專利名稱：治療免疫復(fù)合物相關(guān)疾病的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療免疫復(fù)合物相關(guān)疾病的方法和組合物，特別適用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)以及與患有Toll樣受體(TLR)/Bcell受體(BCR)雙結(jié)合(在B cells中)或者TLR/Fc gamma受體雙結(jié)合(在樹突狀細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞)異常的患者相關(guān)的其他系統(tǒng)性自身免疫疾病。
背景技術(shù)：
自身免疫疾病是一系列很常見的疾病，但目前對(duì)其知之甚少；在患有自身免疫疾病的個(gè)體中，其免疫系統(tǒng)或者1)開始將自身抗原作為外源抗原加以識(shí)別，并且開始破壞表達(dá)此類抗原的組織從而引發(fā)疾病；或者2)與這些抗原形成免疫復(fù)合物，這些免疫復(fù)合物隨后沉積在組織中并引發(fā)炎癥反應(yīng)。此類自身免疫疾病包括例如，糖尿病，其中免疫系統(tǒng)發(fā)生轉(zhuǎn)變，破壞產(chǎn)生胰島素的胰島細(xì)胞；多發(fā)性硬化癥，其中目標(biāo)抗原是髓鞘保護(hù)的神經(jīng)元，導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元功能的破壞；牛皮癬，其中免疫系統(tǒng)的目標(biāo)是皮膚；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，其中目標(biāo)器官是軟骨；以及系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，其特征是沒有明顯特異性或選擇性地將多種組織作為靶標(biāo)，但是目標(biāo)抗原本身卻非常一致并且很獨(dú)特。由于人們對(duì)導(dǎo)致自身免疫疾病發(fā)展的機(jī)制總的來(lái)說(shuō)還幾乎一無(wú)所知，因此對(duì)它們的治療通常是一般性地抑制免疫系統(tǒng)。此類一般性免疫抑制療法往往會(huì)產(chǎn)生很多不良的副作用，包括癌癥，不育癥，對(duì)病毒、真菌、酵母和細(xì)菌的易感性增加等。因此，人們很希望能理解引起免疫系統(tǒng)發(fā)生轉(zhuǎn)變從而識(shí)別自身抗原的機(jī)制，從而使人們可以發(fā)展出特異性更強(qiáng)的治療自身免疫疾病的方法。
人們知之甚少的自身免疫疾病的一個(gè)實(shí)例是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，通常稱為狼瘡。SLE的特征是免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)失常，從而導(dǎo)致了抗核抗體的產(chǎn)生，循環(huán)系統(tǒng)中免疫復(fù)合物的產(chǎn)生以及補(bǔ)體系統(tǒng)的活化。免疫復(fù)合物在組織和關(guān)節(jié)中積累從而引發(fā)炎癥以及關(guān)節(jié)和組織的降解。雖然術(shù)語(yǔ)“系統(tǒng)性”恰當(dāng)?shù)匕凳玖嗽摷膊∮绊懻麄€(gè)機(jī)體和大多數(shù)器官系統(tǒng)，但最為常見的是，該疾病涉及炎癥反應(yīng)以及相應(yīng)的對(duì)關(guān)節(jié)、皮膚、腎、大腦、體腔膜、肺、心臟和胃腸道的損害。患有SLE的個(gè)體通常會(huì)經(jīng)歷預(yù)想不到的急性期或“暴發(fā)”以及同樣令人意外的恢復(fù)。該疾病的病理特征是反覆、分布廣以及類似皮疹的多種脈管損傷或皮膚表面的變化。
在美國(guó)，SLE的流行是一個(gè)有爭(zhēng)議的話題。預(yù)計(jì)流行范圍在250,000到2,000,000人之間。雖然在年齡很大的老人以及年齡非常小的孩子中也有報(bào)道，但該疾病主要的感染對(duì)象是育齡婦女。在孩子之中，女孩子患有SLE的比例比男孩子患SLE的比例高三倍。60％的SLE患者的發(fā)病時(shí)間在青春期和四十歲之間，在該人群中，女性與男性的比例為9∶1。此后，女性的患病比例仍然占優(yōu)勢(shì)，這與在青春期前的孩子們身上所觀察到的相同(也就是3∶1)。此外，非洲和亞洲后裔患有該疾病的比例似乎比白種人后裔高三倍。
SLE的病因仍然不為人知。已經(jīng)有人提出，遺傳易感性、性激素的系統(tǒng)性增加以及各種環(huán)境誘因例如病毒感染在誘發(fā)該疾病的典型特征即免疫反應(yīng)異常方面具有一定作用。在SLE患者之中，兩種組織相容性抗原HLA-DR2和HLA-DR3的百分比提高，這暗示了遺傳的作用。此外，在被感染的個(gè)體中，擴(kuò)展單體型HLA-A1、B8和DR3的頻率提高。在同卵雙胞胎中，該疾病的一致性(concordance)進(jìn)一步支持了遺傳的作用。但是，該一致性比例也暗示了這種遺傳易感性的多基因?qū)傩砸约碍h(huán)境因素的作用，據(jù)報(bào)道，該一致性比例在25％到60％之間，僅僅是中等水平。
SLE精確的發(fā)病原因仍然不為人知。但是一般認(rèn)為，該疾病的大部分臨床表現(xiàn)是直接或間接地由自身抗體的產(chǎn)生和后續(xù)的致病免疫復(fù)合物的形成而導(dǎo)致的。這些由調(diào)節(jié)失常的B淋巴細(xì)胞所產(chǎn)生的自身抗體具有不同的特異性，識(shí)別不同的核自身抗原，包括DNA、核小體、亞核小體(subnucleosome)等。某些RNA/蛋白質(zhì)復(fù)合物，包括Sm抗原以及核內(nèi)小核糖核蛋白(snRNP)，是另外的特征性自身抗原種類(specificities)。致病免疫復(fù)合物通過(guò)自身抗體與其相應(yīng)的核自身抗原相結(jié)合而形成。
SLE患者的自身抗體通常與其相應(yīng)的自身抗原相結(jié)合并以免疫復(fù)合物(IC)的形式參加循環(huán)。在小鼠和人中，染色質(zhì)或染色質(zhì)片段例如DNA、核小體或亞核小體微粒是特別常見的自身抗原種類(Tan，E.Adv.Immunol.44，93-151(1989)；Monestier andNovick，Mol.Immunol.3389-99，1996)。
因此在SLE的治療中，最核心的目的或者是努力抑制功能失常的B淋巴細(xì)胞從而減少自身抗體的生產(chǎn)，或者是在免疫復(fù)合物一旦形成后，努力減少其致病性。目前，這些目的只能通過(guò)利用廣譜系統(tǒng)性免疫抑制藥物進(jìn)行治療而實(shí)現(xiàn)，但通常不能完全實(shí)現(xiàn)這些目的，其中所采用的藥物例如可的松、硝基咪唑硫嘌呤、羥化氯喹以及環(huán)磷酰胺。這些療法往往會(huì)有多種嚴(yán)重的不良副作用，包括感染、不育、視網(wǎng)膜病以及癌癥。因此，人們很希望獲得治療SLE以及其他自身免疫疾病的新方法。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的目的是提供用于治療免疫復(fù)合物相關(guān)疾病(ICAD)的方法和組合物，用于患有ICAD的受試者或者ICAD高危受試者，ICAD的實(shí)例包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、丙型肝炎相關(guān)的免疫復(fù)合物疾病(例如冷球蛋白血癥)。
我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，含有染色質(zhì)的免疫復(fù)合物通過(guò)一個(gè)雙受體結(jié)合過(guò)程而活化B細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。在這兩種細(xì)胞中均涉及Toll樣受體(Toll-like receptor，以下簡(jiǎn)稱為TLR)。TLR9位于胞漿的囊泡內(nèi)，是細(xì)胞活化所必需的第二個(gè)受體。對(duì)于B細(xì)胞而言，B細(xì)胞抗原受體位于細(xì)胞表面，是細(xì)胞活化所必需的第一個(gè)受體。對(duì)于樹突狀細(xì)胞而言，刺激性Fc gamma受體位于細(xì)胞表面，是細(xì)胞活化所必需的第一個(gè)受體。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一種治療ICAD的方法，給予需要治療的個(gè)體一種具有如下屬性的化合物或者1)抑制免疫復(fù)合物(也就是自身抗體和核自身抗原)的形成，其或者通過(guò)阻止其形成，和/或通過(guò)與Toll樣受體(TLR)相結(jié)合而實(shí)現(xiàn)上述功能；或者2)干擾含有自身抗原的免疫復(fù)合物(或其抗原成分)與TLR相結(jié)合；或者3)抑制由BCR和TLR(在B細(xì)胞中)或FcR和TLR(在樹突狀細(xì)胞中)雙結(jié)合(通過(guò)免疫復(fù)合(complexed)或未復(fù)合的自身抗原)所啟動(dòng)的信號(hào)通路。在給藥時(shí)，將該化合物置于藥學(xué)上可以接受的載體中。
ICAD優(yōu)選為SLE、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或丙型肝炎相關(guān)的免疫復(fù)合物疾病(例如冷球蛋白血癥)。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述ICAD與器官移植后宿主的免疫反應(yīng)有關(guān)。
雖然并不想受理論上的限制，但是我們相信含有自身抗原(例如染色質(zhì))的免疫復(fù)合物(immune complexes，以下簡(jiǎn)稱為IC)，而不是含有外源抗原的IC，能夠活化自身反應(yīng)性B細(xì)胞，并且這種活化完全依賴于含有自身抗原的IC與B細(xì)胞的B細(xì)胞受體或樹突狀細(xì)胞的FcγR以及第二種受體(一種Toll樣受體)順序結(jié)合的能力。這一發(fā)現(xiàn)在先天性免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)之間建立了一種新的聯(lián)系，并進(jìn)而建立了一種一般性機(jī)制，對(duì)蛋白質(zhì)/核酸自身抗原具有特異性的自身反應(yīng)性B細(xì)胞通過(guò)該機(jī)制而被活化。
本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種治療患有ICAD的受試者或者ICAD高危受試者的方法，包括鑒定出一位患有ICAD的個(gè)體，并給予有效量的化合物，所述化合物能夠抑制自身抗原或自身抗原/免疫復(fù)合物的形成和/或抑制自身抗原或自身抗原/免疫復(fù)合物激活B細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞。
ICAD或系統(tǒng)性自身免疫疾病的高危人包括至少有一位父母、祖父母或兄妹患有ICAD或系統(tǒng)性自身免疫疾病的個(gè)體。
所述化合物選自一個(gè)組，所述的組由與免疫復(fù)合物的組成成分相結(jié)合的化合物所構(gòu)成，這些化合物或者阻止所述免疫復(fù)合物的形成，或者阻止自身抗原活化Toll樣受體(TLR)。此類化合物包括Toll樣受體誘餌(decoys)，抑制MyD88活性的化合物，抑制免疫復(fù)合物成分的生產(chǎn)的化合物(例如反意核苷酸)，負(fù)顯性(dominant-negative)TLR，Toll樣受體拮抗劑，以及抑制信號(hào)通路的化合物，其中所述信號(hào)通路由免疫復(fù)合物或自身抗原片段與TLR的結(jié)合或相互作用而活化。較為理想的是，所述化合物與Toll樣受體TLR2、TLR3、TLR9或其功能性結(jié)構(gòu)域結(jié)合和/或抑制其功能。更為理想的是，所述TLR是TLR3、TLR9或其功能性片段。
與免疫復(fù)合物的組成成分相結(jié)合并阻止其形成或者阻止復(fù)合物與Toll樣受體相結(jié)合的化合物以及抑制MyD88信號(hào)傳導(dǎo)的化合物包括多克隆或單克隆抗體，能夠阻斷野生型TLR的活性或阻斷TLR介導(dǎo)的信號(hào)級(jí)聯(lián)成分的負(fù)顯性蛋白質(zhì)，抑制性寡聚脫氧核苷酸(ODN)例如S-ODN 2088(Lenart，et al.，AntisenseNucleic Acid Drug Dev.4，247-256(2001))，翻譯核苷酸(包括RNA和經(jīng)修飾的核苷酸)，或其他的通路特異性激酶抑制劑。所述化合物中不包括氯奎。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了篩選能抑制復(fù)合物形成或與Toll樣受體結(jié)合和/或抑制B細(xì)胞/樹突狀細(xì)胞活化的化合物或試劑的方法。所述方法包括將免疫復(fù)合物成分與待測(cè)試劑相接觸，并檢測(cè)B細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞的活化和/或增殖和/或復(fù)合物與Toll樣受體的結(jié)合。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了診斷ICAD的方法。該方法包括從被懷疑患有ICAD的個(gè)體身上提取生物樣品，其中含有IgG；將所述生物樣品與RF+B細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞一起進(jìn)行培養(yǎng)；測(cè)定RF+B細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞活化，其中，與暴露于來(lái)自對(duì)照個(gè)體的含有IgG的生物樣品的RF+B細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞相比，暴露于從被懷疑患有ICAD的個(gè)體身上提取的生物樣品的RF+B細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞活性的變化表明患有ICAD。較為理想的是，該變化是活性的增加?？梢詼y(cè)定B細(xì)胞的活化，例如通過(guò)測(cè)定B細(xì)胞的增殖或者各種共刺激分子(例如CD80或CD86)的表達(dá)或MHC II類分子的上調(diào)節(jié)。樹突狀細(xì)胞的活化可以通過(guò)多種方式加以評(píng)估，例如通過(guò)測(cè)定共刺激分子的表達(dá)，細(xì)胞因子例如TNF-α的生產(chǎn)，或者樹突狀細(xì)胞表現(xiàn)型的變化。
在有一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種體內(nèi)模型系統(tǒng)，用于評(píng)價(jià)化合物或者試劑在治療ICAD方面的功效。該模型系統(tǒng)包括給ICAD模型動(dòng)物(包括小鼠和大鼠模型)服用一種待測(cè)試劑，并測(cè)定在此類動(dòng)物中B細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞的活化和/或增殖和/或復(fù)合物與Toll樣受體的結(jié)合，其中，如果活化減少則表明該試劑能夠治療ICAD。可選地，人們可以使用表達(dá)Toll樣受體的細(xì)胞系，并篩選調(diào)節(jié)(最好是抑制或阻斷)此類受體的化合物。
