專利名稱：治療糖尿病的組合物和方法
背景技術(shù)：
I型糖尿病是一種進行性自身免疫反應(yīng)引起的能夠選擇性破壞產(chǎn)生胰島素的β細胞的疾病，I型糖尿病患者的胰島細胞會喪失。II型糖尿病是所謂的成人疾病，但在肥胖的年輕人群中發(fā)生的比例也在增大，II型糖尿病患者體內(nèi)的β細胞減少多達正常水平的60％。胰島中功能性β細胞的數(shù)量對于糖尿病的開始、發(fā)展、以及帶來的后果具有至關(guān)重要的意義。在I型糖尿病患者體內(nèi)，β細胞數(shù)量下降到低于正常水平的2％。即使是對胰島素有嚴(yán)重的排斥作用的II型糖尿病也只會在β細胞的數(shù)量沒有得到充分的補充增加的情況下發(fā)生。因此，無論哪一種類型的糖尿病都是歸因于β細胞不能適應(yīng)性的生長和由此而引起的胰島素分泌的缺乏。因此，激發(fā)前體細胞生成胰島和β細胞，即“胰島再生”，的能力對于改善糖尿病癥狀來說將是一種新穎而頗具吸引力的途徑。
通過一系列的實驗，制得了一種稱之為“Ilotropin”的胰腺提取物。實驗表明，此化合物激發(fā)已經(jīng)存在的前體細胞使β細胞再生，而這種前體細胞與胰腺導(dǎo)管系統(tǒng)有關(guān)。根據(jù)以下假設(shè)，即胰腺導(dǎo)管細胞的轉(zhuǎn)化從而引起胰島的再生是由內(nèi)部的生長因子、基因和蛋白質(zhì)產(chǎn)物所決定的，開展了對ilotropin中活性成分的尋找及鑒定。也正是這一研究主線導(dǎo)致了一種新基因以及與其相關(guān)的蛋白質(zhì)(INGAP)的發(fā)現(xiàn)，而這種蛋白質(zhì)又與胰島的再生相關(guān)。
INGAP肽(INGAP104-118)，包含在含有175個氨基酸INGAP內(nèi)的15個氨基酸序列-被證明能夠激發(fā)大頰鼠類胰腺導(dǎo)管細胞的增殖。INGAP肽是美國專利5,834,590的序列標(biāo)識號2的103至117氨基酸，該專利引入本文以供參考。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及定量給養(yǎng)攝取法和INGAP肽的配方。本發(fā)明公開的配方具有作為藥物試劑應(yīng)具有的可接受的穩(wěn)定性和應(yīng)用于人類臨床試驗的適當(dāng)?shù)陌踩浴Ｈ缦轮苽涞腎NGAP肽進一步顯示能夠使維持正常反饋控制的功能性胰島細胞再生。
因此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種藥學(xué)上可接受的和穩(wěn)定的INGAP肽組合物，該組合物參與Langerhans胰島的再生過程。
本發(fā)明的另一目的是提供治療哺乳動物糖尿病的方法。
本發(fā)明的又一個目的是提供治療哺乳動物體內(nèi)生理血糖調(diào)節(jié)異常的方法。
本發(fā)明的再一個目的是提供增加哺乳動物體內(nèi)的胰腺β細胞或Langerhans胰島的數(shù)目的方法。
本發(fā)明的再一個目的是提供治療接受胰島細胞移植的哺乳動物的方法。
本發(fā)明的再一個目的是提供誘導(dǎo)胰腺前體細胞分化的方法。
所有引用的相關(guān)文獻都引入本發(fā)明的相應(yīng)部分以供參考。任何資料的引用都不可理解為是對其作為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)的認可。
圖表說明

圖1顯示INGAP肽處理過的ARIP細胞(大鼠胰腺導(dǎo)管細胞)，顯示細胞數(shù)量隨INGAP的增加而增加。
圖2顯示在對正常的敘利亞大頰鼠施用INGAP后胰島細胞數(shù)量的增加。
圖3顯示在由鏈脲霉素誘導(dǎo)引起糖尿病的C57BL/J6鼠體內(nèi)施用INGAP肽或生理鹽水后血糖的時間變化曲線。
圖4顯示將由鏈脲霉素誘導(dǎo)而引起糖尿病的C57BL/J6鼠用INGAP肽處理后其胰腺中胰島素和胰高血糖素的正常分布。
圖5顯示INGAP肽誘發(fā)C57BL/J6鼠的胰腺導(dǎo)管壁中的細胞的PDX-1的表達。
圖6顯示用鏈脲霉素處理過的C57BL/J6鼠與依次用鏈脲霉素和INGAP處理過的小鼠之間的胰島組織對比。
圖7顯示用INGAP肽處理31天后的正常鼠的胰島素免疫反應(yīng)性組織區(qū)域的胰島素增加百分數(shù)。
