專利名稱：胸腺素強化的遺傳免疫方法
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背景技術：
慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染是導致慢性肝病、肝硬化和肝細胞癌的主要醫(yī)學難題。在大多數由輸血后導致的肝炎病例中，丙型肝炎病毒被推定是主要誘因。盡管已采取了措施改進捐血人庫的質量并且對所捐的血進行補測，但是在接受輸血的人中急性感染的發(fā)病率依然很高。在有急性HCV感染的患者中至少一半的患者會發(fā)展成慢性肝炎(結果顯示大約90％的患者是非甲非乙型肝炎(NANB))，并且在這一組患者中至少有20％會發(fā)展成肝硬化。
就阻止或延緩HCV相關疾病發(fā)展的目的而言，業(yè)界已對多種用于此項目的藥物進行了評價。目前關注的標準涉及干擾素α和病毒唑的使用。然而，相當數量的個體對這種治療無反應。遺傳免疫已顯示出增強對HCV結構蛋白和非結構蛋白廣泛基礎的細胞免疫應答。然而，按照Tokushige等人在1996年所提出的觀點來看，在幾個實驗動物模型中各種HCV構建物(construct)的生物學活性都很弱。
遺傳免疫法是一種對傳統(tǒng)的抗原-基疫苗(例如減毒的病毒或蛋白亞單位疫苗)的用途的新的替換方法(emerging alternative)。遺傳免疫法使用裸DNA免疫受體。該DNA在含義(sense)上是“裸的”，即它不需要任何為促進其進入細胞起作用的傳染性輸送媒介，例如病毒粒子。當給予裸DNA時，受體可表達質粒DNA編碼的蛋白，然后可刺激一個由細胞毒T細胞、輔助性T細胞和抗體組成的特定的免疫應答。使用DNA疫苗不需要純化用于接種的病原體或免疫保護的抗原，并且沒有毒性逆轉的可能，因為該DNA編碼單一的病毒蛋白。
使用多核苷酸用于免疫具有很多優(yōu)點，例如，可以使用任何由多核苷酸編碼的抗原進行免疫。而且，在天然的狀態(tài)下，編碼抗原的該多核苷酸被表達成“純”抗原并被正常宿主細胞修飾。而且，多核苷酸操作容易和便宜，并且其干品或其存在于一寬溫度范圍的溶液中都很穩(wěn)定。因此，這項技術對于發(fā)展高效亞單位疫苗很有價值。
誘導出的體液和/或細胞介導的免疫應答可以對例如細菌、病毒和真核微生物(例如寄生蟲)等病原因子的感染提供保護或預防性免疫。該預防性體液和/或細胞介導的免疫應答然后與病原體的傳染性或活性相互干擾，或限制其擴散或生長，導致對隨后由病原體帶來的免疫激發(fā)的防備性保護。免疫應答也可以抗擊涉及產生特定蛋白的細胞的疾病和病癥。
通過肌注的遺傳免疫已在各種動物中顯示出對抗許多病毒有效。例如，豚鼠抗2型單純皰疹病毒(HSV)感染的免疫(Boume等，1996)；小鼠抗流感病毒的免疫(Fu等，1997)；雞抗流感病毒的疫苗(Kodihalli等，1997)；以及哺乳動物和鳥類抗輪狀病毒(Herrmann等，美國專利No.5,620,896)。Daheshia等(1997)公開了將編碼IL-1的裸DNA單獨應用在表現(xiàn)出皰疹性基質角膜炎的動物的角膜上解決了這些動物受到的損害，使得損害癥狀緩解。
在例如美國專利No.5,830,876(Weiner等)中可以發(fā)現(xiàn)遺傳免疫的一般討論和其用途。
已發(fā)現(xiàn)得自胸腺的一族多肽免疫調節(jié)物—胸腺素，在淋巴細胞中引發(fā)成熟的(maturational)事件，增強T細胞功能并促進免疫缺陷的重建。胸腺素α1(THNα1)是一個分子量為3100的28個氨基酸的酸性多肽，具有有效的免疫活性，包括刺激α-和γ-干擾素產生、增加巨噬細胞遷移抑制因子產生、誘導T細胞標記物(markers)、IL-2受體的表達、以及提高T細胞輔助性細胞的活性。THNα1的分離、特性和用途已在例如美國專利No.4,079,127中描述。
