專利名稱：用于治療中風(fēng)的非神經(jīng)毒性纖溶酶原激活因子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明與非神經(jīng)毒性纖溶酶原激活劑的治療用途有關(guān)，特別是源自Desmodus rotundus唾液的非神經(jīng)毒性纖溶酶原激活劑(DSPA)，優(yōu)選治療中風(fēng)。
將臨床癥狀相關(guān)的不同臨床現(xiàn)象概括為術(shù)語“中風(fēng)”。根據(jù)各自的發(fā)病機(jī)理，這些臨床現(xiàn)象可能會首先分化為所謂的缺血性和出血性損傷。
缺血性損傷(缺血)的特征是，因動脈血供應(yīng)匱乏而導(dǎo)致腦中血液循環(huán)的減弱或中斷。這常常是由因動脈硬化而變窄的血管的血栓形成，或動脈或心栓塞引起的。
出血性損傷主要以因動脈壓過高而損傷形成的腦供應(yīng)動脈穿孔為基礎(chǔ)。然而，在所有腦損傷中僅有大約20％是由出血性損傷引起的。因此，由血栓形成引起的中風(fēng)更為相關(guān)。
與其它組織缺血相比，神經(jīng)組織缺血普遍伴隨著受影響細(xì)胞的壞死。神經(jīng)組織中較高的壞死發(fā)生率可以用對“興奮性中毒”現(xiàn)象的新理解來解釋，該現(xiàn)象是一種包括眾多反應(yīng)步驟的復(fù)雜級聯(lián)反應(yīng)。該級聯(lián)反應(yīng)由因缺氧而瞬間丟失ATP并去極化的缺血神經(jīng)元引發(fā)。它導(dǎo)致突觸后釋放神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的增加，該神經(jīng)遞質(zhì)激活調(diào)控陽離子通道的膜結(jié)合谷氨酸受體。然而，由于該谷氨酸釋放的增加使得谷氨酸受體被過度激活。
谷氨酸受體調(diào)控由谷氨酸與受體的結(jié)合而開啟的電壓依賴型陽離子通道。它導(dǎo)致Na+和Ca2+大量流入細(xì)胞從而干擾Ca2+依賴型細(xì)胞代謝。Ca2+依賴型分解代謝酶的激活尤其可以解釋隨后的細(xì)胞死亡(Lee，Jin-Mo等，″The changing landscape of ischaemic brain injurymechanisms″；Dennis W.Zhol″Glutamate neurotoxicity and diseasesof the nervous system″)。
盡管谷氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)毒性機(jī)制還未被完全了解，但是人們都同意其在很大程度上促成了腦缺血后的神經(jīng)細(xì)胞死亡(Jin-Mo Lee，等)。
除保護(hù)重要功能和穩(wěn)定生理參數(shù)外，在急性腦缺血的治療中，重新疏通封閉的血管也具有極大的重要性?？梢越?jīng)不同的方法實現(xiàn)重新疏通。單純的機(jī)械重新疏通方法，例如心臟病發(fā)作后的PTCA，迄今為止仍未獲得令人滿意的效果。只有實現(xiàn)成功纖維蛋白溶解作用才能使病人的物理狀況得到令人滿意的改善。這可以通過導(dǎo)管的局部應(yīng)用來實現(xiàn)(PROCAT，一項用尿激酶前體進(jìn)行的研究)。然而，盡管已經(jīng)獲得了陽性結(jié)果，該方法作為一種藥物治療方法還未獲得官方批準(zhǔn)。
自然發(fā)生的纖維蛋白溶解作用是以絲氨酸蛋白酶纖溶酶的蛋白水解活性為基礎(chǔ)的，該酶由其失活前體經(jīng)催化(激活)形成。體內(nèi)天然存在的纖溶酶原激活劑u-PA(尿激酶型纖溶酶原激活劑)和t-PA(組織纖溶酶原激活劑)催化纖溶酶原的天然激活。與u-PA相反，t-PA與纖維蛋白和纖溶酶原一起形成一個所謂的激活劑復(fù)合體。因此，t-PA的催化活性是纖維蛋白依賴的，并且在其存在下增強(qiáng)約550倍。除纖維蛋白外，纖維蛋白原也能刺激由t-PA介導(dǎo)的纖溶酶原向纖溶酶轉(zhuǎn)變的催化作用——即使程度較低一些。在纖維蛋白原存在下，t-PA活性僅增強(qiáng)25倍。纖維蛋白的切割產(chǎn)物也(纖維蛋白降解產(chǎn)物(FDP))能刺激t-PA。
對急性中風(fēng)進(jìn)行血栓溶解治療的早期嘗試可以追溯至二十世紀(jì)五十年代。用鏈激酶，一種源自β溶血性鏈球菌的纖維蛋白溶解劑，進(jìn)行的首次廣泛臨床試驗于1995年才開始。鏈激酶與纖溶酶原一起形成催化其它纖溶酶原分子轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶的復(fù)合體。
由于鏈激酶是一種細(xì)菌蛋白酶從而能激發(fā)機(jī)體的變態(tài)反應(yīng)，因此采用鏈激酶的療法存在嚴(yán)重缺陷。此外，由于之前包括抗體產(chǎn)生的鏈球菌感染使病人可能出現(xiàn)所謂的鏈激酶抗性從而使得該療法更難進(jìn)行。除此之外，歐洲(Multicenter Acute Stroke Trial of Europe(MAST-E)，Multicenter Acute Stroke Trial of Italy(MAST-I))和澳大利亞(Australian Streptokinase Trial(AST))的臨床試驗表明，用鏈激酶治療病人后呈現(xiàn)上升的死亡率風(fēng)險以及更高的腦內(nèi)流血(腦內(nèi)出血(intracerebral haemorrhage)ICH)風(fēng)險。這些試驗不得不在早期就被終止。
作為選擇，也可以采用尿激酶——它也是一種經(jīng)典的纖維蛋白溶解劑。與鏈激酶相反，由于它是一種天然存在于不同機(jī)體組織的酶，因此它不具有抗原特性。它是一種纖溶酶原激活劑，且不依賴于輔助因子。尿激酶由腎細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生。
已經(jīng)獲得用產(chǎn)生自重組倉鼠細(xì)胞的組織型纖溶酶原激活劑——所謂的rt-PA——(參見EP 0 093 619，US 4 766 075)進(jìn)行的治療性血栓溶解的廣泛經(jīng)驗。九十年代用t-PA在全世界范圍內(nèi)完成了幾個臨床試驗——以急性心肌梗死為主要癥狀——得到部分無法了解且矛盾的結(jié)果。在所謂的歐洲急性中風(fēng)試驗中(ECASS)，在病人出現(xiàn)中風(fēng)癥狀后6小時內(nèi)于靜脈內(nèi)使用rt-PA進(jìn)行治療。90天后檢查死亡率和Barthel指數(shù)作為病人的殘疾或獨立生活力指標(biāo)。未報道生活力的顯著改善，但是報道了——盡管不顯著——死亡率的上升。因此可以推斷，對根據(jù)各自病史個別選擇出的病人在中風(fēng)發(fā)作后立即用rt-PA進(jìn)行的血栓溶解治療可能是有利的。然而，不推薦rt-PA在中風(fēng)發(fā)作后6小時內(nèi)的普遍使用，因為在這段時間內(nèi)的應(yīng)用會增加腦內(nèi)出血(ICH)的危險(C.Lewandowski C和Wiliam Barsan，2001Treatment ofAcute Stroke；inAnnals of Emergency Medicine 372；S.202 ff.)。
中風(fēng)的血栓溶解治療也是美國National Institute of NeurologicDisorder and Stroke進(jìn)行的臨床試驗(所謂的NINDS rtPA中風(fēng)試驗)課題。該試驗的重點集中在出現(xiàn)癥狀后3小時內(nèi)用rt-PA靜脈內(nèi)治療的效果上。治療后三個月檢查病人。由于觀察到該治療對病人生活力的積極效果，因此推薦在三個小時的時間段內(nèi)用rt-PA進(jìn)行治療，盡管作者發(fā)現(xiàn)了更高的ICH風(fēng)險。
