專利名稱:CpG制劑及相關(guān)方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及與其它治療制劑組合的免疫刺激性核酸的用途。
背景技術(shù):
僅在美國因感染性疾病所致的死亡率在1980和1992年間上升58%。在此期間,與感染性疾病對(duì)抗的抗感染療法的應(yīng)用顯著增長,目前成為每年數(shù)十億美元的產(chǎn)業(yè)。即使存在抗感染劑應(yīng)用的這些增長,感染性疾病的治療和預(yù)防依然是全世界醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的難題。一般說來,存在3類抗感染劑,抗細(xì)菌劑、抗病毒劑和抗真菌劑,而且即便是在這些類別的制劑內(nèi),就它們用于治療的微生物類型而言,仍存在一些重疊。
抗感染劑療法的一個(gè)問題是發(fā)生在用該抗感染劑治療的宿主中的副作用。例如,許多抗感染劑能夠殺死或抑制廣譜的微生物,而非特定類型物種特異性的。用這些類型的抗感染劑治療導(dǎo)致殺死生活在宿主內(nèi)的正常微生物菌群及傳染微生物。微生物菌群的喪失能夠引起疾病并發(fā)癥,并使得宿主易被其它病原體感染,因?yàn)槲⑸锞号c傳染性病原體競爭并起屏障的作用。其它副作用可能由于這些化學(xué)藥品對(duì)宿主的非微生物細(xì)胞或組織的特異性或非特異性作用而引起。
除了抗感染劑之外,疫苗被用于預(yù)防和治療感染性疾病。疫苗包括與佐劑組合的抗原。佐劑在疫苗治療和預(yù)防感染性疾病的功效方面起著重要作用。除了提高免疫應(yīng)答的強(qiáng)度和動(dòng)力學(xué),佐劑還起著決定所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的類型的作用。鋁化合物,包括氫氧化鋁和磷酸鋁,被廣泛用于人類疫苗。這些佐劑使免疫應(yīng)答偏向T-輔助細(xì)胞2型(Th2)應(yīng)答,它的特征是Th2型細(xì)胞因子例如IL-4和IL-5的分泌以及IgG1和IgE型抗體的產(chǎn)生,但細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答微弱或者不存在(Bofraford,R.1998.Will adjuvants be needed for vaccines of thefuture?Dev.Biol.Stand.9213-17;Brazolot Millan,C.L.等1998.CpGDNA can induce strong Th1 humoral and cell-mediated immuneresponses against hepatitis B surface antigen in young mice.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9515553-15558;Davis,H.L.等1998.CpG DNA is apotent enhancer of specific immunity in mice immunizde withrecombinant hepatitis B surface antigen.JImmunol 160870-876)。適當(dāng)類型的免疫應(yīng)答對(duì)于成功免疫是必要的。與Th1型免疫應(yīng)答相關(guān)聯(lián)的強(qiáng)有力的先天免疫被認(rèn)為對(duì)于控制胞內(nèi)病原體是必要的,反之,強(qiáng)有力的體液免疫,其被發(fā)現(xiàn)與Th1和Th2型免疫應(yīng)答相關(guān),似乎對(duì)于控制胞外病原體是必要的(Constant,S.L.和K.Bottomly.1997.Induction of Th1 and Th2 CD4+ T cell responsesthe alternativeapproaches.Ann.Rev.Immunol.15297-322)。含有未甲基化的CpG二核苷酸的合成寡聚脫氧核糖核苷酸(CpGODN)是新佐劑,已知其促進(jìn)Th1型免疫應(yīng)答,分泌IFN-γ、TNF-α和IL-12細(xì)胞因子,調(diào)理諸如那些IgG2a同型的抗體,和強(qiáng)CTL誘導(dǎo)(Chu,R.s.等1997.CpGoligodeoxynucleotides act as adjuvants that switch on T helper 1(Th1)immunity.J.Exp.Med 1861623-1631;Klinman,D.M等1999.CpGmotifs as immune adjuvants.Vaccine 1719-25)。
牛皰疹病毒-1(Bovine herpesvirus-1,BHV-1),α皰疹病毒亞科的一個(gè)成員,與包括鼻氣管炎、外陰陰道炎、流產(chǎn)、結(jié)膜炎(conjuctivitis)、腦炎以及全身性的系統(tǒng)感染在內(nèi)的許多臨床疾病表現(xiàn)有關(guān)(Gibbs,E.P.J.和M.M.Rweyemamu.1977.Bovine herpesvirus-1,p.31Anonymous Bovine herpesvirus.Vet.Bull,London;Yates,W.D.G.1982.A review of infectious bovine rhinotrachetitis,shipping feverpneumonia and viral-bacterial synergism in respiratory disease of cattle.Can.J.Comp.Med 46225-263)。牛呼吸道疾病在北美導(dǎo)致養(yǎng)牛業(yè)每年高達(dá)10億美元的損失(Yates,W.D.G.1982.A review of infectiousbovine rhinotrachetitis,shipping fever pneumonia and viral-bacterialsynergism in respiratory disease of cattle.Can.J.Comp.Med 46225-263)。即使有減毒活疫苗以及滅活疫苗可用,這些損失仍然發(fā)生。目前,能夠最大潛力地集合針對(duì)BHV-1的功效、安全性、抗原特異性和保護(hù)的在于亞單位疫苗,它由一種或多種病毒糖蛋白gB、gC和gD,以及佐劑組成。但是,常規(guī)佐劑例如VSA3,不僅產(chǎn)生Th2-樣免疫應(yīng)答,而且不被代謝并遺留注射部位反應(yīng)。這種反應(yīng)是人類或獸醫(yī)疫苗所無法接受的。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了利用免疫刺激核酸聯(lián)合特定的制劑治療受試個(gè)體的改善的方法和產(chǎn)品。本發(fā)明部分地建立在當(dāng)某些類型的免疫刺激核酸與特定制劑聯(lián)合使用時(shí),觀察到意料之外的、改善的結(jié)果這一發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上。例如,某些免疫刺激核酸和制劑聯(lián)合的功效比免疫刺激核酸單獨(dú)使用有極大的提高。這個(gè)結(jié)果令人驚訝,部分地是因?yàn)槊庖叽碳ず怂崤c制劑是通過不同的機(jī)制起作用的,不會(huì)必然地預(yù)期能以協(xié)同的方式提高另一個(gè)的功效。
在一方面,本發(fā)明涉及通過向感染病毒或具有病毒感染風(fēng)險(xiǎn)的非人動(dòng)物施用降低病毒釋放(viral shedding)有效量的免疫刺激核酸和水包油乳劑,來降低非人動(dòng)物體內(nèi)病毒釋放的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中,水包油乳劑是EMULSIGENTM??蛇x地,非人動(dòng)物為狗、貓、馬、牛、豬、綿羊、山羊、靈長類動(dòng)物或雞。
活性劑的組合可以與或不與抗原或抗病毒劑一起給藥。在一些實(shí)施方案中,抗病毒劑從由醋孟南(Acemannan)、阿昔洛韋(Acyclovir)、阿昔洛韋鈉(Acyclovir Sodium)、阿德福韋(Adefovir)、Alovudine、阿韋舒托(Alvircept Sudotox)、鹽酸金剛烷胺(AmantadineHydrochloride)、阿拉諾丁(Aranotin)、阿立酮(Arildone)、甲磺酸阿替韋啶(Atevirdine Mesylate)、阿夫立定(Avridine)、Cidofovir、Cipamfylline、鹽酸阿糖胞苷(Cytarabine Hydrochloride)、甲磺酸地拉夫定(Delavirdine Mesylate)、地昔洛韋(Desciclovir)、去羥肌苷(Didanosine)、二噁沙利(Disoxaril)、依度尿苷(Edoxudine)、恩韋拉登(Enviradene)、恩韋肟(Enviroxime)、泛昔洛韋(Famciclovir)、鹽酸法莫汀(Famotine Hydrochloride)、非西他濱(Fiacitabine)、非阿尿苷(Fialuridine)、膦利脂(Fosarilate)、膦甲酸鈉(FoscarnetSodium)、膦乙酸鈉(Fosfonet Sodium)、更昔洛韋(Ganciclovir)、更昔洛韋鈉(Ganciclovir Sodium)、碘苷(Idoxuridine)、乙氧丁酮醛(Kethoxal)、拉米夫定(Lamivudine)、洛布卡韋(Lobucavir)、鹽酸美莫汀(Memotine Hydrochloride)、美替沙腙(Methisazone)、奈韋拉平(Nevirapine)、噴昔洛韋(Penciclovir)、吡羅達(dá)韋(Pirodavir)、利巴韋林(Ribavirin)、鹽酸金剛乙胺(RimantadineHydrochloride)、甲磺酸沙奎那韋(Saquinavir Mesylate)、鹽酸索金剛胺(Somantadine Hydrochloride)、索立夫定(Sorivudine)、維司托隆(Statolon)、司他夫定(Stavudine)、鹽酸替洛隆(TiloroneHydrochloride)、曲氟尿苷(Trifluridine)、鹽酸伐昔洛韋(ValaciclovirHydrochloride)、阿糖腺苷(Vidarabine)、磷酸阿糖腺苷(VidarabinePhosphate)、磷酸阿糖腺苷鈉(Vidarabine Sodium Phosphate)、韋羅肟(Viroxime)、扎西他濱(Zalcitabine)、齊多夫定(Zidovudine)和凈韋肟(Zinviroxime)組成的組中選擇。
在另一方面,本發(fā)明是通過經(jīng)侵入途徑向受試個(gè)體施用加佐劑疫苗(adjuvanted vaccine)以及降低加佐劑疫苗引起的組織損傷有效量的免疫刺激核酸,來降低受試個(gè)體接種后的組織損傷的方法,其中疫苗以水包油乳劑為佐劑。在一個(gè)實(shí)施方案中,水包油乳劑是EMULSIGENTM。侵入途徑可以是造成組織屏障(例如皮膚)開口的任何類型途徑。在一些實(shí)施方案中,侵入途徑是皮下或肌內(nèi)途徑。
根據(jù)另一方面,本發(fā)明是通過向受試個(gè)體施用產(chǎn)生免疫應(yīng)答有效量的CpG寡核苷酸和水包油乳劑,來誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法。可選地,免疫應(yīng)答為抗原特異性免疫應(yīng)答,并向受試個(gè)體施用抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中,水包油乳劑是EMULSIGENTM。
而根據(jù)另一方面,本發(fā)明涉及通過向受試個(gè)體施用亞治療劑量的抗原和免疫刺激核酸,來降低向受試個(gè)體給藥產(chǎn)生抗原特異性免疫應(yīng)答的抗原劑量的方法,其中亞治療劑量的抗原和免疫刺激核酸的聯(lián)合產(chǎn)生抗原特異性免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中,抗原的亞治療劑量是比在抗原與明礬配制時(shí)產(chǎn)生抗原特異性免疫應(yīng)答的抗原最小有效劑量少至少50%的劑量。作為選擇地,抗原的亞治療劑量可以是比在抗原與明礬配制時(shí)產(chǎn)生抗原特異性免疫應(yīng)答的抗原最小有效劑量少至少90%的劑量。
本發(fā)明的方法包括免疫刺激核酸的應(yīng)用。免疫刺激核酸可以是CpG寡核苷酸,而且在一些實(shí)施方案中是2007(TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT)、2142(TCGCGTGCGTTTTGTCGTTTTGACGTT)、2135(TCGTCGTTTGTCGTTTTGTCGTT)和/或2216(ggGGGACGATCGTCgggggG)。作為選擇地,免疫刺激核酸可以是富含T的核酸,例如SEQ ID NO52-57和/或SEQ ID NO62-94的ODN,或者多聚-G核酸例如SEQ ID NO46、SEQ ID NO47、SEQ ID NO58、SEQ ID NO61和/或SEQ ID NO95-133的ODN。在另外的實(shí)施方案中,免疫刺激核酸可以具有從由SEQ ID NO1到SEQ ID NO146組成的組中選擇的序列。
免疫刺激核酸,例如CpG寡核苷酸可以單次或多次給藥。如果CpG寡核苷酸多次給藥,它可以定期給藥,例如,象以周計(jì)、以天計(jì)或以月計(jì)。
免疫刺激核酸,例如CpG寡核苷酸,可以通過任何途徑給藥。例如,免疫刺激核酸可以通過口服、通過注射、或者通過持續(xù)釋放裝置給藥。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中,受試個(gè)體患有癌癥或感染性疾病。在其它實(shí)施方案中,受試個(gè)體處于患癌癥或感染性疾病的風(fēng)險(xiǎn)中??蛇x地,受試個(gè)體患有從由骨癌、腦癌和CNS癌、結(jié)締組織癌、食道癌、眼癌、霍奇金淋巴瘤、喉癌、口腔癌、皮膚癌和睪丸癌組成的組中選擇的癌癥。受試個(gè)體還可能是免疫受損的(immunocompromised)個(gè)體。在其它實(shí)施方案中,受試個(gè)體具有選自病毒性、細(xì)菌性、真菌性和寄生蟲性感染的感染性疾病。而在另一個(gè)實(shí)施方案中,受試個(gè)體處于患從由病毒性、細(xì)菌性、真菌性和寄生蟲性感染組成的組中選擇的感染性疾病的風(fēng)險(xiǎn)中。
免疫刺激核酸可以具有修飾的主鏈,例如磷酸修飾的主鏈或肽修飾的寡核苷酸主鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中,磷酸修飾的主鏈為硫代磷酸修飾的主鏈。
在另一方面,本發(fā)明是免疫刺激核酸與水包油乳劑的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中,水包油乳劑為EMULSIGENTM。
在本發(fā)明所有方面的某些實(shí)施方案中,免疫刺激核酸可以是刺激Th1免疫應(yīng)答的核酸。類似地,在本發(fā)明的某些方面,有可能向受試個(gè)體給藥一種或多種不同的免疫刺激核酸。因此根據(jù)此實(shí)施方案,可以在特定的方法中向受試個(gè)體給藥一種、兩種、三種、四種、五種或更多不同的免疫刺激核酸。因此,術(shù)語“免疫刺激核酸”旨在包括單個(gè)免疫刺激核酸、特定類型的多種免疫刺激核酸,以及不同類型的多種免疫刺激核酸。
根據(jù)其它實(shí)施方案,免疫刺激核酸在給藥其它治療制劑如水包油乳劑、抗原等的同時(shí)、之前或之后給藥。
在一些實(shí)施方案中,免疫刺激核酸以上調(diào)、增強(qiáng)或激活免疫應(yīng)答的有效量給藥。在一些實(shí)施方案中,免疫刺激核酸以使免疫應(yīng)答由Th2改向?yàn)門h1免疫應(yīng)答的有效量給藥。而在其它實(shí)施方案中,給藥具有不同的核酸序列并且具有不同的功效的多種免疫核酸分子。
本發(fā)明的各種限制可以涵蓋本發(fā)明的各種實(shí)施方案。所以,可以預(yù)期涉及任何一個(gè)元素或元素組合的本發(fā)明的各種限制可以被包括在本發(fā)明的各個(gè)方面。
附圖的簡單說明
圖1是描繪接種動(dòng)物和對(duì)照動(dòng)物在初次免疫14、47和64天后,BHV-1中和抗體反應(yīng)的條形圖(Imm 1(14天)初次免疫后14天,Imm2(47天)二次免疫后8天,post chall(64天)病毒攻擊后11天)??贵w滴度表達(dá)為使用100 PFU BHV-1的50%終點(diǎn)。誤差條表示7個(gè)動(dòng)物的幾何平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖2是描繪接種后細(xì)胞免疫應(yīng)答的三個(gè)條形圖。數(shù)據(jù)表達(dá)為平均數(shù)±平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差。(a)攻擊前后PBMC抗原特異性增殖。刺激指數(shù)代表存在抗原時(shí)的每分鐘計(jì)數(shù)除以不存在抗原時(shí)的每分鐘計(jì)數(shù)。(b)抗原-刺激孔中每106個(gè)細(xì)胞的斑點(diǎn)數(shù)目與非刺激孔中每106個(gè)細(xì)胞的斑點(diǎn)數(shù)目的差別。(c)24小時(shí)后PBMC響應(yīng)BHV-1 gD所分泌的IFN-γ的量。
圖3是描繪二次免疫8天后(Imm 2)和病毒感染11天后(攻擊后)針對(duì)BHV-1糖蛋白的血清抗體的兩個(gè)條形圖。(a)針對(duì)tgD的抗體,(b)針對(duì)tgB的抗體。
圖4是描繪在用BHV-1攻擊的動(dòng)物中免疫對(duì)直腸溫度的影響的兩個(gè)圖。a.平均溫度反應(yīng)b.發(fā)熱天數(shù);溫度≥40℃的全部天數(shù)。
圖5是描繪在用BHV-1攻擊的動(dòng)物中免疫對(duì)體重增加的影響的兩個(gè)圖。(a)累積體重變化。(b)體重?fù)p失超過或低于5kg的動(dòng)物天數(shù)(number of animal days)。
圖6是描繪-1攻擊后病毒復(fù)制程度的圖。在攻擊當(dāng)天及之后交替的天數(shù)中,在免疫動(dòng)物的鼻分泌物中測定病毒滴度。誤差條表示7個(gè)動(dòng)物的幾何平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。
發(fā)明的詳細(xì)說明根據(jù)本發(fā)明令人驚奇地發(fā)現(xiàn),免疫刺激核酸和治療制劑例如水包油乳劑的被選組合比其中任一組分單獨(dú)時(shí)作用引人注目地更好,并且有時(shí)甚至協(xié)同地作用,提高免疫應(yīng)答。雖然許多制劑已經(jīng)被開發(fā)和測試用于施用藥物,但這些特定類型引人注目地增強(qiáng)免疫刺激核酸的活性。這令人驚奇,部分是因?yàn)槠渌嗨浦苿┎槐憩F(xiàn)出與本文描述的治療制劑同樣引人注目的改進(jìn)。如本文所用的術(shù)語“治療制劑”是指水包油乳劑例如EMULSIGENTM。
正如下文所描述的實(shí)施例中所證明的那樣,免疫刺激核酸的組合在治療和預(yù)防感染性疾病方面表現(xiàn)出顯著提高的治療效果。最近證明CpG ODN與明礬的組合具有增強(qiáng)小鼠免疫應(yīng)答的極大潛力,與其它佐劑組合相比在注射部位具有最小的副作用(Weeratha,R.D.,等2000.CpG DNA induces strohger immune responses with less toxicity thanother adjuvants.Vaccine 181755-1762)。不過,盡管在小鼠中存在有前景的結(jié)果,但發(fā)現(xiàn)以CpG ODN與明礬組合為佐劑的BHV-1tgD與以單獨(dú)CpG ODN為佐劑的tgD誘導(dǎo)類似的免疫應(yīng)答,未能完全保護(hù)小牛免受BHV-1的攻擊。另外,佐以弗氏不完全佐劑的BHV-1亞單位疫苗也不能保護(hù)小牛免受BHV-1的攻擊(Israel,B.A.,等1998.Epitopespecificity and protective efficacy of the bovine immune response tobovine herpesvirus-1 glycoprotein vaccines.Vaccine 6349-356)。
