專利名稱：糖基神經(jīng)酰胺作為用于抗傳染病和癌癥的疫苗的佐劑的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及糖基神經(jīng)酰胺作為提高各種傳染性的和腫瘤的抗原的免疫原性的佐劑的用途。
背景技術(shù)：
病原體，腫瘤細(xì)胞的成功去除，或者預(yù)防性或治療性免疫之后的自身反應(yīng)免疫機(jī)理很大程度上取決于宿主免疫系統(tǒng)響應(yīng)免疫而變得被激活并且封固有效應(yīng)答的能力，優(yōu)選對(duì)健康組織有最小的損傷。
疫苗的合理設(shè)計(jì)最初涉及鑒定與負(fù)責(zé)抵抗疾病的保護(hù)作用的保護(hù)-免疫效應(yīng)物機(jī)理的免疫學(xué)相關(guān)性，并且接著選擇能激發(fā)期望的適應(yīng)性應(yīng)答的抗原。一旦鑒定了合適的抗原，就基本上將其有效地送遞給宿主免疫系統(tǒng)。
在有效疫苗的設(shè)計(jì)中，免疫佐劑作為決定性成分，促進(jìn)，延長(zhǎng)，和/或增強(qiáng)抗原-特異性免疫應(yīng)答，以及提供合適類型應(yīng)答的選擇性誘導(dǎo)作用。
用于控制各種腫瘤、自身免疫和感染疾病，包括人免疫缺陷病毒(HIV)和肺結(jié)核的新的疫苗現(xiàn)在正處于研發(fā)和試驗(yàn)中。與早先的疫苗相比，它們一般以活體減弱病原體或者非復(fù)制型滅活病原體為基礎(chǔ)，現(xiàn)代疫苗由合成的、重組的、或高度純化的亞基抗原組成。設(shè)計(jì)只包括保護(hù)免疫作用需要的抗原的亞基疫苗，并且相信比全部滅活或活體-減弱疫苗更安全。但是，亞基抗原的純度以及不存在與減弱或殺死的疫苗聯(lián)合的自身輔助免疫調(diào)節(jié)成分經(jīng)常導(dǎo)致較弱的免疫原性。
通過(guò)同時(shí)或者更一般地聯(lián)合施用帶有“佐劑”的抗原能提高相對(duì)弱的抗原的免疫原性，當(dāng)單獨(dú)施用時(shí)通常沒(méi)有免疫原性的物質(zhì)仍然能喚起、增強(qiáng)和/或延長(zhǎng)響應(yīng)抗原的免疫應(yīng)答。不存在佐劑，可能發(fā)生減小的免疫應(yīng)答或者沒(méi)有免疫應(yīng)答，或者更糟的是，宿主變得對(duì)抗原耐受。
能在一組結(jié)構(gòu)上異質(zhì)的化合物中找到佐劑(Gupta等，1993，Vaccine，11293-306)。常規(guī)認(rèn)為佐劑的例子包括油乳狀液(例如弗氏佐劑)，皂甙，鋁鹽或鈣鹽(例如，明礬)，非離子嵌段聚合物表面活性劑，脂多糖(LPS)，分支桿菌，破傷風(fēng)類毒素，和很多其他的物質(zhì)。理論上說(shuō)，能有利于或擴(kuò)大免疫作用級(jí)聯(lián)特定情況，最終導(dǎo)致更明顯免疫應(yīng)答的各種分子或物質(zhì)可以被鑒定為佐劑。
理論上講，通過(guò)在疫苗配方中使用佐劑，人們能(1)指導(dǎo)和優(yōu)化對(duì)于疫苗是合適的并且是所期望的免疫應(yīng)答；(2)能粘膜送遞疫苗，即施用導(dǎo)致疫苗與粘膜表面接觸，所述粘膜表面例如口腔或胃或肺上皮和相關(guān)的淋巴樣組織；(3)促進(jìn)細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答；(4)提高較弱的免疫原例如高度純化的或重組抗原的免疫原性；(5)減小提供保護(hù)性免疫性需要的抗原的量或免疫次數(shù)；和(6)提高免疫應(yīng)答減小或減弱的個(gè)體例如新生兒、老年人和無(wú)免疫應(yīng)答疫苗接受者的疫苗效力。
雖然關(guān)于它們的作用方式知之甚少，現(xiàn)在相信佐劑通過(guò)下面機(jī)理之一增強(qiáng)免疫應(yīng)答(1)延長(zhǎng)抗原的生物或免疫性半壽期(參見(jiàn)，例如，Lascelles，1989，Vet.Immunol.Immunopathol.，2215-27；Freund，1956，Adv.Tuber.Res.，7130-147)；(2)改善對(duì)抗原-呈遞細(xì)胞(APCs)的抗原送遞，以及改善APCs對(duì)抗原的處理和呈遞(參見(jiàn)，例如，F(xiàn)azekas de St.Groth等，Immunol.Today，19448-454，1998)，例如，在抗原佐劑復(fù)合體被APCs消化之后通過(guò)使抗原跨越紅細(xì)胞漿質(zhì)膜進(jìn)入胞質(zhì)溶膠(Kovacsovics-Bankowski等，Science，1995，267243-246)；(3)模擬微生物結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致位于先天免疫系統(tǒng)的附屬細(xì)胞上的病原體識(shí)別受體(PRRs)對(duì)微生物產(chǎn)生的抗原的識(shí)別的改善(Janeway，1989，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，541-13；Medzhitov，1997，Cell，91295-298；Rook，1993，Immunol.Today，1495-96)；(4)模擬來(lái)自應(yīng)激或損傷細(xì)胞用來(lái)引發(fā)免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)危險(xiǎn)的信號(hào)(參見(jiàn)，例如，Matzinger，1994，Annu.Rev.Immunol.，12991-209)，(5)誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生(參見(jiàn)，例如，Nohria，1994，Biotherapy，7261-269；Iwasaki等，1997，J.Immunol.，1584591-4601；Maecker等，1997，Vaccine，151687-1696)；(6)使免疫應(yīng)答偏置于特定亞組的免疫系統(tǒng)(例如，產(chǎn)生Th1-或Th2-極化應(yīng)答[參見(jiàn)下文]，等)(Janssen等，Blood，972758-2763，2001；Yamamoto等，Scand.J.Immunol.，53211-217，2001；Weiner G.J.，J.Leukoc.Biol.，68455-63，2000；Lucey，Infect.Dis.Clin.North Am.，131-9，1999)，和(7)阻斷抗原攻擊的快速傳播(″蓄積效應(yīng)″)(Hood等，Immunology，Second Ed.，1984，Benjamin/CummingsMenlo Park，CA；St Clair等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，969469-9474，1999；Ahao等，J.Pharm.Sci.，851261-1270，1996；Morein等，Vet.Immunol.Immunopathol.，54373-384，1996)。(也可以參見(jiàn)Schijns的綜述文獻(xiàn)，Curr.Opin.Immunol.，12456-463，2000；Vogel，Clin.Infect.Dis.，30[增刊3]S266-70，2000；Singh和O′Hagan，NatureBiotechnol.，171075-81，1999；Cox和Coulter，Vaccine，15248-256，1997)。
最近的發(fā)現(xiàn)強(qiáng)烈提示，內(nèi)源產(chǎn)生的細(xì)胞因子作為傳統(tǒng)佐劑激發(fā)的基本通訊信號(hào)而起作用。細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的冗余使得它難以將特定佐劑的活性歸因于一種或幾種細(xì)胞因子。對(duì)于免疫原性重要的細(xì)胞因子可以包括炎性物質(zhì)原(1型)干擾素(IFN)-α/β，腫瘤壞死因子(TNF)-α，白細(xì)胞介素(IL)-1，IL-6，IL-12，IL-15和IL-18，它們影響抗原呈遞。其他的可以但當(dāng)更下游克隆擴(kuò)展和T和B細(xì)胞的分化，IL-2，IL-4和IFN-γ作為原型(Brewer等，1996，Eur.J.Immunol.，262062-2066；Smith等，1998，Immunology，93556-562)。通過(guò)誘導(dǎo)IFN-γ和延遲型過(guò)敏性而增強(qiáng)免疫應(yīng)答的佐劑也激發(fā)IgG亞類的產(chǎn)生，而IgG亞類在補(bǔ)體-介導(dǎo)的溶胞作用和抗體-依賴性-介導(dǎo)的-細(xì)胞毒性效應(yīng)物機(jī)理中最具有活性(例如，小鼠中的IgG2a和人中的IgG1)(Allison，Dev.Biol.Stand.，1998，92311；Unkeless，Annu.Rev.Immunol.，1988，6251-81；Phillips等，Vaccine，1992，10151-8)。
毫無(wú)疑問(wèn)，一些佐劑可以發(fā)揮一項(xiàng)以上的功能。例如，純化的微生物成分例如LPS或者鼠弓形體的提取物不只是快速增加抗原-呈遞樹突細(xì)胞(DC)的數(shù)目而且它們的遷移還增加IL-12產(chǎn)生(Souza等，1997，J.Exp.Med.，1861819-1829)。
因?yàn)椴煌淖魟┛梢跃哂胁煌淖饔脵C(jī)理，可以以要應(yīng)用的給藥途徑，期望的免疫應(yīng)答的類型(例如，抗體-介導(dǎo)的，細(xì)胞-介導(dǎo)的，粘膜等)，和基本抗原的特別不適性為基礎(chǔ)來(lái)選擇和特定疫苗使用。
一定平衡考慮向疫苗配方中摻入佐劑提高免疫原性的好處和這些試劑會(huì)誘導(dǎo)局部和/或全身副作用的風(fēng)險(xiǎn)。局部副反應(yīng)包括注射部位局部炎癥和，罕見(jiàn)的，誘導(dǎo)肉芽留或無(wú)菌膿腫形成。對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物觀察到的對(duì)佐劑的全身性反應(yīng)包括不適，發(fā)燒，佐劑關(guān)節(jié)炎，和先前的葡萄膜炎(Allison等，Mol.Immunol.，1991，28279-84；Waters等，Infect.Immun.，1986，51816-25)。這樣的反應(yīng)經(jīng)常是由佐劑和抗原本身的相互作用引起的，或者可能因?yàn)樽魟?duì)特定抗原產(chǎn)生的應(yīng)答的類型，或者佐劑誘導(dǎo)的細(xì)胞因子分布。
因此，很多有效的免疫佐劑，例如弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑，是毒性的，因此只用于動(dòng)物研究目的，而不是對(duì)人接種。目前，鋁鹽和MF59被證明是對(duì)人使用的最佳的疫苗佐劑。在評(píng)估的新的佐劑中，免疫刺激分子例如脂多糖-衍生的MPL和皂甙衍生的QS-21表現(xiàn)出最有希望，但是對(duì)它們對(duì)人用安全性有懷疑。特定佐劑，例如MF59微乳液和脂粒免疫刺激復(fù)合體(ISCOMs)的臨床前研究提示這些分子本身也是體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答的有效激發(fā)劑，另外，對(duì)CpG寡核苷酸的臨床前數(shù)據(jù)表現(xiàn)得令人鼓舞，特別是關(guān)于它們選擇性操作免疫應(yīng)答的能力。所有這些佐劑表現(xiàn)預(yù)示，開發(fā)更有效的新的佐劑可以開發(fā)新疫苗，使新的和已經(jīng)存在的疫苗用作治療藥物和改進(jìn)的預(yù)防性藥物。
最近，已經(jīng)鑒定了新的淋巴樣血統(tǒng)，天然殺傷T(NKT)細(xì)胞，與主流T細(xì)胞，B細(xì)胞和NK細(xì)胞不同(Arase等，1992，Proc.Natl Acad.Sci.USA，896506；Bendelac等，1997，Annu.Rev.Immunol.，15535)。這些細(xì)胞特征在于在小鼠中共同表達(dá)Vα14和Jα281基因片段編碼的NK細(xì)胞受體和半-不變T細(xì)胞受體(TCR)和在人體中共同表達(dá)Vα24和JαQ基因片段編碼的NK細(xì)胞受體和半-不變T細(xì)胞受體(TCR)。NKT細(xì)胞的體內(nèi)激活迅速誘導(dǎo)一系列導(dǎo)致先天細(xì)胞例如天然殺傷(NK)細(xì)胞和樹突細(xì)胞(DC)激活的細(xì)胞激活作用，適應(yīng)細(xì)胞例如B細(xì)胞和T細(xì)胞的激活，共同刺激分子的誘導(dǎo)，和突然釋放細(xì)胞因子例如白細(xì)胞介素-4(IL-4)和干擾素-γ(IFN-γ)(Burdin等，Eur.J.Immunol.292014-2025，1999；Carnaud等，J.Immmunol.，1634647-4650，1999；Kitamura等，J.Exp.Med.，1891121-1128，1999；Kitamura等，Cell Immunol.，19937-42，2000；Aderem和Ulevitch，Nature，406782-787，2000)。另外，激活的NKT細(xì)胞本身帶來(lái)Fas和穿孔素介導(dǎo)的殺傷。NKT TCR的銜接能補(bǔ)充全部激活級(jí)聯(lián)?；蛘撸ㄟ^(guò)感染的巨噬細(xì)胞或DC釋放的細(xì)胞因子例如白細(xì)胞介素-12(IL-12)能選擇性觸發(fā)有效的1型(Th1)輔助細(xì)胞功能。有可能相信這些功能與NKT細(xì)胞在如自身免疫糖尿病，已經(jīng)確定的腫瘤的排斥這樣的癥狀中的重要作用或者化學(xué)誘導(dǎo)的腫瘤的預(yù)防有關(guān)(Yoshimoto等，1995，Science，2701845；Hammond等，J.Exp.Med.，1871047-1056，1998；Kawano等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，955690；Lehuen等，J.Exp.Med.，1881831-1839，1998；Wilson等，Nature，391177-181，1998；Smyth等，J.Exp.Med.，191661-668，2000)。最后，認(rèn)為NKT細(xì)胞通過(guò)它們影響Th1-Th2極化的能力而成為抗菌免疫性的致因(Cui等，J.Exp.Med.，190783-792，1999；Singh等，J.Immunol.，1632373-2377，1999；Shinkai和Locksley，J.Exp.Med.，191907-914，2000)。因此，推斷這些細(xì)胞是先天免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞。但是，NKT細(xì)胞在適應(yīng)性免疫應(yīng)答的發(fā)展中潛在的作用還不清楚。
最近，有人證明α-半乳糖基-神經(jīng)酰胺(α-GalCer)，一種最初從Okinawan海綿中提取的糖脂(Natori等，Tetrahedron，502771-2784，1994)，或者其合成的類似物KRN7000[(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖苷)-2-(N-二十六酰氨基)-1，3，4，-十八烷三醇]能體外和體內(nèi)激活NKT細(xì)胞，KRN7000能從Pharmaceutical ResearchLaboratories，Kirin Brewery(Gumna，日本)獲得或者根據(jù)先前描述而獲得(參見(jiàn)，例如，Kobayashi等，1995，Oncol.Res.，7529-534；Kawano等，1997，Science，2781626-9；Burdin等，1998，J.Immunol.，1613271；Kitamura等，1999，J.Exp.Med.，1891121；美國(guó)專利No.5,936,076)。因此，表明iα-GalCer能刺激NK活性和NKT細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，并且表現(xiàn)出體內(nèi)潛在的抗腫瘤活性(Kawano等，1997，上文；Kawano等，1998，Proc.Natl Acad.Sci.USA，955690；Kitamura等，1999，上文)。Kitamura等(1999，上文)證明α-GalCer的免疫刺激效應(yīng)由CD40-CD40L-介導(dǎo)的NKT-DC相互作用引發(fā)。因?yàn)樵贑D1d-1-和NKT-缺陷小鼠中不存在α-GalCer的免疫調(diào)節(jié)功能，這表明α-GalCer由MHC I類-樣分子CD1d呈現(xiàn)。
CD1是與MHC相關(guān)的非多態(tài)性基因的保守家族，它看起來(lái)涉及向T細(xì)胞呈遞脂質(zhì)和糖脂抗原，并且在這個(gè)途徑中參與抗原識(shí)別的先天和適應(yīng)途徑(Park和Bendelac的綜述，Nature，406788-792，2000；還參見(jiàn)Calabi等，Eur.J.Immunol.，19285-292，1989；Porcelli和Modlin，Annu.Rev.Immunol.，17297-329，1999)。包括最多5種基因(同位型)，它們以序列同源性為基礎(chǔ)能分為兩組。第1組，包括CD1a，CD1b，CD1c和CD1e，在人體中呈現(xiàn)但是在小鼠和大鼠身上沒(méi)有。第2組，包括CD1d，在迄今為止的研究的所有的物種中都發(fā)現(xiàn)了，包括人。
抗原呈遞細(xì)胞例如樹突細(xì)胞(DCs)，巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞亞型選擇性表達(dá)CD1同位型，但是除CD1d在肝細(xì)胞中表達(dá)之外，它們一般不在實(shí)體組織中表達(dá)(Porcelli等，上文；Bendelac等，Annu.Rev.Immunol.，15535-562，1997)。表達(dá)半-不變體TCR并且發(fā)揮有效的效應(yīng)物和調(diào)節(jié)功能的小鼠和人CD1d-限制淋巴細(xì)胞中的那些以皮摩爾濃度識(shí)別α-GalCer(Kawano等，Science，2781626-1629，1997)。CD1d/α-GalCer復(fù)合體接著被小鼠Vα14和人Vα24天然殺傷T(NKT)細(xì)胞的抗原受體識(shí)別(Bendelac等，Science，268863-865，1995；Bendelac等，Annu.Rev.Immunol.，15535-562，1997；Park等，Eur.J.Immunol.，30620-625，2000)。
與CD1d結(jié)合時(shí)，證明α-GalCer體內(nèi)和體外激活鼠NKT細(xì)胞(Kawano等，1997，Science，2781626-1629；Burdin等，1998，J.Immunol.，1613271-3281)，和體外激活人NKT細(xì)胞(Spada等，1998，J.Exp.Med.，1881529-1534；Brossay等，1998，J.Exp.Med.1881521-1528)。例如，證明α-GalCer通過(guò)激活人NKT細(xì)胞而體外展示NKT-介導(dǎo)的抗-腫瘤活性(Kawano等，1999，Cancer Res.，595102-5105)。
除了α-GalCer之外，證明具有糖基部分α-異構(gòu)構(gòu)象和植物鞘氨醇的3，4-羥基的其他糖基神經(jīng)酰胺(例如α-葡糖基神經(jīng)酰胺[α-GlcCer]，Galα1-6Galα1-1′Cer，Galα1-6Glcα1-1′Cer，Galα1-2Galα1-1′Cer，和Galβ1-3Galα1-1′Cer)刺激小鼠Vα14 NKT細(xì)胞的增殖，但是效率較低(Kawano等，Science，2781626-1629，1997)。通過(guò)對(duì)一組α-GalCer類似物分析與小鼠Vα14 NKT細(xì)胞雜交瘤的反應(yīng)性，Brossay等(J.Immunol.，1615124-5128，1998)認(rèn)為α-GalCer酰基鏈從24至2碳原子幾乎完全截?cái)嗖伙@著影響小鼠對(duì)小鼠CD1或者其人類似物呈遞的糖脂的NKT細(xì)胞應(yīng)答。
還證明了體內(nèi)施用α-GalCer不只引起通過(guò)CD1d-限制機(jī)理誘導(dǎo)強(qiáng)NK活性和細(xì)胞因子產(chǎn)生(例如，IL-4，IL-12和IFN-γ)的NKT細(xì)胞的激活作用，而且還誘導(dǎo)獲得性免疫性中涉及的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞的激活(Nishimura等，2000，Int.Immunol.，12987-994)。具體地說(shuō)，除了巨噬細(xì)胞和NKT細(xì)胞的激活作用之外，證明體內(nèi)施用α-GalCer導(dǎo)致早期激活標(biāo)記物CD69對(duì)CD4+T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞，和B細(xì)胞的誘導(dǎo)(Burdin等，1999，Eur.J.Immunol.292014；Singh等，1999，J.Immunol.1632373；Kitamura等，2000，Cell.Immunol.19937；Schofield等，1999，Science 283225；Eberl等，2000，J.Immunol.，1654305-4311)。這些研究展現(xiàn)了這樣的可能性，即α-GalCer在橋接中可以起著同等重要的作用，不僅橋接NKT細(xì)胞介導(dǎo)的先天免疫性，而且還橋接B細(xì)胞，T輔助(Th)細(xì)胞和T細(xì)胞毒性(Tc)細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫。
