專利名稱：修改器官和組織細(xì)胞膜的脂肪酸組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種組合物和用于迅速改變器官和組織細(xì)胞膜的脂肪酸組成的方法，特別是通過給人或動物體胃腸外使用適宜的包含所選擇的脂肪酸甘油三酯的等滲脂質(zhì)乳劑形式的脂肪酸來增加器官和組織細(xì)胞膜ω-3脂肪酸的量。
已知脂質(zhì)乳劑是胃腸外營養(yǎng)品的必需組分并且現(xiàn)在考慮將其用于其它應(yīng)用。在正常(口服)營養(yǎng)品不可能、有害或有醫(yī)學(xué)禁忌的情況下或當(dāng)必須迅速改變細(xì)胞的脂肪酸模式時，用作胃腸外營養(yǎng)品的脂質(zhì)乳劑以可靜脈內(nèi)可接受的劑型形式來為機(jī)體提供脂肪。目前可獲得的脂質(zhì)乳劑是由植物油(例如，紅花油或豆油)制得的。在一些情況下，其還包含中鏈甘油三酯(MCT)和/或海洋來源的油(魚油)。
植物或海洋來源的長鏈甘油三酯可作為能量來源，并且當(dāng)包含多不飽和脂肪酸(“PUFA”)時，可用作必需脂肪酸的供應(yīng)者。將該多不飽和的脂肪酸分成ω-6(ω-6；在現(xiàn)有技術(shù)中有時被稱為“n-6”PUFA)或ω-3(ω-3，有時被稱為“n-3”PUFA)系列的分類是以化學(xué)結(jié)構(gòu)特征為基礎(chǔ)的，更準(zhǔn)確地說，是以第一個不飽和鍵與該脂肪酸分子甲基末端(ω末端)的距離為基礎(chǔ)的。例如，在本說明書中，優(yōu)選地使用“ω-3”。
植物油，例如，大豆油和紅花油的特征在于ω-6系列多不飽和脂肪酸(主要是亞油酸，18∶2ω-6)的含量高而其ω-3脂肪酸(幾乎只是α-亞麻酸形式，18∶3ω-3)的含量低。
得自冷水魚的魚油(“FO”)的特征在于ω-3系列多不飽和脂肪酸(主要是順式-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸，“EPA”，20∶5ω-3、二十二碳五烯酸，＂DPA＂，22∶5ω-3和順式-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸，“DHA”，22∶6 ω-3)的含量高而其ω-6脂肪酸的含量低。
與脂質(zhì)乳劑一起進(jìn)行給藥的中鏈甘油三酯(“MCT”)主要作為能量的來源。中鏈甘油三酯包含飽和脂肪酸，所以其既不包含ω-6也不包含ω-3必需脂肪酸。因為它們的快速水解和其它性質(zhì)(增強(qiáng)顆粒與細(xì)胞的結(jié)合)，所以MCT對乳劑顆粒的代謝具有令人感興趣的影響。
人體本身不能產(chǎn)生必需的ω-6或ω-3系列的多不飽和長鏈脂肪酸，即，其必需口服、腸內(nèi)或胃腸外給藥。機(jī)體僅能由短鏈不飽和脂肪酸來合成長鏈不飽和脂肪酸。兩種系列競爭同一個延長-去飽和的酶系。但是，不能由ω-3系列的母體來形成ω-6脂肪酸，反之亦然。
為了使身體可以獲得外源性的游離脂肪酸，其必需通過酶——脂蛋白脂肪酶(LPL)從輸入的甘油三酯水解釋放或者與乳劑顆粒一起被吸收或其殘余物直接進(jìn)入細(xì)胞。一直認(rèn)為這種開始的脂質(zhì)水解步驟是脂質(zhì)代謝的限速步驟。這種限制是由裂解甘油三酯時脂質(zhì)蛋白脂肪酶相對受限制的活性所導(dǎo)致的。因此，植物油乳劑的最大代謝速率為每天約3.8g脂質(zhì)/kg體重(Hallberg等人，Acta Physiol.Scand.(1965)第65卷，增刊254，2-23頁)。
在甘油三酯輸入期間，希望達(dá)到盡可能低的甘油三酯血清濃度，例如相當(dāng)于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)對外源性脂質(zhì)的低負(fù)載。
一般而言，手術(shù)后和創(chuàng)傷后的情況以及嚴(yán)重的膿毒性發(fā)作的特征為免疫系統(tǒng)的極大刺激。免疫反應(yīng)包括在高水平時可造成嚴(yán)重組織損害的細(xì)胞因子(例如，腫瘤壞死因子和白介素)的釋放。此外，高細(xì)胞因子濃度還損害LPL對循環(huán)的甘油三酯的水解。
在該類臨床情況中，特別重要的是使用可迅速水解和消除(以避免血漿甘油三酯濃度的過度增加)并且可以提供能降低細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及細(xì)胞因子對組織的毒性的脂肪酸(例如ω-3脂肪酸)的外源性甘油三酯。當(dāng)脂肪酸從該甘油三酯分子裂解下來并混入(以游離形式或作為磷脂的組分的形式)到細(xì)胞膜中時可獲得這種作用，其中，在細(xì)胞膜中脂肪酸影響膜的結(jié)構(gòu)(和功能)并可作為第二信使和類花生酸的母體。因此，希望這種過程盡可能迅速地發(fā)生。