圖8顯示用INGAP肽處理34天后的正常狗的胰島素免疫反應(yīng)性組織區(qū)域的胰島素增加百分數(shù)。
發(fā)明詳述術(shù)語表以下是本發(fā)明所使用的術(shù)語定義的列表“藥學(xué)上可接受的鹽”是指本發(fā)明中的化合物上的任何酸性基團(如，羧基)形成的陽離子鹽或者任何堿性基團(如，氨基、烷胺基、二烷胺基、嗎啡啉基和其它類似的基團)形成的陰離子鹽。由于INGAP肽是兩性的，因此兩種鹽都是可能的，也都是可以接受的。在本領(lǐng)域已知許多此類的鹽。優(yōu)選的陽離子鹽包括但不限于堿金屬離子鹽(如，鈉和鉀)，堿土金屬離子鹽(如，鎂和鈣)和有機鹽，如銨鹽。優(yōu)選的陰離子鹽包括鹵化物、磺酸鹽、羧酸鹽、磷酸鹽和其它類似的鹽。在該種鹽中清楚考慮的是提供光學(xué)活性中心的加成鹽，因為加入之前是沒有光學(xué)活性中心的。例如，手性的酒石酸鹽可以用本發(fā)明的化合物來制備，且本定義包括了這種手性鹽。所考慮的鹽要在施用給患病的動物、哺乳動物或人的量內(nèi)無毒性。比較適當(dāng)?shù)奶砑拥柠}有鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、乙酸鹽、三氟乙酸鹽、硝酸鹽、檸檬酸鹽、延胡索酸鹽、甲酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、己二酸鹽、戊二酸鹽、乳酸鹽、丙酸鹽、丁酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽、三氟甲磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、十二烷基磺酸鹽、環(huán)己烷基氨基磺酸鹽和其它類似的鹽，但又不局限于這些鹽。
“可生物水解的酯”是指本發(fā)明的酯化合物，其中這些酯應(yīng)基本上不妨礙、優(yōu)選完全不妨礙化合物的生物活性，或者選擇很容易在患者體內(nèi)轉(zhuǎn)化生成活性化合物的酯。在本領(lǐng)域中已知有許多這樣的酯，如Johnston和Mobashery在1988年11月8日公開的美國專利4,783,443中所述。這樣的酯包括低級烷基酯、低級酰基的烷基酯(如，乙酸甲酯、乙酸乙酯、氨基甲酸甲酯、異戊酸甲酯和異戊酸乙酯)、內(nèi)酯(如，2-苯并[c]呋喃酮基和硫代酞基酯)、低級烷氧羧酸烷基酯(如，碳酸二甲酯、碳酸二乙酯、異丙基乙基碳酸酯)、烷氧基烷酯、膽堿酯和酰胺基烷酯(如，乙酰胺基甲酯)。
本發(fā)明中使用的“治療”至少是指使用本發(fā)明的化合物能夠減輕生理葡萄糖失調(diào)帶來的疾病，其適合對象優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選人類。因此，術(shù)語“治療”包括預(yù)防實驗對象因生理血糖異常而引起的紊亂，特別是當(dāng)實驗對象十分傾向于患此病，但還診斷不出患有此病時；抑制因生理血糖異常而引起的紊亂；和/或減輕或逆轉(zhuǎn)實驗對象因生理血糖異常而引起的的紊亂。目前，本發(fā)明的方法主要在于預(yù)防實驗對象因生理血糖異常而引起的紊亂。應(yīng)當(dāng)理解，這里所說的“預(yù)防”并不要求患病的狀態(tài)完全治愈(Webster第九版大學(xué)生字典)，這里所指的預(yù)防是指熟練的技術(shù)人員鑒別易于因生理血糖異常而引起的紊亂的人群的能力，因此，可以在因生理血糖異常而引起紊亂之前，很好地應(yīng)用本發(fā)明中的化合物來起到預(yù)防的作用。本發(fā)明所指的“預(yù)防”并不意味著可以完全避免疾病的發(fā)生。因生理血糖異常而引起紊亂(I型和II型糖尿病)的人群主要是那些通過家庭病史能看其具有易患糖尿病基因的人群。其它風(fēng)險因素包括如肥胖癥和飲食不當(dāng)。
制造與穩(wěn)定性INGAP肽是一種由包含在175個天然氨基酸INGAP中的104至118這15個氨基酸組成的氨基酸序列。可以用本領(lǐng)域熟悉的多種不同的方法來合成INGAP肽，盡管優(yōu)選地是通過利用9-氟甲酸甲酯(Fmoc)進行的固相合成法來合成。INGAP肽的優(yōu)選形式為呈藥學(xué)上可接受的鹽的形式、優(yōu)選乙酸鹽形式的INGAP肽。肽鹽的制備在本領(lǐng)域是熟知的。利用9-氟甲酸甲酯(moc)的合成法在美國專利4,108,846中已有描述。Fmoc利用哌啶使甲氧羰基斷掉，用三氟乙酸將肽從樹脂上切斷。由此工藝制得的INGAP粗品可以通過制備性高效色譜柱來純化。