由于鑒定了新的腫瘤特異性抗原并且認(rèn)識(shí)到免疫系統(tǒng)在預(yù)防癌癥和控制腫瘤生長(zhǎng)中起著重要的作用，最近幾年，再次恢復(fù)了對(duì)開發(fā)治療性癌癥疫苗的興趣(例如，減小腫瘤負(fù)擔(dān)和控制轉(zhuǎn)移)。
糖脂配體α-GalCer和NKT細(xì)胞快速接觸誘導(dǎo)細(xì)胞激活級(jí)聯(lián)，這涉及先天和適應(yīng)性免疫以及產(chǎn)生腫瘤特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的共同原理(Nishimura等，2000，上文)，的實(shí)證提示，施用α-GalCer一般不只是可以影響速度和強(qiáng)度而且還影響接著的免疫應(yīng)答的類型，特別是，抗腫瘤細(xì)胞的那些。事實(shí)上，Kabayashi等(1995，Oncol.Res.，7529-534)發(fā)現(xiàn)合成形式的α-GalCer(KRN 7000)在攜帶B16的小鼠中比生物反應(yīng)改性劑例如OK432和香菇多糖和化療藥物絲裂霉素C有更強(qiáng)的抗轉(zhuǎn)移活性。在這些實(shí)驗(yàn)中，60％帶腫瘤的小鼠用100μg/kgKRN7000治療得到治愈。KRN7000還表現(xiàn)出在鼠T-淋巴瘤EL-4細(xì)胞(Nakagawa等，Oncol.Res.，10561-568，1998)或結(jié)腸26細(xì)胞(Nakagawa等，Cancer Res.，581202-1207，1998)的肝轉(zhuǎn)移小鼠中誘導(dǎo)顯著的腫瘤-特異性免疫性。此外，對(duì)小鼠施用α-GalCer抑制原發(fā)性黑素瘤發(fā)生肝轉(zhuǎn)移(Kawano等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，955690-5693)。
上面得出的數(shù)據(jù)使得本發(fā)明人假設(shè)糖基神經(jīng)酰胺-誘導(dǎo)的NKT細(xì)胞應(yīng)答也可以有助于抗各種炎癥中涉及的免疫應(yīng)答。事實(shí)上，本發(fā)明人和同事最近發(fā)現(xiàn)對(duì)小鼠施用α-GalCer快速產(chǎn)生強(qiáng)的抗瘧疾活性，抑制嚙齒動(dòng)物瘧疾寄生蟲約氏瘧原蟲和P.berghei發(fā)育到肝細(xì)胞內(nèi)階段(Gonzalez-Aseguinolaza等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，978461-8466)。但是單獨(dú)對(duì)沒(méi)有CD1d或Vα14 NKT細(xì)胞的小鼠施用α-GalCer，沒(méi)有保護(hù)它們抗瘧疾，表明α-GalCer的抗瘧活性需要NKT細(xì)胞和CD1d的表達(dá)。此外，α-GalCer不能抑制寄生蟲在沒(méi)有IFN-γ或IFN-γ受體的小鼠的肝中發(fā)育，表明糖脂的抗瘧活性主要由IFN-γ介導(dǎo)。
著眼于α-GalCer的NKT-介導(dǎo)的抗腫瘤和抗寄生蟲活性的數(shù)據(jù)，提出這種糖脂是保護(hù)性免疫應(yīng)答的有效的誘導(dǎo)劑(參見(jiàn)，例如，Park和Bendelac，上文)。本發(fā)明人第一次構(gòu)思和證明重要地祥述這些假設(shè)，即α-GalCer和相關(guān)的糖基神經(jīng)酰胺可以不僅作為抗原使用，而且可以用作能增強(qiáng)和/或擴(kuò)大其他抗原誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫應(yīng)答的持續(xù)時(shí)間的佐劑。這是意想不到的發(fā)現(xiàn)，因?yàn)棣?GalCer-介導(dǎo)的NKT細(xì)胞激活導(dǎo)致瘧疾感染細(xì)胞的完全消除，因此排除了發(fā)生適應(yīng)性免疫應(yīng)答需要的抗原源。事實(shí)上，用照射子孢子免疫之前施用兩天α-GalCer幾乎完全破壞子孢子-誘導(dǎo)的保護(hù)作用。因此，為了使用α-GalCer作為佐劑，與給定抗原相關(guān)的施用時(shí)間是非常重要的。
因此，本發(fā)明第一次提供了用于增強(qiáng)和/或延長(zhǎng)哺乳動(dòng)物特別是人體中抗原的免疫應(yīng)答時(shí)間的方法和組合物，涉及用(i)抗原和(ii)含有糖基神經(jīng)酰胺，特別是α-GalCer的佐劑，聯(lián)合對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行免疫。
重要的是，除了它刺激免疫應(yīng)答的能力之外，已經(jīng)證明α-GalCer，不依賴其劑量，對(duì)嚙齒動(dòng)物和猴子不誘導(dǎo)毒性(Nakagawa等，1998，Cancer Res.，581202-1207)。此外，雖然近期研究表明α-GalCer處理小鼠之后立即觀察到肝酶活性暫時(shí)提高，提示有較小的肝損傷(Osman等，2000，Eur.J.Immunol.，391919-1928)，最近使用α-GalCer進(jìn)行了人體試驗(yàn)治療癌癥患者沒(méi)有顯著并發(fā)癥(Giaccone等，2000，Abstract.Proc.Amer.Soc.Clin.Oncol.，19477a)。最后，和很多新研制開發(fā)的佐劑不一樣(見(jiàn)下文)，α-GalCer和相關(guān)的糖基神經(jīng)酰胺可以以合理的產(chǎn)率和效率合成制備(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利No.5,936,076)。所有的這些因素使得糖基神經(jīng)酰胺，特別是α-GalCer，成為期望的佐劑候選。
與α-GalCer和相關(guān)的糖基神經(jīng)酰胺相反，批準(zhǔn)對(duì)人使用的常規(guī)疫苗送遞系統(tǒng)和佐劑，鋁鹽和MF59(Singh和O′Hagan，Nat.Biotechnol.，171075-1081，1999)，在誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答方面不好。雖然一些新的佐劑，例如純化的皂甙，免疫刺激復(fù)合體，脂質(zhì)體，CpG DNA基序，和重組減弱病毒(例如，腺病毒，新培斯病毒，流感病毒，和牛痘病毒)，已經(jīng)被證明與單獨(dú)的給定的相同抗原誘導(dǎo)的或與標(biāo)準(zhǔn)明礬佐劑聯(lián)合誘導(dǎo)的那些相比，改善抗原特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答(Newman等，J.Immunol.，1992；1482357-2362；Takahashi等，Nature，1990，344873-875；Babu等，Vaccine，1995，131669-1676；Powers等，J.Infect.Dis.，1995，1721103-7；White等，Vaccine，1995，131111-1122；Krieg等，TrendsMicrobiol.，623-27，1998；Rodrigues等，J.Immunol.，1581268-1274，1997；Tsuji等，J.Virol.，726907-6910，1998；Li等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，905214-52188，1993)，目前可得的佐劑中沒(méi)有一個(gè)兼有對(duì)人的低毒性，生產(chǎn)的低成本和有效刺激免疫系統(tǒng)的能力。
產(chǎn)生適應(yīng)性免疫應(yīng)答是一個(gè)多因素現(xiàn)象，其中很多因素參與。就這一點(diǎn)來(lái)說(shuō)，α-GalCer-激活的NKT細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生適應(yīng)性免疫應(yīng)答中涉及的很多元件的激活，例如抗原呈遞細(xì)胞(APC)，B細(xì)胞，T輔助(Th)細(xì)胞和T細(xì)胞毒性(Tc)細(xì)胞。因此，理論上說(shuō)，α-GalCer可能是理想的免疫調(diào)節(jié)劑。另外的好處是能施用α-GalCer并且通過(guò)很多不同的途徑激活免疫系統(tǒng)，包括適合人使用的口服，皮下和肌內(nèi)途徑。最后，證明α-GalCer對(duì)嚙齒動(dòng)物和猴子不誘導(dǎo)毒性(Nakagawa等，Cancer Res.，581202-1207，1998)。
因此，本領(lǐng)域強(qiáng)烈需要開發(fā)新的佐劑，它能綜合低毒性和容易利用，有明顯程度增強(qiáng)和/或延長(zhǎng)抗原特異性免疫應(yīng)答的能力。本發(fā)明通過(guò)提供糖基神經(jīng)酰胺，一組新的具有卓越性能的佐劑，滿足本領(lǐng)域這些和其他需求。這樣的佐劑能改善用于治療各種炎癥和癌癥的預(yù)防性和/或治療性疫苗。
本發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供增強(qiáng)哺乳動(dòng)物體內(nèi)抗原的免疫原性的方法，包括與含有通式1的糖基神經(jīng)酰胺的佐劑的組合物聯(lián)合施用所述抗原 其中R1，R2和R5代表H或具體單糖；R3和R6分別代表H或OH；R4代表H，OH或具體單糖；X代表1-23的整數(shù)；R7代表下面基團(tuán)(a)-(g)的任一個(gè)(a)--(CH2)11--CH3，(b)--(CH2)12--CH3，(c)--(CH2)13--CH3，(d)--(CH2)9--CH(CH3)2，(e)--(CH2)10--CH(CH3)2，(f)--(CH2)11--CH(CH3)2，(g)--(CH2)11--CH(CH3)--C2H5。
本發(fā)明優(yōu)選的佐劑包括α-半乳糖基神經(jīng)酰胺(α-GalCer)，具體地說(shuō)，是式2代表的(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖苷)-2-(N-二十六酰基氨基)-1，3，4-十八烷三醇((2S，3S，4R)-1-O-(α-D-ctopyranosyl)-2-(N-hexacosanoylamino)-1，3，4-octadecanetriol)
根據(jù)本發(fā)明，糖基神經(jīng)酰胺用作佐劑導(dǎo)致抗原誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫性的增強(qiáng)和/或時(shí)間的延長(zhǎng)，并且至少部分引起抗原特異性Th1-型應(yīng)答，特別是CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的增強(qiáng)和/或時(shí)間的延長(zhǎng)。
本發(fā)明的含有糖基神經(jīng)酰胺的佐劑可以和任何抗原特別是來(lái)自感染物質(zhì)或腫瘤的抗原聯(lián)合施用。優(yōu)選地，同時(shí)施用佐劑和抗原，最優(yōu)選以單位劑量形式。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于治療哺乳動(dòng)物疾病的預(yù)防性和/或治療性方法，包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物與佐劑組合物一起施用免疫保護(hù)性抗原，所述佐劑組合物包括糖基神經(jīng)酰胺。如這里具體指出的，該方法能用于預(yù)防和/或治療各種炎癥或腫瘤疾病。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，應(yīng)用本發(fā)明的方法治療選自病毒感染，細(xì)菌感染，寄生蟲感染和真菌感染的感染。
因此，在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明公開了用于對(duì)哺乳動(dòng)物(例如人)賦予抗瘧疾的子孢子階段的免疫性的方法，其中所述方法包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物聯(lián)合施用瘧疾特異性抗原和含有α-GalCer的免疫佐劑。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明公開了用于增強(qiáng)哺乳動(dòng)物對(duì)HIV感染(和有效預(yù)防和/或治療AIDS)的免疫應(yīng)答的方法，其中所述方法包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物聯(lián)合施用HIV-特異性抗原和含有α-GalCer的佐劑。這里公開的另外的具體方法不受限制地包括(i)通過(guò)施用牛分支桿菌(Mycobacterium bovis)桿菌Calmette-Guérin和含有α-GalCer的佐劑，增強(qiáng)對(duì)牛分支桿菌(Mycobacterium bovis)桿菌Calmette-Guérin的免疫應(yīng)答，用于預(yù)防結(jié)核分支桿菌(M.Tuberculosis)感染；(ii)通過(guò)施用編碼人黑素瘤相關(guān)抗原，gp100，的質(zhì)粒cDNA和含有α-GalCer的佐劑，增強(qiáng)對(duì)黑素瘤的免疫應(yīng)答；(iii)通過(guò)施用從免疫決定簇(determinant)抗原65kDa甘露糖蛋白(mannoprotein)(MP65)衍生的肽和含有α-GalCer的佐劑，增強(qiáng)對(duì)白色假絲酵母(Candida albicans)的免疫應(yīng)答。
與本發(fā)明的方法結(jié)合，還提供了含有免疫原有效量的抗原和免疫原有效量的選自式1的糖基神經(jīng)酰胺，和，任選的，藥學(xué)可接受載體或賦形劑的藥物和疫苗組合物。在具體的實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的佐劑制劑的糖基神經(jīng)酰胺是α-GalCer，具體地是[(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖苷)-2-(N-二十六酰氨基)-1，3，4，-十八烷三醇]。
在本發(fā)明的組合物中使用的抗原不受限制地包括各種病毒，細(xì)菌，真菌，寄生蟲-特異性的，和腫瘤特異性的抗原。本發(fā)明的病毒抗原的非限制性例子包括HIV抗原，例如gp120，gp160，p18，Tat，Gag，Pol，Env，Nef；來(lái)自皰疹病毒的糖蛋白；來(lái)自乙肝病毒的表面抗原和核心抗原。本發(fā)明的細(xì)菌抗原的非限制性例子包括來(lái)自疏螺旋體屬OspA，OspB和OspC抗原。本發(fā)明的真菌和寄生蟲抗原的非限制性例子包括分別來(lái)自白色假絲酵母(Candida albicans)的MP65和來(lái)自瘧原蟲屬(Plasmodium sp.)的CS蛋白質(zhì)。本發(fā)明的腫瘤特異性的非限制性例子包括來(lái)自黑素瘤的Melan A和gp100抗原。
在具體的實(shí)施方案中，所述抗原是瘧疾-特異性的并且包括，例如，照射的瘧原蟲子孢子或者包括瘧原蟲環(huán)子孢子(CS)蛋白質(zhì)的T細(xì)胞表位，例如CD4+T細(xì)胞表位YNRNIVNRLLGDALNGKPEEK(SEQ ID NO1)或者約氏瘧原蟲CS蛋白質(zhì)的CD8+T細(xì)胞表位SYVPSAEQI(SEQ ID NO2)，或者CD4+T細(xì)胞表位(NVDPNANP)n(SEQ ID NO3)，或P.falciparum CS蛋白質(zhì)的CD4+/CD8+T細(xì)胞表位EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT(SEQID NO4)的合成肽抗原。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗原是HIV-特異性的，例如p18蛋白質(zhì)的CD8+T細(xì)胞表位RGPGRAFVTI(SEQ ID NO5)或者HIV-1 Gag p24CD8+T細(xì)胞表位(例如，KAFSPEVIPMF(aa 30-40，SEQ ID NO6)，KAFSPEVI(aa30-37，SEQ ID NO7)，TPQDLNM(或T)ML(aa 180-188，SEQ IDNOS8和9)，DTINEEAAEW(aa 203-212，SEQ ID NO10)，KRWIILGLNK(aa 263-272，SEQ ID NO11)，和QATQEVKNW(aa 308-316，SEQ IDNO12))，或Gag p17 CD8+T細(xì)胞表位(例如，RLRPGGKKK(aa 20-29，SEQ ID NO13)和SLYNTVATL(aa 77-85，SEQ ID NO14))。
在具體的實(shí)施方案中，表達(dá)所述抗原的重組病毒呈遞所述抗原。優(yōu)選地，所述病毒選自重組腺病毒，重組痘病毒，和重組新培斯病毒(Sindbis virus)。
本發(fā)明還提供了用于含有至少一種抗原和含有糖基神經(jīng)酰胺佐劑的疫苗組合物的制備方法，所述方法包括混合佐劑和抗原。
在相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于制備含有至少一種抗原和含有糖基神經(jīng)酰胺佐劑的藥物或疫苗組合物的試劑盒，所述試劑盒在第一個(gè)容器中含有抗原，并且在第二個(gè)容器中含有佐劑，以及任選地，包括將抗原和佐劑混合的說(shuō)明和/或施用組合物的說(shuō)明；并且其中任選地容器在一個(gè)包裝中。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1A-D.α-GalCer增強(qiáng)由照射的子孢子和表達(dá)瘧原蟲抗原的重組病毒誘導(dǎo)的保護(hù)性抗-瘧疾免疫性。A.用不同劑量的(0.5，1，或2微克)或賦形劑(-)對(duì)一組BALB/C小鼠腹膜內(nèi)共同注射，并且一起用約氏瘧原蟲照射的子孢子(γ-spz)靜脈內(nèi)免疫。兩星期之后，用傳染性子孢子攻擊所有組的小鼠，并且通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)定肝中寄生蟲rRNA的量。收集來(lái)自免疫的和沒(méi)有免疫的小鼠的血清并且通過(guò)IFA測(cè)定抗-子孢子抗體的滴度。B.用γ-spz免疫BALB/c(■)或B10.D2(□)小鼠之前兩天(-2)，同一天(0)或者兩天之后(+2)施用單一劑量的α-GalCer。C.用表達(dá)約氏瘧原蟲CS蛋白質(zhì)的重組腺病毒，AdPyCS，皮下免疫一組BALB/c小鼠，同時(shí)皮下施用α-GalCer(+)或賦形劑(-)。D.用表達(dá)約氏瘧原蟲(P.yoelii)CS蛋白質(zhì)，SIN(Mal)的CD8+T細(xì)胞表位的重組新培斯病毒對(duì)一組小鼠皮下免疫，同時(shí)皮下施用α-GalCer(+)或賦形劑(-)。星號(hào)(*)表示應(yīng)用未配對(duì)t-試驗(yàn)的兩個(gè)值之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)誤差(P＜0.01)。在B-D中，兩個(gè)星期之后，所有組的小鼠都感染了活體約氏瘧原蟲子孢子，如A所述測(cè)定活體中入侵的寄生蟲。結(jié)果以五只小鼠的平均值±SD表示。
圖2A-C.α-GalCer提高各種疫苗激發(fā)的抗原-特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答。A.通過(guò)相同途徑施用或沒(méi)有施用α-GalCer，用γ-spz皮下免疫一組BALB/c小鼠，兩周或六周之后分離脾淋巴細(xì)胞，并且通過(guò)ELISPOT分析測(cè)定IFN-γ分泌CS-特異性CD8+(■)和CD4+(□)T細(xì)胞的數(shù)目。B.用表達(dá)約氏瘧原蟲CS蛋白質(zhì)，AdPyCS，的重組腺病毒皮下免疫一組BALB/c小鼠，并且皮下施用α-GalCer(+)或賦形劑(-)。兩個(gè)星期之后通過(guò)ELISPOT分析測(cè)定IFN-γ分泌CS-特異性CD8+(■)和CD4+(□)T細(xì)胞的數(shù)目。C.用表達(dá)約氏瘧原蟲CS蛋白質(zhì)，SIN(Mal)，的CD8+T細(xì)胞表位的重組新培斯病毒，或者表達(dá)HIV的p18蛋白質(zhì)，SIN(p18)，的CD8+T細(xì)胞表位的重組新培斯病毒皮下免疫一組BALB/c小鼠，并且皮下施用α-GalCer(+)或賦形劑(-)。兩個(gè)星期之后通過(guò)ELISPOT分析測(cè)定IFN-γ分泌CS-特異性和p18-特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)目。數(shù)據(jù)代表相似結(jié)果的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)并且表示為三只小鼠的平均值±SD。
圖3A和3B.α-GalCer延長(zhǎng)γ-spz激發(fā)的保護(hù)性抗瘧疾免疫應(yīng)答的時(shí)間。A.用γ-spz和α-GalCer(+)或賦形劑(-)一起免疫BALB/c小鼠，如圖2所示，2-4周之后，通過(guò)ELISPOT分析測(cè)定脾中IFN-γ分泌CS-特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)目。B.用1×104或1×105γ-spz免疫經(jīng)α-GalCer(+)或賦形劑(-)處理過(guò)的BALB/c小鼠，分別在2或4周之后，用50個(gè)活約氏瘧原蟲子孢子攻擊這些和沒(méi)有接種的小鼠。通過(guò)監(jiān)測(cè)攻擊之后3-14天稀少的額血涂片中寄生物血癥確定血液感染的發(fā)生。
