專(zhuān)利名稱(chēng)：修飾的抗－TNFα抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及尤其是向人施用的且特別是用于治療用途的多肽。該多肽是修飾的多肽，所述修飾導(dǎo)致該多肽當(dāng)給予人被試者時(shí)具有減少的引起免疫反應(yīng)的傾向。本發(fā)明具體地涉及對(duì)人腫瘤壞死因子α(TNFα)反應(yīng)性抗體進(jìn)行修飾，從而導(dǎo)致當(dāng)用于體內(nèi)時(shí)與任何非修飾的對(duì)應(yīng)物相比基本無(wú)免疫原性或具低的免疫原性的抗-TNFα抗體。
背景技術(shù)：
有許多關(guān)于治療性蛋白質(zhì)的功效受對(duì)該治療性蛋白質(zhì)有害的免疫反應(yīng)限制的例子。幾種小鼠單克隆抗體已顯示出有希望用作許多人類(lèi)疾病情形的治療劑，但在某些情況下由于引起顯著程度的人抗-鼠抗體(HAMA)反應(yīng)而失敗[Schroff，R.W.等人(1985)Cancer Res.45879-885；Shawler，D.L.等人(1985)J.Immunol.1351530-1535]。對(duì)于單克隆抗體已發(fā)展了許多技術(shù)來(lái)試圖減少HAMA反應(yīng)[WOA8909622；EPA0239400；EPA0438310；WOA9106667；EPA0699755]。這些重組DNA方法通常減少最終抗體構(gòu)建體中小鼠的遺傳信息，同時(shí)增加最終構(gòu)建體中人的遺傳信息。但是，在幾種情況下，結(jié)果所得的“人源化”抗體仍然在患者中引起免疫反應(yīng)[Issacs，J.D.(1990)Sem.Immunol.2449，456；Rebello，P.R.等人(1999)Transplantation681417-1420]。
抗體不是唯一一類(lèi)作為治療劑給藥而可產(chǎn)生免疫反應(yīng)的多肽分子。即使人來(lái)源的且與人體內(nèi)存在的蛋白質(zhì)具有相同氨基酸序列的蛋白質(zhì)也可誘導(dǎo)人體內(nèi)免疫反應(yīng)。顯著的例子包括粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子[Wadhwa，M.等人(1999)Clin.Cancer Res.51353-1361]和干擾素α2[Russo，D.等人(1996)Bri.J.Haem.94300-305；Stein，R.等人(1988)New Engl.J.Med.3181409-1413]等的治療應(yīng)用。
誘導(dǎo)免疫反應(yīng)關(guān)鍵的是蛋白質(zhì)中肽的存在，該肽可通過(guò)在II型MHC分子上呈遞而刺激T-細(xì)胞的活性，即所謂的“T-細(xì)胞抗原決定部位”。這種T-細(xì)胞抗原決定部位通常定義為具有與II型MHC分子結(jié)合的能力的任何氨基酸殘基序列?！癟-細(xì)胞抗原決定部位”含蓄地指如下抗原決定部位，該抗原決定部位當(dāng)與MHC分子結(jié)合時(shí)可由T細(xì)胞受體(TCR)識(shí)別，且至少在原則上可通過(guò)與TCR嚙合導(dǎo)致這些T-細(xì)胞活化以促進(jìn)T-細(xì)胞反應(yīng)。
II型MHC分子是一組在輔助T-細(xì)胞的選擇和活化中起重要作用的高度多態(tài)的蛋白質(zhì)。人類(lèi)DR類(lèi)白細(xì)胞抗原(HLA-DR)是該組蛋白質(zhì)的主要同種型，然而同種型HLA-DQ和HLA-DP也發(fā)揮相似的功能。本發(fā)明可應(yīng)用于對(duì)呈遞在DR、DP或DQII型MHC環(huán)境中的T-細(xì)胞抗原決定部位的檢測(cè)。在人類(lèi)群體中，每個(gè)個(gè)體攜帶2-4個(gè)DR等位基因、2個(gè)DQ和2個(gè)DP等位基因。許多DR分子的結(jié)構(gòu)已得到了解析，這些結(jié)構(gòu)顯示為具有許多疏水口袋的開(kāi)放式(open-ended)肽結(jié)合溝，該疏水口袋與肽的疏水殘基(口袋殘基)結(jié)合[Brown等人Nature(1993)36433；Stern等人(1994)Nature368215]。確定不同II型MHC分子同種異型的多態(tài)性造成了肽結(jié)合溝中多種多樣的不同肽結(jié)合表面，且在群體水平上確保了能夠最大的靈活度地識(shí)別外源蛋白質(zhì)及對(duì)病原體生物產(chǎn)生免疫反應(yīng)。
對(duì)治療性蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)通過(guò)II型MHC肽呈遞途徑進(jìn)行。在此，外源蛋白質(zhì)被吞入并經(jīng)加工以與DR、DQ或DP類(lèi)的II型MHC分子結(jié)合進(jìn)行呈遞。II型MHC分子是由專(zhuān)業(yè)的抗原呈遞細(xì)胞(APC)，如巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞等表達(dá)的。II型MHC肽復(fù)合物與T-細(xì)胞表面上關(guān)連T-細(xì)胞受體的結(jié)合，加上某些其他共同受體如CD4分子的交互結(jié)合可誘導(dǎo)T-細(xì)胞內(nèi)的活化狀態(tài)。該活化導(dǎo)致細(xì)胞因子的釋放，從而進(jìn)一步活化其他淋巴細(xì)胞如B細(xì)胞以產(chǎn)生抗體，或者活化T殺傷細(xì)胞而形成完全的細(xì)胞免疫反應(yīng)。
T-細(xì)胞抗原決定部位的鑒定是抗原決定部位消除的第一步，然而在本領(lǐng)域中幾乎沒(méi)有清楚的案例將鑒定抗原決定部位和去除抗原決定部位整合在單個(gè)方案中。WO98/52976和WO00/34317講授了鑒定多肽序列的計(jì)算穿線(xiàn)(computational threading approach)方法，該多肽序列具有與人II型MHC DR同種異型亞型結(jié)合的潛力。在這些講授中，預(yù)測(cè)的T-細(xì)胞抗原決定部位通過(guò)在目的蛋白質(zhì)中應(yīng)用合理的氨基酸替代而去除。然而利用該方案和其他鑒定抗原決定部位的基于計(jì)算的程序[Godkin，A.J.等人(1998)J.Immunol.161850-858；Sturniolo，T.等人(1999)Nat.Biotechnol.17555-561]，預(yù)測(cè)能夠與II型MHC分子結(jié)合的肽可能并不會(huì)在所有情況下，特別是在體內(nèi)(由于加工途徑或其他現(xiàn)象)發(fā)揮T-細(xì)胞抗原決定部位的功能。此外，這些預(yù)測(cè)T-細(xì)胞抗原決定部位的計(jì)算方法通常不能夠預(yù)測(cè)具有DP或DQ限制性的抗原決定部位。
除計(jì)算技術(shù)之外，存在測(cè)量合成的肽與II型MHC分子結(jié)合能力的體外方法。一種示例性的方法應(yīng)用具有限定的MHC同種異型的B-細(xì)胞系作為II型MHC結(jié)合表面的來(lái)源，且可應(yīng)用于II型MHC配體的鑒定中[Marshall K.W.等人(1994)J.Immunol.1524946-4956；O’Sullivan等人(1990)J.Immunol.1451799-1808；Robadey C.等人(1997)J.Immunol.1593238-3246]。然而，這種技術(shù)不適用于篩選可針對(duì)廣泛多樣的MHC同種異型的多重潛在抗原決定部位，且它們也不能證實(shí)結(jié)合的肽能否發(fā)揮T-細(xì)胞抗原決定部位的功能。
最近采用重組MHC分子與合成的肽的可溶性復(fù)合物的技術(shù)已得到應(yīng)用[Kern，F(xiàn).等人(1998)Nature Medicine4975-978；Kwok，W.W.等人(2001)TRENDS in Immunol.22583-588]。這些試劑和方法可用于鑒定來(lái)自人或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物被試者的外周血液樣品中是否存在能夠結(jié)合特定的MHC-肽復(fù)合物的T-細(xì)胞克隆，但這些方法和試劑也不適用于篩選可針對(duì)廣泛多樣的MHC同種異型的多重潛在抗原決定部位。
T-細(xì)胞活化的生物學(xué)測(cè)定法可提供實(shí)際的選擇方案，通過(guò)該方案可讀出所檢測(cè)的肽/蛋白質(zhì)序列引起免疫反應(yīng)的能力。該類(lèi)方法的例子包括Petra等人的工作，該工作對(duì)細(xì)菌蛋白質(zhì)葡萄球菌激酶應(yīng)用T-細(xì)胞增殖測(cè)定，隨后用合成的肽刺激T-細(xì)胞系以對(duì)抗原決定部位進(jìn)行作圖[Petra，A.M.等人(2002)J.Immunol.168155-161]。類(lèi)似地，應(yīng)用合成的破傷風(fēng)毒素蛋白質(zhì)的肽進(jìn)行的T-細(xì)胞增殖測(cè)定導(dǎo)致對(duì)毒素中免疫優(yōu)勢(shì)抗原決定部位的確定[Reece J.C.等人(1993)J.Immunol.1516175-6184]。WO99/53038公開(kāi)了所測(cè)試蛋白質(zhì)的T-細(xì)胞抗原決定部位可用分離的人免疫細(xì)胞亞群進(jìn)行確定的方法，其中細(xì)胞分離后，促進(jìn)其在體外分化并在合成的目的肽存在時(shí)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，在培養(yǎng)的T-細(xì)胞中對(duì)任何誘導(dǎo)的增殖進(jìn)行測(cè)量。相同技術(shù)也由Stickler等人[Stickler，M.M.等人(2000)J.Immunotherapy23654-660]描述，其中在兩種情況下該方法應(yīng)用于在細(xì)菌枯草桿菌蛋白酶中探測(cè)T-細(xì)胞抗原決定部位。這種技術(shù)需要仔細(xì)地應(yīng)用細(xì)胞分離技術(shù)和利用多種細(xì)胞因子補(bǔ)充物進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)以便獲得想要的免疫細(xì)胞亞群(樹(shù)突細(xì)胞、CD4+和/或CD8+T-細(xì)胞)，且不利于應(yīng)用多個(gè)供體樣品的快速通量篩選。
如上所述，由此期望從給定的原則上有治療價(jià)值但最初為免疫原性的肽、多肽或蛋白質(zhì)中鑒定并去除或至少減少T-細(xì)胞抗原決定部位。這種治療上有價(jià)值的分子之一是對(duì)腫瘤壞死因子α(TNFα)具有結(jié)合特異性的單克隆抗體。本發(fā)明優(yōu)選的單克隆抗體是描述于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,284,471中的抗體cA2的修飾形式。在此處將抗體cA2稱(chēng)為本發(fā)明的“親代”抗體。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供對(duì)人TNFα具有結(jié)合特異性的親代鼠源單克隆抗體的修飾形式，該修飾形式去除了一個(gè)或多個(gè)T細(xì)胞抗原決定部位。TNFα參與介導(dǎo)許多病理學(xué)狀況，如Crohn氏病、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和內(nèi)毒素性或心血管性休克。本發(fā)明修飾的抗體預(yù)期可在這些病癥和TNFα作為病理生理學(xué)的顯著成分的其他疾病中具有治療用途。
cA2抗體不是對(duì)TNFα具有結(jié)合特異性的唯一抗體。各種具有類(lèi)似特異性的多克隆和單克隆抗體制品是本領(lǐng)域中公知的。例子包括公開(kāi)于EP0212489、EP0218868、EP0288088和WO91/02078中的抗-TNFα制品。對(duì)重組人TNFα特異的嚙齒動(dòng)物或鼠類(lèi)單克隆抗體的其它例子已描述于文獻(xiàn)中[參見(jiàn)如Liang等人(1986)Biochem.Biophys.Res.Comm.137847-854；Meager等人(1987)，Hybridoma6305-311；Fendly等人(1987)，Hybridoma6359-369；Bringman等人(1987)，Hybridoma6489-507；Hirai等人(1987)J.Immunol.Meth.9657-62和Moller等人(1990)，Cytokine2162-169]。這些抗體的一些能夠在體外中和TNFα的作用并已用于發(fā)展對(duì)TNFα的免疫測(cè)定或用于重組TNFα的純化。通常，但與抗體cA2相反，這些抗體尚未被開(kāi)發(fā)用于人體內(nèi)實(shí)施診斷和治療。
然而已用鼠抗-TNFα抗體在人被試者中進(jìn)行了臨床研究。在14個(gè)接受了單一劑量的鼠抗-TNFα抗體的嚴(yán)重膿毒性休克患者中，7個(gè)由于治療性鼠抗體的免疫原性而對(duì)治療物產(chǎn)生了人抗-鼠抗體反應(yīng)。[Exley，A.R.等人(1990)，Lancet3351275-1277]。這種免疫原性可使得正在接受鼠抗-TNFα抗體的診斷或治療的患者中的治療無(wú)效。
在這點(diǎn)上，Adair等人[EP0927758]描述了重組抗體分子，該重組抗體分子包括具有人恒定區(qū)序列的抗體以及通過(guò)將互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)移植在修飾的人抗體構(gòu)架序列上形成的抗體。這種抗體和人源化抗體聲稱(chēng)保持了對(duì)人TNFα□的特異性且可用于診斷和治療中。
抗體cA2的臨床應(yīng)用由Le等人[US5,919,425]描述，Le等人詳細(xì)描述了用cA2治療TNFα介導(dǎo)的疾病的方法，該cA2事實(shí)上是命名為A2的最初鼠單克隆抗體的嵌合形式。類(lèi)似地，F(xiàn)eldmen等人[US6,270,766]描述了相同抗體與重度骨髓抑制劑氨甲蝶呤的組合療法在治療關(guān)節(jié)炎和Crohn氏病中的應(yīng)用。