兩項進(jìn)一步的研究(ECASS II TrialAlteplase Thrombolysis forAcute Noninterventional Therapy in Ischaemic Stroke(ATLANTIS))調(diào)查了中風(fēng)發(fā)作后三小時內(nèi)用rt-PA治療的積極效果是否能在六小時內(nèi)的治療中重現(xiàn)。然而，由于未曾觀察到臨床癥狀的改善或死亡率的任何降低，這個問題并不能得到肯定回答。其仍具有更高的ICH風(fēng)險。
那些部分矛盾的結(jié)果使得對rt-PA的使用需要高度謹(jǐn)慎。在1996年美國心臟協(xié)會(American Heart Association)的一份出版物中已經(jīng)指出醫(yī)生們對血栓溶解治療中風(fēng)的嚴(yán)重多疑癖；而對心肌梗死治療中的纖維蛋白溶解物卻沒有這樣的多疑癖(van Gijn J，MD，F(xiàn)RCP，1996-Circulation 1996，931616-1617)。
一份1997年出版的綜述首先給出了這一多疑癖背后的合理性(更新于2001年3月)。根據(jù)該綜述，當(dāng)在中風(fēng)發(fā)作后六小時內(nèi)應(yīng)用血栓溶解物時，所有的血栓溶解物治療(尿激酶、鏈激酶、rt-PA或重組尿激酶)都導(dǎo)致中風(fēng)后第一個10天內(nèi)顯著更高的死亡率，盡管死亡或殘廢病人的總數(shù)降低了。這一效果主要是由ICH導(dǎo)致的。因此并不推薦血栓溶解物在治療中風(fēng)中的廣泛應(yīng)用。
甚至之前，這樣的結(jié)果使得其它一些作者給出了純粹的諷刺言論中風(fēng)病人必須選擇要么死亡要么殘廢地活著(SCRIP 19972265，26)。
不過迄今為止使用rt-PA的療法仍然是美國食品和藥物管理局(FDA)唯一批準(zhǔn)的急性腦缺血的治療方法。然而，其被限制于在中風(fēng)后三小時內(nèi)使用rt-PA。
對rt-PA的批準(zhǔn)是在1996年。之前在1995年，公開了關(guān)于t-PA消極副作用的第一份聲明，其中為在三小時之外將t-PA應(yīng)用于中風(fēng)治療時產(chǎn)生的劇烈效果提供了說明性依據(jù)。相應(yīng)地，海馬小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生促進(jìn)谷氨酸介導(dǎo)的興奮性中毒的t-PA。該結(jié)論是從一項關(guān)于t-PA缺陷型和野生型小鼠的研究推導(dǎo)得出的，其中將谷氨酸激動劑分別注射入它們的海馬。t-PA缺陷型小鼠對外源(inthrathecal)施用的谷氨酸表現(xiàn)出顯著更高的抗性(Tsirka SE等，Nature，Vol.377，1995，″Excitoxin-induced neuronal degeneration and seizure aremediated by tissue plasminogen activator″)。這些結(jié)果在1998年得到證實，當(dāng)時Wang等證明當(dāng)靜脈內(nèi)注射t-PA時t-PA缺陷型小鼠中出現(xiàn)幾乎兩倍量的壞死神經(jīng)組織。在野生型小鼠中外源t-PA的這一消極結(jié)果僅為約33％(Wang等，1998，Nature，″Tissue plasminogenactivator(t-PA)increases neuronal damage after focal cerebralischaemia in wild type and t-PA deficient mice″)。
2001年初Nicole等發(fā)表了對由t-PA引起的興奮性中毒的進(jìn)一步研究結(jié)果(Nicole O.，Docagne F Ali C；Margaill I；Carmeliet P；MacKenzie ET，Vivien D和Buisson A，2001The proteolytic activityof tissue-plasminogen activator enhances NMDA receptor-mediatedsignaling；inNat Med 7，59-64)。他們證明由去極化皮質(zhì)神經(jīng)元釋放的t-PA會與所謂的NMDA型谷氨酸受體的NR1亞單位相互作用從而導(dǎo)致NR1的裂解。它增強(qiáng)受體活性從而導(dǎo)致施用谷氨酸激動劑NMDA后出現(xiàn)更大的組織破壞。NMDA激動劑誘導(dǎo)興奮性中毒。因此，t-PA通過激活NMDA型谷氨酸受體表現(xiàn)出神經(jīng)毒性。
根據(jù)進(jìn)一步的說明性概念，t-PA的神經(jīng)毒性由纖溶酶原向纖溶酶的轉(zhuǎn)變間接導(dǎo)致。根據(jù)該模型，纖溶酶是神經(jīng)毒性的效應(yīng)物(Chen ZL和Strickland S，1997Neuronal Death in the hippocampus ispromoted by plasmin-catalysed degradation of laminin.Cell91，917-925)。
附圖9給出了t-PA的時間依賴性神經(jīng)毒性效應(yīng)的總結(jié)。其中，與內(nèi)源t-PA相比重組t-PA增強(qiáng)的毒性變得明顯。這可能是由于rt-PA能以更高的濃度進(jìn)入組織。
盡管t-PA具有神經(jīng)毒性副作用以及上升的死亡率效應(yīng)，它仍然得到了FDA的批準(zhǔn)。這是因為缺乏無害但卻有效的替代物——因此這得感謝非常實際的成本效益分析。所以，仍然需要安全的療法。然而，如果它們?nèi)匀灰匝ㄈ芙馕餅榛A(chǔ)——在不能找到血栓溶解作用的替代方式的情況下——那就要考慮神經(jīng)毒性問題(參見如Wang等a.a.O.；Lewandowski和Barson 2001 a.a.O.)。
因此盡管幾乎所有血栓溶解物都是潛在適用的，也還是終止了為開發(fā)中風(fēng)治療新藥物而進(jìn)行的對包括DSPA(Desmodus rotundus)纖溶酶原激活劑)在內(nèi)的已知血栓溶解物的進(jìn)一步研究。尤其是就DSPA來說，較早期就已經(jīng)指出了它對這一醫(yī)藥用途的潛在適用性(Medan P；Tatlisumak T；Takano K；Carano RAD；Hadley SJ；Fisher MThrombolysis with recombinant Desmodus saliva plasminogenactivator(rDSPA)in a rat embolic stroke model；inCerebrovascDis 19966；175-194(4th International Symposium on ThrombolicTherapy in Acute Ischaemic Stroke)。DSPA是一種與t-PA高度同源(相似)的纖溶酶原激活劑。因此——且加上由于t-PA的神經(jīng)毒性副作用導(dǎo)致的希望破滅——對將DSPA作為中風(fēng)治療的適宜藥物沒有更多的指望。
相反，近期旨在改進(jìn)已知血栓溶解療法的策略試圖不再于靜脈內(nèi)使用血栓溶解物質(zhì)，而經(jīng)導(dǎo)管于動脈內(nèi)使用血栓溶解物質(zhì)，從而直接接近血管內(nèi)的血栓。首次試驗是用重組產(chǎn)生的尿激酶進(jìn)行的。因此，可能可以降低血栓溶解作用的必需劑量以及隨之產(chǎn)生的消極副作用。然而，這一應(yīng)用需要高的技術(shù)花費，而且并不是任何地方都可以進(jìn)行的。此外，病人不得不經(jīng)費時的過程進(jìn)行準(zhǔn)備。然而時間常常是有限的。因此，這一準(zhǔn)備過程又導(dǎo)致了附加的危險。
目前，新的思想指向了抗凝血劑，例如肝素、阿司匹林或安克洛酶——馬來蝰蛇(malayan pit viper)毒液中的活性物質(zhì)。然而兩個檢驗肝素效果的進(jìn)一步臨床試驗(International Stroke Trial(IST)和Trial of ORG 10172 in Acute Stroke Treatment(TOAST))并未顯示出對死亡率的顯著改善或?qū)χ酗L(fēng)的預(yù)防。