魚油的甘油三酯的水解比得自植物油(例如豆油)的甘油三酯的水解更緩慢，得自植物油的甘油三酯的水解比中鏈甘油三酯的水解更慢。向長鏈甘油三酯乳劑中添加魚油乳劑甚至可以抑制由LPL進(jìn)行的長鏈甘油三酯(得自豆油)的水解。
公開的歐洲專利申請EP-A-0311091公開了一種用于胃腸外營養(yǎng)的包含中鏈甘油三酯和高量魚油的脂質(zhì)乳劑。
公開的國際專利申請WO-A-90/08544公開了作為ω-脂肪酸來源的包含魚油和以總脂質(zhì)為基礎(chǔ)的0至90％中鏈甘油三酯的脂肪乳以及其用于治療腹腔膿毒性感染的腹膜內(nèi)應(yīng)用。
公開的國際專利申請WO-A-97/19683公開了用于胃腸外營養(yǎng)的包含中鏈甘油三酯、植物油和魚油的脂質(zhì)乳劑。WO-A-97/19683還公開了所說脂質(zhì)乳劑用于治療手術(shù)后、創(chuàng)傷后、膿毒癥、炎癥或消瘦病、血管血栓形成風(fēng)險增加和嚴(yán)重的心律失常的應(yīng)用。
公開的歐洲專利申請EP-A-0687418提供了一種限制患有創(chuàng)傷、燒傷和/或膿毒癥的患者的損傷性響應(yīng)的脂質(zhì)乳劑，該脂質(zhì)乳劑可以被腸內(nèi)給藥或胃腸外給藥。
Simoens，C.等人在Clinical Nutrition(1995)，14，177-185中公開了四種包含不同植物油的脂質(zhì)乳劑對各種組織中脂肪酸組成的影響。Sato，M.等人在Journal of Parenteral and Enteral Nutrition(1994)，18，112-118中公開了在類似血漿的介質(zhì)中脂蛋白脂肪酶對包含中鏈和長鏈甘油三酯的混合脂質(zhì)乳劑的水解。
公開的德國專利申請DE-A-3721137公開了一種只包含魚油或包含魚油和植物油并包含或不包含中鏈甘油三酯的脂質(zhì)乳劑用于胃腸外營養(yǎng)和降低腫瘤生長的應(yīng)用。
公開的德國專利申請DE-A-3409793描述了一種用于輸入的脂質(zhì)乳劑，其包含含有20至22個碳原子的脂肪酸、其酯或2或多種該類脂肪酸或酯的混合物以及植物油、乳化劑、和水。脂肪酸是得自海洋來源(魚油)的酯的脂肪酸，特別是ω-3脂肪酸。所說的植物油是精制的豆油和/或紅花油。
Treskova，E.等人在Journal of Parenteral and EnteralNutrition(2000)，23，253-257中用小鼠模型對不同靜脈內(nèi)脂質(zhì)乳劑(魚油；MCT/植物油/魚油；植物油和MCT/植物油)的血漿清除率和組織靶向性進(jìn)行了比較。Billman，G.E.，等人在Circulation(1999)，99，2452-2457中令人信服地證明了以其純游離脂肪酸形式靜脈內(nèi)給藥的ω-3脂肪酸可預(yù)防狗的由局部缺血誘導(dǎo)的心律不齊。
由上面可以看出，公認(rèn)的ω-多不飽和脂肪酸的主要作用有(i)降低炎癥和栓塞反應(yīng)，(ii)降低細(xì)胞對不同刺激的反應(yīng)性(例如，降低心律失常的刺激，即心肌梗塞或局部缺血期間的刺激，在癌癥和炎癥中降低作為對介質(zhì)如TNFα響應(yīng)的惡疾)，(iii)改善組織的微灌注(例如，中風(fēng)期間或局部缺血-重新灌注后的微灌注)，
(iv)改善細(xì)胞內(nèi)的抗氧化劑情況(盡管PUFAs對過氧化物的敏感性是眾所周知的，但是其可通過足夠量的脂溶性抗氧化劑來進(jìn)行控制)，和(v)限制細(xì)胞內(nèi)的脂肪積聚。
此外，ω-3 PUFAs對于胎兒和早產(chǎn)新生兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和視網(wǎng)膜的成熟而言也是必需的。但是，在口服供給后，ω-3脂肪酸富集的速率在不同組織間有很大的差別并且在腦的一些區(qū)域和視網(wǎng)膜中特別低。
雖然ω-3脂肪酸在所有這些不同水平都起著重要作用，但人類食物攝取的發(fā)展特征為ω-3脂肪酸的消費大量增加和ω-6脂肪酸攝取的增加，在西方國家人口中尤其如此。
在一些臨床情況中更已經(jīng)證明了與進(jìn)入到細(xì)胞膜磷脂中的ω-3脂肪酸濃度十分相關(guān)的ω-3脂肪酸的益處。
本發(fā)明的一個目的是要提供一種使得可以使ω-3脂肪酸十分迅速和有效地吸收/富集到器官和組織的細(xì)胞膜中的方法和組合物。ω-3脂肪酸被有效攝入到器官和組織的細(xì)胞膜中指的是所給的ω-3脂肪酸或其母體僅有一部分(或沒有)被氧化，其大多數(shù)(或全部)都混入到器官和組織中即細(xì)胞膜中。在某些情況下，細(xì)胞膜及其磷脂富含ω-3長鏈多不飽和脂肪酸對于ω-3和ω-6脂肪酸之間的恢復(fù)和充分平衡而言是必需的(或至少是部分需要的)。獲得這些作用不僅對急性病癥中的患者而言是必需的，而且對于有增加細(xì)胞膜磷脂中ω-3脂肪酸需要的所有患者而言都是必需的，并且當(dāng)通過靜脈內(nèi)途徑給藥時可提供某些優(yōu)點，如在早產(chǎn)兒和患有惡病質(zhì)性(cachectic)(消瘦)疾病的患者和不能吸收到大量的ω-3脂肪酸的人的情況中都是有益的。