圖4A和4B.α-GalCer的佐劑活性需要CD1d分子和Vα14 NKT細(xì)胞。A.用γ-spz靜脈內(nèi)免疫BALB/c背景CD1d-缺陷(CD1-1-)，Vα14NKT(Jα281-1-)缺陷和野生型(WT)小鼠組并且腹膜內(nèi)施用α-GalCer(+)或賦形劑(-)。兩周之后用活子孢子攻擊這些和沒(méi)有接種的小鼠，并且如圖1所述測(cè)定肝中入侵的寄生蟲。B.用γ-spz免疫相同組的A中描述的小鼠，腹膜內(nèi)注射α-GalCer(+)或賦形劑(-)。兩周之后，通過(guò)ELISPOT分析測(cè)定脾中IFN-γ分泌CS-特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)目。星號(hào)(*)表示應(yīng)用未配對(duì)t-試驗(yàn)的兩個(gè)值之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)誤差(P＜0.01)。結(jié)果反映相似結(jié)果的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)并且表示為五個(gè)(A)或三個(gè)(B)的平均值±SD。
圖5A-C.在IFN-γ受體缺陷小鼠中取消α-GalCer的佐劑活性。A.用γ-spz靜脈內(nèi)免疫B10.D2背景IFN-γ受體缺陷(IFN-γR-1-)和野生型(WT)小鼠組并且腹膜內(nèi)施用α-GalCer(+)或賦形劑(-)。兩之后獲得脾淋巴細(xì)胞，并且通過(guò)ELISPOT分析測(cè)定IFN-γ分泌CS-特異性CD8+(■)和CD4+(□)T細(xì)胞的數(shù)目。B.從IFN-γR-1-和WT小鼠獲得肝淋巴細(xì)胞，并且染有PE-標(biāo)記的CD1d/α-GalCer四聚體和FITC-標(biāo)記的抗-CD3抗體，并且通過(guò)流式細(xì)胞儀分析測(cè)定α-GalCer-特異性T細(xì)胞百分比。右上角表明的數(shù)字代表肝淋巴樣細(xì)胞群中雙陽(yáng)性細(xì)胞百分比。C.從IFN-γR-1-(■)和WT(□)小鼠獲得肝淋巴細(xì)胞，并且通過(guò)ELISPOT分析測(cè)定分泌IFN-γ或IL-4的α-GalCer-特異性細(xì)胞的數(shù)目，結(jié)果表示為五只小鼠的平均值±SD。
本發(fā)明的詳細(xì)描述定義術(shù)語(yǔ)″佐劑″和″免疫佐劑″在本發(fā)明中互換使用，并且指當(dāng)單獨(dú)對(duì)宿主施用時(shí)可以是非免疫原性，但是當(dāng)與抗原聯(lián)合施用時(shí)增強(qiáng)對(duì)另一種抗原的宿主免疫應(yīng)答的化合物或混合物。
通過(guò)本領(lǐng)域公知的任何方法能評(píng)價(jià)佐劑-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的增強(qiáng)和/或免疫時(shí)間的延長(zhǎng)，包括并且不限于下面的一種或幾種(i)相對(duì)相應(yīng)單獨(dú)用抗原免疫而產(chǎn)生的那些，提高相應(yīng)佐劑/抗原聯(lián)合接種而產(chǎn)生的抗體的數(shù)目；(ii)提高識(shí)別抗原或佐劑的T細(xì)胞的數(shù)目；和(iii)提高一種或幾種I型細(xì)胞因子的水平。
本發(fā)明的佐劑包括屬于通式1能代表的一類鞘糖脂的化合物，特別是糖基神經(jīng)酰胺 其中R1，R2和R5代表H或具體單糖；R3和R6分別代表H或OH；R4代表H，OH或具體單糖；X代表1-23的整數(shù)；R7代表下面基團(tuán)(a)-(g)的任一個(gè)(a)--(CH2)11--CH3，(b)--(CH2)12--CH3，(c)--(CH2)13--CH3，(d)--(CH2)9--CH(CH3)2，(e)--(CH2)10--CH(CH3)2，(f)--(CH2)11--CH(CH3)2，(g)--(CH2)11--CH(CH3)--C2H5。
本發(fā)明優(yōu)選的佐劑包括α-半乳糖基神經(jīng)酰胺(α-GalCer)，具體地說(shuō)，是式2代表的(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖苷)-2-(N-二十六?；被?-1，3，4-十八烷三醇 本發(fā)明的佐劑中有用的糖基神經(jīng)酰胺的其他例子包括但不限于α-葡糖基神經(jīng)酰胺(α-GlcCer)，具體地說(shuō)，是式3的(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃葡糖苷)-N-二十六?；?2-氨基-1，3，4-十八烷三醇 Galα1-6Galα1-1′Cer，具體地說(shuō)，是式4的(2S，3S，4R)-2-氨基-1-O-(α-D-吡喃半乳糖苷-(1-6)-α-D-吡喃半乳糖苷)-N-二十六酰基-1，3，4-十八烷三醇
Galα1-6Glcα1-1′Cer，具體地說(shuō)，是式5的(2S，3S，4R)-2-氨基-1-O-(α-D-吡喃半乳糖苷-(1-6)-α-D-吡喃葡糖苷)-N-二十六?；?1，3，4-十八烷三醇 Galα1-2Glcα1-1′Cer，具體地說(shuō)，是式6的(2S，3S，4R)-2-氨基-1-O-(α-D-吡喃葡糖苷-(1-2)-α-D-吡喃半乳糖苷)-N-[(R)-2-羥基二十四?；鵠-1，3，4-十八烷三醇
Galβ1-3Galα1-1′Cer，具體地說(shuō)，是式7的(2S，3S，4R)-2-氨基-1-O-(β-D-呋喃半乳糖苷-(1-4)-α-D-吡喃半乳糖苷)-N-[(R)-2-羥基二十四?；鵠-1，3，4-十八烷三醇 優(yōu)選地，本發(fā)明的佐劑是人用藥學(xué)可接受的。
本發(fā)明的佐劑能作為含有抗原的藥物或疫苗組合物的部分或者作為分開的制劑施用，它與含有抗原的第二組合物聯(lián)合施用。在這些組合物中，糖基神經(jīng)酰胺能與其他佐劑和/或賦形劑/載體混合。這些其他佐劑包括但不限于，油-乳狀液和乳化劑-為基礎(chǔ)的佐劑，例如弗氏完全佐劑，弗氏不完全佐劑，MF59或SAF；礦物凝膠，例如氫氧化鋁(明礬)，磷酸鋁或磷酸鈣；微生物產(chǎn)生的佐劑例如霍亂毒素(CT)，百日咳毒素，大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素(LT)，突變體毒素(例如，LTK63或LTR72)，卡介苗(BCG)，小型棒狀桿菌(Corynebacterium parmacm)，DNA CpG基序，胞壁酰二肽，或單磷酸酯A；顆粒佐劑例如免疫刺激復(fù)合體(ISCOMs)，脂質(zhì)體，生物可降解微球，或皂甙(例如，QS-21)；細(xì)胞因子例如IFN-γ，IL-2，IL-12或GM-CSF；合成的佐劑例如非離子嵌段共聚物，胞壁酰肽類似物(例如，N-乙酰基-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷酰胺[thr-MDP]，N-乙?；?去甲-胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷酰胺，乙?；邗?L-丙氨酰-D-異谷酰胺-L-丙氨酸-2-[1′-2′-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧基]-乙基胺)，聚磷腈(polyphosphazenes)，或合成的多核苷酸，和表面活性物質(zhì)例如溶血卵磷脂，多聚醇，聚陰離子，肽，烴乳狀液，或匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)。優(yōu)選地，這些附加佐劑對(duì)于人用也是藥學(xué)可接受的。
在本發(fā)明的定義中，術(shù)語(yǔ)″聯(lián)合施用″用來(lái)指在一種組合物中同時(shí)施用，或者在不同的組合物中同時(shí)，或者依次施用免疫佐劑和抗原。順序施用認(rèn)為是″聯(lián)合″，但是，抗原和佐劑必須以仍然使得佐劑增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的一定時(shí)間間隔分開施用。例如，當(dāng)抗原是一種多肽時(shí)，在同一天施用抗原和佐劑，優(yōu)選地，彼此間隔1小時(shí)，最優(yōu)選地同時(shí)施用。但是，當(dāng)對(duì)受試者送遞核酸并且多肽抗原在宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，施用核酸24小時(shí)之內(nèi)施用佐劑，優(yōu)選6小時(shí)之內(nèi)。
如這里使用的，術(shù)語(yǔ)″免疫原″意思是抗原能激發(fā)體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答，優(yōu)選激發(fā)這兩者。免疫原整體也是抗原性的。免疫原組合物是當(dāng)對(duì)具有免疫體系的動(dòng)物施用時(shí)激發(fā)體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答或者這兩者的組合物。
術(shù)語(yǔ)″抗原″指當(dāng)導(dǎo)入宿主，動(dòng)物或人體中時(shí)被宿主的免疫系統(tǒng)識(shí)別并且能激發(fā)免疫應(yīng)答的任何物質(zhì)(例如，蛋白質(zhì)，肽，多糖，糖蛋白，糖脂，核酸，或者它們的組合)。如這里定義的，抗原-誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答可以是體液的或細(xì)胞介導(dǎo)的，或兩者。當(dāng)一種物質(zhì)能特異性與免疫系統(tǒng)的抗原識(shí)別分子例如免疫球蛋白(抗體)或T細(xì)胞抗原受體(TCR)相互作用時(shí)，稱為是″抗原性的″。在本發(fā)明的定義中，抗原優(yōu)選是″表面抗原″，即，在病原體的表面，在受感染細(xì)胞的表面，或者在腫瘤細(xì)胞的表面上天然表達(dá)。是抗原性的分子其本身不必須是免疫原性的，即，沒(méi)有佐劑或載體就能激發(fā)免疫應(yīng)答。
術(shù)語(yǔ)″表位″或″抗原決定簇″指B細(xì)胞，或T細(xì)胞或兩者識(shí)別的抗原的任何部分。優(yōu)選地，這樣的表位與免疫球蛋白(抗體)或T細(xì)胞抗原受體(TCR)的抗原識(shí)別位點(diǎn)相互作用導(dǎo)致誘導(dǎo)抗原-特異性免疫應(yīng)答。只有當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)裂解成較小的肽并且以位于另一個(gè)細(xì)胞表面的稱之為“主要組織相容性復(fù)合體(MHC)”的復(fù)合體存在時(shí)T細(xì)胞才識(shí)別蛋白質(zhì)。有兩類MHC復(fù)合體-I類和II類，每一類有很多不同的等位基因構(gòu)成。事實(shí)上每個(gè)細(xì)胞細(xì)胞上都發(fā)現(xiàn)了I類MHC復(fù)合體并且呈遞細(xì)胞中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)產(chǎn)生的肽。因此，I類MHC復(fù)合體用于殺死病毒感染的細(xì)胞或者由于致癌基因表達(dá)的結(jié)果而變成癌的細(xì)胞。其表面上有稱作CD8的蛋白質(zhì)的T細(xì)胞通過(guò)T細(xì)胞受體(TCR)特異性結(jié)合，I類MHC/肽復(fù)合體。這導(dǎo)致溶細(xì)胞效應(yīng)物活性。只是在抗原-呈遞細(xì)胞(APC)上發(fā)現(xiàn)II類MHC復(fù)合體，并且用來(lái)呈遞來(lái)自循環(huán)病原體的肽，所述循環(huán)病原體已經(jīng)被APC內(nèi)吞。具有稱為CD4的蛋白質(zhì)的T細(xì)胞通過(guò)TCR與II類MHC/肽復(fù)合體結(jié)合。這導(dǎo)致刺激免疫應(yīng)答的特異細(xì)胞因子的合成。為了通過(guò)I類MHC呈遞而被免疫系統(tǒng)有效地識(shí)別，抗原多肽必須包含至少大約8-10個(gè)氨基酸的表位，而為了通過(guò)II類MHC呈遞而被免疫系統(tǒng)有效地識(shí)別，抗原多肽必須包含至少大約13-25個(gè)氨基酸的表位。參見(jiàn)，例如，F(xiàn)undamental Immunology，第三版，W.E.Paul編著，1999，Lippincott-RavenPubl。
術(shù)語(yǔ)″物種-特異性″抗原指只存在于或者從特定物種產(chǎn)生的抗原。
這樣，術(shù)語(yǔ)″瘧疾-衍生的″或″瘧疾-特異性″抗原指天然的(例如，照射的子孢子)或合成的(例如，化學(xué)合成的多抗原肽[MAP]或重組合成的多肽)抗原，它包括構(gòu)成瘧原蟲的任一種蛋白質(zhì)衍生的至少一種表位(B細(xì)胞和/或T細(xì)胞)(所述瘧原蟲是但不限于P.falciparuin，P.vivax，三日瘧原蟲(P.Malariae)，蛋形瘧原蟲(P.Ovale)，賴氏(P.Reichenowi)，諾氏瘧原蟲(P.knowlesi)，巴斯食蟹猴瘧原蟲(P.cynomolgi)，巴西瘧原蟲(P.brasilianum)，約氏瘧原蟲(P.yoelii)，伯氏瘧原蟲(P.berghei)，或夏氏瘧原蟲(P.Chabaudi))并且包括至少5-10個(gè)氨基酸殘基。抗原產(chǎn)生的優(yōu)選的瘧原蟲蛋白質(zhì)是環(huán)子孢子(CS)蛋白質(zhì)，但是，也能使用其他蛋白質(zhì)，例如，凝血酶致敏蛋白相關(guān)附著(Anonymous)蛋白質(zhì)(TRAP)，也稱作子孢子表面蛋白質(zhì)2(SSP2)，LSAI，hsp70，SALSA，STARP，Hep17，MSA，RAP-1，RAP-2等。
術(shù)語(yǔ)″疫苗″指能用來(lái)激發(fā)受試者保護(hù)性免疫性的組合物(例如，蛋白質(zhì)或載體，例如，腺病毒載體，新培斯病毒載體，或痘病毒載體)。應(yīng)該指出為了有效，本發(fā)明的疫苗能激發(fā)一部分接種種群的免疫性，因?yàn)橐恍﹤€(gè)體不能發(fā)生有力的或保護(hù)性免疫應(yīng)答，或者在一些情況下引起任何免疫應(yīng)答。這種無(wú)能可能源自個(gè)體的遺傳背景或者因?yàn)槊庖呷毕輻l件(或者是后天的或先天的)或者免疫抑制(例如，由于用化學(xué)療法治療或者使用免疫抑制藥物，例如，防止器官排斥或抑制自身免疫癥狀)。在動(dòng)物模型中能確定疫苗效力。
術(shù)語(yǔ)″DNA疫苗″是本領(lǐng)域非正式術(shù)語(yǔ)，在這里指利用重組載體送遞的疫苗?；蛘撸@里使用更多的描述術(shù)語(yǔ)是″載體疫苗″(因?yàn)橐恍┛赡艿妮d體，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒是RNA病毒，并且因?yàn)樵谀承┣闆r下非病毒RNA代替DNA被通過(guò)載體送遞給細(xì)胞)。一般情況下，體內(nèi)施用載體，但是也包括合適的抗原呈遞細(xì)胞例如樹突細(xì)胞(DC)的來(lái)自體內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，體內(nèi)施用經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。
術(shù)語(yǔ)″治療″在這里用來(lái)指減輕或緩解患者的疾病的至少一種癥狀。在本發(fā)明的定義中，術(shù)語(yǔ)″治療″還可以指延長(zhǎng)顯露前期(prepatency)，即，感染疾病和疾病臨床表現(xiàn)之間的時(shí)間。優(yōu)選地，所述疾病或者是感染的疾病(例如，病毒，細(xì)菌，寄生蟲，或真菌)或者惡性腫瘤(例如，實(shí)體或血液腫瘤例如肉瘤，癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，胚細(xì)胞瘤，胰腺癌，乳房癌，卵巢癌，前列腺癌，淋巴瘤，白血病，黑素瘤等)。
術(shù)語(yǔ)″保護(hù)″在這里指預(yù)防或治療，或者兩者，如果合適，預(yù)防或治療患者疾病的發(fā)展或持續(xù)。在本發(fā)明的定義中，所述疾病選自感染(例如，病毒，細(xì)菌，寄生蟲，或真菌)和惡性腫瘤(例如，實(shí)體或血液腫瘤例如肉瘤，癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，胚細(xì)胞瘤，胰腺癌，乳房癌，卵巢癌，前列腺癌，淋巴瘤，白血病，黑素瘤等)。例如，如這里公開的，預(yù)防性施用含有與包括α-GalCer的佐劑混合的來(lái)自瘧原蟲的抗原的抗瘧疫苗能保護(hù)受試者不冒發(fā)生瘧疾的危險(xiǎn)。類似地，根據(jù)本發(fā)明，與含有α-GalCer或另一種式1的糖基神經(jīng)酰胺聯(lián)合治療性施用腫瘤-特異性抗原能增強(qiáng)抗-腫瘤免疫應(yīng)答，導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移緩慢，甚至腫瘤消退。
術(shù)語(yǔ)″保護(hù)性免疫性″指宿主動(dòng)物的免疫應(yīng)答(或者是主動(dòng)的/后天的或被動(dòng)的/先天的，或者兩者)，它導(dǎo)致所述抗原負(fù)載的失活和/或減少和產(chǎn)生持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)的免疫性(那是獲得性的，例如，通過(guò)產(chǎn)生抗體)，它預(yù)防或延遲重復(fù)接觸相同的或相關(guān)的抗原時(shí)發(fā)生疾病?！灞Ｗo(hù)性免疫應(yīng)答″包括體液(抗體)免疫性或細(xì)胞免疫性，或者兩者，例如有效地消除或減少病原體負(fù)載或感染的細(xì)胞(或者導(dǎo)致感染的任何其他可測(cè)得的減輕)，或者減輕免疫的(接種的)受試者的腫瘤負(fù)擔(dān)。在本發(fā)明的定義中，保護(hù)性免疫性可以是部分的。
免疫系統(tǒng)分類為兩個(gè)一般系統(tǒng)，″先天的″或″天然的″免疫系統(tǒng)和″后天的″或″適應(yīng)性″免疫系統(tǒng)。認(rèn)為天然免疫系統(tǒng)最初保持控制下的感染，使得適應(yīng)性免疫系統(tǒng)有時(shí)間產(chǎn)生合適的應(yīng)答。最近的研究提出，先天免疫系統(tǒng)的各種成分觸發(fā)和增強(qiáng)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的成分，包括抗原-特異性B和T淋巴細(xì)胞(Fearon和Locksley，上文；Kos，1998，Immunol.Res.，17303；Romagnani，1992，Immunol.Today，13379；Banchereau和Steinman，1988，Nature，392245)。
術(shù)語(yǔ)″先天免疫性″或″天然免疫性″指先前接觸抗原不受影響的先天免疫應(yīng)答。先天免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞(DC)，通過(guò)模式識(shí)別受體吸收外來(lái)抗原，這些抗原的肽片段與I類和II類MHC分子結(jié)合，并且分別刺激天然CD8+和CD4+T細(xì)胞(Banchereau和Steinman，上文；Holmskov等，1994，Immunol.Today，1567；Ulevitch和Tobias，1995，Annu.Rev.Immunol.，13437)。專業(yè)抗原-呈遞細(xì)胞(APC)與這些T細(xì)胞聯(lián)系，導(dǎo)致天然CD4+T細(xì)胞分化成T-輔助1(Th1)或T-輔助2(Th2)淋巴細(xì)胞，它們分別介導(dǎo)細(xì)胞和體液免疫性(Trinchieri，1995，Annu.Rev.Immunol.，13251；Howard和O′Garra，1992，Immunol.Today，13198；Abbas等，1996，Nature，383787；Okamura等，1998，Adv.Immunol.，70281；Mosmann和Sad，1996，Immunol.Today，17138；O′Garra，1998，Immunity，8275)。
術(shù)語(yǔ)″后天免疫性″或″適應(yīng)性免疫性″在這里用來(lái)指在動(dòng)物的生命中確立的主動(dòng)或被動(dòng)的，體液或細(xì)胞的免疫性，它對(duì)誘導(dǎo)抗原是特異性的，并且顯著的是在反復(fù)與所述抗原接觸時(shí)應(yīng)答增強(qiáng)。適應(yīng)性免疫系統(tǒng)T細(xì)胞的一個(gè)關(guān)鍵特征是它們檢測(cè)細(xì)胞表面上MHC分子呈遞的病原體產(chǎn)生的肽的詳細(xì)濃度。
如這里使用的，術(shù)語(yǔ)″增強(qiáng)免疫應(yīng)答″意指增強(qiáng)免疫應(yīng)答或者延長(zhǎng)免疫應(yīng)答時(shí)間，或者兩者。當(dāng)指一種物質(zhì)(例如佐劑)的性質(zhì)時(shí)，術(shù)語(yǔ)″[能]增強(qiáng)免疫原性″指增強(qiáng)抗原的免疫原性的能力或者延長(zhǎng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答時(shí)間的能力，或者兩者。