根據(jù)本發(fā)明令人驚訝地發(fā)現(xiàn),以CpG ODN和水包油乳劑例如EMULSIGENTM為共同佐劑的BHV-1 tgD疫苗比單以CpG ODN、VSA3或EMULSIGENTM為佐劑或者以非-CpG ODN和EMULSIGENTM為共同佐劑的tgD誘導(dǎo)更強(qiáng)和更平穩(wěn)的免疫應(yīng)答,而且提供更好的對(duì)BHV-1攻擊的保護(hù)。此外,存在或不存在EMULSIGENTM時(shí)與CpG ODN配制的tgD誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答是Th1-偏向性的,與跟EMULSIGENTM、VSA3或非-CpG ODN和EMULSIGENTM配制的那些相反。該數(shù)據(jù)表明用以CpG ODN和EMULSIGENTM為佐劑的疫苗例如BHV-1亞單位疫苗免疫動(dòng)物,比單以非-CpG ODN和EMULSIGENTM、EMULSIGENTM、CpG ODN或VSA3為佐劑的疫苗誘導(dǎo)更強(qiáng)更平穩(wěn)的體液和細(xì)胞應(yīng)答,和更好的抗病毒感染保護(hù)。
在牛中,針對(duì)BHV-1的防護(hù)在主要地是由顯著的體液免疫應(yīng)答介導(dǎo)的。確實(shí),在不存在高抗體滴度下的強(qiáng)細(xì)胞免疫不能充分防止感染(Loehr,B.I,等2000.Gene gun-mediated DNA immunization primesdevelopment of mucosal immunity against bovine herpesvirus 1 in cattle.J.Virol.746077-6086)。早先的研究指出BHV-1誘導(dǎo)的疾病的有效防止可以通過含有一種或多種病毒糖蛋白的亞單位疫苗實(shí)現(xiàn)(Gao,Y.,等1994.Truncated bovine herpesvirus-1 glycoprotein I(gpI) initiates aprotective local immune response in its natural host.Vaccine 12145-152;Baca-Estrada,M.E.,等1996.Immunogenicity of bovine herpesvirus 1glycoprotein D in miceeffect of antigen form on the induction ofcellular and humoral immune responses.Viral Immunol 911-22;Babiuk,L.A.,L.等1996.Immunology of bovine herpesvirus 1 infection.Vet.Microbiol.5331-42;Zhu,X,S.等1997.Yeast-secreted bovineherpesvirus type 1 glycoprotein D has authentic conformationalstructure and immunogenicity.Vaccine 15679-688;van DrunenLittel-van den Hurk,S.,等1994.A subunit gIV vaccine,produced bytransfected mammalian cells in culture,induces mucosal immunityagainst bovine herpesvirus-1 in cattle.Vaccine 121295-1302)。不過,由于效率低下的體液免疫應(yīng)答,一些BHV-1亞單位疫苗誘導(dǎo)很小或者沒有防止攻擊的保護(hù)(Israel,B.A.,等1988.Epitope specificity andprotective efficacy of the bovine immune response to bovineherpesvirus-1 glycoprotein vaccines.Vaccine 6349-356)。常規(guī)佐劑例如VSA3產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答,但它們留下不受歡迎的注射部位反應(yīng)。VSA3由以礦物油為基礎(chǔ)的乳劑和炎性化合物溴化雙甲基雙十八烷基銨(DDA)組成。在人類中,DDA公知誘導(dǎo)宿主注射部位的炎性反應(yīng),包括腫脹和疼痛,以及延遲型超敏反應(yīng)(Vogel,F(xiàn).R.和M.F.Powell.1995.Acompendium of vaccine adjuvants and excipients,p.141-228.InM.F.Powell,M.J Newman,和JR.Burdman(編輯),Vaccine Designthesubunit and adjuvant approach.Plenum Press,New York)。由于它的炎性傾向,DDA還被用來誘導(dǎo)大鼠實(shí)驗(yàn)用關(guān)節(jié)炎(Mia,M.Y.,Let al.2000.Dimethyl dioctadecyl ammonium bromide(DDA)-induced artritis in ratsa model of experimental arthritis.J.Autoimmun.14303-310)。
另外發(fā)現(xiàn)利用皮下(s.c.)途徑遞送可誘導(dǎo)增強(qiáng)的保護(hù)性免疫應(yīng)答。皮下給藥由于它的給藥容易加上皮膚的免疫活性,在獸醫(yī)和人類實(shí)踐中是有用的遞送方式。通常疫苗是通過肌內(nèi)(i.m.)給藥的。本發(fā)明的組合物當(dāng)s.c.遞送時(shí)比i.m.遞送可具有甚至更加增強(qiáng)的效果。
下文顯示的數(shù)據(jù)證明免疫刺激核酸與治療制劑的組合導(dǎo)致病毒釋放顯著下降。事實(shí)上,有些動(dòng)物表現(xiàn)出零病毒釋放。這是極為重要的一個(gè)參數(shù),因?yàn)樗从沉丝垢腥颈Wo(hù)的量。“病毒釋放”是指感染病毒的動(dòng)物在粘膜表面產(chǎn)生病毒顆粒。病毒釋放的存在或缺乏可以通過從動(dòng)物取樣(也就是鼻分泌物),并分析樣品中病毒的存在進(jìn)行確定。如果藥物防止病毒釋放,則它有效地預(yù)防該動(dòng)物的感染。本發(fā)明的治療制劑中核酸降低甚至消除病毒釋放的能力顯示了該組合物令人驚訝的效力。
因此,與治療制劑組合的免疫刺激核酸可刺激免疫系統(tǒng)預(yù)防或治療感染性疾病。由該核酸的免疫刺激能力所致的強(qiáng)而平衡的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答反映了受試個(gè)體針對(duì)入侵微生物的天然防御系統(tǒng)。
如本文所用,術(shù)語“預(yù)防”、“防治”或“防止”以及“治療”、“治愈”或“處置”當(dāng)就預(yù)防或治療感染性疾病而言使用時(shí),是指增強(qiáng)受試個(gè)體對(duì)微生物的抗性,或者換言之,降低受試個(gè)體患該微生物感染性疾病的可能性的預(yù)防性治療,以及受試個(gè)體感染后的治療以便與感染性疾病對(duì)抗,例如,減輕或者完全消除疾病或者防止其惡化。
免疫刺激核酸可用于治療或預(yù)防受試個(gè)體的感染性疾病?!笆茉噦€(gè)體”應(yīng)當(dāng)意味著人或脊椎哺乳動(dòng)物,包括但不限于狗、貓、馬、牛、豬、綿羊、山羊或靈長類動(dòng)物,例如猴。在一些實(shí)施方案中,受試個(gè)體明確排除嚙齒類動(dòng)物例如小鼠。
免疫刺激核酸在本發(fā)明的某些方面可用作處置處于患感染性疾病風(fēng)險(xiǎn)中的受試個(gè)體的預(yù)防藥,其中已知或懷疑受試個(gè)體暴露于微生物或者預(yù)期暴露于微生物。如本文所用的患感染性疾病“風(fēng)險(xiǎn)中的受試個(gè)體”是具有暴露于微生物的任何風(fēng)險(xiǎn)的受試個(gè)體,例如與感染的受試個(gè)體接觸或者將要到發(fā)現(xiàn)特定微生物的地方旅行的人。例如,有風(fēng)險(xiǎn)的受試個(gè)體可能是計(jì)劃到發(fā)現(xiàn)特定微生物的地區(qū)旅行的受試個(gè)體,或者可能甚至是居住在鑒定到微生物的地區(qū)的任何受試個(gè)體。處于患感染性疾病風(fēng)險(xiǎn)中的受試個(gè)體包括具有暴露于微生物(例如流感)的一般風(fēng)險(xiǎn),但在本發(fā)明的治療期間沒有活動(dòng)性疾病的那些受試個(gè)體,以及由于醫(yī)學(xué)或環(huán)境因素使之暴露于特定微生物而被認(rèn)為是處于患感染性疾病的明確風(fēng)險(xiǎn)中的受試個(gè)體。
除了利用免疫刺激核酸和抗微生物劑作為預(yù)防治療,本發(fā)明還包括利用藥物組合治療患有感染性疾病的受試個(gè)體。“患有感染性疾病的受試個(gè)體”是已經(jīng)與微生物接觸過的受試個(gè)體。因此,該微生物已經(jīng)侵入該受試個(gè)體的身體。這里所用的詞“侵入”是指微生物與受試個(gè)體外表面,例如皮膚或粘膜接觸和/或指微生物穿過受試個(gè)體的外表面。
如本文所用的“感染性疾病”是指由于傳染性微生物表面地、局部地或者全身地侵入宿主而引起的疾病。傳染性性微生物包括細(xì)菌、病毒和真菌。細(xì)菌是通過二分分裂無性繁殖的單細(xì)胞生物。它們是基于它們的形態(tài)學(xué)、染色反應(yīng)、營養(yǎng)和代謝需求、抗原結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成和基因同源性而被分類和命名的。細(xì)菌基于它們的形態(tài)學(xué)形狀可以被分為三組,球形(球菌)、直桿狀(桿菌)和彎曲或螺旋桿狀(弧菌、彎曲菌、螺菌和螺旋體)。細(xì)菌還更常見地基于它們的染色反應(yīng)而被表征為兩類生物,革蘭氏陽性和革蘭氏陰性。革蘭氏染色是微生物實(shí)驗(yàn)室普遍進(jìn)行的染色方法。革蘭氏陽性生物在染色操作后保留染料并呈深紫羅蘭色。革蘭氏陰性生物不保留染料但吸收復(fù)染劑因而呈粉紅色。
傳染性細(xì)菌包括,但不限于,革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌。革蘭氏陽性菌包括,但不限于,巴氏桿菌屬(Pasteurella)物種、葡萄球菌屬(Staphylococci)物種和鏈球菌屬(Streptococcus)物種。革蘭氏陰性菌包括,但不限于大腸埃希氏菌(Escherichia coli)、假單胞菌屬(Pseudomonas)物種和沙門氏菌屬(Salmonella)物種。傳染性細(xì)菌的具體例子包括,但不限于幽門螺桿菌(Helicobacter pyloris)、布氏疏螺旋體(Borelia burgdorferi)、侵肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophilia)、分枝桿菌屬菌種(Mycobacteria sps)(例如結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)、鳥分枝桿菌(M.avium),胞內(nèi)分枝桿菌(M.intracellulare),堪薩斯分枝桿菌(M.kansaii),戈登分枝桿菌(M.gordonae))、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)(A組鏈球菌)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)(B組鏈球菌)、鏈球菌屬(Streptococcus)(viridans組)、糞鏈球菌(Streptococcus faecalis)、牛鏈球菌(Streptococcus bovis)、鏈球菌屬(Streptococcus)(厭氧種)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、致病性彎曲桿菌屬物種(Campylobacter sp.)、腸球菌屬(Enterococcus sp.)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、炭疽桿菌(Bacillus antracis)、白喉棒桿菌(corynebacterium diphtheriae)、棒狀桿菌屬菌種(corynebacterium sp.)、豬紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringers)、破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetani)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、多殺巴斯德氏菌(Pastsurellamultocida)、擬桿菌屬(Bacteroides sp.)、具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum)、念珠狀鏈桿菌(Streptobacillus moniliformis)、蒼白密螺旋體(Treponema pallidium)、極細(xì)密螺旋體(Treponema pertenue)、鉤端螺旋體屬(Leptospira)、立克次氏體屬(Rickettsia)和衣氏放線菌(Actinomyces israelli)。
病毒是含有核酸核芯和蛋白外殼的小的傳染性因子,但不是獨(dú)立生存的生物。病毒在缺乏它在其中能夠復(fù)制的活細(xì)胞時(shí)不能夠存活。病毒或者通過內(nèi)吞作用或者通過直接注入DNA(噬菌體)進(jìn)入特定的活細(xì)胞并繁殖,導(dǎo)致疾病。繁殖的病毒可以接著釋放并感染另外的細(xì)胞。一些病毒時(shí)含DNA的病毒,而其它的為含RNA的病毒。
一旦病毒進(jìn)入細(xì)胞,它可以導(dǎo)致許多生理學(xué)效應(yīng)。一個(gè)效應(yīng)是細(xì)胞變性,其中病毒在細(xì)胞內(nèi)的積聚導(dǎo)致細(xì)胞死亡和變成碎片,并釋放病毒。另一個(gè)效應(yīng)是細(xì)胞融合,其中感染的細(xì)胞與相鄰細(xì)胞融合產(chǎn)生合胞體。其它類型的病毒導(dǎo)致細(xì)胞增殖,這導(dǎo)致腫瘤形成。
病毒包括,但不限于,interoviruses(包括,但不限于,小RNA病毒科(picornaviridae)的病毒,例如脊髓灰質(zhì)炎病毒(polio virus)、柯薩奇病毒(coxsackie virus)、人腸道孤病毒(echo virus))、輪狀病毒(rotaviruses)、腺病毒(adenovirus)、肝炎病毒(hepatitus)。已經(jīng)在人類中發(fā)現(xiàn)的具體的病毒的例子包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)(如人免疫缺陷病毒,例如HIV-1(還被稱之為HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV,或者HIV-III;以及其它分離群,例如HIV-LP);小RNA病毒科(Picornaviridae)(如脊髓灰質(zhì)炎病毒(polio viruses)、甲型肝炎病毒(hepatitis A virus)、腸道病毒(enteroviruses)、人柯薩奇病毒(Coxsackie viruses)、鼻病毒(rhinoviruses)、人腸道孤病毒(echoviruses));Calciviridae(如導(dǎo)致腸胃炎的毒株);披蓋病毒科(Togaviridae)(如馬腦炎病毒(equineencephalitis viruses)、風(fēng)疹病毒(rubella viruses));黃病毒科(Flaviridae)(如登革熱病毒(dengue viruses)、腦炎病毒(encephalitisviruses)、黃熱病毒(yellow fever viruses));冠狀病毒科(Coronoviridae)(如冠狀病毒(coronaviruses));棒狀病毒科(Rhabdoviradae)(如水泡性口膜炎病毒(vesicular stomatitisviruses)、狂犬病病毒(rabies viruses));冠狀病毒科(Coronoviridae)(如冠狀病毒(coronaviruses));棒狀病毒科(Rhabdoviradae)(如水泡性口膜炎病毒(vesicular stomatitis viruses)、狂犬病病毒(rabiesviruses));線狀病毒科(Filoviridae)(如歐鮑拉病毒(ebola viruses));副粘病毒科(Paramyxoviridae)(如副流感病毒(parainfluenzaviruses)、腮腺炎病毒(mumps virus)、麻疹病毒(measles virus)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus));正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(如流感病毒(influenza viruses));布尼亞病毒科(Bungaviridae)(如漢坦病毒(Hantaan viruses)、bunga viruses、白蛉病毒(phleboviruses)和納伊羅病毒(Nairo viruses));沙粒病毒科(Arena viridae)(出血熱病毒(hemorrhagic fever viruses));呼腸孤病毒科(Reoviridae)(如呼腸孤病毒(reoviruses)、環(huán)狀病毒(orbiviurses)和輪狀病毒(rotaviruses));雙RNA病毒科(Birnaviridae);嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)(乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus));細(xì)小病毒科(Parvovirida)(細(xì)小病毒(parvoviruses));乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳頭瘤病毒(papilloma viruses)、多瘤病毒(polyoma viruses));腺病毒科(Adenoviridae)(大多數(shù)腺病毒(adenoviruses));皰疹病毒科(Herpesviridae)(單純皰疹病毒(herpes simplex virus)(HSV)1和2、水痘帶狀皰疹病毒(varicella zoster virus)、巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus)(CMV)、皰疹病毒(herpes virus));痘病毒科(Poxviridae)(天花病毒(variola viruses)、痘苗病毒(vacciniaviruses)、痘病毒(pox viruses));和虹彩病毒科(Iridoviridae)(如非洲豬瘟病毒(African swine fever virus));以及無分類病毒(如海綿狀腦病的病原體、丁型肝炎病原體(被認(rèn)為是乙型肝炎病毒的缺損隨體)、非-A非-B肝炎因子(1類=內(nèi)部傳播;2類=腸胃外傳播(即丙型肝炎);諾沃克因子(Norwalk)和相關(guān)病毒,以及星狀病毒(astroviruses))。
除了感染人類受試個(gè)體導(dǎo)致人類紊亂的病毒,本發(fā)明還可用于治療其它非人脊椎動(dòng)物。非人脊椎動(dòng)物也可以患感染性疾病,其可用本文公開的免疫刺激核酸和抗微生物制劑組合預(yù)防或治療。例如,除了治療傳染性人類疾病,本發(fā)明的方法可用于治療或預(yù)防非人動(dòng)物的感染。
