-結(jié)合部位以通過(guò)TRAF分子活化NF-kB(Int.Immunol.10203，1998)。
一項(xiàng)近來(lái)的報(bào)道進(jìn)一步顯示，CD30信號(hào)作用不僅依賴(lài)于其配體的結(jié)合，而且還依賴(lài)于其表達(dá)水平，即它們是通過(guò)本身過(guò)表達(dá)而自我活化的，從而不依賴(lài)于配體而活化NF-kB(Clinical Immunology，34812-819，2000)。CD30的表達(dá)水平在細(xì)胞類(lèi)型以及活化和分化階段之間變化相當(dāng)大，表明CD30的多種效應(yīng)似乎在部分程度上是由表達(dá)水平的變化引起的，但在許多情況下它們不能僅僅用表達(dá)水平來(lái)解釋?zhuān)崾舅鼈儗?duì)細(xì)胞的作用可能還通過(guò)胞內(nèi)沖動(dòng)傳導(dǎo)系統(tǒng)的變化來(lái)修飾。可溶性CD30血清水平升高與霍奇金病、艾滋病、乙型肝炎、特應(yīng)性疾病或Omenn綜合征患者或自身免疫病如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的預(yù)后相關(guān)(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，948670-8674，1997，J.Neuroimmunol.，97，182-190，1999，J.Neurol.Sci.，17149-55，1999，Clin.Endocrinol.，49609-613，1998，Br.J.Dermatol.，14073-78，1999)。特別地，霍奇金病患者血清可溶性CD30水平升高以及特應(yīng)性皮炎中血清ECP(嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白)水平或者艾滋病的階段或預(yù)后與血清可溶性CD30水平之間的關(guān)聯(lián)提示CD30涉及這些疾病。
在霍奇金病中，也報(bào)道了嗜酸性粒細(xì)胞的增多(Ann.Oncol.，889-96，1997，Blood，951207-1213，2000)，但原因和機(jī)制未知，并且沒(méi)有報(bào)道顯示CD30在嗜酸性粒細(xì)胞中表達(dá)。因此，迄今為止還沒(méi)有報(bào)道將嗜酸性粒細(xì)胞增加與升高的可溶性CD30水平聯(lián)系起來(lái)。
為了終止炎癥，必需抑制嗜酸性粒細(xì)胞新產(chǎn)生或其浸潤(rùn)進(jìn)入炎癥區(qū)域并活化并且消除活化的嗜酸性粒細(xì)胞。但是如果嗜酸性粒細(xì)胞在壞死過(guò)程中溶解，則組織會(huì)受到由于細(xì)胞膜破壞而引起的顆粒蛋白分泌的進(jìn)一步損傷，炎癥加重。因此，本發(fā)明旨在提供使用誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞迅速和強(qiáng)烈凋亡的物質(zhì)而用于嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑或治療方法或相關(guān)手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明計(jì)劃克服上述現(xiàn)有技術(shù)的問(wèn)題。我們基于以下發(fā)現(xiàn)而完成了本發(fā)明，即經(jīng)由抗人CD30單克隆抗體或類(lèi)似物的CD30介導(dǎo)的信號(hào)作用可誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞迅速和強(qiáng)烈凋亡，從而有效治療嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病包括過(guò)敏性疾病。
在本發(fā)明公開(kāi)之前，不知道CD30分子在人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中表達(dá)以及CD30介導(dǎo)的信號(hào)作用具有生理學(xué)活性誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡。
我們對(duì)以下假設(shè)繼續(xù)進(jìn)行研究CD30調(diào)節(jié)嗜酸性粒細(xì)胞的凋亡，并且如果凋亡誘導(dǎo)受到可溶性CD30的抑制，則由增加的嗜酸性粒細(xì)胞或嗜酸性粒細(xì)胞增多引起的疾病就會(huì)發(fā)生。結(jié)果我們基于以下發(fā)現(xiàn)完成了本發(fā)明，即CD30介導(dǎo)的信號(hào)作用較已知的信號(hào)作用可選擇性地在人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中更為迅速和強(qiáng)烈地誘導(dǎo)凋亡，并且這種凋亡誘導(dǎo)不是簡(jiǎn)單地由對(duì)IL-5介導(dǎo)的存活信號(hào)作用的拮抗所致，而是通過(guò)不依賴(lài)于IL-5信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑發(fā)生。如以下實(shí)施例中詳細(xì)顯示，我們發(fā)現(xiàn)在固定有識(shí)別CD30配體結(jié)合部位的某些抗人CD30單克隆抗體的平板上培養(yǎng)的50％或更多的人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中，在1-4小時(shí)之內(nèi)迅速誘導(dǎo)凋亡。
由此，我們基于以下發(fā)現(xiàn)完成了本發(fā)明，即通過(guò)CD30和/或參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的物質(zhì)可以是嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑。
因此，本發(fā)明涉及(1)嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑，包含通過(guò)CD30和/或參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的物質(zhì)作為活性成分；(2)如以上(1)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑，其中所述通過(guò)CD30和/或參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的物質(zhì)是識(shí)別由Ber-H8或HRS-4識(shí)別的位點(diǎn)的免疫球蛋白或其活性片段、肽或低分子量化合物；(3)如(1)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑，其中所述通過(guò)CD30和/或參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的物質(zhì)是免疫球蛋白或其活性片段(包括那些得自天然來(lái)源或通過(guò)基因重組獲得的)；(4)如以上(2)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑，其中所述通過(guò)CD30和/或參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的物質(zhì)是識(shí)別SEQ ID NO1的氨基酸序列(CD30氨基酸序列的第112和412位之間的氨基酸序列)的至少一部分或全部的免疫球蛋白或其活性片段；(5)如以上(4)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑，其中所述免疫球蛋白是Ber-H8或HRS-4；(6)如以上(1)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑，其中所述通過(guò)CD30和/或參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的物質(zhì)是CD30配體或其活性片段(包括那些得自天然來(lái)源或通過(guò)基因重組獲得的)；(7)如以上(6)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑，其中所述CD30配體是CD153；(8)如以上(1)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑，其中所述通過(guò)CD30和/或參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的物質(zhì)是編碼CD30配體或其活性片段的核酸；(9)如以上(8)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑，其中所述核酸是編碼SEQ ID NO2的氨基酸(CD153的氨基酸序列)的DNA；(10)如以上(1)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑，其中所述通過(guò)CD30和/或參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的物質(zhì)是表達(dá)和/或分泌CD30配體的吞噬細(xì)胞；(11)如以上(1)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑，其中所述通過(guò)CD30和/或參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的物質(zhì)是使吞噬細(xì)胞表達(dá)和/或分泌CD30配體的物質(zhì)；(12)如以上(1)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑，其中所述通過(guò)CD30和/或參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的物質(zhì)是能調(diào)節(jié)CD30表達(dá)和/或聚集的物質(zhì)；(13)如以上(1)-(12)之任一項(xiàng)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑，其中所述嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病是選自下組的疾病過(guò)敏性疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、皮膚疾病、自身免疫病、免疫缺陷疾病、消化系統(tǒng)疾病、腫瘤性疾病、寄生蟲(chóng)感染或特發(fā)性嗜酸性粒細(xì)胞增多綜合征；(14)如以上(13)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑，其中所述過(guò)敏性疾病是選自藥物過(guò)敏、支氣管哮喘和過(guò)敏性鼻炎的疾??