INGAP肽的氨基酸序如下NH2-Ile-Gly-Leu-His-Asp-Pro-Ser-His-Gly-Thr-Leu-Pro-Asn-Gly-Ser-COOH(SEQ ID NO3)INGAP肽的分子式為C64H100N20O22，分子量為1501.6±1道爾頓，在1％濃度的乙酸中旋光度為-103.2°。
INGAP肽的結(jié)構(gòu)可以通過分析由INGAP肽分子進行水解得到的組成氨基酸而得到確認。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)，可以定量表示出各種存在的氨基酸的正確摩爾比，肽的分子量可以用電子噴霧質(zhì)譜儀來確認，并且應(yīng)該與計算的、理論質(zhì)量相一致(1501.6±1個質(zhì)量單位)。
為了確認所合成的分子是否具有生物活性，可以通過生物測定來確認活性。生物測定用的是一種從ATCC(Manassas，VA)獲得的大鼠胰腺導(dǎo)管細胞□ARIP細胞。將測試細胞以每孔10,000個細胞裝在有96個孔的培養(yǎng)板中，在含有10％的牛胎血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時。24個小時之后，替換成沒有血清的DMEM培養(yǎng)液。然后用不同劑量(0，10-3和10-5克/毫升)的INGAP肽來處理相同的孔。21個小時之后，用Roche Molecular Biochemicals公司的BrDU細胞增殖ELISA試劑盒中的溴脫氧尿苷(BrdU)標(biāo)記溶液加入培養(yǎng)液后，再培養(yǎng)3小時。24個小時之后，將細胞在60℃下干燥60分鐘，將其固定和變性。根據(jù)試劑盒使用說明，將這些細胞放到BrdU抗體中處理90分鐘，反應(yīng)15分鐘。帶有BrdU標(biāo)記的細胞可以用Wallac Victor 1420型多標(biāo)記記數(shù)器進行計算。將結(jié)果與在相同培養(yǎng)板中進行的細胞增殖的標(biāo)準(zhǔn)曲線相對照，開始時細胞密度為每孔100至20,000細胞。正如圖1所示，生物測定結(jié)果表明與對照組相比，使用0.1微克/毫升的INGAP肽處理過的細胞增殖約1.6倍。
INGAP肽的穩(wěn)定性穩(wěn)定性是通過對比不同的參數(shù)來確定的，這些參數(shù)包括但不限于樣本的純度、雜質(zhì)總百分含量、雜質(zhì)單獨百分含量(用高效液相色譜或其它合適的定量的方法來確定)、表觀和水含量等。高效液相色譜的方法可以用來確定相對于INGAP肽的各種降級產(chǎn)物的含量的增加。INGAP肽樣品(無論是溶液還是冷凍干燥粉末)存儲在各種不同的溫度、潮濕或干燥狀態(tài)下，以及存儲在透明或避光的小瓶子中。不同的存儲條件下的降解都會導(dǎo)致雜質(zhì)的增加和INGAP肽的含量的降低。樣品制備的純度大于80％是可取的，優(yōu)選大于90％，更優(yōu)選大于95％，最優(yōu)選大于97％。
當(dāng)INGAP肽以冷凍干燥粉末保存時，在任何存儲條件下都是穩(wěn)定的。在這些存儲條件下，INGAP肽的純度可以得到很好的保持，降解產(chǎn)物低于可接受的水平。進一步存儲期長達六個月時，也不會引起任何明顯的INGAP肽的降解。
組合物本發(fā)明的另一方面是組合物，該組合物包括(a)本發(fā)明的安全而有效量的肽，(b)藥學(xué)上可接受的載體。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的藥物配制技術(shù)，例如，Mack PublishingCompany出版的Easton，Pa.編著的《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington’sPharmaceutical Sciences)的最新版本所公開的那些技術(shù)。
