專利名稱：抗氧化組合物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防和/或治療由氧化應(yīng)力(stress)、伴隨氧化應(yīng)力而來(lái)的過(guò)早生理性細(xì)胞程序死亡現(xiàn)象和/或環(huán)境因素誘導(dǎo)的細(xì)胞程序死亡引起的病癥或者疾病的組合物。
因此，該組合物可以采取飲食補(bǔ)充物或者藥物的形式發(fā)揮作用，這依賴其支持或者預(yù)防性作用，或者嚴(yán)格的治療作用，這些作用是該組合物對(duì)其施用的特定個(gè)體所要起到的作用。
本發(fā)明組合物能夠有效預(yù)防或者治療的疾病包括動(dòng)脈粥樣硬化、缺血再灌注性損傷、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、癌癥、中風(fēng)、白內(nèi)障和其他眼科疾病、甲狀腺疾病、肝病、性功能障礙、帕金森氏癥、阿爾茨海默氏病以及受病毒感染病人的各種變性病癥。
氧化應(yīng)力、氧化應(yīng)力引起的過(guò)早發(fā)生的生理性細(xì)胞程序死亡現(xiàn)象和環(huán)境因素誘導(dǎo)的細(xì)胞程序死亡是由反應(yīng)性氧物質(zhì)(ROS)產(chǎn)生的。ROS是高反應(yīng)性的物質(zhì)，它形成于生理性正常代謝反應(yīng)之后以及線粒體呼吸鏈的電子運(yùn)輸過(guò)程中。
氧化應(yīng)力能夠被抗氧化劑中和，后者通過(guò)調(diào)節(jié)發(fā)生在體內(nèi)的氧化過(guò)程而在保持健康方面舉足輕重。ROS的失控生成引起的氧化性損傷已經(jīng)被認(rèn)為是數(shù)目日益增加的臨床病癥的病因，例如前面所列的那些病癥。
ROS介導(dǎo)的細(xì)胞和組織的損傷的機(jī)理主要包括脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、氧化性DNA損傷和蛋白質(zhì)氧化，但是也有ROS能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的證據(jù)。實(shí)際上，內(nèi)生性抗氧化系統(tǒng)的紊亂能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)可能是正向或者負(fù)向，分別導(dǎo)致在低過(guò)氧化物水平時(shí)刺激細(xì)胞增殖或者在高濃度下導(dǎo)致細(xì)胞程序死亡/細(xì)胞壞死。
因此，顯而易見(jiàn)的是，研究能夠中和這種氧化途徑的化合物就可能具有相應(yīng)的臨床效果。均衡的人體飲食含有多種抗氧化劑，并且有強(qiáng)有力的證據(jù)表明那些抗氧化劑物質(zhì)之間存在累加與協(xié)同作用。從臨床的角度來(lái)看，這意味著使用含多個(gè)抗氧化性物質(zhì)的組合物所提供的抗氧化應(yīng)力的保護(hù)與單獨(dú)使用每種抗氧化劑相比可能會(huì)顯著改善。
本發(fā)明的主要目標(biāo)就是提供這樣一種組合物。
目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一種可口服或者腸胃外給藥的組合物(i)，該組合物含有混合(in administrative)或者分開(kāi)包裝的下列成分(a)L-肉堿內(nèi)鹽或其可藥用鹽；(b)乙酰L-肉堿內(nèi)鹽或其可藥用鹽；(c)α-硫辛酸；(d)輔酶Q10；(e)維生素E；與(f)硒代蛋氨酸，該組合物完全達(dá)到了有效中和氧化應(yīng)力的滿意目標(biāo)。
L-肉堿和乙酰L-肉堿的可藥用鹽是指其與酸形成的任何鹽類(lèi)，所述酸不會(huì)引起不想要的毒害或者副作用。這些酸對(duì)藥理學(xué)家和制藥技術(shù)專家來(lái)說(shuō)是眾所周知的。
這樣的鹽類(lèi)的非限制性例子如下氯化物；溴化物；碘化物；天冬氨酸鹽，酸式天冬氨酸鹽；檸檬酸鹽，酸式檸檬酸鹽；酒石酸鹽；磷酸鹽，酸式磷酸鹽；延胡索酸鹽，酸式延胡索酸鹽；半乳糖二酸鹽；甘油磷酸鹽；葡萄糖磷酸鹽；乳酸鹽；馬來(lái)酸鹽，酸性馬來(lái)酸鹽；乳清酸鹽；草酸鹽；酸式草酸鹽；硫酸鹽，酸式硫酸鹽；三氯乙酸鹽；三氟乙酸鹽以及甲基磺酸鹽。
一份FDA批準(zhǔn)的藥理學(xué)可接受的酸類(lèi)名單列于Int.J.Pharm.，33，1986，201-217，這份最近的出版物在本說(shuō)明書(shū)中引用以備參考之用。
關(guān)于固體給藥形式的制備，比如，藥片、藥丸、膠囊和顆粒，優(yōu)選使用非吸濕性鹽類(lèi)。