人類和非人脊椎動(dòng)物的傳染性病毒包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、RNA病毒和DNA病毒。這類逆轉(zhuǎn)錄病毒包括簡單逆轉(zhuǎn)錄病毒和復(fù)雜逆轉(zhuǎn)錄病毒。簡單逆轉(zhuǎn)錄病毒包括B-型逆轉(zhuǎn)錄病毒、C-型逆轉(zhuǎn)錄病毒和D-型逆轉(zhuǎn)錄病毒亞組。B-型逆轉(zhuǎn)錄病毒的例子是小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)。C-型逆轉(zhuǎn)錄病毒包括亞類C-型A組(包括勞斯肉瘤病毒(RSV)、禽白血病病毒(ALV)和禽類成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV))和C-型B組(包括鼠白血病病毒(MLV)、貓白血病病毒(FeLV)、鼠肉瘤病毒(MSV)、長臂猿白血病病毒(GALV)、脾壞死病毒(SNV)、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒(RV)和猿肉瘤病毒(SSV))。D-型逆轉(zhuǎn)錄病毒包括Mason-Pfizer猴病毒(MPMV)和猿逆轉(zhuǎn)錄病毒-1型(SRV-1)。復(fù)雜逆轉(zhuǎn)錄病毒包括慢病毒、T-細(xì)胞白血病病毒和泡沫病毒亞組。慢病毒包括HIV-1,但也包括HIV-2、SIV、綿羊髓鞘脫落病毒、貓免疫缺陷病毒(FIV)以及馬傳染性貧血病病毒(EIAV)。T-細(xì)胞白血病病毒包括HTLV-1、HTLV-II、猿T-細(xì)胞白血病病毒(STLV)和牛白血病病毒(BLV)。泡沫病毒包括人泡沫病毒(HFV)、猿泡沫病毒(SFV)和牛泡沫病毒(BFV)。
在脊椎動(dòng)物中是抗原的其它RNA病毒的例子包括,但不限于,以下呼腸孤病毒科成員,包括正呼腸孤病毒屬(哺乳動(dòng)物和禽類逆轉(zhuǎn)錄病毒多血清型)、環(huán)狀病毒屬(藍(lán)舌病病毒、Eugenangee virus、Kemerovo virus、非洲馬瘟病毒和科洛拉多蜱傳熱病毒)、輪狀病毒屬(人輪狀病毒、內(nèi)布拉斯加州犢牛腹瀉病毒、鼠輪狀病毒、猿輪狀病毒、牛或綿羊輪狀病毒、禽輪狀病毒),小核糖核酸病毒科,包括腸道病毒(脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒A和B、腸細(xì)胞病變?nèi)斯聝?ECHO)病毒、甲型肝炎病毒、猿腸道病毒、鼠腦脊髓炎(ME)病毒、鼠脊髓灰質(zhì)炎病毒、牛腸道病毒、豬腸道病毒、心病毒屬(腦心肌炎病毒(EMC)、門戈病毒),鼻病毒屬(包括那至少113革亞型的人鼻病毒;其它鼻病毒),Apthovirus(口蹄疫(FMDV);Calciviridae科,包括豬水泡疹病毒、San Miguel海獅病毒、貓細(xì)小核糖核酸病毒和諾沃克病毒;囊膜病毒科,包括甲病毒屬(東方馬腦炎病毒、西門利克森林病毒、辛德畢斯病毒、切昆貢亞熱病毒、O′Nyong-Nyong病毒、羅斯河病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒、西方馬腦炎病毒),F(xiàn)lavirius(蚊子傳播的黃熱病病毒、登革熱病毒、日本腦炎病毒、圣路易斯腦炎病毒、墨萊溪谷腦炎病毒、西尼羅河病毒、Kunjin病毒、中歐蜱傳播的病毒、遠(yuǎn)東蜱傳播的病毒、科薩努爾森林病毒、Louping III病毒、Powassan病毒、鄂木斯克出血熱病毒),Rubivirus屬(風(fēng)疹病毒),瘟病毒(粘膜病病毒、豬瘟病毒、邊境病病毒),Bunyaviridae,包括Bunyvirus屬(Bunyamwera及相關(guān)病毒、加利福尼亞腦炎類病毒),Phlebovirus屬(白蛉熱西西里島病毒、里夫特山谷熱病毒),Nairovirus屬(克里米亞-剛果出血熱病毒、內(nèi)羅畢綿羊病病毒)以及Uukuvirus屬(Uukuniemi及相關(guān)病毒);正粘病毒科,包括流感病毒屬(A型流感病毒,許多人亞型);豬流感病毒以及禽和馬流感病毒;B型流感病毒(許多人亞型)以及C型流感病毒(可能是獨(dú)立的屬);副粘病毒科,包括副粘病毒屬(1型副流感病毒、仙臺(tái)病毒、血細(xì)胞吸附病毒、2到5型副流感病毒、新城疫病毒、腮腺炎病毒),Morbillivirus屬(麻疹病毒、亞急性硬化性全腦炎病毒、瘟熱病毒、牛瘟病毒),肺炎病毒屬(呼吸道合胞體病毒(RSV)、牛呼吸道合胞病毒和小鼠肺炎病毒);森林病毒、辛德畢斯病毒、切昆貢亞熱病毒、O′Nyong-Nyong病毒、羅斯河病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒、西方馬腦炎病毒),F(xiàn)lavirius屬(蚊子傳播的黃熱病病毒、登革熱病毒、日本腦炎病毒、圣路易斯腦炎病毒、墨萊溪谷腦炎病毒、西尼羅河病毒、Kunjin病毒、中歐蜱傳播的病毒、遠(yuǎn)東蜱傳播的病毒、科薩努爾森林病毒、Louping III病毒、Powassan病毒、鄂木斯克出血熱病毒),Rubivirus屬(風(fēng)疹病毒),瘟病毒(粘膜病病毒、豬瘟病毒、邊境病病毒);Bunyaviridae,包括Bunyvirus屬(Bunyamwera及相關(guān)病毒、加利福尼亞腦炎類病毒),Phlebovirus屬(白蛉熱西西里島病毒、里夫特山谷熱病毒),Nairovirus屬(克里米亞-剛果出血熱病毒、內(nèi)羅畢綿羊病病毒)以及Uukuvirus屬(Uukuniemi及相關(guān)病毒);正粘病毒科,包括流感病毒屬(A型流感病毒,許多人亞型);豬流感病毒以及禽和馬流感病毒;B型流感病毒(許多人亞型)以及C型流感病毒(可能是獨(dú)立的屬);副粘病毒科,包括副粘病毒屬(1型副流感病毒、仙臺(tái)病毒、血細(xì)胞吸附病毒、2到5型副流感病毒、新城疫病毒、腮腺炎病毒),Morbillivirus屬(麻疹病毒、亞急性硬化性全腦炎病毒、瘟熱病毒、牛瘟病毒),肺炎病毒屬(呼吸道合胞體病毒(RSV)、牛呼吸道合胞病毒和小鼠肺炎病毒);彈狀病毒科,包括Vesiculovirus屬(VSV)、Chandipura病毒、弗蘭德-雄鹿公園病毒)、狂犬病毒屬(狂犬病病毒)、魚彈狀病毒、以及兩個(gè)可能的彈狀病毒(馬伯格氏病毒和埃博拉病毒);嵌沙樣病毒科,包括淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCM)、Tacaribe virus complex和拉沙病毒;冠狀病毒科,包括傳染性支氣管炎病毒(IBV)、小鼠肝炎病毒、人腸冠狀病毒和貓傳染性的腹膜炎(貓冠狀病毒)。
說明性的感染脊椎動(dòng)物的DNA病毒包括,但不限于痘病毒科,包括正痘病毒屬(重型天花、輕型天花、猴痘、牛痘、水牛痘、兔痘、缺肢畸形),野兔痘病毒屬(粘液瘤、纖維瘤),禽痘病毒屬(傳染性上皮瘤其它禽痘病毒),山羊痘病毒屬(綿羊痘、山羊痘),豬痘病毒屬(豬痘),副痘病毒屬(傳染性postular皮炎病毒、偽牛痘、牛丘疹性口炎病毒);虹彩病毒科(非洲豬瘟病毒、蛙病毒2和3、魚淋巴球增多病毒);皰疹病毒科,包括α-皰疹病毒(1型和2型單純性皰疹、水痘-帶狀皰疹、馬流產(chǎn)病毒、馬皰疹病毒2和3、偽狂犬病病毒、傳染性牛角膜結(jié)膜炎病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒、貓鼻氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒),β-皰疹病毒(人巨細(xì)胞病毒以及豬、猴和嚙齒類動(dòng)物巨細(xì)胞病毒);γ-皰疹病毒(EB病毒(EBV)、馬立克氏病病毒、Herpes saimiri、蛛猴屬皰疹病毒、棉尾兔屬皰疹病毒、豚鼠皰疹病毒、勒克腫瘤病毒);腺病毒科,包括柱狀腺病毒屬(人亞組A、B、C、D、E以及未分類的猿腺病毒(至少23個(gè)血清型),犬傳染性肝炎以及牛、豬、羊、蛙和許多其它物種的腺病毒,禽腺病毒屬(禽腺病毒);以及不可培養(yǎng)的腺病毒;乳多泡病毒科,包括乳頭狀瘤病毒屬(人乳頭狀瘤病毒、牛乳頭瘤病毒、肖普兔乳頭狀瘤病毒以及其它物種的各種致病乳頭狀瘤病毒),多瘤病毒屬(多瘤病毒、猿空泡因子(SV-40),兔空泡因子(RKV),K病毒,BK病毒,JC病毒以及其它靈長類動(dòng)物多形瘤病毒例如嗜淋巴細(xì)胞乳頭狀瘤病毒);細(xì)小病毒科包括腺病毒相關(guān)病毒屬、細(xì)小病毒屬、(貓泛白細(xì)胞減少癥病毒、牛細(xì)小病毒、犬細(xì)小病毒、阿留申貂病病毒等)。最后,DNA病毒可以包括不適合上述的病毒,例如苦魯病和早老癡呆癥病毒以及慢性傳染性神經(jīng)病因子(CHINA病毒)。
真菌是真核生物體,其中只有少數(shù)導(dǎo)致脊椎動(dòng)物感染。由于真菌是真核生物體,它們與原核細(xì)菌在大小、結(jié)構(gòu)組織、生命周期和繁殖機(jī)制方面顯著不同。真菌通常是基于形態(tài)學(xué)特點(diǎn)、繁殖方式和培養(yǎng)特征而分類的。雖然真菌能夠?qū)е率茉噦€(gè)體不同型新的疾病,例如吸入真菌抗原后的呼吸過敏癥,由于攝入有毒物質(zhì),例如毒蘑菇產(chǎn)生的amatatoxin和鬼筆毒蕈肽以及曲菌屬菌種產(chǎn)生的aflotoxins而引起的真菌中毒,但并非所有真菌都引起感染性疾病。
傳染性真菌可以導(dǎo)致全身或表面感染。初次全身感染可以發(fā)生在正常健康受試個(gè)體中,而機(jī)會(huì)感染最頻繁地發(fā)現(xiàn)于免疫受損個(gè)體中。導(dǎo)致初次全身感染的最常見的真菌因子包括芽生菌屬(blastomyces)、球孢菌屬(coccidioides)和組織胞漿菌屬(histoplasma)。導(dǎo)致免疫受損個(gè)體或免疫抑制個(gè)體機(jī)會(huì)感染的常見真菌包括,但不限于,白色假絲酵母(candida albicans)(為呼吸道菌群正常部分的一種生物體)、新型隱球酵母(cryptococcus neoformans)(有時(shí)為呼吸道正常菌群)以及各種曲霉屬菌種。全身真菌感染為內(nèi)部器官的侵入性感染。生物體通常通過肺、胃腸道或靜脈網(wǎng)絡(luò)進(jìn)入身體。這些類型的感染可以由初次致病真菌或者機(jī)會(huì)致病真菌導(dǎo)致。
表面真菌感染包括真菌在外表面生長而不侵入內(nèi)部組織。典型的表面真菌感染包括涉及皮膚、頭發(fā)或指甲的皮膚真菌感染。皮膚感染的例子有癬感染,例如由dermatohytes,例如小孢子菌屬(microsporum)或traicophyton種,也就是犬子孢子菌(microsporumcanis)、石膏狀小孢子菌(microsporum gypsum)、石膏狀小孢子菌(tricofitin rubrum)所致的輪癬。
真菌的例子包括新型隱球酵母(Cryptococcus neoformans)、莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)、粗球孢菌(Coccidioidesimmitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)、白色假絲酵母(Candida albicans)。
本發(fā)明的方法靶向的寄生性感染包括如下寄生蟲所引起的那些感染鐮狀瘧原蟲(Plasmodium falciparum)、卵形瘧原蟲(Plasmodiumovale)、三日瘧原蟲(Plasmodium malariae)、間日瘧原蟲(Plasmdodium vivax)、Plasmodium knowlesi、微小巴貝蟲(Babesiamicroti)、分歧巴貝蟲(Babesia divergens)、克氏錐蟲(Trypanosomacruzi)、鼠弓形體(Toxoplasma gondii)、旋毛蟲(Trichinella spiralis)、碩大利什曼原蟲(Leishmania major)、杜氏利什曼原蟲(Leishmaniadonovani)、巴西利什曼原蟲(Leishmania braziliensis)、和熱帶利什曼蟲(Leishmania tropica)、岡比亞錐蟲(Trypanosoma gambiense)、羅德西亞錐蟲(Trypanosmoma rhodesiense)及曼氏血吸蟲病(Schistosoma mansoni)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中,本方法涉及導(dǎo)致瘧疾的寄生蟲感染的預(yù)防。
其它醫(yī)學(xué)相關(guān)微生物在文獻(xiàn)中被廣泛描述,如參見C.G.AThomas,Medical Microbiology,Bailliere Tindall,英國,1983,茲將其全文并入作為參考。每一個(gè)前述列表都是舉例說明性的,而并非旨在限制。
本發(fā)明的方法涉及免疫刺激核酸與治療制劑的組合。活性劑的組合還可以與抗微生物劑聯(lián)合給藥以治療或預(yù)防感染性疾病。如本文所用的抗微生物制劑,是指能夠殺死或抑制傳染性微生物的天然存在的或者合成的化合物。根據(jù)本發(fā)明,可用的抗微生物劑的類型取決于受試個(gè)體感染的或者處于感染風(fēng)險(xiǎn)中的微生物類型。一類抗微生物劑為抗細(xì)菌劑。抗細(xì)菌劑殺死或抑制細(xì)菌的生長或功能。一大類抗細(xì)菌劑是抗生素。
抗病毒劑是防止細(xì)胞被病毒感染或者病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的化合物??共《舅幬镆瓤辜?xì)菌藥物少的多,因?yàn)椴《緩?fù)制過程與宿主細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制關(guān)系如此密切,以至于非特異性抗病毒劑對(duì)宿主通常有毒。在病毒侵染過程中有若干階段可以由抗病毒劑阻斷或者抑制。這些階段包括,病毒對(duì)宿主細(xì)胞的吸附(免疫球蛋白或結(jié)合肽)、病毒脫殼(如金剛胺)、病毒mRNA的合成或翻譯(如干擾素)、病毒RNA或DNA的復(fù)制(如核苷類似物)、新生病毒蛋白的成熟(如蛋白酶抑制劑)以及病毒的出芽和釋放。
抗真菌劑用于治療和預(yù)防傳染性真菌,殺寄生物藥是直接殺死寄生蟲的藥劑。這樣的化合物是本領(lǐng)域公知的并且一般商業(yè)上可獲得。
除了利用免疫刺激核酸和治療制劑預(yù)防人類感染外,優(yōu)選的實(shí)施方案的方法尤其較好地適于非人脊椎動(dòng)物的治療。近距離存在的、以及象在動(dòng)物園動(dòng)物、農(nóng)場動(dòng)物和科研動(dòng)物的情況下允許混合的非人脊椎動(dòng)物也涵蓋在本發(fā)明的方法的受試個(gè)體中。動(dòng)物園動(dòng)物例如貓科動(dòng)物物種包括例如獅、虎、豹、獵豹和美洲獅;象、長頸鹿、熊、鹿、狼、牦牛、非人靈長類動(dòng)物、海豹、海豚和鯨;以及科研動(dòng)物例如小鼠、大鼠、倉鼠和沙鼠都是本發(fā)明的方法的潛在受試個(gè)體。
禽類例如母雞、小雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉和雉是許多類型的感染的主要靶。孵化的禽類剛出生不久就暴露于病原微生物。雖然這些禽類最初通過來自母親的抗體可以防范病原體,但這種保護(hù)僅僅是暫時(shí)的,并且禽類自身未發(fā)育完全的免疫系統(tǒng)必須開始針對(duì)病原體保護(hù)其自己。通常期望在它們最易感的情況下預(yù)防幼禽類的感染。還期望預(yù)防老齡禽類的感染,特別是當(dāng)這些禽類近距離圈養(yǎng),導(dǎo)致疾病迅速傳播時(shí)。因此,期望向禽類給藥免疫刺激核酸和抗微生物劑以預(yù)防感染性疾病。
小雞中常見感染的例子是小雞傳染性貧血病毒(CIAV)。CIAV首次于1979年在日本調(diào)查馬立克氏病接種失敗期間分離(Yuasa等,1979,Avian Dis.23366-385)。從那時(shí)起,CIAV已經(jīng)在所有主要的家禽生產(chǎn)國家的商業(yè)家禽中檢測到(van Bulow等,1991,pp.690-699)in Diseasesof Poultry,第9版,Iowa State University Press)。
CIAV感染導(dǎo)致臨床疾病,以年幼易感小雞的貧血、出血和免疫抑制為特征。CIAV-感染的小雞的胸腺和骨髓萎縮以及與之一致的損傷也是CIAV感染的特征。胸腺以及偶爾的法氏囊中的淋巴細(xì)胞損耗,導(dǎo)致免疫抑制和對(duì)二次病毒、細(xì)菌和真菌感染的增加的易感性,這隨之使疾病的進(jìn)程復(fù)雜化。免疫抑制在感染一種或多種馬立克氏病病毒(MDV)、傳染性雞囊病病毒、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒、腺病毒或呼腸孤病毒后可導(dǎo)致疾病惡化。已經(jīng)報(bào)道MDV發(fā)病機(jī)理被CIAV增強(qiáng)(DeBoer等,1989,p.28 In Proceedings of the 38th Western PoultryDiseases Conference,Tempe,Ariz.)。此外,已經(jīng)報(bào)道CIAV惡化傳染性雞囊病的病征(Rosenberger等,1989,Avian Dis.33707-713)。小雞對(duì)由CAA引起的試驗(yàn)誘導(dǎo)的疾病形成年齡抗性。這基本上是在2周齡時(shí)完成的,但更大的禽類仍然易受感染(Yuasa,N.等,1979,同上;Yuasa,N.等,Arian Diseases 24,202-209,1980)。不過,如果小雞具有CAA和免疫抑制因子(IBDV,MDV等)雙重感染,針對(duì)疾病的年齡抗性延遲(Yuasa,N.等,1979和1980,同上;Bulow von V.等,J.VeterinaryMedicine 33,93-116,1986)??赡芗訌?qiáng)疾病傳播的CIAV的特征包括對(duì)環(huán)境鈍化和常見消毒劑的高抗性。CIAV感染對(duì)養(yǎng)禽業(yè)的經(jīng)濟(jì)影響從10%到30%的感染禽類在疾病爆發(fā)中死亡的事實(shí)中顯而易見。
牛和家畜也易受感染。影響這些動(dòng)物的疾病可以造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,特別是牛。本發(fā)明的方法可用來保護(hù)家畜,例如奶牛、馬、豬、綿羊和山羊免于感染。
奶??杀慌2《靖腥?。牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)是小的包膜正鏈RNA病毒,并且與豬霍亂病毒(HOCV)和邊地綿羊病病毒(BDV)一起分類在瘟病毒屬(pestiviruses)中。雖然,瘟病毒屬以前被歸類為囊膜病毒科,一些研究建議它們與flavivirus和丙型肝炎病毒(HCV)群一起重新分類在Flaviviridae科內(nèi)(Francki,等,1991)。
BVDV,是重要的牛病原體,可以根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)分析區(qū)分為致細(xì)胞病變(CP)和非致細(xì)胞病變(NCP)生物型。NCP生物型分布更為廣泛,雖然兩種生物型都見于牛中。如果懷孕奶牛感染了NCP菌株,該奶??缮a(chǎn)持久感染并且特異性免疫耐受的小牛,它一生中將傳播病毒。持久感染的??伤烙谡衬ぜ膊?,而后可以從該動(dòng)物中分離到兩種生物型。臨床表現(xiàn)可包括流產(chǎn)、畸形發(fā)生以及呼吸問題、粘膜疾病和中度腹瀉。另外,伴隨著獸群流行病的、可能導(dǎo)致動(dòng)物死亡的嚴(yán)重血小板減少癥已有描述,并且與該病有關(guān)的株系似乎比標(biāo)準(zhǔn)的BVDV更加致命。