第一種選擇是輸入純ω-3 PUFA。但是，因為游離的脂肪酸具有很高的細(xì)胞毒性，所以輸入純ω-3脂肪酸PUFA的唯一可能途徑是將其與白蛋白(因為其存在于血漿中)相結(jié)合。輸入速率應(yīng)十分緩慢以避免血漿濃度的顯著增加。白蛋白的存在將增加血漿區(qū)的大小并還將顯著增加成本。
第二種選擇是輸入純魚油乳劑。但是，純魚油乳劑顆粒具有十分緩慢的消除速率，并且當(dāng)考慮其在ω-3 PUFA方面的高含量時，用純魚油乳劑所獲得的ω-3脂肪酸向細(xì)胞膜磷脂中的混入是十分低效的。這一點可以用大部分通過其它途徑如氧化而被代謝的事實來說明。
第三種選擇是輸入MLF 541——一種由公開的國際專利申請WO-A-97/19683所獲知的脂質(zhì)乳劑。按脂質(zhì)的總量計，所說的脂質(zhì)乳劑包含50％MCT(“M”)、植物油(“L”)和10％魚油(“F”)。但是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這種乳劑能維持膜磷脂中ω-3和ω-6脂肪酸之間的平衡，但是卻不能誘發(fā)特定的ω-3脂肪酸的富集。
從上面可以看出，本發(fā)明的目的是胃腸外給藥，但并不涉及為了營養(yǎng)支持/營養(yǎng)的目的而進(jìn)行的平衡的脂肪酸供給。本發(fā)明的這種目的和其它目的已經(jīng)通過包含中鏈甘油三酯(MCT)和魚油的等滲脂質(zhì)乳劑得到了解決。本發(fā)明的乳劑不包含植物油。本發(fā)明特別是涉及一種等滲的脂質(zhì)乳劑，以該乳劑中的脂質(zhì)總量計，其包含(i)約60至約95％重量的中鏈甘油三酯(MCT)，和(ii)約5至約40％重量的魚油，前提是該乳劑不包含植物油。
已經(jīng)令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，通過使用本發(fā)明的脂質(zhì)乳劑可以顯著增加某些關(guān)鍵器官和組織的細(xì)胞膜的ω-3脂肪酸含量。與包含魚油作為唯一甘油三酯來源的相似乳劑或包含魚油、植物油和中鏈甘油三酯組合的相似乳劑相比，雖然與純魚油乳劑相比使用的魚油更少并且不含任何植物油，但上面所說的本發(fā)明的脂質(zhì)乳劑更有效。已經(jīng)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)MCT與魚油的比例對所得效果有顯著影響。
本發(fā)明的中鏈甘油三酯包含具有6至14個碳原子的脂肪酸。優(yōu)選地，至少90％重量的MCTs是辛酸(C8)和癸酸(C10)的甘油三酯。本發(fā)明脂質(zhì)乳劑中的中鏈甘油三酯部分優(yōu)選地為該脂質(zhì)乳劑總脂質(zhì)含量的70％至90％，更優(yōu)選地為78％至85％重量。
已知魚油包含混入到甘油三酯中的二十碳五烯酸(EPA，20∶5ω-3)和二十二碳六烯酸(DHA，22∶6ω-3)，這些酸是所謂的高不飽和ω-3脂肪酸，其對于必需供給機(jī)體的結(jié)構(gòu)單元而言是必需的并且在生物學(xué)上是很重要的，例如作為類花生酸類物質(zhì)的母體和膜脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)元素。這些酸進(jìn)一步有助于抗血栓形成和降低脂質(zhì)的作用。因為將其從天然產(chǎn)物分離出來和其化學(xué)合成的費用都很昂貴，所以選擇用較便宜的魚油來提供這些必需脂肪酸。本發(fā)明中所用的術(shù)語“魚油”包括天然魚油、加工的魚油、高純化的魚油濃縮物或(再-)酯化的(合成的)魚油。在公開的歐洲專利申請EP-A-0298293中對加工的魚油進(jìn)行了描述，該公開物在這里被引入作為參考。