本發(fā)明單位劑量形式的組合物(ii)包含(a)20-110毫克L-肉堿內(nèi)鹽或者等摩爾量的其可藥用鹽；
(b)20-110毫克乙酰L-肉堿內(nèi)鹽或者等摩爾量的其可藥用鹽；(c)70-130毫克α-硫辛酸；(d)90-110毫克輔酶Q10；(e)5-15毫克維生素E；與(f)40-60微克硒代蛋氨酸。
特別優(yōu)選的組合物(iii)包含(a)100毫克L-肉堿內(nèi)鹽；(b)100毫克乙酰L-肉堿內(nèi)鹽；(c)100毫克α-硫辛酸；(d)100毫克輔酶Q10；(e)10毫克維生素E；與(f)50微克硒代蛋氨酸。
本發(fā)明同時(shí)涉及預(yù)防/治療方法，該方法包括給有這種需要的病人服用有效量的前述組合物(i)。正在進(jìn)行多劑量給藥方案的病人優(yōu)選服用前述單位劑量形式的組合物(ii)，以及更特別地，可以服用單位劑量形式的組合物(iii)。本方法尤其適用于那些正在補(bǔ)充精氨酸的病人，因?yàn)榍笆鼋M合物對(duì)預(yù)防/對(duì)抗由上述補(bǔ)充精氨酸引起的氧化氮誘導(dǎo)的氧化性損傷效果顯著。
最近幾年里，不僅營(yíng)養(yǎng)方面的醫(yī)師而且心臟病專家與內(nèi)分泌專家也已經(jīng)越來(lái)越多地推薦包含精氨酸的飲食補(bǔ)充。
精氨酸能比其他任何氨基酸更有效地減少膽固醇。6-17克的精氨酸日劑量已經(jīng)被證明能降低低密度脂蛋白-膽固醇，不會(huì)影響高密度脂蛋白-膽固醇，而且不會(huì)引起副作用。精氨酸還促進(jìn)高膽固醇人群健康的冠狀微循環(huán)，并且抑制血凝塊的形成，血凝塊是導(dǎo)致心臟病和中風(fēng)的主要病因。據(jù)報(bào)道，向心絞痛病人的冠狀血管直接灌輸精氨酸能顯著地恢復(fù)他們的循環(huán)。
精氨酸是一種一氧化氮前體。一氧化氮(NO)通常由許多類(lèi)型的細(xì)胞產(chǎn)生，并且在從神經(jīng)傳遞到血管舒張的領(lǐng)域扮演各種角色。通過(guò)松馳動(dòng)脈，一氧化氮能夠改善循環(huán)相關(guān)疾病，比如心絞痛、間歇性跛行、高血壓以及腦循環(huán)損傷。
盡管一氧化氮有那么多益處，但它是一種自由基，一種有毒的氧化劑超出50到100ppm的水平能產(chǎn)生肺部毒性。
臨床試驗(yàn)下面的臨床試驗(yàn)對(duì)前面提到的組合物(iii)的抗氧化功效進(jìn)行了評(píng)估。該組合物以小藥囊的形式提供。
1.1研究設(shè)計(jì)本試驗(yàn)是一個(gè)16周的隨機(jī)試驗(yàn)?？偣灿?0個(gè)健康的受試者(12男，8女)參加了這次研究。這些受試者必須滿足下列包含標(biāo)準(zhǔn)非吸煙者，沒(méi)有服用維生素/抗氧化劑或者雌激素補(bǔ)劑、甲狀腺素或者降脂藥物；血糖、肝及腎功能測(cè)試正常；參加本研究前至少三個(gè)月無(wú)急性疾?。粎⒓诱弑粐诟涝趯?shí)驗(yàn)期間不得選擇特別的生活方式，堅(jiān)持他們?nèi)粘５娘嬍澈蜕眢w活動(dòng)，并且不得改變維生素豐富食物的消費(fèi)；在研究期間，無(wú)人接受任何額外的補(bǔ)劑或者藥物。參加者給出書(shū)面允諾，并且被要求每周進(jìn)行匯報(bào)。
參加者在三個(gè)星期的時(shí)間內(nèi)每天服用一小藥囊組合物(iii)的形式的抗氧化補(bǔ)劑。該小藥囊組合物每天早晨飯后服用。對(duì)照組A(5個(gè)受試者)只服用乙酰L-肉堿和L-肉堿，并且對(duì)照組B(6個(gè)受試者)只服用與組合物(iii)等量的硒代蛋氨酸、α-生育酚、α-硫辛酸以及輔酶Q10。
參加研究小組的受試者與兩個(gè)對(duì)照組中的受試者在開(kāi)始研究時(shí)在年齡、體重指標(biāo)和脂肪分布(lipid profile)方面是相似的。安全評(píng)價(jià)包括負(fù)作用和生命跡象評(píng)價(jià)、血液學(xué)檢驗(yàn)、生化檢驗(yàn)、尿液分析以及體格檢查。這些評(píng)價(jià)在治療開(kāi)始前在基線完成，然后在治療期的每周以及完成該研究?jī)蓚€(gè)星期后進(jìn)行評(píng)價(jià)。
