專利名稱：仙人掌提取物和由其分離的化合物在保護神經(jīng)細胞中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及仙人掌(Opuntia ficus-indica)的乙酸乙酯提取物和由其分離的化合物在保護神經(jīng)細胞中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
當通過腦動脈或冠狀動脈的血液流量低于閾值，例如由于血栓形成和動脈硬化的阻斷作用而低于閾值時，所產(chǎn)生的局部缺血會損傷腦細胞或心臟細胞，從而由于細胞死亡而導(dǎo)致腦梗塞或心肌梗塞。腦局部缺血是在心臟驟停和局部缺血性中風中觀察到的常見癥狀，并引起難于處理的腦神經(jīng)元損傷，其可導(dǎo)致勞動力喪失、昏睡甚至死亡。
有關(guān)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理學機理是多變而復(fù)雜的，但已經(jīng)發(fā)現(xiàn)反應(yīng)性氧物質(zhì)例如自由基在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病例如缺血性中風、阿爾茨海默氏病和帕金森病中起重要作用。也就是說，已經(jīng)有人提出，在急性和慢性神經(jīng)變性疾病中，由氧化應(yīng)力產(chǎn)生的各種ROS對某些神經(jīng)細胞造成損傷。最近有人報道，由缺血性中風造成的腦損傷是由局部缺血和再灌注所產(chǎn)生的自由基引起的(Korosfetz &Moskowitz，Trends Neurosci.17227，1996)。
自由基也是在阿爾茨海默氏病中觀察到的某些神經(jīng)細胞損失的原因。阿爾茨海默氏病的典型臨床表現(xiàn)之一是通過β-淀粉樣(Aβ)蛋白質(zhì)的聚集而形成的老年斑。聚集的β-淀粉樣蛋白質(zhì)引起過氧化氫在神經(jīng)細胞中聚集，從而導(dǎo)致氧化和過氧化反應(yīng)。此外，這些反應(yīng)促進一氧化氮的產(chǎn)生，而由此產(chǎn)生的一氧化氮與超氧化物陰離子自由基，形成具有非常強的反應(yīng)性的過亞硝酸鹽，從而導(dǎo)致自由基毒性增加。
同樣地，據(jù)信，是由氧化應(yīng)力產(chǎn)生的羥基自由基一一種強的神經(jīng)毒介質(zhì)引起了帕金森病(Ebadi等人，Prog.Neurobiol.481，1996)。此外，有人提出，ROS在興奮毒素神經(jīng)元細胞死亡中起重要作用，而興奮毒素神經(jīng)元細胞死亡是由于在急性腦損傷和慢性神經(jīng)變性疾病中過度釋放的谷氨酸引起的(Choi，Neuron 1623，1988)。
因此，由氧化應(yīng)力產(chǎn)生的ROS直接或間接地參與各種急性和神經(jīng)變性疾病例如腦缺血、阿爾茨海默氏病、帕金森病，所以人們在積極研究抗氧化物質(zhì)以預(yù)防和治療這樣的神經(jīng)疾病。
本發(fā)明者們致力于探尋天然存在的具有抗氧化活性的物質(zhì)，并且發(fā)現(xiàn)仙人掌(Linne)Mill提取物具有可以用來保護神經(jīng)細胞的非常強的抗氧化活性。
仙人掌作為民間藥物被廣泛用于治療燒傷、水腫、消化不良和支氣管哮喘，并且已知仙人掌果實和莖的乙醇提取物在保護胃粘膜、降低血糖水平以及通過止痛和抗炎癥作用來提高免疫力方面顯示出了多種功效(Trejo-Gonzalez等人，J.Ethnopharmacol.5527-33，1996；Ahn，Illustrated book of Korean medical herbs Kyohaksa，497，1998；Galati等人，J.Ethnopharmacol.761-9，2001)。最近還有報道，仙人掌能夠抑制涉及黑素合成的酪氨酸酶(Lee N.H.等人，J.Pharmacognosy 31412，2000)。