魚油的適宜實例有工業(yè)大規(guī)模得自冷水魚的油。典型的冷水魚選自鮭魚、沙丁魚、鯖魚、鯡魚、鳳尾魚、胡瓜魚和箭魚。同樣，術(shù)語魚油也包括通過ω-3-脂肪酸的(再-)酯化而合成獲得的油，其中所說的ω-3-脂肪酸如得自上面冷水魚的魚油，所說的(再-)酯化是通過將甘油三酯水解，然后進(jìn)行純化并將所得的ω-3-脂肪酸與甘油一起進(jìn)行濃縮進(jìn)行的。魚油一般包含具有12至22個碳原子鏈長度的脂肪酸的甘油酯。特別優(yōu)選的是高純化的魚油提濃物，例如，其是由沙丁魚、鮭魚、鯡魚和/或鯖魚油獲得的。以通過氣相色譜法測定的魚油提濃物的脂肪酸甲酯為基礎(chǔ)(面積百分?jǐn)?shù))，其具有20至40％，優(yōu)選至少25％的二十碳五烯酸含量。此外，以通過氣相色譜測定的魚油濃縮物的脂肪酸甲酯為基礎(chǔ)(面積百分?jǐn)?shù))，其具有約10至20％，優(yōu)選至少12％的二十二碳六烯酸含量。在可通過ω-3脂肪酸的再酯化作用合成獲得的魚油的情況中，以甘油三酯的總量計，可以將二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的總濃度升至至少45％。USP 6,159,523公開了一種制備魚油提濃物的方法。一般而言，天然魚油中ω-6系列(例如，亞油酸，18∶2ω-6)多不飽和脂肪酸的量較低并且一般低于10％，優(yōu)選低于5％。
當(dāng)要影響炎癥過程時，特別優(yōu)選地使用一種富含EPA的魚油。在ω-3脂肪酸不足從而影響了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生長和成熟的情況中，在兒科患者中特別優(yōu)選富含DHA的魚油。
以該脂質(zhì)乳劑的總脂質(zhì)含量計，本發(fā)明乳劑的魚油含量優(yōu)選地為約5％至約30％，更優(yōu)選地為約15％至約22％重量。
以水性脂質(zhì)乳劑的總重量為基礎(chǔ)，該脂質(zhì)乳劑的總脂質(zhì)含量(MCT+魚油)為約5％至約30％，優(yōu)選地為約10％至約25％重量。
在整篇說明書中，將在涉及該乳劑的脂質(zhì)濃度時使用的“％重量”與“g脂質(zhì)/100mL乳劑”可互換使用。
除蒸餾水外，該等滲的脂質(zhì)乳劑還可包含常規(guī)輔劑和/或添加劑，如乳化劑、乳化助劑(輔助乳化劑)、穩(wěn)定劑、抗氧化劑、和等滲添加劑。
對于乳化劑而言，可以使用生理上可接受的乳化劑(表面活性劑)，如動物或植物來源的磷脂。特別優(yōu)選的是精制的卵磷脂類，尤其是大豆卵磷脂、雞蛋卵磷脂、或其某些部分、或相應(yīng)的磷脂。以總?cè)閯榛A(chǔ)，乳化劑含量可以為約0.02至約2.5％重量，優(yōu)選地為約0.6％至約1.5％并且最優(yōu)選地為約1.2％重量。
此外，還可以用長鏈——C16至C20脂肪酸的堿金屬鹽來作為乳化助劑(輔助乳化劑)。尤其優(yōu)選的是其鈉鹽。以總?cè)閯榛A(chǔ)，所用輔助乳化劑的濃度為約0.005％至約0.1％，優(yōu)選地為約0.02％至約0.04％重量。此外，還可以使用單獨或與其它輔助乳化劑組合形式的膽固醇、膽固醇酯，以乳劑為基礎(chǔ)，其使用濃度為約0.005％至約0.1％，優(yōu)選地為約0.02％至約0.04％重量。
本發(fā)明的脂質(zhì)乳劑可包含有效量的抗氧化劑，如維生素E，特別是α-生育酚(其是人體內(nèi)維生素E的最具活性的異構(gòu)體)以及β-和γ-生育酚、和/或作為抗氧化劑的棕櫚酸抗壞血酸酯，從而避免形成過氧化物。所說抗氧化劑的總量可高至5000mg。在一個優(yōu)選的實施方案中，以100g脂質(zhì)為基礎(chǔ)，所說抗氧化劑的總量可以為約10mg至約2000mg，更優(yōu)選地為約25mg至約1000mg，最優(yōu)選為約100mg至500mg。
對于穩(wěn)定和等滲而言，以該乳劑為基礎(chǔ)，本發(fā)明的乳劑可包含約2％至約5％重量的穩(wěn)定劑或等滲添加劑，例如多羥基的醇。優(yōu)選甘油、山梨醇、木糖醇或葡萄糖，特別優(yōu)選甘油。以各治療必需的藥學(xué)有效量將該等滲的脂質(zhì)溶劑給予受治療者。給藥可以連續(xù)進(jìn)行或以每天一次或幾次劑量的形式進(jìn)行。藥學(xué)有效量指的是每天每公斤體重約0.1至約1.0g TG(甘油三酯)，優(yōu)選地為每天每公斤體重提供約0.2g至約0.5g TG，最優(yōu)選地為每天每公斤體重約0.25g至約0.33g TG。
關(guān)鍵的組織選自內(nèi)皮、白細(xì)胞、血小板和免疫細(xì)胞。器官選自心、腦、腎、肺、肝和脂肪。本發(fā)明等滲的脂質(zhì)乳劑和方法可用于治療患有ω-3脂肪酸普遍不足或在某些器官和組織的細(xì)胞膜中相對不足的患者。本發(fā)明的乳劑和方法特別是對于手術(shù)或經(jīng)皮血管再造術(shù)如在冠狀動脈或其它“外周”動脈中等的手術(shù)、心肌局部缺血或梗死、不穩(wěn)定的咽痛、短暫的局部腦缺血或中風(fēng)、炎癥、自體免疫性、以及血栓形成性疾病如靜脈或動脈的疾病、器官移植(既包括供體的輸入又包括受體的輸入)、血管造影操作、血液透析、早產(chǎn)兒、急性期反應(yīng)、急性呼吸痛苦綜合征、腸局部缺血、糖尿病的心血管并發(fā)癥、嚴(yán)重?zé)齻?、?yán)重的惡病質(zhì)、雷諾氏病、和細(xì)胞膜ω-3脂肪酸不足有很高的價值。