馬皰疹病毒(EHV)包括一組抗原性不同的生物學(xué)因子,它們導(dǎo)致馬從臨床癥狀不明顯的到致命的疾病的許多感染。這些包括馬皰疹病毒-1(EHV-1),一種馬中普遍存在的病原體。EHV-1與流產(chǎn)、呼吸道疾病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂的流行病有關(guān)聯(lián)。年輕馬的上呼吸道初感染導(dǎo)致持續(xù)8-10天的發(fā)熱。經(jīng)過免疫的母馬可能通過呼吸道再感染,而沒有明顯的疾病,因此流產(chǎn)通常沒有預(yù)兆就發(fā)生了。神經(jīng)綜合癥伴隨著呼吸疾病和流產(chǎn),并且可以侵襲任何年齡任一性別的動(dòng)物,導(dǎo)致不協(xié)調(diào)、無力和后軀癱瘓(Telford,E.A.R.等,Virology 189,304-316,1992)。其它EHV包括EHV-2或馬巨細(xì)胞病毒、EHV-3、馬交媾疹病毒以及以前歸類為EHV-1亞型2的EHV-4。
綿羊和山羊可被許多危險(xiǎn)微生物感染,包括羊進(jìn)行性間質(zhì)肺炎(visna-maedi)。
靈長類動(dòng)物例如猴、猿和恒河猴可被猴免疫缺陷病毒感染。已報(bào)道失活的細(xì)胞病毒和無細(xì)胞全猴免疫缺陷疫苗在恒河猴中提供保護(hù)(Stott等,(1990)Lancet 361538-1541;Desrosiers等,PNAS USA(1989)866353-6357;Murphey-Corb等(1989)Science 2461293-1297;以及Carlson等(1990)AIDS Res.Human Retroviruses 61239-1246)。已報(bào)道重組HIV gp120疫苗在黑猩猩中提供保護(hù)(Berman等(1990)Nature 345622-625)。
家養(yǎng)和野生的貓科動(dòng)物都易受許多微生物的感染。例如,貓科傳染性腹膜炎是發(fā)生在家養(yǎng)和野生貓科動(dòng)物,例如獅、豹、獵豹和美洲虎中的疾病。當(dāng)期望預(yù)防貓科動(dòng)物感染這種和其它類型的病原微生物時(shí),本發(fā)明的方法可用來預(yù)防或治療貓科動(dòng)物的感染。
家養(yǎng)貓可感染許多逆轉(zhuǎn)錄病毒,包括但不限于貓白血病毒(FeLV)、貓肉瘤病毒(FeSV)、內(nèi)生性C型致癌RNA病毒(RD-114)和貓合胞體形成病毒(FeSFV)。其中,F(xiàn)eLV是最重要的病原體,導(dǎo)致不同的癥狀,包括淋巴網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)性和骨髓性贅生物、貧血、免疫介導(dǎo)的紊亂以及與人類獲得性免疫缺損綜合癥(AIDS)相似的免疫缺陷綜合癥。最近發(fā)現(xiàn),一種特別的復(fù)制缺陷FeLV突變體,命名為FeLV-AIDS,與免疫抑制性質(zhì)特別相關(guān)。
貓嗜T-淋巴細(xì)胞性慢病毒(也被稱之為貓免疫缺陷)的發(fā)現(xiàn)首先報(bào)道在Pedersen等(1987)Science 235790-793中。FIV的特征描述報(bào)道在Yamamoto等(1988)Leukemia,December Supplement 2204S-215S;Yamamoto等(1988)Am.J.Vet.Res.491246-1258以及Ackley等(1990)J.Virol.645652-5655中。FIV的克隆和序列分析報(bào)道在Olmsted等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA862448-2452以及864355-4360中。
貓傳染性腹膜炎(FIP)是不可預(yù)測地發(fā)生在家養(yǎng)和野生貓科動(dòng)物中的散發(fā)疾病。雖然FIP主要是家養(yǎng)貓的疾病,它在獅子、美洲獅、豹、獵豹和美洲虎中診斷到。受FIP折磨的小型野生貓類包括猞猁以及獰獾、沙貓(sand cat)和帕拉貓(pallas cat)。在家養(yǎng)貓中,疾病主要是在年幼動(dòng)物中發(fā)生,雖然所有年齡的貓都易感。高峰發(fā)病率發(fā)生在6-12月齡之間。在5-13歲齡中觀察到下降的發(fā)病率,接著是14-15歲齡貓中提高的發(fā)病率。
在有鰭水生動(dòng)物、有殼水生動(dòng)物或其它水生生命形式中的病毒、細(xì)菌和寄生病給水產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的問題。由于孵卵場池或圍閉的海洋牧場區(qū)域中動(dòng)物的高密度,感染性疾病可消滅,例如有鰭水生動(dòng)物、有殼水生動(dòng)物或其它水生生命形式的設(shè)施中大比例的動(dòng)物。魚免疫系統(tǒng)與哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)具有許多相似的特點(diǎn),例如B細(xì)胞、T細(xì)胞、淋巴因子、補(bǔ)體和免疫球蛋白的存在。魚具有似乎在許多方面與哺乳動(dòng)物的B和T細(xì)胞相似的作用的淋巴細(xì)胞亞型。
水產(chǎn)業(yè)物種包括但不限于有鰭水生動(dòng)物、有殼水生動(dòng)物或其它水生動(dòng)物。有鰭水生動(dòng)物包括所有的脊椎動(dòng)物魚,它可能是硬骨魚或軟骨魚,例如,象鮭魚、鯉魚、鯰魚、黃尾魚、海鯛和海鱸。鮭魚是有鰭水生動(dòng)物中的科,其包括鱒魚(包括虹鱒)、大麻哈魚和北極紅點(diǎn)鮭。有殼水生動(dòng)物的例子包括,但不限于,蛤、龍蝦、河蝦、螃蟹和牡蠣。其它培養(yǎng)的水生動(dòng)物包括,但不限于鰻鱺、魷魚和章魚。
在有些情況下,期望與免疫刺激核酸和治療制劑一起施用抗原,而在其它情況下不遞送抗原。如果使用的話,抗原優(yōu)選為微生物抗原。微生物抗原包括,但不限于細(xì)胞、細(xì)胞提取物、蛋白、多肽、肽、多糖、多糖綴合物、多糖和其它分子的肽及非肽模擬物、小分子、脂肪、糖脂和碳水化合物。不過,許多微生物抗原在本質(zhì)上為蛋白或多肽,因?yàn)榈鞍缀投嚯囊话惚忍妓衔锘蛑靖呖乖浴O蚴茉噦€(gè)體給藥抗原的方法是本領(lǐng)域公知的。一般而言,抗原可通過任何途徑直接給予受試個(gè)體,例如象靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、口服、經(jīng)皮、粘膜、鼻內(nèi)、氣管內(nèi)或皮下給藥??乖梢匀砘蚓植拷o藥。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中,抗原不與免疫刺激核酸綴合。給藥方法在下文更加詳細(xì)地描述。
如本文所用的術(shù)語“基本上純的”是指基本上不含它在自然狀態(tài)下結(jié)合的其它蛋白、脂肪、碳水化合物或者其它材料的分子物質(zhì)。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可以利用蛋白純化的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化多肽,如抗原?;旧霞兊亩嚯耐ǔT诜沁€原性聚丙烯酰胺凝膠上產(chǎn)生單條主帶。在部分糖基化的多肽或者具有數(shù)個(gè)起始密碼子的多肽的情況下,在非還原性聚丙烯酰胺凝膠上可能有數(shù)條帶,但這些條帶將形成該多肽有特色的模式。多肽的純度還可以通過氨基末端氨基酸序列分析測定。
微生物抗原,如果給藥并且如果是多肽的話,當(dāng)向受試個(gè)體給藥時(shí)可以是多肽的形式,或者它可以由核酸載體編碼。如果向受試個(gè)體給藥核酸載體,該蛋白在體內(nèi)表達(dá)。多肽微生物抗原的一級(jí)氨基酸序列的小的修飾也可以產(chǎn)生與未修飾的對(duì)應(yīng)多肽相比具有基本上等同的抗原活性的多肽。這種修飾可能是有意的,如定點(diǎn)突變那樣,或者可能是自發(fā)的。因此,還包括了具有這種修飾的核酸。當(dāng)給藥由核酸載體編碼的抗原時(shí),免疫刺激核酸與含有抗原的質(zhì)?;虮磉_(dá)載體不同。
編碼抗原的核酸可操作地連接于指導(dǎo)在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)蛋白的基因表達(dá)序列?!盎虮磉_(dá)序列”是任何調(diào)控核苷酸序列,例如啟動(dòng)子序列或者啟動(dòng)子增強(qiáng)子組合,它促進(jìn)與它可操作地連接的蛋白的有效轉(zhuǎn)錄和翻譯?;虮磉_(dá)序列可以是,例如,哺乳動(dòng)物或病毒啟動(dòng)子,例如組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。組成型哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子包括,但不限于,下列基因的啟動(dòng)子次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPTR)、腺苷脫氨酶、丙酮酸激酶、b-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和其它組成型啟動(dòng)子。在真核細(xì)胞中組成型起作用的例示性病毒啟動(dòng)子包括,例如,來自巨細(xì)胞病毒(CMV)、猿猴病毒(如SV40)、乳頭狀瘤病毒、腺病毒、人類免疫缺陷性病毒(HIV)、勞氏肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子,莫洛尼氏白血病病毒及其他逆轉(zhuǎn)錄病毒的長末端重復(fù)(LTR),以及單純皰疹病毒的胸腺嘧啶核苷激酶啟動(dòng)子。其它組成型啟動(dòng)子是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的??捎米鞅景l(fā)明的基因表達(dá)序列的啟動(dòng)子還包括誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在誘導(dǎo)劑存在下表達(dá)。例如,金屬硫蛋白啟動(dòng)子在某些金屬離子存在下被誘導(dǎo)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄和翻譯。其它誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的。
免疫刺激核酸與治療制劑組合還可用于治療核預(yù)防癌癥。目前的癌癥治療太常無效,而且伴隨著高度的患者發(fā)病率,最可能是由于缺乏對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性特異性。本發(fā)明的組合物通過促進(jìn)增強(qiáng)的免疫應(yīng)答提供了更有效的癌癥治療。免疫應(yīng)答可以是抗原特異性的或者先天的免疫應(yīng)答(非抗原特異性的)。在有些情況下,免疫刺激核酸與治療制劑的組合是協(xié)同的,產(chǎn)生以單獨(dú)利用這些物質(zhì)本來所預(yù)期的加和更大的效應(yīng)。
因此,在一個(gè)方面,本發(fā)明提供了治療或預(yù)防癌癥的方法,包括向患有癌癥的受試個(gè)體或者處于患癌癥風(fēng)險(xiǎn)中的受試個(gè)體施用預(yù)防或治療癌癥有效量的一些形式的免疫刺激核酸和一些形式的治療制劑。
癌細(xì)胞是由于喪失正常的生長調(diào)控而異常分裂和繁殖的細(xì)胞。癌細(xì)胞幾乎總是由于至少一個(gè)基因突變引起的。在有些情況下,有可能根據(jù)表達(dá)的基因和蛋白的類型及其表達(dá)的水平來區(qū)分癌細(xì)胞和它們的正常對(duì)應(yīng)物。通常在癌細(xì)胞中起作用的基因包括致癌基因,例如ras、neu/HER2/erbB、myb、myc和abl,還有腫瘤抑制基因例如p53、Rb、DCC、RET和WT。這些基因中某些基因的癌相關(guān)突變導(dǎo)致它們的表達(dá)的下降或者完全的缺失。在其它基因中突變導(dǎo)致表達(dá)增加或者表達(dá)正常對(duì)應(yīng)物的活化變體。癌細(xì)胞中的遺傳突變?cè)谟行┣闆r下可以是治療制劑的靶。例如,一些藥物靶向被認(rèn)為對(duì)癌細(xì)胞存活和分裂所必需的蛋白,例如細(xì)胞周期蛋白(如細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶)、端粒酶和端粒酶相關(guān)蛋白,以及腫瘤抑制蛋白,其中許多在癌細(xì)胞中上調(diào)或者失調(diào)。
術(shù)語“腫瘤”通常與贅生物等價(jià),在文字上意味著“新生物”并可與癌癥交換使用?!百樕晕蓙y”是與細(xì)胞增殖,特別是贅生物相關(guān)的任何紊亂。“贅生物”是在撤除引起它出現(xiàn)的致癌因子后存留且增殖的異常組織塊。有兩類贅生物,良性和惡性的。幾乎所有的良性腫瘤是包囊的并且是非侵襲性的;相反,惡性腫瘤幾乎從不包囊,但是通過浸潤破壞性生長侵襲鄰近組織。浸潤生長可以繼之以腫瘤細(xì)胞植入與原始腫瘤不連續(xù)的部位。本發(fā)明的方法可用來治療人類贅生性紊亂,包括但不限于肉瘤、惡性腫瘤、纖維瘤、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤以及本文所描述的每一種其它腫瘤。
如本文所用的“癌癥”是指干擾身體器官和系統(tǒng)的正常功能的失控的細(xì)胞生長。從它們的起始位置遷徒和植入關(guān)鍵器官的癌癥可通過感染器官的功能衰竭最終導(dǎo)致受試個(gè)體死亡。血生成性癌,例如白血病,能夠勝過受試個(gè)體的正常造血區(qū)室,藉此導(dǎo)致造血失敗(以貧血、血小板減少和中性粒細(xì)胞減少的形式),最終導(dǎo)致死亡。
轉(zhuǎn)移是由于癌細(xì)胞從初始腫瘤向身體其它部分?jǐn)U散引起的,區(qū)別于原發(fā)性腫瘤位置的癌細(xì)胞區(qū)域。在原發(fā)性腫瘤塊診斷時(shí),可以監(jiān)測受試個(gè)體中轉(zhuǎn)移的存在。除了監(jiān)視特定癥狀外,轉(zhuǎn)移最常通過單獨(dú)或聯(lián)合利用磁共振成象(MRI)掃描、計(jì)算機(jī)斷層(CT)掃描、血和血小板計(jì)數(shù)、肝功能研究、胸X-光和骨掃描進(jìn)行檢測。
癌癥包括,但不限于,基層細(xì)胞癌、膽道癌;膀胱癌;骨癌;腦和CNS癌;乳腺癌;子宮頸癌;絨毛膜癌;結(jié)腸和直腸癌結(jié)締組織癌;消化系統(tǒng)癌;子宮內(nèi)膜癌;食道癌;眼癌;頭和頸部癌;胃癌;上皮內(nèi)贅生物;腎癌;喉癌;白血??;肝癌;肺癌(例如小細(xì)胞性及非小細(xì)胞性);淋巴瘤包括霍奇金和非霍奇金淋巴瘤;黑色素瘤;骨髓瘤;成神經(jīng)細(xì)胞瘤;口腔癌(例如唇、舌、口和咽癌);卵巢癌;胰腺癌;前列腺癌;成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤;橫紋肌肉瘤;直腸癌;腎癌;呼吸系統(tǒng)癌;肉瘤;皮膚癌;胃癌;睪丸癌;甲狀腺癌;子宮癌;泌尿系統(tǒng)癌;以及其它惡性腫瘤和肉瘤。
免疫刺激核酸和治療制劑可用于治療或預(yù)防受試個(gè)體的癌癥。本發(fā)明可用于治療人或非人受試個(gè)體的癌癥和腫瘤。癌癥是陪伴動(dòng)物(即貓和狗)死亡的主要原因。癌癥通常攻擊老齡動(dòng)物,在家庭寵物的情況下,它們已經(jīng)與家庭融為一體。45%大于10歲齡的狗很可能死于該病。最常見的治療選擇包括外科手術(shù)、化療和放射療法。已經(jīng)取得些許成功的其它治療方式是激光療法、低溫療法、高溫和免疫療法。治療的選擇取決于癌癥的類型和擴(kuò)散的程度。除非惡性生長局限于身體上不連續(xù)的區(qū)域,否則難于僅除去惡性組織而不同時(shí)影響正常細(xì)胞。
通常在狗和貓中診斷的惡性紊亂包括但不限于淋巴肉瘤、骨肉瘤、乳房瘤、肥大細(xì)胞瘤、腦瘤、黑色素瘤、腺鱗癌、良性腫瘤肺腫瘤、支氣管腺瘤、支氣管腺瘤、纖維瘤、粘液軟骨瘤、肺肉瘤、神經(jīng)肉瘤、骨瘤、乳頭狀瘤、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、尤因氏肉瘤、胚胎性癌肉瘤、伯基特氏淋巴瘤小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、破骨細(xì)胞瘤、口腔瘤形成、纖維肉瘤、骨肉瘤和橫紋肌肉瘤。狗的其它贅生物包括生殖器鱗狀細(xì)胞癌、傳染性毒液瘤、睪丸瘤、精原細(xì)胞瘤、睪丸足細(xì)胞瘤、血管外皮細(xì)胞瘤、組織細(xì)胞瘤、綠色瘤(粒細(xì)胞肉瘤)、角膜乳頭狀瘤、角膜鱗狀細(xì)胞癌、血管肉瘤、胸膜間皮瘤、基底細(xì)胞瘤、胸腺瘤、胃瘤、腎上腺惡性腫瘤、口腔乳頭狀瘤、血管內(nèi)皮瘤和囊腺瘤。額外在貓中診斷的惡性瘤包括濾泡性淋巴瘤、腸淋巴肉瘤、纖維肉瘤和肺鱗狀細(xì)胞癌。雪貂,一直以來比較流行的家庭寵物,已知可患胰島細(xì)胞癌、淋巴瘤、肉瘤、神經(jīng)瘤、郎格罕氏島細(xì)胞瘤、胃MALT淋巴瘤和胃腺癌。
影響農(nóng)業(yè)家畜的瘤形成包括白血病、血管外皮細(xì)胞瘤和牛眼瘤形成(牛);包皮纖維肉瘤、潰瘍性鱗狀細(xì)胞癌、包皮惡性腫瘤、結(jié)締組織瘤形成和肥大細(xì)胞瘤(馬);肝細(xì)胞癌(豬);淋巴瘤和綿羊肺腺瘤病(羊);肺肉瘤、淋巴瘤、魯斯氏肉瘤、成血細(xì)胞綜合征、纖維肉瘤、腎母細(xì)胞瘤、B細(xì)胞淋巴瘤和淋巴白血病(禽類);成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、肝瘤形成、淋巴肉瘤成淋巴細(xì)胞性淋巴瘤)、血漿白血病和鰾肉瘤(魚)、干酪塊腺炎(CLA)由細(xì)菌假結(jié)核棒狀桿菌(Corynebacterium psaudotuberculosis)導(dǎo)致的綿羊和山羊的慢性感染性疾病,以及由肺腺瘤病導(dǎo)致的綿羊傳染性肺腫瘤。
在一方面,提供了治療癌癥的方法,它包括向患有癌癥的受試個(gè)體給予本發(fā)明的組合物?!盎加邪┌Y的受試個(gè)體”是診斷具有癌癥的受試個(gè)體。在一些實(shí)施方案中,受試個(gè)體具有以實(shí)體腫瘤為特征的癌癥類型。實(shí)體腫瘤塊,如果存在的話,可能是原發(fā)性腫瘤塊。原發(fā)性腫瘤塊是指由于組織中正常細(xì)胞的轉(zhuǎn)化引起的組織中癌細(xì)胞的生長物。在大多數(shù)情況下,原發(fā)性腫瘤塊是通過囊腫的存在鑒定的,它可通過目視或觸診法,或者通過該組織形狀、質(zhì)地或重量的不規(guī)則而發(fā)現(xiàn)。
不過,有些原發(fā)性腫瘤是不可觸摸的,并且只能通過醫(yī)學(xué)成像技術(shù)例如X-光(如乳房造影術(shù))或者通過針吸術(shù)進(jìn)行檢測。后面的這些技術(shù)在早期檢測中更為常見。組織內(nèi)癌細(xì)胞的分子和表型分析通常會(huì)確認(rèn)腫瘤是否為組織內(nèi)生的,或者損害是否歸因于從其它部位的轉(zhuǎn)移。
關(guān)于預(yù)防性治療方法,本發(fā)明旨在向處于患癌癥風(fēng)險(xiǎn)的受試個(gè)體施用本發(fā)明的組合物。處于患癌癥風(fēng)險(xiǎn)的受試個(gè)體是具有患癌癥高度可能性的個(gè)體。這些受試個(gè)體包括,例如,具有遺傳異常的受試個(gè)體,這種異常的存在已被證明與較高的患癌可能性有相關(guān)關(guān)系。暴露于致癌因子例如煙草、石棉或其它化學(xué)毒素的受試個(gè)體也是本文所用的處于患癌癥風(fēng)險(xiǎn)的受試個(gè)體。當(dāng)處于患癌癥風(fēng)險(xiǎn)的受試個(gè)體用免疫刺激核酸和治療制劑定期,例如按月治療時(shí),受試個(gè)體將能夠針對(duì)癌癥發(fā)動(dòng)連續(xù)的免疫應(yīng)答。還可以利用抗原刺激腫瘤特異性免疫應(yīng)答。如果腫瘤開始在受試個(gè)體中形成,受試個(gè)體將形成針對(duì)一種或多種癌抗原的特異性免疫應(yīng)答。當(dāng)受試個(gè)體將要接觸的抗原已知時(shí),本發(fā)明的這個(gè)方面尤為有利。例如,根據(jù)本發(fā)明,在某些行業(yè)就職的、不間斷地暴露于致癌因子的受試個(gè)體將是理想的治療受試個(gè)體,特別是因?yàn)橹掳┮蜃油ǔ?yōu)先靶向特定的組織或器官。例如,許多空氣傳播、或者吸入的致癌劑例如煙草煙霧和石棉與肺癌相關(guān)。其中受試個(gè)體被動(dòng)暴露于致癌劑的方法可以特別地取決于給藥免疫刺激核酸和治療制劑(優(yōu)選以癌疫苗(例如癌抗原)的形式)的時(shí)間安排。例如,在有患癌癥風(fēng)險(xiǎn)的受試個(gè)體中,當(dāng)風(fēng)險(xiǎn)最大,也就是在暴露于致癌因子之后,受試個(gè)體可以癌定期地給藥免疫刺激核酸和含有癌抗原的腫瘤疫苗。