；(15)如以上(13)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑，其中所述呼吸系統(tǒng)疾病是嗜酸性粒細(xì)胞肺浸潤(rùn)；(16)如以上(13)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑，其中所述皮膚疾病是選自特應(yīng)性皮炎、蕁麻疹、血管性水腫、牛皮癬、木村病、伴有嗜酸性粒細(xì)胞增多的發(fā)作性血管性水腫、嗜酸性粒細(xì)胞性膿皰性毛囊炎和淋巴瘤樣丘疹病的疾?。?17)如以上(13)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑，其中所述自身免疫病是選自多動(dòng)脈炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡的疾病；(18)如以上(13)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑，其中所述免疫缺陷疾病是選自高IgE綜合征、Wiscott-Aldrich綜合征和Omenn綜合征的疾??；(19)如以上(13)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑，其中所述消化系統(tǒng)疾病是選自過(guò)敏性胃腸炎、嗜酸性粒細(xì)胞性胃腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎和胰腺炎的疾??；(20)如以上(13)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑，其中所述腫瘤性疾病是霍奇金病；(21)如以上(13)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑，其中所述寄生蟲(chóng)感染是選自異尖線(xiàn)蟲(chóng)病、旋毛蟲(chóng)病、類(lèi)圓線(xiàn)蟲(chóng)病、日本血吸蟲(chóng)病和肺吸蟲(chóng)病的疾??；(22)嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療方法，包括施用通過(guò)CD30和/或參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的物質(zhì)；(23)如以上(22)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療方法，其中所述通過(guò)CD30和/或參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的物質(zhì)是識(shí)別由Ber-H8或HRS-4識(shí)別的位點(diǎn)的免疫球蛋白或其活性片段或低分子量化合物；(24)如以上(22)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療方法，其中所述通過(guò)CD30和/或參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的物質(zhì)是免疫球蛋白或其活性片段(包括那些得自天然來(lái)源或通過(guò)基因重組獲得的)；(25)如以上(23)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療方法，其中所述通過(guò)CD30和/或參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的物質(zhì)是識(shí)別SEQ ID NO1的氨基酸序列(CD30氨基酸序列的第112和412位之間的氨基酸序列)的至少一部分或全部的免疫球蛋白或其活性片段；(26)如以上(24)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療方法，其中所述免疫球蛋白是Ber-H8或HRS-4；(27)如以上(22)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療方法，其中所述通過(guò)CD30和/或參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的物質(zhì)是CD30配體或其活性片段(包括那些得自天然來(lái)源或通過(guò)基因重組獲得的)；(28)如以上(27)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療方法，其中所述CD30配體是CD1 53；(29)如以上(22)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療方法，其中所述通過(guò)CD30和/或參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的物質(zhì)是編碼CD30配體或其活性片段的核酸；(30)如以上(29)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療方法，其中所述核酸是編碼SEQ ID NO2的氨基酸(CD153的氨基酸序列)的DNA；(31)如以上(22)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療方法，其中所述通過(guò)CD30和/或參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的物質(zhì)是表達(dá)和/或分泌CD30配體的吞噬細(xì)胞；(32)如以上(22)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療方法，其中所述通過(guò)CD30和/或參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的物質(zhì)是使吞噬細(xì)胞表達(dá)和/或分泌CD30配體的物質(zhì)；(33)如以上(22)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療方法，其中所述通過(guò)CD30和/或參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的物質(zhì)是能調(diào)節(jié)CD30表達(dá)和/或聚集的物質(zhì)；(34)如以上(22)-(33)之任一項(xiàng)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療方法，其中所述嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病是選自下組的疾病過(guò)敏性疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、皮膚疾病、自身免疫病、免疫缺陷疾病、消化系統(tǒng)疾病、腫瘤性疾病、寄生蟲(chóng)感染或特發(fā)性嗜酸性粒細(xì)胞增多綜合征；(35)如以上(34)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療方法，其中所述過(guò)敏性疾病是選自藥物過(guò)敏、支氣管哮喘和過(guò)敏性鼻炎的疾?。?36)如以上(34)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療方法，其中所述呼吸系統(tǒng)疾病是嗜酸性粒細(xì)胞肺浸潤(rùn)；(37)如以上(34)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療方法，其中所述皮膚疾病是選自特應(yīng)性皮炎、蕁麻疹、血管性水腫、牛皮癬、木村病、伴有嗜酸性粒細(xì)胞增多的發(fā)作性血管性水腫、嗜酸性粒細(xì)胞性膿皰性毛囊炎和淋巴瘤樣丘疹病的疾??；(38)如以上(34)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療方法，其中所述自身免疫病是選自多動(dòng)脈炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡的疾病；(39)如以上(34)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療方法，其中所述免疫缺陷疾病是選自高IgE綜合征、Wiscott-Aldrich綜合征和Omenn綜合征的疾??；(40)如以上(34)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療方法，其中所述消化系統(tǒng)疾病是選自過(guò)敏性胃腸炎、嗜酸性粒細(xì)胞性胃腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎和胰腺炎的疾病；(41)如以上(34)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療方法，其中所述腫瘤性疾病是霍奇金病；(42)如以上(34)中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療方法，其中所述寄生蟲(chóng)感染是選自異尖線(xiàn)蟲(chóng)病、旋毛蟲(chóng)病、類(lèi)圓線(xiàn)蟲(chóng)病、日本血吸蟲(chóng)病和肺吸蟲(chóng)病的疾?。?43)嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的診斷方法，包括測(cè)量血清可溶性CD30水平，以基于所述水平的變化診斷該疾??；和(44)CD30介導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物的篩選方法，包括以下步驟(a)基于抑制抗CD30抗體與表達(dá)CD30的細(xì)胞結(jié)合的初級(jí)篩選，(b)基于在外周血-、臍帶血-或骨髓-來(lái)源的培養(yǎng)的嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的二級(jí)篩選，和(c)基于在外周血嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的三級(jí)篩選。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1顯示使用6種小鼠抗人CD30單克隆抗體或?qū)φ招∈驣gG對(duì)人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中CD30表達(dá)的分析的結(jié)果。