目前用該抗體已進(jìn)行了大量臨床試驗(yàn)，該抗體得到了化合物名稱(chēng)“infliximab”，且在一些地區(qū)以REMICADE作為商品名銷(xiāo)售。該抗體已被證明在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和Crohn氏病的治療中具有一定程度的治療功效，并已在美國(guó)和歐洲得到用于Crohn氏病的管理批準(zhǔn)。該抗體是用重組技術(shù)生產(chǎn)的，且如上文所提出的，該抗體是“嵌合的”，從而意味著抗體的恒定區(qū)由源自人恒定區(qū)基因的序列組成，因此減少了鼠源蛋白質(zhì)序列的貢獻(xiàn)。盡管如此，Crohn氏病治療中高達(dá)13％的患者顯示出對(duì)治療性抗體的免疫反應(yīng)[Mani R.N.等人(1998)Arthritis Rheum.411552-1563；Elliot M.J.等人(1994)Lancet3441105-1110；Targan S.R.等人(1997)N.Engl.J.Med.3371029-1035；Present D.H.等人(1999)N. Engl.J.Med.3401398-1405]。
因此需要具有增強(qiáng)性質(zhì)，尤其在蛋白質(zhì)的生物學(xué)性質(zhì)中有改善的抗-TNFα抗體類(lèi)似物。在這一點(diǎn)上，非常期望的是提供在人被試者中不具有或具有減少的誘導(dǎo)免疫反應(yīng)潛力的抗-TNFα抗體。這種蛋白質(zhì)預(yù)期在人被試者中將顯示增加的循環(huán)時(shí)間，且在慢性或復(fù)發(fā)性疾病情形中，如在許多抗-TNFα抗體適應(yīng)癥的情況中將是特別有利的。本發(fā)明提供了預(yù)期顯示增強(qiáng)的體內(nèi)性質(zhì)的抗-TNFα抗體修飾形式。
本發(fā)明的一個(gè)特定的目的是提供修飾的抗-TNFα抗體，其中免疫特征通過(guò)減少潛在T-細(xì)胞抗原決定部位的數(shù)目而被修飾。
本發(fā)明公開(kāi)了在抗-TNFα抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)序列中鑒定的序列，該序列由于其II型MHC結(jié)合潛力而是潛在的T細(xì)胞抗原決定部位。
本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了在抗-TNFα抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)中鑒定的序列，該序列由于在作為合成肽呈遞給體外培養(yǎng)的人外周血單核細(xì)胞(PBMC)群體時(shí)能夠誘導(dǎo)該P(yáng)BMC細(xì)胞的增殖反應(yīng)而是潛在的T細(xì)胞抗原決定部位。這些信息使得能夠構(gòu)建存在于該抗體可變區(qū)中的T-細(xì)胞抗原決定部位的圖譜，且提供了從分子中去除T-細(xì)胞抗原決定部位所必需的關(guān)鍵信息。
盡管其他人已提供了包括嵌合[US，5,919,425]和人源化[EP0927758]形式的抗-TNFα抗體分子，但這些講授內(nèi)容中無(wú)一認(rèn)識(shí)到T細(xì)胞抗原決定部位對(duì)蛋白質(zhì)免疫原性性質(zhì)的重要性，也無(wú)一設(shè)想到根據(jù)本發(fā)明方案以特定且有控制的方式直接影響該性質(zhì)。
發(fā)明概述和描述本發(fā)明提供了修飾的抗體，其中免疫特征通過(guò)減少或去除潛在T-細(xì)胞抗原決定部位的數(shù)目而被修飾。
本發(fā)明優(yōu)選的鼠源非修飾的“親代”單克隆抗體在此處指描述于美國(guó)專(zhuān)利No.6,284,471中的抗體cA2。
本發(fā)明公開(kāi)了在cA2重鏈和輕鏈的可變區(qū)序列中鑒定的序列，該序列由于其II型MHC結(jié)合潛力而是潛在的T細(xì)胞抗原決定部位。
本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了在人體中具有免疫原性的抗體V-區(qū)序列的主要區(qū)域，從而提供了對(duì)該序列進(jìn)行修飾以消除或減少這些位點(diǎn)的免疫原性效力所必需的關(guān)鍵信息。
在一方面，本發(fā)明提供了對(duì)單克隆抗體cA2所識(shí)別的抗原具有特異性的修飾的抗體分子，其中對(duì)該cA2抗體可變區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸進(jìn)行替代以減少I(mǎi)I型MHC對(duì)源自該區(qū)域的肽的識(shí)別。
在另一方面，本發(fā)明提供了在人體中具有減少的免疫原性潛力的變體單克隆抗體，該變體在cA2抗體V-區(qū)中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代以消除或減少該V-區(qū)域中可以作為II型MHC配體或能夠刺激T-細(xì)胞的肽片段。
在本發(fā)明另一方面提供了在人體中具有減少的免疫原性潛力的變體單克隆抗體，該變體包含重鏈和輕鏈V-區(qū)的組合，所述組合包含選自Vh1/Vk1、Vh1/Vk5、Vh1/Vk8、Vh5/Vk12和Vh8/Vk5的氨基酸序列。
最優(yōu)選的是提供特征在于具有V-區(qū)結(jié)構(gòu)域Vh5/Vk12組合的抗體，但也可以考慮如上文所列的V-區(qū)成分的其他組合。
上文所列的Vh和Vk序列的序列完整地詳細(xì)描述于下面分項(xiàng)概述及圖8中，圖8也給出了如在此處所用的SEQ ID No分配號(hào)。
因此，本發(fā)明提供了在人體中具有減少的免疫原性的修飾的抗-TNFα抗體，其中該修飾的抗體包含重鏈和輕鏈可變區(qū)氨基酸序列，所述序列選自SEQ ID No1/SEQ ID No5、SEQ ID No1/SEQ ID No7、SEQ IDNo1/SEQ ID No8、SEQ ID No3/SEQ ID No6和SEQ ID No4/SEQID No7，或者與上列每一個(gè)配對(duì)中的一個(gè)或兩個(gè)氨基酸序列具有至少70％相似性的氨基酸組合。
根據(jù)本發(fā)明命名為SEQ ID 1-8的序列為
SEQ ID No1(＝Vh1)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNHWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRSKSINSATHYAESVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTTLTVSSSEQ ID No2(＝Vh3)EVKLEESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNHWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRSKSINSATHYAESVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTGVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTTVTVSSSEQ ID No3(＝Vh5)EVKLEESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNHWMNWVRQSPEKGLEWVAETRSKSTNSATHYAESVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTGVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTTVTVSSSEQ ID No4(＝Vh8)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNHWMNWVRQSPEKGLEWVAETRSKSTNSATHYADSVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTLVTVSSSEQ ID No5(＝Vk1)DIQLTQSPDTSSASPGERVSFSCRASQFVGSSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESMSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSHSWPFTFGSGTNVEVKRSEQ ID No6(＝Vk12)DIQLTQSPDTSSASPGERASFSCRASQFVGSSIHWYQHTTNGSPRLLIKYASESMSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSHSWPFTFGSGTNLEVKRSEQ ID No7(＝Vk5)DIQLTQSPDTSSASPGERVSFSCRASQFVGSSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESMSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSHSWPFTFGGGTKVEIKRSEQ ID No8(＝Vk8)DIQLTQSPDTSSASPGERASFSCRASQFVGSSIHWYQHTTNGSPRLLIKYASESMSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSHSWPFTFGGGTKVEIKR概括而言，本發(fā)明涉及下面的要點(diǎn)●在此處稱(chēng)為Vh1的單克隆抗體V-區(qū)重鏈，以單字母代碼形式，其包含氨基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNHWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRSKSINSATHYAESVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTTLTVSS；●在此處稱(chēng)為Vh3的單克隆抗體V-區(qū)重鏈，以單字母代碼形式，其包含氨基酸序列EVKLEESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNHWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRSKSINSATHYAESVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTGVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTTVTVSS；●在此處稱(chēng)為Vh5的單克隆抗體V-區(qū)重鏈，以單字母代碼形式，其包含氨基酸序列EVKLEESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNHWMNWVRQSPEKGLEWVAETRSKSTNSATHYAESVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTGVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTTVTVSS；●在此處稱(chēng)為Vh8的單克隆抗體V-區(qū)重鏈，以單字母代碼形式，其包含氨基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNHWMNWVRQSPEKGLEWVAETRSKSTNSATHYADSVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTLVTVSS；●在此處稱(chēng)為Vk1的單克隆抗體V-區(qū)輕鏈，以單字母代碼形式，其包含氨基酸序列DIQLTQSPDTSSASPGERVSFSCRASQFVGSSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESMSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSHSWPFTFGSGTNVEVKR；●在此處稱(chēng)為Vk12的單克隆抗體V-區(qū)輕鏈，以單字母代碼形式，其包含氨基酸序列DIQLTQSPDTSSASPGERASFSCRASQFVGSSIHWYQHTTNGSPRLLIKYASESMSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSHSWPFTFGSGTNLEVKR；●在此處稱(chēng)為Vk5的單克隆抗體V-區(qū)輕鏈，以單字母代碼形式，其包含氨基酸序列DIQLTQSPDTSSASPGERVSFSCRASQFVGSSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESMSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSHSWPFTFGGGTKVEIKR；●在此處稱(chēng)為Vk8的單克隆抗體V-區(qū)輕鏈，以單字母代碼形式，其包含氨基酸序列DIQLTQSPDTSSASPGERASFSCRASQFVGSSIHWYQHTTNGSPRLLIKYASESMSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSHSWPFTFGGGTKVEIKR；●包含重鏈V-區(qū)序列Vh1和輕鏈序列Vk1的單克隆抗體；
