專利名稱：核酸傳遞系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因和類似核酸傳遞至體內(nèi)靶點。更具體地說，本發(fā)明涉及由脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因向血管生成血管(angiogenic blood vessel)的傳遞。
背景技術(shù)：
整聯(lián)蛋白是一類已知結(jié)合胞外基質(zhì)蛋白的細胞受體，因此介導(dǎo)一般稱為細胞粘附事件的細胞-細胞和細胞-胞外基質(zhì)相互作用。盡管文獻中描述了許多整聯(lián)蛋白及結(jié)合整聯(lián)蛋白的配體，但大部分整聯(lián)蛋白的生物學(xué)功能仍令人困惑。整聯(lián)蛋白受體構(gòu)成了一個蛋白家族，其共有結(jié)構(gòu)特征是由α和β亞單位形成非共價異二聚體糖蛋白復(fù)合物，Cheresh & Mecham編輯，整聯(lián)蛋白；與胞外基質(zhì)的分子生物學(xué)反應(yīng)，Academic Press，Inc.，San Diego，CA 92101(1994)，Horton，Int.J.Exp.Pathol.，71741-759(1990)。這些整聯(lián)蛋白在組織內(nèi)的許多細胞相互作用中所起的特異性細胞粘附作用仍在研究之中。
內(nèi)皮-基質(zhì)的相互作用在形成新生血管的血管發(fā)生過程中起作用。稱為αVβ3整聯(lián)蛋白的細胞粘著受體位于參與血管發(fā)生的活性內(nèi)皮細胞表面。
眾所周知，血管發(fā)生還是惡性腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的必要條件。在沒有血管發(fā)生的情況下，局部腫瘤擴張受到抑制。此外，已知特異性血管發(fā)生標志αVβ3整聯(lián)蛋白的表達與腫瘤分級有關(guān)。
現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)攜帶非肽整聯(lián)蛋白拮抗劑作為靶向藥物的陽離子脂質(zhì)體可傳遞核酸(例如基因)至血管生成血管。根據(jù)需要適當選擇的核酸可抑制或促進血管生長，因此提供一種治療血管發(fā)生依賴性疾病的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供包含非肽整聯(lián)蛋白受體拮抗劑和核酸的靶向脂質(zhì)體。這些靶向脂質(zhì)體當全身或局部導(dǎo)入時，有效地將核酸(例如基因、反義寡核苷酸序列、DNA、RNA等)選擇性傳遞至預(yù)定的靶點，例如體內(nèi)的血管生成血管。選定核酸可以此方式傳遞至血管生成血管，以介導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞吸收核酸進行表達或反義傳遞?？梢詫崿F(xiàn)對新生血管生長的破壞。此外，如有需要，通過適當選擇要傳遞的核酸，可誘導(dǎo)新生血管生長。
更具體地說，αVβ3整聯(lián)蛋白受體靶向脂質(zhì)體是一種大小不超過約100nm的納米顆粒，其為單層或多層囊泡，包含陽離子兩性分子(例如陽離子脂質(zhì))、中性脂質(zhì)、具有αVβ3整聯(lián)蛋白靶向結(jié)構(gòu)域和疏水結(jié)構(gòu)域的靶向脂質(zhì)以及核酸(例如基因、反義寡核苷酸序列、DNA序列、RNA序列等)。所述靶向脂質(zhì)體還可選地包含中性脂質(zhì)。在所述靶向脂質(zhì)中，靶向結(jié)構(gòu)域可直接與疏水結(jié)構(gòu)域相連?；蛘撸霭邢蚪Y(jié)構(gòu)域可共價結(jié)合至親水連接結(jié)構(gòu)域(表面連接體)，其再共價結(jié)合至疏水結(jié)構(gòu)域。所述核酸可與脂質(zhì)體中存在的陽離子兩性分子復(fù)合。所述靶向結(jié)構(gòu)域包含非肽αVβ3整聯(lián)蛋白拮抗劑。
在所述靶向脂質(zhì)體中，基于脂質(zhì)體中脂質(zhì)的總摩爾數(shù)，陽離子兩性分子(例如陽離子脂質(zhì))的存在量為約1至約50mol％，靶向脂質(zhì)的靶向結(jié)構(gòu)域的存在量為約1至約20mol％。構(gòu)成靶向脂質(zhì)體的脂質(zhì)在其各自的疏水部分可具有寡聚化和/或多聚化功能基團，存在于脂質(zhì)體中的所述脂質(zhì)的至少一部分可通過所述基團互相交聯(lián)。如有需要，陽離子脂質(zhì)還可具有可交聯(lián)基?；蛘撸栯x子脂質(zhì)可沒有可交聯(lián)基。
本發(fā)明的靶向脂質(zhì)體可用于傳遞核酸來治療癌癥、炎癥、眼病等。所述靶向脂質(zhì)體還可用于傳遞基因來鑒別血管中的治療標靶。
本發(fā)明的靶向脂質(zhì)體為多點結(jié)合(multibinding)納米顆粒，不大于約250nm，優(yōu)選約40至約100nm，包含陽離子脂質(zhì)或細胞轉(zhuǎn)染劑連同與之復(fù)合的核酸。優(yōu)選的靶向脂質(zhì)可表示為L-X-K，其中L為靶向結(jié)構(gòu)域，例如整聯(lián)蛋白受體拮抗劑(如αVβ3受體拮抗劑)等，X為用作疏水結(jié)構(gòu)域K表面連接體的親水結(jié)構(gòu)域?；蛘撸霭邢蛑|(zhì)可表示為L-K，其中靶向結(jié)構(gòu)域L直接結(jié)合至疏水結(jié)構(gòu)域K。
適于本發(fā)明目的的非肽整聯(lián)蛋白受體拮抗劑L在生理pH值為具有陽離子基團和陰離子基團的兩性離子，可作用于或結(jié)合整聯(lián)蛋白受體。陽離子基團和陰離子基團通過間隔基(例如二價芳基)互相分開。受體拮抗劑分子上陽離子基團和陰離子基團之間的間距為約10至約100埃，可由烷氧基苯甲酸、雙環(huán)或三環(huán)化合物、螺環(huán)化合物等產(chǎn)生，條件是由其分開的陽離子基團和陰離子基團可在生理pH值下與整聯(lián)蛋白受體相互作用。合適的整聯(lián)蛋白受體拮抗劑可圖示如下
說明性的非肽αVβ3受體拮抗劑以下式表示 其中游離氨基(NH2)可用于使所述拮抗劑直接或通過表面連接基共價結(jié)合至脂質(zhì)體的疏水結(jié)構(gòu)域。
美國專利笫5,561,148號、第5,776,973號和第6,204,280號以及專利公開WO00/63178、WO01/10841、WO01/14337、WO01/14338、WO97/45137、WO98/35949和WO00/26212描述了其它在結(jié)合至靶向脂質(zhì)親水結(jié)構(gòu)域時適用于本發(fā)明目的的非肽αVβ3受體拮抗劑。
非肽整聯(lián)蛋白受體拮抗劑L和可選表面連接基X組合構(gòu)成了適于結(jié)合核酸載體(例如陽離子脂質(zhì)體等)的αVβ3受體靶向分子或基團。然后所產(chǎn)生的靶向脂質(zhì)體通過與其復(fù)合結(jié)合至預(yù)先確定的核酸(例如基因)。
附圖簡述在附圖中，

圖1圖示說明了本發(fā)明的靶向脂質(zhì)體；圖2圖解了本發(fā)明的交聯(lián)靶向脂質(zhì)體；圖3圖解了本發(fā)明的另一種交聯(lián)靶向脂質(zhì)體；圖4圖示說明了靶向脂質(zhì)體的全身循環(huán)；圖5圖示說明了靶向脂質(zhì)體在生血管部位的匯集；圖6和7圖示說明了DNA(例如基因)向目標細胞的傳遞；圖8圖示說明適于測試αVβ3拮抗劑的粘附測定；圖9以曲線圖顯示使用圖8所示的粘附測定獲得的數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)表明本發(fā)明的靶向脂質(zhì)體結(jié)合αVβ3受體；圖10以圖解顯示的數(shù)據(jù)表明，使用本發(fā)明的靶向脂質(zhì)體有效地將綠色熒光蛋白(GFP)基因靶向傳遞至體內(nèi)的αVβ3表達細胞；攜帶所述基因的靶向脂質(zhì)體顯示以αVβ3依賴方式轉(zhuǎn)染細胞；使用的細胞為人黑素瘤細胞M21和M21L；M21細胞表達αVβ3整聯(lián)蛋白，而M21L細胞不表達αVβ3整聯(lián)蛋白(αV-無效)；圖11以圖解顯示的數(shù)據(jù)表明，使用本發(fā)明的靶向脂質(zhì)體將螢火蟲熒光素酶基因體內(nèi)選擇性靶向表達αVβ3的腫瘤血管細胞；靶向基因載體顯示以αVβ3依賴方式轉(zhuǎn)染腫瘤細胞；使用的細胞為移植入小鼠的人黑素瘤細胞M21和M21L；M21細胞表達αVβ3整聯(lián)蛋白，而M21L細胞不表達αVβ3整聯(lián)蛋白；圖12以曲線圖顯示的數(shù)據(jù)證實移植腫瘤生長的體內(nèi)抑制和消退是由于給予了與表達血管發(fā)生抑制性突變型Raf蛋白的基因結(jié)合的靶向脂質(zhì)體；圖13以曲線圖顯示的數(shù)據(jù)證實移植腫瘤生長的體內(nèi)抑制和消退是由于給予了與表達血管發(fā)生抑制性突變型Raf蛋白的基因結(jié)合的靶向脂質(zhì)體；圖14展示的顯微照片證實使用本發(fā)明的靶向脂質(zhì)體將GFP編碼基因體內(nèi)傳遞至小雞CAM的血管生成血管；圖15展示的顯微照片證實通過玻璃體內(nèi)注射結(jié)合GFP編碼基因的本發(fā)明靶向脂質(zhì)體，將該基因體內(nèi)傳遞至小鼠眼睛的血管；圖16展示的顯微照片證實通過靶向脂質(zhì)體介導(dǎo)的突變型Raf編碼基因向小鼠視網(wǎng)膜血管生成血管的傳遞，使體內(nèi)新生血管凋亡；圖17圖解了靶向脂質(zhì)體合成流程1，詳述了關(guān)鍵中間體三價脂質(zhì)-整聯(lián)蛋白拮抗劑綴合物12的合成；以及圖18圖解了靶向脂質(zhì)體合成流程2，該流程概述了通過合適脂質(zhì)的自裝配和多聚化由三價脂質(zhì)-整聯(lián)蛋白拮抗劑綴合物12形成納米顆粒靶向脂質(zhì)體(NP)。