短語(yǔ)″增強(qiáng)免疫應(yīng)答″在本發(fā)明的定義中指對(duì)給定抗原的免疫反應(yīng)性的增大的規(guī)格和/或效率的性質(zhì)和過(guò)程，所述免疫反應(yīng)性是體液或細(xì)胞免疫性，或者兩者。如果抗原-特異性免疫反應(yīng)性的任何可測(cè)量參數(shù)(例如，抗體滴度，T細(xì)胞產(chǎn)生)提高至少兩倍，優(yōu)選10倍，最優(yōu)選30倍，則相信免疫應(yīng)答被增強(qiáng)。
對(duì)劑量或量使用的術(shù)語(yǔ)″治療有效的″指對(duì)需要的哺乳動(dòng)物施用時(shí)足以導(dǎo)致期望的活性的化合物或藥物組合物或疫苗的量。如這里關(guān)于含有佐劑或含有抗原的組合物或疫苗所使用的，術(shù)語(yǔ)″治療有效量/劑量″與術(shù)語(yǔ)″免疫原有效量/劑量″互換使用，并且指哺乳動(dòng)物施用時(shí)足以產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答的化合物(例如，抗原和/或含有糖基神經(jīng)酰胺的佐劑)或藥物組合物或疫苗的量/劑量。
短語(yǔ)″藥學(xué)可接受的″與本發(fā)明的組合物聯(lián)合使用時(shí)指當(dāng)對(duì)人施用時(shí)是生理耐受的并且一般不產(chǎn)生不期望的反應(yīng)的這樣的組合物的分子整體和其他成分。優(yōu)選地，如這里使用的，術(shù)語(yǔ)″藥學(xué)可接受的″意思是得到聯(lián)邦或政府管理部門的批準(zhǔn)或者美國(guó)藥典中列出的或者一般公知的對(duì)哺乳動(dòng)物更特別地對(duì)人使用的藥典列出的。
對(duì)本發(fā)明的藥物或疫苗組合物使用的術(shù)語(yǔ)″載體″指和化合物(例如，抗原和/或包括糖基神經(jīng)酰胺的佐劑)一起施用的稀釋劑，賦形劑或載體。這樣的藥學(xué)載體可以是無(wú)菌液體，例如水和油，包括石油，動(dòng)物，植物或合成來(lái)源的那些，例如花生油，豆油，礦物油，芝麻油和類似的。水或含水溶液，鹽水溶液，和葡萄糖水溶液和甘油溶液優(yōu)選用作載體，特別用于注射液。合適的藥物載體是E.W.Martin，″Remington′s Pharmaceutical Sciences″，18版中描述的那些。
術(shù)語(yǔ)″天然抗體″或″免疫球蛋白″指通常的大約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白，由兩個(gè)相同的輕鏈(L)和兩個(gè)相同的重鏈(H)構(gòu)成。每一條輕鏈通過(guò)一個(gè)共價(jià)二硫鍵與重鏈連接，而不同的免疫球蛋白同位型的重鏈之間的二硫鍵數(shù)目不同。每條重鏈和輕鏈還有有規(guī)律間隔的鏈間二硫橋。每條重鏈一端具有一個(gè)可變區(qū)(VH)接著是幾個(gè)恒定區(qū)。每條輕鏈一端具有一個(gè)可變區(qū)(VL)，另一端有一個(gè)恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個(gè)恒定區(qū)排列，輕鏈可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)排列。相信特定氨基酸殘基形成輕鏈和重鏈可變區(qū)之間的界面(Clothia等，J Mol.Biol.，186651-663，1985；Novotny和Haber，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，824592-4596，1985)。
術(shù)語(yǔ)″抗體″或″Ab″以最廣義使用并且具體不只是覆蓋天然抗體而且還包括單鏈單克隆抗體(包括激動(dòng)劑和拮抗劑抗體)，具有多表位特異性的抗體組合物，以及抗體片段(例如，F(xiàn)ab，F(xiàn)(ab′)2，scFv和Fv)，只要它們表現(xiàn)出期望的生物活性。
″細(xì)胞因子″是對(duì)另一個(gè)細(xì)胞種群作用作為細(xì)胞間調(diào)節(jié)劑的一個(gè)細(xì)胞種群釋放的一組蛋白質(zhì)的一般術(shù)語(yǔ)。這樣的細(xì)胞因子的例子是淋巴因子單核因子和傳統(tǒng)的多肽激素。細(xì)胞因子包括干擾素(IFN，特別是IFN-γ)，白細(xì)胞介素(IL，特別是IL-1，IL-2，IL-4，IL10，IL-12)，集落刺激因子(CSF)，血小板生成素(TPO)，紅細(xì)胞生成素(EPO)，白血病抑制因子(LIF)，試劑盒-配體，生長(zhǎng)激素(GH)，胰島素-樣生長(zhǎng)因子(IGF)，甲狀旁腺素，甲狀腺素，胰島素，松弛素，濾泡刺激激素(FSH)，甲狀腺刺激激素(TSH)，leutinizing hormone(LH)，造血生長(zhǎng)因子，肝生長(zhǎng)因子，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)，催乳激素，胎盤催乳激素，腫瘤壞死因子(TNF)，mullerian-抑制物質(zhì)，小鼠促性腺素-相關(guān)肽，抑制素，活化素，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，整聯(lián)蛋白，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)，血小板生長(zhǎng)因子，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)，骨誘導(dǎo)因子等。
術(shù)語(yǔ)″受試者″在這里指具有免疫系統(tǒng)的動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物(例如，嚙齒類動(dòng)物例如小鼠)。特別地，該術(shù)語(yǔ)指人。
術(shù)語(yǔ)″大約″或″大概″通常意指給定值或范圍的20％之內(nèi)，更優(yōu)選10％之內(nèi)，最優(yōu)選5％之內(nèi)?；蛘?，特別是在生物系統(tǒng)中(例如，當(dāng)測(cè)定免疫應(yīng)答時(shí))，術(shù)語(yǔ)″大約″意指優(yōu)選在給定兩個(gè)值系數(shù)之內(nèi)的大約對(duì)數(shù)之內(nèi)(即，數(shù)量級(jí))。
術(shù)語(yǔ)″載體″，″克隆載體″，和″表達(dá)載體″意指通過(guò)它能將DNA或RNA序列(例如，外來(lái)基因)導(dǎo)入宿主細(xì)胞，從而轉(zhuǎn)化宿主并且促進(jìn)導(dǎo)入的序列的表達(dá)(例如，轉(zhuǎn)錄和/或翻譯)的載體。載體包括質(zhì)粒，噬菌體，病毒等。
根據(jù)本發(fā)明，可以應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)分子生物學(xué)，微生物學(xué)，和重組DNA技術(shù)。這樣的技術(shù)是公知的并且在文獻(xiàn)中有詳細(xì)解釋。參見(jiàn)，例如，Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版(1989)，Cold Spring Harbor拉Laboratory Press，冷泉港，紐約(這里是″Sambrook等，1989″)；DNACloningA Practical Approach Volumes I and II(D.N.Glover編著1985)；Oligoizucleotide Synthesis(M.J.Gait編著1984)；Nucleic Acid Hybridization[B.D.Hames & S.J.Higgins編著(1985)]；Transcription And Translation[B.D.Hames & S.J.Higgins，編著(1984)]；Animal Cell Culture[R.I.Freshney，編著(1986)]；Immobilized Cells And Enzymes[IRL Press，(1986)]；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；F.M.Ausubel等(編著)Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，Inc.(1994)。
″核酸分子″(或者″核酸″)指核糖核苷的磷酸酯聚合物形式(腺苷，鳥苷，尿苷，或胞苷″RNA分子″)或者脫氧核糖核苷(脫氧腺苷，脫氧鳥苷，脫氧尿苷，或脫氧胞苷″DNA分子″)，或者它們的任何磷酯類似物，例如硫代磷酸酯或硫酯，或者是單鏈形式，或者是雙鏈螺旋。定義的術(shù)語(yǔ)中包括寡核苷酸(具有少于100個(gè)核苷酸的構(gòu)成單元)或多核苷酸，還有雙鏈DNA-DNA，DNA-RNA，和RNA-RNA螺旋。該術(shù)語(yǔ)例如包括特別是在線性(例如，限制性片段)或環(huán)狀DNA分子，質(zhì)粒，和染色體中發(fā)現(xiàn)的雙鏈DNA。在討論特定雙鏈DNA分子的結(jié)構(gòu)中，可以根據(jù)只以5′至3′方向沿著沒(méi)有轉(zhuǎn)錄的DNA鏈(即，具有與mRNA的序列同源性的鏈)給出的序列的常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)描述序列?！逯亟MDNA分子″是經(jīng)歷分子生物學(xué)操作的DNA分子。
如這里使用的，術(shù)語(yǔ)″多肽″指以氨基酸為基礎(chǔ)的聚合物，它可以由核酸編碼或者合成制備。多肽可以是蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)片段，嵌合蛋白等。一般來(lái)說(shuō)，術(shù)語(yǔ)″蛋白質(zhì)″指細(xì)胞內(nèi)源表達(dá)的多肽。一般來(lái)說(shuō)，編碼特定蛋白質(zhì)或酶的DNA序列被″轉(zhuǎn)錄″成相應(yīng)的mRNA序列。mRNA序列接著″翻譯″成形成蛋白質(zhì)的氨基酸序列?！灏被嵝蛄小迨莾蓚€(gè)或多個(gè)氨基酸的鏈。術(shù)語(yǔ)″肽″通常用于具有少于100個(gè)氨基酸構(gòu)成單元的以氨基酸為基礎(chǔ)的聚合物，而術(shù)語(yǔ)″多肽″指具有至少100個(gè)這樣的單元的聚合物。但是，在這里，″多肽″是一般術(shù)語(yǔ)。
含有糖基神經(jīng)酰胺的佐劑的應(yīng)用一方面，本發(fā)明提供增強(qiáng)哺乳動(dòng)物抗原的免疫原性的方法，包括與含有式1的糖基神經(jīng)酰胺優(yōu)選半乳糖基神經(jīng)酰胺(α-GalCer)的佐劑組合物聯(lián)合施用所述抗原。根據(jù)本發(fā)明，糖基神經(jīng)酰胺用作佐劑導(dǎo)致抗原誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫性的增強(qiáng)和/或時(shí)間的延長(zhǎng)。例如，如這里公開的，聯(lián)合施用糖基神經(jīng)酰胺和相應(yīng)于腫瘤或病毒抗原的T細(xì)胞或B細(xì)胞表位的肽，或者表達(dá)這些抗原的DNA構(gòu)建體，增強(qiáng)抗原-特異性免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的含有糖基神經(jīng)酰胺的佐劑可以與任何抗原聯(lián)合施用，特別地，與來(lái)自感染的物質(zhì)或腫瘤的抗原。
如
背景技術(shù)：
部分討論的，小鼠和人體中糖基神經(jīng)酰胺的免疫刺激作用取決于CD1d分子的表達(dá)并且由NKT細(xì)胞介導(dǎo)。事實(shí)上，本發(fā)明證明α-GalCer佐劑活性至少部分歸因于它增強(qiáng)和/或延長(zhǎng)NKT-介導(dǎo)的抗原特異性Th1-型T細(xì)胞應(yīng)答和CD8+T細(xì)胞(或Tc)應(yīng)答的能力。
從免疫治療的角度看，NKT細(xì)胞系統(tǒng)的糖基神經(jīng)酰胺-介導(dǎo)的激活作用表現(xiàn)出比其他機(jī)理顯著優(yōu)越，在于下面幾個(gè)原因(a)激活的NKT細(xì)胞的細(xì)胞毒性水平非常高并且有效抗很多種腫瘤細(xì)胞或感染細(xì)胞；(b)糖基神經(jīng)酰胺對(duì)NKT細(xì)胞的激活作用完全依賴于CD1d分子，它在個(gè)體中是單態(tài)性的(Porcelli，Adv.Immunol.，591-98，1995)，表明含有糖基神經(jīng)酰胺的佐劑能被所有的患者利用，不管MHC單元型；(c)在免疫治療之前通過(guò)使用Vα14 NKT細(xì)胞狀態(tài)作為指示劑對(duì)小鼠體內(nèi)測(cè)試，能評(píng)價(jià)人患者的DC的抗原呈遞功能和NKT激活作用。
根據(jù)本發(fā)明，含有式1的糖基神經(jīng)酰胺的佐劑和抗原可以作為兩個(gè)分開的配方施用或者作為相同組合物的部分施用。如果分開施用，可以順序或同時(shí)施用佐劑和抗原。如這里公開的，同時(shí)施用糖基神經(jīng)酰胺佐劑和抗原是優(yōu)選的，并且一般使得實(shí)現(xiàn)最有效免疫刺激。
因?yàn)楸景l(fā)明的糖基神經(jīng)酰胺佐劑與大多數(shù)不同的抗原結(jié)合表現(xiàn)出它的免疫刺激活性，因此它用于保護(hù)性和治療性應(yīng)用。因此，在另一方面，本發(fā)明提供處理哺乳動(dòng)物疾病的預(yù)防性和/或治療性方法，包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物聯(lián)合施用抗原和含有式1的糖基神經(jīng)酰胺的佐劑。該方法能用于，例如，保護(hù)性抗和/或治療各種炎癥以及用于治療各種腫瘤疾病。
能應(yīng)用增強(qiáng)本發(fā)明方法的免疫原性克服感染，包括但不限于，寄生蟲感染(例如瘧原蟲引起的那些等)，病毒感染(例如流感病毒，白血病病毒，免疫缺陷病毒例如HIV，乳頭狀瘤病毒，皰疹病毒，肝炎病毒，風(fēng)疹病毒，痘病毒，流行性腮腺炎病毒，巨細(xì)胞病毒[CMV]，埃-巴病毒等引起的那些)，細(xì)菌感染(例如葡萄球菌屬，鏈球菌屬，肺炎球菌屬，淋病奈瑟氏球菌屬，疏螺旋體屬，甲單胞菌屬，等引起的那些)，和真菌感染(例如念珠菌屬，發(fā)癬菌屬，ptyrosporum，等引起的那些)。
本發(fā)明的方法還用于治療各種癌癥，包括但不限于纖維肉瘤，粘液肉瘤，脂肉瘤，軟骨肉瘤，成骨肉瘤，脊索瘤，血管肉瘤，內(nèi)皮肉瘤，淋巴肉瘤，淋巴內(nèi)皮肉瘤，滑膜瘤，間皮瘤，Ewing′s腫瘤，平滑肌肉瘤，橫紋肌肉瘤，結(jié)腸癌，胰腺癌，乳房癌，卵巢癌，前列腺癌，淋巴瘤，白血病，鱗狀細(xì)胞癌，基礎(chǔ)細(xì)胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳頭狀癌，乳頭狀腺癌，囊腺肉瘤，骨髓癌，支氣管原癌，腎細(xì)胞癌，肝癌，膽管癌，絨膜癌，精原細(xì)胞瘤，胚胎癌，Wilms′腫瘤，子宮頸癌，睪丸癌，肺癌，小細(xì)胞肺癌，膀胱癌，上皮癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，星形細(xì)胞瘤，成神經(jīng)管細(xì)胞瘤，顱咽管瘤，室管膜細(xì)胞瘤，松果體瘤，成血管細(xì)胞瘤，聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)瘤，少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤，腦膜瘤，黑素瘤，神經(jīng)母細(xì)胞瘤，和成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤。
如這里另外公開的，當(dāng)同時(shí)施用抗原和糖基神經(jīng)酰胺佐劑時(shí)獲得增強(qiáng)本發(fā)明方法的免疫原性的最大效率。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明公開了預(yù)防和/或治療哺乳動(dòng)物(例如人)瘧疾的方法，其中所述方法包括對(duì)所述動(dòng)物聯(lián)合施用瘧疾-特異性抗原和含有式1的糖基神經(jīng)酰胺，優(yōu)選α-GalCer的佐劑。如下面實(shí)施例1中公開的，用最適度以下劑量的照射的瘧疾寄生蟲對(duì)小鼠接種，聯(lián)合施用α-GalCer，大大增強(qiáng)保護(hù)性抗-瘧疾免疫性。聯(lián)合施用α-GalCer不僅僅提高保護(hù)作用的水平，而且還延長(zhǎng)保護(hù)性抗瘧疾免疫性時(shí)間。此外，這里公開了對(duì)小鼠共同施用α-GalCer和照射的寄生蟲或肽(相應(yīng)于瘧疾CS蛋白質(zhì)的CD4+或CD8+表位)，導(dǎo)致抗原-特異性T細(xì)胞數(shù)目的增加。
在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明公開了提高哺乳動(dòng)物相應(yīng)HIV感染(和有效地預(yù)防和/或治療AIDS)的免疫應(yīng)答的方法，其中所述方法包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物聯(lián)合施用HIV-特異性抗原和α-GalCer佐劑。如下面實(shí)施例2中公開的，對(duì)用HIV的p18(V3環(huán))的CD8+T細(xì)胞表位(RGPGRAFVTI[SEQ ID NO5])免疫的小鼠聯(lián)合施用α-GalCer，與沒(méi)有用α-GalCer處理免疫的小鼠中誘導(dǎo)的相比，HIV-特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答幾乎提高3倍。
本發(fā)明的方法能和其他治療方法結(jié)合使用。例如，能與化療和/或放療和/或IL-12治療結(jié)合應(yīng)用使用腫瘤-特異性抗原和含有糖基神經(jīng)酰胺的本發(fā)明佐劑的抗癌治療。能與IFN-α治療結(jié)合應(yīng)用包括含有α-糖基-神經(jīng)酰胺的佐劑的抗-病毒疫苗。
除了它的治療應(yīng)用之外，本發(fā)明的糖基神經(jīng)酰胺佐劑還可以用作研究基礎(chǔ)免疫學(xué)諸多方面的研究工具。例如，能用它研究免疫機(jī)理，例如NKT細(xì)胞的功能，DC的抗原呈，和細(xì)胞因子和它們的受體對(duì)免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)。還可以在疫苗設(shè)計(jì)研究中使用糖基神經(jīng)酰胺佐劑，這有助于鑒定保護(hù)性免疫性的要求，因?yàn)閷?duì)于相同的抗原，不同的佐劑可以產(chǎn)生強(qiáng)度和/或時(shí)間長(zhǎng)短不同的免疫應(yīng)答。
含有糖基神經(jīng)酰胺的藥物和疫苗組合物結(jié)合本發(fā)明的方法，還提供了含有免疫原有效量的抗原和免疫原有效量的包括糖基神經(jīng)酰胺的佐劑，和，任選的，另外一種免疫刺激物，載體或賦形劑的藥物(優(yōu)選全部是藥學(xué)可接受的)的藥物和疫苗組合物。所述抗原和佐劑可以配制成單一組合物或者為兩種分開的組合物，它們可以同時(shí)或順序施用。
本發(fā)明的佐劑包括屬于通式1能代表的鞘糖脂類的化合物，特別是糖基神經(jīng)酰胺 其中R1，R2和R5代表H或具體單糖；R3和R6分別代表H或OH；R4代表H，OH或具體單糖；X代表1-23的整數(shù)；R7代表下面基團(tuán)(a)-(g)的任一個(gè)(a)--(CH2)11--CH3，(b)--(CH2)12--CH3，(c)--(CH2)13--CH3，(d)--(CH2)9--CH(CH3)2，(e)--(CH2)10--CH(CH3)2，(f)--(CH2)11--CH(CH3)2，(g)--(CH2)11--CH(CH3)--C2H5。
本發(fā)明優(yōu)選的佐劑包括α-半乳糖基神經(jīng)酰胺(α-GalCer)，具體地說(shuō)，是式2代表的(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖苷)-2-(N-二十六酸基氨基)-1，3，4-十八烷三醇 本發(fā)明的佐劑中有用的糖基神經(jīng)酰胺的其他例子包括但不限于α-葡糖基神經(jīng)酰胺(α-GlcCer)，具體地說(shuō)，是式3的(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃葡糖苷)-N-二十六?；?2-氨基-1，3，4-十八烷三醇 Galα1-6Galα1-1′Cer，具體地說(shuō)，是式4的(2S，3S，4R)-2-氨基-1-O-(α-D-吡喃半乳糖苷-(1-6)-α-D-吡喃半乳糖苷)-N-二十六?；?1，3，4-十八烷三醇
Galα1-6Glcα1-1′Cer，具體地說(shuō)，是式5的(2S，3S，4R)-2-氨基-1-O-(α-D-吡喃半乳糖苷-(1-6)-α-D-吡喃葡糖苷)-N-二十六?；?1，3，4-十八烷三醇 Galα1-2Glcα1-1′Cer，具體地說(shuō)，是式6的(2S，3S，4R)-2-氨基-1-O-(α-D-吡喃葡糖苷-(1-2)-α-D-吡喃半乳糖苷)-N-[(R)-2-羥基二十四?；鵠-1，3，4-十八烷三醇