●包含重鏈V-區(qū)序列Vh1和輕鏈序列Vk5的單克隆抗體；●包含重鏈V-區(qū)序列Vh1和輕鏈序列Vk8的單克隆抗體；●包含重鏈V-區(qū)序列Vh5和輕鏈序列Vk12的單克隆抗體；●包含重鏈V-區(qū)序列Vh8和輕鏈序列Vk5的單克隆抗體；●包含抗體cA2的氨基酸序列的單克隆抗體V-區(qū)重鏈，該序列經(jīng)修飾含有一個(gè)或多個(gè)選自下組中替代M18L、K19R、V23A、I28T、I51T、I56T、S79N、A80S、V81L、T86N、D87S、R89K、L116V，其中氨基酸是以單字母代碼標(biāo)識(shí)的且編號(hào)指當(dāng)N-末端殘基為第1位殘基時(shí)用數(shù)字表示的氨基酸位置；●包含抗體cA2的氨基酸序列的單克隆抗體V-區(qū)重鏈，該序列經(jīng)修飾含有一個(gè)或多個(gè)選自下組中替代K3Q、E5V、M18L、K19R、V23A、I28T、S79N、A80S、V81L、T86N、D87S、R89K、G94A，其中氨基酸是以單字母代碼標(biāo)識(shí)的且編號(hào)指當(dāng)N-末端殘基為第1位殘基時(shí)用數(shù)字表示的氨基酸位置；●包含抗體cA2的氨基酸序列的單克隆抗體V-區(qū)重鏈，該序列經(jīng)修飾含有一個(gè)或多個(gè)選自替代M18L、K19R、V23A、I28T、S79N、A80S、V81L、T86N、D87S、R89K、L116V中的替代，其中氨基酸是以單字母代碼標(biāo)識(shí)的且編號(hào)指當(dāng)N-末端殘基為第1位殘基時(shí)用數(shù)字表示的氨基酸位置；●包含抗體cA2的氨基酸序列的單克隆抗體V-區(qū)重鏈，該序列經(jīng)修飾含有一個(gè)或多個(gè)選自替代K3Q、E5V、M18L、K19R、V23A、I28T、I51T、I56T、E64D、S79N、A80S、V81L、T86N、D87S、R89K、G94A、T115L、L116V中的替代，其中氨基酸是以單字母代碼標(biāo)識(shí)的且編號(hào)指當(dāng)N-末端殘基為第1位殘基時(shí)用數(shù)字表示的氨基酸位置；●包含抗體cA2的氨基酸序列的單克隆抗體V-區(qū)輕鏈，該序列經(jīng)修飾含有一個(gè)或多個(gè)選自替代L3Q、A9D、I10T、L11S、V13A、V19A、Q38H、R39T、I58V、S74T、T77S、V78L、S80A、I83A、D85T中的替代，其中氨基酸是以單字母代碼標(biāo)識(shí)的且編號(hào)指當(dāng)N-末端殘基為第1位殘基時(shí)用數(shù)字表示的氨基酸位置；●包含抗體cA2的氨基酸序列的單克隆抗體V-區(qū)輕鏈，該序列經(jīng)修飾含有一個(gè)或多個(gè)選自替代L3Q、A9D、I10T、L11S、V13A、I58V、S74T、T77S、V78L、S80A、I83A、D85T、L104V中的替代，其中氨基酸是以單字母代碼標(biāo)識(shí)的且編號(hào)指當(dāng)N-末端殘基為第1位殘基時(shí)用數(shù)字表示的氨基酸位置；●包含抗體cA2的氨基酸序列的單克隆抗體V-區(qū)輕鏈，該序列經(jīng)修飾含有一個(gè)或多個(gè)選自替代L3Q、A9D、I10T、L11S、V13A、I58V、S74T、T77S、V78L、S80A、I83A、D85T、S100G、N103K、L104V、V106I中的替代，其中氨基酸是以單字母代碼標(biāo)識(shí)別的且編號(hào)指當(dāng)N-末端殘基為第1位殘基時(shí)用數(shù)字表示的氨基酸位置；●包含抗體cA2的氨基酸序列的單克隆抗體V-區(qū)輕鏈，該序列經(jīng)修飾含有一個(gè)或多個(gè)選自替代L3Q、A9D、I10T、L11S、V13A、Q38H、R39T、I58V、S74T、T77S、V78L、S80A、I83A、D85T、S100G、N103K、L104V、V106I中的替代，其中氨基酸是以單字母代碼標(biāo)識(shí)的且編號(hào)指當(dāng)N-末端殘基為第1位殘基時(shí)用數(shù)字表示的氨基酸位置；●據(jù)此修飾的額外包含人IgG1恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域和人κ恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的抗體V-區(qū)；●據(jù)此修飾的能夠結(jié)合TNFα的抗體；●據(jù)此修飾的能夠?qū)υ隗w外致死濃度的TNFα中生長(zhǎng)的WEHI164細(xì)胞提供保護(hù)作用的抗體；●據(jù)此修飾的能夠抑制體外人內(nèi)皮細(xì)胞中TNFα刺激的ICAM-1產(chǎn)生的抗體；●據(jù)此修飾的能夠抑制體外人成纖維細(xì)胞中TNFα刺激的IL-6產(chǎn)生的抗體；●據(jù)此修飾的包含一個(gè)或多個(gè)V-區(qū)結(jié)構(gòu)域的抗體，在所述V區(qū)結(jié)構(gòu)域中免疫原性區(qū)域已用T-細(xì)胞試驗(yàn)進(jìn)行作圖并然后進(jìn)行了修飾，從而當(dāng)在T-細(xì)胞試驗(yàn)中再次檢驗(yàn)時(shí)，修飾的蛋白質(zhì)比親代(非修飾的)分子引起較小的刺激指數(shù)；●具有單克隆抗體cA2的生物學(xué)活性且與非修飾的cA2相比基本無(wú)免疫原性或有低的免疫原性的修飾的抗體分子；●當(dāng)體內(nèi)應(yīng)用時(shí)與抗體cA2具有相同生物學(xué)活性的修飾的抗體分子；●上文所述的抗體分子，其中該免疫原性的喪失是通過(guò)去除一個(gè)或多個(gè)源自最初非修飾分子的T-細(xì)胞抗原決定部位而實(shí)現(xiàn)的；●上文所述的抗體分子，其中該免疫原性的喪失是通過(guò)減少能夠結(jié)合源自該分子的肽的MHC同種異型的數(shù)目而實(shí)現(xiàn)的；●上文所述的抗體分子，其中去除了一個(gè)T-細(xì)胞抗原決定部位；●上文所述的抗體分子，其中所述最初存在的T-細(xì)胞抗原決定部位是II型MHC配體或肽序列，該配體或肽序列顯示出通過(guò)在II型MHC上呈遞而刺激或結(jié)合T-細(xì)胞的能力；●上文所述的分子，其中所述肽序列選自

圖1中描述的組；●上文所述的分子，其中在任何一個(gè)最初存在的T-細(xì)胞抗原決定部位中1-9個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選一個(gè)氨基酸殘基被改變；●上文所述的分子，其中氨基酸殘基的改變是在特定位置上由其他氨基酸殘基對(duì)最初存在的氨基酸殘基的替代、添加或最初存在的氨基酸殘基的缺失；●上文所述的分子，其中如果必要，額外進(jìn)行進(jìn)一步改變——通常由特定氨基酸替代、添加或缺失來(lái)進(jìn)行——以恢復(fù)該分子的生物學(xué)活性；●上文所述的分子，其中改變是在如下連續(xù)殘基鏈序列(A)-(H)之任何一個(gè)或全部的一個(gè)或多個(gè)殘基上進(jìn)行的，其中所述序列源自該分子的cA2抗體V-區(qū)序列結(jié)構(gòu)域并應(yīng)用單字母代碼標(biāo)識(shí)為；
A.＝GLVQPGGSMKLSCVAS；B.＝WVAEIRSKSINSA；C.＝SRDDSKSAVYLQMTDLRTD.＝RNYYGSTYDYWGQGTTLTVSSE.＝DILLTQSPAILSVSPGERVSFF.＝HWYQQRTNGSPRG.＝LIKYASESMSGIPSH.＝DFTLSINTVESEDIADYYCQQ●包含來(lái)自上述序列(A)-(H)中任何一個(gè)的至少9個(gè)連續(xù)殘基的肽分子；●與源自(A)-(H)的任何一個(gè)肽序列有超過(guò)90％的氨基酸一致性的上述肽分子；●與源自(A)-(H)的任何一個(gè)肽序列有超過(guò)80％的氨基酸一致性的上述肽分子；●含有與上述序列(A)-(H)中一個(gè)或多個(gè)相同或基本同源的序列元件的肽分子；●能夠結(jié)合II型MHC的上述肽序列；●包含具有II型MHC結(jié)合活性的任一上述肽或修飾的肽的藥物組合物；●編碼在上文和下文中限定的任何一個(gè)特定的修飾分子的DNA序列或分子；●包含具有cA2的生物學(xué)活性的修飾分子的藥物組合物；●如上文和/或在權(quán)利要求中限定的藥物組合物，任選地還包含藥物可接受的載體、稀釋劑或賦形劑；●一種制備如上文或下文限定的具有抗體cA2生物學(xué)活性的修飾分子的方法，該方法包括下面的步驟(i)確定多肽或其部分的氨基酸序列；(ii)通過(guò)任何方法鑒定蛋白質(zhì)氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)潛在T-細(xì)胞抗原決定部位，該方法包括用體外或in silico技術(shù)或生物學(xué)測(cè)定法確定肽與MHC分子的結(jié)合；(iii)設(shè)計(jì)新的序列變體，該變體在鑒定的潛在T-細(xì)胞抗原決定部位中具有修飾的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，從而如由體外或in silico技術(shù)或生物學(xué)測(cè)定法通過(guò)肽與MHC分子的結(jié)合所確定的，基本減少或消除這些T-細(xì)胞抗原決定部位的活性；(iv)用重組DNA技術(shù)構(gòu)建這種序列變體并檢驗(yàn)該變體以鑒定一個(gè)或多個(gè)具有期望性質(zhì)的變體；和(v)可選擇地重復(fù)步驟(ii)-(iv)；●上文所述的方法，其中步驟(iii)是通過(guò)在任何一個(gè)最初存在的T-細(xì)胞抗原決定部位中替代、添加或缺失1-9個(gè)氨基酸殘基而實(shí)施的；●上文所述的方法，其中改變是參照同源蛋白質(zhì)序列和/或in silico模建(modelling)技術(shù)而進(jìn)行的；●由上述13聚體T-細(xì)胞抗原決定部位肽中的至少9個(gè)連續(xù)氨基酸殘基組成的肽序列及其在制備抗-TNFα抗體中的應(yīng)用，該抗體當(dāng)體內(nèi)應(yīng)用時(shí)與任何非修飾的分子相比基本無(wú)免疫原性或具有低的免疫原性，且具有抗-TNFα抗體的生物學(xué)活性。
提到“基本無(wú)免疫原性”或“減少的免疫原性潛力”包括與親代抗體即非修飾的鼠源或嵌合單克隆抗體相比減少的免疫原性。術(shù)語(yǔ)“免疫原性”包括在宿主動(dòng)物中引起、誘導(dǎo)或否則促進(jìn)體液和/或T-細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)的能力，特別是當(dāng)該“宿主動(dòng)物”是人時(shí)。
本發(fā)明修飾抗體的一個(gè)重要且顯著的特征是它們保持了非修飾的或“親代”抗體的功能活性。因此特別想要的是產(chǎn)生修飾的抗體，其顯示了與親代非修飾的抗體的治療功效相關(guān)的所有有利技術(shù)特征。這與本發(fā)明的預(yù)期應(yīng)用有關(guān)，即提供在許多人類(lèi)重要疾病中具有治療功效的組合物，該疾病尤其包括類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和Crohn氏病及TNFα介導(dǎo)的許多其他臨床適應(yīng)癥。這種治療法是本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案。
因此，本發(fā)明修飾的抗體對(duì)其目標(biāo)抗原顯示出與單克隆抗體cA2所顯示的親和力相似的親和力。該抗體識(shí)別TNFα而不是TNFα，且能夠在一系列體外測(cè)定試驗(yàn)中中和TNFα活性。這種測(cè)定試驗(yàn)包括細(xì)胞毒性、細(xì)胞分裂發(fā)生、細(xì)胞因子誘導(dǎo)和粘著分子誘導(dǎo)。除中和TNFα的生物學(xué)活性之外，親代分子的治療功效被認(rèn)為也由抗體誘導(dǎo)ADCC(依賴(lài)抗體的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性)的能力所介導(dǎo)，且可有效殺傷表達(dá)細(xì)胞表面結(jié)合形式的TNFα的細(xì)胞。ADCC現(xiàn)象是由完整抗體分子的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的，且本發(fā)明考慮到包含與ADCC誘導(dǎo)相容的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的完整抗體分子的生產(chǎn)。
關(guān)于證明TNFα中和活性的體外測(cè)定試驗(yàn)，許多這樣的測(cè)定試驗(yàn)在此處作為實(shí)驗(yàn)例子描述，并提供了本發(fā)明優(yōu)選抗體具有體外能力的證據(jù)。
“抗體”指能夠與抗原組合、相互作用或結(jié)合的免疫球蛋白家族的蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“抗原”在此處用于指能夠與抗體相互作用的物質(zhì)，且在本發(fā)明的情況下指TNFα。本發(fā)明的TNFα是腫瘤壞死因子α(TNFα)，且最優(yōu)選地為作為抗體cA2的抗原的人TNFα或任何TNFα。TNFα可為可溶性的TNFα或膜結(jié)合的TNFα。
術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白”在此處用于指由一種或多種基本上由免疫球蛋白基因編碼的多肽組成的蛋白質(zhì)。公認(rèn)的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、σ、ε和μ恒定區(qū)基因和實(shí)際上多個(gè)免疫球蛋白可變區(qū)基因。一個(gè)天然形式的免疫球蛋白是包含相同的兩個(gè)配對(duì)的四聚體，其中每一個(gè)配對(duì)具有一條輕鏈和一條重鏈。在每一個(gè)配對(duì)中，重鏈和輕鏈可變區(qū)一起提供了能夠與抗原相互作用的結(jié)合表面。術(shù)語(yǔ)Vh在此處用于指重鏈可變區(qū)，而術(shù)語(yǔ)Vk在此處用于指輕鏈可變區(qū)，且在本情況下與許多單克隆抗體共同的是該輕鏈?zhǔn)恰発appa”(κ)類(lèi)型的鏈。
如在此處所用的，Vh指長(zhǎng)度約為110～125個(gè)氨基酸殘基的多肽，其序列相應(yīng)于任何一個(gè)在此處所述的Vh鏈，該Vh鏈與Vk組合能夠結(jié)合人TNFα。類(lèi)似地，Vk指長(zhǎng)度約為95～130個(gè)氨基酸殘基的多肽，其序列相應(yīng)于任何一個(gè)在此處所述的Vk鏈，該Vk鏈與Vh組合能夠結(jié)合人TNFα。全長(zhǎng)的免疫球蛋白重鏈分子量為約50kDa，且在N-末端由Vh基因編碼，而在C-末端由恒定區(qū)基因之一(如γ)編碼。類(lèi)似地，全長(zhǎng)的免疫球蛋白輕鏈分子量為約25kDa，且在N-末端由V-區(qū)基因編碼，而在C-末端由κ或λ恒定區(qū)基因編碼。