圖2顯示使用6種小鼠抗人CD30單克隆抗體或?qū)φ招∈驣gG對(duì)由IL-5活化的人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中CD30表達(dá)的分析的結(jié)果。
圖3是電泳圖，顯示對(duì)人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中CD30 mRNA表達(dá)的分析的結(jié)果。
圖4顯示抗人CD30單克隆抗體在人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中的凋亡誘導(dǎo)測(cè)定的結(jié)果。
圖5顯示對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞供體之間在抗人CD30單克隆抗體在人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡方面?zhèn)€體變異的評(píng)價(jià)的結(jié)果。
圖6顯示抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的隨時(shí)間變化。
圖7是電泳圖，顯示基于DNA斷裂對(duì)抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的評(píng)價(jià)的結(jié)果圖8顯示對(duì)抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的能力的評(píng)價(jià)的結(jié)果，與抗人Fas單克隆抗體相比較。
圖9顯示對(duì)抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在中性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的能力的評(píng)價(jià)的結(jié)果。
圖10顯示對(duì)抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在淋巴細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的能力的評(píng)價(jià)的結(jié)果。
圖11顯示對(duì)抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在培養(yǎng)的人肥大細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的能力的評(píng)價(jià)的結(jié)果。
圖12顯示高濃度IL-5對(duì)抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的影響。
圖13顯示對(duì)抗小鼠CD30單克隆抗體(YMSM636.4.10)在人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的評(píng)價(jià)的結(jié)果。
圖14顯示對(duì)小鼠CD30配體在人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的評(píng)價(jià)的結(jié)果。
圖15顯示對(duì)固定在聚苯乙烯微珠上的抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的評(píng)價(jià)的結(jié)果。
圖16顯示使用來(lái)源于臍帶血的巨噬細(xì)胞對(duì)人外周血嗜酸性粒細(xì)胞的吞噬作用測(cè)定的結(jié)果，在所述外周血嗜酸性粒細(xì)胞中由固定在聚苯乙烯微珠上的抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8誘導(dǎo)凋亡。
圖17顯示使用PMA刺激的人單核的細(xì)胞系U937的細(xì)胞對(duì)人外周血嗜酸性粒細(xì)胞的吞噬作用測(cè)定的結(jié)果，在所述外周血嗜酸性粒細(xì)胞中由固定在聚苯乙烯微珠上的抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8誘導(dǎo)凋亡。
本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方案如本文所用，參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子不僅意指直接或間接作用于在嗜酸性粒細(xì)胞表面上表達(dá)的CD30的分子，而且還意指參與CD30介導(dǎo)的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子以及參與細(xì)胞表面到核水平細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的每一步驟的分子。因此，如本文所用的通過(guò)CD30和/或參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的物質(zhì)意指直接或間接作用于胞外或胞內(nèi)信號(hào)作用的這些多種步驟中的各分子以誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的物質(zhì)。
通過(guò)CD30和/或參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的物質(zhì)不僅是抗CD30抗體，而且還可以是任何能在嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡并滿(mǎn)足臨床應(yīng)用的必要條件的物質(zhì)。實(shí)例為CD30配體、表達(dá)和/或分泌CD30配體的吞噬細(xì)胞、能調(diào)節(jié)CD30表達(dá)和/或聚集的物質(zhì)、使吞噬細(xì)胞表達(dá)和/或分泌CD30配體的物質(zhì)或在嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)CD30介導(dǎo)的凋亡的物質(zhì)，所述物質(zhì)通過(guò)下文所述的篩選方法獲得。
表達(dá)和/或分泌CD30配體的吞噬細(xì)胞、能調(diào)節(jié)CD30表達(dá)和/或聚集的物質(zhì)和使吞噬細(xì)胞表達(dá)和/或分泌CD30配體的物質(zhì)預(yù)期也可通過(guò)CD30和/或參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡。表達(dá)和/或分泌CD30配體的吞噬細(xì)胞、能調(diào)節(jié)CD30表達(dá)和/或聚集的物質(zhì)和使吞噬細(xì)胞表達(dá)和/或分泌CD30配體的物質(zhì)可通過(guò)例如用抗CD30配體抗體對(duì)吞噬細(xì)胞進(jìn)行免疫染色或通過(guò)ELISA測(cè)定吞噬細(xì)胞的培養(yǎng)上清中的CD30配體來(lái)篩選。
優(yōu)選的通過(guò)CD30和/或參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的物質(zhì)是識(shí)別由抗CD30抗體Ber-H8或HRS-4識(shí)別的位點(diǎn)的免疫球蛋白或其活性片段、肽或低分子量化合物。Ber-H8和HRS-4被描述為小鼠抗人CD30單克隆抗體(Hybridoma 19，43-48，2000)并可購(gòu)得(Ber-H8可購(gòu)自PharMingen，San Diego，CA而HRS-4可購(gòu)自Immunotech，Marseilles，F(xiàn)rance)。
特別優(yōu)選的通過(guò)CD30和/或參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的物質(zhì)是識(shí)別至少一部分或全部的SEQ ID NO1的氨基酸序列(CD30氨基酸序列的112與412位之間的氨基酸序列)的免疫球蛋白或其活性片段。特別優(yōu)選的免疫球蛋白是抗CD30單克隆抗體。
可使用任何來(lái)源和類(lèi)型的抗CD30單克隆抗體，只要它們是高度純化的，但特別優(yōu)選的是來(lái)自哺乳動(dòng)物的單克隆抗體。
產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞的動(dòng)物種類(lèi)可以是任何哺乳動(dòng)物，包括人或非人哺乳動(dòng)物。來(lái)自非人哺乳動(dòng)物的單克隆抗體優(yōu)選來(lái)源于兔或嚙齒動(dòng)物，因?yàn)槠浔阌谥苽?。嚙齒動(dòng)物的實(shí)例優(yōu)選包括(但不限于)小鼠、大鼠和倉(cāng)鼠。從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備的人抗體也是優(yōu)選的實(shí)例。
這種抗CD30單克隆抗體的實(shí)例是但不限于Ber-H8或HRS-4。抗CD30單克隆抗體可基本上由如下的已知技術(shù)提供。將合適的宿主用CD30作為免疫抗原根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的免疫接種技術(shù)進(jìn)行免疫，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞融合技術(shù)將所得的經(jīng)免疫細(xì)胞與已知的親本細(xì)胞融合，然后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的篩選方法篩選融合細(xì)胞中產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞。
在本發(fā)明中所用的單克隆抗體不限于那些由雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體，而可以是那些經(jīng)人工修飾以降低相對(duì)于人來(lái)說(shuō)異種的材料的抗原性或其它目的的單克隆抗體。例如，可以使用由來(lái)自非人哺乳動(dòng)物如小鼠的單克隆抗體的可變區(qū)、人抗體的恒定區(qū)和<TXF FR＝0002HE＝250 WI＝080 LX＝1100 LY＝0300>組成的嵌合抗體，這種嵌合抗體可通過(guò)已知的用于制備嵌合抗體的方法制備，特別是基因重組。在本發(fā)明中也可以使用重構(gòu)人源化抗體。這些是通過(guò)用來(lái)自非人哺乳動(dòng)物如小鼠的抗體的互補(bǔ)決定區(qū)替換人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)而獲得的，并且用于制備它們的典型基因重組技術(shù)也是已知的?？捎糜诒景l(fā)明的重構(gòu)人源化抗體可通過(guò)使用這些已知的技術(shù)來(lái)獲得。