“安全有效量”是指本發(fā)明中的肽的量，該量足夠能顯著地激發(fā)治療效果，但又足夠低以盡量減少對需要肽的對象動物、優(yōu)選哺乳動物、更優(yōu)選人的副作用(例如，毒性、刺激或過敏反應(yīng))，使用本發(fā)明從而得到一個合理的“效果/風(fēng)險比值”。顯然，這里所說的“安全有效量”又隨著作用對象的具體因素的不同而改變，具體因素包括如身體狀況、治療的期限、同時進行的療法的性質(zhì)、所用的劑量、應(yīng)用的載體、其中肽的溶解性以及藥劑的用法等。本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員會按照與本發(fā)明相一致的下列方法來確定一種“安全有效量”?？梢詤⒖家韵挛墨ISpilker B編，《臨床研究和發(fā)展草案指南》(Guide to Clinical Studies andDeveloping Protocols)，New YorkRaven Press Books，Ltd.，1984，pp.7-13，54-60；Spilker，《臨床實驗指南》(Guide to Clinical Trials)，New YorkRavenPress Books，Ltd.，1991，pp.93-101；Craig C.和R.Stitzel，編著，《現(xiàn)代藥物學(xué)》(Modern Pharmacology)(第二版)，Little，Brown and Co.，Boston1986，pp.127-33；T.Speight編著，《艾弗里藥物治療原理、藥物臨床實踐和療法》(Avery’sDrug TreatmentPrinciples and Practice of Clinical Pharmacology andTherapeutics)(第三版)，Williams and Wilkins，Baltimore，1987，pp.50-56；R.Tallarida，R.Raffa和P.McGonigle，《常用藥物學(xué)原理》(Principlesin General Pharmacology)，Springer-Verlag，New York1988，pp.18-20。
本發(fā)明的肽溶解或懸浮在藥學(xué)上可接受的緩沖液里面。其中溶解肽的緩沖溶液會影響肽的pH值、溶解性，從而會影響肽的生物可獲得性。緩沖溶液的選擇取決于肽組分、施用方法、希望得到的肽的溶解度、在生理學(xué)基礎(chǔ)上肽的半衰期以及生理體液的pH值和緩沖能力。理想的緩沖溶液的pH值可能更接近肽的pKa值，或其取決于隨肽在體內(nèi)傳導(dǎo)的生理學(xué)環(huán)境。適合的緩沖溶液包括但不限于磷酸鹽、乙酸鹽、碳酸鹽、碳酸氫鹽、氨基乙酸鹽、檸檬酸鹽、咪唑鹽以及其它鹽。尤其優(yōu)選的是乙酸鹽緩沖溶液。
除了主體肽以外，本發(fā)明的組合物還包含藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明中使用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”載體是指適用于動物、優(yōu)選哺乳動物、更優(yōu)選人的一種或多種兼容的固態(tài)或液態(tài)的填料稀釋劑或膠囊包封物質(zhì)。本發(fā)明中使用的術(shù)語“兼容的”是指組合物的各種組分可以與肽混合后，在通常的應(yīng)用條件下不會實質(zhì)性地降低化合物的藥物功效的相互作用。藥學(xué)上可接受的載體當(dāng)然必須要有足夠高的純度和足夠低的毒性，并且適合施用于動物、優(yōu)選哺乳動物、更優(yōu)選人類。選擇藥學(xué)上可接受的載體與肽聯(lián)合使用基本上是由肽的施用方式?jīng)Q定的。如果主題肽是用來注射的，優(yōu)選的藥學(xué)上可接受的載體應(yīng)該是經(jīng)過消毒的，并且具有與血液兼容的膠狀懸浮劑。
更具體地講，用于系統(tǒng)給藥的藥學(xué)上可接受的載體包括糖、淀粉、纖維素及其衍生物、麥芽、凝膠、滑石粉、硫酸鈣、植物油、合成油、多羥基化合物、褐藻酸、磷酸緩沖溶液、乳化劑、生理鹽水和無熱原質(zhì)水。經(jīng)腸胃使用的優(yōu)選的載體包括丙二醇、油酸乙酯、吡咯啉酮、乙醇和芝麻油。，在經(jīng)腸胃施用的組合物中，藥學(xué)上優(yōu)選的可接受的載體至少占整個組合物重量的90％。