除完整的抗體(四聚體)之外，免疫球蛋白可以以通過(guò)重組DNA技術(shù)或蛋白質(zhì)生物化學(xué)衍生的許多其他形式存在。這些形式包括如Fv、Fab、Fab’和(Fab)2分子，且全部可含有本發(fā)明的Vh或Vk序列的任何一個(gè)。其它例子可包括“雙特異性的”抗體，即包含本發(fā)明的Vh/Vk組合和具有不同抗原特異性的第二Vh/Vk組合。
術(shù)語(yǔ)“T-細(xì)胞抗原決定部位”根據(jù)本發(fā)明的理解指能夠結(jié)合II型MHC、能夠刺激T-細(xì)胞和/或也能夠以和II型MHC復(fù)合的形式結(jié)合T-細(xì)胞(但不一定可測(cè)量地活化T細(xì)胞)的氨基酸序列。
如在此處和在所附權(quán)利要求中所用的，術(shù)語(yǔ)“肽”是包括兩個(gè)或多個(gè)氨基酸的化合物。氨基酸是通過(guò)肽鍵(在下文中定義)連接在一起的。有20種不同的天然存在的氨基酸參與肽的生物學(xué)生產(chǎn)，且可以將任何數(shù)目的氨基酸以任何順序連接而形成肽鏈或環(huán)。在肽的生物學(xué)生產(chǎn)中應(yīng)用的天然存在的氨基酸均具有L-構(gòu)型。合成的肽可采用常規(guī)的合成方法利用L-氨基酸、D-氨基酸或兩種不同構(gòu)型氨基酸的各種組合來(lái)制備。一些肽僅含有少數(shù)的氨基酸單位。短肽，如少于10個(gè)氨基酸單位的肽有時(shí)稱(chēng)為“寡肽”。其他肽含有大數(shù)目的氨基酸殘基，如多達(dá)100個(gè)或更多，并稱(chēng)為“多肽”。按慣例，“多肽”可認(rèn)為是含有3個(gè)或更多個(gè)氨基酸的肽鏈，而“寡肽”通常認(rèn)為是特殊類(lèi)型的“短”多肽。因而，如在此處所用的，可以理解的是只要提及到“多肽”也包括寡肽。進(jìn)一步地，只要提及“肽”即包括多肽、寡肽和蛋白質(zhì)。氨基酸的每一種不同排列形成了不同的多肽或蛋白質(zhì)?？尚纬傻亩嚯牡臄?shù)目及由此不同蛋白質(zhì)的數(shù)目實(shí)際上是無(wú)限的。“α碳(Cα)”是肽鏈的碳-氫(CH)成分中的碳原子?！皞?cè)鏈”是Cα的側(cè)基，該基團(tuán)可包含簡(jiǎn)單或復(fù)雜的基團(tuán)或部分，且具有與肽的大小相比可顯著變化的物理大小。
本發(fā)明導(dǎo)致修飾的抗-TNFα抗體的一般方法包括以下步驟(a)確定多肽或其部分的氨基酸序列；(b)通過(guò)任何方法鑒定蛋白質(zhì)氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)潛在的T-細(xì)胞抗原決定部位，該方法包括用體外或in silico技術(shù)或生物學(xué)測(cè)定法確定肽與MHC分子的結(jié)合；
(c)設(shè)計(jì)新的序列變體，該變體在鑒定的潛在T-細(xì)胞抗原決定部位中具有修飾的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，如通過(guò)體外或in silico技術(shù)或生物學(xué)測(cè)定法由肽與MHC分子的結(jié)合而確定的，所述修飾導(dǎo)致基本上減少或消除T-細(xì)胞抗原決定部位的活性。這種序列變體是以一定的方式生成的，從而避免由序列改變生成新的潛在T-細(xì)胞抗原決定部位，否則這種新的潛在T-細(xì)胞抗原決定部位又進(jìn)行修飾以基本減少或消除此T-細(xì)胞抗原決定部位的活性。
(d)用重組DNA技術(shù)構(gòu)建這種序列變體并檢測(cè)該變體以鑒定一個(gè)或多個(gè)具有想要的性質(zhì)的變體。
根據(jù)步驟(b)對(duì)潛在的T-細(xì)胞抗原決定部位的鑒定可根據(jù)本領(lǐng)域中以前描述的方法實(shí)施。適當(dāng)?shù)姆椒ü_(kāi)于WO98/59244；WO98/52976；WO00/34317中。
通過(guò)計(jì)算鑒定T-細(xì)胞抗原決定部位的其他非常有效的方法描述于實(shí)施例1中，該實(shí)施例是根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。已在抗-TNFα抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列上進(jìn)行了該分析。
適合于探測(cè)T-細(xì)胞抗原決定部位的其它技術(shù)方法是生物學(xué)T-細(xì)胞測(cè)定法。這種分析方法描述于實(shí)施例2中并類(lèi)似地是根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。因此，在此處具體化的優(yōu)選生物學(xué)測(cè)定方法包括檢測(cè)源自抗-TNFα抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)序列的重疊肽，或者作為替代方案檢測(cè)由V-區(qū)衍生的肽亞群，如根據(jù)實(shí)施例1所述方法通過(guò)計(jì)算衍生的全部或一些肽。對(duì)合成的肽檢驗(yàn)其在體外培養(yǎng)的人T-細(xì)胞中引起增殖反應(yīng)的能力。該增殖反應(yīng)可通過(guò)任何方便的方法進(jìn)行測(cè)量，但如在本發(fā)明實(shí)施方案中所利用的一種眾所周知的方法應(yīng)用3H-胸腺嘧啶摻入。該方法可用從健康供體中獲取的幼稚人T-細(xì)胞來(lái)實(shí)施，且也可用于檢驗(yàn)完整蛋白質(zhì)分子以及合成的肽在體外的免疫原性。這種方案也已用于本發(fā)明的研究中(實(shí)施例11)來(lái)證明本發(fā)明優(yōu)選的分子具有減少的免疫原性潛力。本發(fā)明人已確立在幼稚T-細(xì)胞測(cè)定試驗(yàn)的操作中，等于或大于2.0的刺激指數(shù)是對(duì)所誘導(dǎo)的增殖作用的有用量度。刺激指數(shù)常規(guī)地通過(guò)用在有檢驗(yàn)的肽時(shí)測(cè)量到的增殖分?jǐn)?shù)(例如如果應(yīng)用3H-胸腺嘧啶摻入則為每分鐘的計(jì)數(shù))除以在不與檢驗(yàn)的(多)肽接觸的細(xì)胞中測(cè)量到的增殖分?jǐn)?shù)而獲得。
實(shí)際上，可產(chǎn)生許多抗-TNFα抗體變體并檢驗(yàn)想要的免疫和功能特征。特別重要的是當(dāng)對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行改變時(shí)，該預(yù)期的變化不引入新的免疫原性抗原決定部位。這在實(shí)踐中可以通過(guò)用任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄔ俅螜z驗(yàn)預(yù)期的序列是否存在抗原決定部位或II型MHC配體而避免。作為本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案的一種特定方法是應(yīng)用體外免疫學(xué)回憶(recall)試驗(yàn)，該試驗(yàn)包括在致敏量的檢驗(yàn)蛋白質(zhì)(抗體)存在時(shí)培養(yǎng)PBMC制品并用相同的檢驗(yàn)蛋白質(zhì)或平行地用該蛋白質(zhì)的修飾形式進(jìn)行再次攻擊。這種方案提供了在不進(jìn)行全面的臨床試驗(yàn)的情況下對(duì)修飾的蛋白質(zhì)減少的免疫原性潛力方便的實(shí)踐證明。對(duì)于大多數(shù)的目的，變體蛋白質(zhì)可以通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生，但也可以考慮其他方法，包括化學(xué)合成。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明修飾的抗體是通過(guò)表達(dá)此處所述的Vh和Vk基因的不同組合而生成的。根據(jù)本發(fā)明最優(yōu)選的組合包括組合Vh5/Vk12。也已產(chǎn)生了其他組合并檢驗(yàn)了其在結(jié)合TNFα方面的功能活性，且這些組合包括Vh1/Vk1、Vh1/Vk5、Vh1/Vk8和Vh8/Vk5。重鏈和輕鏈的所有這種組合均包含于本發(fā)明中。
因此，本發(fā)明提供了在人體中具有減少的免疫原性的修飾的抗-TNFα抗體，其中該修飾的抗體包含選自SEQ ID No1/SEQ ID No5、SEQ IDNo1/SEQ ID No7、SEQ ID No1/SEQ ID No8、SEQ ID No3/SEQID No6和SEQ ID No4/SEQ ID No7，或者如下氨基酸的組合的重鏈和輕鏈可變區(qū)氨基酸序列，所述氨基酸組合與上列每一個(gè)配對(duì)中的一個(gè)或兩個(gè)氨基酸序列具有至少70％的相似性。
本發(fā)明涉及抗-TNFα單克隆抗體，其中在分子V-區(qū)的位置上已進(jìn)行了至少一個(gè)氨基酸殘基的替代，結(jié)果導(dǎo)致一個(gè)或多個(gè)潛在的T-細(xì)胞抗原決定部位的活性被基本減小或一個(gè)或多個(gè)潛在的T-細(xì)胞抗原決定部位從蛋白質(zhì)中被基本上消除。最優(yōu)選地是提供修飾的抗體分子，在該分子中在親代分子的大多數(shù)免疫原性區(qū)域中進(jìn)行了氨基酸修飾(如替代)。本發(fā)明主要的優(yōu)選實(shí)施方案包括修飾的抗體分子，其中對(duì)II型MHC配體中的任一個(gè)進(jìn)行改變，從而消除與MHC的結(jié)合或減少肽可結(jié)合的MHC同種異型的數(shù)目。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)并在此處公開(kāi)了在人體中抗體cA2分子的免疫原性區(qū)域?？梢岳斫獾氖窃谀承┣闆r下那些在此處公開(kāi)的序列之外的額外區(qū)域可變?yōu)榫哂忻庖咴缘目乖瓫Q定部位，例如用表達(dá)與本發(fā)明的序列具有類(lèi)似序列的蛋白質(zhì)或肽的病原體感染的情況。無(wú)論如何，對(duì)于序列元件而言，充當(dāng)II型MHC配體將是關(guān)鍵的，因此原則上在圖1中公開(kāi)的任何序列均可認(rèn)為是在本發(fā)明的范圍內(nèi)的具有免疫原性的抗原決定部位。
為了消除T-細(xì)胞抗原決定部位，氨基酸替代是在肽序列中預(yù)期可實(shí)現(xiàn)T-細(xì)胞抗原決定部位活性的基本減少或消除的適當(dāng)位點(diǎn)上進(jìn)行的。在實(shí)踐中，適當(dāng)?shù)奈稽c(diǎn)優(yōu)選等同于可以在II型MHC結(jié)合溝所提供的一個(gè)口袋中結(jié)合的氨基酸殘基。
最優(yōu)選地是改變肽在所謂的肽P1或P1錨定位置處與裂縫的第一個(gè)口袋的結(jié)合。在肽的P1錨定殘基和II型MHC結(jié)合溝的第一個(gè)口袋之間的結(jié)合相互作用質(zhì)量被公認(rèn)為是完整肽的總結(jié)合親和力的主要決定因素。在肽的該位置中的適當(dāng)替代可為替代為較不易于容納于口袋中的殘基，如替代為更親水的殘基。肽中對(duì)應(yīng)于與MHC結(jié)合裂縫其他口袋區(qū)域結(jié)合的位置的氨基酸殘基也可以加以考慮并且屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
可以理解的是在給定的潛在T細(xì)胞抗原決定部位中單個(gè)氨基酸替代是最優(yōu)選的消除抗原決定部位的途徑。在單個(gè)抗原決定部位中也可以考慮進(jìn)行組合替代，例如當(dāng)單獨(dú)限定的抗原決定部位相互重疊時(shí)組合替代可能是特別適當(dāng)?shù)摹４送?，可以在就II型MHC結(jié)合溝而言非“口袋殘基”的位置，在肽序列中任何位點(diǎn)處進(jìn)行氨基酸替代，該氨基酸替代可以是于給定的抗原決定部位中的單個(gè)替代或于單個(gè)抗原決定部位中的組合替代。所有這種替代均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在本發(fā)明涉及修飾的抗-TNFα抗體的情況下，應(yīng)該認(rèn)為含有這種修飾抗體或修飾抗體的片段的組合物和相關(guān)組合物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此本發(fā)明考慮到應(yīng)用和生成抗體片段，包括如Fv、Fab、Fab’和F(ab’)2片段。這種片段可用標(biāo)準(zhǔn)方法制備[如Coligan等人(Current Protocols inImmunology，John Wiley & Sons 1991-1997)。本發(fā)明也考慮到本領(lǐng)域中眾所周知的各種抗體衍生分子的重組形式。這種抗體衍生分子包括穩(wěn)定化的Fv片段，該片段包括包含連接Vh和Vl構(gòu)域的肽連接體的單鏈Fv形式(如scFv)，或者通過(guò)鏈間二硫鍵穩(wěn)定化的Fv(dsFv)(其含有經(jīng)加工有利于Vh和V1結(jié)構(gòu)域連接的額外半胱氨酸殘基)。同樣地，其他組合物亦是本領(lǐng)域中熟悉的，且可包括稱(chēng)為“小體(minibodies)”的分子和單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域“dAb”。其他的分子還可以加入用于增加修飾抗體V-區(qū)結(jié)構(gòu)域的效價(jià)的手段，即通過(guò)如對(duì)二聚化結(jié)構(gòu)域(如“亮氨酸拉鏈”)進(jìn)行加工或利用化學(xué)修飾策略得到的具有多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子。
在另一方面，本發(fā)明涉及編碼修飾的抗-TNFα抗體實(shí)體的核酸。
在再一方面，本發(fā)明涉及用修飾的抗-TNFα抗體對(duì)人進(jìn)行治療的方法。