免疫刺激核酸和治療制劑還可以與癌癥藥聯(lián)合給藥。如本文所用,“癌癥藥”是指為治療癌癥的目的給予受試個(gè)體的制劑。如本文所用,“治療癌癥”包括防止癌癥發(fā)生,減輕癌癥癥狀和/或抑制已形成的癌癥的生長。在其它方面,癌癥藥為減小患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)的目的向處于患癌癥風(fēng)險(xiǎn)的受試個(gè)體給藥。癌癥藥涵蓋諸如化療劑、免疫治療制劑、癌癥疫苗、激素療法和生物學(xué)應(yīng)答修飾劑的范疇。癌癥藥還包括為了減輕癌癥癥狀,而非減少受試個(gè)體的腫瘤或癌癥負(fù)擔(dān)(即癌癥或腫瘤細(xì)胞的數(shù)目)而向受試個(gè)體給藥的制劑。這后一種類型的癌癥藥的例子是向患癌癥的受試個(gè)體輸血,以使紅細(xì)胞和/或血小板水平維持在正常范圍內(nèi)。作為例子,在不存在輸血時(shí),血小板低于正常水平的癌癥患者處于失控出血的風(fēng)險(xiǎn)中。
如本文所用,癌抗原被廣義地定義為癌細(xì)胞表達(dá)的抗原。優(yōu)選地,抗原表達(dá)在癌細(xì)胞的細(xì)胞表面。甚至更優(yōu)選地,抗原不被正常細(xì)胞表達(dá),或者至少不表達(dá)與癌細(xì)胞相同的水平。例如,有些癌抗原在正常細(xì)胞中正常地是沉默的(即不表達(dá)),有些僅在分化的某些階段表達(dá),而其它的則短暫表達(dá),例如胚胎和胎兒抗原。其它癌抗原由突變的細(xì)胞基因編碼,例如致癌基因(如活化的ras致癌基因)、抑制基因(如突變p53),由于內(nèi)部缺失或染色體易位產(chǎn)生的融合蛋白。其它癌抗原可以由病毒基因例如RNA和DNA腫瘤病毒攜帶的那些基因編碼??梢岳冒┛乖谡:桶┘?xì)胞中的差異表達(dá)靶向癌細(xì)胞。如本文所用,術(shù)語“癌抗原”和“腫瘤抗原”可互換使用。
在本發(fā)明的其它方面,免疫刺激核酸的利用,單獨(dú)或者與治療制劑聯(lián)合,允許給藥比通常給藥產(chǎn)生有效的抗原特異性免疫應(yīng)答更低的抗原劑量。因此,免疫刺激核酸允許給藥更低的亞治療劑量的抗原,但具有比利用如此低的劑量本來所實(shí)現(xiàn)的更高的功效。作為例子,通過給藥免疫刺激核酸和如果本來與常規(guī)佐劑例如明礬聯(lián)合使用將會(huì)無效的劑量的抗原,有可能獲得針對(duì)該抗原的有效免疫應(yīng)答,即便是本領(lǐng)域技術(shù)人員不會(huì)預(yù)料到該劑量的抗原可提供治療益處(即亞治療劑量)。
如本文所用,“免疫刺激核酸”是含有誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的免疫刺激基序或主鏈的任何核酸。免疫應(yīng)答可以表征為,但不限于,Th1-型免疫應(yīng)答或Th2-型免疫應(yīng)答。這種免疫應(yīng)答由激活的免疫細(xì)胞所誘發(fā)的細(xì)胞因子和抗體產(chǎn)生分布圖限定。
輔助(CD4+)T細(xì)胞通過產(chǎn)生對(duì)其它免疫系統(tǒng)細(xì)胞,包括其它T細(xì)胞起作用的可溶性因子協(xié)調(diào)哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答。輔助CD4+而且有些情況下也CD8+的T細(xì)胞在小鼠和人類系統(tǒng)中都被表征為Th1和Th2細(xì)胞,取決于它們細(xì)胞因子產(chǎn)生的分布(Romagnani,1991,ImmunolToday 12256-257,Mosmann,1989,Annu Rev Immunol,7145-173)。Th1細(xì)胞產(chǎn)生白介素2(IL-2)、IL-12、腫瘤壞死因子(TNFα)和干擾素γ(IFN-γ),并且它們主要負(fù)責(zé)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫,例如延遲型過敏反應(yīng)。給藥免疫刺激核酸誘導(dǎo)的細(xì)胞因子主要為Th1型。與Th1應(yīng)答有關(guān)的抗體類型通常更有保護(hù)性,因?yàn)樗鼈兙哂懈叩闹泻图罢{(diào)理能力。Th2細(xì)胞產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13,并且主要參與為體液免疫應(yīng)答例如IgE和IgG4抗體同型轉(zhuǎn)換提供最佳幫助(Mosmann,1989,Annu Rev Immunol,7145-173)。Th2應(yīng)答主要涉及對(duì)感染具有較少保護(hù)效果的抗體。
術(shù)語“核酸”和“寡核苷酸”可互換使用來指多核苷酸(即包含與磷酸基團(tuán)以及可交換有機(jī)堿連接的糖(如核糖或脫氧核糖)的分子,堿基或者是取代的嘧啶(如胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或者尿嘧啶(U)),或者是取代的嘌呤(如腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G))。如本文所用,該術(shù)語指寡聚核糖核苷酸以及寡聚脫氧核糖核苷酸。該術(shù)語還應(yīng)當(dāng)包括多聚核苷(即,除去磷酸的多聚核苷酸)以及含有有機(jī)堿的任何其它多聚體。核酸包括載體,如質(zhì)粒,以及寡核苷酸。核酸分子可以從現(xiàn)存的核酸來源(如基因組或cDNA,稱為分離的核酸)中獲取,但優(yōu)選是合成的(如通過寡核苷酸合成制備)。
免疫刺激核酸可以包括免疫刺激基序例如CpG基序和多聚-G基序。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中,任何核酸,不管它是否擁有可鑒定的基序,都可用于聯(lián)合治療以引發(fā)免疫應(yīng)答。免疫刺激主鏈包括,但不限于,磷酸修飾的主鏈,例如硫代磷酸酯主鏈。免疫刺激核酸在現(xiàn)有技術(shù)中被廣泛描述,并且下文提供了這些核酸的簡要概述。本發(fā)明的大多數(shù)方面,特別是涉及患有或處于患癌癥風(fēng)險(xiǎn)中的受試個(gè)體的那些方面,不包括利用富含T的或甲基化的CpG核酸(即,擁有富含T或甲基化CpG基序的核酸)。
在一些實(shí)施方案中,CpG免疫刺激核酸被用于本發(fā)明的方法。CpG免疫刺激核酸是含有CG二核苷酸的核酸,它的C殘基未甲基化。CpG免疫刺激核酸已知刺激Th1-型免疫應(yīng)答。CpG序列,盡管在人DNA中相對(duì)稀少,當(dāng)常見于傳染性生物例如細(xì)菌的DNA中。人類免疫系統(tǒng)顯然進(jìn)化到將CpG序列作為感染早期警報(bào)信號(hào)予以識(shí)別,并針對(duì)侵入的病原體起始緊急和有力的免疫應(yīng)答,而不導(dǎo)致頻繁見于其它免疫刺激因子的不良反應(yīng)。因此含CpG的核酸,依靠這種先天的免疫防御機(jī)制,能夠利用獨(dú)特和天然的途徑進(jìn)行免疫治療。CpG核酸對(duì)免疫調(diào)節(jié)的作用在美國專利No.6,194,388以及公開的專利申請(qǐng),例如PCT US95/01570、PCT/US97/19791、PCT/US98/03678、PCT/US98/10408、PCT/US98/04703、PCT/US99/07335和PCT/US99/09863中被詳盡描述。茲將這些發(fā)表的專利和專利申請(qǐng)中每一個(gè)的全部內(nèi)容并入作為參考。
CpG核酸是包括至少一個(gè)未甲基化的CpG二核苷酸的核酸。含有至少一個(gè)未甲基化的CpG二核苷酸的核酸是在胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸序列中含有未甲基化的胞嘧啶的核酸分子(即“CpG DNA”或者含有5′胞嘧啶,接著是3′鳥嘌呤,并且通過磷酸酯鍵連接的DNA)并且激活免疫系統(tǒng)。CpG核酸可以是雙鏈或單鏈的。一般而言,雙鏈分子在體內(nèi)更穩(wěn)定,而單鏈分子具有提高的免疫活性。因此在本發(fā)明的某些方面,優(yōu)選核酸是單鏈的,而在其它方面優(yōu)選核酸是雙鏈的。如本文所用,術(shù)語CpG核酸或CpG寡核苷酸除非另行指明,是指免疫刺激CpG核酸。整個(gè)免疫刺激核酸可以是未甲基化的,或者部分可以是未甲基化的,但是至少5′CG3′的C必需是未甲基化的。
在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,提供了免疫刺激核酸,它是至少由通式5′X1X2CGX3X43′代表的CpG核酸。其中X1、X2、X3和X4是核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中,X2為腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶。在另一個(gè)實(shí)施方案中,X3為胞嘧啶、鳥嘌呤、腺嘌呤或胸腺嘧啶。在其它實(shí)施方案中,X2為腺嘌呤、鳥嘌呤或胸腺嘧啶而X3為胞嘧啶、腺嘌呤或胸腺嘧啶。
在另一個(gè)實(shí)施方案中,免疫刺激核酸是至少由通式5′N1X1X2CGX3X4N23′代表的分離的CpG核酸。其中X1、X2、X3和X4是核苷酸而N是任何核苷酸,并且N1和N2分別是由0-25個(gè)N組成的核酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中,X1X2是從由GpT、GpG、GpA、ApA、ApT、ApG、CpT、CpA、CpG、TpA、TpT和TpG組成的組中選擇的核苷酸;而X3X4是從由TpT、ApT、TpG、ApG、CpG、TpC、ApC、CpC、TpA、ApA和CpA組成的組中選擇的核苷酸。優(yōu)選地,X1X2是GpA或GpT而X3X4是TpT。在其它實(shí)施方案中,X1或X2或兩者都是嘌呤,而X3或X4或兩者都是嘧啶,或者X1X2是GpA而X3或X4或兩者都是嘧啶。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,X1X2是從由TpA、ApA、ApC、ApG和GpG組成的組中選擇的核苷酸。而在另一個(gè)實(shí)施方案中,X3X4是從由TpT、TpA、TpG、ApA、ApG、ApC和CpA組成的組中選擇的核苷酸。X1X2在另一個(gè)實(shí)施方案中是從由TpT、TpG、ApT、GpC、CpC、CpT、TpC、GpT和CpG組成的組中選擇的核苷酸。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,免疫刺激核酸具有序列5′TCN1TX1X2CGX3X43′。本發(fā)明的免疫刺激核酸在一些實(shí)施方案中包括選自GpT、GpG、GpA和ApA的X1X2,并且X3X4選自TpT、CpT和TpC。
為便于攝入至細(xì)胞中,免疫刺激核酸優(yōu)選長度在6-100個(gè)堿基的范圍內(nèi)。不過,根據(jù)本發(fā)明,大于6個(gè)核苷酸的任意大小的核酸(甚至幾kb長)能夠誘導(dǎo)免疫應(yīng)答,如果存在足夠的免疫刺激基序的話。優(yōu)選地,免疫刺激核酸的大小在8-100個(gè)核苷酸之間,而在一些實(shí)施方案中,在8-50個(gè)核苷酸之間或者8-30個(gè)核苷酸之間。
“回文順序”應(yīng)當(dāng)指倒轉(zhuǎn)重復(fù)(即,例如ABCDEE′D′C′B′A′的序列,其中A和A′是能夠形成通常的Watson-Crick堿基對(duì)的堿基)。在體內(nèi),這樣的序列可能形成雙鏈結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施方案中,CpG核酸含有回文順序。本上下文中所用的回文順序是指CpG為回文的一部分的回文,并且優(yōu)選CpG是回文的中心。在另一個(gè)實(shí)施方案中,CpG核酸不含回文。不含回文的免疫刺激核酸是CpG不是回文的一部分的核酸。這樣的寡核苷酸可以包括CpG不是回文的中心的回文。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中,利用了非-CpG免疫刺激核酸。非-CpG免疫刺激核酸是它的序列中沒有CpG基序的核酸,不管C是否為二核苷酸,是否甲基化或未甲基化。非-CpG免疫刺激核酸可能誘導(dǎo)Th1或Th2免疫應(yīng)答,取決于它們的序列,它們的遞送方式以及它們給藥的劑量。
非-CpG免疫刺激核酸一個(gè)重要的亞群為多聚-G免疫刺激核酸。許多參考文獻(xiàn),包括Pisetsky和Reich,1993 Mol.Biol.Reports,18217-221;Krieger和Herz,1994,Ann.Rev.Biochem.,63601-637;Macaya等,1993,PNAS,903745-3749;Wyatt等,1994,PNAS,911356-1360;Rando和Hogan,1998,In Applied AntisenseOligonucleotide Technology,編輯Krieg和Stein,p.335-352;以及Kimura等,1994,J Biochem.116,991-994也描述了多聚-G核酸的免疫刺激性能。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面,含多聚-G的核苷酸尤其可用于治療和預(yù)防細(xì)菌、病毒和真菌感染,并因而可用來使這些感染對(duì)癌癥患者的治療的影響最小化。
多聚-G核酸優(yōu)選是具有如下通式的核酸5′X1X2GGGX3X43′。其中X1、X2、X3和X4是核苷酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中,X3和X4中至少一個(gè)為G。在其它實(shí)施方案中,X3和X4都是G。而在其它的實(shí)施方案中,優(yōu)選的通式為5′GGGNGGG 3′或者5′GGGNGGGNGGG 3′,其中N代表0-20個(gè)核苷酸。在其它實(shí)施方案中,多聚-G核酸不含未甲基化的CG二核苷酸,例如象上文所列的SEQ ID NO95到SEQ IDNO133的核酸。在其它實(shí)施方案中,多聚-G核酸包括至少一個(gè)未甲基化的CG二核苷酸,例如象下文所列的SEQ ID NO46、SEQ ID NO47、SEQ ID NO58和SEQ ID NO61的核酸。
富含T基序以及擁有這種基序的核酸描述在公開的PCT專利申請(qǐng)WO01/22972和于2000年9月25日遞交的相關(guān)美國專利申請(qǐng)No.09/669,187中,茲將其全部內(nèi)容并入作為參考。
例示性的免疫刺激核酸包括但不限于表1所示的那些免疫刺激核酸。
表1
為用于本發(fā)明,免疫刺激核酸可以利用本領(lǐng)域公知的許多操作從頭合成。這樣的化合物稱之為“合成”核酸。例如,b-氰乙基亞磷酰胺法(Beaucage,S.L.,和Caruthers,M.H.,Tet.Let.221859,1981);核苷H-膦酸酯法(Garegg等,Tet.Let.274051-4054,1986;Froehler等,Nucl.Acid.Res.145399-5407,1986;Garegg等,Tet.Let.274055-4058,1986,Gaffney等,Tet.Let.292619-2622,1988)。這些化學(xué)方法可以通過市場上可獲得的各種自動(dòng)寡核苷酸合成儀進(jìn)行。這些核酸被稱為合成核酸。作為選擇地,免疫刺激核酸可以在質(zhì)粒中大規(guī)模產(chǎn)生(參見Sambrook,T.,等,″Molecular CloningA Laboratory Manual″,冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版,New York,1989)并且分成小份或者整體給藥。核酸可以利用已知技術(shù)從現(xiàn)存的核酸序列中制備(如基因組或cDNA),例如使用限制性酶、核酸外切酶或核酸內(nèi)切酶的那些技術(shù)。以這種方式制備的核酸被稱為分離的核酸。術(shù)語“免疫刺激核酸”包括合成和分離的免疫刺激核酸。
為在體內(nèi)應(yīng)用,核酸優(yōu)選相對(duì)抵抗降解(如穩(wěn)定化的)?!胺€(wěn)定化的核酸分子”是指相對(duì)能抵抗體內(nèi)降解(如通過外切-或內(nèi)切-核酸酶)的核酸分子。穩(wěn)定化可以是長度或二級(jí)結(jié)構(gòu)的功能。數(shù)十到數(shù)百kb長的免疫刺激核酸相對(duì)抵抗體內(nèi)降解。對(duì)于較短的免疫刺激核酸,二級(jí)結(jié)構(gòu)可以穩(wěn)定并增強(qiáng)它們的功效。例如,如果核酸的3′末端具有與上游區(qū)域的自身互補(bǔ)性,使得它可以折疊回來,并形成短的莖環(huán)結(jié)構(gòu),則該核酸變得穩(wěn)定,因而表現(xiàn)出更多的生物學(xué)體內(nèi)活性。
作為選擇地,核酸穩(wěn)定化可以通過主鏈修飾實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選的穩(wěn)定的當(dāng)前發(fā)明的核酸具有修飾的主鏈。已經(jīng)證明當(dāng)體內(nèi)給藥時(shí),修飾核酸主鏈為免疫刺激核酸提供增強(qiáng)的活性。一種類型的修飾主鏈?zhǔn)橇姿嶂麈溞揎?。在寡核苷?′末端包括至少兩個(gè)硫代磷酸酯鍵而在3′末端有多個(gè),優(yōu)選5個(gè)硫代磷酸酯鍵的免疫刺激核酸,能夠在某些場合下提供最大的活性,并保護(hù)該核酸免受胞內(nèi)外切-或內(nèi)切-核酸酶的降解。其它磷酸修飾核酸包括磷酸二酯修飾核酸、組合磷酸二酯和硫代磷酸酯核酸、甲基膦酸酯、甲基硫代磷酸酯酯、二硫代磷酸酯酯、及其組合。CpG核酸中的這些組合每一種及它們對(duì)免疫細(xì)胞的特定效果在發(fā)表的美國專利6,194,388、6,207,646和6,239,116中更加詳細(xì)地討論,茲將其全部內(nèi)容并入作為參考。雖然不旨在束縛于任何特定的理論,我們相信這些磷酸修飾核酸可能由于增強(qiáng)的核酸酶抗性、提高的細(xì)胞攝取、增強(qiáng)的蛋白結(jié)合和/或改變的胞內(nèi)定位而表現(xiàn)出更大的刺激活性。
修飾的主鏈例如硫代磷酸酯可以使用氨基磷酸酯或者H-膦酸酯化學(xué)利用自動(dòng)化技術(shù)合成。芳基和烷基膦酸酯可以,例如,象美國專利No.4,469,863中所描述的那樣制備。烷基磷酸三酯,其中帶電的氧原子成分如美國專利No.5,023,243和歐洲專利No.092,574所述被烷基化,可以利用商業(yè)上可獲得的試劑通過自動(dòng)固相合成制備。進(jìn)行其它DNA主鏈修飾和取代的方法已有描述(Uhlmann,E.和Peyman,A.,Chem.Rev.90544,1990;Goodchild,J.,Biocojugate Chem.1165,1990)。
含有免疫刺激基序的硫代磷酸酯和磷酸二酯核酸在免疫細(xì)胞中都有活性。不過,根據(jù)誘導(dǎo)免疫刺激核酸特異性效果所需的濃度,核酸酶抗性硫代磷酸酯主鏈免疫刺激核酸比磷酸二酯主鏈免疫刺激核酸更為有力。例如,2μg/ml硫代磷酸酯已表明實(shí)現(xiàn)與90μg/ml磷酸二酯相同的免疫刺激。
根據(jù)本發(fā)明可用的另一種類型的修飾主鏈,為肽核酸。主鏈由氨基乙基甘氨酸構(gòu)成,并支撐提供DNA特征的堿基。主鏈不包括任何磷酸,因而可以任選地沒有凈電荷。沒有電荷允許更強(qiáng)的DNA-DNA結(jié)合,因?yàn)閮蓷l鏈之間的電荷排斥不存在。另外,由于主鏈具有額外的亞甲基基團(tuán),寡核苷酸是酶/蛋白酶抗性的。肽核酸可以從各種商業(yè)來源,例如Perkin Elmer購得,或者從頭合成。