優(yōu)選實施方案的描述圖1-3和18圖示說明了本發(fā)明的靶向脂質(zhì)體，其由結(jié)合脂質(zhì)的整聯(lián)蛋白受體拮抗劑(如αVβ3受體拮抗劑)和核酸載體(例如陽離子兩性分子，如陽離子脂質(zhì))構(gòu)成。所述脂質(zhì)體還可包含中性或兩性填充脂質(zhì)(filler lipid)。
靶向脂質(zhì)具有靶向結(jié)構(gòu)域，包括共價結(jié)合至疏水結(jié)構(gòu)域的αVβ3整聯(lián)蛋白受體拮抗劑。靶向結(jié)構(gòu)域可直接結(jié)合至疏水結(jié)構(gòu)域，或者靶向結(jié)構(gòu)域可結(jié)合至親水結(jié)構(gòu)域，如連接基(表面連接體)，親水結(jié)構(gòu)域再結(jié)合至疏水結(jié)構(gòu)域。
適用于本發(fā)明目的的整聯(lián)蛋白受體拮抗劑在生理pH值為兩性離子，并具有可作用于或結(jié)合整聯(lián)蛋白受體的陽離子基團和陰離子基團。所述陽離子和陰離子基團通過間隔基(例如二價芳基)互相分開。受體拮抗劑分子上陽離子基團和陰離子基團之間的間距為約10至約100埃，可由對-烷氧基苯甲酸、雙環(huán)或三環(huán)化合物、螺環(huán)化合物等產(chǎn)生，條件是由其分開的陽離子基團和陰離子基團可在生理pH值下與整聯(lián)蛋白受體相互作用。
本文和所附權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“芳基”是指含至少一個6-碳芳香環(huán)的烴基，其還可包含直鏈、支鏈或環(huán)狀烴取代基。術(shù)語“雜芳基”是指含至少一個含碳-雜原子的芳香環(huán)的基團，其還可包含直鏈、支鏈或環(huán)狀烴取代基，其中所述雜原子可為選自元素周期表中IUPAC命名為15(氮類)和16(氧類)的任一元素，包括L.A.Paquette，現(xiàn)代雜環(huán)化學(xué)原理，Benjamin/Cummings Publishing Company，Inc.(1968)所公開化合物的芳族雜環(huán)基，該文獻的相關(guān)公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。當在本文中提及芳基和雜芳基時，其可為未取代的，或者可為取代的。
本文和所附權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“雜環(huán)基”是指含至少一個含碳-雜原子的非芳香環(huán)的基團，其還可包含直鏈、支鏈或環(huán)狀烴取代基，其中所述雜原子可為選自元素周期表中IUPAC命名為15(氮類)和16(氧類)的任一元素，包括Paquette(同上)所公開化合物的非芳族雜環(huán)基，該文獻的相關(guān)公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。雜環(huán)基可為未取代的，或者可由烷基或反應(yīng)性功能基(例如鹵素、氨基、羥基、羧酸基、磺酸基等)取代。
本文和所附權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“烷基”是指烴基部分，其可為直鏈、支鏈，或者可含有碳環(huán)結(jié)構(gòu)。
本文和所附權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“烯基”是指具有至少一個碳-碳雙鍵的烷基。
本文和所附權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“炔基”是指具有至少一個碳-碳三鍵的烷基。
本文和所附權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“取代的”是指用烷基、苯基或功能基取代上述基團之一的一個或多個氫原子，所述功能基例如為羥基、烷氧基、氨基、亞硝基、硝基、偶氨基、疊氮基、酰胺基、羧基、氧代、硫醇、次硫酸基、磺?；?、氧膦基、膦?；?、氟、氯、溴、碘以及R.Panieo等編輯，有機化合物IUPAC命名法指引，Blackwell Science Ltd.(1993)描述的類似基團，所述文獻的相關(guān)公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。
本文和所附權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“脂質(zhì)體”是指其壁為脂質(zhì)分子的球狀物，脂質(zhì)分子互相之間可共聚合或可以不共聚合。
本文和所附權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“脂質(zhì)”是指油、脂肪、脂肪樣物質(zhì)中任一成員，其特征為可溶于相對非極性溶劑，但僅微溶于水性溶劑。脂質(zhì)由存在于活體組織的四類主要化合物構(gòu)成，包括脂肪酸、中性脂肪(例如三酰甘油、脂肪酸酯和皂類、長鏈(脂肪)醇和蠟、鞘氨基醇和其它長鏈堿基、糖脂、磷脂、鞘脂、胡蘿卜素、多萜醇、甾醇等)以及萜烯和類似的類異戊二烯。
本文和所附權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“細胞轉(zhuǎn)染劑”是指適于基因傳遞和表達的陽離子脂質(zhì)，由陽離子頭基團組成，其通過連接體連接至疏水結(jié)構(gòu)域或部分。
本文和所附權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“中性”當修飾脂質(zhì)時包括不帶電脂質(zhì)(例如膽固醇等)以及兩性脂質(zhì)(例如二油酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰膽堿等)。
本文和所附權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“膽甾醇基”是指衍生自或結(jié)構(gòu)上類似膽甾醇的甾族烴基部分。
本文和所附權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“整聯(lián)蛋白受體拮抗劑”是指選擇性結(jié)合并拮抗整聯(lián)蛋白受體(例如αVβ3受體、αVβ5受體、αVβ6受體等)的非肽化合物。
說明性的所述αVβ3拮抗化合物以下式表示 其中游離氨基(NH2)可用于使所述拮抗劑通過表面連接基(例如羧基和/或其它合適的活性基團)共價結(jié)合至脂質(zhì)體的疏水結(jié)構(gòu)域。
美國專利第5,561,148號、第5,776,973號和笫6,204,280號以及專利公開WO00/63178、WO01/10841、W001/14337、WO01/14338、WO97/45137、WO98/35949和WO00/26212描述了其它在直接或間接結(jié)合靶向脂質(zhì)的疏水結(jié)構(gòu)域時適用于本發(fā)明目的的說明性非肽αVβ3受體拮抗劑，所述文獻的相關(guān)公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。所述αVβ3受體拮抗劑例舉如下如WO01/14338所述的
等；如WO01/14337所述的 等；如WO00/63178所述的 等；如WO01/10841所述的
等；前提是所述化合物包括或經(jīng)修飾后包括可與表面連接體或疏水結(jié)構(gòu)域反應(yīng)形成靶向脂質(zhì)的功能基或橋聯(lián)基。所述修飾在化學(xué)領(lǐng)域眾所周知。例如，以上例舉化合物的一個芳族部分可用氨基、羥基或硫醇基化學(xué)取代，提供一種連接表面連接體的方法。或者，例如可用羧酸取代芳基，而表面連接體可為氨基取代基。
使用在非肽整聯(lián)蛋白受體拮抗劑與表面連接體或疏水結(jié)構(gòu)域之間產(chǎn)生共價鍵的常規(guī)化學(xué)技術(shù)，使所述拮抗劑共價連接親水表面連接體或直接連接疏水結(jié)構(gòu)域。產(chǎn)生所述鍵的反應(yīng)化學(xué)在本領(lǐng)域眾所周知，包括使用表面連接體或疏水結(jié)構(gòu)域與整聯(lián)蛋白拮抗劑配體上的互補功能基團。優(yōu)選相對于配體上存在的可鍵合功能基團或者可導(dǎo)入配體用于鍵合的功能基團選擇表面連接體或疏水結(jié)構(gòu)域上的互補功能基團。再者，所述互補功能基團在本領(lǐng)域眾所周知。例如，羧酸與伯胺或仲胺在合適的周知活化劑存在下反應(yīng)形成可共價連接配體與表面連接體或疏水結(jié)構(gòu)域的酰胺鍵；胺基與磺酰鹵基團反應(yīng)形成可共價連接配體與表面連接體或疏水結(jié)構(gòu)域的磺酰胺鍵；而醇或酚基與烷基鹵或芳基鹵反應(yīng)形成可共價結(jié)合整聯(lián)蛋白拮抗劑配體與表面連接體或疏水結(jié)構(gòu)域的醚鍵。