本發(fā)明現(xiàn)在將由下面的實(shí)施例進(jìn)行闡明，但不受其限制。該實(shí)施例涉及下面的附圖圖1提供了源自抗-TNFα抗體cA2的V-區(qū)結(jié)構(gòu)域的肽序列表，所述序列具有潛在的人II型MHC結(jié)合活性。圖1A涉及重鏈來(lái)源的序列。圖1B涉及輕鏈來(lái)源的序列。
圖2提供了證明用本發(fā)明的抗-TNFα抗體(Vh5/Vk12)可以對(duì)TNFα誘導(dǎo)的體外WEHI細(xì)胞殺傷進(jìn)行中和的圖。
圖3提供的圖證明了用本發(fā)明的抗-TNFα抗體(Vh5/Vk12)可以對(duì)TNFα刺激的體外人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中ICAM-1的表達(dá)產(chǎn)生進(jìn)行中和。
圖4提供了證明本發(fā)明的抗-TNFα抗體(Vh5/Vk12)能夠在體外測(cè)定中與陽(yáng)性對(duì)照抗體(infliximab)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合TNFα的圖。
圖5提供了一組柱形圖，這些圖所映了在體外幼稚T-細(xì)胞增殖測(cè)定中針對(duì)合成的肽的增殖反應(yīng)。該數(shù)據(jù)涉及由來(lái)自單個(gè)供體#4的PBMC記錄的反應(yīng)，并相應(yīng)于肽CA1-CA75的每一個(gè)的1μM和5μM濃度給出。每一個(gè)圖用刺激指數(shù)(SI)相對(duì)于肽標(biāo)識(shí)碼繪圖。SI＝CPM檢驗(yàn)肽/CPM未處理的對(duì)照。肽序列和方法詳細(xì)描述于實(shí)施例2中。
圖6提供了體外幼稚T-細(xì)胞增殖測(cè)定中針對(duì)13-聚體肽P1-P15的每一個(gè)所記錄的增殖反應(yīng)。A圖描述了來(lái)自供體#2的PBMC中的反應(yīng)；B圖描述了來(lái)自供體#4的PBMC中的反應(yīng)。結(jié)果相應(yīng)于1μM和5μM濃度的給定肽來(lái)顯示。對(duì)于兩圖，SI＞2.0的反應(yīng)表示為正的(+)而SI＜2.0的結(jié)果表示為負(fù)的(-)。
圖7顯示平板ELISA的結(jié)果，其中TNFα是由本發(fā)明修飾的抗體(Vh5/Vk12)探測(cè)的。結(jié)合曲線(xiàn)是抗體濃度相對(duì)492nm的光密度(OD492)所繪制的圖。
圖8提供了本發(fā)明抗-TNFα抗體的修飾的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，序列以單字母代碼表示。
圖9提供了證明用本發(fā)明的抗-TNFα抗體(Vh5/Vk12)可以對(duì)TNFα刺激的體外人HS27成纖維細(xì)胞中IL-6的表達(dá)產(chǎn)生進(jìn)行中和的圖。陰性對(duì)照(210G12)是非-TNFα結(jié)合抗體且陽(yáng)性對(duì)照(infliximab)是TNFα中和抗體。
圖10提供的圖描述了應(yīng)用幼稚人PBMC的免疫原性測(cè)定試驗(yàn)的結(jié)果，該人PBMC是在不同濃度的修飾抗體(Vh5/Vk12)或免疫原性親代抗體(infliximab)存在時(shí)培養(yǎng)的。該圖顯示從反應(yīng)性供體PBMC(A圖)和非反應(yīng)性供體PBMC(B圖)獲得的結(jié)果。SI＝刺激指數(shù)。
實(shí)施例1用計(jì)算方法鑒定抗-TNFαVH和VL蛋白質(zhì)序列中潛在的II型MHC配體。
分析具有充當(dāng)II型MHC結(jié)合配體的潛力的肽序列的方案已在以前進(jìn)行了詳細(xì)描述[WO02/069232]。已開(kāi)發(fā)了應(yīng)用該程序的軟件工具并將其應(yīng)用于抗-TNFα抗體V-區(qū)結(jié)構(gòu)域的分析中。簡(jiǎn)言之，該軟件由多個(gè)元件建成，這些元件包括II型MHC分子模型文庫(kù)——該文庫(kù)形成以覆蓋在人類(lèi)群體中現(xiàn)存的大量同種異型變體；肽主鏈結(jié)構(gòu)文庫(kù)——該文庫(kù)形成以包含理論的和已知的主鏈構(gòu)象。利用這些元件，基于使每一個(gè)主鏈構(gòu)象?？?docking)在每一個(gè)MHC同種異型模型結(jié)合溝中的結(jié)果而生成一個(gè)大的數(shù)據(jù)集。該數(shù)據(jù)集也包括在給定位置上所有可能氨基酸的最佳側(cè)鏈構(gòu)象。肽側(cè)鏈(在最佳構(gòu)象中)和MHC蛋白質(zhì)之間的原子間距離貯存于該數(shù)據(jù)集中。來(lái)自目標(biāo)蛋白質(zhì)的待檢驗(yàn)的肽是按如下進(jìn)行分析的將其側(cè)鏈序列添加到所有主鏈上，然后檢索數(shù)據(jù)集得到最佳側(cè)鏈構(gòu)象，由此計(jì)算針對(duì)每一個(gè)主鏈的“肽分?jǐn)?shù)”。選擇最好的分?jǐn)?shù)用于展示，并使該過(guò)程針對(duì)每一個(gè)可用的MHC模型結(jié)構(gòu)進(jìn)行重復(fù)。該算法已應(yīng)用于分析抗-TNFα抗體cA2的V-區(qū)結(jié)構(gòu)域。該分析鑒定了多個(gè)13聚體肽序列，這些序列經(jīng)預(yù)測(cè)是一種或多種同種異型MHCII分子的配體，因而是潛在的T-細(xì)胞抗原決定部位。這些肽顯示于圖1A(重鏈來(lái)源的肽)和1B(輕鏈來(lái)源的肽)中。
實(shí)施例2體外增殖測(cè)定中用合成的肽和幼稚人PBMC對(duì)T-細(xì)胞抗原決定部位的鑒定。
MHC、肽和T-細(xì)胞受體(TCR)之間的相互作用為T(mén)-細(xì)胞識(shí)別的抗原特異性提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。T-細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢驗(yàn)肽與MHC的結(jié)合和TCR對(duì)MHC/肽復(fù)合物的識(shí)別。本實(shí)施例的體外T-細(xì)胞增殖測(cè)定涉及對(duì)外周血單核細(xì)胞(PBMC)的刺激，該外周血單核細(xì)胞含有抗原呈遞細(xì)胞(APC)和T-細(xì)胞。刺激是在體外用合成的肽抗原進(jìn)行的，且在一些實(shí)驗(yàn)中是用完整的蛋白質(zhì)抗原進(jìn)行的。刺激的T-細(xì)胞增殖是用3H-胸腺嘧啶(3H-Thy)測(cè)量的，其中摻入的3H-Thy通過(guò)對(duì)洗滌后的固定細(xì)胞進(jìn)行閃爍計(jì)數(shù)來(lái)估計(jì)。
表1合成的肽
來(lái)自貯存少于12小時(shí)的人血液的白細(xì)胞層從國(guó)家血液服務(wù)部門(mén)(National Blood Service)(Addenbrooks Hospital，Cambridge，英國(guó))獲得。Ficoll-paque從Amersham Pharmacia Biotech(Amersham，英國(guó))獲得。無(wú)血清AIM V培養(yǎng)基從Gibco-BRL(Paisley，英國(guó))獲得，該培養(yǎng)基用于原代人淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)并含有L-谷氨酰胺、50μg/ml鏈霉素、10μg/ml gentomycin和0.1％的人血清清蛋白。合成的肽從Eurosequence(Groningen，荷蘭)和Babraham Technix(Cambridge，英國(guó))獲得。紅細(xì)胞和白細(xì)胞是通過(guò)對(duì)白細(xì)胞層的輕輕離心而從血漿和血小板中分離的。移走并丟棄上層相(含有血漿和血小板)。使紅細(xì)胞和白細(xì)胞在磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中進(jìn)行1∶1的稀釋?zhuān)缓箐佋?5ml ficoll-paque(Amersham Pharmacia，Amersham英國(guó))上。根據(jù)制造商建議的條件進(jìn)行離心，并從血清+PBS/ficoll paque界面收獲PBMC。使PBMC與PBS混合(1∶1)并通過(guò)離心收集。移走并丟棄上清液，且將PBMC沉淀重懸于50ml PBS中。再次通過(guò)離心使細(xì)胞沉淀，并丟棄PBS上清液。將細(xì)胞用50ml AIM V培養(yǎng)基重懸，并在此時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并用錐蟲(chóng)藍(lán)染料排除法進(jìn)行生存力的估計(jì)。再次通過(guò)離心收集細(xì)胞并丟棄上清液。將細(xì)胞重懸并以每ml 3×107的密度進(jìn)行低溫貯存。貯存培養(yǎng)基是90％(v/v)熱失活的AB人血清(Sigma，Poole，英國(guó))和10％(v/v)DMSO(Sigma，Poole，英國(guó))。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到有調(diào)控的冷凍容器(Sigma)中并于-70℃放置過(guò)夜。當(dāng)需要使用時(shí)，將細(xì)胞在轉(zhuǎn)移到10ml預(yù)熱的AIM V培養(yǎng)基中之前于37℃水浴中快速解凍。
PBMC是以每孔2×105個(gè)PBMC的密度在96孔的平底平板上用蛋白質(zhì)和肽抗原刺激的。在用3H-Thy(Amersham-Pharmacia，Amersham英國(guó))進(jìn)行脈沖之前，使PBMC于37℃溫育7日。對(duì)于本研究，制備了橫跨抗體cA2的重鏈和輕鏈的完整V-區(qū)結(jié)構(gòu)域的合成的肽(15聚體)。每一個(gè)肽與鄰接的下一個(gè)肽在序列上重疊12個(gè)殘基，即每一個(gè)肽從相繼的下一個(gè)肽起增加3個(gè)殘基。肽序列和標(biāo)識(shí)號(hào)顯示于表1中。每一個(gè)肽都單獨(dú)地針對(duì)從20個(gè)供體中分離的幼稚PBMC進(jìn)行篩選。在每一個(gè)供體測(cè)定試驗(yàn)中都應(yīng)用兩個(gè)對(duì)照肽C32(PKYVKQNTLKLAT)和C49(KVVDQIKKISKPVQH)(該對(duì)照肽先前已證明具有免疫原性)和有效的非回憶性抗原KLH。將肽在DMSO中溶解至10mM的終濃度，然后將這些貯存液在A(yíng)IM V培養(yǎng)基中1/500稀釋(終濃度20μM)。將肽添加到平底的96孔板上以得到100μl中2和10μM的終濃度。解凍的PBMC的生存力是通過(guò)錐蟲(chóng)藍(lán)染料排除法進(jìn)行估計(jì)的，然后將細(xì)胞以2×106個(gè)細(xì)胞/ml的密度進(jìn)行重懸，并將100μl(2×105個(gè)PBMC/孔)轉(zhuǎn)移到含有肽的每一個(gè)孔中。在每一個(gè)肽濃度重復(fù)對(duì)三個(gè)孔的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行測(cè)定。將平板在5％CO2的潮濕空氣中于37℃溫育7日。在濾器墊上收獲細(xì)胞之前用每孔1μCi的3H-胸腺嘧啶對(duì)細(xì)胞脈沖18-21小時(shí)。CPM值是用Wallac小平板β頂部平板計(jì)數(shù)器(Wallac microplate beta top plate counter)(Perkin Elmer)測(cè)定的。結(jié)果表示為刺激指數(shù)(SI)，其中SI＝CPM檢驗(yàn)的肽/CPM未處理的對(duì)照。
用幼稚T細(xì)胞增殖測(cè)定試驗(yàn)對(duì)cA2V-區(qū)序列中的T細(xì)胞抗原決定部位作圖，導(dǎo)致對(duì)幾個(gè)免疫原性區(qū)域的鑒定。在各供體中具有顯著的刺激指數(shù)的肽包括如CA34(SI＝2.22)和CA52(SI＝2.09)等。
利用另一具有15個(gè)不同的13-聚體肽(P1-P15)的亞群對(duì)該圖譜在圍繞Vh和Vk序列的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的序列區(qū)域中進(jìn)行了精細(xì)化，該13-聚體肽具有如下序列
P1＝KGLEWVAEIRSKSP2＝EWVAEIRSKSINSP3＝AEIRSKSINSATHP4＝KSINSATHYAESVP5＝TGVYYCSRNYYGSP6＝STYDYWGQGTTLTP7＝SQFVGSSIHWYQQP8＝QFVGSSIHWYQQRP9＝SSIHWYQQRTNGSP10＝HWYQQRTNGSPRLP11＝PRLLIKYASESMSP12＝RLLIKYASESMSGP13＝LLIKYASESMSGIP14＝IKYASESMSGIPSP15＝ESMSGIPSRFSGS肽P1-P7源自Vh鏈序列，而肽P8-P15源自Vk鏈序列。在如前文一樣包括多種不同MHC同種異型的另一組10個(gè)幼稚PBMC制品中篩選肽P1-P15以獲得能體外引起增殖反應(yīng)的肽。從合成肽和供體組這兩個(gè)集合得到的幼稚T-細(xì)胞增殖測(cè)定結(jié)果可以綜合在一起產(chǎn)生抗體Vh和Vk鏈的抗原決定部位圖譜。通常，在編緝這樣的圖譜時(shí)，將SI＞1.95認(rèn)為是正反應(yīng)。顯示所有15-聚體肽對(duì)一個(gè)反應(yīng)性供體的SI的代表性柱形圖在附圖5中給出。13-聚體肽P1-P15的示例性結(jié)果在圖6中給出。
實(shí)施例3抗-TNFα抗體Vh和Vk基因的構(gòu)建抗體的序列源自美國(guó)專(zhuān)利5,656,272?？勺兘Y(jié)構(gòu)域重鏈(Vh)和可變結(jié)構(gòu)域輕鏈(Vk)基因是通過(guò)基因合成制備的。簡(jiǎn)言之，設(shè)計(jì)并合成了一組合成的寡核苷酸。基因是用連接酶鏈反應(yīng)(LCR)組裝的，其中使具有互補(bǔ)末端特征的寡核苷酸能夠退火，隨后用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行擴(kuò)增和補(bǔ)平。該P(yáng)CR是通過(guò)添加增加濃度的側(cè)翼寡核苷酸以充當(dāng)引物而驅(qū)動(dòng)的。通過(guò)進(jìn)一步從載體進(jìn)行PCR而將該P(yáng)CR產(chǎn)物組裝為全長(zhǎng)抗體基因，其中該載體含有免疫球蛋白基因的5’和3’側(cè)翼區(qū)域，并將該全長(zhǎng)抗體基因亞克隆入表達(dá)載體中以表達(dá)完整的抗體。該組裝的Vh和Vk基因可充當(dāng)模板來(lái)誘變和構(gòu)建多個(gè)去除了T-細(xì)胞抗原決定部位的變體抗體序列。