然而，還沒有關(guān)于仙人掌莖、果實或加工過的果實的乙酸乙酯提取物，或者由其分離的化合物表現(xiàn)出保護神經(jīng)細胞的抗氧化活性的報道，因此，本發(fā)明第一次公開了這樣的提取物能夠有效地用于預(yù)防和治療慢性神經(jīng)疾病例如局部缺血性中風和阿爾茨海默氏病，以及心臟缺血例如心肌梗塞。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的主要目的是提供表現(xiàn)出抗氧化活性的仙人掌提取物或由其分離的化合物在預(yù)防和治療缺血性疾病、腦神經(jīng)疾病或心血管系統(tǒng)疾病中的治療應(yīng)用。
按照本發(fā)明的一個方面，提供了可用于保護神經(jīng)細胞的表現(xiàn)出抗氧化活性的仙人掌的乙酸乙酯提取物。
按照本發(fā)明的另一個方面，提供了從仙人掌的乙酸乙酯提取物中分離出的化合物及其制備方法。
按照本發(fā)明的另一個方面，提供了包含仙人掌的乙酸乙酯提取物或由其分離的化合物作為有效成分的藥物組合物，所述藥物組合物能夠用于預(yù)防或治療缺血性疾病、腦神經(jīng)系統(tǒng)疾病或心血管系統(tǒng)疾病。
按照本發(fā)明的另一個方面，提供了仙人掌的乙酸乙酯提取物或由其分離的化合物在預(yù)防和治療缺血性疾病、腦神經(jīng)系統(tǒng)疾病或心血管系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用。
附圖簡述當結(jié)合參閱分別顯示于以下的附圖時，從本發(fā)明的下面描述中，本發(fā)明的上述和其它目的和特征將會變的顯而易見附

圖1從仙人掌果實中提取的各種級分對黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶誘發(fā)的神經(jīng)毒性的抑制作用，附圖2從仙人掌果實中提取的各種級分對過氧化氫誘發(fā)的神經(jīng)毒性的抑制作用，附圖3從仙人掌莖中提取的各種級分對黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶誘發(fā)的神經(jīng)毒性的抑制作用，附圖4從仙人掌莖中提取的各種級分對過氧化氫誘發(fā)的神經(jīng)毒性的抑制作用，附圖5從仙人掌的乙酸乙酯提取物中分離的化合物對黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶誘發(fā)的神經(jīng)毒性的抑制作用，附圖6從仙人掌的乙酸乙酯提取物中分離的化合物對過氧化氫誘發(fā)的神經(jīng)毒性的抑制作用，附圖7從仙人掌的乙酸乙酯提取物中分離的化合物清除DPPH自由基的活性，附圖8從仙人掌的乙酸乙酯提取物中分離的化合物清除超氧化物陰離子自由基的活性，附圖9槲皮素(quercetin)、槲皮素3-甲基醚和二氫槲皮素對大腦皮層、紋狀體的梗塞體積或總梗塞體積的影響，附圖10槲皮素、槲皮素3-甲基醚和二氫槲皮素對校正的總梗塞體積的影響，附圖11槲皮素、槲皮素3-甲基醚和二氫槲皮素對腫脹比率的影響，附圖12槲皮素、槲皮素3-甲基醚和二氫槲皮素對神經(jīng)恢復(fù)的影響。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于預(yù)防和治療缺血性疾病、腦疾病或心血管系統(tǒng)疾病的藥物組合物，所述藥物組合物包含仙人掌的乙酸乙酯提取物；或選自式(1)山柰酚、式(2)二氫槲皮素和式(3)槲皮素3-甲基醚的任一種化合物，以及它們的可藥用鹽、水合物、溶劑化物、異構(gòu)體及其混合物。