一種進(jìn)一步的新療法的焦點既非集中于血栓也非稀釋血液或抗凝結(jié)作用，而是嘗試提高因中斷血液供應(yīng)而受損的細(xì)胞的生命力(WO01/51613 A1和WO 01/51614 A1)。為達(dá)到該目的，使用了源自醌類、氨基糖苷類或氯霉素類的抗生素?；谙嗨圃?，進(jìn)一步建議從中風(fēng)發(fā)作后立即應(yīng)用胞磷膽堿(citicholin)開始。胞磷膽堿在體內(nèi)被切割為胞苷和膽堿。切割產(chǎn)物形成神經(jīng)元細(xì)胞膜的一部分并因此支持受損組織的再生(US 5,827,832)。
近期對安全治療的研究以下面新發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)的，即，中風(fēng)的致命后果部分是僅僅由中斷的血液供應(yīng)間接導(dǎo)致或由包括過度激活的谷氨酸受體在內(nèi)的興奮性中毒或神經(jīng)毒性直接導(dǎo)致的。t-PA加強(qiáng)這一效應(yīng)(參見上述)。因此一種降低興奮性中毒的思想是應(yīng)用所謂的神經(jīng)保護(hù)劑(neuroprotectives)。它們可以個別使用或與纖維蛋白溶解劑一起使用以減小神經(jīng)毒性效應(yīng)。它們能夠或者作為例如谷氨酸受體拮抗劑直接地降低興奮性中毒、或者通過抑制電壓依賴型鈉或鈣離子通道間接地導(dǎo)致興奮性中毒降低(Jin-Mo Lee等a.a.O.)。
可以用例如2-氨基-5膦酰戊酸鹽(2-amino-5-phosphonovalerate，APV)或2-氨基-5-膦酰庚酸(2-amino-5-phosphonoheptanoate，APH)產(chǎn)生對NMDA型谷氨酸受體的競爭性抑制(拮抗作用)?？梢杂美缃Y(jié)合于通道苯環(huán)利定的物質(zhì)來實現(xiàn)非競爭性抑制。這樣的物質(zhì)可以是苯環(huán)利定、MK-801、右啡烷或cetamine。
迄今為止，采用神經(jīng)保護(hù)劑的治療還未表現(xiàn)出所期望的成功，可能因為神經(jīng)保護(hù)劑要表現(xiàn)它們的保護(hù)效應(yīng)必須與血栓溶解劑結(jié)合。這適用于其它物質(zhì)(同時參見附

圖10)。
甚至t-PA和神經(jīng)保護(hù)試劑的組合也僅導(dǎo)致有限的損傷。盡管如此，也未避免此類纖維蛋白溶解試劑的神經(jīng)毒性缺陷。
因此當(dāng)前的發(fā)明的一個目的是為人類中風(fēng)治療提供一種新的治療理念。
根據(jù)本發(fā)明，如權(quán)利要求1所概括，建議在中風(fēng)治療中使用非毒性纖溶酶原激活因子。進(jìn)一步的有利用途分別作為獨立權(quán)利要求以及進(jìn)一步的從屬權(quán)利要求主題。
本發(fā)明的中心思想是纖溶酶原激活劑在中風(fēng)治療中的用途，其成熟酶表現(xiàn)出選擇性由纖維蛋白增強(qiáng)許多倍的活性，即大于650倍。
根據(jù)本發(fā)明，纖溶酶原激活劑的用途以下列發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)血腦屏障由于因中風(fēng)導(dǎo)致的腦內(nèi)組織損傷而受到損傷或破壞。因此，在腦中循環(huán)的纖維蛋白原能進(jìn)入腦神經(jīng)組織。它在此處激活導(dǎo)致——通過激活谷氨酸受體或纖溶酶原——進(jìn)一步組織損傷的t-PA。為避免該效應(yīng)，本發(fā)明建議使用呈高度纖維蛋白選擇性且——作為對討論的反駁——具有降低的被纖維蛋白原激活的潛力的纖溶酶原激活劑。因此，該纖溶酶原激活劑并非——至少與t-PA相比而言程度較低——由因血腦屏障受損而從血液進(jìn)入神經(jīng)組織的纖維蛋白原激活，因為t-PA的激活劑纖維蛋白由于其大小而不能進(jìn)入神經(jīng)組織。因此根據(jù)本發(fā)明的纖溶酶原激活劑是非神經(jīng)毒性的。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式，使用了非毒性纖溶酶原激活劑，其包括至少一種所謂的cymogene三聯(lián)體(cymogene triade)元件。一個類似的已知三聯(lián)體是來自胰凝乳蛋白酶家族的絲氨酸蛋白酶的催化中心，它由三個互作的氨基酸即天門冬氨酸194、組氨酸40和絲氨酸32組成。然而，該三聯(lián)體并不存在于與絲氨酸蛋白酶一樣同屬于胰凝乳蛋白酶家族的t-PA中。不過，已知向天然t-PA的適宜位點導(dǎo)入至少一個上述氨基酸的定向誘變導(dǎo)致在纖維蛋白存在下前體酶活性(單鏈t-PA)減弱和成熟酶活性(雙鏈t-PA)增強(qiáng)。因此，三聯(lián)體中至少一個氨基酸——或具有與三聯(lián)體中對應(yīng)功能的氨基酸——的導(dǎo)入能增強(qiáng)t-PA的cymogenity(也就是成熟酶活性與前體酶活性的比率)。結(jié)果導(dǎo)致纖維蛋白特異性顯著提高。這是由所導(dǎo)入的氨基酸殘基和/或野生型序列氨基酸殘基之間的構(gòu)象互作引起的。
已知t-PA中用His取代Phe 305(F305H)和用Ser取代Ala 292(A292S)的誘變使cymogenity增強(qiáng)20倍，而單純的F305H突變使cymogentity增強(qiáng)5倍(EL Madison，Kobe A，Gething M-J；SambrookJF，Goldsmith EJ 1993Converting Tissue Plasminogen Activator to aZymogenA regulatory Triad of Asp-His-Ser；Science262，419-421)。存在纖維蛋白時，這些t-PA突變活性分別增強(qiáng)30.000倍(F305H)和130.000倍(F305H，A292S)。另外，這些突變包括將Arg275置換為R275E以防止纖溶酶在切割位點Aug275-Ile276的切割，從而將單鏈t-PA轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈形式。單一的突變部位R275E使t-PA的纖維蛋白特異性增強(qiáng)6.900倍(K Tachias，Madison EL 1995Variants ofTissue-type Plasminogen Activator Which Display SubstantiallyEnhanced Stimulation by Fibrin，inJournal of Biological Chemistry270，3118319-18322)。
t-PA的位點305和292與胰凝乳蛋白酶中絲氨酸蛋白酶的已知三聯(lián)體的位點His40和Ser32同源。通過分別導(dǎo)入組氨酸或絲氨酸的相應(yīng)取代，這些氨基酸能與t-PA的天門冬氨酸477互作從而在t-PA突變體中產(chǎn)生有功能的三聯(lián)體(Madison等，1993)。
根據(jù)本發(fā)明，由于這些t-PA突變體因增強(qiáng)的纖維蛋白特異性而不表現(xiàn)或——與野生型t-PA相比——表現(xiàn)顯著降低的神經(jīng)毒性，因此可將它們用于治療中風(fēng)。為公開已述及的t-PA單純F305H；F305H；A292S突變體或與R275E的組合突變，我們引入Madison等(1993)的出版物，以及將Tachias和Madison(1995)全文引作參考。
作為替代，纖溶酶原激活劑纖維蛋白特異性的增強(qiáng)可通過Asp194(或同源位點的天門冬氨酸)的點突變實現(xiàn)。纖溶酶原激活劑屬于胰凝乳蛋白酶家族中絲氨酸蛋白酶組，且因此它包含負(fù)責(zé)成熟蛋白酶的催化活性構(gòu)象穩(wěn)定性的保守氨基酸Asp194。已知在絲氨酸蛋白酶的cymogenic形式中Asp194與His40相互作用。Cymogene經(jīng)切割激活后該特異性互作被打斷，Asp194側(cè)鏈旋轉(zhuǎn)約170°以與Ile16形成一個新鹽橋。該鹽橋本質(zhì)上促進(jìn)絲氨酸蛋白酶催化中心氧陰離子穴(oxyanione pocket)的穩(wěn)定性。它也存在于t-PA中。