1.2抗氧化酶的分析酶活性在新鮮紅細(xì)胞中確定。離心1毫升血液后，紅細(xì)胞用等滲溶液沖洗三次，然后在雙蒸水中溶解(終體積為5毫升)。超氧化物岐化酶(SOD)活性根據(jù)Flohé和Otting(Flohé，L.，Otting F.，MethodsEnzymol.10593-104，1984)確定。過(guò)氧化氫酶(CAT)活性根據(jù)Pippenger等[Pippenger，C.E.，Browne，R.W.，Armstrong，D.，Regulatory antioxidant enzymes；Methods in Molecular Biology；Free Radical and Antioxidant Protocols(D.Armstrong，Ed.)vol108，pp299-313，Humana Press，Totowa NJ，1998.]確定。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSHPX)活性根據(jù)Flohé和Gunzler(Flohé，L.，Gunzler，W.A.，Methods Enzymol.105114-121，1984)確定。結(jié)果以酶單位/毫克血紅蛋白表示。
1.3血漿維生素E，輔酶Q10與QH2的測(cè)量維生素E與輔酶Q10的測(cè)定依據(jù)Lang等人的方法(Lang，J.K.，Gohil，K.，Packer，L.，Anal.Biochem.157106-116，1986)。血漿通過(guò)新鮮汲取短暫離心(在4℃800g持續(xù)5分鐘)后的肝素化靜脈血得到。1毫升血漿與含有0.1毫摩爾BHT的1毫升乙醇混合，并且用3毫升正己烷萃取。然后將正己烷相在氮?dú)饬飨抡舭l(fā)至干，重新溶于乙醇。取400微升經(jīng)0.45微米過(guò)濾器過(guò)濾后，取其中100微升等份用于HPLC分析。HPLC系統(tǒng)由一個(gè)配有兩個(gè)510泵的Waters裝置、一個(gè)帶有100微升環(huán)的Rheodyne進(jìn)樣閥、一個(gè)配有相同材料基質(zhì)預(yù)柱(guardcolumn)(10毫米)并穩(wěn)定于27℃的Symmetry 300柱(反相C18，4.6×25厘米，粒徑5微米)、一個(gè)Waters996二極管陣列檢測(cè)器和一個(gè)Waters474熒光光譜檢測(cè)器組成。這兩個(gè)檢測(cè)器呈直線裝配，柱中流體首先經(jīng)過(guò)紫外(UV)檢測(cè)器。用由A(80/20體積/體積甲醇/水)和B(95/5體積/體積乙醇/異丙醇)組成的混合物作為梯度以1毫升/分鐘的流速洗脫。初始狀態(tài)為39％A和61％B。16分鐘后，流動(dòng)相線性改變兩分鐘后到100％B；100％B持續(xù)10分鐘，此后系統(tǒng)反向線性改變兩分鐘后到初始狀態(tài)?；诜乎?Rt＝25.1分鐘；λmax＝290nm)與泛醌(Rt＝27.1分鐘；λmax＝275nm)的保留時(shí)間和吸收光譜，以及維生素E(Rt＝18.2分鐘；λmax＝292nm；λex＝220nm；λem＝335nm)的保留時(shí)間、熒光和吸收光譜來(lái)鑒別峰。峰定量通過(guò)采用專用軟件進(jìn)行自動(dòng)峰面積整合來(lái)完成。
1.4TRAP分析總自由基俘獲抗氧化參數(shù)(TRAP)根據(jù)Ghiselli等(Ghiselli，A.，Serafini，M.，Maiani G.，Azzini，E.，F(xiàn)erro-Luzzi，A.，F(xiàn)ree Radic.Biol.Med.1829-36，1995)來(lái)確定。
1.5血漿氫過(guò)氧化物的定量血清氧化能力的估計(jì)采用意大利DIACRONs.r.l生產(chǎn)的D-ROMs試劑盒檢測(cè)方法。該方法基于氫過(guò)氧化物存在下過(guò)渡金屬通過(guò)Fenton型反應(yīng)催化形成羥基自由基(-OH)的能力。產(chǎn)生的羥基自由基的量與存在于血漿中的過(guò)氧化物的量直接成比例，該自由基被N，N-二乙基-對(duì)-苯二胺分子俘獲后，形成λmax為505nm的色原。
1.6淋巴細(xì)胞的分離PBMCs從肝素化外周血中通過(guò)Lymphoprep梯度離心(Nycomed，Oslo，Norway)分離，用磷酸緩沖鹽(PBS)沖洗兩次，再重懸于補(bǔ)加了10％熱滅活胎牛血清(FCS；Life Technologics)、10IU/毫升盤(pán)尼西林/鏈霉素(Life Technologics)、10mM HEPES(Sigma ChemicalCompany，St.Louis，MO，USA)和1mM L-谷氨酰胺(Life Technologics)的RPMI1640(Life Technologics，Inc.，Paisley，UK)培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)中。在程序性細(xì)胞死亡分析中，PBMCs(5×105/毫升)在37℃、5％CO2增濕空氣下于完全培養(yǎng)基上培養(yǎng)12個(gè)小時(shí)。另外，為了對(duì)線粒體的功能進(jìn)行分析，分離細(xì)胞等分試樣并保持在4℃完全培養(yǎng)基上直到標(biāo)記。