可以用本發(fā)明等滲的脂質(zhì)乳劑來制備用于治療上述疾病的藥物/藥用組合物。
本發(fā)明的脂質(zhì)乳劑一律是水包油(o/w)乳劑，其中外部連續(xù)相由精制的用于胃腸外目的的蒸餾水所組成。該類水包油(o/w)乳劑是通過將MCT和魚油進(jìn)行混合，然后乳化和滅菌來獲得的。將該脂質(zhì)乳劑的pH值調(diào)節(jié)至生理學(xué)可接受的值，優(yōu)選地將pH調(diào)至約6.0至約9.0，更優(yōu)選地為約6.5至約8.5。正如從所描述的制備方法中看出的那樣，本發(fā)明的乳劑是一種甘油三酯混合物的乳劑。在乳化前可以向該MCT/魚油混合物中加入助劑和添加劑或可以在滅菌前將其加入到該乳劑中。
本發(fā)明等滲的脂質(zhì)乳劑可以根據(jù)公知的標(biāo)準(zhǔn)操作用interization來進(jìn)行制備。常用的方法是首先將脂質(zhì)、乳化劑和其它助劑和添加劑進(jìn)行混合，然后在分散的同時用水對其進(jìn)行添補(bǔ)。水可任選地包含另外的水溶性組分(例如甘油)。由此獲得的乳劑仍然包含直徑約10微米的脂質(zhì)顆粒。然后，必須通過附加的均化來進(jìn)一步降低該乳劑的平均顆粒大小，例如用高壓均化器來進(jìn)行均化。對于胃腸外應(yīng)用而言，優(yōu)選小于約1.0微米，特別是小于約0.8微米，最優(yōu)選小于約0.5微米的中等脂質(zhì)小滴。本發(fā)明的脂質(zhì)乳劑優(yōu)選是可靜脈內(nèi)注射的。因此，本發(fā)明還涉及一種包含如上所屬的等滲脂質(zhì)乳劑的藥用組合物，其優(yōu)選是用于注射到人或動物體內(nèi)的藥用組合物。
本發(fā)明的脂質(zhì)乳劑可被胃腸外給藥于有受損的組織或器官灌注或增加的嚴(yán)重心律失常(例如心室纖維性顫動)風(fēng)險或血管血栓形成或嚴(yán)重的心律失?；蛴獬５难仔苑磻?yīng)、急性呼吸困難綜合征的患者，或在用血液透析進(jìn)行治療的患者的透析期間進(jìn)行給藥或用于迅速升高早產(chǎn)兒腦和視網(wǎng)膜中的ω-3脂肪酸含量。本發(fā)明可用于血管再造操作前處于手術(shù)前狀況或處于手術(shù)后狀況或患有炎性疾病的患者；此外，其還可用于操作如腹部手術(shù)或器官移植后嚴(yán)重或持續(xù)的侵犯后代謝反應(yīng)、和多發(fā)性損傷、炎性疾病、燒傷、感染、即將發(fā)生的或顯現(xiàn)出的膿毒癥、消瘦病。
將用下面的實施例來對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明，但不應(yīng)認(rèn)為本發(fā)明會受到這些實施例的限制。
實施例下表表示了用于下面實施例脂質(zhì)乳劑的各種油的脂肪酸組成(大約的％)表
1)中鏈甘油三酯，例如，Captex 355，Karlshamns商品。
2)豆油，例如，“Sojal”，Croda的商品。
3)紅花油，例如，“Saflorl”，Gustav Heess的商品。
4)高純化的魚油，例如，Sanomega S28GA，Nippon Oil and Fats的商品。
包含MCT、魚油和乳化劑(每100mL乳劑約1.2g得自小雞蛋黃的分級的磷脂)并任選地包含植物油的實施例中的脂質(zhì)乳劑可以用制備在水中的治療乳劑的標(biāo)準(zhǔn)工業(yè)方法來進(jìn)行制備，其是通過用Ultra-Turrax將成分進(jìn)行分散并在攪拌的同時用水性組分來對其進(jìn)行補(bǔ)充。用氫氧化鈉水溶液和/或油酸鈉將pH值調(diào)至pH 8.0至9.0。用高壓均化器在400kg/cm2下來進(jìn)行隨后的均化。在將其分散于適宜等級的玻璃瓶中后，用公知的方法來進(jìn)行熱滅菌。以總?cè)閯榛A(chǔ)，每100mL試驗乳劑具有20g的總脂質(zhì)含量，其相當(dāng)于約20％重量。該乳劑顆粒的平均粒度為約300nm并且可以變化±20％。所有的乳劑都具有大約相同的乳劑顆粒直徑。乳劑MLF 541、魚油100％、和MCT/魚油5∶5不是本發(fā)明的乳劑，其僅用于進(jìn)行比較。
材料和方法在加到細(xì)胞培養(yǎng)物之前，將脂質(zhì)制劑在血漿中在25℃下以250mgTG/dL(TG＝甘油三酯)的終濃度培養(yǎng)45分鐘并通過短期的超-離心(30分鐘；20,000g)將乳劑富含甘油三酯的顆粒(TGRP)進(jìn)行分離。此外，將HUVEC(人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)用牛脂蛋白脂肪酶(8微克/mL，在DMEM中)在室溫下培養(yǎng)30分鐘，然后將其進(jìn)行洗滌(用包含3％BSA的DMEM(Gibco)洗滌一次，用DMEM洗滌兩次)。