<式1>
<式2>
<式3>
因為式1-3化合物可在其結(jié)構(gòu)內(nèi)可以具有不對稱碳原子，所以它們可以以對映體、非對映體或含有外消旋體的其混合物的形式存在，因此，其混合物的這些異構(gòu)體包含于本發(fā)明范圍內(nèi)。
本發(fā)明化合物也能夠形成可藥用鹽。這些可藥用鹽包括但不限于用下列堿形成的鹽無機堿例如堿金屬氫氧化物(例如氫氧化鈉、氫氧化鉀)，堿金屬碳酸氫鹽(例如碳酸氫鈉、碳酸氫鉀)，堿金屬碳酸鹽(例如碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸鈣)以及有機堿例如伯、仲和叔胺氨基酸。
此外，本發(fā)明化合物可以以溶劑化物、特別是水合物的形式存在。水合作用可以在分離期間發(fā)生，或者經(jīng)過一定時間通過其吸濕性而發(fā)生的。這樣的鹽和水合物包括于本發(fā)明范圍內(nèi)。
具有保護神經(jīng)細胞活性的仙人掌提取物可以通過用乙酸乙酯提取仙人掌的果實、莖或蒸汽干燥的果實來制備，例如通過以下步驟制得將仙人掌的果實、莖或蒸汽干燥的果實精細切碎；在室溫將每千克所述切碎的仙人掌在0.1-10L、優(yōu)選0.5-7L C1-3醇例如甲醇和乙醇，或C1-3醇的水溶液中浸泡4-5天，以獲得提取混合物；過濾該混合物，并從濾液中除去醇以獲得醇提取物；將0.1-10L、優(yōu)選1-4L水加到1kg所述醇提取物中；用0.1-5L、優(yōu)選0.5-2L乙酸乙酯(EtOAc)提取所得水溶液以獲得乙酸乙酯提取物。直接用乙酸乙酯提取仙人掌的果實、莖或蒸汽干燥的果實來獲得類似提取物也是可能的。
本發(fā)明仙人掌的果實、莖或蒸汽干燥果實的乙酸乙酯提取物在以下方面顯示了高的活性清除DPPH(1，1-二苯基-2-苦基偕腙肼)自由基；抑制黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶誘發(fā)的神經(jīng)毒性；以及抑制過氧化氫誘發(fā)的神經(jīng)毒性。仙人掌乙酸乙酯提取物的這種活性是獨特的，因為其它的提取物例如仙人掌的C2HCl2和BuOH提取物基本上沒有活性。
因此，仙人掌的乙酸乙酯提取物是有效的ROS清除劑，并且能夠用于預(yù)防和治療由腦疾病例如阿爾茨海默氏病病、中風和帕金森病引起的腦神經(jīng)細胞損傷；以及通過防止由心臟缺血引起的心肌損傷來預(yù)防和治療心肌梗塞。
通過進行使用硅膠、Sephadex LH-20、RP-18、聚酰胺、Toyoperl或XAD樹脂柱的柱色譜純化，可以從本發(fā)明仙人掌的乙酸乙酯提取物中分離出用于保護神經(jīng)元的活性化合物。優(yōu)選使用Sephadex LH-20、RP-18或硅膠柱。
作為結(jié)果，3-氧代-α-ionol β-D-葡糖苷、山柰酚、二氫山柰酚、山柰酚3-甲基醚、槲皮素、二氫槲皮素和槲皮素3-甲基醚從本發(fā)明仙人掌的乙酸乙酯提取物中被分離出來。在本發(fā)明中，3-氧代-α-ionolβ-D-葡糖苷、山柰酚3-甲基醚和槲皮素3-甲基醚是第一次從仙人掌中分離出來。