1.7細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)抗原的表達(dá)帶有CD4或者CD8表型的細(xì)胞絕對(duì)數(shù)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)確定。PBMCs用如下抗體染色藻紅蛋白(PE)-標(biāo)記的抗-hCD4或者抗-hCD8(BectonDickinson，Immunocytometry Systems，BDIS，San Josè，CA，USA)。為了對(duì)表面抗原進(jìn)行染色，將5×105PBMCs用含有1％BSA(Sigma)與0.1％疊氮化鈉的PBS(PBS-BSA-NaN3)沖洗，然后在4℃用前面所述的單克隆抗體溫育20分鐘。為了確定背景染色，將細(xì)胞用20微升小鼠IgG1PE(Becton Dickinson)溫育。然后，用含有2％FCS的PBS-BSA-NaN3沖洗兩次，用FACScan流式細(xì)胞計(jì)量?jī)x(Becton Dickinson)采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)標(biāo)記過(guò)的細(xì)胞進(jìn)行分析。每個(gè)樣品根據(jù)大小(前向角散射，F(xiàn)SC)和粒度(側(cè)向角散射，SSC)參數(shù)選通10,000個(gè)活淋巴細(xì)胞。
1.8用碘化丙錠對(duì)程序死亡細(xì)胞核染色淋巴細(xì)胞程序死亡采用Nicoletti等(Nicoletti，I.；Migliorati，G.；Pagliacci，C.；Grignani，F(xiàn).；Riccardi，C.，J.Immunol.Method 139271-279，1968)的方法以含有亞二倍DNA細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)來(lái)定量。簡(jiǎn)而言之，在經(jīng)過(guò)短時(shí)間培養(yǎng)后，細(xì)胞懸浮液在200g下離心10分鐘。為了對(duì)表面抗原染色，1×106個(gè)細(xì)胞的等分試樣用前面所述的結(jié)合有異硫氰酸熒光素(FITC)的抗-hCD4或者抗-hCD8(Becton Dickinson)mAbs進(jìn)行培養(yǎng)，并且沖洗后，輕輕地重懸于1毫升低滲熒光染料溶液(0.1％檸檬酸鈉加0.1％Triton X-100TM，含50微克/毫升的PI，0.05毫克/毫升的RNaseA；Sigma)。細(xì)胞在4℃保存過(guò)夜，然后在置于FACScan流式細(xì)胞計(jì)量?jī)x(Becton Dickinson)上的染色溶液中進(jìn)行分析，該流式細(xì)胞計(jì)量?jī)x裝有一個(gè)15毫瓦空氣冷卻的488nm氬離子激光器。程序死亡細(xì)胞核在紅色熒光信道下顯示一個(gè)寬的亞二倍體DNA峰，它與含有正常(二倍體)DNA的細(xì)胞核顯示的窄峰很容易區(qū)分。橙色PI熒光在一束585/42nm波段光通過(guò)濾光器后被收集到，并且以四個(gè)對(duì)數(shù)值(four decade log)的規(guī)模顯示。流式血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上的檢測(cè)以低樣品流速(12μl/min)來(lái)實(shí)現(xiàn)，目的是為了提高DNA直方圖的變動(dòng)系數(shù)。以它們的FSC和SSC參數(shù)為基礎(chǔ)選通(gated)淋巴細(xì)胞(包括活的、早期程序死亡和后期程序死亡細(xì)胞)，在FSC對(duì)PI熒光雙參數(shù)輪廓圖上選通熒光數(shù)據(jù)，以排除單核細(xì)胞、細(xì)胞殘骸以及細(xì)菌凝塊。這種選通方法能很容易地區(qū)分細(xì)胞殘骸(很低的FSC和降低的PI熒光)與死亡細(xì)胞(低FSC和高PI熒光)。每份樣品至少收集到了10,000個(gè)事件(events)。
1.9程序死亡T細(xì)胞的表型分析短期培養(yǎng)淋巴細(xì)胞中的程序死亡細(xì)胞的定量與表型分析采用Schmid等(Schmid，I.，Uittenbogaart，C.H.，Keld，B.，Giorgi，J.V.，J.Immunol.