本發(fā)明的其他方面將在下面進(jìn)行描述。


附圖被插入到本申請(qǐng)的說(shuō)明書中，并構(gòu)成了本申請(qǐng)說(shuō)明書的一部分；附圖與說(shuō)明書一起解釋了本發(fā)明的實(shí)施方式，用于解釋和說(shuō)明本發(fā)明的目的、優(yōu)點(diǎn)以及原理。在附圖中，圖1表明AM14 RF+B細(xì)胞的抗核小體抗體(PL2-3)刺激對(duì)Dnase敏感。IgG2a抗核小體抗體與從培養(yǎng)物的B細(xì)胞中釋放出來(lái)的染色質(zhì)相結(jié)合，以形成免疫復(fù)合物，所述免疫復(fù)合物可由B細(xì)胞通過(guò)其IgG2a特異性抗原受體所識(shí)別。在加入山羊抗小鼠IgM F(ab′)2，PL2-3(IgG2aj抗核小體mAb)或LPS之前，將AM14RF+脾細(xì)胞與不同濃度的DNase I(0，5，15或50μg/ml)預(yù)培養(yǎng)15分鐘。結(jié)果表示為在Dnase不存在的情況下對(duì)每種配體最大反應(yīng)的百分比。
圖2A-2B表明抗TNP/TNP-BSA IC不能有效地刺激AM14RF+B細(xì)胞的增殖。將抗TNP mAbs Hy1.2(IgG2aa)和C4010(IgG2ab)與不同濃度的TNP-BSA[50μg/ml(圓圈)，12.5μg/ml(正方形)，3.1μg/ml(上三角形)]相混合，以便形成抗體/蛋白質(zhì)比例分別為1∶1、4∶1和16∶1的IC。在圖2A中，通過(guò)Clq結(jié)合活性相對(duì)于未復(fù)合抗體(下三角形)的偏移而確認(rèn)IC的形成。在圖2B中，將上述抗TNP/TNP-BSA IC刺激RF+B細(xì)胞增殖的能力與抗核小體mAb PR1-3、未復(fù)合的Hy1.2、C4010或50μg/mlTNP-BSA所誘導(dǎo)的刺激相比較。
圖3表明，RF+B細(xì)胞的自身抗體/自身抗原IC刺激不依賴于補(bǔ)體受體。利用山羊抗小鼠IgM F(ab′)2、CpG S-ODN 1826、抗核小體mAbs PR1-3(IgG2aj)、PL2-3(IgG2aj)、PL2-8(IgG2b)或來(lái)自代表性自身免疫小鼠(lpr/gld和gld)的3％血清來(lái)刺激來(lái)自兩種WT對(duì)照小鼠(灰色)、RF+CR+/+小鼠(白色)以及RF+CR-/-小鼠(陰影線)的脾細(xì)胞。
圖4A-4C表明，RF+B細(xì)胞的autoAb/autoAg-IC刺激依賴于MyD88。在圖4A中，利用B220和個(gè)體基因型特異性抗體4G7對(duì)來(lái)自野生型(WT)和RF+MyD88-/-小鼠的被去除T的脾細(xì)胞進(jìn)行染色。在圖4B中，通過(guò)PCR對(duì)MyD88 WT或敲除小鼠進(jìn)行鑒定。在圖4C中，利用抗IgM F(ab′)2、CpG S-ODN 1826、抗核小體mAbs PR1-3、PL2-3、PL2-8或3％lpr/gld血清來(lái)刺激來(lái)自兩種WT(灰色)、RF+MyD88+/+(白色)以及RF+MyD88-/-小鼠(陰影線)的脾細(xì)胞。抗IgM刺激的培養(yǎng)物的總cpm為83,414/39,049(WT)；93,126/61,315(RF+MyD88+/+)以及39,826/57,484(RF+MyD88-/-)。結(jié)果被表示為抗IgM反應(yīng)的百分比，并代表了四個(gè)分開進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。
圖5A-5C表明，RF+B細(xì)胞的autoAb/autoAg-IC刺激可以被TLR9信號(hào)通路的抑制劑所阻斷。在圖5A中，在加入刺激性配體抗IgM F(ab′)2、5-50μg/ml PL2-3、0.3-2.0μlg/ml CpG S-ODN1826、LPS脂肽或孔蛋白B之前，將RF+B細(xì)胞與1或2μg/ml的氯奎(a)預(yù)培養(yǎng)15分鐘，與concanamycin B(b)預(yù)培養(yǎng)2小時(shí)，或與抑制性CpG S-ODN 2088(c)預(yù)培養(yǎng)30分鐘。在圖5B中，在加入刺激性配體之前，將RF+B細(xì)胞與12μg/ml的CpG S-ODN 2088預(yù)培養(yǎng)30分鐘。結(jié)果被表示為在抑制劑不存在的情況下抗IgM反應(yīng)的百分比。圖5A和圖5C中的數(shù)據(jù)代表了2-4個(gè)試驗(yàn)，而圖5B是兩個(gè)試驗(yàn)的平均值。
圖6A-B示出了試驗(yàn)結(jié)果，在所述試驗(yàn)中，MyD88-缺陷型(MyD88-/-)Fas-充足小鼠與MyD88-充足(MyD88+/+)Fas-缺陷型(lprlpr)自身免疫小鼠雜交，以產(chǎn)生MyD88-/-lpr/lpr小鼠以及合適的對(duì)照組。按照前述方法(Rifkin et al.，Journal of Immunology.1615164-5170，1998)以HEp-2細(xì)胞為底物，通過(guò)間接免疫熒光法檢測(cè)年齡匹配的MyD88+/+lprlpr(圖6A)和MyD88-/-lpr/lpr(圖6B)同窩小鼠(12-13周齡)血清中的抗核抗體(ANA)。來(lái)自患病的自身免疫M(jìn)RL-lpr/lpr小鼠的血清作為陽(yáng)性對(duì)照，來(lái)自非自身免疫BALB/c小鼠的血清作為陰性對(duì)照。該體內(nèi)試驗(yàn)證明，在廣泛使用的標(biāo)準(zhǔn)狼瘡小鼠模型株系中，自身抗體的產(chǎn)生需要通過(guò)MyD88的信號(hào)傳導(dǎo)。這強(qiáng)烈暗示，在該模型中TLR的活化對(duì)狼瘡的發(fā)展是必需的。
在圖7A-7B表明，B細(xì)胞可通過(guò)TLR9而被活化，并且這種活化可以被ODN 2088導(dǎo)致的TLR9抑制所阻斷。B細(xì)胞從MRL+/+小鼠的脾臟中純化得到，并與不同劑量的ODN 2088(一種特異性地阻斷通過(guò)TLR9的信號(hào)傳導(dǎo)的抑制性寡聚脫氧核苷酸)預(yù)培養(yǎng)30分鐘，也可以不進(jìn)行上述的預(yù)培養(yǎng)操作。然后向培養(yǎng)物中加入通過(guò)B細(xì)胞受體發(fā)揮活化作用的抗IgM F(ab′)2(抗IgM)(7A)，或者通過(guò)TLR9發(fā)揮特異性活化作用的(7B)刺激性O(shè)DN 1826。在20-24小時(shí)之后，向培養(yǎng)物中加入3[H]胸腺嘧啶核苷，在另外的14-18小時(shí)之后，通過(guò)檢測(cè)胸腺嘧啶核苷的摻入而確定增殖，其中使用了LKB Wallac 1212 Rackbeta counter。只有通過(guò)TLR9的刺激被ODN 2088阻斷，這表明了抑制效果的特異性由B細(xì)胞受體交聯(lián)所誘導(dǎo)的刺激沒有被抑制。
圖8A-8C表明，樹突狀細(xì)胞可以通過(guò)TLR9被特異性地活化，并且這種活化可以被ODN 2088導(dǎo)致的TLR9抑制所阻斷。
圖9表明，ODN 2088對(duì)含有染色質(zhì)的免疫復(fù)合物所介導(dǎo)的B細(xì)胞增殖的抑制性效果是長(zhǎng)期的。B細(xì)胞從MRL+/+小鼠的脾臟中純化得到，并與12μg/ml的ODN 2088(一種特異性地阻斷通過(guò)TLR9的信號(hào)傳導(dǎo)的抑制性寡聚脫氧核苷酸)預(yù)培養(yǎng)16-20小時(shí)，也可以不進(jìn)行上述的預(yù)培養(yǎng)操作。在預(yù)培養(yǎng)之后沖洗細(xì)胞以便將ODN 2088從培養(yǎng)物中除去，然后培養(yǎng)B細(xì)胞，或者單獨(dú)用培養(yǎng)基培養(yǎng)，或者與新鮮的濃度為12μg/ml的ODN 2088一起培養(yǎng)。三十分鐘之后，向培養(yǎng)物中加入抗染色質(zhì)單克隆抗體PL2-3(50μg/ml)或LPS(10μg/ml)。在20-24小時(shí)之后，向培養(yǎng)物中加入3[H]胸腺嘧啶核苷，在另外的14-18小時(shí)之后，通過(guò)檢測(cè)胸腺嘧啶核苷的摻入而確定增殖，其中使用了LKB Wallac 1212Rackbeta counter。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供了用于治療和/或預(yù)防免疫復(fù)合物相關(guān)疾病(ICAD)的方法和組合物，用于患有ICAD的受試者或者ICAD高危受試者。
出于本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“免疫復(fù)合物相關(guān)疾病”(immunecomplex associated diseases)或“ICAD”的含義包括但不限于系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)以及相關(guān)的結(jié)締組織疾病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、丙型肝炎(Hepatitis-C)及乙型肝炎(Hepatitis-B)相關(guān)的免疫復(fù)合物疾病(例如冷球蛋白血癥)、貝切特氏病(Behcetsdisease)、自身免疫腎小球性腎炎(autoimmuneglomerulonephritides)以及與LDL/抗LDL免疫復(fù)合物的存在有關(guān)的血管病變等疾病。
我們發(fā)現(xiàn)，含有自身抗原(例如染色質(zhì))的免疫復(fù)合物(immune complexes，以下簡(jiǎn)稱為IC)，而不是含有外源抗原的IC，能夠活化自身反應(yīng)性B細(xì)胞，并且這種活化依賴于含有自身抗原的IC與B細(xì)胞受體和第二種受體(一種Toll樣受體)順序結(jié)合的能力。這一發(fā)現(xiàn)在先天性免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)之間建立了一種新的聯(lián)系，并進(jìn)而建立了一種一般性機(jī)制，對(duì)蛋白質(zhì)/核酸自身抗原具有特異性的自身反應(yīng)性B細(xì)胞通過(guò)該機(jī)制而被活化。
Toll樣受體(TLRs)是一個(gè)膜結(jié)合受體蛋白質(zhì)家族，它們?cè)谙忍煨悦庖叻磻?yīng)中具有重要作用，識(shí)別與病原體有關(guān)的、看來(lái)是微生物所特有的分子模式(molecular patterns)或決定簇(determinants)，并且參與活化免疫細(xì)胞以對(duì)抗這些微生物微粒的來(lái)源。
Toll樣受體家族在其胞外結(jié)構(gòu)域上具有富含亮氨酸的重復(fù)序列，在其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域上具有Toll/IL-1受體同源結(jié)構(gòu)域。Toll家族在進(jìn)化上是高度保守的。第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的成員是toll基因的產(chǎn)物，它是與果蠅Drosophila melanogaster早期發(fā)育階段背腹極性形成有關(guān)的信號(hào)通路的一部分。
目前已經(jīng)鑒定出了十種哺乳動(dòng)物同源體，稱為TLR1到TLR10。IL-1受體和TLRs具有相似的下游效應(yīng)，例如免疫反應(yīng)基因的活化；所有這些受體都通過(guò)信號(hào)級(jí)聯(lián)(包括適配蛋白MyD88)(Mussio et al.，Science 2781612；Wesche et al.，Immunity7837)發(fā)揮作用，此前MyD88被描述為髓樣分化蛋白(Lord etal.，Oncogene 51095)。一般認(rèn)為，不同的TLRs通過(guò)不同類型的微生物微?；罨?Hemmi et al.，Nature 408740-745(2000)；Underhill et al.，Nature 40239-43(1999)；Aliprantis et al.，EMBOJ.，193325-3336(2000))。但是有越來(lái)越多的證據(jù)表明，除了微生物微粒以外，哺乳動(dòng)物的TLRs也可以識(shí)別某些自身(哺乳動(dòng)物)抗原，更具體地說(shuō)，是細(xì)胞死亡所產(chǎn)生的、從細(xì)胞中釋放出來(lái)的胞漿成分(Akira et al.，Nat.Immunol.，2675-680(2000))。
此處，術(shù)語(yǔ)“Toll樣受體”的含義包括完整的Toll樣受體，例如在Online Mendelian Inheritance in Man中所描述的登記號(hào)如下的Toll樣受體*601194 TOLL樣受體1，TLR1；*603028 TOLL樣受體2，TLR2；*603029 TOLL樣受體3，TLR3；*603030 TOLL樣受體4，TLR4；*603031 TOLL-LIKE RECEPTOR 5，TLR5；*605403 TOLL樣受體6，TLR6；*300365 TOLL樣受體7，TLR7；*300366 TOLL樣受體8，TLR8；*605474 TOLL樣受體9；TLR9；and*606270 TOLL樣受體10；TLR10或其功能性片段，例如Toll樣受體的可溶形式，也就是膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域已經(jīng)被去掉或已改變，在某些實(shí)施例中，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域也不存在，或者Toll樣受體的MyD88結(jié)合或相互作用片段，或者能夠與MyD88結(jié)合或發(fā)生相互作用的Toll樣受體類似物。更為優(yōu)選的TLR是TLR9。
通過(guò)在這方面所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，我們已經(jīng)確證了TLR9和含有染色質(zhì)的免疫復(fù)合物中的染色質(zhì)成分之間的相互作用很重要。但是，在SLE以及相關(guān)疾病中，免疫復(fù)合物通常由自身抗體和不同的RNA/蛋白質(zhì)抗原復(fù)合物所形成，所述RNA/蛋白質(zhì)抗原復(fù)合物包括Sm抗原以及核內(nèi)小核糖核蛋白(snRNP)(Tan，E.Adv.ImmunoL 44，93-151(1989))。此外，在免疫復(fù)合物相關(guān)疾病例如丙型肝炎中，致病的免疫復(fù)合物在抗體和含有RNA的病毒之間形成。已經(jīng)證實(shí)TLR3是雙鏈RNA的一種特異性受體(Alexopoulou，Nature.413，732-738(2001)。因此，可以合理地預(yù)測(cè)TLR3的結(jié)合在由這些含有RNA的免疫復(fù)合物所引發(fā)的活化過(guò)程中有重要作用。