本發(fā)明的組合物優(yōu)選以單位劑量的形式提供。如本發(fā)明中所使用的“單位劑量形式”是指根據(jù)比較好的臨床實踐經(jīng)驗，包含適合用于動物、優(yōu)選哺乳動物、更優(yōu)選人類對象的單劑量的INGAP肽的本發(fā)明的組合物。這些組合物優(yōu)選含有約0.1毫克至約300毫克，更優(yōu)選約5毫克至約150毫克的INGAP肽。使用本發(fā)明的組合物進行治療的頻率可以更改以獲得所希望的大劑量并能避免副作用。因此，治療計劃的非限制性實施例包括一天一次、一天兩次、一天三次、每周一次、兩周一次、每月一次，和這幾種方式的組合。另一種可供選擇的方法是也可以連續(xù)輸液給藥。
本發(fā)明的組合物可能有各種不同的形態(tài)，例如，可以口服、可以用于局部、可以作為鼻用藥、或者作為注射用藥。根據(jù)所希望的某種特定的施用方式，可使用多種在本領(lǐng)域內(nèi)人們熟知的并且藥學(xué)上可接受的載體。這些載體包括固態(tài)或液態(tài)的填料、稀釋劑、助水溶物、表面活性劑和包封物質(zhì)。不會實質(zhì)性地干擾INGAP肽的活性的其它任選的藥物活性材料也可以被包括。用于與INGAP肽聯(lián)合的載體足以為每單位劑量提供足夠的肽。在本發(fā)明的方法中實用的制備技術(shù)和組合物在以下參考文獻中都有描述1979年，Banker & Rhodes編著的《現(xiàn)代藥物學(xué)》(ModernPharmaceutics)，第九、十章；1981年，Lieberman等人編著的《藥物的劑量形式片劑》(Pharmaceutical Dosage FormsTablets)；1976年，Ansel編著的《藥物劑量形式簡介》(Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms)(第二版)。
INGAP肽的配制在INGAP肽的各種配制中，優(yōu)選的是一種用消毒水和調(diào)節(jié)肌肉的彈性所需的氯化鈉配制的注射液，這種注射液制備有四種濃度0，7.5，30和120毫克/0.5毫升/瓶。如果需要，可以用鹽酸和氫氧化鈉來調(diào)節(jié)PH值至所需要的水平。其它濃度可以通過用生理鹽水稀釋較高濃度的溶液制備。稀釋并不影響INGAP肽的生物活性。
如此制備的INGAP肽當(dāng)保存在5℃的黑暗或光照處時在pH值4至6的范圍內(nèi)是穩(wěn)定的。然而，如果保存在25℃的條件下，組合物會發(fā)生部分的降解。組合物在pH值為6的條件下會比在pH值為4.5的條件下更容易發(fā)生降解反應(yīng)。由上可以知道，INGAP肽保存在8℃以下和pH值低于6的條件下更穩(wěn)定。
實施例1 注射用的INGAP肽溶液120毫克的INGAP肽的溶液可以按照以下的規(guī)格進行配制。
表1
實施例2 對正常大頰鼠施用INGAP肽本實驗研究了INGAP肽對正常大頰鼠的胰島生成的影響。用5毫克/千克(25毫克/平方米)INGAP肽溶液腹腔注射對象每天一次，連續(xù)進行四周，在第十天和第三十天進行β-細胞數(shù)目的評定。與用安慰劑處理過的動物相比，用INGAP肽處理過的動物表現(xiàn)出胰島細胞數(shù)目的顯著增加(見圖2)。胰島的再生效應(yīng)可以通過更多胰島素的生成和胰腺中胰島數(shù)目的增加而得到證明。新形成的β-細胞生長并出現(xiàn)在胰腺輸導(dǎo)管壁。這些含胰島素的細胞是由輸導(dǎo)管表皮細胞分化和胰島細胞的生長產(chǎn)生的，并且它們的染色的外觀效果與INGAP肽的劑量和作用的持續(xù)時間成正比。經(jīng)過較長時間的作用，這些細胞會從輸導(dǎo)管處發(fā)生遷移并在胰腺的軟體組織中形成胰島。連續(xù)使用10天INGAP肽后，胰島的數(shù)量會增加30％，連續(xù)使用30天后，組織中的胰島數(shù)量會翻一倍，這與以前在動物模型實驗中應(yīng)用ilotropin、rINGAP和玻璃紙包埋獲得的實驗結(jié)果是一致的。