引入替換Asp194的點突變似乎分別阻礙絲氨酸蛋白酶催化構(gòu)象的形成或穩(wěn)定性。盡管這樣，該突變的纖溶酶原激活劑在它們的輔助因子纖維蛋白的存在下顯示出顯著增強(qiáng)的活性——特別是與成熟野生形式相比——這只能解釋為與纖維蛋白的互作允許促進(jìn)催化活性的構(gòu)象變化(L Strandberg，Madison EL，1995Variants of Tissue-typePlasminogen Activator with Substantially Enhanced Response andSelectivity towards Fibrin co-factors，inJournal of BiologicalChemistry 270，402344-2349)。
總之，纖溶酶原激活劑的Asp194突變體在纖維蛋白存在下其活性高度增強(qiáng)，因此根據(jù)本發(fā)明可對其進(jìn)行利用。
在根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，使用了t-PA突變體，該突變體中Asp194被谷氨酸(D194E)或天冬酰胺(D194N)取代。這些突變體中的t-PA活性在無纖維蛋白時減少1～2000倍，而當(dāng)纖維蛋白存在時其活性增強(qiáng)可達(dá)到498.000～1.050.000倍。這些突變體可進(jìn)一步包含Arg15至R15E的取代，它防止纖溶酶在肽鍵Arg15-Ile16處切割單鏈t-PA，從而導(dǎo)致形成雙鏈形式的t-PA。該單一突變將纖維蛋白對t-PA的激活增強(qiáng)12.000倍。為公開在位點194和15的t-PA突變，引入Strandberg和Madison(1995)全文作為參考。
也可以通過在所謂的“自溶環(huán)(autolysis loop)”中導(dǎo)入點突變來增強(qiáng)纖溶酶原激活劑對纖維蛋白的依賴性。該成分已知源于胰蛋白酶；在絲氨酸蛋白酶的同源部分中也能發(fā)現(xiàn)該成分，且其尤以三個疏水氨基酸(Leu、Pro和Phe)為特征。纖溶酶原激活劑中的自溶環(huán)負(fù)責(zé)與纖溶酶原的相互作用。該區(qū)域中的點突變使纖溶酶原與纖溶酶原激活劑間不再有效形成蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。這些突變僅在缺少纖維蛋白時是功能相關(guān)的。相反在存在纖維蛋白時，它們負(fù)責(zé)纖溶酶原激活劑活性的增強(qiáng)(K Song-Hua，Tachias K，Lamba D，Bode W，MadisonEL，1997Identification of a Hydrophobic exocite on Tissue TypePlasminogen Activator That Modulates Specificity for Plasminogen，inJournal of Biological Chemistry 272；3，1811-1816)。
在一個優(yōu)選實施方式中，使用在位置420至423具有點突變的t-PA。若這些殘基經(jīng)定向誘變?nèi)〈涫沟胻-PA的纖維蛋白依賴性增強(qiáng)高達(dá)61.000倍(K Song-Hua等)。Song-Hua等檢測了點突變L420A、L420E、S421G、S421E、P422A、P422G、P422E、F423A和F423E。為公開根據(jù)本發(fā)明的用途將這些出版物全文引入作為參考。
根據(jù)進(jìn)一步的有利實施方式，使用具有根據(jù)SEQ ID NO.1(附圖13)所示氨基酸序列的改良組織纖溶酶原激活劑。該改良t-PA與野生型t-PA的區(qū)別在于，其自溶環(huán)中位點420至423的疏水氨基酸改變?nèi)缦翲is420、Asp421、Ala422和Cys423。該t-PA優(yōu)選在位點194具有一個苯丙氨酸。進(jìn)一步，位點275可為谷氨酸。有利的是，位點194為苯丙氨酸。
進(jìn)一步，根據(jù)本發(fā)明可以使用尿激酶。根據(jù)本發(fā)明，尿激酶可以具有根據(jù)SEQ ID NO.2(附圖14)所示的氨基酸序列，其中自溶環(huán)的疏水氨基酸被Val420、Thr421、Asp422和Ser423取代。有利的是，尿激酶帶有一個Ile275和一個Glu194。該突變體具有——與野生型尿激酶相比——增強(qiáng)500倍的纖維蛋白特異性。
兩種突變體——尿激酶與t-PA——都進(jìn)行了半定量試驗分析，且與野生型t-PA相比都顯示增強(qiáng)的纖維蛋白特異性。
源自吸血蝙蝠(vampire bat)(Desmodus rotundus)唾液的纖溶酶原激活劑(DSPA)在纖維蛋白存在時也表現(xiàn)出高度增強(qiáng)的活性——特異增強(qiáng)100.000倍。因此，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選可以使用它。術(shù)語DSPA包括四種不同的蛋白酶，它們完成吸血蝙蝠的主要功能，即獵物傷口流血時間的延長(Cartwright，1974)。這四種蛋白酶(DSPAα1、DSPAα2、DSPAβ、DSPAγ)彼此間以及與人t-PA呈現(xiàn)高度的相似性(同源性)。它們也表現(xiàn)出相似的生理活性，因此同分類于術(shù)語DSPA下。DSPA公開于專利EP 0 352 119 A1和US 6 008 019和5 830 849中，因此為滿足公開將它們?nèi)囊胱鳛閰⒖肌?br> 迄今為止DSPAα是該組中最徹底分析的蛋白酶。其氨基酸序列與已知的人t-PA氨基酸序列具有大于72％的同源性(Krtzschmar等人，1991)。然而，t-PA和DSPA間有兩個本質(zhì)區(qū)別。首先，所有的DSPA作為單鏈分子時具有完全蛋白酶活性，因為——與t-PA相反——它不轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈形式(Gardell等，1989；Krtzschmar等，1991)。其次，DSPA的催化活性幾乎完全依賴于纖維蛋白(Gardell等，1989；Bringmann等，1995；Toschie等，1998)。例如，在纖維蛋白存在下，DSPAα1的活性增強(qiáng)100.000倍而t-PA的活性僅增強(qiáng)550倍。相反，纖維蛋白原對DSPA活性的誘導(dǎo)顯著較弱，因為其活性僅增強(qiáng)7～9倍(Bringmann等，1995)?？傊?，DSPA比僅被纖維蛋白激活550倍的野生型t-PA顯著更依賴于纖維蛋白且更為纖維蛋白特異性的。
由于其纖維蛋白溶解特性以及與t-PA極大相似，DSPA成為血栓溶解試劑開發(fā)中一種令人感興趣的候選物。盡管如此，DSPA作為血栓溶解物試劑的醫(yī)療用途過去被限制于對心肌梗死的治療，因為——由于t-PA對谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的促進(jìn)——人們不能合理預(yù)測與t-PA有關(guān)的纖溶酶原激活劑可被合理應(yīng)用于急性中風(fēng)的治療。
令人驚訝的是，即使DSPA顯示出與t-PA高度相似(同源)并且其分子的生理效應(yīng)在很大程度上也類似，DSPA卻沒有神經(jīng)毒性效應(yīng)。上述結(jié)論導(dǎo)致產(chǎn)生這樣一種思想，DSPA也許可以在中風(fēng)治療中成功用作血栓溶解試劑而不造成神經(jīng)組織損傷的嚴(yán)重危險。特別有趣的是這樣一個事實，DSPA也可以在出現(xiàn)中風(fēng)癥狀3小時后使用。