Methods170145-157；1994)報(bào)道的方法用7-氨基-放線菌素D(7-AAD；Sigma)染色程序死亡細(xì)胞而進(jìn)行。這種方法證明能根據(jù)它們?cè)黾拥募?xì)胞膜通透性區(qū)分早期和晚期程序死亡細(xì)胞。經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞首先用上述表面抗原的FITC綴合單克隆抗體培育，并且沖洗過(guò)的細(xì)胞接著用20微克/毫升的7-AAD在4℃避光培育20分鐘。在20微克/毫升非熒光放線菌素D(Sigma)存在下，染色過(guò)的細(xì)胞進(jìn)一步用含有1％多聚甲醛的PBS固定，以防止程序死亡細(xì)胞中的7-AAD染色和避免活細(xì)胞非特異性標(biāo)記。最后，雙重染色的細(xì)胞在4℃黑暗中培育過(guò)夜，然后在其染色溶液中用FACScan流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器(BectonDickinson)分析。綠色熒光經(jīng)530/30BPnm濾光器后收集，來(lái)自7-AAD的紅色熒光經(jīng)650長(zhǎng)穿透(long pass)濾光器濾過(guò)。將FSC與7-AAD熒光結(jié)合生成散點(diǎn)圖，并且在具有負(fù)(活細(xì)胞)、淡(早期程序死亡細(xì)胞)和亮(后期程序死亡細(xì)胞)熒光的清晰群體周?chē)?huà)出區(qū)域。每個(gè)樣品至少收集到10,000個(gè)事件。
1.10線粒體功能分析為了同時(shí)對(duì)表面標(biāo)記和ROS(比如超氧化物陰離子和羥基過(guò)氧化物)的形成進(jìn)行估計(jì)，首先將細(xì)胞用PE標(biāo)記的抗-hCD4或者抗-hCD8抗體染色，然后在37℃下2毫摩爾/升的hydroethidine(HE；MolecularProbes)和37℃下5mm2’，-7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)(Molecular Probes)中分別暴露15分鐘和1小時(shí)。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞在與解偶聯(lián)試劑羰基氰化物間氯苯腙(mClCCP；50毫摩爾/升，37℃，30分鐘；Sigma)或者ROS-生成試劑2-甲萘醌(1毫摩爾/升，37℃，1小時(shí)，Sigma)預(yù)先培育后進(jìn)行標(biāo)記。對(duì)于DCFH-DA，采取了陽(yáng)性對(duì)照(細(xì)胞在15mM H2O2中保存2分鐘并沖洗三次)。Monobromobimane(MBB)(Molecular Probes)染色谷胱甘肽(GSH)。在谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶存在下，MBB在低濃度下與GSH非酶促結(jié)合，產(chǎn)生GSH特異性熒光。簡(jiǎn)而言之，將T細(xì)胞成團(tuán)化，并在1毫升含有40μMMBB的培養(yǎng)基中室溫黑暗重懸10分鐘。在FACScan細(xì)胞熒光計(jì)(BectonDickinson)上進(jìn)行分析操作之前將細(xì)胞置于冰上。對(duì)正常大小淋巴細(xì)胞的主要群體選通FSC與SSC參數(shù)。適當(dāng)補(bǔ)償后，在不同波長(zhǎng)下記錄熒光在525nm為FITC，DCFH-DA和MBB(FL-1)，在575nm為PE(FL-2)以及600nm下為HE(FL-3)。
2 統(tǒng)計(jì)分析所有結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Student t檢驗(yàn)進(jìn)行組之間的統(tǒng)計(jì)對(duì)比。P值＜0.05認(rèn)為是顯著的。
結(jié)果血漿抗氧化狀態(tài)與過(guò)氧化物水平補(bǔ)充前述組合物(iii)21天導(dǎo)致總抗氧化狀態(tài)的顯著增高(表1)。從血漿TRAP值和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的測(cè)定中得到了支持這種增強(qiáng)的抗氧化狀態(tài)的證據(jù)。在兩個(gè)對(duì)照組中也發(fā)現(xiàn)了相當(dāng)?shù)腡RAP值的上升，這兩個(gè)小組只使用組合物成分中的一部分，即對(duì)照組A使用肉堿，對(duì)照組B使用硒代蛋氨酸、α-生育酚、α-硫辛酸以及輔酶Q10。相反地，發(fā)現(xiàn)處理末期組合物組中血漿過(guò)氧化物水平與基線相比顯著下降，而兩個(gè)對(duì)照組的下降程度則較低。