優(yōu)選的TLR是TLR3或者TLR9，或者其功能性片段，或者與TLR3或TLR9同源并且能夠與MyD88結(jié)合或發(fā)生相互作用的片段。
根據(jù)本發(fā)明的較為有用的Toll樣受體也可以是融合受體，其中，Toll樣受體與另一種蛋白質(zhì)例如Myc-tag相融合。優(yōu)選的Toll樣受體包括Toll樣受體2或Toll/白細(xì)胞介素1樣受體4(Toll/Interleukin-1 receptor-like 4)(Chaudhary，et al.，Blood 914020-4027，1998)，Toll樣受體3(Rock，et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.95588-593，1998)，Toll樣受體9(Chuang and Ulevitch，Europ.Cytokine Netw.11372-378，2000；Du，et al.，Europ.Cytokine Netw.11362-371，2000)，或者其功能性片段，或者具有類似功能(例如與MyD88相結(jié)合)的同源物。
此處所使用的術(shù)語(yǔ)“治療”包括(1)阻止受試者感染此類疾病，其中，所述的受試者對(duì)于此類疾病易感，但尚未被診斷為患有所述疾?。?2)抑制此類疾病，也就是阻止其發(fā)展；或者(3)改善或者緩解此類疾病的癥狀，也就是引發(fā)患病狀態(tài)的消退。
這些化合物優(yōu)先抑制B細(xì)胞(BC)或樹突狀細(xì)胞(DC)的活化，在下面所討論的體外或體內(nèi)試驗(yàn)中，其抑制作用至少為約50％。這些化合物更為優(yōu)先地抑制B細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞通過(guò)Toll樣受體的自身抗原活化，其抑制作用為75％，最為的是95％。在篩選試驗(yàn)中，還鑒定并測(cè)試了其他一些化合物，下面將對(duì)其進(jìn)行更為詳細(xì)的討論。
根據(jù)本發(fā)明的較為有用的化合物選自一個(gè)組，所述的組由與免疫復(fù)合物或Toll樣受體的組成成分相結(jié)合的化合物所構(gòu)成。這些化合物或者阻止所述免疫復(fù)合物的形成；阻止自身抗原或者所述免疫復(fù)合物的自身抗原片段，使其不能活化Toll樣受體(TLR)，或者阻止源自Toll樣受體的下游分子信號(hào)傳導(dǎo)，例如通過(guò)MyD88介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)。此類化合物包括Toll樣受體誘餌(decoys)，抑制MyD88活性的化合物，抑制免疫復(fù)合物成分的生產(chǎn)的化合物(例如反意核苷酸)，負(fù)顯性TLR，Toll樣受體拮抗劑或阻斷劑(例如ODN 2088或抗TLR的抗體)，以及抑制信號(hào)通路的化合物，其中所述信號(hào)通路由免疫復(fù)合物的自身抗原片段與TLR的結(jié)合或相互作用而活化。較為理想的是，所述化合物與Toll樣受體TLR2、TLR3、TLR9或其功能性結(jié)構(gòu)域結(jié)合和/或抑制其功能。更為理想的是，所述TLR是TLR3、TLR9或其功能性片段。
本發(fā)明還提供了有效的篩選方法，以鑒定藥理學(xué)試劑(pharmacological agents)或者抑制免疫復(fù)合物(或其自身抗原成分)與TLR結(jié)合的試劑的先導(dǎo)化合物(lead compound)，優(yōu)選為TLR2、TLR3、TLR9或其任意組合，最為優(yōu)選的是TLR3或TLR9。所述方法適用于自動(dòng)化的較為經(jīng)濟(jì)的高通量藥物篩選，并且在很多藥物發(fā)展項(xiàng)目中有直接的應(yīng)用。
一般來(lái)講，這些篩選方法涉及對(duì)化合物的試驗(yàn)，其中所述化合物調(diào)節(jié)與TLR的自身抗原相互作用，優(yōu)選為TLR2、TLR3、TLR9或其任意組合，最為優(yōu)選的是TLR3或TLR9。同樣，更為理想的是，所述化合物調(diào)節(jié)與TLR9的自身抗原相互作用。還提供了多種用于結(jié)合試劑(binding agents)的試驗(yàn)，包括標(biāo)記式體外蛋白-蛋白結(jié)合試驗(yàn)，免疫試驗(yàn)，基于細(xì)胞的試驗(yàn)等。
體外結(jié)合試驗(yàn)中使用一種由多種成分構(gòu)成的混合物，包括TLR多肽，優(yōu)選為TLR2、TLR3、TLR9或其任意組合，最為優(yōu)選的是TLR3或TLR9，更進(jìn)一步優(yōu)選的是TLR9，它可以是與另一種肽或多肽所形成的融合產(chǎn)物的一部分，例如用于檢測(cè)或錨定的標(biāo)簽。試驗(yàn)中所采用的上述混合物中也可以包含天然的細(xì)胞內(nèi)TLR結(jié)合靶標(biāo)，例如MyD88。雖然可以使用天然的全長(zhǎng)結(jié)合靶標(biāo)，但通常較為優(yōu)選的是使用其某些部分(例如肽)，只要所述的部分提供了與受試者M(jìn)yD88多肽的結(jié)合親和力(affinity andavidity)并且所述親和力在試驗(yàn)中可以很方便的測(cè)量即可。試驗(yàn)中所采用的混合物中也可以包含候選的藥理學(xué)試劑。候選試劑覆蓋多種化學(xué)類別，雖然它們通常是有機(jī)化合物；較為優(yōu)選的是小分子有機(jī)化合物，可由多種來(lái)源獲得，包括合成化合物庫(kù)或天然化合物庫(kù)。所述混合物中也可以包含很多其他試劑。這些試劑包括鹽、緩沖劑、中性蛋白(例如清蛋白)、去污劑、蛋白酶抑制劑、核酸酶抑制劑、抗菌劑等。
所獲得的混合物在一定條件下(在候選藥理學(xué)試劑的存在下)進(jìn)行溫育，使得TLR多肽與細(xì)胞的結(jié)合靶標(biāo)、部分或類似物以參考值的結(jié)合親和力發(fā)生特異性的結(jié)合。所述混合物的成分可以以任何適當(dāng)?shù)捻樞蚣尤耄芴峁┍匦璧慕Y(jié)合；溫育可以在任何有利于使結(jié)合效果最佳的溫度下進(jìn)行。同樣可以對(duì)溫育時(shí)間進(jìn)行選擇，以便使結(jié)合效果最佳，但也應(yīng)使之盡量的短，以便有利于使篩選過(guò)程更快、產(chǎn)率更高。
在溫育之后，通過(guò)任何方便的手段將TLR多肽與一種或多種結(jié)合靶標(biāo)的結(jié)合檢測(cè)出來(lái)，其中所述結(jié)合是對(duì)試劑有選擇性的(agent-biased)。在不存在所述試劑的情況下所述TLR多肽對(duì)靶標(biāo)的結(jié)合親和力與存在所述試劑情況下的結(jié)合親和力之間的差別說(shuō)明，所述試劑調(diào)節(jié)TLR多肽與所述TLR結(jié)合靶標(biāo)之間的結(jié)合。類似地，在下面所描述的基于細(xì)胞的試驗(yàn)中，在試劑存在和不存在的情況下TLR依賴型轉(zhuǎn)錄活化之間的差別說(shuō)明所述試劑調(diào)節(jié)TLR的功能，例如與MyD88的結(jié)合。此處所使用的術(shù)語(yǔ)“差別”是指在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性，并且優(yōu)選為代表至少50％，更優(yōu)選為至少75％，再進(jìn)一步優(yōu)選為至少90％的差別。
在檢驗(yàn)藥理學(xué)試劑阻斷B細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞活化的能力的優(yōu)選試驗(yàn)中，包括RF+B細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞，將其與待測(cè)試劑和TLR刺激劑例如PR1-3、PL2-3或CpG S-ODN 1826(參見Leadbetter et al.，Nature，416603-607，2002)在適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行溫育。可以在加入刺激劑之前或者在加入刺激劑的同時(shí)，進(jìn)行與待測(cè)試劑的溫育。
可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多種技術(shù)觀察到B細(xì)胞的活化。例如，可以通過(guò)3[H]胸腺嘧啶核苷摻入試驗(yàn)檢測(cè)B細(xì)胞的增殖?；蛘咭部梢酝ㄟ^(guò)熒光激活細(xì)胞分類術(shù)(FACS)分析B細(xì)胞的活化，以檢測(cè)某些物質(zhì)在細(xì)胞表面的表達(dá)，例如CD80、CD86或MHC II類分子。樹突狀細(xì)胞的活化可以通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞因子，例如TNF-α、干擾素α、IL-12以及BAFF，或者共刺激分子，例如CD80、CD86或MHC II類分子，的生產(chǎn)而觀察到(Banchereau，et al.，Annu.Rev.Immunol.18767-811，2000；Mackay andBrowning，Nat.Rev.Immunol.2465-475)。
樹突狀細(xì)胞的活化也可以通過(guò)檢測(cè)DC的形態(tài)變化而觀察到(Banchereau，et al.，Annu.Rev.Immunol.18767-811，2000)。
如果對(duì)表達(dá)(例如共刺激分子)的刺激由于加入了待測(cè)試劑而減小，那么就可以認(rèn)為該待測(cè)試劑是一種可能用于治療ICAD的試劑。與未加入待測(cè)試劑的細(xì)胞樣品相比，如果表達(dá)量減少了至少約50％，更優(yōu)選為至少約60-75％，最優(yōu)選為至少約90％，那么可以認(rèn)為表達(dá)量減少了。更具體的細(xì)節(jié)將在本部分末尾的實(shí)施例部分中給出。
在實(shí)施例中描述了本發(fā)明優(yōu)選的試驗(yàn)混合物。本發(fā)明的試驗(yàn)混合物中也包含候選的藥理學(xué)試劑。一般來(lái)講，多種試驗(yàn)混合物與不同濃度的候選試劑平行地進(jìn)行試驗(yàn)，以便獲得對(duì)各種濃度的不同反應(yīng)。典型地，以這些試驗(yàn)混合物中的一種作為對(duì)照，也就是濃度為零或者在試驗(yàn)所能檢測(cè)的限度以下。候選試劑覆蓋多種化學(xué)類別，雖然它們通常是有機(jī)化合物，較為優(yōu)選的是小分子有機(jī)化合物。例如，較為合適的小分子有機(jī)化合物的分子量可以大于約50但小于約2,500。候選試劑可以包含與蛋白質(zhì)和/或DNA相互作用的化學(xué)官能團(tuán)。
候選試劑由多種來(lái)源獲得，包括合成化合物庫(kù)或天然化合物庫(kù)。例如，現(xiàn)有多種手段用于隨機(jī)地或定向地合成很多有機(jī)化合物和生物分子，包括隨機(jī)化寡核苷酸和肽的表達(dá)。作為另一種選擇，細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物提取物形式的天然化合物庫(kù)也可以得到，或者可以很容易地生產(chǎn)出來(lái)。庫(kù)可以由較小的多肽(參見例如Lam et al.，Nature，35482，1991以及WO92/00091；Geysenet al.，J Immunol Meth，102259，1987；Houghten et al.，Nature，35484，1991以及WO92/09300以及Lebl et al.，Int J Pept Prot Res，41，201，1993)。作為另一種選擇，非肽小分子庫(kù)可以基于共同的模板或核心結(jié)構(gòu)(例如，苯并二氮模板參考Ellman and Bunin，JAmer Chem Soc，11410997，1992；唑酮和aminidine模板參考WO95/32184；苯并二氫吡喃(dihydrobenzopyran)模板參考WO95/30642，四氫吡咯模板參考WO95/35278)。
此外，可以通過(guò)常規(guī)的化學(xué)、物理以及生物化學(xué)手段很容易地對(duì)天然的以及合成的庫(kù)和化合物進(jìn)行修飾。而且，可以對(duì)已知的藥理學(xué)試劑進(jìn)行定向的或隨機(jī)的化學(xué)修飾，例如?；?、烷基化、酯化、amidification等。
抗體，以及能夠與免疫復(fù)合物成分相結(jié)合并阻止形成或TLR結(jié)合的所述抗體的結(jié)合片段或適體(aptamers)(例如可從SomaLogic Inc.，Boulder，CO獲得)也是有用的。根據(jù)本發(fā)明的有用的抗體實(shí)例包括抗TLRs的單克隆抗體，例如抗TLR3的單克隆抗體(Matsumoto et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，2931364-1369，2002)，抗TLR-9(Toll樣受體9，Imgenex，圣地亞哥，加利福尼亞州)或其人化版本(humanized versions)。
此處所使用的術(shù)語(yǔ)“負(fù)顯性Toll樣受體”是指被工程化從而具有某種缺陷，例如下游信號(hào)傳導(dǎo)所需的結(jié)構(gòu)域缺失，但能結(jié)合免疫復(fù)合物的抗原部分的Toll樣受體。
抗體及其結(jié)合片段可以是多克隆的或單克隆的，但優(yōu)選為單克隆的。如果是多克隆的，那么抗體的形式可以是抗血清或者單一特異性的抗體，例如用經(jīng)純化的蛋白質(zhì)免疫動(dòng)物而制得的純化的抗血清。但是優(yōu)選為單克隆抗體，以便使給予個(gè)體的外源蛋白質(zhì)最少?？梢愿鶕?jù)公知的試驗(yàn)方法制備單克隆抗體。參見例如Skare et al.，J Biol.Chem.26816302-16308(1993)；以及美國(guó)專利4,918,163和5,057,598，此處以引用的方式將其包括在本文中?？贵w可以是完整抗體、Fab′s、單鏈、單結(jié)構(gòu)域重鏈等。單鏈抗體是優(yōu)選的。在美國(guó)專利4,946,778中詳細(xì)地描述了單鏈結(jié)合多肽的制備方法，此處以引用的方式將其包括在本文中。
當(dāng)使用抗體或其他蛋白質(zhì)或肽時(shí)，肽最好與載體相偶聯(lián)，所述載體的實(shí)例包括生物素或聚堿性氧化物(例如聚乙二醇)。可以使用多種聚合物，例如葡聚糖、聚乙烯基砒絡(luò)烷酮、多糖、淀粉、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺或其他類似的聚合物。聚堿性氧化物(poly(alkylene oxide))可以包括單甲氧基聚乙二醇、聚乙二醇、聚乙二醇嵌段共聚物等。作為聚堿性氧化物的聚乙二醇是優(yōu)選的。聚合物的末端也可以由C1-4的烷基而不是單甲氧基進(jìn)行加帽(capped)。
對(duì)于人類的給藥而言，例如作為體內(nèi)治療組合物的一種成分，單克隆抗體最好基本是人源的或者是人化的以便使免疫原性最小，并且最好基本是純凈的?！盎臼侨嗽吹摹笔侵杆鼋M合物的免疫球蛋白部分通常含有至少約70％人類抗體序列，優(yōu)選為至少約80％人類抗體序列，最優(yōu)選為至少約90-95％或更大比例的人類抗體序列。