由上述發(fā)現(xiàn)發(fā)展而來的本發(fā)明的進(jìn)一步教導(dǎo)是以顯示DSPA的本質(zhì)特征(尤其是缺乏t-PA的神經(jīng)毒性)的方式來改良和生產(chǎn)進(jìn)一步的纖溶酶原激活劑。其基礎(chǔ)是研究獲得的結(jié)構(gòu)與生化效應(yīng)間的關(guān)系，這使得根據(jù)已知或新發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)毒性纖溶酶原激活劑將神經(jīng)毒性纖溶酶原激活劑轉(zhuǎn)化為非神經(jīng)毒性纖溶酶原激活劑從而生產(chǎn)非神經(jīng)毒性纖溶酶原激活劑成為可能。
該新教導(dǎo)是以通過使用所謂的紅藻氨酸模型和NMDA誘導(dǎo)的紋狀體損傷檢測模型完成的對一側(cè)使用t-PA和另一側(cè)使用DSPA的神經(jīng)變性效應(yīng)的體內(nèi)比較試驗為基礎(chǔ)的。
紅藻氨酸模型(也稱為紅藻氨酸損傷模型)以通過外部應(yīng)用紅藻氨酸(KA)作為紅藻氨酸型(KA型)谷氨酸受體以及NMDA和AMPA谷氨酸受體的激動劑所產(chǎn)生的對神經(jīng)毒性谷氨酸級聯(lián)反應(yīng)的刺激為基礎(chǔ)。以t-PA缺陷型小鼠腦干為試驗?zāi)Ｐ停梢燥@示只有在補(bǔ)加外源t-PA后實驗動物對紅藻氨酸的敏感性才能達(dá)到野生型小鼠的水平。相反，相同實驗條件下輸入等摩爾濃度的DSPA不能恢復(fù)對紅藻氨酸(KA)的敏感性。得出結(jié)論，t-PA的神經(jīng)毒性效應(yīng)不是由DSPA誘導(dǎo)的。這些結(jié)果的總結(jié)于表2。
表2
*P＜0.0001基于該模型的定量研究顯示，甚至10倍的DSPA濃度增長也不能恢復(fù)t-PA缺陷型小鼠對KA處理的敏感性而降低10倍的t-PA濃度就已經(jīng)導(dǎo)致KA誘導(dǎo)的組織損傷。由此得出結(jié)論，就KA處理后的神經(jīng)變性刺激來說，DSPA具有比t-PA至少低100倍的神經(jīng)毒性潛力(同時參見附圖11和12)。
在第二個神經(jīng)變性模型中，用野生型小鼠比較了t-PA以及DSPA對NMDA依賴型神經(jīng)變性刺激的可能效應(yīng)。為此目的，向野生型小鼠單獨注射NMDA，或者與t-PA或DSPA組合注射NMDA(用作NMDA型谷氨酸受體的激動劑)。該模型可以在因血腦屏障被破壞而始終導(dǎo)致神經(jīng)變性或血漿蛋白質(zhì)流入的條件下比較這些蛋白酶的效果(Chen等，1999)。
用該模型工作時，NMDA注射導(dǎo)致小鼠紋狀體的可重復(fù)性損傷。t-PA和NMDA的聯(lián)合注射使損傷量增加至少50％。相反，與DSPAα1的共注射不會導(dǎo)致由NMDA引起的損傷的增強(qiáng)或延伸。甚至在能夠自由擴(kuò)散于由NMDA引起的損傷區(qū)域的血漿蛋白質(zhì)存在下，DSPA也不會導(dǎo)致神經(jīng)變性的增強(qiáng)(同時參見表3)。
表3 **不顯著這些結(jié)果顯示，無纖維蛋白的DSPA——與t-PA相反——表現(xiàn)得類似哺乳動物以及人神經(jīng)系統(tǒng)中的一種惰性蛋白酶——且因此不促進(jìn)由KA或NMDA引起的神經(jīng)毒性效應(yīng)。盡管存在對類t-PA蛋白質(zhì)在中風(fēng)治療用途中的偏見，無神經(jīng)毒性使DSPA成為一種適宜治療急性中風(fēng)的血栓溶解物試劑。
首個臨床試驗結(jié)果也顯示這些結(jié)果也適用于人類中風(fēng)治療。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)成功灌輸后病人可以得到顯著改善(改善8個點NIHSS或NIHSS值0到1)。表1列出這些數(shù)據(jù)。
表1
DSPA和其它非神經(jīng)毒性纖溶酶原激活劑的神經(jīng)毒性缺乏特性(參見上述)為中風(fēng)治療提供了特別的優(yōu)勢，這些纖溶酶原激活劑的使用——與野生型t-PA相反——并不受限于中風(fēng)發(fā)作后最長為3小時的時間段。相反，治療可以遲些開始——例如6小時后或甚至更遲，因為幾乎不存在刺激興奮性中毒反應(yīng)的危險。首次用DSPA進(jìn)行的臨床試驗證明了中風(fēng)發(fā)作后在甚至超過6至9小時的時間范圍對病人的安全治療。
用非神經(jīng)毒性激活劑進(jìn)行的這一無時間限制的治療特別重要，因為它第一次允許甚至在診斷被延誤或不能足夠肯定地確定中風(fēng)發(fā)作時安全地治療呈急性中風(fēng)癥狀的病人。現(xiàn)有技術(shù)中，這組病人由于不利的風(fēng)險評估而是被排除在采用纖溶酶原激活劑的血栓溶解療法之外的。因此，消除了血栓溶解試劑用于中風(fēng)治療的禁忌。
DSPA和其它的非神經(jīng)毒性纖溶酶原激活劑不表現(xiàn)組織損傷副作用。然而，為限制由天然存在于人體的谷氨酸誘導(dǎo)的組織損傷，將它們與神經(jīng)保護(hù)試劑聯(lián)合應(yīng)用于中風(fēng)治療是有利的。可以使用競爭性或非競爭性抑制谷氨酸受體的神經(jīng)保護(hù)試劑。有效的組合是使用例如已知的NMDA型、紅藻氨酸型或使君子酸型谷氨酸受體抑制劑，例如APV、APH、苯環(huán)利定、MK-801、右啡烷或cetamine。
進(jìn)一步，與陽離子聯(lián)用是有利的，因為陽離子尤其是Zn離子會阻斷由谷氨酸受體調(diào)控的陽離子通道從而能夠降低神經(jīng)毒性效應(yīng)。
在進(jìn)一步有利的實施方式中，非神經(jīng)毒性纖溶酶原激活劑可以與至少一種進(jìn)一步的治療性試劑或與藥學(xué)可接受載體聯(lián)用。尤其有利的是與通過活化細(xì)胞來支持組織損傷降低的治療性試劑的聯(lián)用，因為它促進(jìn)已受損組織的再生或在防止進(jìn)一步發(fā)生中風(fēng)中起作用。有利的例子是與抗生素如醌類、抗凝血劑如肝素或水蛭素以及與胞磷膽堿或乙酰水楊酸的組合。
與至少一種凝血酶抑制劑的聯(lián)用也是有利的。優(yōu)選，也可以使用血栓調(diào)節(jié)蛋白和血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物例如solulin、triabin或pallidipin。進(jìn)一步與抗炎癥物質(zhì)的聯(lián)用是有利的，因為它們影響白細(xì)胞浸潤。
t-PA和DSPA的比較檢測方法如下1.動物野生型小鼠(c57/Black 6)和t-PA缺陷型小鼠(t-PA-/-mice)(c57/Black 6)(Carmeliet等，1994)由Dr.Peter Carmeliet，Leuven，Belgium提供。
2.腦組織蛋白質(zhì)抽提t(yī)-PA或DSPAα1灌注后用酶譜分析進(jìn)行腦組織中蛋白水解活性的評估(Granelli-Piperno和Reich，1974)。對海馬進(jìn)行七天灌注后麻醉小鼠，然后用PBS經(jīng)心臟灌流，取腦。切下海馬區(qū)域，轉(zhuǎn)入eppendorf管并培養(yǎng)于等體積(w/v)(約30-50μm)不含蛋白酶抑制劑的0.5％NP-40裂解緩沖液(0.5％NP-40，10mM Tris-HCl pH7.4，10mMNaCL，3mM MgCl2，1mM EDTA)中。用手動式玻璃勻漿機(jī)勻漿腦提取物并將其置于冰上30分鐘。隨后離心樣品，取得上清。檢測存在的蛋白質(zhì)含量(Bio-Rad-reagent)。
3.蛋白酶的酶譜分析根據(jù)Granelli，Piperno和Reich(1974)的方法用酶譜分析檢測樣品和腦組織提取物中的蛋白水解活性。在非還原條件下對含重組蛋白質(zhì)(至多100nM)的樣品或腦組織提取物(20μg)進(jìn)行(10％)SDS-PAGE。將膠從盤中取出，在1％triton×100中洗滌2小時，之后覆蓋在一塊含有聚合纖維蛋白原和纖溶酶原的瓊脂糖凝膠上(Granelli，Piperno和Reich，1974)。于37C下將膠在濕潤容器中溫育直到出現(xiàn)蛋白水解條帶。