或者，整聯(lián)蛋白受體拮抗劑可包含疏水結(jié)構(gòu)域，例如C18-C30烷基、C18-C30烯基、C18-C30炔基、膽甾醇基等。
有或沒有間隔性表面連接體的疏水結(jié)構(gòu)域與整聯(lián)蛋白受體拮抗劑的連接位置保留了受體結(jié)合位點的相互作用，具體地說，其使得拮抗劑自身適于結(jié)合整聯(lián)蛋白受體結(jié)合位點。所述鍵的位置和合成方案在本領(lǐng)域眾所周知。
包含疏水結(jié)構(gòu)域或可共價結(jié)合疏水結(jié)構(gòu)域的優(yōu)選αVβ3整聯(lián)蛋白受體拮抗劑用下式(I)和(II)表示
其中在式(I)中，R1和R2均為氫，或一起形成橋聯(lián)1，2-亞苯基(C6H4)基團或橋聯(lián)乙烯基(-CH＝CH-)；X是-C(O)-或共價鍵；n是1，2或3；Z1是-C(O)-R3、-C(O)OR3或SO2R3；而R3是苯基、取代的苯基、吡啶基、芐基、取代的芐基、C1-C4鹵代烷基、C2-C30烷基、C2-C30烯基、C2-C30炔基或膽甾醇基；以及其中式(II)中，R4和R5均為氫，或一起形成共價鍵；Y是-C(O)-或-CH2-；Z2是-C(O)-R6、-C(O)OR6或SO2R6；R6是苯基、取代的苯基、吡啶基、芐基、取代的芐基、C1-C4鹵代烷基、C2-C30烷基、C2-C30烯基、C2-C30炔基或膽甾醇基；而Het是2-吡啶基或2-咪唑基。
式(I)的整聯(lián)蛋白受體拮抗劑的非限制性實例包括以下的化合物Ia、Ib、Ic、Id、Ie和If。這些具體化合物的制備描述于PCT公開WO98/35949。
式(II)的整聯(lián)蛋白受體拮抗劑的非限制性實例包括以下的化合物IIa、IIb、IIc、IId、IIe和IIf。這些具體化合物的制備描述于PCT公開WO00/26212。


優(yōu)選的αVβ3整聯(lián)蛋白受體拮抗劑在不與靶向脂質(zhì)的疏水結(jié)構(gòu)域共價連接時，其分子量(MW)約200至約800道爾頓，更優(yōu)選為450至約610道爾頓。
共價連接或包含疏水結(jié)構(gòu)域的αVβ3整聯(lián)蛋白受體拮抗劑與陽離子脂質(zhì)組合產(chǎn)生的陽離子脂質(zhì)體生物可相容且基本無免疫原性。靶向脂質(zhì)體的生物活性可能易受親水表面連接體(如果存在并又在靶向脂質(zhì)體整體構(gòu)型上的話)的化合價、幾何形狀、組成、大小、柔性或剛性等以及表面連接體的相對親水性等的影響。因此，如果存在親水表面連接體，則最好選擇親水表面連接體使靶向脂質(zhì)體生物活性最大化?？蛇x擇表面連接體以增強靶向分子生物活性。一般來說，可由任何使拮抗劑定位于其結(jié)合位點的有機分子結(jié)構(gòu)中選擇表面連接體。在這一點上，可將表面連接體看作一個“框架”，在其上排列著一個或多個整聯(lián)蛋白拮抗劑，以便產(chǎn)生需要的定位結(jié)果。定位可包括例如以距離脂質(zhì)體表面合適的距離提供拮抗劑，以使拮抗劑和整聯(lián)蛋白受體的活性位點有效地相互作用。
例如，可通過包括在框架基團中含有單環(huán)或多環(huán)基團(包括芳基和/或雜芳基基團)或含有加入一個或多個碳-碳多鍵(烯基、亞烯基、炔基或亞炔基)的結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)不同取向。其它基團還可以包括為支鏈或直鏈形式的寡聚物和多聚物。在優(yōu)選實施方案中，剛性由存在的環(huán)狀基團(例如芳基、雜芳基、環(huán)烷基、雜環(huán)基等)賦予。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述環(huán)為6元環(huán)或10元環(huán)。在另一實施方案中，所述環(huán)為芳族環(huán)，例如苯基或萘基。
Xiong等，Science 296151-155(2002)描述了在結(jié)合了整聯(lián)蛋白拮抗劑時αVβ3整聯(lián)蛋白胞外部分的晶體結(jié)構(gòu)。用于實施本發(fā)明的αVβ3整聯(lián)蛋白受體拮抗劑所具有的結(jié)構(gòu)以類似于Xiong等描述的作用方式和αVβ3整聯(lián)蛋白受體相互作用。
熟練技術(shù)人員可輕易控制表面連接體的不同親水特性以及脂質(zhì)體上帶電部分的存在與否。例如，可通過用聚(氧化烯)基團(例如聚(乙二醇)、聚(丙二醇)等)取代烯基，將衍生自1，6-己二胺(H2N(CH2)6NH2)或相關(guān)多胺的表面連接體的疏水特性修飾得明顯更親水。
可通過將輔助基團加入或插入到表面連接體之上或其中改良表面連接體的特性，例如改變脂質(zhì)體(在水、脂肪、脂質(zhì)、生物流體等中)的溶解性、疏水性、親水性、表面連接體柔性、抗原性、穩(wěn)定性等。例如，將一個或多個聚(乙二醇)(PEG)基團引入表面連接體之上或其中，可增強納米顆粒脂質(zhì)體的親水性和水溶性，同時增加分子量和分子大小，并且根據(jù)表面連接體的特性還可增加體內(nèi)保留時間。此外，PEG可降低抗原性，并潛在增強表面連接體的整體剛性。
可增強脂質(zhì)體水溶性/親水性的輔助基團對實施本發(fā)明有效。因此，使用輔助基團增強本發(fā)明脂質(zhì)體的水溶性和/或親水性屬于本發(fā)明范疇，所述輔助基團例如少量重復(fù)單元的乙二醇、丙二醇、醇、多元醇(例如甘油、丙氧基甘油、糖(包括單糖、寡糖)等)、羧酸(例如少量重復(fù)單元的谷氨酸、丙烯酸等)、胺(例如四乙撐五胺)等。在優(yōu)選實施方案中，用于改善水溶性/親水性的輔助基團為聚醚。輔助基團可連接至靶向脂質(zhì)上的表面連接體，或可連接至脂質(zhì)體中的其它脂質(zhì)，例如陽離子脂質(zhì)或中性填充脂質(zhì)。
將親脂輔助基團加入到表面連接體結(jié)構(gòu)中來增強本文所述脂質(zhì)體的脂溶性和/或疏水性也屬于本發(fā)明范疇。用于本發(fā)明表面連接體的親脂基團包括(僅作為實例)未取代或取代的芳基和雜芳基，但至少由允許其共價連接至表面連接體的基團取代。其它用于本發(fā)明表面連接體的親脂基團包括脂肪酸衍生物，其在水性介質(zhì)中在達到相對較高的濃度之前不形成雙層。
可通過包含大和/或剛性的輔助基團操控表面連接體的柔性。存在大或剛性基團可阻礙表面連接體中的鍵、表面連接體和輔助基團之間鍵或者表面連接體和功能基團之間鍵的自由轉(zhuǎn)動。剛性基團可包括例如基團中存在環(huán)和/或多鍵抑制其構(gòu)象不穩(wěn)定性的基團，例如芳基、雜芳基、環(huán)烷基、環(huán)烯基和雜環(huán)基?？少x予剛性的其它基團包括多肽基團，例如寡或聚脯氨酸鏈。
靜電也可以賦予剛性。因此，如果輔助基團帶正電或負電，則帶同種電荷的輔助基團將迫使表面連接體變成帶同種電荷的輔助基團間距離最大的構(gòu)型。使帶同種電荷的基團間更接近的能耗代價將使得表面連接體處于維持帶同種電荷的輔助基團分開的構(gòu)型。另外，攜帶相反電荷的輔助基團趨向于吸引相反電荷部分，很有可能形成分子間離子鍵和分子內(nèi)離子鍵。這種非共價機制將使得表面連接體成為相反電荷基團可以鍵合的構(gòu)像。加入表面連接體后加入帶電或去保護后帶電荷的輔助基團，包括通過改變pH、氧化、還原或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的導(dǎo)致去除保護基的其它機制對羧基、羥基、硫醇基或氨基去保護，都屬于本發(fā)明范疇。
剛性也可以由內(nèi)部氫鍵合或疏水折疊賦予。
大基團可包括例如大原子、離子(例如碘、硫、金屬離子等)或含大原子的基團、多環(huán)基團(包括芳基、非芳基)和加入一個或多個碳-碳多鍵(即烯基和炔基)的結(jié)構(gòu)。大基團還可以包括支鏈或直鏈形式的寡聚物和多聚物。預(yù)計支鏈形式提供給所述結(jié)構(gòu)的剛性要強于相似分子量的直鏈形式。
在某些實施方案中，剛性由存在的環(huán)狀基團(例如芳基、雜芳基、環(huán)烷基、雜環(huán)基等)賦予。在其它實施方案中，表面連接體含有一個或幾個六元環(huán)。在另一實施方案中，所述環(huán)為芳基，例如苯基或萘基。
適當選擇表面連接體以提供合適的取向、限制/非限制性轉(zhuǎn)動、需要程度的疏水性/親水性等，完全屬于本領(lǐng)域技術(shù)。消除或降低本文所述納米顆粒的抗原性也屬于本領(lǐng)域技術(shù)。在某些案例中，可通過使用聚(乙二醇)基之類的基團消除或降低納米顆?？乖?。
核酸載體為陽離子兩性分子，例如陽離子脂質(zhì)、陽離子脂質(zhì)體或具有陽離子基團的膠束，其通常能夠通過與負電荷核酸序列相互作用結(jié)合核酸，形成能夠進入細胞的復(fù)合物。圖1、2、3、17和18圖解了靶向脂質(zhì)體。