另一類主鏈修飾包括2′-O-甲基核糖核苷(2′-Ome)。這些類型的取代在現(xiàn)有技術(shù)中廣泛地描述過,而且具體與它們的免疫刺激性能相關(guān)的有Zhao等,Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters,1999,9243453。Zhao等描述了制備核酸2′-Ome修飾的方法。
本發(fā)明的核酸分子可以包括天然存在的或者合成的嘌呤或嘧啶雜環(huán)堿基以及修飾的主鏈。嘌呤或嘧啶雜環(huán)堿基包括,但不限于,腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶和次黃嘌呤。其它有代表性的雜環(huán)堿基在Merigan等的美國專利No.3,687,808中公開了。術(shù)語“嘌呤”或“嘧啶”或“堿基”在這里是指天然存在的或合成的嘌呤、嘧啶或堿基。
其它穩(wěn)定化的核酸包括非離子DNA類似物,例如烷基-和-芳基磷酸酯(其中帶電的膦酸氧原子被烷基或芳基基團(tuán)代替)、磷酸二酯和烷基磷酸三酯,其中帶電的氧成分被烷基化。在任一端或兩端含有二醇,例如四乙二醇或六乙二醇的核酸也已證明對(duì)核酸酶降解具有抗性。
根據(jù)本發(fā)明可用的具有主鏈修飾的免疫刺激核酸,在一些實(shí)施方案中是S-或R-手性免疫刺激核酸。如本文所用的“S手性免疫刺激核酸”是其中至少兩個(gè)核苷酸具有形成手性中心的主鏈修飾,并且其中至少75%的手性中心具有S手性的免疫刺激核酸。如本文所用的“R手性免疫刺激核酸”是其中至少兩個(gè)核苷酸具有形成手性中心的主鏈修飾,并且其中至少75%的手性中心具有R手性的免疫刺激核酸。主鏈修飾可以是形成手性中心的任何類型的修飾。修飾包括但不限于硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、甲基硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、2′-Ome及其組合。
手性免疫刺激核酸在核酸內(nèi)必需具有至少兩個(gè)具有主鏈修飾的核苷酸。不過,全部或少于全部的核苷酸可以具有修飾的主鏈。在具有修飾主鏈的核苷酸中(稱之為手性中心),至少75%具有單一手性S或R。因此,不到全部的手性中心可能具有S或R手性,只要至少75%的手性中心具有S或R手性。在一些實(shí)施方案中,至少80%、85%、90%、95%或100%的手性中心具有S或R手性。在其它實(shí)施方案中,至少80%、85%、90%、95%或100%的核苷酸具有主鏈修飾。
S-和R-手性免疫刺激核酸可以通過本領(lǐng)域公知的制備手性純寡核苷酸的任何方法制備。Stec等教導(dǎo)了利用oxathiaphospholane制備立體純硫代磷酸酯寡聚脫氧核糖核苷酸的方法(Stec,W.J.,等,1995,J.Am.Chem.Soc.,11712019)。制備手性純寡核苷酸的其它方法已經(jīng)被公司例如ISIS制藥公司描述過。公開了生產(chǎn)立體純寡核苷酸的方法的美國專利包括5883237、5837856、5599797、5512668、5856465、5359052、5506212、5521302和5212295,茲將每一篇全文并入作為參考。
如本文所用,給藥免疫刺激核酸旨在涵蓋給藥一種或多種就其類型(profile)、序列、主鏈修飾和生物學(xué)效應(yīng)而言可能有或可能沒有差異的免疫刺激核酸。作為例子,CpG核酸和多聚-G核酸可以給予單個(gè)受試個(gè)體。在另一個(gè)例子中,還可以向受試個(gè)體給予核苷酸序列不同的多個(gè)CpG核酸。
本發(fā)明的治療制劑為水包油乳劑。如本文所用的術(shù)語水包油乳劑是指懸浮于水中的油微滴的異質(zhì)混合物組成的液體。水包油乳劑是本領(lǐng)域公知的。一個(gè)優(yōu)選的水包油乳劑以商標(biāo)名EMULSIGENTM(由MPV Laboratories,Nebraska,U.S.A出售)出售。
術(shù)語“有效量”的免疫刺激核酸是指實(shí)現(xiàn)預(yù)期的生物學(xué)效應(yīng)所必需的或足夠的量。例如,有效量的免疫刺激核酸可以是導(dǎo)致激活免疫系統(tǒng),潛在地導(dǎo)致形成抗原特異性免疫應(yīng)答所必需的量。根據(jù)本發(fā)明的某些方面,有效量是免疫刺激核酸的該量和治療制劑的該量,當(dāng)它們組合或共給藥時(shí),在預(yù)防或者治療癌或感染性疾病中,產(chǎn)生對(duì)腫瘤或傳染因子的協(xié)同應(yīng)答。協(xié)同量是產(chǎn)生大于免疫刺激核酸及治療制劑單獨(dú)的個(gè)別效應(yīng)的加和的應(yīng)答的量。例如,免疫刺激核酸和治療制劑的協(xié)同組合提供的生物學(xué)效應(yīng)大于分別利用每一種組份(即所述核酸和藥劑)所實(shí)現(xiàn)的組合的生物學(xué)效應(yīng)。生物學(xué)效應(yīng)可以是因癌癥或感染性疾病引起的癥狀的改善或者完全消除。在另一個(gè)實(shí)施方案中,生物學(xué)效應(yīng)是癌癥或感染性疾病的徹底消失,例如象通過腫瘤的缺失或者沒有癌細(xì)胞的生檢或者血涂片所證實(shí)的那樣。
在治療癌癥或感染性疾病或者在降低患癌癥或感染性疾病的風(fēng)險(xiǎn)中,與治療制劑協(xié)同所必需的免疫刺激核酸的有效量可能根據(jù)免疫刺激核酸的序列、核酸的主鏈成分以及核酸的遞送方式而變化。任何特定應(yīng)用的有效量可以根據(jù)諸如治療的疾病、給藥的特定免疫刺激核酸(例如,核酸中免疫刺激基序的性質(zhì)、數(shù)目或位置)、受試個(gè)體的大小或者疾病或狀況的嚴(yán)重度等因素變化。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠經(jīng)驗(yàn)性地確定特定免疫刺激核酸和治療制劑組合的有效量而無需過度的實(shí)驗(yàn)。結(jié)合本文提供的教導(dǎo),通過在各種活性化合物中選擇,并衡量諸如藥效、相對(duì)生物利用度、患者體重、不良副作用的嚴(yán)重度以及優(yōu)選的給藥方式等因素,可以設(shè)計(jì)有效的預(yù)防性或治療性治療方案,其不導(dǎo)致實(shí)質(zhì)上的毒性,而又完全有效地治療特定的受試個(gè)體。
在一些實(shí)施方案中,免疫刺激核酸以刺激或誘導(dǎo)Th1免疫應(yīng)答、或者Th2免疫應(yīng)答、或者普通的免疫應(yīng)答的有效量給藥。刺激Th1免疫應(yīng)答的有效量可定義為刺激產(chǎn)生一種或多種Th1-型細(xì)胞因子例如白介素2(IL-2)、IL-12、腫瘤壞死因子(TNFα)以及干擾素γ(IFN-γ)和/或產(chǎn)生一種或多種Th1-型抗體的量。另一方面,刺激Th2免疫應(yīng)答的有效量可以定義為刺激產(chǎn)生一種或多種Th2-型細(xì)胞因子例如IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10以及IL-13和/或產(chǎn)生一種或多種Th2-型抗體的量。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中,免疫刺激核酸以預(yù)防細(xì)菌、病毒或真菌感染的有效量給藥。免疫刺激核酸已知可用于預(yù)防細(xì)菌和病毒感染。
在某些情況下,亞治療劑量的抗原被用來治療患癌癥或感染性疾病或者處于患癌癥或感染性疾病風(fēng)險(xiǎn)中的受試個(gè)體。作為例子,根據(jù)本發(fā)明已發(fā)現(xiàn),當(dāng)抗原與免疫刺激核酸共同給藥時(shí),抗原能夠以亞治療劑量給藥而仍然產(chǎn)生期望的治療結(jié)果。如本文所用的“亞治療劑量”是指比如果在不存在另一制劑時(shí)給藥會(huì)在受試個(gè)體中產(chǎn)生治療結(jié)果的劑量小的劑量。因此,亞治療劑量的抗原是單獨(dú)或與常規(guī)佐劑例如明礬組合時(shí)在不給藥免疫刺激核酸的情況下不會(huì)在受試個(gè)體中產(chǎn)生預(yù)期的治療結(jié)果的量??乖闹委焺┝吭谝呙缃臃N領(lǐng)域是公知的。這些劑量已經(jīng)在文獻(xiàn)中廣泛地描述,醫(yī)學(xué)行業(yè)依靠其作為疫苗接種的指導(dǎo)。免疫刺激核酸的治療劑量在本領(lǐng)域中也有描述,并且鑒定受試個(gè)體治療劑量的方法在這里更加詳細(xì)地描述了。
對(duì)于本文所述的任何化合物,治療有效量可以最初從細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)中確定。具體地,免疫刺激核酸的有效量可以利用體外刺激試驗(yàn)進(jìn)行確定。免疫刺激核酸的刺激指數(shù)可以與事先測試的免疫刺激酸的指數(shù)進(jìn)行比較。刺激指數(shù)可以用來確定特定寡核苷酸對(duì)特定受試個(gè)體的有效量,并且劑量可以向上或向下調(diào)整以在受試個(gè)體中達(dá)到預(yù)期的水平。
治療有效量還可以在動(dòng)物研究中確定。例如,誘導(dǎo)協(xié)同應(yīng)答的免疫刺激核酸和治療制劑的有效量可以利用腫瘤退化和/或預(yù)防腫瘤形成的體內(nèi)測定進(jìn)行評(píng)估。相關(guān)的動(dòng)物模型包括將惡性細(xì)胞注入動(dòng)物受試個(gè)體的測定,通常注射在限定的部位。一般而言,一定劑量范圍的免疫刺激核酸與一定劑量范圍的治療制劑一起向動(dòng)物給藥。注射惡性細(xì)胞后腫瘤生長的抑制指示降低患癌癥風(fēng)險(xiǎn)的能力。預(yù)存腫瘤進(jìn)一步生長的抑制(或尺寸的減小)指示治療癌癥的能力。經(jīng)過改造含有人類免疫系統(tǒng)元件的小鼠可用作人類癌細(xì)胞系的受體以確定協(xié)同組合的有效量。
對(duì)于已經(jīng)在人類中測試(已經(jīng)開始人類臨床試驗(yàn))的免疫刺激核酸以及對(duì)于已知表現(xiàn)出相似藥理學(xué)活性治療的化合物,例如其它佐劑,如LT以及用于免疫接種目的的其它抗原,有效劑量還可以從人類數(shù)據(jù)中確定。
應(yīng)用的免疫刺激核酸和治療制劑的劑量可以根據(jù)相對(duì)生物利用度以及給藥的化合物,包括所用的佐劑的藥效進(jìn)行調(diào)整。根據(jù)上文所述方法和其它方法調(diào)整劑量實(shí)現(xiàn)最大效果,完全是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員能力范圍之內(nèi)的事。
本文所述的化合物的受試個(gè)體劑量典型地在從大約0.1μg到10,000mg的范圍內(nèi),更典型地從大約1μg/天到8000mg,并且最典型地從大約10μg到100μg。就受試個(gè)體體重而言,典型的劑量在從大約0.1μg到20mg/kg/天的范圍內(nèi),更典型地從大約1到10mg/kg/天,并且最典型地從大約1到5mg/kg/天。
在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中,免疫刺激核酸以常規(guī)時(shí)間表給藥。如本文所用的“常規(guī)時(shí)間表”是指預(yù)定的指定時(shí)間段。常規(guī)時(shí)間表可以涵蓋相同長度或長度不等的時(shí)間段,只要時(shí)間表是預(yù)定的。例如,常規(guī)時(shí)間表可以包括以每天、每兩天、每三天、每四天、每五天、每六天、每周、每月或其間任何設(shè)定數(shù)目的天數(shù)或周、每兩個(gè)月、三個(gè)月、四個(gè)月、五個(gè)月、六個(gè)月、七個(gè)月、八個(gè)月、九個(gè)月、十個(gè)月、十一個(gè)月、十二個(gè)月等為基礎(chǔ)給藥免疫刺激核酸。作為替代,預(yù)定的常規(guī)時(shí)間表可以包括第一周按每天給藥免疫刺激核酸,接著數(shù)月按每月給藥,之后按每三個(gè)月給藥。任何特定的組合可被常規(guī)時(shí)間表覆蓋,只要提前確定適當(dāng)?shù)娜粘瘫戆ㄔ谀骋惶旖o藥。
免疫刺激核酸可以以質(zhì)粒載體的形式向受試個(gè)體遞送。在一些實(shí)施方案中,一個(gè)質(zhì)粒載體可以既包括免疫刺激核酸又包括編碼抗原的核酸。在其它實(shí)施方案中,可以利用分開的質(zhì)粒。而在其它實(shí)施方案中,可以不利用質(zhì)粒。
免疫刺激核酸和治療制劑可以單獨(dú)(例如在鹽水或緩沖液中)或者利用本領(lǐng)域已知的任何遞送載體給藥。例如,下列遞送介質(zhì)已被描述cochleates(Gould-Fogerite等,1994,1996);Emulsomes(Vancott等,1998,Lowell等,1997);ISCOMs(Mowat等,1993,Carlsson等,1991,Hu et.,1998,Morein等,1999);脂質(zhì)體(Childers等,1999,Michalek等,1989,1992,de Haan 1995a,1995b);活細(xì)菌載體(如沙門氏菌屬(Salmonella)、大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli),Bacilluscalmatte-guerin、志賀氏菌屬(Shigella)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus))(Hone等,1996,Pouwels等,1998,Chatfield等,1993,Stover等,1991,Nugent等,1998);活病毒載體(例如牛痘、腺病毒、單純皰疹)(Gallichan等,1993,1995,Moss等,1996,Nugent等,1998,F(xiàn)lexner等,1988,Morrow等,1999);微球體(Gupta等,1998,Jones等,1996,Maloy等,1994,Moore等,1995,O′Hagan等,1994,Eldridge等,1989);核酸疫苗(Fynan等,1993,Kuklin等,1997,Sasaki等,1998,Okada等,1997,Ishii等,1997);聚合物(例如,羧甲基纖維素、脫乙酰殼多糖)(Hamajima等,1998,Jabbal-Gill等,1998);聚合物環(huán)(Wyatt等,1998);蛋白體(Vancott等,1998,Lowell等,1988,1996,1997);氟化鈉(Hashi等,1998);轉(zhuǎn)基因植物(Tacket等,1998,Mason等,1998,Haq等,1995);病毒體(Gluck等,1992,Mengiardi等,1995,Cryz等,1998);以及病毒樣顆粒(Jiang等,1999,Leibl等,1998)。
免疫刺激核酸可以與另外的治療劑例如細(xì)胞因子組合以甚至進(jìn)一步增強(qiáng)免疫應(yīng)答。免疫刺激核酸和其它治療劑可以同時(shí)或者前后給藥。當(dāng)其它治療劑同時(shí)給藥時(shí),它們可以在同一或分開的制劑中給藥,但在同一時(shí)間給藥。其它治療劑與免疫刺激核酸的給藥還可以暫時(shí)分開,意味著治療劑在不同的時(shí)間,在給藥免疫刺激核酸之前或之后給藥。這些化合物給藥時(shí)間之間的分開可能是幾分鐘的事情,或者可能更長。其它治療因子包括但不限于細(xì)胞因子、免疫治療抗體、抗原等。
免疫應(yīng)答還可以通過與免疫刺激核酸共給藥或共線性表達(dá)細(xì)胞因子或共刺激分子而誘導(dǎo)或增強(qiáng)。細(xì)胞因子可以直接與免疫刺激核酸給藥,或者以編碼該細(xì)胞因子的核酸載體的形式給藥,從而細(xì)胞因子可以在體內(nèi)表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中,細(xì)胞因子以質(zhì)粒表達(dá)載體的形式給藥。術(shù)語“細(xì)胞因子”用作為各類可溶性蛋白或肽的通稱,它們?cè)诩{摩爾或皮摩爾濃度時(shí)起體液調(diào)節(jié)劑的作用,并且它們?cè)谡;虿±項(xiàng)l件下,調(diào)節(jié)各細(xì)胞和組織的功能性活動(dòng)。這些蛋白還直接介導(dǎo)細(xì)胞之間的相互作用,并調(diào)節(jié)發(fā)生在胞外環(huán)境中的過程。細(xì)胞因子還是指導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答的中心。細(xì)胞因子的例子包括,但不限于IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、干擾素γ(IFN-γ)、IFN-α、腫瘤壞死因子(TNF)、TGF-β、FLT-3配體以及CD40配體。在一些實(shí)施方案中,細(xì)胞因子是Th1細(xì)胞因子。而在其它實(shí)施方案中,細(xì)胞因子為Th2細(xì)胞因子。在其它實(shí)施方案中,細(xì)胞因子不與免疫刺激核酸聯(lián)合給藥。
在其它方面,本發(fā)明涉及試劑盒。本發(fā)明的一種試劑盒包括盛裝免疫刺激核酸的容器和盛裝水包油乳劑的容器以及給藥免疫刺激核酸和水包油乳劑的說明書。本發(fā)明的另一種試劑盒包括盛裝免疫刺激核酸的容器和的時(shí)間安排給藥免疫刺激核酸的時(shí)間安排的說明書??蛇x地,該試劑盒還可以包括抗原,盛裝在分開的容器中或者與免疫刺激核酸或治療制劑配制在一起??蛇x地,抗原可以處在持續(xù)釋放裝置中。持續(xù)釋放載體在這里根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)是用來指緩慢釋放抗原的任何裝置。
這種系統(tǒng)能夠避免重復(fù)給藥化合物,增加受試個(gè)體和醫(yī)師的方便。存在許多類型的釋放遞送系統(tǒng)并且是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的。它們包括聚合物為基礎(chǔ)的系統(tǒng)例如聚(丙交酯-乙交酯)、共聚草酸酯、聚己內(nèi)酯、聚酯酰胺、聚原酸酯、聚羥基丁酸和聚酐。含有的藥物前述聚合物的微膠囊描述在,例如美國專利5,075,109中。遞送系統(tǒng)還包括非聚合物系統(tǒng),它們是包括固醇在內(nèi)的脂肪,例如膽固醇、膽固醇酯和脂肪酸或中性脂肪例如單-、雙-或三-甘油酯;水凝膠釋放系統(tǒng);sylastic系統(tǒng);肽為基礎(chǔ)的系統(tǒng);蠟包衣;利用常規(guī)粘結(jié)劑和賦形劑的壓制片劑;部分融合的植入物等。具體的例子包括,但不限于(a)腐蝕系統(tǒng),其中本發(fā)明的制劑包含在如美國專利Nos.4,452,775、4,675,189和5,736,152中所述的基質(zhì)形式中,和(b)擴(kuò)散系統(tǒng),其中活性組份以可控速率從例如美國專利Nos.3,854,480、5,133,974和5,407,686中所述的聚合物中滲透。另外,可以利用基于泵的硬件遞送系統(tǒng),其中一些適合植入。
制劑例如水包油乳劑被盛裝在至少一個(gè)容器中。容器可以是一起盛裝所有制劑的單個(gè)容器,或者可以是盛裝單個(gè)劑量的多個(gè)容器或腔室,例如硬質(zhì)泡沫塑料襯墊包裝。試劑盒還具有給藥治療制劑時(shí)間安排的說明書。說明書將指導(dǎo)患有癌癥或處于患癌癥風(fēng)險(xiǎn)中的受試個(gè)體在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間服用治療制劑。例如,遞送藥物的合適時(shí)間可能是癥狀發(fā)生的時(shí)候。作為替代方式,給藥藥物的合適時(shí)間可能是依照常規(guī)時(shí)間表例如每月或每年。
本發(fā)明的藥物組合物含有有效量的免疫刺激核酸和治療制劑,任選地包括在藥學(xué)上可接受的載體中。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”是指適于給藥人類或其它脊椎動(dòng)物的一種或多種相容固體或液體填料、稀釋劑或者膠囊物質(zhì)。術(shù)語“載體”表示有機(jī)或無機(jī)成分,天然的或合成的,活性成分與之組合便于施用。藥物組合物的組份還能夠以一定方式與本發(fā)明的化合物混合,以及彼此之間混合,使得沒有在實(shí)質(zhì)上會(huì)削減預(yù)期的藥效的相互作用。