實施例3 活體功效研究連續(xù)5天以35(毫克/千克/天)量的STZ處理過的使其患糖尿病的C57BL/6J小鼠被分成兩組，每組四只，其中一組用250微克INGAP肽的量，每天處理兩次，而另外一組用生理鹽水處理作為對照組。用INGAP肽處理過的全部四只小鼠的血糖濃度都恢復(fù)到正常，而用生理鹽水處理過的四只小鼠仍然處于高血糖狀態(tài)(見圖3)。39天后停止使用藥劑，進一步的觀察結(jié)果顯示，到48天停止實驗時，藥物作用仍有持續(xù)效果。對INHAP肽處理過的動物進行組織病理評價結(jié)果顯示正常出現(xiàn)胰島以及新胰島形成的區(qū)域，包括胰島素和胰增血糖素的分泌細胞的補充和分布均已出現(xiàn)(見圖4和圖6)。由于胰增血糖素對預(yù)防高血糖有非常重要的作用，因此，胰增血糖素分泌細胞的出現(xiàn)是非常引人注目的。INGAP肽能夠誘導(dǎo)胰島再生的這一特點對于逆轉(zhuǎn)已經(jīng)受損害的低血糖負調(diào)節(jié)控制作用有很大幫助，而這一調(diào)節(jié)作用與糖尿病的過度治療密切相關(guān)。所有用INGAP肽處理過的動物都沒有發(fā)現(xiàn)患高血糖病，而用鹽水處理的對照組的動物體內(nèi)都沒有觀察到胰島的生成。INGAP肽的應(yīng)用會誘導(dǎo)導(dǎo)管細胞的分化，這可以通過細胞對轉(zhuǎn)錄因子PDX-1的表達而得到證實(見圖5)。用生理鹽水處理的由STZ引起糖尿病的動物的胰島表現(xiàn)出嚴(yán)重的炎癥細胞侵入，并且會壞死。而用INGAP肽處理過的動物，炎癥狀況明顯降低，且其胰島也很健康(見圖6)。
圖4顯示用鏈脲霉素和INGAP肽依次處理過的C57BL/6J鼠的胰腺的免疫細胞化學(xué)特征。左上方的圖表明胰島仍然與部分輸導(dǎo)管上被胰島素抗體染色過的上皮細胞有聯(lián)系，這就證明了胰島素蛋白的正常存在和分布。左下方的圖表明同樣的胰島被胰增血糖素抗體和生長激素抑制素抗體染色后，胰島表層區(qū)的胰島細胞蛋白仍然表現(xiàn)出正常分布。右上方的圖顯示的是與H&E染色過的輸導(dǎo)管上新形成的胰島。右下方的圖顯示的是輸導(dǎo)管壁細胞上含胰島素的細胞。
實施例4 對鼠的31天研究(重復(fù)劑量)
對實驗鼠還進行了為期31天，每天INGAP肽的注射量為0，2，20和100(毫克/千克/天)的重復(fù)劑量毒性研究。在此研究中，分成了四個處理組和兩個恢復(fù)組，每個處理組由10只雄鼠和10只雌鼠組成，每個恢復(fù)組由5只雌鼠和5只雄鼠組成。實驗結(jié)束時，還收集了血樣和進行了尸體剖檢以便進行粗略和精微的觀察。并對每組中大約半數(shù)的動物進行了臨床病理學(xué)和血清水平方面的評價。對選擇的器官(腦、腎上腺、心臟、腎、肝、肺、胰腺和脾)進行了稱重并對相對器官重量進行了計算。胰腺中的一部分被分離并冷凍在液氮中以便評價胰島素含量，部分胰腺組織交給相關(guān)研究人員進行獨立的顯微觀察研究?；謴?fù)健康的實驗鼠在停止進行藥劑處理的28天后進行了相同的實驗處理。用于進一步的研究和潛在地與藥相關(guān)的異常發(fā)現(xiàn)的各種參數(shù)被評估以決定實驗的可重復(fù)性和潛在的臨床意義。
對實驗鼠進行31天連續(xù)的肌肉注射INGAP肽藥劑，在停止注射藥劑和其后的28天后治療的評價中，并沒有產(chǎn)生與本藥相關(guān)的副作用。隨著最高劑量注射次數(shù)的增加，在雄性和雌性實驗鼠的身上的注射位置觀察到了炎癥反應(yīng)，但是以同樣的劑量在恢復(fù)健康的鼠身上卻不再觀察到刺激反應(yīng)，這表現(xiàn)出了炎癥的可逆性。在該31天的實驗研究中發(fā)現(xiàn)，在一只高劑量處理的雄性鼠的脾臟內(nèi)發(fā)生骨髓外造血作用。在顯微鏡下觀察沒有發(fā)現(xiàn)發(fā)炎細胞滲透、水腫、骨疽或萎縮等跡象。非常突出的觀察結(jié)果就是，在與輸導(dǎo)管相關(guān)的組織和胰腺泡組織中小胰島數(shù)量的增加。在連續(xù)進行31天的藥劑作用后的兩小時后，實驗鼠體內(nèi)的血清中的INGAP水平就低于限制的數(shù)值。這些動物體內(nèi)觀察到的含胰島素的組織面積的增加可以衡量出藥理學(xué)活性(見圖7)。本實驗結(jié)果表明對CD-1鼠進行31天的藥劑作用時，無副作用的水平值(NOAEL)大于100毫克/千克。
實施例5 對狗的34天研究(重復(fù)劑量)還對小獵犬進行了為期34天的重復(fù)劑量的毒性實驗，每天肌肉注射INGAP肽的量分別為0，0.5，1.5和10(毫克/千克/天)。并獲得了根據(jù)免疫組織化學(xué)來定量β-細胞的胰腺組織，而這些胰腺組織分別取自34天治療完畢時的實驗鼠和治療完畢25天后恢復(fù)健康的實驗鼠的體內(nèi)。胰腺β-細胞隨著INGAP肽的使用量的增加而增加(見圖8)。這些結(jié)果表明在實驗研究的劑量下，對正常實驗犬進行INGAP肽的肌肉注射實驗獲得了生物學(xué)上比較重要的響應(yīng)。而且，對胰腺組織區(qū)域的更深入的研究沒有顯示出水腫、炎性細胞侵入、骨疽或萎縮等癥狀。