適于本發(fā)明目的的陽離子脂質(zhì)(細胞轉(zhuǎn)染劑)例如為1，2-二油酰氧-3-(N，N，N-三甲銨)丙烷氯化物(DOTAP)、二甲基雙十八烷基溴化銨(DDAB)、二油酰二甲基氯化銨、二油酰-L-α-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、N-膽甾醇基氧西維因(carbaryl)-3，7，12-三氮雜十五烷-1，15-二胺(CTAP)等。優(yōu)選的陽離子脂質(zhì)為DOTAP。其它合適的陽離子脂質(zhì)描述于Miller，Angew.Chem.Int.Ed.371768-1785(1998)，后文稱為“Miller”以及Copper等，Chem.Eur.J.4(1)137-151(1998)，這些文獻在相關(guān)程度上通過引用結(jié)合到本文中。
本發(fā)明的靶向脂質(zhì)體可交聯(lián)、部分交聯(lián)或未交聯(lián)。交聯(lián)脂質(zhì)體可包含交聯(lián)以及非交聯(lián)的組分。
本發(fā)明的代表性非交聯(lián)靶向脂質(zhì)體為一種脂質(zhì)混合物，其包含DOTAP(陽離子脂質(zhì))、類固醇(中性脂質(zhì))、聚乙二醇(親水輔助組分)，例如PEG-350(具有350個氧乙烯重復(fù)單元的聚氧乙烯)，以及共價結(jié)合或包含脂質(zhì)的非肽整聯(lián)蛋白受體拮抗劑。DOTAP∶類固醇∶聚乙二醇的比率優(yōu)選分別為約1∶1∶0.12，所包含的含非肽整聯(lián)蛋白受體拮抗劑脂質(zhì)(整聯(lián)蛋白靶向脂質(zhì))的量足以提供相對較高的αVβ3整聯(lián)蛋白親合性。靶向脂質(zhì)體優(yōu)選包含整聯(lián)蛋白靶向脂質(zhì)，其量以脂質(zhì)體中脂質(zhì)組分的總mol數(shù)為基準為約1-約20mol％，更優(yōu)選為約8-約12mol％。
本發(fā)明優(yōu)選的交聯(lián)靶向脂質(zhì)體包含聚合兩性或中性脂質(zhì)、聚合整聯(lián)蛋白靶向脂質(zhì)和適于結(jié)合核酸的聚合陽離子脂質(zhì)。
在另一個優(yōu)選實施方案中，所述交聯(lián)靶向脂質(zhì)體包含聚合兩性或中性脂質(zhì)、聚合整聯(lián)蛋白靶向脂質(zhì)和非聚合陽離子脂質(zhì)。
含聚合脂質(zhì)的脂質(zhì)體可通過例如加入合適的自由基聚合引發(fā)劑、用合適波長的紫外燈輻射或聚合領(lǐng)域已知的其它方法交聯(lián)。
合適的陽離子脂質(zhì)或細胞轉(zhuǎn)染劑可商購，也可如Sipkins等，Nature Medicine，1998，4(5)(1998)，623-626所述或Miller(同上)所述制備。制備。
陽離子脂質(zhì)體可由單一陽離子兩性分子形成，或者可由陽離子兩性分子與中性脂質(zhì)組合而成，例如由3，3-[N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)氨基甲?；鵠膽固醇和二油酰L-α-磷脂酰乙醇胺組合而成。
親水特性緣于存在磷酸根、膦酸根、羧酸根、硫酸根、磺酸根、巰基、氨基、硝基、羥基或本領(lǐng)域眾所周知的其它類似基團。疏水性可通過包含以下基團賦予包括但不限于最高達20個碳原子的長鏈飽和和不飽和脂肪烴基團，以及由一個或多個芳基、雜芳基、環(huán)烷基和/或雜環(huán)基取代的所述基團。優(yōu)選的脂質(zhì)為磷酸甘油酯和鞘酯。磷酸甘油脂的代表性實例包括磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇聚糖、磷脂酸、棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿和二亞油酰磷脂酰膽堿。沒有含磷基團的化合物(如鞘脂和鞘糖脂家族)也屬于命名為脂質(zhì)的類別。另外，上述兩親脂質(zhì)可與其它脂質(zhì)(包括三甘油酯和類固醇，例如膽固醇、改良膽固醇等)混合。
整聯(lián)蛋白受體拮抗劑可包含疏水結(jié)構(gòu)域或連接表面連接體或以任何合適部位直接連接疏水結(jié)構(gòu)域，例如連接在直鏈末端或其任一中間位置，只要此連接不干擾拮抗劑與整聯(lián)蛋白受體的結(jié)合。如果有需要，整聯(lián)蛋白受體拮抗劑還可包含或具有可選二價橋聯(lián)基，以促進與表面連接體的連接。
圖1圖示說明了為球形顆粒的靶向脂質(zhì)體，其在顆粒表面具有核酸結(jié)合位點和整聯(lián)蛋白靶向位點。
圖2圖示了本發(fā)明的交聯(lián)靶向脂質(zhì)體。圖3圖示了另一個交聯(lián)靶向脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體中存在陽離子脂質(zhì)，但不與其交聯(lián)。下文的材料與方法部分詳細描述了制備此靶向脂質(zhì)體的實施方案。所述交聯(lián)脂質(zhì)體在其外表面上存在衍生自膽堿部分并能夠結(jié)合核酸的陽離子基團以及來自結(jié)合親水表面連接體的整聯(lián)蛋白拮抗劑基團的整聯(lián)蛋白受體結(jié)合位點。
通過使帶負電核酸接觸存在于脂質(zhì)體上的陽離子基團，例如通過在生理pH的藥學(xué)上可接受的水性介質(zhì)中混合核酸和靶向脂質(zhì)體，可使核酸結(jié)合交聯(lián)脂質(zhì)體納米顆粒。所形成的復(fù)合核酸的靶向脂質(zhì)體在體外和體內(nèi)都很容易被接觸靶向脂質(zhì)體的存在整聯(lián)蛋白的細胞吸收。
靶向脂質(zhì)體正電荷對核酸負電荷的比率優(yōu)選大于1，更優(yōu)選至少約1.2。
為選擇性靶向或拮抗整聯(lián)蛋白(例如αVβ3整聯(lián)蛋白)，本發(fā)明的化合物和組合物可以單位劑量形式和藥用載體、溶媒和佐劑一起，以治療有效量胃腸外、口服、吸入或局部給藥。本文使用的術(shù)語“胃腸外”包括靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、膜內(nèi)、眼內(nèi)(例如玻璃體內(nèi))和腹腔給藥，以及通過輸注技術(shù)給藥。
可利用任何合適的給藥途徑。包含本發(fā)明結(jié)合核酸的納米顆粒的藥用組合物可以預(yù)定治療有效劑量使用。本領(lǐng)域技術(shù)人員使用藥學(xué)領(lǐng)域已知的臨床前和臨床研究很容易確定治療特定病癥或抑制其發(fā)展所需的治療有效量。
本文使用的術(shù)語“治療有效量”是指臨床醫(yī)生或研究者所尋找的激發(fā)組織、系統(tǒng)、動物或人的生物學(xué)或藥學(xué)反應(yīng)的活性成分用量。
本文使用的術(shù)語“抑制”是指病癥的舒緩、中斷或停止，但不是一定表示病癥完全消除。本質(zhì)上，患者生命延長表明病癥受到有益地控制。
本發(fā)明的結(jié)合核酸的靶向脂質(zhì)體或含所述靶向脂質(zhì)的組合物的劑量方案基于若干因素，例如患者的年齡、體重、性別和疾病類型、病癥嚴重性、給藥途徑以及使用的特定靶向分子或配體的拮抗活性。劑量方案可根據(jù)前述因素改變。與約0.01mg至約1000mg/kg體重相似的劑量水平對治療前述病癥有效。優(yōu)選的劑量水平為約0.01mg至約100mg/kg體重。
對于注射給藥，用藥用載體(例如水、鹽水或葡萄糖水溶液)配制本發(fā)明描述的含靶向脂質(zhì)體的組合物。對于注射，通常的日劑量為約0.01mg至約100mg/kg體重，根據(jù)上述因素每日以單劑或多劑注射。
為抑制血管發(fā)生，例如，給予需要抑制血管發(fā)生的患者治療有效量的本發(fā)明所述靶向脂質(zhì)體，其攜帶能夠表達血管發(fā)生抑制性蛋白或肽的核酸，例如核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)。接著給予的核酸進入細胞核，并在血管內(nèi)皮細胞中表達目標蛋白。
提供以下的非限制性實施例進一步闡述本發(fā)明的各個方面。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認識到，可在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下對本文公開的實施例和說明性實施方案進行修改。