免疫刺激核酸和治療制劑可以自身(純的)或者以藥學(xué)可接受的鹽的形式給藥。當(dāng)用于藥時(shí),鹽應(yīng)當(dāng)是藥學(xué)上可接受的,但是非藥學(xué)上可接受的鹽可以常規(guī)地用來制備其藥學(xué)上可接受的鹽。這樣的鹽包括,但不限于,從如下酸中制備的那些鹽鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、馬來酸、乙酸、水楊酸、p-甲苯磺酸、酒石酸、檸檬酸、甲磺酸、蟻酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。而且,這樣的鹽可以作為堿金屬或堿土金屬鹽制備,例如羧酸基團(tuán)的鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽。
合適的緩沖劑包括乙酸和鹽(1-2%w/v);檸檬酸和鹽(1-3%w/v);硼酸和鹽(0.5-2.5%w/v);以及磷酸和鹽(0.8-2%w/v)。合適的防腐劑包括潔爾滅(0.003-0.03%w/v);氯代丁醇(0.3-0.9%w/v);parabens(0.01-0.25%w/v)和硫柳汞(0.004-0.02%w/v)。
腸胃外給藥的藥物制劑包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。另外,活性活化合物懸浮液可作為合適的油注射懸浮液制備。合適的親脂溶劑或介質(zhì)包括脂肪油例如芝麻油,或者合成的脂肪酸酯,例如油酸乙酯或甘油三酸酯,或者脂質(zhì)體。水性注射懸浮液可以包含增加懸浮液粘度的物質(zhì),例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。任選地,懸浮液還可以含有合適的穩(wěn)定劑或者增加化合物溶解度的制劑,以允許制備高度濃縮的溶液。用于持續(xù)釋放遞送的另一個(gè)合適的化合物是GELFOAM,一種由修飾的膠原纖維組成的商業(yè)上可獲得的產(chǎn)品。
作為替代,活性化合物可以是粉劑形式,用前與合適的載體如無菌無熱原的水配制。
藥物組合物還可以包含合適的固體和凝膠相載體或賦形劑。這樣的載體或賦形劑的例子包括但不限于碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖、淀粉、纖維素衍生物、明膠和聚合物例如聚乙二醇。
免疫刺激核酸和治療制劑可以按固定的時(shí)間表或者以彼此不同的時(shí)間關(guān)系給藥。各種組合比現(xiàn)有技術(shù)的方法具有很多優(yōu)勢。
免疫刺激核酸和治療制劑可以通過任何平常的藥物給藥途徑給藥。根據(jù)治療的紊亂的類型,免疫刺激核酸和治療制劑可以吸入、咽下或通過系統(tǒng)途徑。系統(tǒng)途徑包括口服和腸胃外。由于直接遞送到肺部,特別是在治療呼吸道疾病或肺癌中,在某些實(shí)施方案中優(yōu)選吸入的藥物。許多類型的計(jì)量型劑量吸入器被常規(guī)地用來吸入給藥。這些類型的裝置包括計(jì)量型劑量吸入器(MDI)、呼吸驅(qū)動(dòng)型MDI、干粉吸入器(DPI)、與MDI組合的間隔/容納腔以及噴霧器。優(yōu)選的給藥途徑包括但不限于口服、腸胃外、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、氣管內(nèi)、鞘內(nèi)、靜脈內(nèi)、吸入、眼睛、陰道和直腸途徑。
為用于治療,有效量的免疫刺激核酸和治療制劑可以通過將核酸遞送到感染的器官或組織,或者作為替代地,遞送到免疫系統(tǒng)的任何方式向受試個(gè)體給藥。“給藥”本發(fā)明的藥物組合物可以通過熟練技術(shù)人員公知的任何手段實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選的給藥途徑包括但不限于口服、腸胃外、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、氣管內(nèi)、吸入、眼睛、陰道和直腸途徑。
對(duì)于口服給藥,化合物(即免疫刺激核酸、治療制劑和其它治療劑)可以通過組合活性化合物和本領(lǐng)域公知的藥學(xué)上可接受的載體容易地配制。這樣的載體使得本發(fā)明的化合物配制成片劑、藥丸、糖衣丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿劑、膏劑、懸浮液等,用于被治療的受試個(gè)體口服攝入??诜玫乃帉W(xué)制劑可以作為固體賦形劑獲得,任選地研磨所得的混合物,并處理顆?;旌衔?,在加入合適的助劑后,如果需要的話,獲得片劑或糖衣丸核芯。合適的賦形劑為,特別地,填料例如糖,包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇;纖維素制劑例如,象玉米淀粉、小麥淀粉、水稻淀粉、馬鈴薯淀粉、凝膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥基丙基甲基-纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要,可以添加崩解劑,例如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或褐藻酸或其鹽例如褐藻酸鈉。任選地,口服制劑還可以在鹽水或用于中和內(nèi)部酸環(huán)境的緩沖液中配制,或者可以無需任何載體給藥。
糖衣丸核芯被提供合適的包衣。為了這個(gè)目的,可以利用濃縮的糖溶液,它可以任選地含有阿拉伯膠、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯凝膠、聚乙二醇和/或二氧化鈦、漆溶液和適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑或溶劑混合物。可以向片劑或糖衣丸衣料中添加染料或顏料用于識(shí)別或表征不同的活性化合物劑量的組合。
口服用的藥學(xué)制劑包括由明膠制成的推入配合膠囊(push-fitcapsules),以及由明膠和增塑劑,例如甘油或山梨醇制成的軟密封膠囊。推入配合膠囊可以含有與填料例如乳糖、粘附劑例如淀粉和/或潤滑劑例如滑石粉或硬脂酸鎂,以及任選地,穩(wěn)定劑混合的活性成分。在軟膠囊中,活性化合物可以溶解或懸浮在合適的液體,例如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇中。另外,可以添加穩(wěn)定劑。也可以利用配制成口服給藥的微球體。這種微球體在本領(lǐng)域已經(jīng)被很好地詳細(xì)說明。所有口服給藥的制劑應(yīng)當(dāng)處于適于這樣給藥的劑量。
對(duì)于口腔給藥,組合物可采取以常規(guī)方式配制的片劑或藥糖塊的形式。
對(duì)于吸入給藥,根據(jù)本發(fā)明可用的化合物可以方便地從加壓包裝或噴霧器中借助于適當(dāng)?shù)耐七M(jìn)劑,例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它適當(dāng)?shù)臍怏w,以氣溶膠噴射呈遞的形式遞送。在加壓氣溶膠的情況下,劑量單位可以通過提供閥門遞送計(jì)量的量進(jìn)行確定。用于吸入器或吹藥器的例如明膠的膠囊和藥筒可以配成含有化合物的粉末混合物和適當(dāng)?shù)姆勰┗桌缛樘腔虻矸邸V苽錃馊苣z遞送系統(tǒng)的技術(shù)是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的。一般而言,這種系統(tǒng)應(yīng)當(dāng)利用不會(huì)顯著削減治療劑的生物學(xué)性能,例如核酸的免疫刺激能力的組分(例如參見Sciarra和Cutie,″Aerosols,″inRemington′s Pharmaceutical Sciences,第18版,1990,pp 1694-1712;并入作為參考)。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員能夠容易地確定制備氣溶膠的各種參數(shù)和條件而無需采取過多的實(shí)驗(yàn)。
當(dāng)期望全身遞送時(shí),化合物可以配制為通過注射,例如通過快速濃注或連續(xù)輸注的腸胃外給藥。注射用制劑可以以單位劑量的形式呈現(xiàn),例如,在安瓿中或在多劑量容器中,并添加有防腐劑。組合物可以采取諸如懸浮液、溶液或油或水性載體中的乳劑的形式,并且可以含有配制劑例如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。
而在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中,免疫刺激核酸提供在用于將輸注遞送到癌癥患者的靜脈內(nèi)溶液,袋和/或管中。免疫刺激核酸可以被引入靜脈內(nèi)溶液,在接受輸注之前向受試個(gè)體給藥,或者它可以被引入到輸血液本身(即紅細(xì)胞或血小板懸浮液)中。作為選擇地,靜脈內(nèi)袋或管本身可以在其內(nèi)表面涂敷免疫刺激核酸,或者它們可以在制造期間用免疫刺激核酸飽和。制造靜脈內(nèi)系統(tǒng)用于遞送生物學(xué)活性材料的方法是本領(lǐng)域公知的。例子包括Alza,Corp的美國專利Nos.4,973,307和5,250,028中所描述的那些。
化合物還可以配制成直腸或陰道組合物,例如栓劑或滯留灌腸劑,例如含有常規(guī)栓劑基底可可脂或其它甘油酯。
除了以前描述的制劑,化合物還可以配制成儲(chǔ)藏制劑。這種長效作用制劑可以與合適的聚合物或疏水材料(例如作為在可接受的油中的乳劑)或離子交換樹脂,或者作為有限可溶性衍生物,例如,作為有限可溶性鹽配制。
合適的液體或固體藥學(xué)制劑形式有,例如,用于吸入的水或鹽水溶液,裝入微膠囊中,螺旋化(encochleaed),涂敷到顯微金顆粒上,包含在脂質(zhì)體中,噴霧化,氣溶膠,植入皮膚內(nèi)的小團(tuán)塊,或者干燥于銳器上以擦傷皮膚。藥物組合物還包括顆粒、粉末、片劑、包衣片劑、(微)膠囊、栓劑、糖漿劑、乳劑、混懸劑、霜?jiǎng)?、滴劑或延遲釋放活性化合物的制劑,在這種制劑中,通常如上所述利用賦形劑和添加劑和/或助劑例如崩解劑、粘附劑、包衣劑、膨脹劑、潤滑劑、調(diào)味劑、增甜劑或增溶劑。藥物組合物適用于許多藥物遞送系統(tǒng)。有關(guān)藥物遞送方法的簡要綜述,參見Langer,Science 2491527-1533,1990,茲將其并入作為參考。
本發(fā)明進(jìn)一步通過如下實(shí)施例進(jìn)行舉例說明,它們決不應(yīng)當(dāng)理解為進(jìn)一步的限制。
實(shí)施例1與EMULSIGENTM組合的CpG進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測試以EMULSIGENTM(Em)和CpG ODN為共同佐劑的牛皰疹病毒-1(BHV-1)亞單位疫苗在牛中的免疫原性和保護(hù)功效。與單加VSA3、Em或CpG ODN作佐劑的tgD相比,以Em和CpG ODN為共同佐劑的截短形式的BHV-1糖蛋白D(tgD)在25、2.5或0.25mg/劑量的濃度時(shí)產(chǎn)生更強(qiáng)和更平衡的Th1/Th2免疫應(yīng)答,更高的血清中和抗體以及BHV-1攻擊后更大的保護(hù)。此外,以Em和25mg非-CpGODN/劑量為共同佐劑的tgD產(chǎn)生與單獨(dú)的Em相當(dāng)?shù)拿庖咚?,并且免疫水平低于CpG ODN/Em組合。
材料和方法細(xì)胞和病毒BHV-1毒株P(guān)8-2和108在Madin Darby牛腎(MDBK)細(xì)胞中如以前所描述的那樣繁殖(van Drunen Littel-van den Hurk,S.,J.等1994.A subunit gIV vaccine,produced by transfected mammaliancells in culture,induces mucosa limmunitv against bovine herpesvirus-1in catte.Vaccine 121295-1302)。毒株108用來攻擊動(dòng)物,而對(duì)于刺激PBMC體外增殖,則利用毒株P(guān)8-2。
BHV-1 tgD的制備、處理和純化截短形式的BHV-1 gD(tgD)通過在氨基酸355,緊接跨膜錨定的上游處,終止蛋白來構(gòu)建。它在MDBK細(xì)胞中在牛熱激70A(hsp70)基因啟動(dòng)子的調(diào)控下表達(dá)(Kowalski,J等1993.Heat-shock promoter-driven synthesis of secretedbovine herpesvirus glycoprteins in transfected cells. VAccine111100-1107)。如別處所述制備、處理并純化截短的gD(van DrunenLittel-van den Hurk,S.,J.等1994.A subunit gIV Vvaccine,produced bytransfected mammalian cells in culture,induces mucosal immunityagainst bovine herpesvirus-1 in cattle.Vaccine 121295-1302)。
CpG和非-CpG ODN合成寡聚脫氧核糖核苷酸(ODN)制備物(Qiagen,Hilden,德國)中未甲基化的CpG二核苷酸在本研究中被用作為佐劑或共佐劑。所用的CpG ODN 為 ODN 2007(TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT;CpG基序加有下劃線)。為確定免疫應(yīng)答是否由CpG二核苷酸誘導(dǎo),我們還利用了非-CpG ODN;2041(CTGGTCTTTCTGGTTTTTTTCTGG)(Qiagen)。CpG和非-CpG ODN被硫代磷酸酯修飾以增加對(duì)核酸酶降解的抗性(Kuhnle,G.,A.等1998.The class II membrane glycoprotein G of bovine respiratorysyncytial virus,expressed from a synthetic open reading frame,isincorporated into virions of recombinant bovine herpesvirus 1.J.Virol.723804-3811)。
免疫8組,每組7個(gè)9月齡的BHV-1-血清反應(yīng)陰性的Angus和Hereford雜交小牛用以30%vol/vol EMULSIGENTM(Em)(MVPLaboratories,Nebraska,U.S.A)、30%vol/vol VSA3(含有24mM溴化二甲基雙十八烷基銨[DDA]的Em)、25mg CpG ODN(CpG)、30%Em與25(高)、2.5(中)或0.25(低)mg CpG ODN組合(分別為HCpG/Em,M CpG/Em,L CpG/Em)或者Em與25mg非-CpG ODN(非-CpG/Em)組合為佐劑的50μg BHV-1 tgD皮下免疫。疫苗以2ml的體積皮下給藥。小牛的安慰劑組僅用2ml PBS免疫。39天后,動(dòng)物再次免疫,然后在二次免疫2周后攻擊(接種的第53天)。
實(shí)驗(yàn)性攻擊和臨床評(píng)估二次免疫5周后,動(dòng)物被運(yùn)輸?shù)礁綦x的圍欄中,稱重并臨床檢查。然后如以前所描述的那樣使小牛單個(gè)地暴露于107PFU BHV-1的氣溶膠4分鐘(Loelir,B.L,等200.Genegun-mediated DNA immunization primes development of mucosalimmunity against bovine herpesvirus I in cattle.J.Virol.746077-6086;van Drunen Littel-van den Hurk,S.,等1990.Epitope specifcity of theprotective immune response induced by individual bovine herpesvirus-1glycoproteins.Vaccine 8358-368)。攻擊后,小牛每天稱重。此外,連續(xù)11天對(duì)它們進(jìn)行臨床評(píng)估。臨床評(píng)估由對(duì)動(dòng)物的接種狀態(tài)一無所知的獸醫(yī)在每天的同一時(shí)間進(jìn)行。評(píng)估的臨床征象包括發(fā)熱(直腸溫度>40℃)、抑郁、鼻粘膜炎和conjuctivitis。
取樣和病毒分離在接種后第0、14、39、47、53、57、61、64和67天對(duì)動(dòng)物放血評(píng)價(jià)抗體應(yīng)答。在第50和61天收集帶有抗凝血?jiǎng)?終濃度0.2%的乙二胺四乙酸[EDTA])的血液,通過ELISPOT和ELISA試驗(yàn)來評(píng)價(jià)體外增殖和IFN-γ的產(chǎn)生。在攻擊后每兩天收集含有高達(dá)5ml鼻液的鼻棉塞,并在當(dāng)天處理以測量病毒釋放。從鼻棉塞中回收的病毒如以前所描述的那樣在具有抗體涂層的微量滴定板中通過噬斑滴定法定量(Rouse,B.T.和L.A.Babiuk.1974.Host responses toinfectious bovine rhinotracheitis virus.III.Isolation and immunologicactivities of bovine T lymphocytes.J.Immunol 1131391-1398)。
酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)為了確定攻擊前后的特異性抗體應(yīng)答,96孔聚苯乙烯微量滴定板(Immulon 2,Dynatech,Gaithersburg,Md)每孔用0.05μg每孔的純化tgD或純化tgB過夜包被(Li,Y.,等1996.Production and characterization of bovine herpesvirus 1 glycoprotein Bectodomain derivatives in an hsp70A gene promoter-based expressionsystem.Arch Virol.1412019-2029)。系列稀釋的牛血清(從1∶10開始以三倍稀釋)在室溫下溫育2小時(shí)。利用1∶5,000稀釋度的堿性磷酸酶(AP)-綴合的山羊抗牛IgG(Kirkegaard & Perry Laboratories,Gaithersburg,Md)檢測結(jié)合的IgG。反應(yīng)用磷酸對(duì)硝基苯酯(SigmaChemical Co.,Oakville,Ontario,Canada)視覺化。
利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的免疫球蛋白同種型為了確定用tgD免疫的牛的特異性IgG1和IgG2抗體應(yīng)答,聚苯乙烯微量滴定板每孔用0.05μg純化的tgD過夜包被,并用熱失活的馬血清于37℃封閉30分鐘。系列稀釋的牛血清(從1∶10開始以三倍稀釋)于4℃過夜溫育。結(jié)合的抗體分別用1∶40,000和1∶8000稀釋度的針對(duì)牛IgG1(M-23)或IgG2(M-37)的單克隆抗體檢測,它們依次用1∶10,000稀釋的AP-耦連的山羊抗小鼠IgG(Kirkegaard & Perry Laboratories,Gaithersburg,Md)檢測。反應(yīng)如ELISA試驗(yàn)?zāi)菢右曈X化。結(jié)果表示為IgG1與IgG2的比率。
病毒中和試驗(yàn)牛血清的中和滴度如先前所描述的那樣確定(Babiuk,L.A.,等1975.Defense mechanisms against bovine herpesvirusrelationship of virus-host cell events to susceptibility toantibody-complement cell lysis.Infect.Immun.12958-963)。滴度表示為導(dǎo)致相對(duì)于病毒對(duì)照而言噬斑減少50%的抗體最高稀釋度的倒數(shù)。