在本發(fā)明中，通過(guò)CD30和/或參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的物質(zhì)可以是CD30配體或其活性片段。優(yōu)選的CD30配體包括(但不限于)具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的來(lái)源于人的CD153和具有SEQ ID NO5的氨基酸序列的來(lái)源于小鼠的CD153。通過(guò)CD30和/或參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的物質(zhì)還可以是編碼CD30配體或其活性片段的核酸。優(yōu)選的編碼CD30配體的核酸包括(但不限于)編碼SEQ ID NO2的氨基酸(來(lái)源于人的CD153的氨基酸序列)的DNA和編碼SEQ ID NO5的氨基酸(來(lái)源于小鼠的CD153的氨基酸序列)的DNA。
篩選通過(guò)CD30和/或參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的物質(zhì)的方法的實(shí)例包括(但不限于)基于抑制抗CD30抗體(例如HRS-4，Ber-H8，YMSM636.4.10等)與表達(dá)CD30的細(xì)胞(例如Jurkat，K562，RD等)結(jié)合的初級(jí)篩選，基于在來(lái)源于外周血、臍帶血或骨髓的培養(yǎng)的嗜酸性粒細(xì)胞中凋亡誘導(dǎo)的次級(jí)篩選，和基于在外周血嗜酸性粒細(xì)胞中凋亡誘導(dǎo)的三級(jí)篩選。
凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)的存在可在嗜酸性粒細(xì)胞是否顯示出凋亡特征的基礎(chǔ)上進(jìn)行確定，特別是觀察形態(tài)學(xué)特征，如細(xì)胞體積減小、DNA斷裂和形成凋亡小體(通過(guò)透射電鏡)，或嗜酸性粒細(xì)胞的生存。細(xì)胞體積可通過(guò)電子大小測(cè)定技術(shù)(electronic sizing technique)使用例如Coulter計(jì)數(shù)器來(lái)測(cè)量。核小體之間的DNA斷裂可使用市售的用于檢測(cè)凋亡的梯檢測(cè)試劑盒(來(lái)自例如Wako Pure Chemical Industries，Ltd.，Osaka，Japan)作為DNA梯來(lái)檢測(cè)。細(xì)胞生存可例如使用比色MTT測(cè)定通過(guò)線(xiàn)粒體脫氫酶活性來(lái)評(píng)價(jià)。MTT可被甲臘試劑如WAT-1或WST-8替代。細(xì)胞生存還可基于活細(xì)胞排斥臺(tái)盼藍(lán)染色而確定?？晒┻x擇地，具有結(jié)合的FITC-標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V的凋亡細(xì)胞可通過(guò)流式細(xì)胞儀(例如FACScan Becton Dickinson)測(cè)定，使用市售的試劑盒如MEBCYTO-凋亡試劑盒(Medical BiologicalLaboratories，Nagoya，Japan)。
與涉及顆粒蛋白分泌的細(xì)胞壞死相比，凋亡的嗜酸性粒細(xì)胞在細(xì)胞膜破壞而分泌顆粒蛋白之前被吞噬細(xì)胞如巨噬細(xì)胞吞噬并被除去，而不損傷周?chē)慕M織/細(xì)胞。
一般而言，認(rèn)為由吞噬細(xì)胞的吞噬作用而排除凋亡細(xì)胞經(jīng)由以下4個(gè)階段發(fā)生。
1.吞噬細(xì)胞遷移到凋亡細(xì)胞周?chē)谘装Y區(qū)域，吞噬細(xì)胞已經(jīng)鄰近凋亡細(xì)胞。
2.吞噬細(xì)胞識(shí)別凋亡細(xì)胞吞噬細(xì)胞通過(guò)吞噬作用受體識(shí)別凋亡細(xì)胞表面上的吞噬作用標(biāo)志分子。最為公知的吞噬作用標(biāo)志分子之一是磷脂酰絲氨酸(PS)。作為吞噬作用受體，已鑒定了識(shí)別PS的B類(lèi)清除劑受體I型(SR-BI)和LOX-1(凝集素樣氧化的低密度脂蛋白受體-1)。
3.吞噬細(xì)胞對(duì)凋亡細(xì)胞的吞入(吞噬作用)響應(yīng)來(lái)自吞噬作用受體的信號(hào)，吞噬細(xì)胞的吞噬作用經(jīng)由一種未知的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制而發(fā)生。
4.轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)細(xì)胞器如溶酶體并加工被吞噬的凋亡細(xì)胞。
嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的具體實(shí)例包括過(guò)敏性疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、皮膚疾病、自身免疫病、免疫缺陷疾病、消化系統(tǒng)疾病、特發(fā)性嗜酸性粒細(xì)胞增多綜合征、腫瘤性疾病(例如霍奇金病)和寄生蟲(chóng)感染。
本發(fā)明的包含如上篩選的通過(guò)CD30和/或參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的物質(zhì)作為活性成分的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑與用于常規(guī)制劑的載體、賦形劑和其它添加劑一起制備。
用于配制的載體或賦形劑包括例如乳糖、硬脂酸鎂、淀粉、滑石、明膠、瓊脂、果膠、阿拉伯膠、橄欖油、芝麻油、可可脂、乙二醇和其它常用添加劑。
合適的口服固體組合物包括片劑、藥丸、膠囊、粉劑和顆粒劑。在這種固體組合物中，至少一種活性成分與至少一種惰性稀釋劑如乳糖、甘露醇、葡萄糖、羥丙基纖維素、微晶纖維素、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或硅鋁酸鎂(magnesium aluminometasilicate)混合。所述組合物可常規(guī)含有除惰性稀釋劑之外的其它添加劑，例如潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂；崩解劑如羧甲基纖維素鈣；和增溶劑如谷氨酸或天冬氨酸。片劑或藥丸可用糖包衣如蔗糖、明膠或羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯，或胃溶性或腸溶性材料的膜，或兩層或多層包衣?？杀晃盏牟牧先缑髂z的膠囊也包括在內(nèi)。
口服液體組合物包括藥學(xué)可接受的乳劑、溶液、懸浮劑、糖漿和酏劑，并可含有常規(guī)惰性稀釋劑如純凈水和乙醇。除惰性稀釋劑之外，這些組合物還可含有輔劑如潤(rùn)濕劑或懸浮劑、甜味劑、矯味劑、芳香劑和防腐劑。
腸胃外給藥的注射劑包括無(wú)菌的含水或非水溶液、懸浮劑和乳劑。水溶液和含水懸浮劑含有例如注射用水和注射用生理鹽水。非水溶液和懸浮劑含有例如丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油、醇如乙醇和聚山梨酯80。這些組合物還可含有輔劑如防腐劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑、分散劑、穩(wěn)定劑(例如乳糖)和增溶劑(例如谷氨酸和天冬氨酸)。這些物質(zhì)可以通過(guò)常規(guī)滅菌方法滅菌，如采用微孔過(guò)濾膜的機(jī)械滅菌、熱滅菌如高壓滅菌或包含殺菌劑。注射劑可以是溶液制劑或在用前重構(gòu)的凍干制劑。對(duì)于凍干合適的賦形劑包括例如糖醇或糖如甘露醇或葡萄糖。
當(dāng)本發(fā)明的治療劑用于基因治療時(shí)，可將通過(guò)CD30和/或參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的物質(zhì)的核酸整合入病毒載體，優(yōu)選慢病毒屬載體、腺伴隨病毒載體，更優(yōu)選腺病毒載體，或整合入已知的適于基因治療的載體，如化學(xué)合成的脂質(zhì)體、病毒包膜或病毒包膜與化學(xué)脂質(zhì)體的復(fù)合體，位于在宿主細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子序列如巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(CMV啟動(dòng)子)的下游。
本發(fā)明的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑優(yōu)選經(jīng)由藥學(xué)上常規(guī)的途徑如口服或腸胃外途徑給藥。當(dāng)活性成分是抗體時(shí)，它們通常經(jīng)由腸胃外途徑如注射(皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或腹膜內(nèi)注射)或經(jīng)皮、粘膜、鼻或肺給藥而給予，但也可以口服給藥。
本發(fā)明的制劑中所包含的作為活性成分的通過(guò)CD30和/或參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的物質(zhì)的量可取決于有待治療的疾病類(lèi)型、疾病的嚴(yán)重程度、患者的年齡和其它因素來(lái)確定，但通常可以以0.01-500mg/ml的范圍給予，優(yōu)選0.1-200mg/ml，表示為終濃度。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明的通過(guò)CD30和/或參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的物質(zhì)可用作嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑，在嗜酸性粒細(xì)胞中CD30介導(dǎo)的凋亡誘導(dǎo)基于一種新的機(jī)制可用作對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療。這種疾病的實(shí)例是那些與炎癥反應(yīng)作為主要癥狀有關(guān)的疾病，其中嗜酸性粒細(xì)胞起著關(guān)鍵作用，如過(guò)敏性疾病、寄生蟲(chóng)感染和自身免疫病。