在治療慢性HCV的嘗試中已將各種抗病毒劑用作單獨的治療劑，包括無環(huán)鳥苷、阿糖腺苷和阿糖胞苷。用這些抗病毒劑單獨治療通常不成功，由于這些藥劑高毒性或者導致最初抑制某些病毒復制，但不能持續(xù)長時間抑制病毒復制。見例如，Alexander等，1988。
仍然非常需要能有效而具有較少旁效應地攻擊病毒并調控免疫應答系統(tǒng)和降低復發(fā)率的對HCV的治療。
發(fā)明概述本發(fā)明描述了在一個對HCV的NS5蛋白的優(yōu)選實施方案中，α胸腺素在增強CD4+和CD8+對HCV的致免疫肽的細胞免疫應答的用途。增強對病毒和細胞蛋白的細胞免疫應答是困難的。本發(fā)明描述了α胸腺素的體內用途，其可以顯著地增強對HCV蛋白的抗原決定部位的細胞毒T細胞應答和增殖的T細胞應答。在一個優(yōu)選實施方案中，該胸腺素是胸腺素α1。DNA-基疫苗是一個新技術，而且與先前所有類型的疫苗接種都不相同(那些疫苗接種是基于蛋白、肽、或滅活病毒，所有都引起體液、或抗體-介導的免疫，而DNA-基疫苗則引起細胞介導的免疫)，因此α胸腺素增加疫苗的效力的事實對于DNA-基疫苗在HCV的治療和預防上提供了一種新的、未預料的改進。
附圖簡述

圖1為DNA-基免疫機制的說明；圖2為丙型肝炎病毒(HCV)基因組的示意性表示；圖3顯示與編碼NS5的多核苷酸一起給予5μg胸腺素α1 i.p.，在3個激發(fā)濃度(0.1μg、0.5μg和1μg)下對于T細胞增殖應答的影響；圖4顯示在2個淋巴細胞效應細胞/靶細胞(L/T)比率上，與編碼NS5的多核苷酸一起給予5μg胸腺素α1 i.p.，對于細胞毒應答的影響。
發(fā)明詳述本發(fā)明描述了α胸腺素與DNA-基(或“遺傳的”)免疫結合以顯著增強對HCV的細胞免疫應答的用途。一個優(yōu)選的實施方案提供強化的帶有胸腺素α1的DNA-基疫苗(thymalfasin)。本發(fā)明在預防性疫苗和治療性疫苗的發(fā)展上具有廣泛的含義，并在對伴隨DNA-基免疫的病毒和細胞蛋白的細胞免疫應答上提供了顯著的改進。
將編碼致免疫的HCV肽、多肽或蛋白的多核苷酸與一種或多種α胸腺素聯(lián)合體內直接給藥于動物。該多核苷酸編碼一多肽，該多肽與一作為靶的致免疫的HCV蛋白共有至少一個表位(epitope)。通過個體的細胞表達該多核苷酸以形成致免疫的靶蛋白，該靶蛋白引起廣泛基的(broad based)抗HCV的免疫應答。HCV基因組編碼2個外殼蛋白(E1和E2)和6個結構蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。圖2。編碼這些病毒蛋白的任何的多核苷酸、或其結合或其片段都可用于本發(fā)明。
本發(fā)明可應用天然的(即自然產生的)α胸腺素以及合成的α胸腺素和重組的α胸腺素，該重組的α胸腺素具有天然α胸腺素的氨基酸序列、與其基本相同的氨基酸序列、或來自于它的簡并的氨基酸序列、以及它們的生物學上的活性同類物，這些同類物具有與天然α胸腺素基本相同的生物活性的取代的、缺失的、延長的、置換的和甚至修飾的序列。優(yōu)選的胸腺素是胸腺素α1。
α胸腺素的分離、特性和用途已在例如美國專利No.4,079,127、美國專利No.4,353,821、美國專利No.4,148,788和美國專利No.4,116,951中描述。引起需要程度的強化效力的DNA-基疫苗所需要的α胸腺素的量可以通過常規(guī)劑量滴定實驗來確定。已發(fā)現(xiàn)當以高至16mg/kg體重/天的劑量給藥時，α胸腺素對于人類是安全的。α胸腺素的優(yōu)選劑量是在0.001mg/kg體重/天至10mg/kg體重/天的范圍內，最優(yōu)選的劑量是大約0.02mg/kg體重/天。
本發(fā)明的多核苷酸序列為DNA或RNA序列，該序列可操作地連接于轉錄調節(jié)子的序列，編碼抗原的/致免疫的HCV多肽。這些序列可以與編碼控制這些多肽表達的調節(jié)蛋白的其他多核苷酸序列聯(lián)合使用。該調節(jié)蛋白可以通過與基因組DNA結合而發(fā)揮作用，以調節(jié)其轉錄；或者，它可以通過與信使RNA結合而發(fā)揮作用，以增加或降低其穩(wěn)定性或翻譯效率。