在治療實(shí)踐中，所述化合物可以被適當(dāng)?shù)亟o予受試者例如哺乳動(dòng)物，特別是人，可以單獨(dú)給予或者作為藥物組合物的一部分給予，所述藥物組合物中包含所述化合物以及一種或多種可接受的載體以及可以選擇加入的其他治療成分。所述載體在與制劑的其他成分相容方面必須是“可以接受的”，并且對(duì)其接受者無(wú)害。
本發(fā)明的藥物組合物包括那些適用于口腔、直腸、鼻腔、局部(包括口腔和舍下)、陰道、非腸道(包括皮下、肌肉、靜脈內(nèi)以及皮下)、眼部(使用滴眼液)、經(jīng)肺給藥(使用氣霧劑化或霧狀藥物)的組合物。制劑可以以單位劑量的形式方便地給予，例如藥片和緩釋膠囊以及位于脂質(zhì)體中，可以通過(guò)制藥領(lǐng)域公知的任何方法制備這些制劑(參見例如RemingtonThe Science andPractice of Pharmacy by Alfonso R.Gennaro(Ed.)20th edition，December 15，2000，Lippincott，Williams & Wilkins；ISBN0683306472.)。
此類制備方法包括一個(gè)步驟，在該步驟中，使待給予的分子與諸如載體之類的成分相互聯(lián)系，其中所述成分構(gòu)成了一種或多種添加劑。一般來(lái)講，通過(guò)使活性成分與液態(tài)載體、脂質(zhì)體或粉碎得很細(xì)的固態(tài)載體或兩者均一而密切地相互聯(lián)系，從而制備所述組合物；然后，必要時(shí)可以對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行成形。
本發(fā)明適用于口腔給藥的組合物可以以不連續(xù)單位(discreteunits)的形式給予，例如膠囊、扁膠劑(cachets)或藥片，其中的每一個(gè)含有預(yù)定量的活性成分；可以作為粉末或顆粒；可以作為水性液體或非水性液體的溶液或懸濁液；或者作為水中油液體乳濁液或油中水液體乳濁液，或者包裝在脂質(zhì)體中，以及作為大藥丸等。
藥片可以通過(guò)擠壓或成型(molding)而進(jìn)行制備，可以選擇性地加入一種或多種輔助成分。擠壓的藥品可以通過(guò)在合適的機(jī)器中擠壓自由流動(dòng)形式(例如粉末或顆粒)的活性成分而獲得，可以選擇性地與粘合劑、潤(rùn)滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、表面活性劑或分散劑進(jìn)行混合。成型的藥品可以通過(guò)在合適的機(jī)器中對(duì)已用惰性液體稀釋劑潤(rùn)濕的粉末狀化合物進(jìn)行成型而獲得。可以選擇性地對(duì)藥品進(jìn)行包被或劃線；可以對(duì)其進(jìn)行配制，以便使其較慢地或持續(xù)地釋放其中所含有的活性成分。
適用于局部給藥的組合物包括錠劑(lozenges)，其中包含帶有味道的成分，通常是蔗糖、阿拉伯樹膠或黃蓍膠；以及軟錠劑(pastilles)，其中包含惰性成分，例如明膠和甘油，或者蔗糖以及阿拉伯樹膠。
適用于非腸道給藥的組合物包括水性和非水性的無(wú)菌注射溶液，其中可以含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑以及使得該制劑與預(yù)期服藥者的血液等滲的溶質(zhì)；水性和非水性的無(wú)菌懸濁液，其中可以包括懸浮劑和增稠劑。制劑可以以單位劑量或多劑量容器的形式給予，例如密封的安瓿和管形瓶；可以儲(chǔ)存在冰凍干燥(凍干)條件下，僅需要在馬上就要使用之前加入無(wú)菌的液態(tài)載體例如水以便用于注射?，F(xiàn)成可用的(Extemporaneous)注射溶液和懸濁液可以由無(wú)菌粉末、顆粒和藥片制得。
應(yīng)當(dāng)理解，在給定的治療中所使用的給定化合物的實(shí)際優(yōu)選量將會(huì)根據(jù)多種因素而有所變化，例如所使用的具體化合物，所配制的具體組合物，應(yīng)用方式，給藥的具體位置，患者的體重、一般健康狀況、性別等，有待治療的具體指征(indication)等，以及可以被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所認(rèn)知的其他此類因素，包括巡診醫(yī)師或獸醫(yī)。對(duì)于給定的給藥方案而言，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以通過(guò)常規(guī)的劑量確定試驗(yàn)而容易地確定最佳的給藥量。
本發(fā)明還提供了診斷個(gè)體是否患有ICAD的方法。該方法包括測(cè)定由Toll樣受體所介導(dǎo)的、由生物樣品所誘導(dǎo)的B細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞活化，其中，所述生物樣品中含有免疫復(fù)合物，所述免疫復(fù)合物由自身抗原和自身抗體所構(gòu)成。B細(xì)胞Toll樣受體的活化可以直接測(cè)定，例如通過(guò)測(cè)定B細(xì)胞的增殖、各種共刺激分子例如CD80或CD86的表達(dá)或MHC II類分子的上調(diào)節(jié)。樹突狀細(xì)胞Toll樣受體的活化可以通過(guò)多種方式測(cè)定，例如通過(guò)觀察經(jīng)/不經(jīng)特異性染色后樹突狀細(xì)胞的形態(tài)變化，或者通過(guò)測(cè)定共刺激分子例如CD80或CD86的表達(dá)，或者通過(guò)測(cè)定活化標(biāo)志物例如CD69的上調(diào)節(jié)，或者通過(guò)測(cè)定趨化因子例如CCR7的上調(diào)節(jié)，或者通過(guò)測(cè)定細(xì)胞因子例如TNF-α的生產(chǎn)，可以使用多種不同的技術(shù)，包括檢測(cè)mRNA或蛋白質(zhì)的水平。
例如，TNF-α表達(dá)的變化可以利用從樹突狀細(xì)胞中所分離到的RNA來(lái)加以測(cè)定。RNA定量方法包括基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的方法，例如TaqMan system(Applied Biosystems)，BrilliantQuantitative PCR(Stratagene)，Platinum quantitative PCR(Resgen，Inc.)。RNA是從生物樣品例如血液樣品中分離出來(lái)的，所述生物樣品來(lái)自被懷疑患有ICAD的個(gè)體。Toll樣受體mRNA的量利用諸如前面所列出的方法進(jìn)行測(cè)定，并與來(lái)自對(duì)照個(gè)體的樣品進(jìn)行比較。
較為理想的是，利用諸如FACS分析等試驗(yàn)來(lái)測(cè)定共刺激分子蛋白質(zhì)的表達(dá)。如果這些共刺激分子的表達(dá)量增加，那么就表明該個(gè)體已經(jīng)感染了ICAD。如果試驗(yàn)表明，與對(duì)照樣品相比，共刺激分子的量增加至少約5％，那么就認(rèn)為活性增加了。
或者，將來(lái)自被懷疑患有ICAD的待測(cè)個(gè)體的血清注射到細(xì)胞培養(yǎng)物中，所述細(xì)胞培養(yǎng)物表達(dá)功能性Toll樣受體通路。然后平行地測(cè)定經(jīng)對(duì)照血清和待測(cè)受試者的血清處理過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)物中Toll樣受體的活性。與經(jīng)對(duì)照血清處理的細(xì)胞相比，如果經(jīng)待測(cè)個(gè)體的血清處理過(guò)的細(xì)胞中的Toll樣受體活性增加，那么這說(shuō)明該個(gè)體已經(jīng)感染ICAD。如果與對(duì)照樣品相比表達(dá)量增加了至少約5％，那么就認(rèn)為表達(dá)量增加了。
應(yīng)當(dāng)理解，盡管本發(fā)明是參照其特定的優(yōu)選實(shí)施例來(lái)描述的，但是前面的描述以及后面要描述的實(shí)施例都是出于解釋和說(shuō)明的目的，而不是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，其他的方面、優(yōu)點(diǎn)和修改將是清楚明了的。
實(shí)施例1自身反應(yīng)性B細(xì)胞存在于健康個(gè)體的淋巴組織中，但通常處于靜止?fàn)顟B(tài)(quiescent)。當(dāng)這種動(dòng)態(tài)平衡被打破時(shí)，自身反應(yīng)性抗體的形成可能會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的病理效應(yīng)。表達(dá)對(duì)自身IgG具有特異性的抗原-受體的B細(xì)胞制造一類被稱為類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor，以下簡(jiǎn)稱為RF)的自身抗體。此處我們證明RF+B細(xì)胞的有效活化是通過(guò)IgG2a/染色質(zhì)免疫復(fù)合物介導(dǎo)的，并且需要所述抗原-受體和MyD88依賴型Toll樣受體家族成員的順序結(jié)合。這些數(shù)據(jù)在系統(tǒng)性自身免疫疾病的發(fā)展上，在先天性免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)之間建立了一種新的聯(lián)系，并解釋了對(duì)核酸/蛋白質(zhì)微粒具有反應(yīng)性的自身抗體為何占優(yōu)勢(shì)。這種雙結(jié)合通路(dual-engagement pathway)獨(dú)有的特性應(yīng)該有助于特異性地將自身反應(yīng)性B細(xì)胞作為靶標(biāo)的療法的發(fā)展。
目前我們已經(jīng)發(fā)展出了一種體外系統(tǒng)模型，用于分析在自身免疫疾病中自身反應(yīng)性B細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的活化所涉及的因子。在紅斑狼瘡易感性lpr小鼠中，一種常見的特異性自身抗體是類風(fēng)濕因子(RF)。RFs是能夠與自身IgG進(jìn)行反應(yīng)的抗體。在自身免疫的小鼠品系中，RF B細(xì)胞被活化，數(shù)量增多，并分化為可分泌抗體的細(xì)胞，但是在沒有自身免疫背景的小鼠中則沒有上述現(xiàn)象。為了研究該病理活化過(guò)程所涉及的機(jī)理，我們研究了從小鼠脾臟中獲得的原代RF+B細(xì)胞，此處所使用的小鼠已經(jīng)被基因工程化以表達(dá)一對(duì)轉(zhuǎn)基因，所述的轉(zhuǎn)基因可以使其具有對(duì)大部分B細(xì)胞有特異性的某種RF。這些B細(xì)胞是SLE患者體內(nèi)所發(fā)現(xiàn)的自身反應(yīng)性B細(xì)胞的原型。
最初的時(shí)候，我們證明了這些RF+B細(xì)胞被來(lái)自自身免疫小鼠的血清樣品所活化，但來(lái)自非自身免疫小鼠的血清不能使其活化(Rifkin et al，2000)。我們又進(jìn)一步證明了血清中的刺激因子實(shí)際上是IgG2a。但是，從非自身免疫的血清中所分離出來(lái)的數(shù)量相當(dāng)?shù)腎gG2a卻沒有刺激作用，這表明并不是所有的IgG2a都足以刺激RF+B細(xì)胞。因此，我們認(rèn)為自身免疫的血清中的IgG2a具有獨(dú)特的性質(zhì)。為了進(jìn)一步鑒定出有關(guān)的IgG2a成分，我們使用了IgG2a的單克隆抗體(mAbs)，并證明了對(duì)自身抗原，例如DNA-組蛋白復(fù)合物，有特異性的mAbs具有刺激作用，而對(duì)外源抗原或非自身抗原有特異性的抗體不具有刺激作用。
接下來(lái)我們考慮了自身抗體/自身抗原免疫復(fù)合物是相關(guān)成分的可能性。當(dāng)使用血清和mAbs的實(shí)驗(yàn)在DNAse的存在下進(jìn)行時(shí)，RF+B細(xì)胞的刺激被顯著減弱(圖1)。這些數(shù)據(jù)暗示，DNA骨架的斷裂導(dǎo)致了自身抗體/自身抗原(DNA)免疫復(fù)合物的解離。這清楚地表明自身抗原/自身抗體免疫復(fù)合物具有獨(dú)特的性質(zhì)，優(yōu)先活化自身反應(yīng)性B細(xì)胞。含有非自身抗原的免疫復(fù)合物不能活化自身反應(yīng)性B細(xì)胞，如圖2所示。
我們研究了自身抗體/自身抗原免疫復(fù)合物能夠與第二個(gè)受體相結(jié)合的可能性，而這種結(jié)合有助于RF B細(xì)胞的活化。最近的研究表明，被稱為Toll樣受體(TLR)的蛋白質(zhì)家族可以與細(xì)菌DNA相結(jié)合，并導(dǎo)致巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和B細(xì)胞的活化，因此，我們考慮了TLR在這些自身反應(yīng)性RF B細(xì)胞的活化中發(fā)揮作用的可能性。目前，TLR是一個(gè)很熱門的研究領(lǐng)域，已經(jīng)證明TLR與很多病原體相關(guān)分子模式(PAMPS)的結(jié)合和識(shí)別有關(guān)，因此，與先天性免疫反應(yīng)的這種關(guān)聯(lián)將是自身免疫的一種很獨(dú)特的聯(lián)系。所有已知的哺乳動(dòng)物TLR都通過(guò)適配器蛋白MyD88進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)。通過(guò)基因工程將小鼠的MyD88敲除，在這種小鼠中，TLR介導(dǎo)的活化被嚴(yán)重破壞，并且通過(guò)TLR9介導(dǎo)的信號(hào)被完全破壞。我們將RF+轉(zhuǎn)基因小鼠與MyD88-/-背景進(jìn)行雜交。所得到的小鼠對(duì)RF轉(zhuǎn)基因而言是陽(yáng)性的(圖4A)，但缺乏MyD88信號(hào)分子(圖4B)。
我們發(fā)現(xiàn)，RF MyD88-/-小鼠不能對(duì)任何一種能刺激RFMyD88+/+B細(xì)胞增殖的自身抗體做出反應(yīng)(參見圖4C)。我們測(cè)試了多種形式的自身抗體血清、抗核小體抗體和抗Sm抗體。這與如下假設(shè)是一致的，即自身抗體/自身抗原免疫復(fù)合物中含有重復(fù)模式成分(repeating pattern components)，例如DNA或RNA，其能與Toll受體在B細(xì)胞內(nèi)部(DNA/TLR9)或B細(xì)胞表面(RNA/TLR3)相結(jié)合。對(duì)于自身反應(yīng)性RF+B細(xì)胞而言，自身抗體/自身抗原免疫復(fù)合物可能與BCR和TLR順序結(jié)合，導(dǎo)致增強(qiáng)的活化和增殖。這是BCR和TLR的共結(jié)合(co-engagement)能夠?qū)е伦陨矸磻?yīng)性B細(xì)胞活化的第一個(gè)證據(jù)。這種聯(lián)系在自身免疫和人體的先天性免疫反應(yīng)之間提供了一種很獨(dú)特的聯(lián)系，可以為自身免疫疾病，例如SLE和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，中的很多病原反應(yīng)提供一種初始機(jī)制。