本發(fā)明的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑可在人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡，其比先前已知誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的抗Fas抗體要迅速和強(qiáng)烈得多。凋亡誘導(dǎo)是對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞高度特異性的，在中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞中不誘導(dǎo)凋亡。此外，本發(fā)明的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑在嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡不能被IL-5或類(lèi)似物質(zhì)減弱。因此，本發(fā)明的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑預(yù)期可作為臨床上非常有用的治療劑。
實(shí)施例以下實(shí)施例進(jìn)一步例示說(shuō)明本發(fā)明，但并不將本發(fā)明的范圍限定于此。
實(shí)施例1分析人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中的CD30表達(dá)將肝素化的人外周血用PBS稀釋并鋪層于Percoll(密度1.090g/ml，Pharmacia，Uppsala，Sweden)上，然后離心(1500rpm，30分鐘)。將最底下層中的粒細(xì)胞部分用冷純凈水溶血。然后，使用固定有抗CD16抗體的磁珠(MACS CD16微珠，Miltenyi Biotec，BergischGladbach，Germany)通過(guò)負(fù)選擇獲得嗜酸性粒細(xì)胞部分。嗜酸性粒細(xì)胞的生存率(臺(tái)盼藍(lán)染料排斥，Nakarai)和純度(DIFF-QUICK染色，International Reagents Corporation)均為99％或更高。
將分離的人嗜酸性粒細(xì)胞制備為2×105細(xì)胞/管，并與6種小鼠抗人CD30單克隆抗體或?qū)φ招∈驣gG(10μg/ml)作為初級(jí)抗體于4℃反應(yīng)30分鐘。沖洗后，將細(xì)胞用FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG F(ab’)2作為二抗進(jìn)行染色(于4℃反應(yīng)，30分鐘)，并用1％低聚甲醛固定，然后通過(guò)流式細(xì)胞儀(FACScan Becton Dickinson)進(jìn)行檢測(cè)。用IL-5(1ng/ml，R & D systems，Inc.，Minneapolis，MN)活化(37℃，30分鐘)的嗜酸性粒細(xì)胞也以相同的方式進(jìn)行測(cè)試。所用的小鼠抗人CD30單克隆抗體為HRS-4(Immunotech，Marseilles，F(xiàn)rance)、Ber-H2(DAKO，Glostrup，Denmark)、Ber-H8(PharMingen，San Diego，CA)、AC-10(Ancel，Bayport，MN)、1G12(YLEM Avezzano，Roma，Italy)和Ki-1(YLEM Avezzano，Roma，Italy)，所用的對(duì)照小鼠IgG為MOPC-21(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo)。
對(duì)來(lái)自6名外周血供體的嗜酸性粒細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分析顯示，人外周血嗜酸性粒細(xì)胞被HRS-4和AC10顯著染色，證實(shí)CD30表達(dá)(圖1)。AC10染色的平均熒光強(qiáng)度為8.9±3.2，顯示嗜酸性粒細(xì)胞中的CD30表達(dá)可與IL-5受體α鏈的表達(dá)相比。當(dāng)細(xì)胞用IL-5活化時(shí)，AC10顯示出顯著的表達(dá)，而HRS-4或Ber-H8顯示出相對(duì)增加的表達(dá)(圖2)。
實(shí)施例2分析人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中的CD30mRNA表達(dá)將人外周血嗜酸性粒細(xì)胞溶于Isogen(Nippon Gene，Osaka，Japan)以提取RNA，然后使用來(lái)自Invitrogen Corp(San Diego，CA)的試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用識(shí)別人CD30基因3’-非翻譯區(qū)的上游有義引物(5′-GCC CAG GAT CAA GTC ACT CAT-3′)(SEQID NO3)和下游反義引物(5′-TAC ACG TCT GAA GGC CCTAGG-3′)(SEQ ID NO4)通過(guò)PCR擴(kuò)增501bp片段，所述PCR反應(yīng)在熱循環(huán)儀(Gene Amp PCR System 9700；PE Biosystem)中進(jìn)行(1個(gè)循環(huán)的94℃變性1分鐘；40個(gè)循環(huán)的94℃ 1分鐘/55℃ 1分鐘/72℃2分鐘；以及最后1個(gè)循環(huán)的72℃延伸10分鐘)。反應(yīng)完成后，將反應(yīng)產(chǎn)物在0.8％瓊脂糖凝膠(BRL Life Technologies Inc.)上電泳，所述凝膠中含有0.05％溴化乙錠(Sigma)，顯示目標(biāo)PCR產(chǎn)物為約500bp的條帶。由此顯示CD30 mRNA在人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中表達(dá)(圖3)。
實(shí)施例3評(píng)價(jià)抗人CD30單克隆抗體在人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡將抗人CD30單克隆抗體在PBS中制成多種不同濃度(0.01，0.1，1和10μg/ml)，將1ml的每種制備物加入24孔微量反應(yīng)板(Costar Corp.，Cambridge，MA)，然后于4℃靜置12小時(shí)以固定化。沖洗之后，將板用2ml 1％人血清白蛋白(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)于37℃封閉2小時(shí)。沖洗后，加入在含有10％ FCS，10-5M 2-巰基乙醇(GIBCO)，青霉素/鏈霉素(GIBCO)和1ng/ml人重組IL-5(R&Dsystems，Inc.，Minneapolis，MN)的IMDM(Iscove’s改良Dulbecco’s培養(yǎng)基，GIBCO)中制備為1×106細(xì)胞/ml的分離的人外周血嗜酸性粒細(xì)胞。于37℃溫育4小時(shí)后，收獲細(xì)胞并沖洗，然后使用MEBCYTO凋亡試劑盒(Medical Biological Laborato ries，Nagoya，Japan)檢測(cè)凋亡細(xì)胞。通過(guò)流式細(xì)胞儀(FACScan Becton Dickinson)測(cè)量結(jié)合有FITC-標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V的凋亡細(xì)胞。
結(jié)果顯示，抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8濃度依賴(lài)性地在人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。以1和10μg/ml濃度固定化的HRS-4分別在16.3％和78.8％的嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡；而以0.01，0.1，1和10μg/ml濃度固定化的Ber-H8分別在7.8％，11.4％，44.8％和71.9％的嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡(圖4)。但是，抗人CD30單克隆抗體Ber-H2，AC10，1G12和Ki1以及對(duì)照小鼠IgG在人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中不誘導(dǎo)凋亡。
實(shí)施例4評(píng)價(jià)嗜酸性粒細(xì)胞供體之間在抗人CD30單克隆抗體在人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡方面的個(gè)體變異評(píng)價(jià)了抗人CD30單克隆抗體在從3名供體的外周血分離的嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的能力。以10μg/ml的濃度將抗人CD30單克隆抗體固定化?？谷薈D30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在來(lái)自所有供體的外周血嗜酸性粒細(xì)胞中強(qiáng)烈誘導(dǎo)凋亡(圖5顯示3名供體的平均值)。由此顯示嗜酸性粒細(xì)胞供體之間在HRS-4和Ber-H8在外周血嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的能力方面無(wú)個(gè)體變異發(fā)生。但是，抗人CD30單克隆抗體Ber-H2，AC10，1G12和Ki1以及對(duì)照小鼠IgG在來(lái)自任何供體的嗜酸性粒細(xì)胞中均未誘導(dǎo)凋亡。
實(shí)施例5抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在外周血嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的時(shí)間動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)了抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在分離的人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的時(shí)間動(dòng)力學(xué)。當(dāng)將嗜酸性粒細(xì)胞培養(yǎng)在以10μg/ml濃度固定化HRS-4和Ber-H8的平板上時(shí)，1小時(shí)后兩種抗體均在約50％的嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡，4小時(shí)后凋亡的嗜酸性粒細(xì)胞增加至70％(圖6)。由此發(fā)現(xiàn)HRS-4和Ber-H8在外周血嗜酸性粒細(xì)胞中非常迅速地誘導(dǎo)凋亡。