4.t-PA、DSPA向海馬內(nèi)的灌注及隨后的紅藻氨酸注射紅藻氨酸損傷模型是以Tsirka等的研究(1995)為基礎(chǔ)的。向動物腹腔內(nèi)(i.p.)注射阿托品(4mg/kg)，之后通過腹腔注射戊巴比妥鈉(70mg/kg)麻醉。然后將小鼠置于腦立體定位框架(stereotaxicframe)中，并將一個含有100μl PBS或重組人t-PA(0.12mg/ml，1.85μM)或DSPAα1(1.85μM)的微滲泵(Alzet型號1007D，AlzetCA.USA)皮下植入肩胛骨間。為了在中線附近導(dǎo)入液體，將泵經(jīng)無菌管與腦插管連接，并從穿越顱骨且坐標(biāo)為前囪-2.5mm、midiolateral0.5mm和背腹側(cè)1.6mm的銼孔插入。將插管固定在合適的位置，且使泵能以每小時0.5μl的速率灌注相應(yīng)溶液共7天。
灌注蛋白酶兩天后，再次麻醉小鼠并再將其置于腦立體定位框架中。然后，向海馬單側(cè)注射溶于0.3μl PBS中的1.5nmol紅藻氨酸(KA)。坐標(biāo)為前囪-2.5mm、內(nèi)側(cè)1.7mm和背腹側(cè)1.6mm。將excitotoxin(KA)持續(xù)30秒注入。紅藻氨酸處理后，為防止液體倒流將注射針頭在這些坐標(biāo)再保持2分鐘。
5.腦處理程序KA注射5天后，麻醉動物并用30ml PBS經(jīng)心臟灌流，接著用70ml 4％的多聚甲醛液經(jīng)心臟灌流，用相同的固定劑固定，隨后在30％的蔗糖中進(jìn)一步浸泡24小時。之后在冷凍切片機(jī)上切制冠狀腦片(40μm)，然后或者用硫堇(BDH，Australia)復(fù)染或者如下述進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測處理。
6.海馬內(nèi)神經(jīng)元丟失的定量根據(jù)前人所述(Tsirka等，1995；Tsirka等，1996)完成對海馬CA1-CA3子域神經(jīng)元丟失的定量。從所有處理組制備背側(cè)海馬的五個連續(xù)部分，注意確保它們帶有CA注射和損傷區(qū)域。根據(jù)海馬的照相掃描作圖(camera lucida drawings)對這些切片的海馬子域(CA1-CA3)進(jìn)行作圖。與相同放大倍數(shù)下作圖的1mm標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較以測定出子域全長。測定了含有有活力錐體神經(jīng)元(呈正常形態(tài))的組織長度和無神經(jīng)元(不含細(xì)胞，無硫堇染色)的組織長度。對這些代表各海馬子域完整神經(jīng)元和神經(jīng)元丟失的長度取腦片平均值，并計算標(biāo)準(zhǔn)差。
7.用或不用t-PA或DSPA產(chǎn)生的紋狀體內(nèi)NMDA興奮性中毒損傷麻醉野生型小鼠(c57/Black 6)并將其置于腦立體定位框架內(nèi)(參見上述)。單獨或與46μM rt-PA或46μM DSPAα1聯(lián)合用50nmolNMDA單側(cè)注射小鼠左側(cè)紋狀體。同時單獨注射t-PA和DSPA作為對照(濃度均為46μM)。注射坐標(biāo)為前囪-0.4mm、midiolateral 2.0mm和背腹側(cè)2.5mm。以0.2μl/分鐘的速率轉(zhuǎn)移溶液(對于全部處理組總體積均為1μl)5分鐘并在注射后將針頭在原位再保留2分鐘以使液體回流降到最少。24小時后麻醉小鼠，用30ml PBS經(jīng)心臟灌注，接著用70ml 4％多聚甲醛液經(jīng)心臟灌注，用相同的固定劑固定24小時，之后在30％的蔗糖中進(jìn)一步浸泡24小時。然后在冷凍切片機(jī)上切制腦片(40μm)，并置于明膠包被的玻片上。
8.對注射NMDA后損傷體積的定量用Callaway等(2000)描述的方法完成對紋狀體損傷體積的定量。制備跨越損傷區(qū)域的連續(xù)冠狀切片。根據(jù)Callaway的方法使損傷區(qū)域可視化，并通過使用一臺微電腦成像裝置來定量損傷體積(MCID，Imaging Research Inc.，Brock University，Ontario，Canada)。
9.免疫組織化學(xué)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法完成免疫組織化學(xué)。將冠狀切片在3％H2O2和10％甲醇中浸泡5分鐘，之后在5％正常山羊血清中浸泡60分鐘。將切片與抗-GFAP抗體(1∶1.000；Dako，Carpinteria，CA，USA)孵育過夜以檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞、或與抗-MAC-1抗體(1∶1.000；Serotec，Raleigh，NC，USA)孵育過夜以檢測小膠質(zhì)細(xì)胞或與抗-DSPA多克隆抗體(Schering AG，Berlin)孵育過夜。漂洗后，將切片與適當(dāng)?shù)纳锼鼗诙贵w(Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA)一起孵育。接著在用3，3′-Diaminebebcidine/0.03％H2O2可視化之前用抗生物素蛋白/生物素-復(fù)合體(Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA)最后孵育60分鐘。然后將切片置于明膠包被的玻片上、干燥、脫水以及封上蓋玻片。
B.結(jié)果1.灌注的t-PA或DSPA擴(kuò)散進(jìn)入t-PA-/-小鼠的海馬，并保持蛋白水解活性最初的試驗是為證實DSPA和t-PA在7天灌注期間都保持它們的蛋白水解活性而設(shè)計的。為該目的，將等分量的t-PA和DSPA(100nmol)在37℃和30℃水浴中孵育7天。為檢測蛋白水解活性，在非還原條件下將探針的5倍連續(xù)稀釋液進(jìn)行SPS-PAGE，用酶譜分析來評估蛋白水解活性。用一份冷凍保存7天的等分量t-PA和DSPA作對照。正如可從附圖1看到的，在30℃或37℃下孵育這一段時間僅造成較小的DSPA或t-PA活性喪失。
2.t-PA和DSPA活性在灌注后從t-PA-/-小鼠制備的海馬提取物中被恢復(fù)首先不得不證實所灌注的蛋白酶出現(xiàn)在被灌注動物腦中，且盡管處在該區(qū)室中也仍然保持它們的蛋白水解活性。為證實這一點用t-PA或DSPA灌注t-PA-/-小鼠7天(參見上述)。然后用PBS經(jīng)心臟灌注小鼠，并切除腦。分離海馬同側(cè)和對側(cè)區(qū)以及小腦區(qū)(用作陰性對照)。將組織樣品(20μg)進(jìn)行SDS-PAGE，以及根據(jù)方法部分的說明作酶譜分析。正如可從附圖2看到的，t-PA和DSPA活性在海馬同側(cè)區(qū)都被檢測到了，但在對側(cè)區(qū)也檢測到了一些活性。這表明，所灌注的蛋白酶不僅在腦中保持了它們的活性，而且還擴(kuò)散進(jìn)了海馬區(qū)。作為對照，從小腦制備的提取物中沒有檢測到活性。
3.DSPA的免疫組織化學(xué)評價為進(jìn)一步證實DSPA確實已經(jīng)擴(kuò)散進(jìn)入了海馬區(qū)，灌注DSPA后對t-PA-/-小鼠的冠狀腦片進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。在海馬區(qū)檢測到了DSPA-抗原，其中灌注區(qū)域的染色最深。結(jié)果證實所灌注的DSPA是可溶的并確實出現(xiàn)在海馬中。
4.DSPA灌注不能體內(nèi)恢復(fù)由紅藻氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)變性。
t-PA-/-小鼠特征性表現(xiàn)對紅藻氨酸(KA)介導(dǎo)的神經(jīng)變性的抗性。然而，rt-PA在海馬內(nèi)的灌注完全恢復(fù)對KA-介導(dǎo)的損傷的敏感性。為判定該模型中DSPA是否可以替代t-PA，用微滲泵將t-PA或DSPA灌注至t-PA-/-小鼠海馬內(nèi)。兩組都測試了12只小鼠。2天后給動物注射紅藻氨酸，然后讓它們恢復(fù)。5天后殺死動物，取腦并處理(參見上述)。作為對照，用KA處理前對t-PA-/-小鼠進(jìn)行了PBS灌注(N＝3)。