材料和方法制備納米顆粒要構(gòu)建結(jié)合整聯(lián)蛋白的多價靶向脂質(zhì)體，首先設(shè)計并合成可聚合脂質(zhì)整聯(lián)蛋白靶向分子12(圖17；流程1)。以其芐氧羰基(CBZ)衍生物保護?；撬?的氨基產(chǎn)生2，然后形成磺酰氯3，3偶合叔丁氧羰基二氨基丙酸4，產(chǎn)生化合物5。5皂化產(chǎn)生化合物6，去除叔丁氧羰基(BOC)后得到關(guān)鍵中間體7。7與苯甲酸衍生物8偶合產(chǎn)生化合物9，9氫化以去胺的保護，同時還原嘧啶環(huán)，產(chǎn)生整聯(lián)蛋白受體拮抗劑-連接體綴合物10。Duggan等，J.Med.Chem.，2000，43，3736-3745先前已經(jīng)描述了化合物8的合成，該文獻的相關(guān)公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。使用苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸鹽(BOP)使3當量10與三羧酸螯合劑脂質(zhì)11偶合，產(chǎn)生關(guān)鍵的三價整聯(lián)蛋白拮抗劑脂質(zhì)12。Storrs等，J Magn.Reson.Imaging，1995，5，719-724先前已經(jīng)描述了化合物11的制備，該文獻的相關(guān)公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。用甲醇鈉的甲醇溶液處理11得到化合物15(即11的三鈉鹽)。如Storrs等(同上)所述，通過加熱15和三氯化銪溶液合成銪-螯合劑脂質(zhì)復(fù)合物14。
圖18的流程2概述了由Storrs等(同上)先前描述的通過自組裝和聚合合適的脂質(zhì)形成交聯(lián)靶向脂質(zhì)體(NP)。通過合并三價脂質(zhì)-整聯(lián)蛋白拮抗劑12、丁二炔兩性磷酸脂13和銪-螯合劑脂質(zhì)復(fù)合物14的氯仿溶液，合成代表性的交聯(lián)靶向脂質(zhì)體。將化合物14以1％(重量)加入所有配制物中，以便使用熒光顯微鏡檢術(shù)目測顆粒。向此脂質(zhì)的氯仿溶液中加入陰離子螯合劑脂質(zhì)15或陽離子脂質(zhì)16(DOTAP)，以便改變表面電荷。通過改變脂質(zhì)體中化合物12的量控制NP上整聯(lián)蛋白拮抗劑的表面密度。
為形成囊泡，蒸發(fā)合并的脂質(zhì)溶液至干，高真空干燥去除任何殘余溶劑，形成脂質(zhì)薄膜。使用去離子水將干燥的脂質(zhì)薄膜水化至已知的脂質(zhì)密度(30mM)。然后按照Leaver等，Biochim.Biophys.Acta，1983，732，210-218的方法，在保持pH為7.0-7.5的同時，使用探針尖端超聲器以高于凝膠-液體晶體相轉(zhuǎn)變(Tm64℃)的溫度超聲處理所獲得的懸浮液。大約超聲處理1小時后溶液變得澄清。然后通過在濕冰床上將所述溶液冷卻至0℃，并用手提式UV燈于約254nm輻射所述溶液大約2小時，對囊泡進行聚合。獲得的脂質(zhì)體(NP1至NP6)為橙黃色，并具有兩條可見吸附帶，集中在490nm和535nm，由綴合的烯-炔(ene-yne)丁二炔聚合物產(chǎn)生。根據(jù)動態(tài)光散射(DLS)測定，NP的平均直徑為40nm-50nm。NP1至NP4的ζ電勢為-42至-53mV(即NP1-NP4帶負電荷)，NP5和NP6的ζ電勢分別為+35和+43mV(即NP5和NP6帶正電荷)(Brookhaven Instruments，Holtsville，NY)。所述脂質(zhì)體在使用150mM氯化鈉、50mM組氨酸和5％葡萄糖溶液配制為用于體內(nèi)的溶液后穩(wěn)定數(shù)月，物理和生物特性沒有明顯變化。
下表1提供了脂質(zhì)體NP1至NP6的成分，以組分12(靶向脂質(zhì))、13(兩性脂質(zhì))、14(陰離子螯合劑脂質(zhì))和16(陽離子脂質(zhì)；DOTAP)的mol％表示。
表1-脂質(zhì)體成分NP1-NP6脂質(zhì)體 mol％mol％ mol％ mol％靶向脂質(zhì) 兩性脂質(zhì)陰離子脂質(zhì)陽離子脂質(zhì)NP1 10 80 100NP2 189 100NP3 0.1 90 100NP4 090 100NP5 10 80 0 10NP6 090 0 10如圖18的概述，使用0.1、1和10mol％整聯(lián)蛋白拮抗劑脂質(zhì)復(fù)合化合物12和化合物13通過聚合囊泡構(gòu)建脂質(zhì)體，在聚合之前另外加入材料14、15和16到脂質(zhì)體中，以改變表面電荷密度，使脂質(zhì)體可通過熒光目測。為簡便起見，圖18沒有列出可選的僅含1mol％脂質(zhì)體的化合物13。含有10mol％化合物12的材料(NP1和NP5)對整聯(lián)蛋白αVβ3鍵合位點的親合性最高。在使用時間分辨熒光顯微鏡檢術(shù)的競爭性整聯(lián)蛋白結(jié)合測定中，消耗了超過100倍的游離配體10(65μm)才將NP1和αVβ3整聯(lián)蛋白的結(jié)合降低50％，盡管事實上NP1在其表面上僅具有0.5μM當量的整聯(lián)蛋白拮抗劑10。在使用結(jié)合至玻連蛋白包被平板的αVβ3陽性M21黑素瘤細胞的體外細胞粘附抑制測定中，游離配體10的IC50為64μM。形成強烈對比的是，在表面上的陰離子顆粒NP1的IC50為0.27μM當量化合物10。這表示當10在NP上時對細胞表面的親合力是游離配體的200倍以上。對于陰離子顆粒NP5，IC50為0.35μM當量化合物10，親合力大約是游離配體的180倍，如下表2所示。因此，不管表面電荷如何，與單體配體相比，NP對整聯(lián)蛋白的親合力大約增加180-200倍。該結(jié)果證實，NP表面和細胞表面之間發(fā)生強烈的相互作用。此相互作用與NP上的表面電荷無關(guān)，而是與特定受體配體的相互作用直接相關(guān)。通過在NP表面上以多價提供整聯(lián)蛋白拮抗劑，可使親合力比游離配體增加大約兩個數(shù)量級。當NP制備物中化合物12的量分別下降10倍和100倍至1mol％和0.1mol％(如NP2和NP3)時，阻斷細胞粘附的能力下降約1至2個數(shù)量級，分別如下表2所示。
表2脂質(zhì)體NP1-NP6的物理和生物特性材料大小 ζ電勢 競爭性抑制 細胞粘附測定 多價效果IC50(游離(nm) (mV) 測定(μM10) IC50(μM NP上10) [10]/NP上的[10])NP1 45.1± -42 65 0.27 2370.6NP2 42.8± -49 24 7 91.5NP3 44.4± -53 1 30.5 20.8NP4 46.4± -49 NA 抑制 NA0.7NP5 41.7± 3560 0.35 1832.2NP6 36.8± 43NA 抑制 NA0.9脂質(zhì)體NP5代表本發(fā)明的代表性交聯(lián)靶向脂質(zhì)體。
通用合成方法使用的所有溶劑和試劑都是試劑級。在公用真空(house vacuum)或Welch直流真空泵提供的減壓下以≤40℃進行溶劑蒸發(fā)。如所述對每個實例用JEOL FX90Q記錄其在CDCl3、CD3OD、D2O或混合物中的1H和13C-NMR光譜，質(zhì)子光譜為90MHz，碳光譜為大約23MHz。(注意盡管可溶于CDCl3，但向脂質(zhì)中加入CD3OD抑制反膠束形成，由此產(chǎn)生較尖銳的光譜)。1H實驗光譜以殘余CHCl3(7.25ppm)作為參比，13C實驗光譜以CDCl3中線(77.00ppm)作為參比。用PerSeptive DE儀器(質(zhì)譜，The Scripps Research Institute，La Jolla，CA)進行MALDI-TOF質(zhì)譜。在玻璃基板型Merck 60 F254(0.2mm；EMSeparations，Wakefield，RI)上進行TLC，顯色板按常規(guī)用硫酸鈰(1％)和鉬酸銨(2.5％)的10％硫酸水溶液噴霧，加熱至約150℃。其它顯色劑包括碘(一般用途)、0.5％茚三酮的丙酮溶液(用于胺)和紫外燈(用于UV發(fā)色團)。
N-芐氧羰基-?；撬徕c鹽(2)。將?；撬?(約40g，320mmol)溶解在4N氫氧化鈉溶液(80ml)和水(約200ml)中。向該溶液中滴加芐氧基碳酰氯(約48ml，330mmol)，劇烈攪拌約4小時。加入10％碳酸氫鈉溶液(約300ml)和4N氫氧化鈉溶液(約45ml)將溶液pH維持在堿性。然后用乙醚(約1000ml)洗滌獲得的反應(yīng)混合物，將水層旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，再在高真空下經(jīng)五氧化二磷過夜干燥，產(chǎn)生約12.7g(14％)2。1H-NMR(D2O)δ7.50(5H，s，Ar-H)，5.21(2H，s，Ar-CH2)，3.62(2H，t，CH2)，3.14(2H，t，CH2)。
2-芐氧羰基氨基乙烷磺酰氯(3)。在正壓氬氣下將N-CBZ-?；撬徕c鹽2(約12.7g，32mmol)懸浮在無水乙醚(約30ml)中，并在約15分鐘內(nèi)以5份五氯化磷(約7g，33.6mmol)處理。于室溫下攪拌反應(yīng)物約4小時。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑。加入冰水(約10ml)，以冰浴冷卻燒瓶和內(nèi)容物后研磨獲得的殘余物。再加入冰水(約50ml)，固化產(chǎn)物。過濾收集固體，用冰水(約20ml)洗滌，經(jīng)五氧化二磷過夜干燥，產(chǎn)生約6.95g(78％)3。1H-NMR(CDCl3)δ7.35(5H，s，Ar-H)，5.12(2H，s，Ar-CH2)，3.89(2H，t，CH2)與3.85(2H，t，CH2)重疊。