實(shí)施例6抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡(基于DNA斷裂)基于DNA斷裂評(píng)價(jià)抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在分離的人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。將嗜酸性粒細(xì)胞在以10μg/ml濃度固定化HRS-4和Ber-H8的平板上培養(yǎng)24小時(shí)后，收獲細(xì)胞并用凋亡梯檢測(cè)試劑盒(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.，Osaka，Japan)提取DNA，通過(guò)瓊脂糖電泳評(píng)價(jià)DNA斷裂。
HRS-4和Ber-H8均誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞DNA斷裂(圖7)。但是，抗人CD30單克隆抗體Ber-H2和對(duì)照小鼠IgG均不誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞DNA斷裂。由此通過(guò)DNA斷裂可以證實(shí)，HRS-4和Ber-H8在人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。
實(shí)施例7評(píng)價(jià)抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的能力，與抗人Fas單克隆抗體相比較與抗人Fas單克隆抗體(CH-11，Medical Biological Laboratories，Nagoya，Japan)相比，評(píng)價(jià)了抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在分離的人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的能力。將嗜酸性粒細(xì)胞培養(yǎng)在以10μg/ml濃度固定有所述單克隆抗體的平板上。
培養(yǎng)1小時(shí)后，HRS-4和Ber-H8在約50％的嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡，并且4小時(shí)后凋亡的嗜酸性粒細(xì)胞增加至70％。當(dāng)使用抗人Fas單克隆抗體時(shí)，在培養(yǎng)24小時(shí)之后出現(xiàn)凋亡的嗜酸性粒細(xì)胞，但即使在72小時(shí)后也只是輕微增加(圖8)。由此發(fā)現(xiàn)與抗人Fas單克隆抗體相比，抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中非常迅速和強(qiáng)烈地誘導(dǎo)凋亡。
實(shí)施例8評(píng)價(jià)抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8的凋亡誘導(dǎo)能力的細(xì)胞選擇性將肝素化的人外周血用PBS稀釋并鋪層于Percoll(密度1.090g/ml，Pharmacia，Uppsala，Sweden)上，然后離心(1500rpm，15分鐘)。將最底下層中的粒細(xì)胞部分用冷純凈水溶血。然后，使用固定有抗CD16抗體的磁珠(MACS CD16微珠，Miltenyi Biotec，BergischGladbach，Germany)通過(guò)正選擇獲得中性粒細(xì)胞部分。中性粒細(xì)胞的生存率為99％。通過(guò)流式細(xì)胞儀評(píng)估固定化抗人CD30單克隆抗體在分離的人外周血中性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的能力。
上述6種抗人CD30單克隆抗體在中性粒細(xì)胞中都不誘導(dǎo)凋亡(圖9)。使用來(lái)自6名供體的外周血中性粒細(xì)胞作進(jìn)一步評(píng)價(jià)，但6種抗人CD30單克隆抗體都不誘導(dǎo)凋亡。
然后通過(guò)硅膠(IBL Co.，Ltd.)于37℃1小時(shí)的作用耗盡肝素化的人外周血中的巨噬細(xì)胞，并用PBS稀釋?zhuān)缓箐亴佑贚SM(密度1.077g/ml，ICN)上，隨后離心(1500rmp，15分鐘)，得到淋巴細(xì)胞部分。淋巴細(xì)胞的生存率為99％。以相同的方式通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)量固定化抗人CD30單克隆抗體在分離的人外周血淋巴細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的能力。HRS-4和Ber-H8在淋巴細(xì)胞中均不誘導(dǎo)凋亡(圖10)，盡管兩者在嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。
還通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)量了固定化抗人CD30單克隆抗體在培養(yǎng)的人肥大細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的能力。HRS-4和Ber-H8在培養(yǎng)的人肥大細(xì)胞中均不誘導(dǎo)凋亡(圖11)，盡管兩者在嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。所用的培養(yǎng)的人肥大細(xì)胞是來(lái)自外周血的成熟肥大細(xì)胞(P-肥大細(xì)胞)和來(lái)自臍帶血的成熟肥大細(xì)胞(C-肥大細(xì)胞)，所述細(xì)胞根據(jù)Saito等的方法(J.Immunol.157，343-350，1996和J.Allergy Clin.Immunol.106，321-328，2000)獲得。
此外，HRS-4和Ber-H8在CD30陽(yáng)性的人細(xì)胞系Jurkat(T細(xì)胞淋巴瘤)、K562(紅白血病)和RD(橫紋肌肉瘤)中均不誘導(dǎo)凋亡。
由此發(fā)現(xiàn)抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8選擇性地在人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。
實(shí)施例9高濃度IL-5對(duì)抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的影響先前的證據(jù)顯示抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在10ng/ml人重組IL-5的存在下在人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。但是，如果IL-5以高濃度存在，嗜酸性粒細(xì)胞本身的生存力可增加以減弱HRS-4和Ber-H8的凋亡誘導(dǎo)能力。由此，在0，1，10和100ng/ml的IL-5存在下，評(píng)價(jià)HRS-4和Ber-H8在人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的能力。考慮到嗜酸性粒細(xì)胞供體之間的個(gè)體變異，使用來(lái)自4名供體的外周血嗜酸性粒細(xì)胞。
HRS-4以IL-5濃度依賴(lài)性方式誘導(dǎo)凋亡，在缺乏IL-5條件下不誘導(dǎo)凋亡，但其甚至在100ng/ml下也誘導(dǎo)凋亡。但是，Ber-H8無(wú)論IL-5是否存在均誘導(dǎo)凋亡(圖12)。
這提示在人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中CD30介導(dǎo)的凋亡經(jīng)由IL-5參與和不參與的信號(hào)作用途徑而發(fā)生。但是，顯示HRS-4和Ber-H8的凋亡誘導(dǎo)即使在至少高濃度的IL-5存在下也不減弱。
實(shí)施例10評(píng)價(jià)抗小鼠CD30單克隆抗體在人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡對(duì)抗小鼠CD30單克隆抗體YMSM636.4.10(Serotec Ltd，OxfordUK)和2SH12-5F-2D(BD PharMingen，San Diego，USA)在分離的人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡進(jìn)行了評(píng)價(jià)。當(dāng)將人嗜酸性粒細(xì)胞培養(yǎng)在以10μg/ml的濃度固定化YMSM636.4.10的平板上時(shí)，4小時(shí)后在約30％的嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)了凋亡(圖13)。但是，2SH12-5F-2D和大鼠對(duì)照IgG不誘導(dǎo)凋亡。
實(shí)施例11評(píng)價(jià)小鼠CD30配體在人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡對(duì)重組小鼠CD30配體(R & D Systems Inc.Minneapolis，USA)在分離的人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡進(jìn)行了評(píng)價(jià)。當(dāng)將人嗜酸性粒細(xì)胞培養(yǎng)在以10和100μg/ml的濃度固定化重組小鼠CD30配體的平板上時(shí)，4小時(shí)后在28％和35％的嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)了凋亡(圖14)。
實(shí)施例12評(píng)價(jià)固定在聚苯乙烯微珠上的抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡對(duì)固定在聚苯乙烯微珠上的抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在分離的人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡進(jìn)行了評(píng)價(jià)。根據(jù)Kita等的方法(Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.，18675-686，1998)，將200μg的抗人CD30單克隆抗體加入0.5ml直徑為1.444μM的聚苯乙烯微珠(2.56％固體乳膠，Sigma)，用0.1M硼酸鹽緩沖液洗，并于4℃靜置12小時(shí)以固定化。沖洗后，將珠用0.5ml的2.5％人血清白蛋白于4℃封閉2小時(shí)。沖洗后，將珠懸于0.5ml的PBS中以制備固定在聚苯乙烯微珠上的抗人CD30單克隆抗體。向96孔U底微量反應(yīng)板(NUNC)加入2×105的分離的人外周血嗜酸性粒細(xì)胞以及固定在聚苯乙烯微珠上的HRS-4和Ber-H8(10μl)。于37℃溫育4小時(shí)后，通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)量凋亡細(xì)胞。通過(guò)在前向相對(duì)于側(cè)向散射散點(diǎn)圖上分選來(lái)除外來(lái)自聚苯乙烯微珠的信號(hào)。