為了組裝Vh基因，應(yīng)用在表2中詳述的寡核苷酸OL373-OL391。為了組裝Vk基因，應(yīng)用在表3中詳述的寡核苷酸OL392-OL410。對(duì)于該兩個(gè)基因，通過(guò)使20μl磷酸化的寡核苷酸與1μl Pfu DNA連接酶(Stratagene，Amsterdam，荷蘭)、10μl 10×反應(yīng)緩沖液(與酶一起提供)和69μl水混合而進(jìn)行LCR。將反應(yīng)混合物置于熱循環(huán)儀上，于95℃溫育2分鐘，隨后于95℃進(jìn)行30秒、接著逐漸冷卻到60℃、然后于60℃溫育20分鐘、這3個(gè)步驟重復(fù)25個(gè)循環(huán)，最后于60℃溫育3小時(shí)。一般地，用2％瓊脂糖凝膠電泳對(duì)LCR樣品分析，得到成片的電泳條帶，其中具有剛剛可以看到的正確大小的模糊條帶。在所有情形中的寡核苷酸均購(gòu)自MWG-Biotech(Ebersberg，德國(guó))，并在體外用T4 DNA激酶(Roche，Lewes，英國(guó))和廠(chǎng)商建議的規(guī)程進(jìn)行磷酸化。在LCR后，將5μL反應(yīng)物轉(zhuǎn)移到PCR混合物中以擴(kuò)增組裝的片段。將寡核苷酸OL373和OL382用于驅(qū)動(dòng)Vh反應(yīng)，而將寡核苷酸OL392和OL401用于驅(qū)動(dòng)Vk反應(yīng)。PCR在50μl總體積中用Taq DNA聚合酶(Roche，Lewes，英國(guó))進(jìn)行15個(gè)循環(huán)。將反應(yīng)物在1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，獲取想要的條帶并用Qiagen(Crawley，英國(guó))DNA提取試劑盒進(jìn)行純化。將產(chǎn)物直接克隆入pGemT-easy載體(Promega，Southampton，英國(guó))中以進(jìn)行序列分析。對(duì)7個(gè)克隆進(jìn)行了測(cè)序直到獲得了正確的克隆。含有如上所述制備的可變區(qū)盒的全長(zhǎng)免疫球蛋白基因用重疊PCR進(jìn)行組裝。簡(jiǎn)言之，將載體M13-VHPCR1和M13-VKPCR1的DNA[Orlandi等人(1989)，PNAS，893833-7]用作模板以分別針對(duì)Vh和Vk鏈產(chǎn)生另兩個(gè)重疊的PCR片段，該P(yáng)CR片段包括具有鼠重鏈免疫球蛋白啟動(dòng)子且編碼前導(dǎo)信號(hào)肽的5’側(cè)翼序列和包含剪接位點(diǎn)和內(nèi)含子序列的3’側(cè)翼序列。將針對(duì)Vh和Vk分別由此產(chǎn)生的DNA片段用側(cè)翼引物在PCR中組合在一起，該側(cè)翼引物是獲得全長(zhǎng)DNA序列所必需的。用于這些“連接”反應(yīng)中的引物對(duì)對(duì)于Vh基因?yàn)楣押塑账酧L411/OL413和OL414/OL415，而對(duì)于Vk基因，應(yīng)用了寡核苷酸OL411/OL412和OL411/OL401。
將末端具有5’和3’側(cè)翼序列的此重鏈基因克隆入表達(dá)載體pSVgpt[Reichmann等人(1988)Nature，332323]中，該載體包括人IgG1恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域[Takahashi等人(1982)Cell，29671]和用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行選擇的gpt基因。將末端具有5’和3’側(cè)翼序列的此輕鏈基因克隆入表達(dá)載體pSVhyg[Reichmann等人，見(jiàn)上引文]中，在該載體中g(shù)pt基因由潮霉素抗性基因(hyg)替代且包括人κ恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域[Heiter等人(1980)Cell，22197]。對(duì)于兩個(gè)載體，將完全組裝的Vh和Vk基因以通過(guò)凝膠電泳純化的HindIII/BamHI片段進(jìn)行亞克隆，并用眾所周知的程序和試劑系統(tǒng)進(jìn)行處理。
表2對(duì)于Vh的合成的寡核苷酸
表3對(duì)于Vk的合成的寡核苷酸
實(shí)施例4修飾的抗體Vh和Vk基因的構(gòu)建稱(chēng)為Vk1的修飾的Vk基因是通過(guò)基因合成構(gòu)建的，該基因含有突變L3Q、A9D、I10T、L11S、V13A、I58V、S74T、T77S、V78L、S80A、I83A、D85T和L104V。表4列出了用于組裝Vk1的寡核苷酸。這些寡核苷酸與OL393、OL394、OL395、OL400、OL401、OL403、OL405、OL407和OL408(參見(jiàn)上述實(shí)施例3)一起用于如前文所述的基因合成反應(yīng)中。將該基因克隆入pGEM-T easy載體(Promega)中并將幾個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序直到獲得了正確的克隆。全長(zhǎng)免疫球蛋白基因的組裝和在表達(dá)載體中的亞克隆如同實(shí)施例3，只除了將寡核苷酸OL411和OL469用于Vk基因的連接反應(yīng)中。
在此Vk基因中引入了額外的突變以制備其它變體Vk基因。這些突變包括V19A、Q38H、R39T、S100G、N103K、V106I。誘變是用表5中所列的寡核苷酸通過(guò)PCR進(jìn)行的。將OL768和OL769、OL770和OL771與OL411和OL401(見(jiàn)上文)組合用于重疊PCR中。將OL648與OL411組合用于單個(gè)PCR中。將PCR產(chǎn)物克隆入pGEM-T Easy(Promega)中并通過(guò)測(cè)序鑒定正確的克隆。
變體Vh基因也是用誘變從野生型序列中構(gòu)建的。構(gòu)建了變體Vh基因，該變體Vh基因包含替代K3Q、E5V、M18L、K19R、V23A、I28T、I51T、I56T、E64D、S79N、A80S、V81L、T86N、D87S、R89K、G94A、T115L和L116V。這些突變是用表6中所列的寡核苷酸引入的。簡(jiǎn)言之，將每一套寡核苷酸與OL411和OL415組合用于重疊PCR中。將PCR產(chǎn)物克隆入pGEM-T Easy(Promega)中并通過(guò)測(cè)序鑒定正確的克隆。
將Vh和Vk結(jié)構(gòu)域以如前文所述的HindIII BamHI片段亞克隆入表達(dá)載體中，并根據(jù)如在實(shí)施例5中詳述的方法表達(dá)變體抗體。
表4用于Vk1組裝的合成的寡核苷酸
表5用于Vk誘變的合成的寡核苷酸
表6用于Vh誘變的合成的寡核苷酸
實(shí)施例5抗-TNFα抗體的表達(dá)、純化和定量重鏈和輕鏈表達(dá)載體是用電穿孔共轉(zhuǎn)染入NS/0中的，該NS/0是從歐洲動(dòng)物細(xì)胞保藏中心(ECACC)獲得的非免疫球蛋白產(chǎn)生性小鼠骨髓瘤。表達(dá)gpt基因的集落是在Dulbecco氏改良的Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco’sModified Eagle Medium)(DMEM)上進(jìn)行選擇的，該培養(yǎng)基補(bǔ)充了10％(v/v)的胎牛血清和抗生素(均購(gòu)自Gibco，Paisley，英國(guó))及0.8μg/ml霉酚酸和250μg/ml黃嘌呤(Sigma，Poole，英國(guó))。
轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆產(chǎn)生的人抗體是通過(guò)對(duì)人IgG的ELISA分析進(jìn)行測(cè)量的[Tempest等人(1991)BioTechnology9266]。將分泌抗體的細(xì)胞系進(jìn)行擴(kuò)大并通過(guò)蛋白質(zhì)A親和層析對(duì)抗體進(jìn)行純化[Harlow E.Lane D.；Antibodies，a Laboratory Manual，第309頁(yè)；Cold Spring HarborLaboratory Press(1988)，NY，美國(guó)]。
純化的抗體的濃度用探測(cè)目標(biāo)抗體的人κ恒定區(qū)的ELISA確定。使用治療性抗體infliximab(Schering-Plough Ltd，英國(guó))的商業(yè)制品確定了標(biāo)準(zhǔn)的濃度曲線(xiàn)，并將該標(biāo)準(zhǔn)用于計(jì)算所檢驗(yàn)的抗體制品的濃度。該試驗(yàn)是在96-孔板上進(jìn)行的，且所有測(cè)定均重復(fù)進(jìn)行兩次。
對(duì)于此試驗(yàn)，將平板(Dynatech Immulon 2)用每孔100μl的綿羊抗-人κ抗體(The Binding Site，Birmingham，英國(guó))進(jìn)行包被，該抗體是以1∶250在pH9.6的碳酸鹽/碳酸氫鹽包被緩沖液(Sigma，Poole，英國(guó))中稀釋的。包被在37℃進(jìn)行1小時(shí)，且用PBST(具有0.05％Tween20的PBS)將孔洗滌3次。向孔中加入100μL PBST和所描述的對(duì)照和檢驗(yàn)抗體的稀釋物。陰性對(duì)照僅應(yīng)用PBST而不添加抗體。將標(biāo)準(zhǔn)制品(infliximab)1∶1000(v/v)稀釋?zhuān)⒃谄桨迳蠙M向陳列二倍稀釋物系列。對(duì)于檢驗(yàn)的抗體制品也給出二倍稀釋物系列。將該平板于室溫溫育1小時(shí)，并將平板孔如前文所述進(jìn)行洗滌。結(jié)合的抗體用過(guò)氧化物酶綴合的綿羊抗-人IgGγ鏈特異性試劑(The Binding Site，Birmingham，英國(guó))進(jìn)行探測(cè)。將該第二抗體在PBST中1∶1000稀釋?zhuān)⒃谄桨宓拿恳粋€(gè)孔中添加100μl。將平板于室溫再溫育1小時(shí)并如前文所述進(jìn)行洗滌。探測(cè)是通過(guò)用每孔100μl“Sigmafast”過(guò)氧化物酶底物(Sigma，Poole，英國(guó))實(shí)現(xiàn)的，顯色反應(yīng)通過(guò)添加每孔40μl的1M硫酸而終止。光密度是用平板讀出器在492nm讀取的。相對(duì)于對(duì)照抗體繪制了抗體濃度對(duì)A492的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)比較確定所檢驗(yàn)抗體的濃度。
實(shí)施例6通過(guò)用修飾的抗體對(duì)TNFα進(jìn)行中和而在體外保護(hù)TNFα敏感性細(xì)胞抗-TNFα抗體中和TNFα對(duì)體外生長(zhǎng)的細(xì)胞系的致死作用的能力是用Galloway提供的方案檢驗(yàn)的[Galloway等人，1991，J.Immunol.Meth.14037-43]。該試驗(yàn)應(yīng)用鼠纖維肉瘤細(xì)胞系WEHI164，該細(xì)胞系對(duì)TNFα的致死作用非常敏感。
對(duì)于此試驗(yàn)，使細(xì)胞在固定的致死濃度的TNFα和一系列不同濃度的抗體存在時(shí)生長(zhǎng)過(guò)夜。第二天，測(cè)量細(xì)胞的代謝活性以作為存活的指示?？芍泻蚑NFα的抗體可賦予細(xì)胞保護(hù)作用，因而在試驗(yàn)中可測(cè)量到更大的代謝活性。
WEHI164從歐洲動(dòng)物細(xì)胞保藏中心(ECACC#.8702250)獲得并生長(zhǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基具有Glutamax(Gibco，Paisley，英國(guó))、10％胎牛血清(Perbio，Chester，英國(guó))并含有antibiotic-mycotic(Gibco)。在測(cè)定前的一天，將細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)以確保在隨后的試驗(yàn)期間的活性增殖。該試驗(yàn)在96孔平板上進(jìn)行，對(duì)所有處理均重復(fù)進(jìn)行兩次。制備含有對(duì)照抗體、檢驗(yàn)抗體的稀釋物和無(wú)抗體的陰性對(duì)照的平板。一般地，平板上橫向排列抗體的二倍稀釋物系列，該系列起始于50μl體積中10μg/ml抗體的濃度。制備在含有4μg/ml放線(xiàn)霉素的培養(yǎng)基中的50μg/ml的TNFα貯存液(Pepro Tech EC Ltd，London，英國(guó))并將其添加到處理孔中。通過(guò)輕輕敲打平板混合TNFα溶液，并在將制備的溶液轉(zhuǎn)移到含有細(xì)胞的測(cè)定平板之前將平板于室溫溫育至少2個(gè)小時(shí)。
測(cè)定平板是通過(guò)以每孔50μl接種2.5×104細(xì)胞并于37℃、5％CO2溫育至少1小時(shí)而制備的。隨后，將50μl TNFα/抗體混合物或?qū)φ罩破窂挠糜谙♂尭鞣N處理物的平板轉(zhuǎn)移出來(lái)。將細(xì)胞和處理物的混合物通過(guò)輕輕敲打平板進(jìn)行混合，并將平板于37℃在含有5％CO2的潮濕空氣中溫育過(guò)夜。下一天，用“CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell ProliferationAssay”(Promega，Southampton，英國(guó))估計(jì)每一孔中細(xì)胞的代謝活性。在添加試驗(yàn)溶液之后，將平板再溫育90分鐘，并用平板讀出器在492nm讀取每一孔中溶液的吸收值。吸收數(shù)值相對(duì)抗體濃度作圖。在所有測(cè)定中，陽(yáng)性對(duì)照制品是治療性抗體infliximab(Schering-Plough Ltd，英國(guó))的樣品，該樣品在測(cè)定中一致地展示出在低于0.1μg/ml的濃度下對(duì)TNFα的顯著中和。類(lèi)似地，本發(fā)明修飾的抗體在本試驗(yàn)中一致地展示出與陽(yáng)性對(duì)照制品等價(jià)的保護(hù)作用。圖2顯示從該試驗(yàn)中獲得的示例性圖。