3-丁氧羰基氨基-2-(S)-芐氧羰基氨基乙基亞磺酰氨基丙酸甲酯(5)。在正壓氬氣下用冰浴冷卻磺酰氯3(約21.6g，78mmol)和3-N-丁氧羰基氨基-2-氨基丙酸甲酯(4，約9.96g，39.2mmol)的無水四氫呋喃(THF，150ml)溶液的混合物。在正壓氬氣下于約30分鐘內(nèi)，使用預(yù)先干燥的滴液漏斗向該溶液中滴加入N-甲基嗎啉(約16ml，145mmol)的無水THF(約275ml)溶液。在冰浴中攪拌約1小時后，通過TLC觀察到基本上所有磺酰氯(Rf＝0.65)都已消耗完(洗脫液乙酸乙酯/己烷1∶1)。但是，仍存在未反應(yīng)的二氨基丙酸(Rf＝0.1，茚三酮噴霧)。在約3小時內(nèi)再加入磺酰氯(約5.0g，18mmol)。然后過濾獲得的反應(yīng)產(chǎn)物，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，并溶解在乙酸乙酯(約100ml)中，用冷稀鹽酸(約20ml)、飽和碳酸氫鈉溶液(約20ml)然后是飽和氯化鈉溶液(約20ml)洗滌，接著經(jīng)無水硫酸鈉干燥。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，真空下過夜干燥獲得的殘余物。通過首先溶解在乙酸乙酯中，然后加入等體積己烷，使干燥的殘余物重結(jié)晶，獲得為無色固體的甲酯5約13.4g(約74％)。1H-NMR(CDCl3)δ7.36(5H，s，Ar-H)，5.83(1H，d，NH)，5.55(1H，t，NH)，5.12(2H，s，Ar-CH2)，5.06(1H，t，NH)，4.26(2H，m，CH)，3.79(3H，s，CH3)，3.70(2H，dd，CH2)，3.26(2H，dd，CH2)，1.43(9H，s，(CH3)3)。
3-丁氧羰基氨基-2-(S)-芐氧羰基氨基乙基亞磺酰氨基丙酸(6)。以冰浴冷卻甲酯5(約13.3g，28.9mmol)的四氫呋喃(約160ml)溶液。向該溶液中加入氫氧化鋰(約5.42g，128mmol)的冰水(160ml)溶液。去除冰浴使獲得的反應(yīng)混合物緩慢升溫至室溫，于室溫攪拌混合物約1小時。然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機溶劑。用乙醚(20ml)洗滌殘余的水性部分，然后用稀鹽酸酸化至約pH4。以冰浴冷卻該溶液，然后和乙酸乙酯(約100ml)混合，接著使用冰冷稀鹽酸再酸化至約pH1，并立即用乙酸乙酯(約2×200ml)提取。用鹽水(約50ml)洗滌乙酸乙酯層，經(jīng)無水硫酸鈉干燥。然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，獲得的殘余物在高真空下過夜干燥，獲得約13.3g泡沫固體，將其由己烷/乙酸乙酯(1∶1)中重結(jié)晶，獲得約11.6g(89.7％)的6。1H-NMR(CDCl3)δ7.33(5H，s，Ar-H)，6.12(1H，d，NH)，5.68(1H，t，NH)，5.26(1H，t，NH)，5.1(2H，s，Ar-CH2)，4.24(2H，m，CH2)，3.67(2H，t，CH2)，3.27(2H，t，CH2)，1.45(9H，s，C(CH3)3)。
3-氨基-2-(S)-芐氧羰基氨基乙基亞磺酰氨基-丙酸(7)。用三氟乙酸(約68ml)的二氯甲烷(約350ml)處理N-BOC-β-氨基酸6(約11.5g，25.8mmol)約1.5小時，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。將獲得的殘余物溶解在水(約200ml)中并凍干，獲得約10.9g(98.8％)的固體7。1H-NMR(CDCl3)δ7.30(5H，s，Ar-H)，6.07(1H，d，NH)，5.61(1H，t，NH)，5.20(1H，t，NH)，5.17(2H，s，Ar-CH2)，4.11(2H，m，CH2)，3.53(2H，t，CH2)，3.32(2H，t，CH2)。C13H19N3O6S的DCI-MS為m/z(離子)346(M+H)(C13H19N3O6S+H的理論值，m/z346)。
4-[2-(嘧啶-2-基氨基)乙氧基]苯甲?；?2-(S)-芐氧羰基氨基乙基亞磺酰氨基-β-丙氨酸(9)。在正壓氬氣下將苯甲酸衍生物8(約6.4g，24.7mmol)和N-羥基琥珀酰亞胺(約3.6g，31mmol)溶解在無水二甲亞砜(約110ml)中，并以冰浴冷卻。向該溶液中加入1-(3-(二甲基氨基)丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽鹽酸(約4.9g，25.6mmol)。于冰冷的溫度攪拌該溶液1小時，然后使其升至室溫。再于室溫持續(xù)攪拌約24小時。向獲得的混合物中加入β-氨基酸7(約12.2g，25.8mmol)的溶液，然后加入N-甲基嗎啉。于氬氣下攪拌獲得的反應(yīng)混合物約3天。然后將獲得的混合物傾倒入水(約1L)中，用稀鹽酸酸化至約pH1.5，并用乙酸乙酯(約5×500ml)提取。用飽和氯化鈉溶液(約50ml)洗滌合并的有機相，然后經(jīng)無水硫酸鈉干燥。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑。獲得的殘余物用乙酸乙酯研磨，過濾，然后在高真空下干燥，獲得約10.5g(72.5％)9。1H-NMR(DMSO-d6)δ8.30(2H，d，Ar-H)，7.99(2H，d，Ar-H)，7.34(5H，s，Ar-H)，7.00(2H，d，Ar-H)，6.60(1H，dd，Ar-H)，5.01(2H，s，CH2)，4.15(1H，t，CH)，3.67(2H，t，CH2)，3.56(2H，t，CH2)，3.17(2H，t，CH2)。
4-[2-(3，4，5，6-四氫嘧啶-2-基氨基)乙氧基]苯甲?；?2-(S)-氨基乙基亞磺酰氨基-β-丙氨酸(10)。將嘧啶衍生物9(約3.7g，6.4mmol)的溶液溶解在乙酸(約190ml)和濃鹽酸(約17ml)中。獲得的溶液與10％披鈀碳(約1.62g)混合，在約45psi的氫氣中氫化約5小時。然后通過C鹽床過濾獲得的混合物，用水洗滌。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，高真空下干燥獲得的殘余物。將干燥的殘余物溶解在水(約100ml)中，用1N氫氧化鈉溶液將pH調(diào)節(jié)至約7，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。將獲得的殘余物溶解在甲醇(約20ml)中并過濾。過濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，溶解在水(約275ml)中并凍干。然后獲得的凍干產(chǎn)物由水中重結(jié)晶，獲得約2.96g(約78.9％)產(chǎn)物10。1H-NMR(D2O)δ7.80(2H，d，Ar-H)，7.14(2H，d，Ar-H)，4.49(1H，s，CHaHb)，4.28(2H，t，CH2)，3.94(1H，dd，CHaHb)，3.61(6H，m，CH2)，3.32(4H，t，CH2)，1.90(2H，t，CH2)。C18H28N6O6S的ES-MSm/z(離子)457(M+H)(C18H28N6O6S+H的理論值，m/z457)。(12)。用預(yù)先火焰干燥并充氬氣的3頸RB燒瓶，將(PDA-PEG3)2-DTPA-(COOH)3(約11.69mg，50μmol)溶解在無水CH3CN(約5ml)、無水CH2Cl2(約2ml)和Et3N(約1ml)中。向獲得的溶液加入BOP試劑(約134mg，150μmol)，獲得的混合物充分攪拌5分鐘，以獲得脂質(zhì)溶液。在充氬氣的干燥小瓶中制備10(約69mg，150μmol)的無水CH3CN(約5ml)和無水二甲基甲酰胺(DMF)(約2ml)混合物溶液。使用干燥注射器在連續(xù)攪拌下將10的溶液加入脂質(zhì)溶液中。將如此產(chǎn)生的反應(yīng)混合物于黑暗中攪拌10小時。TLC(溶劑CHCl3、CH3OH、H2O和CH3COOH)顯示起始物質(zhì)(Rf＝0.53)完全消失。有一個主產(chǎn)物(Rf＝0.2)和5個副產(chǎn)物(Rf＜0.18)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，獲得的殘余物在高真空下干燥約24小時，獲得粗產(chǎn)物。使用半制備型硅膠柱通過正常相HPLC純化粗產(chǎn)物，流速約5ml/分鐘(梯度系統(tǒng)起始為100％CHCl3，約5分鐘；然后為75％CHCl3/25％CH3OH，10分鐘；然后為50％CHCl3/50％CH3OH，10分鐘；然后為25％CHCl3/75％CH3OH，10分鐘；最后為100％CH3OH，約20分鐘)。合并含主產(chǎn)物的組分(保留時間＝35-37分鐘)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，獲得的殘余物在高真空下干燥約24小時，獲得約35.5mg(26.5％)目的產(chǎn)物。高分辨率MALDI-FTMSm/z 2681.4711(C130H209N25O29S3+H的理論值，m/z 2681.4882)。
實施例實施例1細胞粘附測定使用人黑素瘤細胞系M21在包被玻連蛋白的平板上進行細胞粘附測定。將多價脂質(zhì)體NP1-NP6以及單體配體10分別與M21細胞溫育，加至包被玻連蛋白的48孔平板上。溫育1小時后，洗滌各孔，用結(jié)晶紫溶液對粘附細胞染色，檢測約590nm的光密度(OD)。檢測的OD與結(jié)合至玻連蛋白平板的細胞數(shù)成比例，將OD對不同配制物中NP表面上的組分10濃度作圖，以計算IC50。