固定在聚苯乙烯微珠上的HRS-4和Ber-H8分別在27.9％和44.0％的嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡(圖15)。但是，固定在聚苯乙烯微珠上的抗人CD30單克隆抗體Ber-H2和對(duì)照小鼠IgG在人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中不誘導(dǎo)凋亡。由此發(fā)現(xiàn)抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8當(dāng)固定在聚苯乙烯微珠上時(shí)也以與固定在微量反應(yīng)板上相同的方式在人嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。
實(shí)施例13吞噬細(xì)胞對(duì)人外周血嗜酸性粒細(xì)胞的吞噬作用測(cè)定，固定在聚苯乙烯微珠上的抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在所述人外周血嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡對(duì)分離的嗜酸性粒細(xì)胞進(jìn)行吞噬細(xì)胞的吞噬作用測(cè)定，固定在聚苯乙烯微珠上的HRS-4和Ber-H8在所述分離的嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。根據(jù)Brown等的方法(J.Biol.Chem.，2755987-5996，2000)，將CD34陰性的細(xì)胞首先從人臍帶血單核的部分中分級(jí)分離出來(lái)，并在10ng/ml人重組M-CSF(巨噬細(xì)胞集落刺激因子，R&D)存在下培養(yǎng)7天，以制備成熟的巨噬細(xì)胞。然后，將嗜酸性粒細(xì)胞與固定在聚苯乙烯微珠上的HRS-4和Ber-H8反應(yīng)30分鐘，在凋亡誘導(dǎo)期間，根據(jù)Fadok等人的方法(J.Biol.Chem.，2761071-1077，2001)對(duì)它們測(cè)定由預(yù)先在chamber slides(NUNC)上培養(yǎng)24小時(shí)的來(lái)源于臍帶血的巨噬細(xì)胞的吞噬作用?；?小時(shí)后在嗜酸性粒細(xì)胞單一培養(yǎng)物和嗜酸性粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)物的培養(yǎng)上清中分泌的嗜酸性粒細(xì)胞顆粒蛋白EDN(嗜酸性粒細(xì)胞源神經(jīng)毒素)濃度的差異來(lái)評(píng)價(jià)吞噬效應(yīng)。使用ELISA試劑盒(MBL)測(cè)量EDN濃度。
固定在聚苯乙烯微珠上的HRS-4和Ber-H8在其中誘導(dǎo)凋亡的嗜酸性粒細(xì)胞顯示出在培養(yǎng)上清中分泌的EDN減少，這是與來(lái)源于臍帶血的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)所致的吞噬作用的結(jié)果。特別地，來(lái)源于臍帶血的巨噬細(xì)胞顯示出對(duì)HRS-4在其中誘導(dǎo)凋亡的嗜酸性粒細(xì)胞的顯著吞噬效應(yīng)(圖1 6)。但是，與固定在聚苯乙烯微珠上的抗人CD30單克隆抗體Ber-H2和對(duì)照小鼠IgG反應(yīng)的嗜酸性粒細(xì)胞的單一培養(yǎng)物和共培養(yǎng)物均顯示出非常低的EDN分泌。在使用人單核細(xì)胞系U937(例如可得自ATCC，編號(hào)為ATCC No.CRL-1593.2)的吞噬作用測(cè)定中獲得了相類(lèi)似的結(jié)果，所述細(xì)胞系通過(guò)用10ng/ml PMA(佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯，Sigma)刺激1小時(shí)而活化，用于引發(fā)作為巨噬細(xì)胞的功能觸發(fā)其吞噬能力的目的(圖17)。
這提示HRS-4和Ber-H8在其中誘導(dǎo)凋亡的人外周血嗜酸性粒細(xì)胞在細(xì)胞膜破壞而分泌顆粒蛋白之前被吞噬細(xì)胞如巨噬細(xì)胞吞噬。
序列表<110>SUNTORY LIMITEDSUNTORY BIOMEDICAL RESEARCH LIMITED<120>嗜酸性粒細(xì)胞疾病的治療劑<130>011472<160>5<210>1<211>595<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>1Met Arg Val Leu Leu Ala Ala Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gly Ala Leu5 10 15Arg Ala Phe Pro Gln Asp Arg Pro Phe Glu Asp Thr Cys His Gly Asn20 25 30Pro Ser His Tyr Tyr Asp Lys Ala Val Arg Arg Cys Cys Tyr Arg Cys35 40 45Pro Met Gly Leu Phe Pro Thr Gln Gln Cys Pro Gln Arg Pro Thr Asp50 55 60Cys Arg Lys Gln Cys Glu Pro Asp Tyr Tyr Leu Asp Glu Ala Asp Arg65 70 75 80Cys Thr Ala Cys Val Thr Cys Ser Arg Asp Asp Leu Val Glu Lys Thr85 90 95Pro Cys Ala Trp Asn Ser Ser Arg Val Cys Glu Cys Arg Pro Gly Met100 105 110Phe Cys Ser Thr Ser Ala Val Asn Ser Cys Ala Arg Cys Phe Phe His115 120 125Ser Val Cys Pro Ala Gly Met Ile Val Lys Phe Pro Gly Thr Ala Gln
130 135 140Lys Asn Thr Val Cys Glu Pro Ala Ser Pro Gly Val Ser Pro Ala Cys145 150 155 160Ala Ser Pro Glu Asn Cys Lys Glu Pro Ser Ser Gly Thr Ile Pro Gln165 170 175Ala Lys Pro Thr Pro Val Ser Pro Ala Thr Ser Ser Ala Ser Thr Met180 185 190Pro Val Arg Gly Gly Thr Arg Leu Ala Gln Glu Ala Ala Ser Lys Leu195 200 205Thr Arg Ala Pro Asp Ser Pro Ser Ser Val Gly Arg Pro Ser Ser Asp210 215 220Pro Gly Leu Ser Pro Thr Gln Pro Cys Pro Glu Gly Ser Gly Asp Cys225 230 235 240Arg Lys Gln Cys Glu Pro Asp Tyr Tyr Leu Asp Glu Ala Gly Arg Cys245 250 255Thr Ala Cys Val Ser Cys Ser Arg Asp Asp Leu Val Glu Lys Thr Pro260 265 270Cys Ala Trp Asn Ser Ser Arg Thr Cys Glu Cys Arg Pro Gly Met Ile275 280 285Cys Ala Thr Ser Ala Thr Asn Ser Cys Ala Arg Cys Val Pro Tyr Pro290 295 300Ile Cys Ala Ala Glu Thr Val Thr Lys Pro Gln Asp Met Ala Glu Lys305 310 315 320Asp Thr Thr Phe Glu Ala Pro Pro Leu Gly Thr Gln Pro Asp Cys Asn325 330 335Pro Thr Pro Glu Asn Gly Glu Ala Pro Ala Ser Thr Ser Pro Thr Gln340 345 350Ser Leu Leu Val Asp Ser Gln Ala Ser Lys Thr Leu Pro Ile Pro Thr355 360 365
Ser Ala Pro Val Ala Leu Ser Ser Thr Gly Lys Pro Val Leu Asp Ala370 375 380Gly Pro Val Leu Phe Trp Val Ile Leu Val Leu Val Val Val Val Gly385 390 395 400Ser Ser Ala Phe Leu Leu Cys His Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile405 410 415Arg Gln Lys Leu His Leu Cys Tyr Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys420 425 430Leu Glu Leu Val Asp Ser Arg Pro Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg435 440 445Ser Gly Ala Ser Val Thr Glu Pro Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met450 455 460Ser Gln Pro Leu Met Glu Thr Cys His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu465 470 475 480Glu Ser Leu Pro Leu Gln Asp Ala Ser Pro Ala Gly Gly Pro Ser Ser485 490 495Pro Arg Asp Leu Pro Glu Pro Arg Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn500 505 510Lys Ile Glu Lys Ile Tyr Ile Met Lys Ala Asp Thr Val Ile Val Gly515 520 525Thr Val Lys Ala Glu Leu Pro Glu Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala530 535 540Glu Pro Glu Leu Glu Glu Glu Leu Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr545 550 555 560Pro Glu Gln Glu Thr Glu Pro Pro Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met565 570 575Leu Ser Val Glu Glu Glu Gly Lys Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala Ala580 585 590Ser Gly Lys