Galβ1-3Galα1-1′Cer，具體地說(shuō)，是式7的(2S，3S，4R)-2-氨基-1-O-(β-D-呋喃半乳糖苷-(1-4)-α-D-吡喃半乳糖苷)-N-[(R)-2-羥基二十四酰基]-1，3，4-十八烷三醇 α-GalCer佐劑成分可以從Okinawan海綿中分離(例如，根據(jù)Natori等，Tetrahedron，502771-2784，1994所述)或者合成制備(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利Nos.5,936,076；5,780,441；5,849,716,和6,071,884；PCT公開Nos.WO 98/29534，和WO98/44928；Kobayashi等，1995，Oncol.Res.，7529534)。類似地，本發(fā)明的其他糖基神經(jīng)酰胺佐劑能從天然來(lái)源分離(例如，從海綿)或者合成制備(例如如美國(guó)專利Nos.5,936,076；5,780,441；5,849,716,和6,071,884；PCT公開Nos.WO 98/29534和WO 98/44928；Morita等，J.Med.Chem.，382176-2187，1995；Teriyuki等，J.Med.Chem.，421836-1841，1999所述)。
本發(fā)明的免疫原(例如疫苗)組合物中使用的抗原可以來(lái)自真核細(xì)胞(例如，腫瘤，寄生蟲，真菌)，細(xì)菌細(xì)胞，病毒顆粒，或者其任何部分。在物質(zhì)對(duì)其所針對(duì)的免疫應(yīng)答有不好的抗原性的作用中，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)共價(jià)結(jié)合技術(shù)，例如使用幾種商售試劑盒中的一種，可以常規(guī)地將它與載體分子例如白蛋白或半抗原偶聯(lián)。
本發(fā)明優(yōu)選的抗原的例子包括(i)瘧疾特異性抗原，例如照射的瘧原蟲子孢子或者包括至少一個(gè)瘧疾環(huán)子孢子(CS)蛋白質(zhì)(參見(jiàn)下文)的T細(xì)胞和/或B細(xì)胞表位的合成的肽抗原；(ii)病毒蛋白或肽抗原，例如從下面的病毒產(chǎn)生的那些流感病毒(例如，表面糖蛋白血凝素(HA)和唾液酸苷酶(NA)[例如禽流感HA或鳥流感A/Jalisco/95H5 HA)；免疫缺陷病毒(例如，貓科免疫缺陷病毒(FIV)抗原，猿免疫缺陷病毒(SIV)抗原，或人免疫缺陷病毒抗原(HIV)例如gp120，gp160，p18抗原[下文實(shí)施例2中所述])，Gagp 17/p24，Tat，Pol，Nef，和Env；皰疹病毒(例如，糖蛋白，例如，來(lái)自貓科皰疹病毒，馬皰疹病毒，牛皰疹病毒，假狂犬病病毒，犬皰疹病毒，單純性皰疹病毒(HSV，例如，HSV tk，gB，gD)，Marek′s病病毒，火雞皰疹病毒(HVT)，或巨細(xì)胞病毒(CMV)，或埃-巴病毒)；肝炎病毒 (例如，乙肝表面抗原(HBsAg))；乳頭狀瘤病毒；牛白血病病毒(例如，gp51，30膜抗原)；貓科白血病病毒(FeLV)(例如，F(xiàn)eLV膜蛋白，Newcastle病病毒(NDV)抗原，例如，HNorF)；勞斯相關(guān)病毒(例如RAV-1 env)；傳染性支氣管炎病毒(例如，基質(zhì)和/或preplomer)；黃病毒(例如，日本大腦炎病毒(JEV)抗原，黃色發(fā)熱病毒，或登革熱病毒抗原)；麻疹病毒(例如，犬科溫?zé)岵《究乖?，麻疹抗原，或牛疫抗原例如HA或F)；狂犬病(例如，狂犬病糖蛋白G)；細(xì)小病毒(例如，犬科細(xì)小病毒抗原)；痘病毒(例如，先天性缺肢畸形抗原，金絲雀痘病毒抗原，或家禽痘病毒抗原)；或雞痘病毒(水痘帶狀皰疹病毒抗原)；傳染性粘液囊病病毒(例如，VP2，VP3，或VP4)；Hantaan病毒；流行性腮腺炎病毒；(iii)細(xì)菌抗原，例如從格蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁分離的脂多糖，和葡萄球菌-特異性的，鏈球菌-特異性的，肺炎球菌-特異性的(例如，PspA[參見(jiàn)PCT公開No.WO 92/14488])，淋病奈瑟氏菌-特異性的，疏螺旋體-特異性的(例如，Lyme疾病相關(guān)的疏螺旋體的OspA，OspB，OspC抗原，例如Borrelia burgdorferi，Borrelia afzelli，和Borreliagarinii[參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利No.5,523,089；PCT公開Nos.WO90/04411，WO91/09870，WO93/04175，WO96/06165，WO93/08306；PCT/US92/08697；Bergstrom等，Mol.Microbiol.，3479-486，1989；Johnson等，Infect.and Immun.601845-1853，1992；Johnson等，Vaccine 131086-1094，1995；The SixthInternational Conference on Lyme BorreliosisProgress on theDevelopment of Lyme Disease Vaccine，Vaccine 13133-135，1995])，和假單胞菌-特異性的蛋白質(zhì)或肽；(iv)真菌抗原，例如從念珠菌屬，毛癬菌屬，或ptyrosporum分離的那些，和(v)腫瘤-特異性蛋白質(zhì)，例如ErbB受體，Melan A[MART1]，gap100，酪氨酸酶，TRP-1/gp 75，和TRP-2(在黑色素瘤中)；MAGE-1和MAGE-3(在膀胱癌，頭頸癌，和非小細(xì)胞癌中)；HPV EG和E7蛋白質(zhì)(在腦癌中)；粘蛋白[MUC-1](在乳房癌，胰腺癌，結(jié)腸癌和前列腺癌中)；前列腺-特異性抗原[PSA](在前列腺癌中)；胚胎癌抗原[CEA](在結(jié)腸癌，乳房癌，和腸胃癌中)和這樣的共有腫瘤-特異性抗原例如MAGE-2，MAGE-4，MAGE-6，MAGE-10，MAGE12，BAGE-1，CAGE-1，2，8，CAGE-3 to 7，LAGE-1，NY-ESO-1/LAGE-2，NA-88，GnTV，和TRP2-INT2。
上面列出的抗原只是為了舉例，因?yàn)楦信d趣的抗原可以來(lái)自任何動(dòng)物或人病原體或腫瘤。關(guān)于感興趣的病原體產(chǎn)生的抗原的編碼DNA，注意參考，例如，美國(guó)專利Nos.4,722,848；5,174,993；5,338,683；5,494,807；5,503,834；5,505,941；5,514,375；5,529,780；U.K.專利No.GB 2 269 820 B；和PCT公開Nos.WO92/22641；WO93/03145；WO94/16716；WO96/3941；PCT/US94/06652。關(guān)于從腫瘤病毒得到的抗原，還可以參見(jiàn)Molecular Biology of TumorViruses，RNA Tumor Viruses，第二版，Weiss等編著，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1982。對(duì)于本發(fā)明組合物中有用的附加的抗原的名單還可以參見(jiàn)Stedman′s Medical Dictionary(24版，1982)。
在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物提供抗瘧疾的保護(hù)性免疫性，特別是抗約氏瘧原蟲和主要人瘧原蟲物種P.Falciparum和P.vivax。這些組合物含有下面成分的一種或多種(i)至少一種包括優(yōu)選能對(duì)不同遺傳背景的哺乳動(dòng)物激發(fā)抗-瘧疾T-細(xì)胞應(yīng)答的T細(xì)胞表位的瘧疾-特異性肽(例如，YNRNIVNRLLGDALNGKPEEK[SEQ ID NO1]或SYVPSAEQI[SEQ ID NO2]約氏瘧原蟲CS蛋白質(zhì)的T細(xì)胞表位[Renia等，J.Immunol.，22157-160，1993；Rodrigues等，Int.Immunol.，3579-585，1991]或(NVDPNANP)n[SEQ ID NO3]或EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT[SEQ ID NO4]P.falciparum CS蛋白質(zhì)的T細(xì)胞表位[Nardin等，Science 2461603，1989；Moreno等，Int.Immunol.3997，1991；Moreno等，J.Immunol.151489，1993])；(ii)至少一種包括能刺激抗-瘧疾(即，中和)抗體(例如，定向抗瘧疾微生物子孢子期)的B細(xì)胞表位的瘧疾-特異性肽(例如，(NANP)3[SEQ ID NO15]位于P.falciparum CS蛋白質(zhì)的重復(fù)區(qū)中的B細(xì)胞表位[Nardin等，J.Exp.Med.15620，1982；Nardin等，Ann.Rev.Immunol.11687，1993])。優(yōu)選地，本發(fā)明的免疫組合物包括至少一種B細(xì)胞表位和至少一種T細(xì)胞表位。B細(xì)胞表位優(yōu)選激發(fā)特異性識(shí)別并且結(jié)合瘧疾環(huán)子孢子(CS)蛋白質(zhì)的抗體的產(chǎn)生?；蛘呋蛄硗?，本發(fā)明的組合物可以包括來(lái)自其他瘧疾成分或者與其他瘧疾成分反應(yīng)的B細(xì)胞和/或T細(xì)胞表位，例如，P.vivax紅細(xì)胞分泌蛋白-1或-2(PvESP-1或PvESP-2)(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利No.5,874,527)，P.falciparum子孢子表面蛋白，指定為凝血酶致敏蛋白相關(guān)附著(Anonymous)蛋白(TRAP)，也稱作子孢子表面蛋白2(SSP2)，LSAI，hsp70，SALSA，STARP，Hep17，MSA，RAP-1，和RAP-2。在一個(gè)實(shí)施方案中，B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位成分摻入導(dǎo)多抗原肽(MAPs)中，形成包含高密度表位的合成的大分子多肽。MAP合成的方法是本領(lǐng)域公知的(參見(jiàn)，例如，Tam，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，855409，1988；Tam，Meth.Enzymol.，1687，1989)。
本發(fā)明還涉及從其他瘧原蟲物種產(chǎn)生的B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位，包括但不限于，三日瘧原蟲(P.Malariae)，蛋形瘧原蟲(P.Ovale)，賴氏(P.Reichenowi)，諾氏瘧原蟲(P.knowlesi)，巴斯食蟹猴瘧原蟲(P.cynomolgi)，巴西瘧原蟲(P.brasilianum)，約氏瘧原蟲，伯氏瘧原蟲(P.berghei)，或夏氏瘧原蟲(P.Chabaudi)。這些表位一般包括從瘧原蟲蛋白質(zhì)衍生的包括8-18個(gè)氨基酸殘基。
在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明優(yōu)選的抗原是HIV特異性的(例如p18蛋白質(zhì)的T細(xì)胞表位RGPGRAFVTI[SEQ ID NO5]，參見(jiàn)下面的實(shí)施例2)。根據(jù)本文公開的，含有這樣的HIV-特異性抗原和包括式1的糖基神經(jīng)酰胺優(yōu)選α-GalCer的佐劑的藥物組合物能增強(qiáng)易感哺乳動(dòng)物宿主對(duì)HIV抗原的T細(xì)胞應(yīng)答。
在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗原是流感A病毒-特異性的。根據(jù)這里公開的，共同施用α-GalCer和最適度以下劑量的(105p.f.u.)表達(dá)流感A病毒的核蛋白(NP)的CD8+T細(xì)胞表位TYQRTRALV(SEQ ID NO16)的重組新培斯病毒顯著增強(qiáng)易感哺乳動(dòng)物宿主的CD8+T細(xì)胞抗-流感應(yīng)答。
為了提供在本發(fā)明的組合物中使用的另外的抗原-衍生的B和T細(xì)胞表位，通過(guò)本領(lǐng)域公知的幾種方法中的一種或者組合可以鑒定這些表位，例如，通過(guò)(i)使用蛋白水解酶將感興趣的抗原水解為重疊的肽，接著測(cè)定各種肽與全長(zhǎng)抗原激發(fā)的抗體結(jié)合的能力或者誘導(dǎo)T細(xì)胞或B細(xì)胞激活的能力(參見(jiàn)，例如，Janis Kuby，Immunology，pp.79-80，W.H.Freeman，1992)；(ii)制備合成的肽，其序列是給定抗原的片段或類似物(參見(jiàn)，例如，Alexander等，1994，Immunity，1751-61；Hammer等，1994，J.Exp.Med.，18023538)，或者易這些片段為基礎(chǔ)的構(gòu)建體，或者與載體或異源抗原連接或融合的類似物，并且測(cè)定這樣的合成的肽激發(fā)抗原-特異性抗體或T細(xì)胞激活的能力(例如，測(cè)定它們體外和體內(nèi)與II類MHC分子相互作用的能力[參見(jiàn)，例如，O′Sullivan等，1991，J.Immunol.，1472663-9；Hill等，1991，J.Immunol.，147189-197])；為了測(cè)定T細(xì)胞表位，肽應(yīng)該至少8-10個(gè)氨基酸長(zhǎng)，占據(jù)I類MHC分子的凹槽，和至少13-25個(gè)氨基酸長(zhǎng)，占據(jù)II類MHC分子的凹槽，優(yōu)選地，肽應(yīng)該更長(zhǎng)；這些肽應(yīng)該還包含合適的固定基序，能使得它們與產(chǎn)生免疫應(yīng)答的足夠高的親和性和特異性結(jié)合各種I類或II類MHC分子(參見(jiàn)Bocchia等，Blood852680-2684，1995；Englehard，Ann.Rev.Immunol.12181，1994)；(iii)對(duì)與純MHC分子結(jié)合的肽測(cè)序(參見(jiàn)，例如，Nelson等，1997，PNAS，94628-33)；(iv)對(duì)肽展示文庫(kù)篩選與II類MHC分子結(jié)合的高親和性，TCR，抗全長(zhǎng)抗原的抗體，等(參見(jiàn)，例如，Hammer等，1992，J.Exp.Med.，1761007-13)；(v)計(jì)算機(jī)分析不同的蛋白質(zhì)序列，鑒定，例如，親水性的一段(親水性氨基酸殘基經(jīng)常位于蛋白質(zhì)的表面，因此易接近抗體)和/或高親和性TCR或II類MHC等位基因-特異性基元，例如，通過(guò)比較感興趣的蛋白質(zhì)的序列和公開的與MHC分子結(jié)合的肽的結(jié)構(gòu)(Mallios，Bioinformatics，15432-439，1999；Milik等，Nat.Biotechnol.，16753-756，1998；Brusic等，Nuc.Acids Res，26368-371，1998；Feller和de 1a Cruz，Nature，349720-721，1991)；(vi)對(duì)天然抗原-抗體復(fù)合體進(jìn)行X-射線結(jié)晶學(xué)分析(Janis Kuby，Immunology，p.80，W.H.Freeman，1992)，和(vii)對(duì)感興趣的抗原的不同部分制備單克隆抗體，然后確定那些抗體體外或體內(nèi)是否減弱從中得到抗原的病原體或腫瘤的生長(zhǎng)(參見(jiàn)美國(guó)專利No.5,019,384和這里引述的文獻(xiàn))。
在具體的實(shí)施方案中，表達(dá)所述抗原的重組病毒可以呈遞本發(fā)明的抗原。優(yōu)選地，所述病毒選自重組腺病毒，重組痘病毒，和重組新培斯病毒。
在公開的組合物中，抗原和糖基神經(jīng)酰胺都以免疫原有效量存在。對(duì)于各種特異抗原，應(yīng)該試驗(yàn)測(cè)定最佳免疫原有效量(考慮到給定患者的具體特征和/或治療類型)。一般情況下，這種量在每公斤體重0.1微克至100毫克抗原的范圍內(nèi)。對(duì)于本發(fā)明的糖基神經(jīng)酰胺佐劑，最佳免疫原有效量?jī)?yōu)選在每公斤體重10-100微克佐劑的范圍內(nèi)。
本發(fā)明還提供了含有至少一種抗原和包括式1的糖基神經(jīng)酰胺優(yōu)選α-GalCer的佐劑的疫苗組合物的制備方法，優(yōu)選地，所述方法包括混合佐劑和抗原，和任選地一種或幾種生理可接受載體和/或賦形劑和/或輔助物質(zhì)。
配方和給藥本發(fā)明提供了含有本發(fā)明的治療物質(zhì)的藥物和疫苗配方(抗原和糖基神經(jīng)酰胺佐劑或者是單一組合物或者作為兩個(gè)分開的組合物，它們可以同時(shí)施用或順序施用)，該配方適合給藥以激發(fā)抗原-特異性保護(hù)性免疫應(yīng)答，用于治療和預(yù)防上述傳染或腫瘤病。以任何常規(guī)方法使用一種或幾種生理可接受載體或賦形劑能配制本發(fā)明的組合物。這樣，可以將抗原和/或含有式1的糖基神經(jīng)酰胺優(yōu)選α-GalCer的佐劑配制，以通過(guò)經(jīng)皮送遞，或者經(jīng)粘膜施用，包括但不限于，口服，口，鼻內(nèi)，眼，陰道，直腸，腦內(nèi)，皮內(nèi)肌內(nèi)，腹膜內(nèi)，靜脈內(nèi)，皮下途徑，通過(guò)劃痕(通過(guò)皮膚上層劃痕，例如，使用分叉針頭)，通過(guò)吸入(肺)或者吹入法(通過(guò)口或鼻)，或者通過(guò)施給來(lái)自體內(nèi)的細(xì)胞呈遞抗原，接著將細(xì)胞施給受試者，或者通過(guò)任何免疫的標(biāo)準(zhǔn)途徑。
優(yōu)選地，本發(fā)明的免疫原配方能腸胃外送遞，即，通過(guò)靜脈內(nèi)(i.v.)，皮下(s.c.)，腹膜內(nèi)(i.p.)，肌內(nèi)(i.m.)，皮下(s.d.)，或者皮內(nèi)(i.d.)給藥，通過(guò)直接注射，通過(guò)，例如，大丸劑注射，連續(xù)輸注，或者基因槍(例如，對(duì)受試者施用載體疫苗，例如裸DNA或RNA)。用于注射的配方可以以單一劑量形式存在，例如，在安瓿或多劑量容器中，有加入的防腐劑。組合物可以采用賦形劑，混懸劑，溶液或在油性賦形劑或含水賦形劑的乳狀液這樣的形式，并且可以含有配制試劑，例如懸浮劑，穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘?，活性成分可以是在使用之前用合適的賦形劑例如無(wú)菌無(wú)熱源水重新兌制的粉末劑形式。
本發(fā)明還涉及各種粘膜接種策略。局部送遞疫苗可以定向于粘膜，可以應(yīng)用各種策略將免疫原組合物送遞給粘膜。例如，在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，可以在和與霍亂毒素例如霍亂毒素B或霍亂毒素A/B嵌合物的結(jié)合物或嵌合融合蛋白的混合物或者作為與霍亂毒素例如霍亂毒素B或霍亂毒素A/B嵌合物的結(jié)合物或嵌合融合蛋白施用免疫原性多肽或載體疫苗(參見(jiàn)，例如，Hajishengallis，J Immunol.，1544322-32，1995；Jobling和Holmes，Infect Immun.，604915-24，1992；Lebens和Holmgren，Dev Biol Stand 82215-27，1994)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于粘膜接種可以制備與熱不穩(wěn)定腸毒素(LT)的混合物。其他粘膜接種策略包括將免疫原制成微膠囊(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利Nos.5,075,109；5,820,883,和5,853,763)并且使用免疫有效膜載體(參見(jiàn)，例如，PCT申請(qǐng)No.WO 98/0558)。通過(guò)使用紅細(xì)胞(rbc)或rbc空細(xì)胞(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利No.5,643,577)，或者通過(guò)使用藍(lán)舌病毒抗原(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利No.5,690,938)能增強(qiáng)口服施用的免疫原的免疫原性。全身施用定向的免疫原也能產(chǎn)生粘膜免疫(參見(jiàn)，美國(guó)專利No.5,518,725)。也可以應(yīng)用各種策略送遞基因用于在粘膜組織中表達(dá)，例如使用嵌合鼻病毒(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利No.5,714,374)，腺病毒，牛痘病毒，或者特異定向核酸(參見(jiàn)，例如，PCT申請(qǐng)No.WO 97/05267)。
對(duì)于口服給藥，本發(fā)明的制劑可以是例如通過(guò)常規(guī)方法使用藥學(xué)可接受賦形劑制備的片劑或膠囊，所述賦形劑是例如粘合劑(例如，預(yù)先明膠化的玉米淀粉，聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；填料(例如，乳糖，微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤(rùn)滑劑(例如，硬脂酸鎂，滑石或二氧化硅)；崩解劑(例如，馬鈴薯淀粉或淀粉羥乙酸鈉)；或濕潤(rùn)劑(例如，月桂基硫酸鈉)。通過(guò)本領(lǐng)域公知的技術(shù)可以將片劑包衣。本發(fā)明的組合物還可以裝入微球中或?yàn)槟z囊中，例如，用聚乙醇酸/乳酸制備(PGLA)(參見(jiàn)，美國(guó)專利Nos.5,814,344；5,100,669和4,849,222；PCT公開Nos.WO95/11010和WO93/07861)。用于口服的液體制劑可以是例如溶液，糖漿，乳狀液或混懸液形式，或者它們可以制備成在使用之前用水或其他合適的賦形劑重新兌制的干燥產(chǎn)品。通過(guò)常規(guī)方法使用藥學(xué)可接受添加劑能制備這樣的液體制劑，所述添加劑是例如懸浮劑(例如，山梨糖醇漿，纖維素衍生物或氫化可食用脂肪)；乳化劑(例如，卵磷脂或阿拉伯膠)；沒(méi)有水的賦形劑(例如，杏仁油，油酯，乙醇或分級(jí)分離的植物油)；和防腐劑(例如羥基苯甲酸或山梨酸甲酯或丙酯)。如果合適，制劑還可以含有緩沖鹽，矯味劑，著色劑和甜味劑?？梢詫⒂糜诳诜闹苿┖线m地配制成控制釋放的活性化合物制劑。