制備冠狀腦切片，并用Nissl染色法檢測神經(jīng)元。如附圖4所示，用PBS灌注的t-PA-/-小鼠對之后的KA刺激有抗性。然而，灌注重組t-PA恢復(fù)了對KA處理的敏感性。相反，海馬區(qū)中灌注相同濃度的DSPA不改變動物對KA的敏感性。
那些結(jié)果的定量是以獲自各組12只小鼠的數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)的。在DSPA灌注的12只小鼠中有兩只觀察到了輕微的神經(jīng)變性擴(kuò)展。其原因尚不清楚，可能與DSPA的存在無關(guān)。綜合數(shù)據(jù)已考慮了這兩只動物中觀察到的這一輕微效應(yīng)。用t-PA處理的所有12只小鼠都對KA處理敏感。這些結(jié)果顯示，當(dāng)灌注等摩爾濃度的t-PA或DSPAα1時，只有t-PA給藥導(dǎo)致對KA誘導(dǎo)的神經(jīng)變性的敏感性的恢復(fù)。
5.DSPA灌注不導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞激活由t-PA灌注產(chǎn)生的t-PA-/-小鼠KA敏感性的修復(fù)也導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞激活(Rogove等，1999)。為評估在t-PA或DSPA灌注及隨后的KA處理后小膠質(zhì)細(xì)胞激活的程度，用Mac-1抗體對小鼠冠狀切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色以確定激活的小膠質(zhì)細(xì)胞。t-PA灌注后對KA敏感性的修復(fù)導(dǎo)致Mac-1陽性細(xì)胞的明顯增多。在用DSPA灌注的小鼠中未觀察到該現(xiàn)象。因此，KA處理后DSPA的存在不導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。
6.小鼠海馬區(qū)的DSPA和t-PA滴定。
用于灌注的t-PA濃度是以Tsirka等(1995)所述濃度為基礎(chǔ)的(100μl 0.12 mg/ml[1.85μM])。用低10倍量的t-PA(0.185μM)和高10倍量的DSPA(18.5μM)重復(fù)KA損傷試驗。較低的t-PA濃度仍然能夠恢復(fù)對KA處理的敏感性(n＝3)。這一發(fā)現(xiàn)尤其值得注意，即KA處理后灌注濃度提高10倍的DSPA僅導(dǎo)致少量神經(jīng)元的丟失。這些數(shù)據(jù)有力地表明，DSPA不導(dǎo)致對KA敏感性的增強(qiáng)。
7.t-PA和DSPA對野生型小鼠中NMDA-依賴型神經(jīng)變性的效應(yīng)還檢測了t-PA和DSPA在野生型小鼠神經(jīng)變性模型中的效應(yīng)。向這些小鼠紋狀體中注射t-PA確定地導(dǎo)致由谷氨酸類似物NMDA引起的神經(jīng)變性效應(yīng)的增強(qiáng)(Nicole等，2001)。
在t-PA或DSPA(各46μM)存在下向野生型小鼠紋狀體區(qū)注射總體積為1μl的NMDA。24小時后取腦，并根據(jù)Callaway的方法(Callaway等，2000)對損傷大小進(jìn)行定量(參見上述)。正如可從附圖7看到的，單獨注射NMDA在所有處理小鼠(N＝4)中產(chǎn)生可重復(fù)性損傷。當(dāng)聯(lián)合使用t-PA和NMDA時，損傷大小提高大約50％(P＜0.01，n＝4)。明顯相反的是，NMDA和相同濃度的DSPA的共同注射與單獨注射NMDA相比不導(dǎo)致?lián)p傷大小的增加。
單獨注射t-PA或DSPA不導(dǎo)致可檢測的神經(jīng)變性。單獨給藥時t-PA缺乏效應(yīng)與Nicole等(2001)的結(jié)果一致。這些數(shù)據(jù)顯示，DSPA的存在甚至在神經(jīng)變性事件過程中也不增強(qiáng)神經(jīng)變性。
為證實DSPA注射確實已經(jīng)擴(kuò)散進(jìn)入了海馬區(qū)，用DSPA抗體對冠狀切片進(jìn)行了免疫組織化學(xué)分析。檢測表明，DSPA確實進(jìn)入了紋狀體區(qū)。
用間接色原測試進(jìn)行的纖溶酶原激活的動力學(xué)分析根據(jù)Madisan E.L.，Goldsmith E.J.，Gerard R.D.，Gething M.-J.，Sambrook J.E.(1989)Nature 339 721-724；Madison E.LO.，Goldsmith E.J.，Gething M.J.，Sambrook J.F.和Bassel-Duby R.S.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci U.SA 87，3530-3533以及MadisonE.L.，Goldsmith E.J.，Gething M.J.，Sambrook J.F.和Gerard R.D.(1990)J.Biol.Chem 265，21423-21426用底物L(fēng)ys-纖溶酶原(American Diagnostica)和spectrocyme PL(American Diagnostica)完成了對t-PA活性的間接色原測試。在有或無輔助因子DESAFIB(American Diagnostica)存在下都進(jìn)行了測試。DESAFIB是一種通過用蛋白酶蛇毒凝血酶(batroxobin)對高純度人纖維蛋白原進(jìn)行切割獲得的可溶性纖維蛋白單體制劑。蛇毒凝血酶切割在纖維蛋白原Aα-鏈中的Arg16-Gly17結(jié)合位點從而釋放纖維蛋白原肽鏈A。無肽Gly-Pro-Arg-Pro存在時，所產(chǎn)生的代表纖維蛋白I單體的des-AA-纖維蛋白原是可溶的。Lys-纖溶酶原的濃度變化范圍在DESAFIB存在時為0.0125～0.2μM以及在無輔助因子存在時為0.9～16μM。
不同刺激物存在下的間接色原測試。
根據(jù)上述引用的出版物完成標(biāo)準(zhǔn)間接色原測試。使用了含有0.25～1ng酶、0.2μM Lys-纖溶酶原和0.62mM spectrocyme PL且總體積為100μl的探針。測試在存在緩沖液、25μg/ml DESAFIB、100μg/ml纖維蛋白原溴化氰片段(American Diagnostica)或100μg/ml刺激性13氨基酸肽P368下完成的。在微量滴定板中進(jìn)行分析，并持續(xù)1小時在“Molecular Devices Thermomax”中于波長405nm處每30秒檢測一次光學(xué)密度。反應(yīng)溫度為37℃。
權(quán)利要求
1.纖溶酶原激活因子用于中風(fēng)治療的用途，其中纖溶酶原激活因子的活性在纖維蛋白存在下增強(qiáng)超過650倍。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的纖溶酶原激活因子的用途，其中纖溶酶原激活因子至少含有組氨酸或絲氨酸殘基，所述組氨酸或絲氨酸殘基與天冬氨酸殘基一起形成cymogene三聯(lián)體的至少一部分。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的纖溶酶原激活因子的用途，其中絲氨酸殘基位于與t-PA的位置292至少部分同源的位點、組氨酸殘基位于與t-PA的位置305至少部分同源的位點和天冬氨酸殘基位于與t-PA的位置447至少部分同源的位點。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的纖溶酶原激活因子的用途，其中纖溶酶原激活因子選自以下t-PA突變體組t-PA/R275E；t-PA/R275E，F(xiàn)305H；t-PA/R275E，F(xiàn)305H，A292S。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的纖溶酶原激活因子的用途，其中纖溶酶原激活因子帶有Asp194上的點突變或在同源位置上的天冬氨酸的點突變，致使在纖維蛋白不存在下纖溶酶原激活因子催化活性構(gòu)象穩(wěn)定性降低。