實施例6 人的臨床研究藥物的劑量通?；谒幬锕πШ蛯游锏乃幬锇踩匝芯?。以兩種劑量的INGAP肽為例，對I型或II型糖尿病患者進行治療。這兩種劑量分別為7.5毫克(對于60公斤體重的患者來講，0.125毫克/千克，或4.625毫克/平方米)和120毫克(對于60公斤體重的患者來講，1.6毫克/千克，或74毫克/平方米)。為了確定INGAP肽治療的效果，對以下參數(shù)進行了評價1.保持總胰島素的劑量，禁食葡萄糖水平降低大于35毫克/分升。
2.保持禁食葡萄糖水平在美國糖尿病協(xié)會(ADA)標(biāo)準(zhǔn)確定的范圍之內(nèi)，將胰島素的劑量降低25％。
3.禁食C-肽的量增至1納克/毫升，飲用SustacalBoost后的C-肽量增至2納克/毫升。
每一位患者都隨機的接受一次INGAP肽的肌肉注射。在評價藥物功效和安全性數(shù)據(jù)之后，患者可以根據(jù)醫(yī)生的判斷進一步給患者進行INGAP肽注射。
下表中簡要地概述了評估的部分列表，該評估是對接受INGAP或安慰劑治療的患者的評估。
表2評估表
C-肽刺激實驗C-肽刺激實驗是在禁食一夜，至少10小時后的第二天早上進行的。只有禁食葡萄糖指數(shù)在80至250毫克/分升之間時才可以進行該實驗?；颊咴趯嶒灥那耙惶焱砩峡梢苑弥委熖悄虿〉乃幬铮窃趯嶒灥脑缟现翆嶒炌耆Y(jié)束期間不能再服用。確定C-肽所需要采集的血樣應(yīng)該分別在Boost飲用之前和飲用之后的0.5小時、2小時和4小時立即抽取。Boost通過口服攝取。如果患者禁食的C-肽水平低于1.0納克/毫升，則認為此患者缺乏胰島素，患者的C-肽刺激的最大值低于2.0納克/毫升。
上述治療的結(jié)果顯示接受INGAP肽治療的患者表現(xiàn)出對糖的耐受性有所提高，禁食后葡萄糖水平有所降低，對胰島素的需求量下降，禁食后C-肽水平有所增加，和飲用Boost后的C-肽的水平有所增加。但是，用安慰劑進行治療的患者的狀況沒有顯示出這樣的改善。
除特別注明外，所有的量，包括數(shù)量、百分數(shù)、分數(shù)和比例都應(yīng)理解為具有“大約”的含義，數(shù)量的意義并不在于數(shù)字本身。
除特別注明外，定冠詞“一個”和“所述”表示“一個或多個”。
雖然對本發(fā)明的特定實施方案進行了圖示和描述，但對于本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員而言，他們在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下可以進行不同的改變和修訂。因此旨在在所附的權(quán)利要求書中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些改變和修訂。
序列表<110>A.I.維尼克(Vinik，Aaron I)L.羅森伯格(Rosenberg，Lawrence)G.皮騰格(Pittenger，Gary)D.泰勒-費西維克(Taylor-Fishwick，David)M.薩勒姆(Salem，Michael)S.莫蘭德(Mohrland，Scott)<120>治療糖尿病的組合物和方法<130>9016#L$<140>Not Yet Assigned<141>2002-09-24<150>US 60/329,330<151>2001-10-16<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>175<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>1Met Met Leu Pro Met Thr Leu Cys Arg Met Ser Trp Met Leu Leu Ser1 5 10 15Cys Leu Met Phe Leu Ser Trp Val Glu Gly Glu Glu Ser Gln Lys Lys20 25 30Leu Pro Ser Ser Arg Ile Thr Cys Pro Gln Gly Ser Val Ala Tyr Gly35 40 45Ser Tyr Cys Tyr Ser Leu Ile Leu Ile Pro Gln Thr Trp Ser Asn Ala50 55 60Glu Leu Ser Cys Gln Met His Phe Ser Gly His Leu Ala Phe Leu Leu65 70 75 80