然后以500μg TG/mL(50mg/dL)的終濃度向細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)(含3％BSA)中加入TGRP。在37℃下培養(yǎng)4小時。在用胰蛋白酶-EDTA溶液進(jìn)行處理前將內(nèi)皮細(xì)胞用0.02％包含BSA的DMEM洗滌一次并用DMEM洗滌兩次。
用氣液色譜法對此前用薄層色譜法分離出來的液體組分(TG、CE[＝膽固醇酯]、PL)中的脂肪酸模式進(jìn)行測定(Lepage G.and Roy C.C.，J.Lipid Res.(1986)，27114-120)。
結(jié)果初步實驗在第一套實驗中，我們對我們關(guān)于培養(yǎng)物中表皮細(xì)胞生長的體外模型的再現(xiàn)性進(jìn)行了試驗。實際上，在培養(yǎng)前必須形成能保證在器皿中形成十分穩(wěn)定和融合的單分子層(并能避免過度融合)的條件，并且必須對內(nèi)皮細(xì)胞生長期間脂肪酸組成的變化進(jìn)行試驗。這一系列實驗證明在5天期間HUVEC必須在包含10％血清的介質(zhì)中進(jìn)行培養(yǎng)以達(dá)到融合，并且證明了然后，生長可以被一種在缺乏血清介質(zhì)中的2天培養(yǎng)所抑制，其確保了穩(wěn)定的脂肪酸組成。
設(shè)計了第二套實驗方案以對達(dá)到ω-3 PUFA的顯著混合的培養(yǎng)時間進(jìn)行最優(yōu)化。這些實驗表明，鑒于介質(zhì)中50mg/dL的甘油三酯濃度(其低于脂質(zhì)輸入期間血漿甘油三酯的平均上升)，在4小時內(nèi)的培養(yǎng)導(dǎo)致了內(nèi)皮細(xì)胞磷脂相當(dāng)大和近乎最大的變化。實際上，與4小時相比，在20小時期間的培養(yǎng)沒有表現(xiàn)出大的另外的改變，但是導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量增加并部分引起細(xì)胞死亡。
在用TGRP培養(yǎng)4小時后，除去包含脂質(zhì)的介質(zhì)并將代之以不含脂肪的介質(zhì)。然后將細(xì)胞再另外培養(yǎng)2小時或20小時以對內(nèi)皮細(xì)胞中脂肪酸模式的穩(wěn)定性進(jìn)行評估。在2小時和20小時后細(xì)胞磷脂中總ω-3脂肪酸的含量仍然沒有改變。但是，在20小時后，發(fā)現(xiàn)ω-3PUFA的分布輕微改變，其主要包括DPA(二十二碳五烯酸)的含量(EPA的消費)增加。這些改變可能是由于發(fā)生于細(xì)胞膜磷脂中的延伸和去飽和途徑。
乳劑甘油三酯對混入到細(xì)胞磷脂中的ω-3多不飽和脂肪酸的影響如上所述的那樣對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，然后將其在不存在(對照細(xì)胞)或存在兩種實驗性TGRP，即MCT/魚油8∶2和MCT/魚油5∶5的情況下培養(yǎng)4小時，與MLF 541(公開的國際專利申請WO-A-97/19683，Lipoplus，B.Braun Melsungen AG，德國)和純魚油(FO 100％)乳劑進(jìn)行比較。
表1在用TGRP培養(yǎng)4小時后內(nèi)皮細(xì)胞磷脂的脂肪酸組成(平均值±SD，n＝4)
(FO＝魚油)通過用MCT/魚油8∶2進(jìn)行培養(yǎng)所誘導(dǎo)的細(xì)胞磷脂內(nèi)EPA的升高分別表示了用MCT/魚油5∶5和純魚油所觀測到的75和82％的增加。在誘導(dǎo)DPA(二十二碳五烯酸，C225 ω-3)和DHA增加方面MCT/魚油8∶2至少與所有其它制劑一樣有效。
表2相對于脂質(zhì)制劑中ω-3脂肪酸含量而言內(nèi)皮細(xì)胞磷脂中ω-3PUFA的增加(Δ)(表示為重量％脂肪酸富集/魚油比例)
考慮在不同試驗制劑中的各魚油含量，顯然MCT/魚油8∶2可比所有其它制劑更有效地在細(xì)胞磷脂中混入EPA、DPA和DHA。
MLF 541在使內(nèi)皮細(xì)胞富含ω-3脂肪酸方面也表現(xiàn)出顯著的功效，而與其高魚油含量相比，純魚油和在較小程度上的MCT/魚油5∶5表現(xiàn)出較差的功效。
表3在用MLF 541、MCT/魚油8∶2或純魚油進(jìn)行處理后內(nèi)皮細(xì)胞膜磷脂中的ω-3/ω-6脂肪酸比例(重量％)
對于細(xì)胞磷脂中的ω-3/ω-6脂肪酸比例而言，MCT/魚油8∶2和FO 100％使得該平衡增加了兩倍，而MLF 541既影響ω-3脂肪酸含量又影響ω-6脂肪酸含量，因而基本沒有改變該比例。