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的用途，其中Asp194被谷氨酸或天冬酰胺取代。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中t-PA中Asp194被Glu194或Asn194所取代。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的纖溶酶原激活因子的用途，其中纖溶酶原激活因子在自溶環(huán)中含有至少一個突變，該突變導(dǎo)致在不存在纖維蛋白的情況下纖溶酶原與纖溶酶原激活因子間的功能性相互作用降低。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的用途，其中在自溶環(huán)中的至少一個突變影響野生型t-PA的氨基酸位置420至423或同源位置。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的用途，其中突變選自由以下突變組成的組I420A、I420E、S421G、S421E、P422A、P422G、P422E、F423A和F423E。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的纖溶酶原激活因子的用途，其中纖溶酶原激活因子是含有至少一個防止纖溶酶催化的點突變的cymogene。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的纖溶酶原激活因子的用途，其中點突變位于t-PA的位置15或275或在與之同源的位置上。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的用途，其中谷氨酸在位置15或275處。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的纖溶酶原激活因子的用途，其中纖溶酶原激活因子分離自吸血蝙蝠唾液(DSPA)。
15.根據(jù)上述權(quán)利要求中至少一項的纖溶酶原激活因子的用途，用于中風(fēng)發(fā)作后至少3小時治療人類中風(fēng)。
16.根據(jù)上述權(quán)利要求中至少一項的纖溶酶原激活因子的用途，用于中風(fēng)發(fā)作后至少6小時治療人類中風(fēng)。
17.根據(jù)上述權(quán)利要求中至少一項的纖溶酶原激活因子的用途，用于中風(fēng)發(fā)作后至少9小時治療人類中風(fēng)。
18.根據(jù)上述權(quán)利要求中至少一項的纖溶酶原激活因子的用途，用于治療中風(fēng)發(fā)作暫時未確診的中風(fēng)病人。
19.根據(jù)上述權(quán)利要求中至少一項的纖溶酶原激活因子的用途，其在避免野生型t-PA神經(jīng)毒性的情況下用于中風(fēng)治療。
20.具有含有His420、Asn421、Ala422和Cys423的自溶環(huán)的組織纖溶酶原激活因子。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的組織纖溶酶原激活因子，其特征在于具有位置194的點突變，該點突變導(dǎo)致在不存在纖維蛋白的情況下纖溶酶原激活因子催化活性構(gòu)象穩(wěn)定性的降低。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的組織纖溶酶原激活因子，其特征在于Phe194。
23.根據(jù)權(quán)利要求20至22中至少一項的組織纖溶酶原激活因子，其特征在于具有防止纖溶酶催化的至少一個點突變。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的組織纖溶酶原激活因子，其特征在于Glu275。
25.具有根據(jù)Seq ID No 1所示氨基酸序列的組織纖溶酶原激活因子。
26.具有含有Val420、Thr421、Asp422和Ser423的自溶環(huán)的尿激酶。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的尿激酶，其特征在于具有位置194的點突變，該點突變導(dǎo)致在不存在纖維蛋白的情況下尿激酶的催化活性構(gòu)象的穩(wěn)定性降低。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的尿激酶，其特征在于Glu194。
29.根據(jù)權(quán)利要求26至28中至少一項的尿激酶，其特征在于具有防止纖溶酶催化的至少一個點突變。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的尿激酶，其特征在于Ile275。
31.具有根據(jù)Seq ID No 2所示氨基酸序列的尿激酶。
32.含有根據(jù)上述權(quán)利要求中至少一項的纖溶酶原激活因子以及至少一種額外藥學(xué)活性成分或其藥學(xué)可接受鹽的藥物組合物。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的藥物組合物，其特征在于含有神經(jīng)保護(hù)試劑。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的藥物組合物，其特征在于含有谷氨酸受體拮抗劑。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的藥物組合物，其特征在于含有競爭性或非競爭性拮抗劑。
36.根據(jù)權(quán)利要求33的藥物組合物，其特征在于含有至少一種凝血酶抑制劑，優(yōu)選選自下列血栓調(diào)節(jié)蛋白、血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物、triabin、pallidipin或solulin。
37.根據(jù)權(quán)利要求33的藥物組合物，其特征在于含有至少一種抗凝血試劑，優(yōu)選選自下列抗凝血試劑水蛭素、肝素、乙酰水楊酸或ancrod。
38.根據(jù)權(quán)利要求33的藥物組合物，其特征在于含有抗炎癥物質(zhì)。
39.根據(jù)權(quán)利要求33的藥物組合物，其特征在于含有抗生素試劑。
40.根據(jù)權(quán)利要求33的藥物組合物，其特征在于含有胞磷膽堿。
41.根據(jù)權(quán)利要求36至45中至少一項的藥物組合物應(yīng)用于根據(jù)權(quán)利要求1至19中至少一項的用途。
42.生產(chǎn)用于中風(fēng)治療的含有一種非神經(jīng)毒性纖溶酶原激活因子的藥物的方法，包括以下改良纖溶酶原激活因子的步驟中的至少一步——導(dǎo)入cymogenic三聯(lián)體的至少一部分；——Asp194或同源天冬氨酸的取代以降低在不存在纖維蛋白的情況下催化活性構(gòu)象的穩(wěn)定性；——自溶環(huán)或與之同源的肽段中的疏水氨基酸殘基的取代；——向cymogene中導(dǎo)入突變以防止纖溶酶對cymogene的催化。
43.根據(jù)權(quán)利要求42生產(chǎn)的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及非神經(jīng)毒性纖溶酶原激活因子的生產(chǎn)及其在治療人類中風(fēng)中的用途，例如源自常見的Desmodus rotundus的非神經(jīng)毒性纖溶酶原激活因子(DSPA)。本發(fā)明也提供了治療人類中風(fēng)的新的治療基礎(chǔ)。
文檔編號A61P7/02GK1592634SQ02823478
公開日2005年3月9日 申請日期2002年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月2日
發(fā)明者M·索恩根, W·索恩根, W-D·施洛伊寧, R·邁德卡夫 申請人:帕昂有限公司