Ser Thr Gly Glu Ile Thr Phe Val Ser Ser Leu Val Lys Asn Ser Leu85 90 95Thr Ala Tyr Gln Tyr Ile Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Ser His Gly100 105 110Thr Leu Pro Asn Gly Ser Gly Trp Lys Trp Ser Ser Ser Asn Val Leu115 120 125Thr Phe Tyr Asn Trp Glu Arg Asn Pro Ser Ile Ala Ala Asp Arg Gly130 135 140Tyr Cys Ala Val Leu Ser Gln Lys Ser Gly Phe Gln Lys Trp Arg Asp145 150 155 160Phe Asn Cys Glu Asn Glu Leu Pro Tyr Ile Cys Lys Phe Lys Val165 170 175<210>2<211>20<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Ile Gly Leu His Asp Pro Ser His Gly Thr Leu Pro Asn Gly Ser Gly1 5 10 15Trp Lys Trp Ser20<210>3<211>15<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>3Ile Gly Leu His Asp Pro Ser His Gly Thr Leu Pro Asn Gly Ser1 5 10 1權(quán)利要求
1.藥物組合物，所述藥物組合物包括具有至少十五種連續(xù)的氨基酸的多肽，所述多肽與哺乳動物胰島的天然再生蛋白有關(guān)，其中所述氨基酸序列為SEQ IDNO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3以及它們的片段，且其pH值為約4至約6。
2.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述組合物為冷凍干燥的粉末或溶液形式。
3.如前述任一項權(quán)利要求所述的藥物組合物，其中所述組合物的pH值為約4至約5。
4.如前述任一項權(quán)利要求所述的藥物組合物，其中所述多肽的形式選自藥學(xué)可接受的酯、鹽以及它們的混合物。
5.如前述任一項權(quán)利要求所述的藥物組合物，所述藥物組合物包括約0.1毫克至約300毫克的所述多肽。
6.如前述任一項權(quán)利要求所述的藥物組合物的使用，所述藥物組合物用于制造治療人類或其它動物所患的糖尿病的藥物。
7.如前述任一項權(quán)利要求所述的藥物組合物的使用，所述藥物組合物用于制造再生Langerhans胰島、胰腺β細胞或在哺乳動物中建立正常生理血糖調(diào)節(jié)的藥物。
8.如前述任一項權(quán)利要求所述的藥物組合物的使用，其中所述給藥頻率為每天一次、每天兩次、每天三次、每周一次、兩周一次、每月一次、連續(xù)輸液或它們的組合。
9.用于如前述任一項權(quán)利要求所述的使用的試劑盒，所述試劑盒包括1)權(quán)利要求1的藥物組合物；和2)用法說明。
全文摘要
本發(fā)明包括定量給養(yǎng)攝取法和與蛋白質(zhì)(INGAP)和INGAP肽相關(guān)聯(lián)的胰島再生的配方。本發(fā)明所公開的配方顯示出作為藥物組合物具有可接受的穩(wěn)定性。此外，此配方可以使功能性胰島再生。
文檔編號A61P3/10GK1723034SQ02820192
公開日2006年1月18日 申請日期2002年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月16日
發(fā)明者A·I·維尼克, L·羅森伯格, G·皮騰格, D·泰勒－費西維克, M·薩勒姆, S·莫蘭德 申請人:Gmp內(nèi)治療學(xué)股份有限公司