PBMC的體外增殖外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)在Ficoll-PlaquePLUS(Pharmacia,Mississauga,Ontario,Canada)中分離,并以3.5×105細(xì)胞/孔在補(bǔ)充有10%(vol/vol)胎牛血清(Sigma Chemical Co)、2mML-谷氨酰胺(Gibco-BRL)、500mg/ml慶大霉素、5×10-5M2-巰基乙醇和1mg/ml地塞米松的極限必需培養(yǎng)基(Gibco BRL,GrandIsland N.Y,U.S.A)中于96孔組織培養(yǎng)板中一式三份培養(yǎng)。細(xì)胞用gD以1μg/ml的終濃度刺激。對(duì)照細(xì)胞不刺激。培養(yǎng)72小時(shí)后,細(xì)胞用[甲基-3H]胸苷(Amersham,Oakville,Ontario,Canada)以0.4μCu/孔的濃度脈沖。18小時(shí)后用半自動(dòng)細(xì)胞收集器(Skatron,Starling VA,U.S.A)收集細(xì)胞,并通過閃爍計(jì)數(shù)確定放射活性。增殖反應(yīng)作為三份孔的平均值計(jì)算,并表示為刺激指數(shù)(SI),其中SI代表存在抗原時(shí)的每分鐘計(jì)數(shù)除以不存在抗原時(shí)的每分鐘計(jì)數(shù)。
ELISPOT試驗(yàn)硝酸纖維素板(Whatman,New Jersey,U.S.A)用1∶400稀釋度的牛干擾素γ(IFN-γ)特異性單克隆抗體于4℃過夜包被。未結(jié)合的抗體用0.05%vol/vol PBS-Tween-20(PBS-T)洗滌除去,終了在PBS中洗滌。如增殖試驗(yàn)一樣分離PBMC,并以106細(xì)胞/孔在存在終濃度為0.4μg/ml的gD時(shí)培養(yǎng)。對(duì)照細(xì)胞僅用培養(yǎng)基培養(yǎng)。24小時(shí)后,洗滌細(xì)胞,重懸于培養(yǎng)基中,轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素板中,并于37℃進(jìn)一步溫育24小時(shí),之后細(xì)胞用0.05%vol/vol PBS-T洗滌。隨后,板在室溫下與1∶100的稀釋度的針對(duì)牛IFN-γ的兔多克隆抗體溫育2小時(shí),然后室溫下與生物素標(biāo)記的大鼠抗兔IgG(Zymed,SanFrancisco,CA,U.S.A)溫育2小時(shí),接著是抗生蛋白鏈菌素-AP(GIBCO-BRL,Ontario,Canada),各自為1∶1000的稀釋度。結(jié)合的IFN-γ利用溴氯吲哚磷酸/氮藍(lán)四唑(BCIP/NBT)底物片(SigmaChemical Co)視覺化。板子在蒸餾水中洗滌并在空氣中干燥,之后在400×放大倍數(shù)下計(jì)數(shù)染色斑點(diǎn)。IFN-γ分泌細(xì)胞的數(shù)目表示為gD-刺激孔中每106細(xì)胞的斑點(diǎn)數(shù)目與對(duì)照孔中每106細(xì)胞的斑點(diǎn)數(shù)目之間的差額。
IFN-γELISA如ELISPOT試驗(yàn)一樣培養(yǎng)牛PBMC。24小時(shí)后,收集上清,并在涂敷有針對(duì)IFN-γ的單克隆抗體的96孔板中進(jìn)行系列稀釋。已知濃度的純化的牛IFN-γ用作標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍從2000到7.8pg/ml(r>0.98)。樣品和標(biāo)準(zhǔn)品在8個(gè)2倍PBS-T稀釋液中以100μl/孔進(jìn)行分析。結(jié)合的IFN-γ利用兔抗-IFN-γIgG檢測,它依次用AP-耦連的山羊-抗-兔IgG檢測。反應(yīng)如tgD特異性抗體ELISAs中所述視覺化。底物的吸光度在405和490nm處測量。利用ELISA讀數(shù)程序(Microplate manager 5,BIO RAD Laboratories,Ontario,Canada)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線和計(jì)算樣品中IFN-γ的濃度。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析為考慮不均衡分布,所有的數(shù)據(jù)在進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析之前通過對(duì)數(shù)變換進(jìn)行轉(zhuǎn)化。血清中和滴度、同型比率、體外增殖反應(yīng)、ELISPOT和IFN-γELISA數(shù)據(jù)的差異,是利用單向方差分析和Tukey′s多對(duì)比檢驗(yàn)研究的。接種組中具有疾病征兆(溫度升高、體重?fù)p失和病毒釋放)的動(dòng)物數(shù)目的差異以及攻擊前后牛血清中tgD和tgB-特異性抗體之間的差異,是通過二向方差分析和Tukey真實(shí)顯著性差異(honestly significantly different,HSD)多對(duì)比檢驗(yàn)確定的。
結(jié)果針對(duì)tgD的體液免疫應(yīng)答為了評(píng)價(jià)CpG ODN的佐劑能力,BHV-1tgD以25mg/劑量的CpG、Em或VSA3為佐劑,或者以Em和25、2.5或0.25mg/劑量濃度的CpG(H-、M-或L-CpG/Em)為共同佐劑,或者佐以Em和25mg/劑量的非-CpG ODN(非-CpG/Em)為共同佐劑。除了VSA3組外,所有的接種組在初次免疫后14天比安慰劑組具有顯著更高水平的中和抗體(p<0.001)(圖4)。H-CpG/Em組中的抗體水平顯著(p<0.001)高于非-CpG/Em、Em、CpG或VSA3組的水平??贵w水平在二次免疫后急劇升高,以至于在第47天,全部3個(gè)CpG/Em組比所有其它接種組具有顯著(p<0.001)更高的滴度。這個(gè)數(shù)據(jù)提供了疫苗中CpG ODN的濃度對(duì)二次免疫應(yīng)答沒有顯著影響的證據(jù)。重要的是,用以非-CpG/Em為共同佐劑的tgD免疫的動(dòng)物的抗體滴度與Em組的滴度沒有顯著的差異。另外,非-CpG/Em組的滴度與CpG和VSA3組的那些滴度沒有顯著差異。
為確定產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的類型,測定了牛血清中tgD-特異性的IgG1和IgG2抗體,并在二次免疫后8天測量了IgG1∶IgG2比率。初次免疫后和攻擊后的比率都相似。在三個(gè)CpG/Em組和CpG組中測量到平衡的免疫應(yīng)答(~1∶1比率),這些組間沒有統(tǒng)計(jì)差異。相反,Em、VSA3和非-CpG/Em配制的疫苗產(chǎn)生IgG1-偏向的免疫應(yīng)答(>1600∶1)。非-CpG/Em組比L-CpG/Em組產(chǎn)生更高的IgG1∶IgG2比率。不過,非-CpG/Em組顯著(p<0.05)不同于M-CpG/Em和H-CpG/Em組。三個(gè)CpG/Em組間或者非-CpG/Em和Em組間沒有顯著性差異。另外,所有三個(gè)CpG/Em組與Em(p<0.001)和VSA3(p<0.01)組都有顯著性差異。
細(xì)胞介導(dǎo)的針對(duì)tgD的免疫應(yīng)答為檢查由疫苗接種誘導(dǎo)的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫,測量了牛淋巴細(xì)胞對(duì)BHV-1gD的體外增殖反應(yīng)。雖然CpG/Em接種的動(dòng)物中攻擊前的增殖反應(yīng)趨向于比接種非-CpG/Em、CpG或Em的動(dòng)物中的更強(qiáng),但是差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(圖5a)。不過,H-CpG/Em和L-CpG/Em組中的增殖反應(yīng)顯著(p<0.05)高于VSA3和安慰劑組。為進(jìn)一步確認(rèn)T-細(xì)胞激活,評(píng)價(jià)了IFN-γ的產(chǎn)生。雖然CpG/Em組中IFN-γ分泌細(xì)胞的數(shù)目不依賴于所用的CpGODN的濃度,它們顯著高于(p<0.001)非-CpG/Em、Em、VSA3和安慰劑組中IFN-γ分泌細(xì)胞的數(shù)目(圖5b)。BHV-1攻擊后,CpG/Em中PBMC群的增殖反應(yīng)比其它免疫組強(qiáng)~2倍(圖5b)。相反,CpG/Em組和CpG組間沒有差異。攻擊前測量的培養(yǎng)的接種動(dòng)物PBMC上清中IFN-γ的量遵從與ELISPOT中相似的應(yīng)答模式(圖5c)。CpG/Em組相互之間或者與CpG或Em組之間沒有顯著性差異。不過,這些組中測量的IFN-γ的量顯著高于安慰劑(p<0.01)、非-CpG/Em(p<0.05)和VSA3(p<0.01)組。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了CpG ODN即使是與EMULSIGENTM組合時(shí)誘導(dǎo)Th1-型免疫應(yīng)答的能力。
BHV-1感染之后的免疫應(yīng)答攻擊后血清中和抗體或病毒蛋白特異性抗體水平的提高是感染的另一種跡象。雖然所有的組在攻擊前對(duì)BHV-1糖蛋白B(tgB)是血清反應(yīng)陰性的,但攻擊后安慰劑、CpG、Em、VSA3和非-CpG/Em組中,而不是CpG/Em組中,針對(duì)tgB的抗體顯著增加(p<0.01)(圖6b)。攻擊后安慰劑、CpG、Em、VSA3和非-CpG/Em組中的血清中和滴度(圖4)以及針對(duì)tgD的抗體(圖6a)也顯著增加(p<0.005),表明這些組未能完全被保護(hù)以免于BHV-1感染。雖然M-CpG/Em組在攻擊后也表現(xiàn)出血清中和抗體以及針對(duì)tgD的抗體的水平些許增加,但這些增加不顯著。血清中和滴度以及針對(duì)tgD的抗體在H-CpG/Em組中事實(shí)上在攻擊后是下降的,而在M-CpG/Em組中保持穩(wěn)定。這些結(jié)果表明了CpG-EMULSIGENTM制劑誘導(dǎo)的無菌免疫。
免于BHV-1攻擊的保護(hù)所有動(dòng)物在攻擊前是健康的。攻擊后,除M-和H-CpG/Em組在整個(gè)跟蹤期間溫度保持≤39.5℃外,所有組的平均直腸溫度從第2天到第6天提高(圖7)。安慰劑和非-CpG/Em組表現(xiàn)出最大的溫度增加(到第6天達(dá)~40.1℃),并與M-和H-CpG/Em組具有顯著型差異(p<0.002)。雖然L-CpG/Em組中小牛的溫度到第6天穩(wěn)定地增至39.5℃,并且其溫度與H-CpG/Em組有顯著差異(p=0.006),但它們也不同于安慰劑組(p<0.001),而與M-CpG/Em組設(shè)有不同。Em、CpG和VSA3組中平均直腸溫度也在第2天到第4天增至>39.4℃,之后降至<39℃。
致病率的另一種評(píng)估是BHV-1感染后重量損失的程度。盡管H-和L-CpG/Em組中的動(dòng)物在試驗(yàn)過程中經(jīng)歷最小的或者沒有重量損失,其它組中的動(dòng)物在攻擊后4天經(jīng)歷高達(dá)8kg的重量損失(圖8)。
為了進(jìn)一步確定防止BHV-1感染的保護(hù)水平,評(píng)價(jià)了來自鼻通道的病毒釋放程度。盡管CpG、Em和非-CpG/Em組中的動(dòng)物在攻擊后第2天開始排放病毒,并這樣持續(xù)至少到第8天,從任一CpG/Em組的動(dòng)物鼻棉塞中未回收到病毒(圖9)。雖然接種疫苗對(duì)病毒釋放具有顯著(p<0.001)作用,三個(gè)CpG/Em組僅與非CpG/Em(p=0.003)和安慰劑(p<0.001)組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
前述的書面說明書被認(rèn)為足以能夠使本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明。本發(fā)明的范圍不受所提供的實(shí)施例的限制,因?yàn)閷?shí)施例旨在作為本發(fā)明的一個(gè)方面的個(gè)別舉例說明,而且其它功能等同的實(shí)施方案在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。從前述的描述中,除了那些本文所顯示和描述的之外的本發(fā)明的各種修飾,對(duì)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員是明顯的,并且落在所附的權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和目的無需為本發(fā)明的每一個(gè)實(shí)施方案涵蓋。
茲將本申請(qǐng)所引用的所有參考文獻(xiàn)、專利和專利申請(qǐng)全文并入作為參考。
權(quán)利要求
1.在非人動(dòng)物中降低病毒釋放的方法,包括向感染有病毒和處于病毒感染風(fēng)險(xiǎn)中的非人動(dòng)物給藥降低病毒釋放有效量的水包油乳劑和免疫刺激核酸。
2.權(quán)利要求1的方法,其中水包油乳劑為EMULSIGENTM。
3.權(quán)利要求1的方法,其中不向該非人動(dòng)物給藥抗原。
4.權(quán)利要求1的方法,進(jìn)一步包括向該非人動(dòng)物給藥抗原。
5.權(quán)利要求1的方法,進(jìn)一步包括給藥抗病毒劑。
6.權(quán)利要求5的方法,其中抗病毒劑從由醋孟南、阿昔洛韋、阿昔洛韋鈉、阿德福韋、Alovudine、阿韋舒托、鹽酸金剛烷胺、阿拉諾丁、阿立酮、甲磺酸阿替韋啶、阿夫立定、Cidofovir、Cipamfylline、鹽酸阿糖胞苷、甲磺酸地拉夫定、地昔洛韋、去羥肌苷、二噁沙利、依度尿苷、恩韋拉登、恩韋肟、泛昔洛韋、鹽酸法莫汀、非西他濱、非阿尿苷、膦利脂、膦甲酸鈉、膦乙酸鈉、更昔洛韋、更昔洛韋鈉、碘苷、乙氧丁酮醛、拉米夫定、洛布卡韋、鹽酸美莫汀、美替沙腙、奈韋拉平、噴昔洛韋、吡羅達(dá)韋、利巴韋林、鹽酸金剛乙胺、甲磺酸沙奎那韋、鹽酸索金剛胺、索立夫定、維司托隆、司他夫定、鹽酸替洛隆、曲氟尿苷、鹽酸伐昔洛韋、阿糖腺苷、磷酸阿糖腺苷、磷酸阿糖腺苷鈉、韋羅肟、扎西他濱、齊多夫定和凈韋肟組成的組中選擇。
7.權(quán)利要求1的方法,其中所述非人動(dòng)物是狗、貓、馬、牛、豬、綿羊、山羊、靈長類動(dòng)物或雞。
8.降低受試個(gè)體接種后組織損傷的方法,包括通過侵入途徑向受試個(gè)體給藥加佐劑疫苗和降低加佐劑疫苗引起的組織損傷有效量的免疫刺激核酸,其中疫苗加有水包油乳劑作為佐劑。
9.權(quán)利要求8的方法,其中水包油乳劑為EMULSIGENTM。
10.權(quán)利要求8的方法,其中侵入途徑為皮下途徑。
11.權(quán)利要求8的方法,其中侵入途徑為肌內(nèi)途徑。
12.誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法,包括向受試個(gè)體給藥產(chǎn)生免疫應(yīng)答有效量的CpG寡核苷酸和水包油乳劑。
13.權(quán)利要求12的方法,其中免疫應(yīng)答為抗原特異性免疫應(yīng)答。
14.權(quán)利要求12的方法,進(jìn)一步包括給藥抗原。
15.權(quán)利要求12的方法,其中水包油乳劑為EMULSIGENTM。
16.權(quán)利要求12的方法,其中受試個(gè)體患有癌癥。
17.權(quán)利要求12的方法,其中受試個(gè)體患有感染性疾病。
18.權(quán)利要求12的方法,其中受試個(gè)體處于患感染性疾病的風(fēng)險(xiǎn)中。
19.降低向受試個(gè)體給藥以產(chǎn)生抗原特異性免疫應(yīng)答的抗原劑量的方法,包括向受試個(gè)體給藥亞治療劑量的抗原和免疫刺激核酸,其中亞治療劑量的抗原和免疫刺激核酸的組合產(chǎn)生抗原特異性免疫應(yīng)答。
20.權(quán)利要求19的方法,其中抗原的亞治療劑量是比在抗原與明礬配制時(shí)產(chǎn)生抗原特異性免疫應(yīng)答的抗原最小有效劑量少至少50%的劑量。
21.權(quán)利要求19的方法,其中抗原的亞治療劑量是比在抗原與明礬配制時(shí)產(chǎn)生抗原特異性免疫應(yīng)答的抗原最小有效劑量少至少90%的劑量。
22.權(quán)利要求1、8、12或19的方法,其中免疫刺激核酸為CpG寡核苷酸。
23.權(quán)利要求22的方法,其中CpG寡核苷酸以有規(guī)律間隔給藥。
24.權(quán)利要求22的方法,其中CpG寡核苷酸以每周為基礎(chǔ)給藥。
25.權(quán)利要求22的方法,其中CpG寡核苷酸以每天為基礎(chǔ)給藥。
26.權(quán)利要求22的方法,其中CpG寡核苷酸以每月為基礎(chǔ)給藥。
27.權(quán)利要求22的方法,其中CpG寡核苷酸通過口服給藥。
28.權(quán)利要求22的方法,其中CpG寡核苷酸通過注射給藥。
29.權(quán)利要求22的方法,其中CpG寡核苷酸通過持續(xù)釋放裝置給藥。
30.權(quán)利要求22的方法,其中CpG寡核苷酸選自2007(TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT);2142(TCGCGTGCGTTTTGTCGTTTTGACGTT);2135(TCGTCGTTTGTCGTTTTGTCGTT);和2216(ggGGGACGATCGTCgggggG)。
31.權(quán)利要求1、8、12或19的方法,其中免疫刺激核酸為富含T的核酸。
32.權(quán)利要求31的方法,其中富含T的核酸具有從由SEQ ID NO52到SEQ ID NO57以及SEQ ID NO62到SEQ ID NO94組成的組中選擇的序列。
33.權(quán)利要求1、8、12或19的方法,其中免疫刺激核酸為多聚-G核酸。
34.權(quán)利要求33的方法,其中多聚-G核酸具有從由SEQ ID NO46、SEQ ID NO47、SEQ ID NO58、SEQ ID NO61以及SEQ ID NO95到SEQ ID NO133組成的組中選擇的序列。
35.權(quán)利要求1、8、12或19的方法,其中免疫刺激核酸具有從由SEQ ID NO1到SEQ ID NO146組成的組中選擇的序列。
36.權(quán)利要求1、8、12或19的方法,其中受試個(gè)體患有從由骨癌、腦和CNS癌、結(jié)締組織癌、食道癌、眼癌、霍奇金淋巴瘤、喉癌、口腔癌、皮膚癌和睪丸癌組成的組中選擇的癌癥。
37.權(quán)利要求1、8、12或19的方法,其中免疫刺激核酸具有修飾的主鏈。
38.權(quán)利要求37的方法,其中修飾的主鏈為磷酸修飾的主鏈。
39.權(quán)利要求38的方法,其中磷酸的修飾主鏈為硫代磷酸酯修飾的主鏈。
40.權(quán)利要求37的方法,其中修飾的主鏈為肽修飾的寡核苷酸主鏈。
41.權(quán)利要求1、8、12或19的方法,其中受試個(gè)體為免疫受損個(gè)體。
42.權(quán)利要求1、8、12或19的方法,其中受試個(gè)體患有選自病毒性、細(xì)菌性、真菌性和寄生蟲性感染的感染性疾病。
43.權(quán)利要求1、8、12或19的方法,其中受試個(gè)體處于患選自病毒性、細(xì)菌性、真菌性和寄生蟲性感染的感染性疾病的風(fēng)險(xiǎn)中。
44.組合物,包括免疫刺激核酸和水包油乳劑。
45.權(quán)利要求44的組合物,其中水包油乳劑為EMULSIGENTM。
全文摘要
本發(fā)明涉及與其它治療制劑例如水包油乳劑組合的免疫刺激核酸的方法和組合物。制劑組合以不同的劑量或以不同的時(shí)間表給藥,用于治療紊亂例如疾病和癌癥。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1671414SQ02822715
公開日2005年9月21日 申請(qǐng)日期2002年10月7日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月6日
發(fā)明者L·A·巴比尤克, R·??藸?申請(qǐng)人:梅瑞爾有限公司