維生素E、輔酶Q10和QH2的基線血漿水平分別為26、0.50、0.66納摩爾/毫升，與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)相當(dāng)。補(bǔ)充組合物3星期導(dǎo)致α-生育酚、輔酶Q10、QH2的平均血漿水平以及QH2/(Q10+QH2)比率(表1)的增加。有趣的是，補(bǔ)充該組合物導(dǎo)致血漿輔酶(主要為它的還原態(tài))濃度增加1.5倍。
紅細(xì)胞中抗氧化酶的活性在治療小組中，服用組合物導(dǎo)致治療末期抗氧化酶GSHPX(p＜0.01)的特異活性比基線值顯著增加(表2)。對(duì)照組B中也發(fā)現(xiàn)了GSHPX活性有相似的增加(p＜0.01)。補(bǔ)充組合物或者組合物的一些組分后，發(fā)現(xiàn)SOD活性沒(méi)有顯著變化。服用組合物的小組在研究末期的CAT活性與基線相比顯著下降(p＜0.05)；兩個(gè)對(duì)照組中也觀察到了CAT活性下降的趨勢(shì)，不過(guò)在服用組合物的一些成分前測(cè)得的值的差異沒(méi)有達(dá)到統(tǒng)計(jì)顯著性。
淋巴細(xì)胞程序死亡組合物的補(bǔ)充與淋巴細(xì)胞對(duì)程序死亡敏感性的降低相聯(lián)系。實(shí)際上，與基線相比，受治療病人經(jīng)3星期補(bǔ)充后遭受程序死亡的淋巴細(xì)胞數(shù)量減少了。這通過(guò)PI染色程序死亡細(xì)胞核建立(參考Nicoletti等，同上)，也就是探測(cè)諸如染色質(zhì)濃縮與DNA等程序細(xì)胞死亡后期事件(Wyllie，A.N.，Morris，R.G.；Smith，A.L.；Dunlop，D.，J.Pathol.14267-77；1991)。在完全培養(yǎng)基中培育12小時(shí)后，接受3星期處理后的CD4與CD8淋巴細(xì)胞與治療前水平相比細(xì)胞自發(fā)性程序死亡率顯著下降(CD4與CD8的基線分別為6.1±0.59和6.8±3.03，處理期末分別為2.8±1.52和3.9±2.09；兩參數(shù)p＜0.01)(表3)。只補(bǔ)充肉堿對(duì)程序細(xì)胞死亡的CD4和CD8淋巴細(xì)胞的頻率有相當(dāng)甚至更大的影響(CD4與CD8淋巴細(xì)胞的基線分別為7.2+1.19和12.2+3.24，處理期末分別為3.9+1.19和5.4+1.94；CD4與CD8細(xì)胞皆為P＜0.01)。甚至服用硒代蛋氨酸、α-生育酚、α-硫辛酸、輔酶Q10的受試者與治療前水平相比程序死亡淋巴細(xì)胞的頻率也有了很大下降(CD4與CD8細(xì)胞的基線分別為6.7+1.58和8.6+1.91，處理期末分別為3.7+1.59和5.9+1.12，兩參數(shù)P＜0.01)。
用7-AAD測(cè)量程序細(xì)胞死亡也進(jìn)一步證實(shí)了這些結(jié)果，7-AAD是一種DNA插入熒光試劑，它只穿透正遭受程序細(xì)胞死亡而因此表現(xiàn)出收縮表型(縮減的FSC)的細(xì)胞膜(兩參數(shù)p＜0.001)(表3)。
反應(yīng)性氧物質(zhì)的生成如表4所示，來(lái)自參加本研究健康自愿者的循環(huán)淋巴細(xì)胞含有一部分能氧化非熒光親脂性(比如膜通透)染料HE成為親水性熒光產(chǎn)物Eth的細(xì)胞。由于HE對(duì)超氧化物陰離子特別敏感，這種變化可能反映了超氧化物陰離子的生成(Rothe，G.；Valet，G.，J.Leukoc.Biol.47440-446，1990)。此外，淋巴細(xì)胞用一種檢測(cè)氫過(guò)氧化物生成的熒光染料DCFH-DA標(biāo)記(Rothe等，同上，和Hockenbery，D.M.，Oltvai，Z.N.，Yin，X.M.，Milliman，C.L.，Korsmeyer，S.J.，Cell 75241-251，1993)。
我們發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充組合物與這種細(xì)胞百分?jǐn)?shù)跟治療前水平相比劇烈下降有關(guān)，其中所述細(xì)胞具有Eth高與DCFH-DA陽(yáng)性表型(表4)。對(duì)于用HE或者DCFH-DA染色過(guò)的CD4和CD8細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)分析顯示治療前后水平之間有非常顯著的差異(兩參數(shù)p＜0.001)。