對(duì)于吸入給藥，根據(jù)本發(fā)明的治療物質(zhì)能方便地以氣溶膠噴霧形式從加壓包裝或噴霧器送遞，使用合適的拋射劑，例如，二氯二氟甲烷，三氯氟代甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或者其他合適的氣體。在加壓氣霧劑情況下，通過(guò)提供一個(gè)閥門送出計(jì)量的量來(lái)確定單位劑量。
可以配制含有化合物和合適的粉末基質(zhì)例如乳糖或淀粉的粉末混合物的在吸入器或吹入器中使用的例如明膠的膠囊或藥筒。
本發(fā)明的組合物還可以配制成直腸組合物，例如栓劑或滯留灌腸劑，例如，含有常規(guī)栓劑基質(zhì)，例如椰子油或其他甘油酯。
除了前面描述的制劑之外，組合物還可以配制成貯存制劑。這樣的長(zhǎng)時(shí)作用的制劑可以通過(guò)植入法給藥(例如，皮下或肌內(nèi))或者通過(guò)肌內(nèi)注射。這樣，例如，用合適的聚合物或疏水性材料(例如，作為可接受油中的乳狀液)或離子交換樹脂，或者作為少量可溶衍生物，例如，作為少量可溶性鹽，能配制所述化合物。
如這里公開的，抗原和/或糖基神經(jīng)酰胺佐劑可以與藥學(xué)可接受的并且與活性成分相匹配的賦形劑混合。合適的賦形劑是，例如，水，鹽水，緩沖鹽，葡萄糖，甘油，乙醇，無(wú)菌等張含水緩沖液或類似的，和它們的混合物。另外，如果期望，制劑還可以包括少量的輔助物質(zhì)，例如濕潤(rùn)劑或乳化劑，pH緩沖劑，和/或免疫刺激物(例如，除了糖基神經(jīng)酰胺的佐劑)，其增強(qiáng)藥物組合物或疫苗的效力。可以增強(qiáng)本發(fā)明的組合物的效力的另外的免疫刺激物的非限制性例子包括免疫刺激，免疫加強(qiáng)，或炎性細(xì)胞因子原淋巴因子，或趨化因子或編碼它們的核酸(具體的例子包括白細(xì)胞介素(IL)-1，IL-2，IL-3，IL-4，L-12，IL-13，巨細(xì)胞-巨噬細(xì)胞(GM)-集落刺激因子(CSF)和其他集落刺激因子，巨噬細(xì)胞炎性因子，F(xiàn)lt3配體，參見(jiàn)“定義”章節(jié)中免疫刺激細(xì)胞因子的一般例子。這些傳統(tǒng)的免疫刺激分子能作為蛋白質(zhì)全身或局部送遞或者通過(guò)編碼分子的表達(dá)的載體的表達(dá)。上面描述的用于送遞抗原和糖基神經(jīng)酰胺的技術(shù)也可以用于送遞傳統(tǒng)的免疫刺激分子。
本發(fā)明還提供了包括一個(gè)或多個(gè)容器的包裝或試劑盒，容器中裝有一種或幾種本發(fā)明的免疫原配方的成分。在相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于制備包括至少一種抗原和含有糖基神經(jīng)酰胺的佐劑的藥物或疫苗組合物的試劑盒(kit)，所述試劑盒第一個(gè)容器中裝有抗原，第二個(gè)容器中裝有佐劑，和任選地，混合抗原和佐劑的說(shuō)明和/或施用組合物的說(shuō)明。試劑盒的每一個(gè)容器還可以任選地包括一種或幾種生理可接受載體和/或賦形劑和/或輔助物質(zhì)。和這樣的容器一起可以有政府機(jī)關(guān)調(diào)節(jié)操作的規(guī)定形式的說(shuō)明，藥物或生物制品的使用或出售說(shuō)明，這些說(shuō)明反映機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)對(duì)人制造，使用或出售。
如果期望，組合物可以存在于包裝或配藥裝置中，包裝或配藥裝置可以包含裝有活性成分的一個(gè)或多個(gè)單位劑量形式(即，抗原和/或含有糖基神經(jīng)酰胺的佐劑)。包裝可以，例如，包括金屬或塑料箔，例如發(fā)泡包裝。包裝或配藥裝置可以帶有給藥說(shuō)明。在相匹配藥物載體中配制的本發(fā)明的組合物也可以在合適的容器中制備，放置，并且標(biāo)明治療指定的癥狀。
有效劑量和安全性評(píng)根據(jù)本發(fā)明的方法，以免疫原有效量，優(yōu)選地，最小毒性，對(duì)患者施用這里描述的藥物和疫苗組合物。如在標(biāo)題是“定義”的章節(jié)中陳述的，公開的配方的″免疫原有效劑量″或″治療有效劑量″指足以使受治療的受試者產(chǎn)生有效免疫應(yīng)答因此足以對(duì)所述受試者帶來(lái)健康利益的抗原和/或糖基神經(jīng)酰胺的量。
根據(jù)本領(lǐng)域已經(jīng)確定的方法(參見(jiàn)，例如，the Center forBiological Evaluation和Food and Drug Administration和theNational Institute of Allergy and Infectious Diseases之間的合作努力對(duì)含有新的佐劑的幾種疫苗配方的評(píng)價(jià)報(bào)告[Goldenthal等，National Cooperative Vaccine Development Working Group.AIDS Res.Hum.Retroviruses，1993，9545-9])，利用小動(dòng)物模型(例如小鼠)臨床前研究第一次測(cè)定了本發(fā)明的化合物和組合物的有效劑量和毒性，其中發(fā)現(xiàn)抗原和含有糖基神經(jīng)酰胺的佐劑是免疫原性的并且通過(guò)對(duì)人臨床試驗(yàn)提出的相同的途徑能重復(fù)免疫。具體地說(shuō)，對(duì)于本發(fā)明的方法中使用的任何藥物組合物或疫苗，最初從動(dòng)物模型能估計(jì)實(shí)現(xiàn)循環(huán)血漿濃度范圍的治療有效劑量，包括IC50(即，實(shí)現(xiàn)癥狀的半最大抑制作用的試驗(yàn)化合物的濃度)。然后使用動(dòng)物系統(tǒng)產(chǎn)生的劑量-應(yīng)答曲線測(cè)定對(duì)人的最初臨床試驗(yàn)的試驗(yàn)劑量。在對(duì)各種組合物的安全性測(cè)定中，免疫的劑量和次數(shù)應(yīng)該符合或超過(guò)臨床試驗(yàn)中使用所預(yù)期的那些。
如這里公開的，確定本發(fā)明的組合物中糖基神經(jīng)酰胺，抗原和其他成分的劑量，以保證連續(xù)或間斷施用的劑量不超過(guò)考慮實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的結(jié)果和患者各自狀況的一定量。根據(jù)配藥規(guī)程，患者或受試動(dòng)物狀況，例如年齡，體重，性別，敏感性，進(jìn)食，用藥時(shí)間，聯(lián)合使用的藥物，疾病的嚴(yán)重程度，具體劑量自然不同。根據(jù)上述指征通過(guò)試驗(yàn)?zāi)艽_定一定條件下的合適的劑量和給藥時(shí)間，并且應(yīng)該根據(jù)醫(yī)師和各個(gè)患者環(huán)境根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)的判斷來(lái)決定。與此相關(guān)，抗原的劑量一般在每千克體重0.1微克至100毫克范圍內(nèi)，增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答需要的糖基神經(jīng)酰胺佐劑的劑量一般在每千克體重10-100微克范圍內(nèi)。
通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)程序能確定本發(fā)明的含有糖基神經(jīng)酰胺的免疫原組合物的毒性和治療功效，例如通過(guò)測(cè)定LD50(50％致死劑量)和ED50(50％治療有效的劑量)。毒性和治療作用之間的劑量之比是治療指數(shù)，并且可以表示為L(zhǎng)D50/ED50。優(yōu)選具有大的治療指數(shù)的組合物。雖然能使用具有毒副作用的治療物質(zhì)(例如，當(dāng)治療嚴(yán)重的癌癥或威脅生命的傳染)，但是為了將對(duì)其他組織和器官的可能的損傷最小化，應(yīng)該小心設(shè)計(jì)送遞系統(tǒng)，將這樣的免疫原組合物定向送給特定位點(diǎn)(例如，介導(dǎo)免疫應(yīng)答的淋巴樣組織，支持傳染物質(zhì)復(fù)制的腫瘤或器官)，從而減小副作用。如這里公開的(也可以參見(jiàn)背景部分和實(shí)施例)，本發(fā)明的糖基神經(jīng)酰胺不只是在相對(duì)低劑量(例如，每千克體重10-100微克佐劑)下有高免疫刺激性，而且還具有低毒性并且產(chǎn)生顯著的副作用。
如上面具體說(shuō)明的，在配制對(duì)人使用的劑量范圍中能使用從動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)。對(duì)人使用的本發(fā)明的含有糖基神經(jīng)酰胺的治療有效劑量?jī)?yōu)選在包括極小或沒(méi)有毒性的ED50的循環(huán)濃度的范圍內(nèi)。根據(jù)使用的劑量形式和使用的給藥途徑，劑量可以在這個(gè)范圍內(nèi)變化。理想地，應(yīng)該使用單一劑量。
實(shí)施例下面的實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明而不限制其范圍。
實(shí)施例1天然殺傷T細(xì)胞α-半乳糖基神經(jīng)酰胺增強(qiáng)瘧疾疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫性并且延長(zhǎng)其時(shí)間方法寄生物和它們用于免疫和攻擊的用途根據(jù)描述(Rodrigues等，Int.Immunol.，3579-585，1991；Gonzalez-Aseguinolaza等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，978461-8466，2000)，通過(guò)解剖蚊子唾液腺而獲得約氏瘧原蟲(17X NL株)子孢子。對(duì)于免疫，通過(guò)將它們暴露于12,000rad而將子孢子照射-減弱，然后靜脈內(nèi)注射給小鼠的尾靜脈或者皮下注射給小鼠的尾根。使用1×104和1×105γ-spz免疫小鼠分別用于保護(hù)試驗(yàn)和ELISPOT試驗(yàn)。通過(guò)顯微鏡觀察吉姆薩氏染色的薄血液涂片確定寄生物血癥，薄血液涂片在子孢子接種之后第3天至第14天每天獲得。完全保護(hù)定義為在整個(gè)時(shí)期內(nèi)沒(méi)有寄生物血癥。
用重組病毒免疫使用最適度以下劑量(1×107p.f.u.)的表達(dá)全約氏瘧原蟲CS蛋白質(zhì)，AdPyCS的重組腺病毒(Rodrigues等，J.Immunol.，1581268-1274，1997)免疫小鼠。根據(jù)描述(Tsuji等，J.Virol.，726907-6910，1998；Villacres等，Virology，27054-64，2000)構(gòu)建表達(dá)約氏瘧原蟲CS蛋白質(zhì)，SIN(Mal)，的CD8+T細(xì)胞表位(SYVPSAEQI[SEQ ID NO2])的重組新培斯病毒，和表達(dá)HIV p18蛋白質(zhì)，SIN(p18)，的CD8+T細(xì)胞表位(RGPGRAFVTI[SEQ ID NO5])的重組新培斯病毒，并且皮下接種作為最適度以下劑量的1×105p.f.u.的病毒。
小鼠.
從Jackson Laboratory(BarHarbor，ME)購(gòu)得BALB/c和B10.D2小鼠，并且保持在Animal Facility標(biāo)準(zhǔn)條件下。通過(guò)應(yīng)用同源重組和聚集嵌合體技術(shù)特異性缺失Jα281基因片段構(gòu)建Vα14NKT-缺陷小鼠(Jα281-1-)(Cui等，Science，2781623-1626，1997；Gonzalez-Aseguinolaza等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，978461-8466，2000)，并且在與BALB/c小鼠3-4次回交之后使用。從129源的胚胎肝細(xì)胞產(chǎn)生CD1d-缺陷小鼠(CD1d-1-)，并且在與BALB/c小鼠7-8次回交之后使用(Mendiratta等，Immunity，6469477，1997；Gonzalez-Aseguinolaza等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，978461-8466，2000)。從Swiss Institute for ExperimentalCancer Research(Epalinges，瑞士)獲得IFN-γ受體-缺陷小鼠(IFN-γR-1-)，在與B10.D2小鼠3次回交之后使用(Rodrigues等，Parasite Immunol.，22157-160，2000)。在6-8周使用兩種性別的小鼠。
α-GalCer.
應(yīng)用公開的方法(Morita等，J.Med.Chem.，382176-2187，1995；Teriyuki等，J.Med.Chem.，421836-1841，1999)由Kirin Brewery(Gunma，日本)合成α-GalCer，[(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖苷)-2-(N-二十六酰氨基)-1，3，4，-十八烷三醇]。起始產(chǎn)物溶解于0.5％聚山梨酯-20(Nikko Chemical，東京)的0.9％NaCl溶液并且在使用之前用PBS稀釋。
肽免疫和α-GalCer處理用相應(yīng)于約氏瘧原蟲CS蛋白質(zhì)的CD4+T細(xì)胞表位(YNRNIVNRLLGDALNGKPEEK[SEQ ID NO1])的肽(Renia等，J.Immunol.，22157-160，1993)或者CD8+T細(xì)胞表位(SYVPSAEQI[SEQID NO2])的肽(Rodrigues等，Int.Immunol.，3579-585，1991)免疫小鼠。代表CS蛋白質(zhì)的CD8+表位的肽在弗氏不完全佐劑(IFA)中乳化，而包含CS-特異性CD4+表位的肽在弗氏完全佐劑(CFA)中乳化。用10mg肽對(duì)小鼠皮下接種。用α-GalCer對(duì)-些免疫的小鼠腹膜內(nèi)注射，其他小鼠單獨(dú)注射賦形劑作為對(duì)照。施用的劑量和時(shí)間在下文中指出。
通過(guò)ELISPOT試驗(yàn)定量測(cè)定表位-特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞進(jìn)行ELISPOT試驗(yàn)測(cè)定產(chǎn)生IFN-γ或IL-4的CS-特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞的數(shù)目(Miyahira等，J.Immunol.Methods，18145-54，1995)。簡(jiǎn)要地說(shuō)，用抗小鼠IFN-γ單克隆抗體(mAb)，或抗小鼠IL-4mAb包被96孔硝基纖維素板(Millipore，Bedford，MA)。室溫下溫育過(guò)夜之后，反復(fù)沖洗孔并且在37℃下用培養(yǎng)基封閉1小時(shí)。MHC-相容靶細(xì)胞，表達(dá)I和II類MHC H-2d分子的A20.2J B細(xì)胞淋巴瘤在37℃下與代表約氏瘧原蟲CS蛋白質(zhì)的CD4+T細(xì)胞表位(YNRNIVNRLLGDALNGKPEEK[SEQ ID NO1])或CD8+T細(xì)胞表位(SYVPSAEQI[SEQ ID NO2])，或者HIV p18蛋白質(zhì)的CD8+T細(xì)胞表位(RGPGRAFVTI[SEQ ID NO5])的合成肽溫育1小時(shí)。照射肽攻擊的靶細(xì)胞之后，將細(xì)胞加給ELISPOT孔。沒(méi)有處理的靶細(xì)胞用作副對(duì)照物。使從免疫小鼠的脾或淋巴結(jié)分離的系列稀釋的淋巴細(xì)胞在ELISPOT孔中與1.5×105個(gè)靶細(xì)胞共同培養(yǎng)。將板在37℃和5％CO2溫育24小時(shí)之后用于IFN-γ檢測(cè)或者溫育48小時(shí)之后用于IL-4檢測(cè)，如先前所述處理板(Rodrigues等，J.Immunol.，1581268-1274，1997)，并且測(cè)定相應(yīng)于IFN-γ和IL-4分泌細(xì)胞的點(diǎn)的數(shù)目。
通過(guò)實(shí)時(shí)PCR定量測(cè)定接種子孢子小鼠的肝中約氏瘧原蟲rRNA根據(jù)描述(Bruna-Romero等，Int.J.Parasitol.311499-1502，2001)進(jìn)行約氏瘧原蟲rRNA的定量測(cè)定。簡(jiǎn)要地說(shuō)，通過(guò)Chomczynski和Sacchi的方法(Chomczynski和Sacchi，Anal.Biochem.，162156-159，1987)，從注射1×104約氏瘧原蟲子孢子42小時(shí)之后解剖的小鼠肝中分離全部RNA。提取的RNA的逆轉(zhuǎn)錄之后，產(chǎn)生cDNA并且通過(guò)即時(shí)PCR，使用ABI Prism 5700 Sequence Detection system(PE Biosystems，F(xiàn)oster City，CA；Bruna-Romero等，Int.J.Parasitol.，311499-1502，2001)分析它的量。利用約氏瘧原蟲(17XNL)18S rRNA序列(Bruna-Romero等Int.J.Parasitol.，311499-1502，2001)，應(yīng)用ABI Prism primer Express軟件(PEBiosystems，F(xiàn)oster City，CA)，常規(guī)設(shè)計(jì)具有下面序列的引物和熒光探針。從Operon Technologies Inc.(Alameda，CA)獲得引物，5′-GGGGATTGGT TTTGACGTTTTTGCG-3′(正引物；SEQ ID NO17)，和5′-AAGCATTAAATAAAG CGAATACATCCTTAT-3′(逆引物；SEQ ID NO18)。從PE Applied biosystems(Foster City，CA)獲得特異熒光探針，PyNYU，5′-FAM-CAATTGGTTTACCTTTTGCTCTTT-TAMRA-3′(SEQID NO19)，并且使用5-丙炔-2′-去氧尿苷(turbo Taqman探針)產(chǎn)生，實(shí)現(xiàn)合適的Tm。反應(yīng)混合物含有5微升的10x Taqman緩沖液A(PEBiosystems，F(xiàn)oster City，CA)，3.5mMMgCl2，200μM dNTP，0.3μM正引物，0.3μM逆引物，50nM turbo Taqman探針PyNYU，1.25UAmpliTaq Gold DNA聚合酶，和最多50微升最終反應(yīng)體積的水。溫度曲線包括95℃10分鐘和95℃變性15秒和60℃淬火/延伸1分鐘35個(gè)循環(huán)。在用0.5mg/ml溴化乙錠染色的2％瓊脂糖-1×TAE(50mMTris-乙酸鹽，pH8.0，1mM EDTA)凝膠中觀察PCR產(chǎn)物。使用Gel Doc2000凝膠文件編輯系統(tǒng)(BioRad，Hercules，CA)獲得凝膠的數(shù)字成象，并且使用Quantity One software(BioRad，Hercules，CA)通過(guò)顯微測(cè)密術(shù)分析。利用從兩個(gè)肝樣品和從用已知量的質(zhì)粒18ScDNA產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得的CT值進(jìn)行線性回歸分析測(cè)定在該項(xiàng)分析中檢測(cè)的寄生物產(chǎn)生的18ScDNA分子的精確量。
通過(guò)ELISPOT分析定量測(cè)定α-GalCer-特異性細(xì)胞利用ELISPOT分析測(cè)定產(chǎn)生α-GalCer-特異性淋巴細(xì)胞的IFN-γ和/或IL-4的相對(duì)數(shù)目。根據(jù)描述(Rodrigues等，J.Immunol.，1581268-1274，1997)從野生型和IFN-γR-缺陷小鼠的肝分離淋巴細(xì)胞。以107細(xì)胞/毫升的細(xì)胞密度與100ng/ml的α-GalCer或賦形劑溫育12小時(shí)之后，將從每孔1×106個(gè)細(xì)胞開始系列稀釋的淋巴細(xì)胞放置于用相應(yīng)的抗-細(xì)胞因子抗體包被的ELISPOT孔中。在37℃和5％CO2下將板溫育24小時(shí)之后，根據(jù)描述(Rodrigues等，J.Immunol.，1581268-1274，1997)進(jìn)行平板培養(yǎng)。
使用CDI d/α-GalCer四聚體進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析根據(jù)描述(Matsuda等，J.Exp.Med.，192741-754，2000)，使用由CDI d分子和α-GalCer組成的CDI d/α-GalCer四聚體復(fù)合體鑒定α-GalCer-特異性淋巴細(xì)胞。新鮮分離的肝淋巴細(xì)胞首先與藻紅蛋白(PE)-標(biāo)記的四聚體復(fù)合體溫育，接著與FITC-標(biāo)記的抗-CD3單克隆抗體第二次溫育。然后通過(guò)FACScalibur儀器(BectonDickinson，San Jose，CA)使用CELLQUEST軟件(Becton Dickinson)分析細(xì)胞。
間接免疫熒光分析(IFA).