圖8圖解了細胞粘附測定，其中表達αVβ3的M21人黑素瘤細胞與共價結(jié)合整聯(lián)蛋白拮抗劑(配體)的脂質(zhì)體或單獨配體混合。然后將細胞置于玻連蛋白平板上，洗滌并染色。然后使用平板計數(shù)器對結(jié)合細胞數(shù)計數(shù)。
圖9以曲線圖列出了使用圖8所示的粘附測定所獲得的數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)顯示結(jié)合整聯(lián)蛋白拮抗劑的脂質(zhì)體強烈抑制細胞粘附(IC50＝1μM)，而單獨的拮抗劑(配體)抑制細胞粘附的效果(IC50＝0.5mM)相差很遠。
實施例2體外轉(zhuǎn)染測定將分別有或沒有共價連接αVβ3靶向配體的約30nmol陽離子脂質(zhì)體NP5和NP6各與約2μg編碼綠色熒光蛋白(GFP)的質(zhì)粒DNA的5％葡萄糖溶液復(fù)合，然后體外接觸黑素瘤細胞約1小時。24小時后通過計數(shù)熒光細胞數(shù)和總細胞數(shù)相比測定轉(zhuǎn)染效率。使用的細胞是人黑素瘤細胞M21和M21L。M21細胞表達αVβ3整聯(lián)蛋白，而M21L細胞不表達αVβ3整聯(lián)蛋白(αV無效)。
如圖10所示，用與GFP基因復(fù)合的靶向脂質(zhì)體(NPS)處理的αV表達細胞(M21)表現(xiàn)出的轉(zhuǎn)染程度(＞125,000細胞/百萬)是用非靶向脂質(zhì)體(NP6)(無拮抗劑；約25,000細胞/百萬)或單獨DNA(無脂質(zhì)體，約12,000細胞/百萬)處理的αV表達細胞的5倍或更高。相比之下，αV無效細胞(M21L)顯示加入GFP基因沒有優(yōu)勢，獲得相對較低水平的轉(zhuǎn)染(25,000細胞/百萬)，而與接受的處理無關(guān)。因此，靶向基因載體顯示以αVβ3依賴方式轉(zhuǎn)染細胞。
實施例3靶向脂質(zhì)體介導(dǎo)的體內(nèi)靶向腫瘤的基因傳遞將各約450nmol的NP5和NP6與各約30μg的編碼螢火蟲熒光素酶的質(zhì)粒DNA的各約200μl 5％葡萄糖溶液靜電復(fù)合，然后將每種復(fù)合DNA的脂質(zhì)體溶液靜脈注射入具有不表達αVβ3(M21L)的約150mm3皮下黑素瘤的動物。約24小時后處死動物，切除所述器官和腫瘤，測定熒光素酶活性。除使用組織研磨機以器官重量標化的Bright-Glo裂解試劑量研磨全部器官以外，按照生產(chǎn)商的指引，使用Bright-Glo熒光素酶檢測試劑盒(Promega Corp.，Madison，WI)測定熒光素酶活性。
如圖11所示，相比于肺、肝和心臟組織，與熒光素酶基因復(fù)合的靶向脂質(zhì)體(NP5)在腫瘤組織中顯示高度選擇性表達，表達水平約4pg熒光素酶/mg組織，相比之下估計在其它組織中的表達水平低于pg/mg組織。與熒光素酶復(fù)合的非靶向脂質(zhì)體(NP6)對轉(zhuǎn)染任何組織都無效。加入約過量20倍的可溶性整聯(lián)蛋白拮抗劑配體通過靶向配體有效抑制細胞轉(zhuǎn)染。
實施例4靶向脂質(zhì)體介導(dǎo)性傳遞突變型Raf基因至腫瘤血管使移植腫瘤消退將不表達αVβ3的黑素瘤(M21L)皮下注射入腰窩，使其生長至約70mm3，此時用200μl5％葡萄糖溶液(對照)、與約30μg編碼顯性失活突變形式的Raf激酶(Raf-ATPμ)的質(zhì)粒DNA復(fù)合的靶向脂質(zhì)體NP5的200μl5％葡萄糖溶液或與不編碼任何DNA的穿梭載體復(fù)合的靶向脂質(zhì)體NP5的200μl5％葡萄糖溶液靜脈注射小鼠。約15天后，以相同的處理方式再注射腫瘤。在圖12所示的時間點，使用公式腫瘤體積＝(最小直徑)2×最大直徑/2檢測腫瘤大小。
如圖12所示，用復(fù)合顯性失活突變形式的Raf激酶(Raf-ATPμ)的靶向脂質(zhì)體NP5處理具有約70mm3初始體積的黑素瘤的小鼠，導(dǎo)致腫瘤體積開始增加至約550mm3，接著在約30天后腫瘤消退，至第35天穩(wěn)定至約200mm3體積的穩(wěn)定狀態(tài)(圖12中標記為“顆粒/Raf(-)”)。該穩(wěn)定狀態(tài)的腫瘤大小又保持了30天，此時終止實驗。在用單獨的靶向脂質(zhì)體NP5(無基因)(標記為“顆粒/穿梭載體”)或單獨的突變型Raf基因(無脂質(zhì)體)處理的小鼠中，腫瘤在35天的整個階段中持續(xù)生長，沒有任何消退跡象。因為所述腫瘤不表達αVβ3，但新生血管內(nèi)皮細胞確實表達αVβ3，所以腫瘤生長的減弱更可能使由于腫瘤血管的血管發(fā)生受到抑制。
實施例5靶向脂質(zhì)體介導(dǎo)性傳遞突變型Raf基因至腫瘤血管使移植黑素瘤消退如實施例4處理腫瘤，只是在初始治療前使腫瘤生長至約300mm3，此時向其注射(a)約450nmol靶向脂質(zhì)體NP5，其靜電復(fù)合約30μg編碼Raf-ATPμ的質(zhì)粒DNA的約200μl5％葡萄糖溶液，(b)約450nmol非靶向脂質(zhì)體NP6，其靜電復(fù)合約30μg編碼Raf-ATPμ的質(zhì)粒DNA的約200μl5％葡萄糖溶液，或(c)約450nmol靶向脂質(zhì)體NP，其與和約20mol過量整聯(lián)蛋白αVβ3競爭配體混合的約30μg編碼Raf-ATPμ的質(zhì)粒DNA的約200μl5％葡萄糖溶液靜電復(fù)合。在圖13所示的時間點進行腫瘤檢測，其中(a)標記為“Raf(-)”，(b)標記為“非靶向”，(c)標記為“過量”。還包括未處理的對照。
如圖13所示，在初始生長階段后，用復(fù)合顯性失活突變形式的Raf激酶(Raf-ATPμ)的靶向脂質(zhì)體NP5處理具有300mm3初始體積黑素瘤的小鼠，也使腫瘤體積比未處理的對照組減小。
實施例6靶向脂質(zhì)體介導(dǎo)的傳遞是血管發(fā)生血管選擇性的將約300nmol NP5與約20μg的編碼綠色熒光蛋白(GFP)的質(zhì)粒DNA的約50μl5％葡萄糖溶液復(fù)合，然后靜脈注射入雞胚，雞胚的尿囊絨膜(CAM)預(yù)先暴露于用1mg/ml bFGF飽和的濾碟達24小時，以刺激血管發(fā)生。復(fù)合物注射后1天，收集CAM組織，用PBS洗滌，用4％低聚甲醛固定，并檢測熒光的存在情況。結(jié)果示于圖14。
由圖14的顯微照片可見，GFP高度定位于CAM的血管系統(tǒng)。
實施例7由靶向脂質(zhì)體介導(dǎo)的突變型Raf基因向腫瘤血管的傳遞誘導(dǎo)血管凋亡，隨后腫瘤細胞死亡將不表達αVβ3的黑素瘤皮下注射入小鼠腰窩。使產(chǎn)生的腫瘤生長至約200mm3，此時用約450nmol NP5靜脈注射小鼠，所述NP5復(fù)合約30μg編碼Raf-ATPμ的質(zhì)粒DNA約200μl5％葡萄糖溶液或復(fù)合穿梭載體的約200μl5％葡萄糖溶液。約72小時后切除腫瘤，用4％低聚甲醛固定，制成切片，使用檢測片段化DNA的TUNEL法(Intergen Corp，Purchase，NY)對Von Willebrand因子(血管標記物)和凋亡染色。
圖15所示的顯微照片表明，接觸納米顆粒/穿梭載體(對照)的腫瘤顯示相對較高的血管密度，幾乎沒有細胞經(jīng)歷凋亡。相反，接觸NP5/Raf-ATPμ的腫瘤的大部分血管經(jīng)歷凋亡，腫瘤的大部分區(qū)域在距凋亡血管的固定距離死亡，推測是由于輸血不足。
實施例8靶向脂質(zhì)體介導(dǎo)的傳遞是血管發(fā)生血管選擇性的在小鼠中，側(cè)支由淺表血管叢視網(wǎng)膜毛細血管出芽，穿過視網(wǎng)膜，在出生后第8天(P8)和第10天(P10)之間形成深部血管叢。在該研究中，在P10對小鼠玻璃體內(nèi)注射復(fù)合約0.15μg編碼綠色熒光蛋白的質(zhì)粒DNA的約1μl5％葡萄糖溶液的靶向脂質(zhì)體NP5，然后玻璃體內(nèi)注射。注射復(fù)合GFP基因的NP5后約24小時，處死小鼠，用連接抗膠原蛋白IV抗體(一種血管標記物)的羅丹明免疫染色視網(wǎng)膜，通過雙光子激光掃描顯微鏡進行評測，以檢測視網(wǎng)膜血管中GFP的相對水平。
圖16的顯微照片顯示GFP高度定位于視網(wǎng)膜血管。
可在不背離本發(fā)明新特征的精神和范圍的情況下，對上述實施方案和實施例實施眾多的變化和修改。本文闡述的具體實施方案沒有限制作用，或者應(yīng)當推斷出沒有限制作用。所附權(quán)利要求書用于覆蓋屬于權(quán)利要求書范圍的所有所述修改。
權(quán)利要求
1.一種αvβ3整聯(lián)蛋白靶向脂質(zhì)體，其包含陽離子兩性分子；中性脂質(zhì)；具有靶向結(jié)構(gòu)域和結(jié)合靶向結(jié)構(gòu)域的疏水結(jié)構(gòu)域的靶向脂質(zhì)；以及與所述陽離子脂質(zhì)復(fù)合的核酸；所述陽離子脂質(zhì)的存在量為約1至約50mol％，所述靶向脂質(zhì)的存在量為約1至約20mol％，mol％值是基于脂質(zhì)體中脂質(zhì)的總摩爾數(shù)，而所述靶向結(jié)構(gòu)域包括非肽αvβ3整聯(lián)蛋白拮抗劑。