在對(duì)照組A和B中，同樣發(fā)現(xiàn)了Eth高與DCFH-DA陽(yáng)性的CD4與CD8亞類(lèi)的發(fā)生次數(shù)也有顯著的下降，即使所述對(duì)照組中的補(bǔ)充對(duì)那些參數(shù)影響(雖然統(tǒng)計(jì)上很顯著)小于用組合物治療的(表4)。
用本組合物治療也跟具有谷胱甘肽染色陽(yáng)性的CD4或者CD8表型的循環(huán)淋巴細(xì)胞發(fā)生次數(shù)的增加有關(guān)(在T0和T1分別為，CD455.1±7.71和59.2±4.58；CD869.4±4.98和74.9±6.29；p分別為p＜0.05與p＜0.01)。我們發(fā)現(xiàn)只服用乙酰L-肉堿和L-肉堿(在T0和T1分別為，CD456.9±4.58和61.1±3.49；CD864.9±7.22和76.3±6.77，p分別為p＜0.18與p＜0.05)，或者組合物成分，即硒代蛋氨酸、α-硫辛酸、α-生育酚以及輔酶Q10(在T0和T1分別為，CD451.6±3.72和60.3±1.91；CD863.7±5.87和72.5±4.30；p分別為p＜0.01與p＜0.05)的受試者中甚至也有類(lèi)似的趨勢(shì)。
安全特性本組合物治療耐受性好，并且參與的受試者無(wú)人有副作用經(jīng)歷。經(jīng)血液學(xué)與生物化學(xué)試驗(yàn)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)異常。
表1血漿抗氧化狀態(tài)
*p＜0.05**p＜0.01***p＜0.001表2抗氧化酶活性
*p＜0.05**p＜0.01***p＜0.001
表3對(duì)程序性死亡的淋巴細(xì)胞染色
*p＜0.05**p＜0.01***p＜0.001表4在線粒體水平對(duì)反應(yīng)性氧物質(zhì)染色
*p＜0.05**p＜0.01***p＜0.001
縮寫(xiě)詞7-AAD7-氨基-放線菌素DABAP 2，2’-偶氮二(2-脒基丙烷)CAT 過(guò)氧化氫酶DCFH-DA 2’，7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽DPPH 1，1-聯(lián)苯-2-苦基-偕腙肼(hydrazil)FITC 異硫氰酸熒光素FSC 前向角散射GSH 谷胱甘肽GSHPX谷胱甘肽過(guò)氧化物酶HE hydroethidineMBB monobromobimanemC1CCP 羰基氰化物間氯苯腙.OH 羥基自由基PBMCs外周血單核細(xì)胞PBS 磷酸鹽緩沖溶液PI 碘化丙錠Q10 輔酶Q10的氧化態(tài)泛醌QH2 輔酶Q10的還原態(tài)泛醇R-PE R-藻紅蛋白R(shí)OS 反應(yīng)性氧物質(zhì)SOD 超氧化物岐化酶SSC 側(cè)向角散射TBARS硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)TRAP 總自由基俘獲抗氧化參數(shù)LOOH 脂質(zhì)過(guò)氧化物
權(quán)利要求
1.一種組合物，包含(a)L-肉堿內(nèi)鹽或其可藥用鹽；(b)乙酰L-肉堿內(nèi)鹽或其可藥用鹽；(c)α-硫辛酸；(d)輔酶Q10；(e)維生素E；與(f)硒代蛋氨酸。
2.以單位劑量形式存在的權(quán)利要求1的組合物，包含(a)20-110毫克L-肉堿內(nèi)鹽或者等摩爾量的其可藥用鹽；(b)20-110毫克乙酰L-肉堿內(nèi)鹽或者等摩爾量的其可藥用鹽；(c)70-130毫克α-硫辛酸；(d)90-110毫克輔酶Q10；(e)5-15毫克維生素E；與(f)40-60微克硒代蛋氨酸。
3.權(quán)利要求2的組合物，包含(a)100毫克L-肉堿內(nèi)鹽；(b)100毫克乙酰L-肉堿內(nèi)鹽；(c)100毫克α-硫辛酸；(d)100毫克輔酶Q10；(e)10毫克維生素E；與(f)50微克硒代蛋氨酸。
4.權(quán)利要求1-3的組合物，其中所述可藥用鹽選自下列氯化物；溴化物；碘化物；天冬氨酸鹽，酸式天冬氨酸鹽；檸檬酸鹽，酸式檸檬酸鹽；酒石酸鹽；磷酸鹽，酸式磷酸鹽；延胡索酸鹽，酸式延胡索酸鹽；半乳糖二酸鹽；甘油磷酸鹽；葡萄糖磷酸鹽；乳酸鹽；馬來(lái)酸鹽，酸式馬來(lái)酸鹽；乳清酸鹽；草酸鹽，酸式草酸鹽；硫酸鹽，酸式硫酸鹽；三氯乙酸鹽；三氟乙酸鹽以及甲磺酸鹽。