后續(xù)研究表明，已知的通過(guò)刺激性CpG ODN通過(guò)TLR9阻斷B細(xì)胞活化的藥物，例如氯奎及concanamycin A，能夠完全阻斷含有染色質(zhì)的IC刺激RF+B細(xì)胞的能力。這種反應(yīng)也可以被抑制性CpG ODN阻斷，而抑制性CpG ODN通過(guò)TLR9特異地抑制活化。這些數(shù)據(jù)表明，TLR9在自身反應(yīng)性B細(xì)胞的活化中是一個(gè)重要的受體。這些數(shù)據(jù)表明，免疫復(fù)合物中的IgG成分與BCR相結(jié)合，導(dǎo)致免疫復(fù)合物的內(nèi)化(internalization)以及向內(nèi)部囊泡的運(yùn)送。接下來(lái)，TLR9在該內(nèi)部囊泡中被IC的染色質(zhì)成分所結(jié)合，從而導(dǎo)致B細(xì)胞的活化。對(duì)生物利用度(availability)的增強(qiáng)以及由此而來(lái)的對(duì)染色質(zhì)本身的攝取(SLE的易感性因子)有貢獻(xiàn)的因子，也能通過(guò)類似的機(jī)制導(dǎo)致B細(xì)胞的活化。值得注意的是，抗染色質(zhì)的抗體是在SLE患者以及自發(fā)性SLE動(dòng)物模型的血清中可被最先檢測(cè)到的自身抗體。
實(shí)施例2受SLE和其他系統(tǒng)性自身免疫疾病困擾的患者會(huì)產(chǎn)生多種特異性自身抗體。這些自身抗體非常頻繁地結(jié)合到染色質(zhì)或其他亞細(xì)胞核酸/蛋白質(zhì)微粒上(Tan，E.Adv.Immunol.44，93-151(1989))。MRL/lpr小鼠是一種研究得較為透徹的用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的鼠類模型，它也產(chǎn)生非常高滴度的IgG抗IgG類風(fēng)濕因子(RF)(Theofilopoulos，et al.，J.Exp.Med.162，1-18(1985)；Wolfowicz，et al.，Clin.Immunol.Immunopath.46，382-395(1988))。這種RF反應(yīng)為研究自身抗體的調(diào)控提供了高度相關(guān)的轉(zhuǎn)基因模型。AM14轉(zhuǎn)基因小鼠種系的B細(xì)胞表達(dá)對(duì)IgG2aa/j具有特異性的抗原受體，其最初是從患病的MRL/lpr小鼠的脾臟中作為雜交瘤產(chǎn)品而獲得的(Shlomchik，et al.，Int.Immunol.5，1329-1341(1993))。AM14對(duì)于單體IgG2a的同種異型特異性和相對(duì)較低的親和力，對(duì)于與RF庫(kù)(repertoire)有關(guān)的疾病來(lái)說(shuō)是很典型的(Jacobson，et al.，J.Immunol.152，4489-99(1994))。在野生型小鼠中，AM14 RF+B細(xì)胞發(fā)育正常，并且保持功能上的幼稚狀態(tài)(naive)(Hannum，et al.，J.Exp.Med.184，1269-1278(1996))。但是，在同種異型的易發(fā)自身免疫lpr的背景下，它們被活化，發(fā)生增殖并且分泌自身抗體(Wang，andShlomchik，J Exp.Med.190，639-649(1999))。某些因子可能對(duì)于lpr小鼠的AM14 B細(xì)胞的活化具有一定作用，其中，自身抗原IgG2a的狀態(tài)起到了較為重要的作用。
RF+B細(xì)胞被自身抗體/自身抗原免疫復(fù)合物所活化前面我們已經(jīng)表明，AM14 RF+B細(xì)胞可以在體外被IgG2aa/j所活化，其中的IgG2aa/j是從自身免疫小鼠的血清中分離得到的；但是，水平相當(dāng)?shù)?、存在于野生型小鼠血清中的IgG2a卻不能將其活化(Rifkin，et al.，J.Immunol.165，1626-1633(2000))。我們也發(fā)現(xiàn)，RF+B細(xì)胞可以在對(duì)親和純化的對(duì)核小體(一種自身抗原)具有特異性的IgG2ajmAbs做出反應(yīng)時(shí)迅速增殖，但是，對(duì)于半抗原或其他外源抗原具有特異性的IgG2aa/jmAbs卻只能做出很弱的反應(yīng)(如果有的話)(Rifkin，et al.，J.Immunol.165，1626-1633(2000))。這些研究表明，由IgG2a核小體特異性mAbs和從共培養(yǎng)細(xì)胞中釋放出來(lái)的染色質(zhì)片段所形成的免疫復(fù)合物(IC)(Emlen，et al.，J.Immunol.148，3042-3048(1992))能夠有效地活化RF+B細(xì)胞，而單體狀態(tài)的抗半抗原IgG2a抗體卻不能。為了進(jìn)一步測(cè)試這一假設(shè)，向?qū)嶒?yàn)用培養(yǎng)基中加入DNase以破壞假定的IC。純化的抗核小體mAb PL2-3(Monestier and Novick.Mol.Immunol.33，89-99(1996))或自身免疫血清通常所能引發(fā)的強(qiáng)烈的增殖反應(yīng)被顯著減弱(圖1)。DNase非特異性的毒性并不是其中的一個(gè)因素，因?yàn)閷?duì)F(ab′)2抗-IgM和LPS的反應(yīng)并未受到影響(圖1)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了RF+B細(xì)胞對(duì)含有DNA的IgG2aIC做出反應(yīng)，而對(duì)單體狀態(tài)的IgG2a抗體不能單獨(dú)做出反應(yīng)。
如果IgG2a IC對(duì)RF+B細(xì)胞的活化僅僅是因?yàn)榭乖贵w交聯(lián)的效果比單體狀態(tài)的IgG2a可能的效果更好的話，那么常規(guī)的抗-半抗原/半抗原-蛋白質(zhì)復(fù)合物也應(yīng)該強(qiáng)烈地刺激RF+B細(xì)胞。為了解決這一問(wèn)題，將IgG2a抗TNP的單克隆抗體與不同濃度的TNP-BSA進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，從而制備ICs；通過(guò)Clq結(jié)合活性的增加而證實(shí)復(fù)合物的形成(圖2a)。正如原來(lái)所期望的那樣，C4010(一種IgG2ab抗TNP mAb)的IC，在各種抗TNP/TNP-BSA比例下均不能刺激RF+B細(xì)胞。令人意外的是，與含有抗核小體mAb的IC所引發(fā)的增殖反應(yīng)相比，Hy1.2(一種IgG2aa抗TNP mAb)的IC僅僅引發(fā)了很溫和的增殖反應(yīng)。這一差異表明，由IC所引發(fā)的RF+B細(xì)胞增殖的程度取決于抗體和(自身)抗原的性質(zhì)。
由IC所引發(fā)的活化不依賴于補(bǔ)體受體的共結(jié)合對(duì)于抗核小體IC和抗NTP IC在刺激能力上的這一巨大差異，一種可能的解釋是，只有前者能夠協(xié)同地與B細(xì)胞受體(BCR)和位于B細(xì)胞表面的第二個(gè)受體相結(jié)合。一種潛在的候選受體是補(bǔ)體受體CD21，因?yàn)橐呀?jīng)表明，補(bǔ)體成分可以與自身抗原IC相結(jié)合，并且理論上能夠與CD19/CD21和BCR有效地共結(jié)合(Carter et al.，J Immunol.141，457-463(1988))。但是，當(dāng)AM14重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因物(transgenics)被雜交(breed)到缺乏CR1/2Cr2的小鼠(Aheam，et al.Immunity 4，251-262(1996))中時(shí)，來(lái)自CR1/2-缺乏和CR1/2-充足的同窩小鼠的RF+B細(xì)胞對(duì)IgG2a抗核小體mAbs和自身免疫血清的反應(yīng)大致相當(dāng)(圖3)。來(lái)自作為對(duì)照的RF-同窩小鼠的B細(xì)胞不能對(duì)任何形式的IgG2a做出反應(yīng)，證實(shí)了在本研究中所采用的配體的特異性。包括致有絲分裂的甲基化不足的CpG寡聚脫氧核苷酸，它在此處用作對(duì)照刺激。這些數(shù)據(jù)表明，對(duì)于RF+B細(xì)胞對(duì)自身抗體/自身抗原IC做出反應(yīng)來(lái)說(shuō)，補(bǔ)體受體并不是必需的。
MyD88依賴性受體的作用潛在的候選受體包括Toll樣受體(TLR)家族的成員。這些模式識(shí)別受體(pattesrn recognition receptor)最早是在果蠅Drosophila中被描述的，已經(jīng)證明它們能在果蠅中引發(fā)抗真菌肽的釋放(Lemaitre et al.，Cell 86，973-983(1996))。人們發(fā)現(xiàn)，后來(lái)被確認(rèn)的哺乳動(dòng)物同源物能夠識(shí)別一系列保守的微生物產(chǎn)物(也就是LPS、微生物脂蛋白以及甲基化不足的CpG DNA)，后者被稱為病原體相關(guān)的分子模式(pathogen associatedmolecular pattern，簡(jiǎn)稱為PAMPS)(Medzhitov，et al.，Nature 388，323-324(1997)；Akira，et al.，Nat.Immunol.2，675-680(2001))。最初的研究重點(diǎn)是微生物產(chǎn)物對(duì)先天性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞的效果，此前人們發(fā)現(xiàn)，這些微生物產(chǎn)物能夠刺激很多炎癥調(diào)節(jié)因子(inflammatory mediators)的釋放(Akira，et al.，Nat.Immunol.2，675-680(2001))。但是，后來(lái)證明除了外源性微生物配體之外，TLRs也能夠識(shí)別從損傷的哺乳動(dòng)物細(xì)胞或脅迫狀態(tài)下的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中釋放出來(lái)的內(nèi)源性配體(Li，et al.，J Immunol.166，7128-7135(2001))。所有已知的哺乳動(dòng)物TLRs信號(hào)通路都使用適配器蛋白MyD88(Akira，et al.，Nat.Immunol.2，675-680(2001))，但是對(duì)于TLR4而言，已經(jīng)描述了另外一種不依賴于MyD88的通路(Horng，et al.，Nat.Immunol.2，835-841(2001))。
為了研究TLRs在介導(dǎo)RF+B細(xì)胞對(duì)自身抗體/自身抗原IC所做出的反應(yīng)中的潛在作用，我們將AM14轉(zhuǎn)基因交叉到MyD88-/-背景上(Adachi，et al.，Immunity 9，143-150(1998))。對(duì)來(lái)自RF-MyD88+/+(野生型)，RF+MyD88+/+以及RF+MyD88-/-子代的B細(xì)胞(通過(guò)將PCR和FACS分析結(jié)合在一起進(jìn)行鑒定(圖4A-4B))進(jìn)行檢測(cè)，分析它們對(duì)抗IgM，CpG ODN，LPS，以及一組(panel)抗核小體mAbs和自身免疫血清的反應(yīng)能力。來(lái)自MyD88缺乏型小鼠的B細(xì)胞能夠?qū)笽gM做出正常的反應(yīng)，但不能對(duì)刺激性CpG DNA做出反應(yīng)[Hacker，et al.，J.Exp.Med.192，595-600(2000)]。它們對(duì)LPS的反應(yīng)要比野生型小鼠低的多，但仍然是可以檢測(cè)到的，這與通過(guò)MyD88的部分活化是一致的；它們只對(duì)LPS做出較弱的反應(yīng)，已經(jīng)公知，LPS是部分地通過(guò)不依賴MyD88的機(jī)制產(chǎn)生刺激(Horng，et al.，Nat.Immunol.2，835-841(2001))(圖4C)。最值得注意的是，來(lái)自RF+MyD88缺乏型小鼠的B細(xì)胞完全不能對(duì)抗核小體mAbs PR1-3或PL2-3或任何一種能有效刺激RF+MyD88+/+B細(xì)胞的自身免疫血清做出反應(yīng)(圖4C)。這些結(jié)果清楚地表明自身抗體/自身抗原IC對(duì)于RF+B細(xì)胞而言刺激特別強(qiáng)，因?yàn)樗鼈兡軌騾f(xié)同地與BCR和MyD88依賴性受體相結(jié)合。
甲基化不足的CpG模體(motifs)是細(xì)菌DNA的共同特征，但它們也存在于哺乳動(dòng)物DNA的啟動(dòng)子元件中(Singal andGinder.Blood 93，4059-4070(1999))。由于B細(xì)胞對(duì)CpG寡聚脫氧核糖核苷酸(ODN)的反應(yīng)是通過(guò)TLR9來(lái)介導(dǎo)的(Hemmi，et al.，Nature 408，740-745(2000))，因此我們假定含有染色質(zhì)的IC能夠通過(guò)與TLR9的共結(jié)合而刺激RF B細(xì)胞。TLR9介導(dǎo)的對(duì)CpG S-ODN的反應(yīng)與其他已知的TLR信號(hào)通路是不同的，其區(qū)別特征在于其對(duì)內(nèi)涵體酸化和/或成熟的假定的要求，這一點(diǎn)可以通過(guò)對(duì)氯奎和氯化銨的敏感性而確定(Yi，et al.，J.Immunol.160，4755-4761(1998)；Hacker，et al.，EMBO J.17，6230-6240(1998))。Concanamycin B and bafilomycin A是負(fù)責(zé)內(nèi)涵體酸化的V型ATPase的特異性抑制劑(Benaroch，et al.，EMBO J.14，37-49(1995))。為了研究TLR9在RF+B細(xì)胞活化中的作用，對(duì)氯奎、concanamycin B、bafilomycin A和氯化銨對(duì)mAb PL2-3以及已知的TLR2(脂蛋白，孔蛋白B)(Massari，et al.，R Immunol.1681533-1537，2002)、TLR4(LPS)以及TLR9(CpG S-ODN 1826)配體的刺激能力的作用進(jìn)行了測(cè)定。正如原來(lái)所期望的，氯奎抑制了CpG S-ODN反應(yīng)，而且這些抑制劑對(duì)TLR2和TLR4配體的反應(yīng)作用很小。值得注意的是，所有四種能夠阻斷氯奎的試劑也抑制RF+B細(xì)胞對(duì)mAb PL2-3的反應(yīng)(圖5A、圖5B)。與氯奎的這種聯(lián)系是很有意思的，因?yàn)槁瓤侵委煱愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和SLE在內(nèi)的自身免疫疾病的有效手段(CanadianHydroxychloroquine Study Group，N.Engl.J Med.324，150-154(1991)；Furst，et al.，Arth.Rheu.42，357-365(1999))。因此，我們的數(shù)據(jù)表明，氯奎的治療效果至少部分地來(lái)源于其干擾TLR介導(dǎo)的信號(hào)的能力，而所述信號(hào)對(duì)于自身抗體的產(chǎn)生或者前炎癥調(diào)節(jié)因子(proinflammatory mediators)的產(chǎn)生是有作用的。