實(shí)施例7對(duì)TNFα刺激的體外人內(nèi)皮細(xì)胞中ICAM-1的產(chǎn)生的中和。
在體外試驗(yàn)中檢驗(yàn)了抗-TNFα抗體對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮(HUVE)細(xì)胞中TNFα刺激的膜結(jié)合ICAM-1的產(chǎn)生進(jìn)行中和的能力。簡(jiǎn)言之，使HUVE細(xì)胞在TNFα和各種濃度的檢驗(yàn)或?qū)φ湛贵w存在時(shí)生長(zhǎng)于96孔平板中。隨后膜結(jié)合ICAM-1的定量相對(duì)表達(dá)應(yīng)用商業(yè)上可購(gòu)得的ICAM-1探測(cè)系統(tǒng)通過(guò)細(xì)胞裂解和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)估計(jì)。
對(duì)于此測(cè)定，制備了平行的兩套96孔平板。一套稱(chēng)為“測(cè)定平板”，是用細(xì)胞接種的，而另一套稱(chēng)為“制備平板”，用于制備TNFα和檢驗(yàn)及對(duì)照抗體溶液的稀釋物。制備平板中的內(nèi)含物最后將轉(zhuǎn)移到測(cè)定平板中。所有測(cè)定均重復(fù)進(jìn)行兩次。
對(duì)于測(cè)定平板，將HUVE細(xì)胞(Cambrex Bio Science，Wokingham，英國(guó))以50μl體積中每孔5×104個(gè)細(xì)胞的密度進(jìn)行接種。通過(guò)于37℃、5％CO2溫育至少2小時(shí)而使細(xì)胞能夠附著到平板上。
對(duì)于制備平板，將檢驗(yàn)抗體和陽(yáng)性對(duì)照抗體的二倍稀釋系列在平板橫向上一式兩份地陳列。抗體的起始濃度為100μl/孔終體積中20μg/ml。陰性對(duì)照無(wú)抗體。制備培養(yǎng)基中40ng/ml的TNFα(Pepro Tech EC Ltd，London，英國(guó))溶液，并以每孔100μl添加到制備平板上每一個(gè)處理孔中。將平板通過(guò)輕輕敲打進(jìn)行混合，并于室溫溫育45分鐘。在該溫育后，將制備平板中每孔50μl添加到測(cè)定平板上其相應(yīng)的孔中。將測(cè)定平板于37℃在含有5％CO2的潮濕空氣中溫育23小時(shí)。
下一天，去除所有孔的培養(yǎng)基并將細(xì)胞用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌1次。將細(xì)胞裂解，并測(cè)定裂解物中是否存在ICAM-1。裂解是通過(guò)在80μl裂解緩沖液中于4℃溫育45分鐘而實(shí)現(xiàn)的。裂解緩沖液包含8.7g/lNaCl、6.05g/l Tris、0.5％(v/v)NP40，pH8.0。裂解緩沖液也含有100mM濃度的蛋白酶抑制劑PMSF、碘乙酰胺和苯甲酰胺及各自為50mM和5mM濃度的胃蛋白酶抑制劑A和亮抑蛋白酶肽。這些抑制劑是在使用時(shí)新鮮添加入裂解緩沖液制備物中的。
在將裂解物轉(zhuǎn)移到新的圓底96孔平板中之前，將孔中的內(nèi)含物用微量移液器混合。將平板離心以清除沉淀的細(xì)胞碎片，并將清澈的裂解物轉(zhuǎn)移到另一新的96孔平板中以進(jìn)行保存(-20℃)或立即測(cè)定。
對(duì)于本測(cè)定試驗(yàn)，用商業(yè)的ELISA系統(tǒng)(sICAM-1Module set；BenderMedsystems，Towcester，英國(guó))和廠(chǎng)商建議的條件分析20μl清澈的裂解物中是否存在溶解的ICAM-1。每一孔中溶液的吸收值是用平板讀出器在492nm讀取的。吸收數(shù)值相對(duì)抗體濃度制圖。在所有測(cè)定中，陽(yáng)性對(duì)照制品是治療性抗體infliximab(Schering-Plough ltd)的樣品，該樣品在測(cè)定中一致地展示出在低于1μg/ml的濃度下對(duì)TNFα的顯著中和。類(lèi)似地，本發(fā)明修飾的抗體也一致地展示出與陽(yáng)性對(duì)照制品等價(jià)的對(duì)ICAM-1表達(dá)的濃度依賴(lài)性抑制作用。圖3顯示從該測(cè)定中獲得的示例性圖。
實(shí)施例8修飾的抗體結(jié)合TNFα的競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定試驗(yàn)本發(fā)明修飾的抗體與TNFα受體(RII，p75)競(jìng)爭(zhēng)的能力是在競(jìng)爭(zhēng)ELISA中測(cè)量的，該測(cè)量基于Siegel等人[Siegel等人(1995)Cytokine 7(1)15-25]所述的方法。將ELISA平板用受體(TNFαRII-Fc)包被，并與固定量的生物素化TNFα和抗體的二倍稀釋系列的混合物進(jìn)行溫育。TNFα與受體的結(jié)合是通過(guò)應(yīng)用鏈霉抗生物素蛋白-HRP綴合物的比色測(cè)定法進(jìn)行測(cè)量的。該測(cè)定試驗(yàn)用Immulon 2HB 96孔平板(Fisher，Loughborough，英國(guó))進(jìn)行，該平板通過(guò)在碳酸鹽包被緩沖液中于4℃用5μg/ml TNFαRII-Fc(R&Dsystems，Abingdon，英國(guó))包被過(guò)夜而制備。將50μl體積應(yīng)用于平板的每一個(gè)孔中。將包被的平板用PBS-0.05％(v/v)Tween20(PBS-T)洗滌至少5次，并通過(guò)添加PBS-T中的1％(v/v)BSA溶液，然后進(jìn)一步于室溫溫育至少1小時(shí)來(lái)封閉。
在該溫育過(guò)程中，設(shè)立了稀釋物平板，在該平板中陳列了檢驗(yàn)抗體和對(duì)照試劑。對(duì)于每一個(gè)檢驗(yàn)抗體，一般使用起始于50μl/孔終體積中50μg/ml的濃度的二倍稀釋系列。對(duì)照包括非-TNFα結(jié)合抗體作為陰性對(duì)照，而臨床等級(jí)的Infliximab(Schering-Plough ltd，英國(guó))作為陽(yáng)性對(duì)照。對(duì)照抗體與檢驗(yàn)抗體為相同的同種型。在添加抗體之后，添加每孔50μl的50ng/ml生物素-TNFα溶液，并將平板通過(guò)輕輕敲打而混合。該TNFα是如前文所述的商業(yè)來(lái)源產(chǎn)品(PeproTech，London，英國(guó))并用EZ連接磺基-NHS-生物素(Perbio，Tattenhall，英國(guó))按廠(chǎng)商建議的規(guī)程進(jìn)行生物素化。
將封閉溶液從測(cè)定平板中去除并將平板如前文所述進(jìn)行洗滌。將來(lái)自稀釋物平板的每一孔的50μl添加到測(cè)定平板的相關(guān)孔中，且在混合后，將測(cè)定平板于室溫溫育至少1小時(shí)。在溫育后，洗滌平板并將100μl稀釋的鏈霉抗生物素蛋白-HRP(Sigma，Poole，英國(guó))試劑添加到平板的每一孔中。將平板進(jìn)一步于室溫溫育至少1小時(shí)，并如前文所述進(jìn)行洗滌。測(cè)定結(jié)果用100μl/孔的Sigma-fast OPD片劑(Sigma，Poole，英國(guó))顯示，且顏色反應(yīng)是通過(guò)添加每孔50μl的1M硫酸而終止的。將平板進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取，并將結(jié)果繪制為抗體濃度對(duì)492nm吸收值的圖。圖4顯示從該測(cè)定試驗(yàn)中獲得的示例性圖。本發(fā)明的優(yōu)選抗體顯示出與本測(cè)定中陽(yáng)性對(duì)照抗體等價(jià)的對(duì)TNFα結(jié)合的濃度依賴(lài)性競(jìng)爭(zhēng)曲線(xiàn)。
實(shí)施例9對(duì)Hs27細(xì)胞中TNFα誘導(dǎo)的IL-6增量調(diào)節(jié)的抑制人包皮成纖維細(xì)胞可通過(guò)暴露于TNFα而被誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-6。本發(fā)明的修飾抗體阻斷該表達(dá)的增量調(diào)節(jié)的能力通過(guò)如下方式估計(jì)將細(xì)胞與TNFα及檢驗(yàn)抗體共溫育，然后用商業(yè)上可購(gòu)得的IL-6探測(cè)系統(tǒng)確定隨后分泌到培養(yǎng)基中的IL-6水平。
對(duì)于本測(cè)定試驗(yàn)，制備了平行的兩套96孔平板。一套稱(chēng)為“測(cè)定平板”，是用細(xì)胞接種的，而另一套稱(chēng)為“制備平板”，用于制備TNFα及檢驗(yàn)和對(duì)照抗體溶液的稀釋物。制備平板中的內(nèi)含物最后將轉(zhuǎn)移到測(cè)定平板中。所有測(cè)定均重復(fù)進(jìn)行兩次。
對(duì)于測(cè)定平板，將從歐洲動(dòng)物細(xì)胞保藏中心(ECACC no.94041901)獲得的人包皮成纖維細(xì)胞Hs27以每孔2×104個(gè)細(xì)胞的密度進(jìn)行接種，并通過(guò)于37℃在含有5％CO2的潮濕空氣中溫育過(guò)夜而使細(xì)胞能夠附著到平板上。貫穿始終的培養(yǎng)基為DMEM+Glutamax(Gibco，Paisley，英國(guó))，含有10％胎牛血清(Perbio，Chester，英國(guó))和常規(guī)的antibiotic/mycotic制品(Gibco)。
對(duì)于制備平板，將檢驗(yàn)抗體和陽(yáng)性對(duì)照抗體的二倍稀釋系列在平板橫向上一式兩份地陳列?？贵w的起始濃度為100μl/孔終體積中1.25μg/ml。陰性對(duì)照無(wú)抗體。將3ng/ml的TNFα溶液(PeproTech EC Ltd.，London，英國(guó))添加到含有抗體的所有孔中，而對(duì)于無(wú)抗體的對(duì)照孔，額外添加100μl/孔的培養(yǎng)基。將平板通過(guò)輕輕敲打進(jìn)行混合，并于室溫溫育至少30分鐘。
從含有Hs27細(xì)胞的測(cè)定平板中除去培養(yǎng)基，并將來(lái)自制備平板每一孔的100μl轉(zhuǎn)移到測(cè)定平板的相關(guān)孔中。將平板通過(guò)輕輕敲打進(jìn)行混合，并于37℃在含有5％CO2的潮濕空氣中溫育至少18小時(shí)。在溫育后，將培養(yǎng)基從每一孔中轉(zhuǎn)移到新的U-底96孔板中以在-20℃進(jìn)行保存或立即測(cè)定。
用商業(yè)的ELISA系統(tǒng)(IL-6 Module set；Bender Medsystems，Towcester，英國(guó))和廠(chǎng)商建議的條件分析培養(yǎng)基中是否存在IL-6。對(duì)于測(cè)定試驗(yàn)，將50μl培養(yǎng)基進(jìn)行1∶15(v/v)的稀釋。每一孔中溶液的吸收值用平板讀出器在492nm讀取。吸收數(shù)值對(duì)抗體濃度制圖。在所有測(cè)定中，陽(yáng)性對(duì)照制品是治療性抗體infliximab(Schering-Plough ltd，英國(guó))的樣品。本發(fā)明優(yōu)選的修飾抗體一致地展示出對(duì)IL-6表達(dá)的濃度依賴(lài)性抑制。圖9顯示從該測(cè)定試驗(yàn)中獲得的示例性圖。
實(shí)施例10TNFα的探測(cè)將簡(jiǎn)單的平板ELISA用于證實(shí)本發(fā)明的修飾抗體與TNFα結(jié)合的能力。該測(cè)定是用治療性抗體Infliximab(Schering-Plough ltd，英國(guó))制品作為正對(duì)照并用非-TNFα結(jié)合性人IgG制品(Sigma I2511)作為負(fù)對(duì)照進(jìn)行比較而進(jìn)行的。該測(cè)定用下面詳述的方法進(jìn)行，并證明本發(fā)明優(yōu)選的組合物(Vh5/Vk12)與本測(cè)定中的對(duì)照抗體具有相同的功效。典型的結(jié)合曲線(xiàn)如圖7所示。
將Immulon 2HB 96孔平板(Fisher，Loughborough，英國(guó))在碳酸鹽包被緩沖液中于4℃用2.5μg/ml TNFα(Peprotech，London，英國(guó))包被過(guò)夜。將50μl的體積應(yīng)用于平板的每一個(gè)孔中。將包被的平板用PBS-0.05％(v/v)Tween20(PBS-T)洗滌3次。
制備了每一個(gè)抗體的二倍稀釋系列，并各自一式兩份地以每孔100μl體積應(yīng)用。最高的抗體濃度為1μg/ml。將平板于室溫溫育1小時(shí)并如前文所述用PBST進(jìn)行洗滌。為了探測(cè)結(jié)合的抗體，將平板與在PBST中1/1000稀釋的小鼠-抗人IgG-HRP綴合物(Sigma，Poole，英國(guó))制品進(jìn)行溫育。溫育為在室溫進(jìn)行至少90分鐘。將平板再次如前文所述用PBST進(jìn)行洗滌，且結(jié)合的抗體用100μl/孔的Sigma-Fast OPD顯示。顯色5分鐘，然后通過(guò)添加40μl/孔的1M H2SO4而終止反應(yīng)。將平板在492nm進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取，并將數(shù)據(jù)繪制為抗體濃度對(duì)光密度的圖。圖7顯示代表性的結(jié)合曲線(xiàn)圖，該結(jié)合曲線(xiàn)圖表明了在該測(cè)定中修飾的抗體(Vh5/Vk12)和陽(yáng)性對(duì)照之間的功能等價(jià)性。
實(shí)施例11