5.一種組合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于預(yù)防、抵消和/或治療由氧化應(yīng)力、伴隨氧化應(yīng)力而來(lái)的過(guò)早生理性細(xì)胞程序死亡現(xiàn)象和/或環(huán)境因素誘導(dǎo)的細(xì)胞程序死亡引起的病癥和/或疾病，并且所述組合物包含(a)L-肉堿內(nèi)鹽或其可藥用鹽；(b)乙酰L-肉堿內(nèi)鹽或其可藥用鹽；(c)α-硫辛酸；(d)輔酶Q10；(e)維生素E；與(f)硒代蛋氨酸。
6.權(quán)利要求5的用途，其中所述單位劑量形式的組合物包含(a)20-110毫克L-肉堿內(nèi)鹽或者等摩爾量的其可藥用鹽；(b)20-110毫克乙酰L-肉堿內(nèi)鹽或者等摩爾量的其可藥用鹽；(c)70-130毫克α-硫辛酸；(d)90-110毫克輔酶Q10；(e)5-15毫克維生素E；與(f)40-60微克硒代蛋氨酸。
7.權(quán)利要求5或者6的用途，用于制備預(yù)防/抵消接受精氨酸補(bǔ)充的病人中一氧化氮誘導(dǎo)的氧化性損傷的藥物。
8.權(quán)利要求5-7的用途，其中所述疾病由淋巴細(xì)胞程序死亡和/或伴隨過(guò)早生理性細(xì)胞程序死亡現(xiàn)象的線粒體變化而引起。
9.權(quán)利要求5-8的用途，其中所述疾病包括動(dòng)脈粥樣硬化、缺血再灌注性損傷、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、癌癥、中風(fēng)、白內(nèi)障和其他眼科疾病、甲狀腺疾病、肝病、性功能障礙、帕金森氏癥、阿爾茨海默氏病以及受病毒感染病人的變性病癥。
10.一種預(yù)防和/或治療由氧化應(yīng)力、伴隨氧化應(yīng)力而來(lái)的過(guò)早生理性細(xì)胞程序死亡現(xiàn)象和/或環(huán)境因素誘導(dǎo)的細(xì)胞程序死亡引起的病癥或者疾病的治療方法，該方法包括給有這種需要的病人服用有效量的組合物，該組合物含有(a)L-肉堿內(nèi)鹽或其可藥用鹽；(b)乙酰L-肉堿內(nèi)鹽或其可藥用鹽；(c)α-硫辛酸；(d)輔酶Q10；(e)維生素E；與(f)硒代蛋氨酸。
11.權(quán)利要求10的治療方法，包括以多劑量給藥方案給所述病人服用單位劑量形式的組合物，該單位劑量形式的組合物含有(a)20-110毫克L-肉堿內(nèi)鹽或者等摩爾量的其可藥用鹽；(b)20-110毫克乙酰L-肉堿內(nèi)鹽或者等摩爾量的其可藥用鹽類(lèi)；(c)70-130毫克α-硫辛酸；(d)90-110毫克輔酶Q10；(e)5-15毫克維生素E；與(f)40-60微克硒代蛋氨酸。
12.權(quán)利要求11的治療方法，包括給接受精氨酸補(bǔ)充的病人服用一定量的所述組合物，該一定量的所述組合物對(duì)預(yù)防/抵消由所述精氨酸補(bǔ)充引起的一氧化氮誘導(dǎo)的氧化損傷是有效的。
13.權(quán)利要求11的治療方法，用于預(yù)防或者治療動(dòng)脈粥樣硬化。
14.權(quán)利要求11的治療方法，用于預(yù)防或者治療缺血再灌注性損傷。
15.權(quán)利要求11的治療方法，用于預(yù)防或者治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
16.權(quán)利要求11的治療方法，用于預(yù)防或者治療癌癥。
17.權(quán)利要求11的治療方法，用于預(yù)防或治療中風(fēng)。
18.權(quán)利要求11的治療方法，用于預(yù)防或者治療白內(nèi)障以及其他眼科疾病。
19.權(quán)利要求11的治療方法，用于預(yù)防或者治療甲狀腺疾病。
20.權(quán)利要求11的治療方法，用于預(yù)防或者治療肝病。
21.權(quán)利要求11的治療方法，用于預(yù)防或者治療性功能障礙。
22.權(quán)利要求11的治療方法，用于預(yù)防或者治療帕金森氏癥。
23.權(quán)利要求11的治療方法，用于預(yù)防或者治療阿爾茨海默氏病。
24.權(quán)利要求11的治療方法，用于預(yù)防或者治療受病毒感染病人的變性病癥。
全文摘要
公開(kāi)了一種口服或者腸胃外給藥的組合物，其含有下列成分(a)L－肉堿內(nèi)鹽或其可藥用鹽；(b)乙酰L－肉堿內(nèi)鹽或其可藥用鹽；(c)α－硫辛酸；(d)輔酶Q
文檔編號(hào)A61K31/355GK1809344SQ02818722
公開(kāi)日2006年7月26日 申請(qǐng)日期2002年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月3日
發(fā)明者C·德西蒙 申請(qǐng)人:艾蒂爾藥物有限公司