與專利法要求進(jìn)行說明和解釋的要求相一致，上面的說明書已經(jīng)涉及了本發(fā)明的特定實施方案。但是，可以對要求保護(hù)的脂質(zhì)乳劑、用于治療的方法和將所述脂質(zhì)乳劑進(jìn)行給藥的方法進(jìn)行許多改進(jìn)、變化和修改，這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，其不會脫離所要保護(hù)的本發(fā)明的范圍和主旨。希望用下面的權(quán)利要求來包含所有該類修改和變化。
權(quán)利要求
1.一種等滲的脂質(zhì)乳劑，以乳劑中脂質(zhì)的總量為基礎(chǔ)，其包含(i)約60至約95％重量的中鏈甘油三酯(MCT)，和(ii)約5至40％重量的魚油，前提是該乳劑不包含植物油。
2.如權(quán)利要求1所述的等滲脂質(zhì)乳劑，其中所述的中鏈甘油三酯脂肪酸包含約6至約14個碳原子。
3.如權(quán)利要求2所述的等滲脂質(zhì)乳劑，其中所述的中鏈甘油三酯包括至少約90％辛酸(C8)和癸酸(C10)的甘油三酯。
4.如權(quán)利要求1所述的等滲脂質(zhì)乳劑，其中所說的魚油選自沙丁魚、鮭魚、鯡魚、鯖魚和/或其它冷水魚油或通過甘油與通過冷水魚油的水解所獲得的ω-3脂肪酸的再酯化而合成獲得的魚油。
5.如權(quán)利要求1所述的等滲脂質(zhì)乳劑，其中以魚油提濃物的脂肪酸甲酯為基礎(chǔ)，所說魚油的甘油三酯包含至少約25％的二十碳五烯酸。
6.如權(quán)利要求1所述的等滲脂質(zhì)乳劑，其中以魚油提濃物的脂肪酸甲酯為基礎(chǔ)，所說魚油的甘油三酯包含至少約12％的二十二碳六烯酸。
7.如權(quán)利要求1所述的等滲脂質(zhì)乳劑，其中以脂質(zhì)乳劑的總量為基礎(chǔ)，總脂質(zhì)含量為約5至約30％重量。
8.如權(quán)利要求1所述的等滲脂質(zhì)乳劑，其進(jìn)一步包含至少一種助劑或添加劑，所說的助劑或添加劑選自乳化劑、乳化助劑(輔助乳化劑)、穩(wěn)定劑、抗氧化劑和等滲添加劑。
9.一種通過給受治療者使用治療有效量的等滲脂質(zhì)乳劑來增加人或動物體關(guān)鍵器官和組織的細(xì)胞膜的ω-3-脂肪酸含量的方法，所說的等滲脂質(zhì)乳劑以乳劑中脂質(zhì)的總量為基礎(chǔ)，包含(i)約60至約95％重量的中鏈甘油三酯(MCT)，和(ii)約5至約40％重量的魚油，前提是該乳劑不包含植物油。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所說的中鏈甘油三酯脂肪酸包含約6至約14個碳原子。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所說的中鏈甘油三酯包括至少約90％辛酸(C8)和癸酸(C10)的甘油三酯。
12.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所說的魚油選自沙丁魚、鮭魚、鯡魚、鯖魚和/或其它冷水魚油或通過甘油與通過冷水魚油的水解所獲得的ω-3脂肪酸的再酯化而合成獲得的魚油。
13.如權(quán)利要求9所述的方法，其中以魚油提濃物的脂肪酸甲酯為基礎(chǔ)，所說魚油的甘油三酯包含至少約25％的二十碳五烯酸。
14.如權(quán)利要求9所述的方法，其中以魚油提濃物的脂肪酸甲酯為基礎(chǔ)，所說魚油的甘油三酯包含至少約12％的二十二碳六烯酸。
15.如權(quán)利要求9所述的方法，其中以該脂質(zhì)乳劑的總量為基礎(chǔ)，總脂質(zhì)含量為約5至約30％重量。
16.如權(quán)利要求9所述的方法，其進(jìn)一步包含至少一種助劑或添加劑，所說的助劑或添加劑選自乳化劑、乳化助劑(輔助乳化劑)、穩(wěn)定劑、抗氧化劑和等滲添加劑。
17.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所說的器官選自心、腎、腦、肝、肺和脂肪組織。
18.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所說的組織選自內(nèi)皮、白細(xì)胞、血小板和免疫細(xì)胞。
19.如權(quán)利要求9所述的方法，其是用于治療手術(shù)或經(jīng)皮血管再造術(shù)、心肌局部缺血或梗死、不穩(wěn)定的咽痛、短暫的局部腦缺血或中風(fēng)、炎癥、自體免疫、以及血栓形成性疾病、器官移植、血管造影操作、血液透析、早產(chǎn)兒、急性期反應(yīng)、急性呼吸痛苦綜合征、腸局部缺血、糖尿病的心血管并發(fā)癥、嚴(yán)重?zé)齻?、?yán)重的惡病質(zhì)、雷諾氏病、以及細(xì)胞膜中ω-3脂肪酸不足。