術語“可操作地連接于轉錄或翻譯調節(jié)序列”是指一多肽編碼序列和最小的轉錄和翻譯控制序列以這樣一種方式連接當適當的分子(例如，轉錄激活子蛋白)連接在該調節(jié)序列時允許多肽表達。當一多核苷酸具有由一靶細胞表達所需的所有遺傳信息時，例如，啟動子等等，它操作地編碼一多肽。術語“啟動子”或“啟動子序列”這里指足以指導轉錄的最小的序列。通常通過一起始位點和一終止位點將一DNA多核苷酸序列結合以形成一DNA轉錄單位，并且該DNA多核苷酸被轉錄以產生一初級轉錄產物。
在體內輸送到細胞的多核苷酸材料可以采用任何數量的型式，并且本發(fā)明不限于對任何特定的HCV多肽進行編碼的任何特定的多核苷酸，盡管編碼NS5蛋白的多核苷酸、或其片段是優(yōu)選的。在文獻中已報道了含有編碼HCV抗原或免疫原的基因的質粒，并且本領域技術人員可以容易地得到(見例如，Tokushige等，1996)。
多核苷酸可以編碼一個或多個抗原，例如來自2個或更多的不同病毒蛋白的抗原?；蛘撸摱嗪塑账峥梢园?個或更多的不同DNA序列，一個序列編碼一抗原，而另一個(或幾個)可以編碼是或不是抗原的多肽。例如，載體(vector)可以編碼2個(或多個)HCV抗原。在另一個實施方案中，另一個(或幾個)多肽可以發(fā)揮增強抗HCV的免疫應答的作用(例如，輔助表位、細胞因子、載體多肽、霍亂毒素亞單位、或其他免疫刺激劑)。
可以將該多核苷酸另外插入包括用于多核苷酸的表達的序列的載體中。當2個或多個多肽編碼DNA序列存在于一個載體中時，為了表達2個或多個非融合的多肽，每個抗原編碼DNA序列的轉錄可以被來自其自身的啟動子指導。或者，一個啟動子可以驅動2個或多個抗原編碼DNA序列的表達，這些抗原編碼DNA序列互相結合在框架中以表達一融合蛋白。
在這些方法中使用的多核苷酸可以是不與宿主細胞的基因組結合的序列。這些多核苷酸可以是非復制DNA序列，或在遺傳上設計成缺乏基因組結合能力的特別復制序列?？梢栽诰哂写龠M核酸攝取或恢復免疫系統(tǒng)細胞至接種位點的佐劑或其他物質存在下，將該多核苷酸給予患者。應當理解的是，該多核苷酸本身可通過由宿主細胞提供的轉錄因子、或由DNA轉錄單位提供的轉錄因子在宿主細胞中表達。
根據本發(fā)明的方法，可表達的DNA和mRNA都可被輸送到細胞中形成其中的一多肽翻譯產物。如果該核酸包含適當的控制序列，它們將指導相關地大量的被編碼蛋白的合成。
致免疫的多肽的劑量可以通過臨床醫(yī)生或獸醫(yī)在動物模型上使用或其他本領域技術人員熟知的測試系統(tǒng)容易地確定。制劑將包括在水溶液中的有效量的DNA。給予的DNA的量取決于例如進行疫苗接種的患者的年齡、體重和生理條件等因素。DNA的量也取決于患者的免疫系統(tǒng)合成抗體的能力，以及需要保護的程度。可以由本領域普通技術人員通過常規(guī)試驗建立劑量反應曲線而容易地建立有效劑量。優(yōu)選的劑量范圍是在1μg/kg患者體重至1mg/kg患者體重之間?？梢酝ㄟ^一次給予該DNA免疫患者，或者通過多次給藥?；颊呖梢孕枰啻谓o藥以維持對特定病原體的免疫狀態(tài)。
構建用于成功轉化的異種多核苷酸的方法和組合物是本領域技術人員熟知的，并且可以使用相同的構建組合物和方法產生這里使用的多核苷酸。多核苷酸的具體的組合物不是本發(fā)明的重點，而且本發(fā)明不依賴于使用的具體的轉化多核苷酸的組合物。多核苷酸的適當的成分包括啟動子、多腺苷酸化序列、終止信號、拼接信號、可選擇的標記、報道基因、增強子、病毒復制子、內含子、和細菌質粒序列都是本領域熟知的。Sambrook等(1989)提供了異種多核苷酸構建的適當的方法。