僅在用子孢子攻擊之前獲得免疫小鼠的血清，在間接免疫熒光分析(IFA)中使用約氏瘧原蟲子孢子測(cè)定它們的Ab滴度。簡(jiǎn)要地說(shuō)，約氏瘧原蟲子孢子放在多點(diǎn)樣載玻片上，空氣風(fēng)干。與血清溫育1小時(shí)之后，在含有1％BSA的PBS中稀釋，用PBS沖洗載玻片，并且與FITC-標(biāo)記的親和性純化的山羊抗-小鼠Ab(Kirkegaard & PerryLaboratories，Gaithersburg，MD)溫育1小時(shí)。然后沖洗載玻片并且固定在含有50％(v/v)甘油和1％(w/v)伊凡斯藍(lán)的PBS中減少漂白。認(rèn)為產(chǎn)生子孢子熒光的最高血清稀釋度被認(rèn)為是IFA滴度。
通過(guò)ELISA測(cè)定同種型水平在用子孢子對(duì)它們攻擊之前獲得免疫小鼠的血清，并且使用Mouse Hybridoma Subtyping試劑盒(Boehringer Mannheim，Mannheim，德國(guó))測(cè)定CS-特異性IgM，IgG1，IgG2a，和IgE同種型的水平。簡(jiǎn)要地說(shuō)，用10mg/ml的約氏瘧原蟲CS蛋白質(zhì)的B細(xì)胞表位(QGPGAP)2(Charoenvit等，J.Immunol.，1461020-1025，1991)包被平板，用含有1％BSA的PBS封閉，并且與來(lái)自免疫的和沒(méi)有免疫的小鼠的血清的1∶5稀釋物溫育1小時(shí)。然后沖洗板并且加入與過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗-小鼠IgM，IgGla，IgG2a(Boehringer Mannheim)和IgE(Southern Biotechnology Associates，Inc.，Birmingham，AL)，接著根據(jù)供應(yīng)商的說(shuō)明與底物2，2-吖嗪-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸鹽(6)]溫育。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析對(duì)所有的比較使用學(xué)生試驗(yàn)。只有P值低于0.01才認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)以平均±SD給出。
結(jié)論α-GalCer增強(qiáng)保護(hù)性抗-瘧疾免疫性為了評(píng)價(jià)α-GalCer增強(qiáng)通過(guò)最適度以下劑量照射的子孢子免疫誘導(dǎo)的保護(hù)性抗-瘧疾免疫應(yīng)答的能力，用最適度以下劑量(1×104)照射的子孢子(γ-spz)和不同劑量的γ-GalCer(0.5，1.2微克)對(duì)BALB/c小鼠靜脈內(nèi)免疫接種。兩個(gè)星期之后，用1×1041活約氏瘧原蟲子孢子攻擊不同組的小鼠，通過(guò)應(yīng)用高靈敏性即時(shí)PCR分析(Bruna Romero等，Int.J.Parasitol.311499 1502，2001)通過(guò)測(cè)定肝中寄生物-特異性rRNA的量來(lái)測(cè)定保護(hù)性抗-瘧疾免疫性的水平。施用α-GalCer以劑量依賴方式顯著增強(qiáng)γ-spz免疫激發(fā)的保護(hù)性免疫性的水平(肝發(fā)育階段抑制作用百分比％)(圖1A)。事實(shí)上，與單獨(dú)用γ-spz免疫的小鼠的肝中的相比，施用2微克α-GalCer的γ-spz免疫的小鼠的肝中負(fù)載的寄生物少10倍。
本發(fā)明人還使用風(fēng)干的約氏瘧原蟲子孢子的免疫熒光分析(IFA)測(cè)定了抗-子孢子抗體的滴度，以及抗環(huán)子孢子(CS)蛋白質(zhì)的滴度，使用ELISA測(cè)定了子孢子的主要表面抗原。不管是否接受了α-GalCer，γ-spz免疫的小鼠組之間抗體滴度相同(圖1A)。當(dāng)測(cè)定抗-CS抗體的免疫球蛋白同種型時(shí)，在α-GalCer處理的和沒(méi)有處理的小鼠之間沒(méi)有檢測(cè)到抗-CS抗體IgE，IgG1，IgG2a或IgM同種型分布的顯著差異。這些結(jié)果標(biāo)明抗-瘧疾體液應(yīng)答不受α-GalCer處理的影響。
然后通過(guò)在用1×104γ-spz靜脈內(nèi)接種的同一天，之前兩天或者之后兩天對(duì)BALB/c小鼠施用2微克的糖脂來(lái)檢測(cè)α-GalCer展示的佐劑活性的動(dòng)力學(xué)。當(dāng)和γ-spz同一天施用α-GalCer時(shí)，激發(fā)最大水平的保護(hù)性抗-瘧疾免疫性(圖1B)。γ-spz免疫之后兩天施用α-GalCer不顯著增強(qiáng)單獨(dú)子孢子誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫性的水平。令人感興趣的是，當(dāng)在γ-spz免疫之前兩天施用α-GalCer時(shí)，保護(hù)性免疫性完全被取消。早兩天施用α-GalCer可能在它們被抗原呈遞細(xì)胞加工和呈遞之前消除了子孢子是可能的，從而防止誘導(dǎo)瘧疾-特異性免疫應(yīng)答。如本發(fā)明人先前研究所證明的(Gonzalez-Aseguinolaza等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，978461-8466，2000)，在用活子孢子攻擊之前兩天施用α-GalCer以取決于NKT細(xì)胞和IFN-γ的方式從活體中完全消除了寄生物。對(duì)B10.D2小鼠發(fā)現(xiàn)了α-GalCer佐劑活性的類似動(dòng)力學(xué)(圖1B)。
共同施用α-GalCer和瘧疾抗原增強(qiáng)瘧疾-特異性T細(xì)胞應(yīng)答，特別是CD8+T細(xì)胞的那些為了測(cè)定α-GalCer-介導(dǎo)的抗瘧疾的保護(hù)性免疫應(yīng)答的增強(qiáng)是否是與γ-spz免疫相關(guān)的特定現(xiàn)象，或者是不依賴施用的免疫原的更一般的現(xiàn)象，在用最適度以下劑量的表達(dá)全CS蛋白質(zhì)，AdPyCS(Rodrigues等，J.Immunol.，1581268-1274，1997)的重組腺病毒，或者表達(dá)CS蛋白質(zhì)，SIN(Mal)(Tsuji等，J.Virol.726907-6910，1998)的CD8+T細(xì)胞表位的重組新培斯病毒皮下接種的同一天對(duì)BALB/c小鼠施用α-GalCer。如圖1C和1D所示，α-GalCer顯著增強(qiáng)用最適度以下劑量的兩種不同的重組病毒接種誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫應(yīng)答。在AdPyCS情況下，在SIN(Mal)情況下，保護(hù)作用的增強(qiáng)是對(duì)照物的幾乎10倍，與α-GalCer共同施用之后保護(hù)作用增強(qiáng)3倍。
為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)α-GalCer與疫苗共同施用的佐劑活性，通過(guò)血液薄涂片的顯微鏡檢查每天監(jiān)測(cè)寄生物血癥(即，血液中存在寄生物)。簡(jiǎn)要地說(shuō)，用1×104γ-spz靜脈內(nèi)或者用1×107p.f.u.的AdPyCS皮下對(duì)BALB/c小鼠免疫，該劑量另外不能帶來(lái)抗瘧疾的保護(hù)作用，有或沒(méi)有α-GalCer處理。兩個(gè)星期之后，用50活約氏瘧原蟲子孢子攻擊所有的小鼠，并且通過(guò)檢測(cè)寄生物血癥測(cè)定血液感染發(fā)生率。30只α-GalCer處理的，γ-spz免疫的小鼠中有28只受到保護(hù)，而大多數(shù)沒(méi)有用α-GalCer處理的，γ-spz免疫的小鼠發(fā)生瘧疾感染(表I)。類似地，α-GalCer與AdPyCS一起施用強(qiáng)烈增強(qiáng)最適度以下劑量病毒誘導(dǎo)的保護(hù)作用效果。另一方面，單獨(dú)施用α-GalCer沒(méi)有保護(hù)受到攻擊的小鼠?？傊@些結(jié)果確認(rèn)肝階段數(shù)據(jù)(圖1)，并且一起表明施用α-GalCer提高最適度以下免疫劑量的γ-spz和重組病毒的效力，表明出色的佐劑效果。
表I.α-GalCer增強(qiáng)瘧疾免疫原誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫性

*用1×104γ-spz靜脈內(nèi)或者用1×107p.f.u.的AdPyCS皮下對(duì)BALB/c小鼠免疫。
α-GalCer增強(qiáng)各種疫苗激發(fā)的T細(xì)胞應(yīng)答為了測(cè)定共同注射α-GalCer和γ-spz增強(qiáng)瘧疾-特異性T細(xì)胞應(yīng)答的哪種成分(即，CD4+和/或CD8+T細(xì)胞應(yīng)答)，對(duì)用或沒(méi)有用α-GalCer處理的γ-spz免疫小鼠比較這些免疫參數(shù)。對(duì)于這個(gè)目的，或者與賦形劑(0.5％聚山梨酯-20，Nikko Chemical，東京)或α-GalCer一起用1×105γ-spz免疫BALB/c小鼠。2或6周之后，分離脾淋巴細(xì)胞，并且通過(guò)ELISPOT分析測(cè)定CS-特異性，IFN-γ和IL-4-分泌CD8+和CD4+T細(xì)胞的數(shù)目(Rodrigues等，J.Immunol.，1581268-1274，1997)。如圖2A所示，免疫之后兩周，α-GalCer處理顯著增強(qiáng)γ-spz激發(fā)的CS-特異T細(xì)胞應(yīng)答的水平。特別地，與γ-spz單獨(dú)免疫誘導(dǎo)的相比，α-GalCer將IFN-γ-分泌CS-特異CD8+T細(xì)胞的數(shù)目提高了大約7倍(圖2A)。此外，IFN-γ-分泌CS-特異CD4+T細(xì)胞的數(shù)目也顯著增加，雖然程度較小(圖2A)。更重要的，施用α-GalCer不僅提高CS-特異CD8+T細(xì)胞應(yīng)答水平而且還延長(zhǎng)應(yīng)答時(shí)間(圖2A；見(jiàn)下文)。當(dāng)在γ-spz免疫之前兩天或者之后兩天施用α-GalCer時(shí)沒(méi)有觀察到這樣的α-GalCer處理對(duì)T細(xì)胞應(yīng)答強(qiáng)的增強(qiáng)。分泌IL-4的CS-特異CD4+或CD8+T細(xì)胞的數(shù)目沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著差異，表明α-GalCer處理主要增強(qiáng)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)體系周抗原-特異性Th1-型應(yīng)答。因?yàn)閷?duì)BALB/c和B10.D2小鼠發(fā)現(xiàn)相似結(jié)果，可以得出結(jié)論，即這些小鼠的不同遺傳背景不影響α-GalCer的佐劑作用。
因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)施用α-GalCer大大增強(qiáng)子孢子免疫小鼠的CS-特異性T細(xì)胞應(yīng)答，本發(fā)明人決定測(cè)定肽免疫時(shí)以及重組病毒免疫時(shí)α-GalCer是否也能增強(qiáng)CS-特異性T細(xì)胞應(yīng)答。用(i)10mg相應(yīng)于CS蛋白質(zhì)的CD8+T細(xì)胞表位或CD4+T細(xì)胞表位的合成肽或者(ii)最適度以下劑量的AdPyCS皮下免疫的同時(shí)對(duì)BALB/c小鼠施用α-GalCer。十天之后，從這些組的小鼠獲得淋巴結(jié)細(xì)胞(對(duì)于肽免疫)和脾細(xì)胞(對(duì)于病毒免疫)，并且通過(guò)ELISPOT分析測(cè)定分泌IFN-γ或IL-4的CS-特異性T細(xì)胞的數(shù)目。α-GalCer處理的肽免疫的小鼠體內(nèi)激發(fā)的分泌IFN-γ的CS-特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞的數(shù)目顯著高于沒(méi)有α-GalCer處理的肽免疫的小鼠體內(nèi)這樣的T細(xì)胞的數(shù)目。肽免疫之前兩天和之后兩天施用α-GalCer也能顯著增強(qiáng)CS-特異性T細(xì)胞應(yīng)答，盡管程度比同時(shí)施用α-GalCer和肽增強(qiáng)的應(yīng)答的程度小。α-GalCer處理的AdPyCS-免疫的小鼠體內(nèi)激發(fā)的分泌IFN-γ的CS-特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞的數(shù)目比只用病毒免疫的小鼠組的T細(xì)胞的數(shù)目高10-倍(圖2B)。當(dāng)使用SIN(Mal)時(shí)，發(fā)現(xiàn)α-GalCer處理也提高分泌IFN-γ的CS-特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)目(圖2C)。
本發(fā)明人還檢查了α-GalCer佐劑活性是否是與CS的H-2Kd-限制CD8+T細(xì)胞表位特異相關(guān)的現(xiàn)象，或者是否能應(yīng)用于非瘧疾表位。為了這個(gè)目的，用表達(dá)p18蛋白質(zhì)HIV的(V3環(huán))(Villacres等，Virology，27054-64，2000)的H-2Dd-限制CD8+T細(xì)胞表位(RGPGRAFVTI[SEQ ID NO5])的重組新培斯病毒免疫BALB/c小鼠。共同施用α-GalCer將SIN(p18)免疫誘導(dǎo)的p18-特異IFN-γ-分泌CD8+T細(xì)胞的數(shù)目提高4-倍(圖2C)。這些結(jié)果表明(i)α-GalCer處理增強(qiáng)小鼠對(duì)HIV抗原的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，和(2)α-GalCer處理增強(qiáng)表達(dá)外源表位的重組新培斯病毒，即，抗原呈遞的另一種形式，誘導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。更一般地，這里給出的數(shù)據(jù)證明，α-GalCer處理對(duì)細(xì)胞免疫應(yīng)答的增強(qiáng)不依賴抗原送遞體系(減弱病原體，肽或重組病毒)和表位。
α-GalCer延長(zhǎng)子孢子接種激發(fā)的瘧疾-特異性T細(xì)胞應(yīng)答和抗瘧疾保護(hù)作用的時(shí)間接著，在α-GalCer處理的，子孢子免疫的小鼠，和子孢子免疫的并且沒(méi)有α-GalCer處理的小鼠之間比較CS-特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的時(shí)間。用1×105γ-spz免疫BALB/c小鼠，有或沒(méi)有α-GalCer處理，2或4周之后，從這些小鼠獲得脾細(xì)胞，并且通過(guò)ELISPOT分析，測(cè)定分泌IFN-γ的CS-特異性CD8+T細(xì)胞數(shù)目。施用α-GalCer不僅提高CS-特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的水平，而且還延長(zhǎng)該應(yīng)答的時(shí)間(圖3A)。
為了測(cè)定α-GalCer的佐劑作用對(duì)抗瘧疾的保護(hù)時(shí)間的影響，通過(guò)在兩個(gè)分開的實(shí)驗(yàn)中顯微鏡檢查血液薄涂片每天監(jiān)測(cè)寄生物血癥(即，血液中存在寄生物)。在實(shí)驗(yàn)1中，兩組小鼠，一組用α-GalCer處理而另一組不用，用1×104γ-spz免疫，該劑量在免疫之后2周不能帶來(lái)抗瘧疾保護(hù)作用。兩周之后，用50活約氏瘧原蟲子孢子攻擊所有的小鼠，并且通過(guò)監(jiān)測(cè)寄生物血癥測(cè)定血液感染的發(fā)生率。在實(shí)驗(yàn)2中，兩組小鼠，一組用α-GalCer處理而另一組不用，用1×105γ-spz免疫，該劑量在免疫之后2周誘導(dǎo)完全保護(hù)作用，但是在之后4周則不能。四周之后，用50活約氏瘧原蟲子孢子攻擊這些免疫的小鼠和天然對(duì)照物，并且如上所述測(cè)定感染過(guò)程。發(fā)現(xiàn)在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中十只α-GalCer處理的子孢子免疫的小鼠中有九只受到保護(hù)，而大多數(shù)沒(méi)有接受α-GalCer處理的子孢子免疫的小鼠發(fā)生瘧疾感染(圖3B)。這些結(jié)果證實(shí)通過(guò)RT-PCR測(cè)定肝中寄生物入侵的研究中獲得的數(shù)據(jù)，并且進(jìn)一步證明施用α-GalCer延長(zhǎng)保護(hù)性免疫應(yīng)答的時(shí)間并且提高最適度以下免疫劑量的照射的子孢子的效力，表明佐劑效果。
α-GalCer的佐劑活性需要CD1d分子，Vα14 NKT細(xì)胞和IFN-γ因?yàn)橐呀?jīng)證明CD1d分子存在下α-GalCer激活NKT細(xì)胞(參見(jiàn)背景部分的參考文獻(xiàn)，例如，Kawano等，Science，2781626-1629，1997)，使用缺失CD1d分子的小鼠和表達(dá)典型NKT細(xì)胞受體的T細(xì)胞缺陷小鼠研究α-GalCer佐劑活性的細(xì)胞機(jī)理。簡(jiǎn)要地，這些敲除的小鼠以及野生型對(duì)照物，都用最適度以下劑量的γ-spz(1×104)免疫，有或沒(méi)有α-GalCer處理。兩個(gè)星期之后，用活子孢子攻擊這些免疫的小鼠和沒(méi)有免疫的小鼠對(duì)照物，并且測(cè)定保護(hù)性抗-瘧疾免疫性的水平。如圖4A所示，施用α-GalCer，提高野生型小鼠γ-spz誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫性的水平，不能增強(qiáng)CD1d-缺陷小鼠，和沒(méi)有Vα14 NKT細(xì)胞的Jα281-缺陷小鼠的保護(hù)性免疫性。這些結(jié)果表明α-GalCer的佐劑活性依賴CD1d分子和Vα14 NKT細(xì)胞。
為了進(jìn)一步證明CD1d分子和Vα14 NKT細(xì)胞對(duì)α-GalCer的佐劑活性生物重要性，對(duì)γ-spz免疫的，α-GalCer處理的或沒(méi)有處理的小鼠，缺失CD1d分子或Vα14 NKT細(xì)胞，測(cè)定CS-特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)目。如圖4B所示，與沒(méi)有處理的小鼠相比，α-GalCer處理不能增加CD1d-缺陷小鼠γ-spz免疫誘導(dǎo)的CS-特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)目，表明α-GalCer需要CD1d增強(qiáng)CS-特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。令人感興趣的是，在γ-spz免疫的并且α-GalCer處理的，Jα281-缺陷小鼠中，與沒(méi)有處理的小鼠相比，CS-特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)目顯著增加(圖4B)。但是，這種增加沒(méi)有達(dá)到α-GalCer處理的γ-spz免疫的野生型小鼠的水平(圖4B)并且不增強(qiáng)保護(hù)性抗-瘧疾免疫性的水平(圖4A)。因此，這些發(fā)現(xiàn)證明Vα14 NKT細(xì)胞在介導(dǎo)α-GalCer的佐劑作用中的重要性。
最后，為了洞察α-GalCer佐劑活性的分子機(jī)理，用γ-spz免疫沒(méi)有IFN-γ受體(IFN-γR-1-)的小鼠，有或沒(méi)有α-GalCer共同處理，十天之后，通過(guò)ELISPOT測(cè)定分析CS-特異性IFN-γ-分泌CD8+和CD4+T細(xì)胞的數(shù)目。共同施用α-GalCer不能增加γ-spz免疫的敲除小鼠的CS-特異性IFN-γ-分泌CD8+和CD4+T細(xì)胞的數(shù)目(圖5A)。有人報(bào)道過(guò)不同分子缺陷的小鼠，例如缺失GM-CSF受體β-鏈(Sato等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，967439-7444，1999)和Fas(Mieza等，J.Immunol.，1564035-4040，1996)也部分缺失NKT細(xì)胞。為了排除IFN-γ受體不存在導(dǎo)致NKT細(xì)胞數(shù)目減少和/或功能缺陷的可能性，通過(guò)CD1d/α-GalCer四聚體染色和ELISPOT測(cè)定分析這些IFN-γR-1-小鼠NKT細(xì)胞的存在和功能。使用CD1d/α-GalCer四聚體的流式細(xì)胞儀分析表明IFN-γR-1-小鼠肝淋巴細(xì)胞中α-GalCer-特異性NKT細(xì)胞的百分比類似于野生型小鼠(圖5B)。另外，野生型和FN-γR-1-小鼠的肝(圖5C)和脾中分泌IFN-γ的α-GalCer-特異細(xì)胞的數(shù)目相似，排除了由于NKT細(xì)胞群缺陷而沒(méi)有佐劑活性的可能性?？傊?，這些結(jié)果表明α-GalCer佐劑活性依賴IFN-γ產(chǎn)生。
討論該實(shí)施例說(shuō)明NKT細(xì)胞配體α-GalCer作為調(diào)節(jié)瘧疾-特異抗原誘導(dǎo)的獲得性抗-瘧疾免疫性的佐劑的能力。如這里公開的，對(duì)用最適度以下劑量的(i)照射的約氏瘧原蟲子孢子，(ii)相應(yīng)于CS蛋白質(zhì)的CD8+T細(xì)胞表位或CD4+T細(xì)胞表位的合成肽或者(iii)表達(dá)全CS蛋白質(zhì)或CS蛋白質(zhì)的CD8+T細(xì)胞表位的重組病毒免疫的小鼠施用α-GalCer，大大增強(qiáng)保護(hù)性抗-瘧疾免疫性。另外，這里發(fā)現(xiàn)α-GalCer處理即使在子孢子免疫之后4周也激發(fā)較高水平的保護(hù)作用，表明聯(lián)合施用α-GalCer能激發(fā)持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間的保護(hù)性免疫性。
表明施用α-GalCer影響的主要免疫成分是分泌IFN-γ的瘧疾-特異性CD8+和CD4+T細(xì)胞。在本項(xiàng)研究中，α-GalCer處理沒(méi)有改變體液應(yīng)答和Th2-型應(yīng)答的水平。相反，施用α-GalCer分別將γ-spz免疫誘導(dǎo)的增加IFN-γ-分泌CS-特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞的數(shù)目提高5-倍和7-倍。此外，與沒(méi)有處理的小鼠相比，α-GalCer處理的小鼠γ-spz免疫之后6周CS-特異性T細(xì)胞應(yīng)答的水平保持高得多。因?yàn)榭汞懠驳母坞A段的保護(hù)性免疫性主要由CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)，并且要求產(chǎn)生IFN-γ(Schofield等，Nature330664-666，1987；Weiss等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85573-576，1988；Doolan和Hoffinan.J.Immunol.，1651453-1462，2000)，則通過(guò)α-GalCer處理提高抗-瘧疾保護(hù)作用并且延長(zhǎng)該保護(hù)作用是意料之中的。
當(dāng)用相應(yīng)于CD4+和CD8+表位的合成肽或者用表達(dá)約氏瘧原蟲CS蛋白質(zhì)或這種蛋白質(zhì)的H-2Kd-限制CD8+T細(xì)胞表位的重組病毒對(duì)α-GalCer處理的小鼠免疫接種時(shí)，也發(fā)現(xiàn)α-GalCer的佐劑作用。這些結(jié)果證明并且擴(kuò)充通過(guò)γ-spz免疫獲得的數(shù)據(jù)，表明不管使用的免疫原的類型(全寄生物，或肽，或重組病毒)，施用α-GalCer增強(qiáng)瘧疾-特異性CD8+和CD4+T細(xì)胞應(yīng)答。這里還證明施用α-GalCer對(duì)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的增強(qiáng)不依賴使用的CD8+T細(xì)胞表位，因?yàn)楸磉_(dá)HIV的H-2Dd-限制T細(xì)胞表位的重組新培斯病毒誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答也得到增強(qiáng)。
α-GalCer增強(qiáng)γ-spz免疫誘導(dǎo)的保護(hù)性抗-瘧疾免疫性的水平的能力需要CD1d分子和Vα14 NKT細(xì)胞。沒(méi)有這些成分，α-GalCer不能增強(qiáng)最適劑量以下免疫原激發(fā)的保護(hù)作用。雖然α-GalCer增強(qiáng)保護(hù)性抗-瘧疾免疫性的能力需要CD1d分子和Vα14 NKT細(xì)胞，在α-GalCer處理之后Jα281-缺陷小鼠體內(nèi)檢測(cè)到CS-特異性CD 8+T細(xì)胞數(shù)目的顯著增加。這可能由于這些小鼠的高度遺傳異質(zhì)性，它影響T細(xì)胞應(yīng)答并且引起這種適度的增加?；蛘?，CD1d-反應(yīng)性，非-Vα14NKT細(xì)胞也可以存在于Jα281-缺陷小鼠體內(nèi)。
雖然α-GalCer的佐劑作用的精確的分子機(jī)理還不完全清楚，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)α-GalCer的這些活性在缺失IFN-γ受體的小鼠中消失，表明IFN-γ在介導(dǎo)α-GalCer的佐劑作用中是重要的。有可能NKT和/或NK細(xì)胞分泌的IFN-γ通過(guò)上調(diào)I類MHC處理機(jī)構(gòu)，例如TAP，蛋白酶亞基和I類重鏈，而對(duì)抗原呈遞細(xì)胞起作用?；蛘撸琁FN-γ可以通過(guò)對(duì)抗原-特異性CD8+T細(xì)胞直接作用而增強(qiáng)獲得性細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明動(dòng)力學(xué)研究證明，只有當(dāng)與抗原(例如照射的瘧原蟲子孢子[γ-spz]，或者瘧疾-特異性肽表位[例如，重組病毒代表的])共同施用糖脂并且在用這些免疫原接種之前兩天或之后兩天導(dǎo)致佐劑活性喪失時(shí)施用α-GalCer，α-GalCer才起著最大佐劑作用。最近使用CD1d/α-GalCer四聚體在施用α-GalCer之后的NKT細(xì)胞體內(nèi)動(dòng)力學(xué)的研究表明，鼠NKT細(xì)胞，特別是構(gòu)成淋巴細(xì)胞群20-30％的肝中的那些，迅速被激活，分泌大量IFN-γ和IL-4，并且在刺激之后5小時(shí)容易消失(Matsuda等，J.Exp.Med.，192741-754，2000)。令人感興趣地，α-GalCer激活的NKT細(xì)胞的迅速消失也通過(guò)用α-GalCer處理的癌癥患者的外周血的表型分析得以證實(shí)。
如先前各研究人員證明的，NKT細(xì)胞激活不只是引起NK細(xì)胞的激活，而且還引起記憶CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖 (Eberl等，J.Immunol.，1654305-4311，2000)或者T細(xì)胞和B細(xì)胞表面上早期激活標(biāo)記CD69的誘導(dǎo)(Nishimura等，Int.Immunol.12987-994，2000)，提出在引發(fā)T細(xì)胞和B細(xì)胞應(yīng)答中激活的NKT細(xì)胞的作用。還有，不同研究人員的近期研究表明α-GalCer處理之后NKT和NK細(xì)胞都分泌IFN-γ(Nishimura等，Int.Immunol.12987-994，2000；Carnaud等，J.Immunol.，1634647-4650，1999；Eberl和MacDonald，Eur.J.Immunol.，30985-992，2000)。在這些研究的一項(xiàng)中證明，對(duì)用T細(xì)胞淋巴瘤免疫的小鼠施用α-GalCer增強(qiáng)腫瘤特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的產(chǎn)生(Nishimura等，Int.Immunol.12987-994，2000)。但是，關(guān)于α-GalCer激活的NKT細(xì)胞是否能貢獻(xiàn)于抗病原體或腫瘤的保護(hù)性免疫性的誘導(dǎo)還沒(méi)有闡明。就這一點(diǎn)來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的研究第一次指出α-GalCer激活的NKT細(xì)胞在誘導(dǎo)保護(hù)性免疫性中起著作用，其中特異CD8+T細(xì)胞是主要效應(yīng)細(xì)胞。
結(jié)論是，該項(xiàng)研究證明α-GalCer作為佐劑增強(qiáng)和/或延長(zhǎng)保護(hù)性抗原特異性免疫應(yīng)答的時(shí)間。具體地說(shuō)，如這里公開的，這種α-GalCer介導(dǎo)的免疫刺激作用至少部分歸因于α-GalCer激活的NKT細(xì)胞。雖然還沒(méi)有鑒定α-GalCer的內(nèi)源哺乳動(dòng)物配對(duì)部分，但是相信它也是在病理和炎癥條件范圍下被誘導(dǎo)激活NKT細(xì)胞(Mieza等，J.Immunol.，1564035-4040，1996；Sumida等，J.Exp.Med.，1821163-1168，1995)。因此，這里公開的研究可以代表NKT細(xì)胞在橋接先天和后天免疫性中的作用的證據(jù)。
本發(fā)明對(duì)于α-GalCer的佐劑活性的發(fā)現(xiàn)清楚地不僅只適用于瘧疾，而且還適合各種其他胞內(nèi)微生物病原體，以及適合其他傳染病和腫瘤。最后，因?yàn)橐呀?jīng)證明α-GalCer不僅能刺激鼠類，而且還刺激人NKT細(xì)胞(Brossay等，J.Exp.Med.1881521-1528，1998；Spada等，J.Exp.Med.，1881529-1534，1998)，本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)可以直接應(yīng)用于對(duì)人NKT細(xì)胞的作用的理解，和新的更有效人疫苗的設(shè)計(jì)。
本發(fā)明不局限于這里描述的具體實(shí)施方案的范圍。事實(shí)上，除了這里描述的之外，從上面的描述和附圖，本發(fā)明的各種修飾對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員變得顯而易見(jiàn)了。這樣的修飾意在落在后面的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
所有的專利，申請(qǐng)，公開物，試驗(yàn)方法，文獻(xiàn)，和其他材料在此引作參考。
序列表<110> New York UniversityTsuji，MoriyaGonzalez-Aseguinolaza，GloriaNussenzweig，Ruth S.