2.權(quán)利要求1的脂質(zhì)體，其中所述陽離子兩性分子為陽離子脂質(zhì)。
3.權(quán)利要求2的脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體中存在的至少一部分脂質(zhì)具有互相交聯(lián)的功能基團。
4.權(quán)利要求2的脂質(zhì)體，其中所述非肽αvβ3整聯(lián)蛋白拮抗劑在生理pH值為兩性離子，具有通過間隔基互相分開的陽離子基團和陰離子基團，所述間隔基在陽離子基團和陰離子基團之間產(chǎn)生的間距為約10埃至約100埃。
5.權(quán)利要求4的脂質(zhì)體，其中所述間隔基包括二價芳基。
6.權(quán)利要求1的脂質(zhì)體，其中所述核酸為DNA。
7.權(quán)利要求1的脂質(zhì)體，其中所述核酸為基因。
8.權(quán)利要求1的脂質(zhì)體，其中所述核酸為反義寡核苷酸序列。
9.權(quán)利要求1的脂質(zhì)體，其中所述核酸為RNA。
10.權(quán)利要求1的脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體的顆粒大小不超過約250nm。
11.權(quán)利要求1的脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體的顆粒大小為約40nm至約100nm。
12.權(quán)利要求1的脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體的顆粒大小為約75nm至約100nm。
13.權(quán)利要求1的脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體的顆粒大小為約40nm至約65nm。
14.權(quán)利要求1的脂質(zhì)體，其中所述非肽αvβ3整聯(lián)蛋白拮抗劑的分子量為約455道爾頓至約605道爾頓。
15.權(quán)利要求1的脂質(zhì)體，其中所述非肽αvβ3整聯(lián)蛋白拮抗劑的分子量為約200道爾頓至約800道爾頓。
16.權(quán)利要求2的脂質(zhì)體，其中所述非肽αvβ3整聯(lián)蛋白拮抗劑由式(I)表示 其中在式(I)中，R1和R2均為氫，或一起形成橋聯(lián)1，2-亞苯基(C6H4)基團或橋聯(lián)乙烯基(-CH＝CH-)；X是-C(O)-或共價鍵；n是1，2或3；Z1是-C(O)-R3、-C(O)OR3或SO2R3；而R3是苯基、取代的苯基、吡啶基、芐基、取代的芐基、C1-C4鹵代烷基、C2-C30烷基、C2-C30烯基、C2-C30炔基或膽甾醇基。
17.權(quán)利要求2的脂質(zhì)體，其中所述非肽αvβ3整聯(lián)蛋白拮抗劑由式(II)表示 其中在式(II)中，R4和R5均為氫，或一起形成共價鍵；Y是-C(O)-或-CH2-；Z2是-C(O)-R6、-C(O)OR6或SO2R6；R6是苯基、取代的苯基、吡啶基、芐基、取代的芐基、C1-C4鹵代烷基、C2-C30烷基、C2-C30烯基、C2-C30炔基或膽甾醇基；而Het是2-吡啶基或2-咪唑基。
18.權(quán)利要求2的脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)體不含交聯(lián)脂質(zhì)，其顆粒大小為約75nm至約100nm。
19.權(quán)利要求2的脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體包含交聯(lián)脂質(zhì)，其顆粒大小為約40nm至約65nm。
20.權(quán)利要求1的脂質(zhì)體，其中所述靶向脂質(zhì)和中性脂質(zhì)至少部分互相交聯(lián)，而所述陽離子兩性分子基本沒有交聯(lián)。
21.權(quán)利要求2的脂質(zhì)體，其中所述陽離子脂質(zhì)為1，2-二油酰氧基-3-(N，N，N-三甲銨)丙烷氯化物。
22.權(quán)利要求21的脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)體還包含具有約250至約500個氧乙烯重復(fù)單元的聚(乙二醇)。
23.權(quán)利要求22的脂質(zhì)體，其中所述聚(乙二醇)包含約350個氧乙烯重復(fù)單元。
24.權(quán)利要求2的脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)體包含1，2-二油酰氧基-3-(N，N，N-三甲銨)丙烷氯化物、膽固醇和聚(乙二醇)，它們的比率分別為約1∶1∶012。
25.權(quán)利要求2的脂質(zhì)體，其中所述核酸能夠在已經(jīng)引入所述脂質(zhì)體的細胞中表達蛋白或肽。
26.權(quán)利要求25的脂質(zhì)體，其中所述核酸能夠表達血管發(fā)生抑制性蛋白或肽。
27.權(quán)利要求26的脂質(zhì)體，其中血管發(fā)生抑制性蛋白為Raf蛋白。
28.一種將核酸導(dǎo)入存在αvβ3整聯(lián)蛋白的細胞中的方法，該方法包括使所述細胞接觸權(quán)利要求1的αvβ3整聯(lián)蛋白受體靶向脂質(zhì)體。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述非肽αvβ3整聯(lián)蛋白受體拮抗劑為選擇性αvβ3整聯(lián)蛋白受體拮抗劑。
30.權(quán)利要求28的方法，其中所述αvβ3整聯(lián)蛋白受體拮抗劑在生理pH值具有能夠結(jié)合整聯(lián)蛋白受體的陽離子基團和陰離子基團，而其中所述陽離子基團和陰離子基團通過間隔基互相分開，所述間隔基在所述拮抗劑的陽離子基團和陰離子基團之間產(chǎn)生的間距為約10埃至約100埃。
31.一種抑制血管發(fā)生的方法，該方法包括給予需要抑制血管發(fā)生的患者治療有效量的權(quán)利要求1的αvβ3整聯(lián)蛋白受體靶向脂質(zhì)體，所述靶向脂質(zhì)體能夠表達血管發(fā)生抑制性蛋白或肽。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述非肽αvβ3整聯(lián)蛋白受體拮抗劑為選擇性αvβ3整聯(lián)蛋白受體拮抗劑。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述αvβ3整聯(lián)蛋白受體拮抗劑在生理pH值具有能夠結(jié)合整聯(lián)蛋白受體的陽離子基團和陰離子基團，而其中所述陽離子基團和陰離子基團通過間隔基互相分開，所述間隔基在所述拮抗劑的陽離子基團和陰離子基團之間產(chǎn)生的間距為約10埃至約100埃。
34.權(quán)利要求31的方法，其中所述脂質(zhì)體眼內(nèi)給藥以治療血管性眼病。
35.權(quán)利要求31的方法，其中所述脂質(zhì)體靜脈內(nèi)給藥。
36.權(quán)利要求31的方法，其中所述脂質(zhì)體通過注射入腫瘤給藥。
37.一種抑制腫瘤生長的方法，該方法包括給予需要抑制腫瘤生長的患者治療有效量的權(quán)利要求1的αvβ3整聯(lián)蛋白受體靶向脂質(zhì)體，所述靶向脂質(zhì)體能夠表達血管發(fā)生抑制性蛋白或肽。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述非肽αvβ3整聯(lián)蛋白受體拮抗劑為選擇性αvβ3整聯(lián)蛋白受體拮抗劑。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述αvβ3整聯(lián)蛋白受體拮抗劑在生理pH值具有能夠結(jié)合整聯(lián)蛋白受體的陽離子基團和陰離子基團，而其中所述陽離子基團和陰離子基團通過間隔基互相分開，所述間隔基在所述拮抗劑的陽離子基團和陰離子基團之間產(chǎn)生的間距為約10埃至約100埃。
40.權(quán)利要求37的方法，其中所述脂質(zhì)體靜脈內(nèi)給藥。
41.權(quán)利要求37的方法，其中所述脂質(zhì)體通過注射入腫瘤給藥。
42.一種誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞凋亡的方法，該方法包括使血管內(nèi)皮細胞接觸誘導(dǎo)凋亡有效量的權(quán)利要求1的αvβ3整聯(lián)蛋白受體靶向脂質(zhì)體，所述靶向脂質(zhì)體能夠表達凋亡誘導(dǎo)性蛋白或肽。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述凋亡誘導(dǎo)性蛋白為Raf蛋白。
全文摘要
α
文檔編號A61K48/00GK1535163SQ02814966
公開日2004年10月6日 申請日期2002年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月30日
發(fā)明者D·A·徹雷斯, J·霍德, M·貝德納斯基, D A 徹雷斯, 履傷夠 申請人:斯克里普斯研究學(xué)院, 萊蘭斯坦福初級大學(xué)評議會