在體外增殖測(cè)定試驗(yàn)中用人PBMC證明修飾的抗-TNFα抗體的減弱的免疫原性潛力。
修飾的抗體是根據(jù)實(shí)施例5的方法制備的。陽(yáng)性對(duì)照(攻擊性抗體)是臨床等級(jí)的infliximab(Schering-Plough ltd，英國(guó))。對(duì)于T細(xì)胞增殖測(cè)定，將來(lái)自健康供體的4×106個(gè)PBMC(每孔)與非修飾的和修飾的抗體在2ml大體積培養(yǎng)物(24孔平板中)中進(jìn)行溫育。用5和50μg/ml的修飾的和非修飾的抗體對(duì)每一個(gè)供體進(jìn)行處理。此外，維持未處理的大體積對(duì)照培養(yǎng)物以確定刺激指數(shù)。在5、6、7和8日，將每一大體積培養(yǎng)物中的細(xì)胞輕輕攪動(dòng)，并取50μl樣品一式三份確定增殖指數(shù)。將50μl樣品等份試樣各自轉(zhuǎn)移到U-底96孔平板的3個(gè)孔中。將新鮮的AIM V培養(yǎng)基(130μl)添加到96孔中的每一個(gè)孔中。將細(xì)胞用每孔1μCi的[3H]胸腺嘧啶進(jìn)行脈沖(18-21小時(shí))，該[3H]胸腺嘧啶稀釋在20μl總體積的AIMV培養(yǎng)基中。對(duì)于每一個(gè)培養(yǎng)物，總體積為200μl。CPM值是用β-平板讀出器收集的，且每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的刺激指數(shù)根據(jù)上文實(shí)施例2所述確定。
相對(duì)于每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)和抗體處理繪制SI圖。將顯著的SI取為＞2.0。在有反應(yīng)的供體中，用infliximab處理導(dǎo)致在第7日具有峰值的顯著的增殖反應(yīng)。在相同的供體中，用本發(fā)明修飾的抗體組合物(Vh5/Vk12)處理未導(dǎo)致顯著的增殖反應(yīng)。該結(jié)果顯示與親代抗體相比，本發(fā)明優(yōu)選的抗體組合物具有減小的免疫原性潛力。從該測(cè)定中獲得的代表性圖在圖10中提供。
權(quán)利要求
1.一種修飾的單克隆抗-TNFα抗體，該抗體當(dāng)體內(nèi)應(yīng)用時(shí)與具有基本相同的生物學(xué)特異性的任何非修飾的抗體相比基本無(wú)免疫原性或有低的免疫原性，且與非修飾的親代抗體相比在重鏈和/或輕鏈V-區(qū)中包含特定氨基酸殘基的改變，其中該改變導(dǎo)致在所述V-區(qū)中可以在親代抗體中充當(dāng)II型MHC結(jié)合配體并刺激T-細(xì)胞的肽序列的數(shù)目減少或消除。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的修飾的抗體，其中所述親代抗體是嵌合的A2(cA2)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的修飾的抗體，其中還在抗體的CDR中進(jìn)行V-區(qū)的改變，從而基本保持親代抗體的結(jié)合親和力。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3的修飾的抗體，其中在非修飾的抗體的所述V-區(qū)中進(jìn)行改變的肽序列選自如圖1和表1所示的連續(xù)的T-細(xì)胞抗原決定部位序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的修飾的抗體，其中對(duì)所述T-細(xì)胞抗原決定部位的任何一個(gè)中的1-9個(gè)氨基酸進(jìn)行改變。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的修飾的抗體，其中對(duì)1個(gè)氨基酸進(jìn)行改變。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的修飾的抗體，其中所述氨基酸殘基的改變是通過(guò)替代實(shí)現(xiàn)的。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-7中任何一項(xiàng)的修飾的抗體，其中還進(jìn)行其它氨基酸殘基改變以恢復(fù)該抗體的生物學(xué)活性。
9.根據(jù)權(quán)利要求3-8中任何一項(xiàng)的修飾的抗體，其中所述V-區(qū)中的氨基酸殘基改變是在親代抗體的至少一段選自如下的具有連續(xù)氨基酸殘基的肽序列中進(jìn)行的(A) GLVQPGGSMKLSCVAS；(B) WVAEIRSKSINSA；(C) SRDDSKSAVYLQMTDLRT；(D) RNYYGSTYDYWGQGTTLTVSS；(E) DILLTQSPAILSVSPGERVSF；(F) HWYQQRTNGSPR；(G) LIKYASESMSGIPS；(H) DFTLSINTVESEDIADYYCQQ.
10.根據(jù)權(quán)利要求2或3的修飾的抗體，其中V-區(qū)重鏈(“Vh”鏈)包含選自SEQ ID 1(Vh1)、SEQ ID 2(Vh3)、SEQ ID 3(Vh5)和SEQID 4(Vh8)的序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求2或3的修飾的抗體，其中V-區(qū)輕鏈(“Vk”鏈)包含選自SEQ ID 5(Vk1)、SEQ ID 6(Vk12)、SEQ ID 7(Vk5)和SEQ ID 8(Vk8)的序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11的修飾的抗體，其包含權(quán)利要求10中的任一Vh鏈和權(quán)利要求11中的任一Vk鏈。
13.權(quán)利要求12的修飾的抗體，其包含Vh5鏈(SEQ ID 3)和Vk12鏈(SEQ ID 6)。
14.權(quán)利要求12的修飾的抗體，其包含Vh1鏈(SEQ ID 1)和Vk1鏈(SEQ ID 5)。
15.權(quán)利要求12的修飾的抗體，其包含Vh1鏈(SEQ ID 1)和Vk5鏈(SEQ ID 7)。
16.權(quán)利要求12的修飾的抗體，其包含Vh1鏈(SEQ ID 1)和Vk8鏈(SEQ ID 8)。
17.權(quán)利要求12的修飾的抗體，其包含Vh8鏈(SEQ ID 4)和Vk5鏈(SEQ ID 7)。
18.權(quán)利要求2或3的修飾的抗體，其具有改變的V-區(qū)重鏈，并與未改變的cA2抗體相比包含下列任一組的氨基酸殘基替代(a1) M18L，K19R，V23A，I28T，I51T，I56T，S79N，A80S，V81L，T86N，D87S，R89K，L116V；(a2) K3Q，E5V，M18L，K19R，V23A，I28T，S79N，A80S，V81L，T86N，D87S，R89K，G94A；(a3) M18L，K19R，V23A，I28T，S79N，A80S，V81L，T86N，D87S，R89K，L116V；(a4) K3Q，E5V，M18L，K19R，V23A，I28T，I51T，I56T，E64D，S79N，A80S，V81L，T86N，D87S，R89K，G94A，T115L，L116V.
19.權(quán)利要求2或3的修飾的抗體，其具有改變的V-區(qū)輕鏈，并與未改變的cA2抗體相比包含下列任一組的氨基酸殘基替代(b1) L3Q，A9D，I10T，L11S，V13A，V19A，Q38H，R39T，I58V，S74T，T77S，V78L，S80A，I83A，D85T；(b2) L3Q，A9D，I10T，L11S，V13A，I58V，S74T，T77S，V78L，S80A，I83A，D85T，L104V；(b3) L3Q，A9D，I10T，L11S，V13A，I58V，S74T，T77S，V78L，S80A，I83A，D85T，S100G，N103K，L104V，V106I；(b4) L3Q，A9D，I10T，L11S，V13A，V19A，Q38H，R39T，I58V，S74T，T77S，V78L，S80A，I83A，D85T，S100G，N103K，L104V，V106I.
20.權(quán)利要求2或3的修飾的抗體，其具有改變的V-區(qū)重鏈和輕鏈，并同時(shí)包含如權(quán)利要求18所示的氨基酸替代組a1-a4中的任一組和如權(quán)利要求19所示的氨基酸替代組b1-b4中的任一組。
21.權(quán)利要求20的修飾的抗體，其具有改變的V-區(qū)重鏈和輕鏈并同時(shí)包含替代組a1和b1。
22.權(quán)利要求20的修飾的抗體，其具有改變的V-區(qū)重鏈和輕鏈并同時(shí)包含替代組a2和b2。
23.權(quán)利要求20的修飾的抗體，其具有改變的V-區(qū)重鏈和輕鏈并同時(shí)包含替代組a2和b3。
24.權(quán)利要求20的修飾的抗體，其具有改變的V-區(qū)重鏈和輕鏈并同時(shí)包含替代組a2和b4。
25.權(quán)利要求20的修飾的抗體，其具有改變的V-區(qū)重鏈和輕鏈并同時(shí)包含替代組a4和b3。
26.根據(jù)權(quán)利要求1-25中任何一項(xiàng)的修飾的抗體，其中恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域源自人IgG1和人κ。
27.根據(jù)權(quán)利要求1-26中任何一項(xiàng)的修飾的抗體，其中當(dāng)該抗體以完整蛋白質(zhì)形式在誘導(dǎo)的人T-細(xì)胞細(xì)胞增殖生物學(xué)測(cè)定試驗(yàn)中檢測(cè)時(shí)，與使用來(lái)自相同供體的細(xì)胞平行檢測(cè)的親代抗體相比顯示出較小的刺激指數(shù)，其中該指數(shù)記為在蛋白質(zhì)刺激后評(píng)定的細(xì)胞增殖值除以在未接受蛋白質(zhì)的對(duì)照細(xì)胞中評(píng)定的細(xì)胞增殖值，且其中細(xì)胞增殖是由任何適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)量的。
28.根據(jù)權(quán)利要求1-26中任何一項(xiàng)的修飾的抗體，其包含V-區(qū)序列，其中從該序列可以得到肽，該肽在誘導(dǎo)的人T-細(xì)胞細(xì)胞增殖生物學(xué)測(cè)定試驗(yàn)中進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，顯示出比平行地進(jìn)行檢測(cè)的源自非修飾的親代抗體的肽有低的刺激指數(shù)，其中該指數(shù)記為在肽刺激后評(píng)定的細(xì)胞增殖值除以在未接受肽的對(duì)照細(xì)胞中評(píng)定的細(xì)胞增殖值，且其中細(xì)胞增殖是由任何適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)量的。
29.一種編碼根據(jù)權(quán)利要求1-28中任何一項(xiàng)的抗體的DNA分子。
30.一種包含如在上述權(quán)利要求的任何一項(xiàng)中限定的修飾的抗-TNFα抗體的藥物組合物，其任選地還包含藥物可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
31.如在上述權(quán)利要求的任何一項(xiàng)中限定的修飾的抗-TNFα抗體在制備用于治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和Crohn氏病的藥物中的用途。
32.一種由9-15個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基組成的肽分子，該肽分子具有潛在的II型MHC結(jié)合活性并從非修飾的抗-TNFα抗體A2的一級(jí)序列中生成，該肽分子在細(xì)胞增殖生物學(xué)測(cè)定試驗(yàn)中具有至少1.8～2的刺激指數(shù)，其中該指數(shù)記為在肽刺激后評(píng)定的細(xì)胞增殖值除以在未接受肽的對(duì)照細(xì)胞中評(píng)定的細(xì)胞增殖值，且其中細(xì)胞增殖是由任何適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)量的。
33.權(quán)利要求32的肽分子，其選自如在圖1或表1中描述的連續(xù)的T-細(xì)胞抗原決定部位序列。
34.一種通過(guò)氨基酸替代從權(quán)利要求32或33的肽分子形成的修飾的肽分子，該修飾的肽分子具有以小于2的刺激指數(shù)表示的減小的或不存在的潛在II型MHC結(jié)合活性，其中該指數(shù)記為在肽刺激后評(píng)定的細(xì)胞增殖值除以在未接受肽的對(duì)照細(xì)胞中評(píng)定的細(xì)胞增殖值，且其中細(xì)胞增殖是由任何適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)量的。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的修飾的肽分子，該肽分子具有小于1.8的刺激指數(shù)。
36.根據(jù)權(quán)利要求32-35之任一項(xiàng)的肽在制備抗-TNFα抗體中的用途，其中所述抗-TNFα抗體當(dāng)體內(nèi)應(yīng)用時(shí)與任何非修飾的親代抗體相比基本無(wú)免疫原性或具有低的免疫原性。
全文摘要
本發(fā)明涉及對(duì)人腫瘤壞死因子α(TNFα)反應(yīng)性抗體進(jìn)行修飾，從而導(dǎo)致當(dāng)用于體內(nèi)時(shí)與任何非修飾的親代抗體相比基本無(wú)免疫原性或具低的免疫原性的抗－TNFα抗體。本發(fā)明也涉及包含親代抗體V－區(qū)域中的T－細(xì)胞抗原決定部位的肽分子，該肽分子通過(guò)氨基酸改變進(jìn)行修飾以減少或消除該T－細(xì)胞抗原決定部位。
文檔編號(hào)A61P1/04GK1585778SQ02822357
公開(kāi)日2005年2月23日 申請(qǐng)日期2002年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月12日
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