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<213>p.falciparum<400>3Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro1 5<210>4<211>20<212>PRT<213>P.falciparum<400>4Glu Tyr Leu Asn Lys Ile Gln Asn Ser Leu Ser Thr Glu Trp Ser Pro1 5 10 15Cys Ser Val Thr20<210>5<211>10<212>PRT<213>HIV-1<400>5Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile1 5 10<210>6<211>11<212>PRT<213>HIV-1<400>6Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe1 5 10<210>7<211>8<212>PRT<213>HIV-1<400>7Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile1 5<210>8<211>9<212>PRT<213>HIV-1
<400>8Thr Pro Gln Asp Leu Asn MetMet Leu1 5<210>9<211>9<212>PRT<213>HIV-1<400>9Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu1 5<210>10<211>10<212>PRT<213>HIV-1<400>10Asp Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala Glu Trp1 5 10<210>11<211>10<212>PRT<213>HIV-1<400>11Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys1 5 10<210>12<211>9<212>PRT<213>HIV-1<400>12Gln Ala Thr Gln Glu Val Lys Asn Trp1 5<210>13<211>9<212>PRT<213>HIV-1<400>13Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys1 5
<210>14<211>9<212>PRT<213>HIV-1<400>14Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu1 5<210>15<211>12<212>PRT<213>P.falciparum<400>15Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro1 5 10<210>16<211>9<212>PRT<213>流感A病毒<400>16Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val1 5<210>17<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于RT-PCR的正向引物<400>17ggggattggt tttgacgttt ttgcg 25<210>18<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于RT-PCR的逆向引物<400>18aagcattaaa taaagcgaat acatccttat30
<210>19<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>熒光探針，PyNYU<400>19caattggttt accttttgct cttt 2權(quán)利要求
1.用于增強(qiáng)哺乳動(dòng)物抗原的免疫原性的方法，包括用所述抗原并且聯(lián)合施用包括通式1的糖基神經(jīng)酰胺的佐劑對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行免疫 其中R1，R2和R5代表H或具體單糖；R3和R6分別代表H或OH；R4代表H，OH或具體單糖；X代表1-23的整數(shù)；R7代表下面基團(tuán)(a)-(g)的任一個(gè)(a)--(CH2)11--CH3，(b)--(CH2)12--CH3，(c)--(CH2)13--CH3，(d)--(CH2)9--CH(CH3)2，(e)--(CH2)10--CH(CH3)2，(f)--(CH2)11--CH(CH3)2，(g)--(CH2)11--CH(CH3)--C2H5。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述糖基神經(jīng)酰胺選自α-半乳糖基神經(jīng)酰胺(α-GalCer)，α-葡糖基神經(jīng)酰胺(α-GlcCer)，Galα1-6Galα1-1′Cer，Galα1-6Glcα1-1′Cer，Galα1-2Galα1-1′Cer，和Galβ1-3Galα1-1′Cer。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述α-GalCer是(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖苷)-2-(N-二十六?；被?-1，3，4-十八烷三醇。
4.權(quán)利要求1的方法，其中同時(shí)施用所述抗原和所述佐劑。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗原是瘧疾-特異性的。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述瘧疾-特異性抗原包括照射的瘧原蟲子孢子。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述瘧疾-特異性抗原包括瘧疾環(huán)子孢子(CS)蛋白質(zhì)的T細(xì)胞表位。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗原是HIV-特異性的。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗原由表達(dá)所述抗原的重組病毒呈遞。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述病毒選自重組腺病毒，重組痘病毒，和重組新培斯病毒。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
12.用于增強(qiáng)或延長(zhǎng)哺乳動(dòng)物抗原-特異性Th1-型免疫應(yīng)答時(shí)間的方法，包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物聯(lián)合施用(i)抗原和(ii)包括通式1的糖基神經(jīng)酰胺的佐劑 其中R1，R2和R5代表H或具體單糖；R3和R6分別代表H或OH；R4代表H，OH或具體單糖；X代表1-23的整數(shù)；R7代表下面基團(tuán)(a)-(g)的任一個(gè)(a)--(CH2)11--CH3，(b)--(CH2)12--CH3，(c)--(CH2)13--CH3，(d)--(CH2)9--CH(CH3)2，(e)--(CH2)10--CH(CH3)2，(f)--(CH2)11--CH(CH3)2，(g)--(CH2)11--CH(CH3)--C2H5。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述Th1-型免疫應(yīng)答是CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。
14.用于治療哺乳動(dòng)物疾病的方法，包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物聯(lián)合施用抗原和包括通式1的糖基神經(jīng)酰胺的佐劑 其中R1，R2和R5代表H或具體單糖；R3和R6分別代表H或OH；R4代表H，OH或具體單糖；X代表1-23的整數(shù)；R7代表下面基團(tuán)(a)-(g)的任一個(gè)(a)--(CH2)11--CH3，(b)--(CH2)12--CH3，(c)--(CH2)13--CH3，(d)--(CH2)9--CH(CH3)2，(e)--(CH2)10--CH(CH3)2，(f)--(CH2)11--CH(CH3)2，(g)--(CH2)11--CH(CH3)--C2H5。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述糖基神經(jīng)酰胺選自α-半乳糖基神經(jīng)酰胺(α-GalCer)，α-葡糖基神經(jīng)酰胺(α-GlcCer)，Galα1-6Galα1-1′Cer，Galα1-6Glcα1-1′Cer，Galα1-2Galα1-1′Cer，和Galβ1-3Galα1-1′Cer。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述α-GalCer是(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖苷)-2-(N-二十六?；被?-1，3，4-十八烷三醇。
17.權(quán)利要求14的方法，其中所述疾病選自傳染病和癌癥。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述傳染選自病毒傳染，細(xì)菌傳染，寄生物傳染，和真菌傳染。
19.權(quán)利要求14的方法，其中所述疾病是瘧疾。
20.權(quán)利要求14的方法，其中所述疾病是HIV感染。
21.權(quán)利要求14的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
22.含有免疫原有效量的具有通式1的糖基神經(jīng)酰胺的佐劑的藥物組合物 其中R1，R2和R5代表H或具體單糖；R3和R6分別代表H或OH；R4代表H，OH或具體單糖；X代表1-23的整數(shù)；R7代表下面基團(tuán)(a)-(g)的任一個(gè)(a)--(CH2)11--CH3，(b)--(CH2)12--CH3，(c)--(CH2)13--CH3，(d)--(CH2)9--CH(CH3)2，(e)--(CH2)10--CH(CH3)2，(f)--(CH2)11--CH(CH3)2，(g)--(CH2)11--CH(CH3)--C2H5。
23.權(quán)利要求22的藥物組合物，其中所述糖基神經(jīng)酰胺選自α-半乳糖基神經(jīng)酰胺(α-GalCer)，α-葡糖基神經(jīng)酰胺(α-GlcCer)，Galα1-6Galα1-1′Cer，Galα1-6Glcα1-1′Cer，Galα1-2Galα1-1′Cer，和Galβ1-3Galα1-1′Cer。
24.權(quán)利要求23的藥物組合物，其中所述α-GalCer是(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖苷)-2-(N-二十六?；被?-1，3，4-十八烷三醇。
25.權(quán)利要求22的藥物組合物，進(jìn)一步包括藥學(xué)可接受載體或賦形劑。
26.權(quán)利要求22的藥物組合物，進(jìn)一步包括免疫原有效量的抗原。
27.用于對(duì)哺乳動(dòng)物增強(qiáng)抗原誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫性的方法，包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用權(quán)利要求22的藥物組合物。
28.用于治療哺乳動(dòng)物疾病的方法，包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用權(quán)利要求22的藥物組合物。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述疾病選自傳染病和癌癥。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述傳染選自病毒傳染，細(xì)菌傳染，寄生物傳染，和真菌傳染。
31.權(quán)利要求28的方法，其中所述疾病是瘧疾。
32.權(quán)利要求28的方法，其中所述疾病是HIV感染。
33.含有免疫原有效量的抗原和免疫原有效量的具有通式1的糖基神經(jīng)酰胺的佐劑的疫苗組合物 其中R1，R2和R5代表H或具體單糖；R3和R6分別代表H或OH；R4代表H，OH或具體單糖；X代表1-23的整數(shù)；R7代表下面基團(tuán)(a)-(g)的任一個(gè)(a)--(CH2)11--CH3，(b)--(CH2)12--CH3，(c)--(CH2)13--CH3，(d)--(CH2)9--CH(CH3)2，(e)--(CH2)10--CH(CH3)2，(f)--(CH2)11--CH(CH3)2，(g)--(CH2)11--CH(CH3)--C2H5。
34.權(quán)利要求33的疫苗組合物，其中所述糖基神經(jīng)酰胺選自α-半乳糖基神經(jīng)酰胺(α-GalCer)，α-葡糖基神經(jīng)酰胺(α-GlcCer)，Galα1-6Galα1-1′Cer，Galα1-6Glcα1-1′Cer，Galα1-2Galα1-1′Cer，和Galβ1-3Galα1-1′Cer。
35.權(quán)利要求34的疫苗組合物，其中所述α-GalCer是(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖苷)-2-(N-二十六?；被?-1，3，4-十八烷三醇。
36.權(quán)利要求33的疫苗組合物，進(jìn)一步包括藥學(xué)可接受載體或賦形劑。
37.用于給易感哺乳動(dòng)物宿主帶來(lái)抗瘧疾子孢子階段的免疫性的方法，包括對(duì)所述宿主聯(lián)合施用(i)第一量的至少一種選自子孢子表面抗原的瘧疾-特異性抗原，和(ii)第二量的作為免疫佐劑的α-半乳糖基神經(jīng)酰胺(α-GalCer)；所述第一和第二量是與不聯(lián)合施用所述佐劑下施用所述第一量的所述抗原時(shí)宿主的免疫應(yīng)答相比，有效聯(lián)合增強(qiáng)或延長(zhǎng)宿主對(duì)所述抗原的免疫應(yīng)答的量。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述α-GalCer是(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖苷)-2-(N-二十六?；被?-1，3，4-十八烷三醇。
39.權(quán)利要求37的方法，其中所述抗原和所述佐劑同時(shí)施用。
40.權(quán)利要求37的方法，其中所述瘧疾-特異性抗原包括瘧原蟲環(huán)子孢子(CS)蛋白質(zhì)的T細(xì)胞表位。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述T細(xì)胞表位具有選自YNRNIVNRLLGDALNGKPEEK(SEQ ID NO1)，SYVPSAEQI(SEQ ID NO2)，(NVDPNANP)n(SEQ ID NO3)，和EYLNKIQNSLSTEWSPC SVT(SEQ IDNO4)的氨基酸序列。
42.權(quán)利要求37的方法，其中所述瘧疾-特異性抗原包括瘧原蟲環(huán)子孢子(CS)蛋白質(zhì)的B細(xì)胞表位。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述B細(xì)胞表位具有氨基酸序列(NANP)3(SEQ ID NO15)。
44.權(quán)利要求37的方法，其中所述瘧疾-特異性抗原由表達(dá)所述抗原的重組病毒呈遞。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述病毒選自重組腺病毒，重組痘病毒，和重組新培斯病毒。
46.權(quán)利要求37的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
47.權(quán)利要求37的方法，其中所述免疫應(yīng)答的增強(qiáng)或延長(zhǎng)是通過(guò)抗原特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的增強(qiáng)和時(shí)間的延長(zhǎng)實(shí)現(xiàn)的。
48.權(quán)利要求37的方法，其中所述第一量是每千克體重0.1微克至100毫克范圍內(nèi)。
49.權(quán)利要求37的方法，其中所述第二量是每千克體重10-100微克范圍內(nèi)。
50.用于對(duì)易感哺乳動(dòng)物宿主增強(qiáng)對(duì)HIV抗原的T細(xì)胞應(yīng)答的方法，包括對(duì)所述宿主聯(lián)合施用(i)第一量的至少一種選自Gag，Tat，Pol，Env，Nef，gp 160，p18，和gp 120的HIV-特異性抗原，和(ii)第二量的作為免疫佐劑的α-半乳糖基神經(jīng)酰胺(α-GalCer)；所述第一和第二量是與不聯(lián)合施用所述佐劑下施用所述第一量的所述抗原時(shí)宿主的免疫應(yīng)答相比，有效聯(lián)合增強(qiáng)宿主對(duì)所述抗原的T細(xì)胞應(yīng)答的量。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述α-GalCer是(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖苷)-2-(N-二十六?；被?-1，3，4-十八烷三醇。
52.權(quán)利要求50的方法，其中所述HIV-特異性抗原和所述佐劑同時(shí)施用。
53.權(quán)利要求50的方法，其中在所述抗原之前1小時(shí)施用所述佐劑。
54.權(quán)利要求50的方法，其中所述HIV-特異性抗原包括Gag，Tat，Env，Pol，Nef，gp160，p18，或gp120的T細(xì)胞表位。
55.權(quán)利要求54的方法，其中所述T細(xì)胞表位具有選自RGPGRAFVTI(SEQ ID NO5)，KAFSPEVIPMF(SEQ ID NO6)，KAFSPEVI(SEQ ID NO7)，TPQDLNMML(SEQ ID NO8)，TPQDLNTML(SEQ ID NO9)，DTINEEAAEW(SEQ ID NO10)，KRWIILGLNK(SEQ ID NO11)，和QATQEVKNW(SEQ ID NO12)，RLRPGGKKK(SEQ ID NO13)，和SLYNTVATL(SEQ ID NO14)的氨基酸序列。
56.權(quán)利要求50的方法，其中所述HIV-特異性抗原由表達(dá)所述抗原的重組病毒呈遞。
57.權(quán)利要求50的方法，其中所述病毒選自重組腺病毒，重組痘病毒，和重組新培斯病毒。
58.權(quán)利要求50的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
59.權(quán)利要求50的方法，其中所述第一量是每千克體重0.1微克至100毫克范圍內(nèi)。
60.權(quán)利要求50的方法，其中所述第二量是每千克體重10-100微克范圍內(nèi)。
61.含有至少一種抗原和包括通式1的糖基神經(jīng)酰胺的佐劑的疫苗組合物的制備方法 其中R1，R2和R5代表H或具體單糖；R3和R6分別代表H或OH；R4代表H，OH或具體單糖；X代表1-23的整數(shù)；R7代表下面基團(tuán)(a)-(g)的任一個(gè)(a)--(CH2)11--CH3，(b)--(CH2)12--CH3，(c)--(CH2)13--CH3，(d)--(CH2)9--CH(CH3)2，(e)--(CH2)10--CH(CH3)2，(f)--(CH2)11--CH(CH3)2，(g)--(CH2)11--CH(CH3)--C2H5，所述方法包括混合佐劑和抗原。
62.用于制備含有至少一種抗原和佐劑的藥物或疫苗組合物的試劑盒，其中所述佐劑包括通式1的糖基神經(jīng)酰胺 其中R1，R2和R5代表H或具體單糖；R3和R6分別代表H或OH；R4代表H，OH或具體單糖；X代表1-23的整數(shù)；R7代表下面基團(tuán)(a)-(g)的任一個(gè)(a)--(CH2)11--CH3，(b)--(CH2)12--CH3，(c)--(CH2)13--CH3，(d)--(CH2)9--CH(CH3)2，(e)--(CH2)10--CH(CH3)2，(f)--(CH2)11--CH(CH3)2，(g)--(CH2)11--CH(CH3)--C2H5，所述試劑盒包括第一容器中的抗原，第二容器中的佐劑，和任選地用于混合抗原和佐劑的說(shuō)明和/或組合物給藥說(shuō)明；并且任選地，容器置于包裝中。
63.權(quán)利要求62的試劑盒，其中所述佐劑選自選自α-半乳糖基神經(jīng)酰胺(α-GalCer)，α-葡糖基神經(jīng)酰胺(α-GlcCer)，Galα1-6Galα1-1′Cer，Galα1-6Glcα1-1′Cer，Galα1-2Galα1-1′Cer，和Galβ1-3Galα1-1′Cer。
64.權(quán)利要求63的試劑盒，其中所述α-GalCer是(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖苷)-2-(N-二十六?；被?-1，3，4-十八烷三醇。
全文摘要
本發(fā)明涉及增強(qiáng)哺乳動(dòng)物體內(nèi)抗原的免疫原性的方法和組合物，包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物一起施用抗原和包括糖基神經(jīng)酰胺優(yōu)選α－半乳糖基神經(jīng)酰胺(α－GalCer)的佐劑組合物。根據(jù)本發(fā)明，使用糖基神經(jīng)酰胺作為佐劑至少部分引起抗原特異性Th1－型應(yīng)答特別是CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的增強(qiáng)和/或延長(zhǎng)。本發(fā)明的方法和組合物能用于預(yù)防和治療各種傳染病和腫瘤。
文檔編號(hào)A61P31/04GK1561389SQ02818746
公開日2005年1月5日 申請(qǐng)日期2002年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月25日
發(fā)明者辻守哉, G·岡薩雷斯－阿塞吉諾拉扎, 肥塚靖彥 申請(qǐng)人:紐約大學(xué), 麒麟麥酒株式會(huì)社