20.一種等滲的脂質(zhì)乳劑用于制備增加關(guān)鍵細(xì)胞和組織細(xì)胞膜ω-3脂肪酸含量的藥物，其中以乳劑中脂質(zhì)的總量為基礎(chǔ)，所說的等滲脂質(zhì)乳劑包含(i)約60至約95％重量的中鏈甘油三酯(MCT)，和(ii)約5至約40％重量的魚油，前提是該乳劑不包含植物油。
21.如權(quán)利要求20所述的應(yīng)用，其中所說的中鏈甘油三酯脂肪酸包含約6至約14個碳原子。
22.如權(quán)利要求20所述的應(yīng)用，其中所說的中鏈甘油三酯包括至少約90％辛酸(C8)和癸酸(C10)的甘油三酯。
23.如權(quán)利要求2 0所述的應(yīng)用，其中所說的魚油選自沙丁魚、鮭魚、鯡魚、鯖魚和/或其它冷水魚油或通過甘油與通過冷水魚油的水解所獲得的ω-3脂肪酸的再酯化而合成獲得的魚油。
24.如權(quán)利要求20所述的應(yīng)用，其中以魚油提濃物的脂肪酸甲酯為基礎(chǔ)，所說魚油的甘油三酯包含至少約25％的二十碳五烯酸。
25.如權(quán)利要求20所述的應(yīng)用，其中以魚油提濃物的脂肪酸甲酯為基礎(chǔ)，所說魚油的甘油三酯包含至少約12％的二十二碳六烯酸。
26.如權(quán)利要求20所述的應(yīng)用，其中以該脂質(zhì)乳劑的總量為基礎(chǔ)，總脂質(zhì)含量為約5至約30％重量。
27.如權(quán)利要求20所述的應(yīng)用，其進(jìn)一步包含至少一種助劑或添加劑，所說的助劑或添加劑選自乳化劑、乳化助劑(輔助乳化劑)、穩(wěn)定劑、抗氧化劑和等滲添加劑。
28.如權(quán)利要求20所述的應(yīng)用，其中所說的器官選自心、腎、腦、肝、肺和脂肪組織。
29.如權(quán)利要求20所述的應(yīng)用，其中所說的組織選自內(nèi)皮、白細(xì)胞、血小板和免疫細(xì)胞。
30.如權(quán)利要求20所述的應(yīng)用，其是用于治療手術(shù)或經(jīng)皮血管再造術(shù)、心肌局部缺血或梗死、不穩(wěn)定的咽痛、短暫的局部腦缺血或中風(fēng)、炎癥、自體免疫、以及血栓形成性疾病、器官移植、血管造影操作、血液透析、早產(chǎn)兒、急性期反應(yīng)、急性呼吸痛苦綜合征、腸局部缺血、糖尿病的心血管并發(fā)癥、嚴(yán)重?zé)齻?、?yán)重的惡病質(zhì)、雷諾氏病、以及細(xì)胞膜中ω-3脂肪酸不足。
31.一種包含一種等滲脂質(zhì)乳劑的藥用組合物，其中以該乳劑中的脂質(zhì)總量為基礎(chǔ)，所說的等滲脂質(zhì)乳劑包含(i)約60至約95％重量的中鏈甘油三酯(MCT)，和(ii)約5至約40％重量的魚油，前提是該乳劑不包含植物油。
32.如權(quán)利要求31所述的藥用組合物，其中所說的中鏈甘油三酯脂肪酸包含約6至約14個碳原子。
33.如權(quán)利要求32所述的藥用組合物，其中所說的中鏈甘油三酯包括至少約90％辛酸(C8)和癸酸(C10)的甘油三酯。
34.如權(quán)利要求31所述的藥用組合物，其中所說的魚油選自沙丁魚、鮭魚、鯡魚、鯖魚和/或其它冷水魚油或通過甘油與通過冷水魚油的水解所獲得的ω-3脂肪酸的再酯化而合成獲得的魚油。
35.如權(quán)利要求31所述的藥用組合物，其中以魚油提濃物的脂肪酸甲酯為基礎(chǔ)，所說魚油的甘油三酯包含至少約25％的二十碳五烯酸。
36.如權(quán)利要求31所述的藥用組合物，其中以魚油提濃物的脂肪酸甲酯為基礎(chǔ)，所說魚油的甘油三酯包含至少約12％的二十二碳六烯酸。
37.如權(quán)利要求31所述的藥用組合物，其中以該脂質(zhì)乳劑的總量為基礎(chǔ)，總脂質(zhì)含量為約5至約30％重量。
38.如權(quán)利要求31所述的藥用組合物，其進(jìn)一步包含至少一種助劑或添加劑，所說的助劑或添加劑選自乳化劑、乳化助劑(輔助乳化劑)、穩(wěn)定劑、抗氧化劑和等滲添加劑。
39.胃腸外應(yīng)用的如權(quán)利要求31所述的藥用組合物。
40.用于注射的如權(quán)利要求39所述的藥用組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于迅速改變器官和組織的細(xì)胞膜脂肪酸組成的組合物和方法，其特別是涉及通過給人或動物體胃腸外使用包含脂肪酸甘油三酯的等滲脂質(zhì)乳劑形式的脂肪酸來增加器官和組織的細(xì)胞膜的ω－3脂肪酸的量。
文檔編號A61K31/231GK1553798SQ02817634
公開日2004年12月8日 申請日期2002年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月25日
發(fā)明者Y·卡彭蒂爾, I·杜龐特, Y 卡彭蒂爾, 猶 申請人:目標(biāo)打擊股份公司