B細(xì)胞對(duì)刺激性CpG S-ODN 1826的反應(yīng)也可以被一組緊密相關(guān)的抑制性CpG S-ODN所阻斷，例如S-ODN 2088(Lenart，etal.，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.4，247-256(2001))。我們發(fā)現(xiàn)，S-ODN 2088嚴(yán)重抑制了對(duì)S-ODN 1826的增殖反應(yīng)，但對(duì)于抗IgM或我們的TLR2和TLR4配體的反應(yīng)則沒有效果(圖5C、圖5B)。最為重要的是，S-ODN 2088也顯著地阻斷了RF+B細(xì)胞對(duì)mAb PL2-3的反應(yīng)。總的來(lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈地暗示了在RF+B細(xì)胞的活化中，內(nèi)涵體處理和/或內(nèi)涵體相關(guān)TLR(最有可能的是TLR9)的結(jié)合。
已經(jīng)清楚地表明，自身反應(yīng)性B細(xì)胞克隆可以經(jīng)歷類別轉(zhuǎn)換(isotype switching)和體細(xì)胞突變(somatic mutation)，這與B細(xì)胞對(duì)外源抗原的常規(guī)反應(yīng)所具有的T依賴性的特征很相似(Shlomchik，et al.，Nature 328，805-811(1987))。但是，最近的研究報(bào)告暗示，自身反應(yīng)性B細(xì)胞可以在外周淋巴組織中與常規(guī)B細(xì)胞分隔開；自身反應(yīng)性B細(xì)胞往往定位于脾臟白髓26的邊緣區(qū)域(Zeng，et al.，J.Immunol.164，5000-5004(2000))，而常規(guī)B細(xì)胞則通過(guò)歸巢作用遷移至濾泡區(qū)域。此外，在某些情況下，自身反應(yīng)性B細(xì)胞的擴(kuò)張和體細(xì)胞突變也可以發(fā)生在生發(fā)中心(germinal center)的外面。這些離散的定位模式可以反應(yīng)出刺激性自身抗體/自身抗原IC在這些位點(diǎn)的優(yōu)先積累?；蛘?，這種相對(duì)獨(dú)特的歸巢模式(homing pattern)可能是由于不同的趨化因子受體譜圖(profiles)所致，后者是在對(duì)BCR/TLR結(jié)合的共同效應(yīng)進(jìn)行反應(yīng)時(shí)所產(chǎn)生的。需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究，以便比較單獨(dú)通過(guò)BCR交聯(lián)而活化的B細(xì)胞和通過(guò)BCR/TLR雙結(jié)合而活化的B細(xì)胞的功能特性。
識(shí)別DNA/核小體的自身抗體是SLE患者和SLE的鼠類模型中定義的和最常見的特異性種類(specificity)，而RFs在一部分SLE患者、自身免疫易感性lpr小鼠和RA患者中是一個(gè)典型特征。值得注意的是，這些同樣的自身抗原是一些新型的鼠類自身免疫模型的靶標(biāo)，而所述的鼠類自身免疫模型是通過(guò)突變而破壞淋巴細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡或自身抗原代謝而得到的(Botto，et al.，Nature Genetics 19，56-59(1998)；Bickerstaff，et al.，NatureMedicine 5，694-697(1999)；Napirei，et al.，Nat.Gen.25，177-180(2000)；Scott，et al.，Nature 411，207-211(2001))。在過(guò)去的很長(zhǎng)時(shí)間之中，人們一直在尋找這些具體的特異性種類之所以占優(yōu)勢(shì)的原因。我們的數(shù)據(jù)提供了一種解釋，也就是對(duì)由含有染色質(zhì)的免疫復(fù)合物介導(dǎo)的BCR/TLR信號(hào)傳導(dǎo)的有效的協(xié)同作用。在我們的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，依賴于內(nèi)涵體/溶酶體定位的TLR9(Hacker，et al.，EMBO J17，6230-6240(1998))，可以合理地推斷自身抗體/自身抗原IC與BCR的結(jié)合觸發(fā)了IC相關(guān)抗原的胞飲作用，并導(dǎo)致染色質(zhì)片段被高效地運(yùn)送至內(nèi)涵體相關(guān)的TLR9。與公開的研究結(jié)果(Bell，et al.，J.Clin.Invest.85，1487-1496(1990)；Bell，et al.，Clin.ImmunoL Immunopath.60，1326(1991))相反，我們不能單獨(dú)通過(guò)培養(yǎng)物上清液或染色質(zhì)片段而活化B細(xì)胞。其他的小鼠品系是否會(huì)對(duì)我們的片段反應(yīng)更為敏感仍有待證實(shí)。
除了目前的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ屯?，一般?lái)講，BCR/TLR雙結(jié)合的原理對(duì)于自身免疫而言具有廣泛的意義。諸如半抗原化的LPS和半抗原化的LPSLPS偶聯(lián)的SRBC的模型配體也可以共同對(duì)BCRs和TLRs進(jìn)行信號(hào)傳遞，而且對(duì)于具有相關(guān)受體的B細(xì)胞而言相當(dāng)有效并且具有較高的特異性(Pike，Methods Enzymol.1987；150265-75，1987)。因此，在很多不同的環(huán)境中，這種模式的活化很可能是外周B細(xì)胞耐受丟失中的主要事件；其他的自身抗原可以通過(guò)TLR9之外的其他TLRs進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)?？偟膩?lái)講，這些數(shù)據(jù)證實(shí)了內(nèi)源性TLR配體在自身免疫的獲得性免疫系統(tǒng)異常活化中的重要作用，并解釋了自身抗體庫(kù)為何經(jīng)常性地不正常地識(shí)別亞細(xì)胞核酸/蛋白質(zhì)微粒(Tan，E. Adv.Immunol.44，93-151(1989))的原因。
方法小鼠.將前面所描述的MRL+/+AM14 BCR Tg小鼠(Hannum，et al.，J.Exp.Med.184，1269-1278(1996)；Riflcin，etal.，J.Immunol.165，1626-1633(2000))與Cr2缺陷型小鼠雜交，后者由Michael Carroll博士提供(哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院，波士頓)，F(xiàn)1子代進(jìn)行互交(intercross)以產(chǎn)生AM14 Cr2缺陷型以及Cr2充足型(sufficient)對(duì)照小鼠。最初由Shizuo Akira博士(大阪大學(xué)，大阪，日本)制備的MyD88-/-小鼠(Adachi，et al.，Immunity 9，143-150(1998))由Douglas Golenbock博士(麻薩諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)院，伍斯特，麻薩諸塞州)提供，將這種小鼠與AM14 MRL+/+小鼠進(jìn)行雜交，以產(chǎn)生AM14 MyD88-/-小鼠以及作為對(duì)照的子代同窩小鼠。首先通過(guò)PCR鑒定RF+子代，然后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析外周血淋巴細(xì)胞或脾臟細(xì)胞而證實(shí)對(duì)它們的鑒定，使用所述的4-G7單克隆抗個(gè)體基因型(4-G7monoclonal anti-idiotype)(Shlomchik，et al.，Int.Immunol.5，1329-1341(1993))。采用FITC-偶聯(lián)的7G6抗體(Pharmingen，圣地亞哥，加利福尼亞州)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)確定補(bǔ)體受體的基因型。MyD88的基因型通過(guò)PCR技術(shù)利用下列引物進(jìn)行確定MyD88F(5′-TGG CAT GCC TCC ATC ATA GTT AAC C-3′)[SEQID NO1]，MyD88R(5′-GTC AGA AAC AAC CAC CAC CATGC-3′)[SEQ ID NO2]，以及neoR(5′-ATC GCC TTC TAT CGCCTT CTT GAC G-3′)[SEQ ID NO3](MWG Biotech，海波因特，北卡羅來(lái)那州)，以獲得長(zhǎng)度分別為約550bp和750bp的野生型和敲除產(chǎn)物。
細(xì)胞培養(yǎng)物和試劑.脾細(xì)胞制備物中的T被去除，并與適當(dāng)?shù)呐潴w共同培養(yǎng)40-48小時(shí)。在某些實(shí)驗(yàn)中，按照文獻(xiàn)中描述的方法將B細(xì)胞與CD40L一起進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)(Rifkin，et al.，J.Immunol.165，1626-1633(2000))。在培養(yǎng)的最后16小時(shí)內(nèi)加入3[H]-胸腺嘧啶核苷以評(píng)估增殖狀況。數(shù)據(jù)是以三組培養(yǎng)物抗IgM反應(yīng)的平均百分比表示的。按照下述公式計(jì)算抗IgM反應(yīng)的百分比[(cpm實(shí)驗(yàn)條件-cpm CD40L單獨(dú))/(cpm抗IgM-cpm CD40L單獨(dú))×100]。
配體包括山羊抗小鼠IgM F(ab′)2(15μg/ml，JacksonImmunoResearch Laboratories，West Grove，賓夕法尼亞州)；核小體特異性mAbs PR1-3(IgG2a′)，PL2-3(IgG2a′)以及PL2-8(IgG2b)(濃度均為50μg/ml)，由Marc Monestier博士提供(坦普爾大學(xué)醫(yī)學(xué)院，費(fèi)城，賓夕法尼亞州)(Monestier and Novick Mol.Immunol.33，89-99(1996))；10μg/ml LPS(Sigma，圣路易斯，密蘇里州)；0.3-2g/ml的刺激性CpG S-ODN 1826(Yi，et al.，J.Immunol.160，4755-4761(1998))(Oligo′s Etc，Wilsonville，俄亥俄州)，10μg/ml腦膜炎雙球菌(Neisseria Meningitidis)孔蛋白B(由Lee Wetzler博士提供，波士頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院，波士頓，麻薩諸塞州)；10μg/ml合成的脂肽Pam3Cys-Sk4(G.Jung博士，Univ.ofTuebingen，德國(guó)，由Doug Golenbock博士提供)；以及抗TNPmAbs Hy1.2(IgG2aa)和C1040(IgG2ab)(Hannum，et al.，J Exp.Med.184，1269-1278(1996))(濃度均為50μg/ml)，與不同濃度的TNP-BSA相絡(luò)合(complexed)。在某些實(shí)驗(yàn)中，在加入配體之前的15-30分鐘-2小時(shí)，將DNase I(IV類)(Sigma，圣路易斯，密蘇里州)，氯奎(Sigma)，concanamycin B，bafilomycin A(Sigma)或12pg/ml的抑制性CpG S-ODN 2008(Lenart，et al.，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.4，247-256(2001))(Oligo′sEtc.)加入到培養(yǎng)物中。通過(guò)鱟魚阿米巴狀細(xì)胞溶解物ELISA(Limulus Amebocyte Lysate ELISA)(Bio-Whittaker，Walkersville，馬里蘭州)證明所有的mAb和ODN制備物均不含內(nèi)毒素。
實(shí)施例3我們進(jìn)一步證明樹突狀細(xì)胞可以被含有染色質(zhì)的免疫復(fù)合物活化，其通過(guò)與Fc受體和TLR9的順序結(jié)合而發(fā)揮作用。這與前面所描述的B細(xì)胞活化的機(jī)理很相似，其區(qū)別在于對(duì)于B細(xì)胞而言，相關(guān)的細(xì)胞表面受體是B細(xì)胞抗原受體；而對(duì)于樹突狀細(xì)胞而言，相關(guān)的細(xì)胞表面受體是Fc gamma受體(FcyR)。這兩種細(xì)胞表面受體的作用都是將染色質(zhì)運(yùn)送到位于內(nèi)涵體/溶酶體囊泡中的TLR9。
在圖8A-圖8C中，我們表明樹突狀細(xì)胞可以通過(guò)TLR9而被特異性地活化，這種活化可以被ODN 2088所形成的TLR9抑制而阻斷。這些實(shí)驗(yàn)證明，我們?cè)诤罄m(xù)實(shí)驗(yàn)中所使用的樹突狀細(xì)胞(示于下面的表1和表2中)表達(dá)功能性的TLR9，因?yàn)樘禺愋曰罨疶LR9的配體ODN 1826誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生TNF-a和IL-12(圖8A，圖8B)，而且還進(jìn)一步誘導(dǎo)共刺激分子的上調(diào)節(jié)(圖8C)。ODN 2088是TLR9介導(dǎo)的活化的特異性抑制劑，因?yàn)镺DN 2088阻斷了ODN 1826介導(dǎo)的活化，但是對(duì)于LPS介導(dǎo)的活化卻沒有作用(如圖8A、8B、8C所示)。
樹突狀細(xì)胞來(lái)源于C57BL/6小鼠的骨髓中，通過(guò)在體外利用GM-CSF和IL-4培養(yǎng)6天而獲得。在第六天時(shí)將CD11c陽(yáng)性的樹突狀細(xì)胞分離出來(lái)，分離過(guò)程中采用磁性珠子(magnetic beads，Miltenyi Biotec)，并與ODN 2088(一種特異性地阻斷通過(guò)TLR9的信號(hào)傳導(dǎo)的抑制性寡聚脫氧核苷酸)預(yù)培養(yǎng)30分鐘；也可以不進(jìn)行上述的預(yù)培養(yǎng)操作。然后向培養(yǎng)物中加入通過(guò)TLR9發(fā)揮特異性活化作用的刺激性O(shè)DN 1826(CpG，3μg/ml)或者通過(guò)TLR4發(fā)揮活化作用的脂多糖(LPS，10μg/ml)，或者僅加入培養(yǎng)基。在48小時(shí)之后，通過(guò)ELISA(結(jié)果以測(cè)得的405nm處的吸收的OD值表示)測(cè)定培養(yǎng)物上清液中TNF-α(圖8A)和IL-12(圖8B)的水平。在除去上清液之后，將細(xì)胞收集起來(lái)，并用流式細(xì)胞術(shù)分析共刺激分子CD86的表達(dá)(圖8c)。“未刺激”是指在只有培養(yǎng)基的情況下CD86的表達(dá)水平，“刺激”是指在存在刺激物(ODN 1826或LPS)的情況下CD86的表達(dá)水平。