可以通過多種已知的方法產生多核苷酸。例如，可以將編碼一預選的抗原的DNA插入一表達載體中(例如見，Sambrook等(1989))。隨著自動核酸合成設備的應用，當核酸序列已知時可以直接合成DNA，或者通過PCR、克隆和發(fā)酵的結合合成DNA。而且，當預選的多核苷酸的序列已知時，可以推出該核苷酸合適的克隆序列。
當多核苷酸是mRNA時，可以在體外從相應的DNA中容易地制備。例如，在單獨的核糖核苷三磷酸鹽存在下，使用噬菌體RNA多聚酶SP6、T3或T7從DNA模板制備mRNA的傳統(tǒng)技術。合適的噬菌體啟動子，例如復制位點的T7原點位于要轉錄的基因的模板DNA直接上游。以這種方式使用T7的系統(tǒng)是公知的，并且在文獻中有描述。
本發(fā)明的另一個方面涉及一免疫組合物，當其被導入一個其中能夠誘導或具有誘導的免疫應答的個體時，該免疫組合物在這個個體中誘導對由此編碼的HCV蛋白的免疫應答，其中該組合物包括編碼并表達一個或多個HCV的抗原/免疫原的多核苷酸，與一個或多個α胸腺素結合。該免疫應答可以用于治療或預防，并且可以以抗體免疫或細胞免疫的形式，例如由CTL或CD4+T細胞引起的免疫。
實施例1質粒構建作為病毒基因來源，使用包含HCV的全長開放閱讀框(ORF)稱為pBRTM/HCV1-3011的質粒來克隆進表達載體(Grakoui等人1993)。使用下述引物在插入設計的起始和終止密碼子和限制性內切酶位點后PCR克隆構建pAp031-Ns5對于NS5，5’T CAG TCT AGA ATG TCC GGC TCC TGG CTAAGG GA-3’(XbaI)[SEQ ID No.1]和5’-A GCT ACG CGT TCA CCG GTT GGGGAG GAG GT-3’(MluI)[SEQ ID No.2]。PCR擴增后，使用高保真PCR系統(tǒng)(Bochringer Mannheim，Indianapolis，IN)，將cDNA片段插入含有勞氏肉瘤病毒增強子成分和CMV啟動子的質粒表達載體pAp031中。將構建體轉染進入DH5α細胞，接著通過用2×氯化銫離心或者用使用Endofree緩沖系統(tǒng)的Qiagen Giga試劑盒(Santa Clara，CA)純化質粒DNA。通過使用標準方法的測序分析證實編碼非結構蛋白的cDNA的正確插入。為建立作為CTL分析的靶細胞的穩(wěn)定的NS5表達細胞系，也將非結構蛋白編碼基因片段克隆入帶有新霉素選擇標記的pcDNA3和pcDNA3.1/Zeo(-)表達載體(Invitrogen，San Diego，CA)。將XbaI和MluI片段NS5亞克隆進Litmus-38載體的NheI/MluI位點，并且連接到pcDNA3和pcDNA3.1/Zeo(-)的EcoRI/XhoI多克隆位點。將含有NS4的HbaI和BamHI片段連接到Litmus-29(New England Biolabs)，用KpnI和EcoRI重切，然后連接到pcDNA3載體。質粒定名為pcDNA3.1/Zeo(-)-NS5。將編碼鼠IL-2的DNA表達質粒(pcD/3-IL2)克隆并如前述純化(Geissler等1997a，1997b，1997c)。
遺傳免疫為增強質粒DNA的細胞攝取，用總量100μl的0.25％hupivacaine在多位點注射Balb/c小鼠的四頭肌。4天后，將質粒構建物以100μl 0.9％NaCl的終體積在5個不同位點注射到相同區(qū)域。2周后，在相對的腿上用質粒DNA加強小鼠。在最終免疫10天后殺死小鼠。將小鼠分成3組，每組5只動物。組1＝用100μg模擬DNA免疫小鼠；組2＝用50μg pAp031NS5和50μg模擬DNA免疫小鼠；組3＝用50μg pAp031NS5和50μg模擬DNA免疫小鼠，并每周2次接受5μg胸腺素α1 i.P.。將動物隔2周免疫3次，并在最后免疫10天后進行研究。