595<210>2<211>234<212>PRT<213>智人<400>2Met Asp Pro Gly Leu Gln Gln Ala Leu Asn Gly Met Ala Pro Pro Gly5 10 15Asp Thr Ala Met His Val Pro Ala Gly Ser Val Ala Ser His Leu Gly20 25 30Thr Thr Ser Arg Ser Tyr Phe Tyr Leu Thr Thr Ala Thr Leu Ala Leu35 40 45Cys Leu Val Phe Thr Val Ala Thr Ile Met Val Leu Val Val Gln Arg50 55 60Thr Asp Ser Ile Pro Asn Ser Pro Asp Asn Val Pro Leu Lys Gly Gly65 70 75 80Asn Cys Ser Glu Asp Leu Leu Cys Ile Leu Lys Arg Ala Pro Phe Lys85 90 95Lys Ser Trp Ala Tyr Leu Gln Val Ala Lys His Leu Asn Lys Thr Lys100 105 110Leu Ser Trp Asn Lys Asp Gly Ile Leu His Gly Val Arg Tyr Gln Asp115 120 125Gly Asn Leu Val Ile Gln Phe Pro Gly Leu Tyr Phe Ile Ile Cys Gln130 135 140Leu Gln Phe Leu Val Gln Cys Pro Asn Asn Ser Val Asp Leu Lys Leu145 150 155 160Glu Leu Leu Ile Asn Lys His Ile Lys Lys Gln Ala Leu Val Thr Val165 170 175
Cys Glu Ser Gly Met Gln Thr Lys His Val Tyr Gln Asn Leu Ser Gln180 185 190Phe Leu Leu Asp Tyr Leu Gln Val Asn Thr Thr Ile Ser Val Asn Val195 200 205Asp Thr Phe Gln Tyr Ile Asp Thr Ser Thr Phe Pro Leu Glu Asn Val210 215 220Leu Ser Ile Phe Leu Tyr Ser Asn Ser Asp225 230<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>3gcccaggatc aagtcactca t<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>4tacacgtctg aaggccctag g<210>5<211>239<212>PRT<213>小鼠<400>5Met Glu Pro Gly Leu Gln Gln Ala Gly Ser Cys Gly Ala Pro Ser Pro
5 10 15Asp Pro Ala Met Gln Val Gln Pro Gly Ser Val Ala Ser Pro Trp Arg20 25 30Ser Thr Arg Pro Trp Arg Ser Thr Ser Arg Ser Tyr Phe Tyr Leu Ser35 40 45Thr Thr Ala Leu Val Cys Leu Val Val Ala Val Ala Ile Ile Leu Val50 55 60Leu Val Val Gln Lys Lys Asp Ser Thr Pro Asn Thr Thr Glu Lys Ala65 70 75 80Pro Leu Lys Gly Gly Asn Cys Ser Glu Asp Leu Phe Cys Thr Leu Lys85 90 95Ser Thr Pro Ser Lys Lys Ser Trp Ala Tyr Leu Gln Val Ser Lys His100 105 110Leu Asn Asn Thr Lys Leu Ser Trp Asn Glu Asp Gly Thr Ile His Gly115 120 125Leu Ile Tyr Gln Asp Gly Asn Leu Ile Val Gln Phe Pro Gly Leu Tyr130 135 140Phe Ile Val Cys Gln Leu Gln Phe Leu Val Gln Cys Ser Asn His Ser145 150 155 160Val Asp Leu Thr Leu Gln Leu Leu Ile Asn Ser Lys Ile Lys Lys Gln165 170 175Thr Leu Val Thr Val Cys Glu Ser Gly Val Gln Ser Lys Asn Ile Tyr180 185 190Gln Asn Leu Ser Gln Phe Leu Leu His Tyr Leu Gln Val Asn Ser Thr195 200 205Ile Ser Val Arg Val Asp Asn Phe Gln Tyr Val Asp Thr Asn Thr Phe210 215 220Pro Leu Asp Asn Val Leu Ser Val Phe Leu Tyr Ser Ser Ser Asp225 230 23權(quán)利要求
1.嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑，包含通過(guò)CD30和/或參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的物質(zhì)作為活性成分。
2.如權(quán)利要求1中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑，其中所述通過(guò)CD30和/或參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的物質(zhì)是識(shí)別由Ber-H8或HRS-4識(shí)別的位點(diǎn)的免疫球蛋白或其活性片段、肽或低分子量化合物。
3.如權(quán)利要求1中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑，其中所述通過(guò)CD30和/或參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的物質(zhì)是免疫球蛋白或其活性片段。
4.如權(quán)利要求2中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑，其中所述通過(guò)CD30和/或參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的物質(zhì)是識(shí)別至少一部分或全部的SEQ ID NO1的氨基酸序列(CD30氨基酸序列的112與412位之間的氨基酸序列)的免疫球蛋白或其活性片段。
5.如權(quán)利要求4中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑，其中所述免疫球蛋白是Ber-H8或HRS-4。
6.如權(quán)利要求1中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑，其中所述通過(guò)CD30和/或參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的物質(zhì)是CD30配體或其活性片段。
7.如權(quán)利要求1中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑，其中所述通過(guò)CD30和/或參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的物質(zhì)是編碼CD30配體或其活性片段的核酸。
8.如權(quán)利要求1中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑，其中所述嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病是選自下組的疾病過(guò)敏性疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、皮膚疾病、自身免疫病、免疫缺陷疾病、消化系統(tǒng)疾病、腫瘤性疾病或寄生蟲(chóng)感染。
9.如權(quán)利要求8中定義的嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑，其中所述過(guò)敏性疾病是選自下組的疾病藥物過(guò)敏、支氣管哮喘和過(guò)敏性鼻炎。
全文摘要
在此公開(kāi)的是嗜酸性粒細(xì)胞增多性疾病的治療劑，包含通過(guò)CD30和/或參與CD30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的物質(zhì)作為活性成分。這種治療劑對(duì)過(guò)敏性疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、皮膚疾病、自身免疫病、免疫缺陷疾病、消化系統(tǒng)疾病、腫瘤性疾病和寄生蟲(chóng)感染有效。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1518459SQ0281250
公開(kāi)日2004年8月4日 申請(qǐng)日期2002年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月22日
發(fā)明者三浦健壽, 松林真紀(jì), 齋藤博久, 松本健治, 久, 治, 紀(jì) 申請(qǐng)人:第一三得利制藥株式會(huì)社, 株式會(huì)社第一三得利生物醫(yī)學(xué)研究所