下面的表1表明，含有染色質(zhì)的免疫復(fù)合物(復(fù)合物中含有自身抗體和染色質(zhì)自身抗原)活化了樹突狀細(xì)胞，使其生產(chǎn)TNF-α；而含有外源抗原(TNP-BSA)的免疫復(fù)合物則不能誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞的這種活化。此外，含有染色質(zhì)的免疫復(fù)合物所誘導(dǎo)的活化可以被TLR9的特異性抑制劑ODN 2088所完全阻斷，這表明TLR9的結(jié)合(可能是通過(guò)位于含有染色質(zhì)的免疫復(fù)合物內(nèi)的染色質(zhì))在上述活化過(guò)程中是一個(gè)很重要的因素。
表1

表1說(shuō)明，含有染色質(zhì)的免疫復(fù)合物所誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞對(duì)TNF-α的生產(chǎn)被TLR9的特異性抑制劑ODN 2088所阻斷。樹突狀細(xì)胞來(lái)源于C57BL/6小鼠的骨髓中，通過(guò)在體外利用GM-CSF和IL-4培養(yǎng)6天而獲得。在第六天時(shí)利用磁性珠子(MiltenyiBiotec)將CD11c陽(yáng)性的樹突狀細(xì)胞分離出來(lái)。然后將樹突狀細(xì)胞與濃度為12μg/ml的ODN 2088預(yù)培養(yǎng)30分鐘，也可以不進(jìn)行上述的預(yù)培養(yǎng)操作。然后向培養(yǎng)物中加入通過(guò)TLR9發(fā)揮特異性活化作用的刺激性O(shè)DN 1826(3μg/ml)，通過(guò)TLR4發(fā)揮活化作用的脂多糖(LPS，10μg/ml)，抗染色質(zhì)抗體PL2-3(50μg/ml)，抗體/蛋白質(zhì)比例不同的三種αTNP/TNP-BSA免疫復(fù)合物(50μg/ml)，或者僅加入培養(yǎng)基。在48小時(shí)之后，通過(guò)ELISA測(cè)定培養(yǎng)物上清液中TNF-α的水平(結(jié)果以pg/ml表示；檢測(cè)靈敏度的下限水平(lower level)是50pg/ml)。此處示出了三個(gè)類似實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)有代表性的實(shí)驗(yàn)。
表2說(shuō)明，含有染色質(zhì)的免疫復(fù)合物能夠誘導(dǎo)來(lái)自野生型小鼠的樹突狀細(xì)胞生產(chǎn)TNF-α(這一點(diǎn)在表1中所示的ODN 2088不存在時(shí)的研究結(jié)果中也能看到)，但是完全不能誘導(dǎo)來(lái)自Fc受體γ鏈缺陷型小鼠的樹突狀細(xì)胞生產(chǎn)TNF-α。這說(shuō)明在含有染色質(zhì)的免疫復(fù)合物活化樹突狀細(xì)胞的過(guò)程中，參與活化作用的Fc受體是絕對(duì)必要的。
表2

表2證明，含有染色質(zhì)的免疫復(fù)合物能夠誘導(dǎo)來(lái)自野生型小鼠的樹突狀細(xì)胞生產(chǎn)TNF-α，但是不能誘導(dǎo)來(lái)自Fc受體γ鏈缺陷型小鼠的樹突狀細(xì)胞生產(chǎn)TNF-α。樹突狀細(xì)胞來(lái)源于C57BL/6小鼠以及缺乏Fc受體γ鏈的C57BL/6小鼠的骨髓，通過(guò)在體外將所述骨髓細(xì)胞與GM-CSF和IL-4培養(yǎng)6天而獲得。在第六天時(shí)利用磁性珠子將CD11c陽(yáng)性的樹突狀細(xì)胞分離出來(lái)。然后向樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)物中加入通過(guò)TLR9發(fā)揮特異性活化作用的刺激性O(shè)DN 1826(3μg/ml)，脂多糖(LPS，10μg/ml)，抗染色質(zhì)抗體PL2-3(50μg/ml；IgG2a)和PL2-8(50μg/ml；IgG2b)，抗體/蛋白質(zhì)比例不同的二種α-TNP/TNP-BSA免疫復(fù)合物(50μg/ml)，或者僅加入培養(yǎng)基。在48小時(shí)之后，通過(guò)ELISA測(cè)定培養(yǎng)物上清液中TNF-α的水平(結(jié)果以pg/ml表示；檢測(cè)靈敏度的下限水平是50pg/ml)。此處示出了二個(gè)類似實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)有代表性的實(shí)驗(yàn)。
將上述的表1和表2合在一起考慮，其中的數(shù)據(jù)證明含有染色質(zhì)的免疫復(fù)合物所誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞的活化，需要一個(gè)通過(guò)參與活化的Fcγ受體的信號(hào)以及由TLR9介導(dǎo)的一個(gè)信號(hào)。
下面將簡(jiǎn)要介紹一下用于評(píng)價(jià)該FcγR/TLR雙結(jié)合通路的機(jī)理和結(jié)果的其他實(shí)驗(yàn)。
生產(chǎn)TNF-α的樹突狀細(xì)胞亞群(subset)的描述小鼠株系.已經(jīng)描述了自身免疫狼瘡樣(Lupus-Like)小鼠株系和非自身免疫小鼠株系之間在樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞功能上的差異。這些差異包括在免疫復(fù)合物的處理(Jones et al.，Clin.Immunol.Immunopathol.3630-39，1985；Magilavy et al.，J.Immunol.1312784-2788，1983)、吞噬作用(Russell，andSteinberg Clin.Immunol.Immunopathol.27387-402，1983)、Fc受體的表達(dá)和功能(Pritchard et al.，Current Biology.10227-230，2000；Jiang et al.，Immunogenetics.51429-435，2000)以及細(xì)胞因子生產(chǎn)(Alleva et al.，J.Immunol.1595610-5619.，1997；Kohet al.，J.Immunol.1654190-4201，2000)等方面的差異。因此，直接比較來(lái)自身免疫和非自身免疫小鼠株系的樹突狀細(xì)胞是很重要的。MRL+/+和(NZBxNZW)F1是我們所使用的兩個(gè)自身免疫狼瘡樣株系，C57BL/6和BALB/c是我們所使用的兩個(gè)非自身免疫小鼠株系。
樹突狀細(xì)胞亞群的純化.有兩個(gè)對(duì)于SLE的發(fā)病機(jī)制特別重要的樹突狀細(xì)胞亞群CD11c+CD8α+以及CD11c+B220+Gr-1+。這些細(xì)胞或者是從脾臟直接獲得(Hochrein et al.，J.Immunol.1665448-5455，2000；Nakano et al.，J.Exp.Med.1941171-1178，2001)，或者是在Flt3配體的存在下通過(guò)體外培養(yǎng)骨髓細(xì)胞而獲得(Brasel et al.，Blood.963029-3039，2000；Gilliet etal.，J.Exp.Med.195953-958，2002)。按照文獻(xiàn)中所述的方法分離脾樹突狀細(xì)胞(Vremec et al.，J.Immunol.1642978-2986，2000)；在經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)臒晒饪贵w染色之后，特定的樹突狀細(xì)胞亞群被分開，并采用MoFlo細(xì)胞分類器(Cytomation，柯林斯堡，科羅拉多州)進(jìn)行收集。在脾臟中也能發(fā)現(xiàn)的CD11c+CD8α-樹突狀細(xì)胞亞群與作為目標(biāo)的CD11c+CD8α+樹突狀細(xì)胞亞群被同時(shí)分離出來(lái)，并且在實(shí)驗(yàn)中被用作對(duì)照。
為了獲得來(lái)源于骨髓的樹突狀細(xì)胞，將骨髓細(xì)胞收集起來(lái)并在重組鼠Flt3配體的存在下體外培養(yǎng)6-10天，采用的是已知的實(shí)驗(yàn)方案(Gilliet et al.，J.Exp.Med.195953-958，2002；Labeuret al.，J.Immunol.162168-175，1999)。在Flt3配體存在下生長(zhǎng)的骨髓細(xì)胞被富集于目標(biāo)種群，也就是CD11c+CD8+以及CD11c+B220+Gr-1+樹突狀細(xì)胞。通過(guò)上面描述的細(xì)胞分類法將來(lái)源于脾的樹突狀細(xì)胞分開。
確定TLR9在特定的樹突狀細(xì)胞亞群中的表達(dá).通過(guò)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)測(cè)定TLR9 mRNA。此外，通過(guò)測(cè)定共刺激分子的表達(dá)和細(xì)胞因子的生產(chǎn)而比較樹突狀細(xì)胞亞群對(duì)TLR9特異的刺激性配體S-ODN 1826的反應(yīng)(Ballas et al.，J.Immunol.1674878-4886，2001)。可以通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的技術(shù)生產(chǎn)鼠TLR9的特異抗體。
IC的制備以及樹突狀細(xì)胞對(duì)IC的結(jié)合和吸收免疫復(fù)合物的制備。將抗核小體單克隆抗體PL2-3(IgG2a)、PL2-8(IgG2b)以及PL9-7(IgG3)與脾細(xì)胞24小時(shí)體外培養(yǎng)物的上清液進(jìn)行培養(yǎng)，以制備抗核小體/染色質(zhì)的IC。染色質(zhì)從培養(yǎng)物中的脾細(xì)胞內(nèi)自發(fā)地釋放出來(lái)(Bell et al.，J.Clin.Invest.851487-1496，1990)；抗核小體的抗體與上述染色質(zhì)的結(jié)合導(dǎo)致了IC的形成，這可以通過(guò)Clq免疫試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定(Riflin et al.，Journal of Immunology.1651626-1633，2000)。我們已經(jīng)進(jìn)一步證明，與培養(yǎng)液預(yù)培養(yǎng)過(guò)的生物素化的PL2-3與類風(fēng)濕因子B細(xì)胞特異性結(jié)合，這可以通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)出來(lái)；而單體狀態(tài)的生物素化的PL2-3則不結(jié)合。使用抗TNP單克隆抗體Hy1.2(IgG2a)或C4010(IgG2b)并將其與TNP-BSA進(jìn)行培養(yǎng)，從而制備非自身抗原對(duì)照IC；IC形成的確認(rèn)也是通過(guò)Clq結(jié)合進(jìn)行的(Leadbetter et al.，Nature.416603-607，2002)。另外的非自身抗原對(duì)照IC是利用本實(shí)驗(yàn)室制備的抗卵清蛋白單克隆抗體Ov1(IgG2a)和Ov2(IgG2b)，并將其與卵清蛋白進(jìn)行培養(yǎng)而制備的。除了用Clq結(jié)合試驗(yàn)證明IC的形成以外，還使用了FPLC作為證實(shí)IC形成的另一種實(shí)驗(yàn)手段。
樹突狀細(xì)胞對(duì)免疫復(fù)合物的結(jié)合和吸收.在建立含有IC和樹突狀細(xì)胞的實(shí)際實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)物之前，有必要確定來(lái)自不同株系的純化的樹突狀細(xì)胞亞群所能結(jié)合和吸收IC的程度。考慮到所報(bào)道的自身免疫和非自身免疫小鼠株系之間在IC處理(Jones et al.，Clin.Immunol.Immunopathol.3630-39，1985；Magilavy et al.，J.Immunol.1312784-2788，1983)和Fc受體表達(dá)(Pritchard etal.，Current Biology.10227-230，2000；Jiang et al.，Immunogenetics.51429-435.，2000)等方面的差別，這一點(diǎn)是特別重要的。該實(shí)驗(yàn)方法是通過(guò)組合利用流式細(xì)胞術(shù)和共聚焦顯微鏡術(shù)而追蹤免疫復(fù)合物中的抗體成分。抗核小體抗體PL2-3(IgG2a)、PL2-8(IgG2b)以及PL9-7(IgG3)已經(jīng)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)步驟與生物素進(jìn)行了偶聯(lián)；通過(guò)上述方法制備生物素-抗核小體/染色質(zhì)IC。為了證實(shí)生物素-抗核小體/染色質(zhì)IC保留了其功能，對(duì)生物素-PL2-3/染色質(zhì)IC能否在誘導(dǎo)類風(fēng)濕因子B細(xì)胞的增殖上達(dá)到非生物素-PL2-3/染色質(zhì)IC所能達(dá)到的程度進(jìn)行了評(píng)估(Rifkinet al.，Journal of Immunology.1651626-1633，2000)。生物素-PL2-8/染色質(zhì)IC和生物素-PL9-7/染色質(zhì)IC不能通過(guò)這種方式進(jìn)行測(cè)定，因?yàn)镮gG2b和IgG3不能被類風(fēng)濕因子B細(xì)胞受體所識(shí)別，但是人們認(rèn)為在不考慮同種異型時(shí)，生物素偶聯(lián)在功能上的影響是相似的。同種異型匹配的生物素-抗TNP/TNP-BSA IC以及生物素-抗卵清蛋白/卵清蛋白IC以類似方法制備。沒有進(jìn)入復(fù)合物的單獨(dú)的生物素偶聯(lián)抗體被用作對(duì)照。生物素偶聯(lián)IC和生物素偶聯(lián)抗體被單獨(dú)加到不同的樹突狀細(xì)胞亞群中，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面的結(jié)合。通過(guò)與特異的熒光染料相偶聯(lián)的抗生物素單克隆抗體，可以看到生物素標(biāo)記的化合物(分子探針抗生物素小鼠單克隆2F5 Alexa Fluor 488偶聯(lián)物)。接下來(lái)，使用共聚焦顯微鏡術(shù)評(píng)估在培養(yǎng)1-12小時(shí)并用3％多聚甲醛固定之后，樹突狀細(xì)胞對(duì)抗核小體抗體(生物素-抗核小體/染色質(zhì)IC)、抗TNP抗體(生物素-抗TNP/TNP-BSA IC)或抗卵清蛋白抗體(生物素-抗卵清蛋白/卵清蛋白IC)的內(nèi)化作用。