T細胞增殖分析用異氟烷(Aerrane，Anaquest，NJ)麻醉小鼠，通過眼球后穿刺去除血液并收獲脾細胞。在37℃ 8.3％NH4Cl/0.17mol/L Tris(pH7.4)中保溫10分鐘除去紅血細胞。用96孔平底板以每孔5×105細胞在含10％FCS的完全培養(yǎng)基(Dulbeccos Modified Eagle’s Medium，Mediatech，Washington，DC)中一式三份培養(yǎng)脾細胞。以不同濃度(1、5、10μg/ml)的重組NS5刺激脾細胞。最后加入2-巰基乙醇至終濃度50μmol/L。作為抗原特異性的對照，用10μg/ml的重組的人絨毛膜促性腺激素的β-亞單位刺激效應細胞，重組的人絨毛膜促性腺激素的β-亞單位由該細胞分泌并已顯示其是一種強的T細胞免疫原(Geissler等，1997d)。刺激脾細胞3天。加入[3H]-胸苷(1μCi/孔)后，將細胞培養(yǎng)18小時。收獲細胞后測定與DNA結合的[3H]-胸苷。圖3。用背景活性校正結合的放射活性(Δcpm)。
細胞毒性分析將來自免疫的小鼠的脾細胞懸浮在含10％FCS和50μmol/L2-巰基乙醇的完全DMEM中；然后體內免疫5天后將細胞用于細胞毒活性分析。用20，000rad處理后，以5U/ml的濃度加入重組鼠IL-2一次，并將應答(responder)細胞(4×107)與6.25×106穩(wěn)定表達NS5的同源細胞共同培養(yǎng)。培養(yǎng)5天后，收獲細胞毒效應淋巴細胞群。用靶細胞系的51Cr-標記的SP2-NS5細胞在96孔圓底板中進行4小時51Cr-釋放實驗。以1∶10和1∶100的淋巴細胞效應細胞∶靶細胞(L/T)比例進行CTL分析。如下計算細胞毒百分數 實驗釋放代表在效應細胞存在下每分鐘由靶細胞釋放的平均數?？傖尫糯碛?％TritonX-100的靶細胞全部溶胞后釋放的放射活性。圖4。
自然釋放代表存在于僅得自靶細胞的培養(yǎng)基中的放射活性。
統(tǒng)計分析為比較不同組間的結果，我們使用了非參數的Mann0Whitney U試驗。P＜0.05認為具有統(tǒng)計學上的顯著性。根據CD4+和CD8+T細胞應答的P值數目分別得自所有的用于刺激的重組NS5濃度和E:T值。
顯示在圖3和圖4中的結果證明通過在DNA-基免疫治療中α胸腺素的共同給予可以獲得免疫應答的明顯改善。共同給予胸腺素增加CD4對所有3個激發(fā)濃度的增殖應答幾乎達100％。圖3。通過α胸腺素的共同給予，細胞毒性百分數也增加達100％，或更多。圖4。
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權利要求
1.使對丙型肝炎病毒感染易感的患者免于這種感染的免疫方法，包括結合一個或多個α胸腺素給所述患者給藥一編碼了一個或多個丙型肝炎病毒肽的多核苷酸。
2.權利要求1的方法，其中所述多核苷酸編碼一個或多個丙型肝炎病毒外殼蛋白。
3.權利要求1的方法，其中所述多核苷酸編碼一個或多個選自NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的丙型肝炎病毒蛋白。
4.權利要求3的方法，其中所述多核苷酸編碼一個或多個NS5蛋白。
5.權利要求1-4的任何一個的方法，其中所述α胸腺素為胸腺素α1。
6.權利要求1-4的任何一個的方法，其中所述胸腺素以0.001mg/kg體重/天至10mg/kg體重/天的劑量給藥。
7.權利要求6的方法，其中所述胸腺素以約0.02mg/kg體重/天的劑量給藥。
全文摘要
本發(fā)明描述了胸腺素對強化對丙型肝炎病毒的細胞免疫應答的用途。公開了使對丙型肝炎病毒感染易感的患者免于這種感染的免疫方法，包括與一個或多個α胸腺素結合給予所述患者一編碼一個或多個丙型肝炎病毒肽的多核苷酸。還公開了適于抗丙肝病毒免疫的組合物，包括一個或多個編碼一個或多個丙肝病毒肽的多核苷酸，以及一個或多個胸腺素。
文檔編號A61K48/00GK1604789SQ02821277
公開日2005年4月6日 申請日期2002年10月28日 優(yōu)先權日2001年10月26日
發(fā)明者杰克·R·萬茲 申請人:羅得島醫(yī)院