此外，還進(jìn)行了共定位研究，其中采用了與對(duì)內(nèi)涵體/溶酶體囊泡具有特異性的熒光標(biāo)記單克隆抗體進(jìn)行的共染色，或者能分配到酸性細(xì)胞器中的熒光pH指示劑(分子探針)。
含有染色質(zhì)的IC所導(dǎo)致的樹突狀細(xì)胞活化的測(cè)定以及Toll樣受體和Fc gamma受體作用的確定IC所導(dǎo)致的樹突狀細(xì)胞活化的測(cè)定.將前述的抗核小體/染色質(zhì)IC、抗TNP/TNP-BSA IC以及抗卵清蛋白/卵清蛋白IC與樹突狀細(xì)胞亞群進(jìn)行培養(yǎng)，樹突狀細(xì)胞的活化通過(guò)測(cè)定共刺激分子的上調(diào)節(jié)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生而確定。對(duì)照包括單獨(dú)的處于單體狀態(tài)未形成符合物的抗體，單獨(dú)的抗原，作為TLR9信號(hào)傳導(dǎo)陽(yáng)性對(duì)照的刺激性CpG S-ODN 1826，作為TLR4信號(hào)傳導(dǎo)陽(yáng)性對(duì)照的LPS以及作為TLR2信號(hào)傳導(dǎo)陽(yáng)性對(duì)照的孔蛋白B。通過(guò)ELISA測(cè)定細(xì)胞因子，所述細(xì)胞因子包括IL-12，TNF-α，IL-10以及IFN-α。IL-12和TNF-α是用作樹突狀細(xì)胞活化標(biāo)記的最常用的兩種細(xì)胞因子(Banchereau et al.，Annu.Rev.Immunol.18767-811，2000)，IFN-α是與CD11c+CD8α+以及CD11c+B220+Gr-1+樹突狀細(xì)胞亞群的活化關(guān)系最為密切的細(xì)胞因子。有必要測(cè)定IL-10，因?yàn)橐呀?jīng)表明，巨噬細(xì)胞Fc受體的結(jié)合可能導(dǎo)致由后續(xù)刺激所誘導(dǎo)的IL-10的生產(chǎn)；而所述刺激在Fc受體未結(jié)合的情況下，會(huì)導(dǎo)致IL-12而不是IL-10的生產(chǎn)(Gerber and Mosser J.Immunol.1666861-6868，2001)。MHC II類分子以及共刺激分子CD80、CD86和CD40表達(dá)的增加通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行測(cè)定。
Toll樣受體和Fc gamma受體在IC介導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞活化中的作用.S-ODN 2088是一種抑制性CpG S-ODN，它特異性地阻斷通過(guò)TLR9的信號(hào)傳導(dǎo)(Lenert et al.，Antisense and NucleicAcid Drug Development.11247-256，2001)。我們已經(jīng)證明，S-ODN 2088強(qiáng)烈抑制含有染色質(zhì)的IC所誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖，其中所述B細(xì)胞來(lái)自類風(fēng)濕因子B細(xì)胞受體轉(zhuǎn)基因小鼠(Leadbetteret al.，Nature.416603-607，2002(Leadbetter et al.，Nature.416603-607，2002)。我們也已經(jīng)證明，S-ODN 2088通過(guò)對(duì)TLR9的作用而完全阻止了刺激性CpG S-ODN(例如S-ODN 1826)對(duì)樹突狀細(xì)胞的活化。上面所介紹的這些實(shí)驗(yàn)是在S-ODN 2088存在/不存在的情況下進(jìn)行的，以便評(píng)價(jià)TLR9在IC介導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞活化中的作用。這些實(shí)驗(yàn)也是在內(nèi)涵體酸化抑制劑存在/不存在的情況下進(jìn)行的，所述抑制劑包括氯奎、concanamycin B和bafilomycin A，其能夠阻止通過(guò)TLR9的信號(hào)傳導(dǎo)。此外，還將來(lái)自C57BL/6 MyD88+/+小鼠的樹突狀細(xì)胞和來(lái)自C57BL/6MyD88-/-小鼠的樹突狀細(xì)胞進(jìn)行了比較，以便確定對(duì)TLR信號(hào)傳導(dǎo)的需要。
為了評(píng)估對(duì)Fc gamma受體(FcγR)信號(hào)傳導(dǎo)的需要，我們還在2.4.G2(一種單克隆抗體，能夠特異性地阻斷鼠FcγR II和FcγR III)(Araujo-Jorge et al.，Infect Immun.614925-4928，1993)存在/不存在的情況下進(jìn)行進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。但是，第三種類型的鼠Fc gamma受體，F(xiàn)cγR I，不能被2.4G2所阻斷，并且可以介導(dǎo)IC誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)(Ioan-Facsinay et al.，Immunity.16391-402，2002；Barnes et al.，Immunity.16379-389，2002)。樹突狀細(xì)胞表達(dá)所有這三種FcγR(FcγR I、FcγR II和FcγR III)(Ravetch andBolland，Ann.Rev.Immunol.19275-290，2001)。因此，可以利用FcγR敲除的小鼠進(jìn)行另外的研究。這種小鼠可以從Jackson實(shí)驗(yàn)室獲得，包括i)FcγR I和FcγR III基因缺陷型小鼠，這種小鼠是通過(guò)將上述兩種受體所共有的刺激性信號(hào)傳導(dǎo)gamma鏈敲除而獲得的(Takai et al.，Cell.76519-529，1994)；ii)FcγR II敲除小鼠(Takai et al.，Nature.379346-349，1996)；以及iii)FcγR III敲除小鼠(Hazenbos et al.，Immunity.5181-188，1996)。
IC和TLR9在樹突狀細(xì)胞的抗原處理和呈遞中的作用. 在人類以及SLE的鼠類模型中，CD4+自身反應(yīng)性T細(xì)胞在SLE的發(fā)病過(guò)程中有很重要的作用(Craft et al.，Immunol.Res.191999；Hoffman，F(xiàn)ront.Biosci.6D1369-78，2001；Shlomchik et al.，Nature Rev.Immunol.1147-153，2001)。在T細(xì)胞應(yīng)答的啟動(dòng)中，樹突狀細(xì)胞是關(guān)鍵的抗原呈遞細(xì)胞(Banchereau et al.，Annu.Rev.Immunol.18767-811，2000)；已經(jīng)證明，TLR9的結(jié)合強(qiáng)烈地促進(jìn)了Th1型免疫反應(yīng)的發(fā)展(Jakob et al.，J.Immunol.1613042-3049，1998；Lipford et al.，J.Immunol.1651228-1235，2000)。為了證明TLR9的結(jié)合是否改變了T細(xì)胞對(duì)包含在免疫復(fù)合物中的抗原的反應(yīng)，我們按照文獻(xiàn)中所述的方法將卵清蛋白與刺激性CpG S-ODN 1826偶聯(lián)在一起(Shirota et al.，J.Immunol.1645575-5582，2000)。因此，IC是通過(guò)將未偶聯(lián)的卵清蛋白或卵清蛋白-CpG偶聯(lián)物與抗卵清蛋白單克隆抗體Ov1(IgG2a)或Ov2(IgG2b)進(jìn)行培養(yǎng)而制得。來(lái)自BALB/c小鼠(H-2d)的樹突狀細(xì)胞亞群與這些IC進(jìn)行脈沖式接觸。CD4+T細(xì)胞在H-2Ad的環(huán)境中識(shí)別卵清蛋白；將CD4+T細(xì)胞從卵清蛋白特異性T細(xì)胞受體轉(zhuǎn)基因小鼠(DO11.10小鼠)的淋巴結(jié)中純化出來(lái)(Murphy etal.，Science.2501720-1723，1990)。將這些CD4+T細(xì)胞與經(jīng)過(guò)IC脈沖式接觸的樹突狀細(xì)胞一起培養(yǎng)；在初次T細(xì)胞應(yīng)答以及再次T細(xì)胞應(yīng)答中，檢測(cè)T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的生產(chǎn)(IFN-gamma，IL-4以及IL-2)。使用S-ODN 2088和內(nèi)涵體酸化抑制劑來(lái)評(píng)價(jià)TLR9的作用。
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權(quán)利要求
1.一種方法，用于治療患有免疫復(fù)合物相關(guān)疾病(ICAD)或系統(tǒng)性自身免疫疾病的患者或者ICAD或系統(tǒng)性自身免疫疾病的高?；颊撸ńo予所述患者有效量的化合物，其中所述化合物抑制所述免疫復(fù)合物或自身抗原使其不能與Toll樣受體相結(jié)合或使Toll樣受體活化，其中所述免疫復(fù)合物包含自身抗體以及與細(xì)胞受體相結(jié)合的自身抗原。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的ICAD是系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的ICAD是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的ICAD是丙型肝炎相關(guān)的免疫復(fù)合物疾病。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的Toll樣受體是Toll樣受體9。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的Toll樣受體是Toll樣受體3。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的化合物選自由以下成員構(gòu)成的組(a)與免疫復(fù)合物的組成成分相結(jié)合并阻止其形成或其與Toll樣受體相結(jié)合的化合物；(b)Toll樣受體誘餌；(c)抑制MyD88活性或TLR起始的信號(hào)級(jí)聯(lián)的其他成分活性的化合物；(d)抑制免疫復(fù)合物成分的生產(chǎn)的化合物；以及(e)Toll樣受體拮抗劑。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的化合物是與Toll樣受體相結(jié)合的抗體。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的抗體是單鏈抗體。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，其中使用了一種化合物溶液(cocktail)，所述化合物抑制與受體組合的結(jié)合，其中所述受體組合由Toll樣受體2、Toll樣受體3、Toll樣受體9中的至少兩種所構(gòu)成。
11.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的Toll樣受體拮抗劑是抑制性寡核苷酸。
12.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的Toll樣受體拮抗劑是負(fù)顯性Toll樣受體。
13.一種用于篩選能抑制免疫復(fù)合物形成或與Toll樣受體結(jié)合的化合物的方法，所述方法包括將免疫復(fù)合物成分與待篩選的化合物相接觸，并檢測(cè)B細(xì)胞的活化和/或增殖和/或免疫復(fù)合物的抗原片段與Toll樣受體的結(jié)合，其中所述的免疫復(fù)合物包括自身抗體和自身抗原。
14.一種用于篩選能抑制免疫復(fù)合物的形成或與Toll樣受體結(jié)合的化合物的方法，所述方法包括將免疫復(fù)合物成分與待篩選的化合物相接觸，并檢測(cè)樹突狀細(xì)胞的活化和/或免疫復(fù)合物的抗原片段與Toll樣受體的結(jié)合和/或細(xì)胞形態(tài)，其中所述的免疫復(fù)合物包括自身抗體和自身抗原。
15.抑制免疫復(fù)合物或自身抗原使其不能與Toll樣受體相結(jié)合或使Toll樣受體活化的化合物在治療患有免疫復(fù)合物相關(guān)疾病(ICAD)或系統(tǒng)性自身免疫疾病的患者或者ICAD或系統(tǒng)性自身免疫疾病的高?；颊咧械膽?yīng)用，其中所述的免疫復(fù)合物包含自身抗體以及與細(xì)胞受體相結(jié)合的自身抗原。
16.如權(quán)利要求15所述的化合物，其中所述的化合物選自由以下成員構(gòu)成的組(a)與免疫復(fù)合物的組成成分相結(jié)合并阻止其形成或其與Toll樣受體相結(jié)合的化合物；(b)Toll樣受體誘餌；(c)抑制MyD88活性或TLR起始的信號(hào)級(jí)聯(lián)的其他成分活性的化合物；(d)抑制免疫復(fù)合物成分的生產(chǎn)的化合物；以及(e)Toll樣受體拮抗劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于治療免疫復(fù)合物相關(guān)疾病(ICAD)的方法和組合物，用于患有ICAD的受試者或者ICAD高危受試者，所述ICAD的實(shí)例包括SLE、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、丙型肝炎相關(guān)的免疫復(fù)合物疾病(例如冷球蛋白血癥)。本發(fā)明基于如下令人意外的發(fā)現(xiàn)，即含有染色質(zhì)的免疫復(fù)合物通過(guò)雙受體結(jié)合過(guò)程而活化自身反應(yīng)性B細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，并且在這兩種細(xì)胞中均涉及Toll樣受體(TLR)。治療ICAD的方法包括給予需要治療的個(gè)體一種具有如下屬性的化合物或者1)抑制免疫復(fù)合物的形成，其或者通過(guò)阻止其形成，和/或通過(guò)與TLR相結(jié)合而實(shí)現(xiàn)上述功能；或者2)干擾含有自身抗原的免疫復(fù)合物(或其抗原成分)與TLR相結(jié)合；或者3)抑制由BCR和TLR(在B細(xì)胞中)或FcR和TLR(在樹突狀細(xì)胞中)雙結(jié)合(通過(guò)免疫復(fù)合或未復(fù)合的自身抗原)所啟動(dòng)的信號(hào)通路。
文檔編號(hào)A61K45/00GK1575184SQ02817512
公開日2005年2月2日 申請(qǐng)日期2002年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月7日
發(fā)明者安·馬沙克－羅斯坦, 伊麗莎白·利德貝特, 伊恩·瑞弗金 申請(qǐng)人:波士頓大學(xué)理事會(huì)