山柰酚、槲皮素、二氫槲皮素和槲皮素3-甲基醚有效抑制由過氧化氫以及黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶誘發(fā)的神經(jīng)細胞損傷，并且顯示了高的清除DPPH自由基的活性。對由黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶或過氧化氫誘發(fā)的神經(jīng)毒性表現(xiàn)出最高抑制活性的是槲皮素3-甲基醚，而槲皮素、二氫槲皮素和山柰酚也表現(xiàn)出了顯著的活性。因此，就證實了在防止黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶或過氧化氫誘發(fā)的神經(jīng)毒性的神經(jīng)元損傷方面，仙人掌的乙酸乙酯提取物中起作用的有效成分是山柰酚、槲皮素、二氫槲皮素和槲皮素3-甲基醚。
此外，二氫槲皮素和槲皮素3-甲基醚是由黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生的超氧化物自由基的有效清除劑，并且有效抑制由NMDA引起的神經(jīng)元損傷。槲皮素3-甲基醚在缺血性腦損傷動物模型中對于腦細胞保護具有特別的活性。因此，山柰酚、二氫槲皮素、槲皮素3-甲基醚或仙人掌的乙酸乙酯提取物可有利地用于預(yù)防和治療由腦神經(jīng)系統(tǒng)疾病例如中風、腦震蕩、阿爾茨海默氏病和帕金森病引起的神經(jīng)元損傷；由局部缺血引起的神經(jīng)元細胞和組織(尤其是腦神經(jīng)細胞和組織)損傷；由局部缺血例如缺血性心肌梗塞引起的心血管系統(tǒng)的細胞損傷，并且也能夠用做神經(jīng)保護劑或心臟保護劑。
按照本領(lǐng)域的常規(guī)方法，可以使用本發(fā)明組合物制備藥物制劑。在這樣的制備中，優(yōu)選以膠囊、小藥囊或其它容器的形式將有效組分與適宜的載體混合、稀釋或包囊。因此，可以將本發(fā)明制劑制成片劑、丸劑、分散劑、小藥囊、酏劑、懸浮液、乳劑、溶液、糖漿劑、氣溶膠劑、軟或硬明膠膠囊、注射用溶液或懸浮液、軟膏劑、霜劑或洗劑。
用于本發(fā)明藥物制劑的可藥用載體、賦形劑和稀釋劑包括但不限于乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸鎂和礦物油。本發(fā)明制劑還可以包含填充劑、抗凝劑、潤滑劑、潤濕劑、矯味劑、乳化劑或防腐劑。按照藥物領(lǐng)域的常規(guī)方法，本發(fā)明藥物組合物可以制備成在給藥哺乳動物后提供迅速、連續(xù)或遲延釋放有效組分的制劑。
本發(fā)明藥物組合物可以口服給藥或經(jīng)胃腸外途徑例如經(jīng)皮、皮下、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)給藥。
對于臨床給藥的目的，仙人掌的乙酸乙酯提取物或由其分離的山柰酚、二氫槲皮素或槲皮素3-甲基醚的典型日劑量為10-5,000mg/kg體重，優(yōu)選50-1,000mg/kg體重，并且能夠以單次劑量或以分開的劑量給藥。特別是，當經(jīng)由靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射給藥時，典型的日劑量可以為10-5,000mg/kg體重，優(yōu)選為150-3,000mg/kg體重，然而，根據(jù)具體的疾病，該劑量可以高于或低于有效組分的日劑量。此外，應(yīng)當理解，實際給藥于具體患者的有效組分的量應(yīng)當根據(jù)各種相關(guān)因素確定，包括給藥的有效化合物的種類、個體患者的體重、年齡、性別、健康狀況、飲食和排泄速度、所選擇的給藥途徑、藥物組合以及患者癥狀的嚴重程度。
此外，為了在治療缺血性疾病中獲得更好效果，本發(fā)明的仙人掌提取物或由其獲得的化合物可以與一種或多種選自以前眾所周知的神經(jīng)保護劑的成分一起給藥。可與本發(fā)明化合物一起給藥的神經(jīng)保護劑的實例是用于提高谷胱甘肽濃度的N-乙酰半胱氨酸、作為鈣拮抗劑的尼莫地平、作為抗氧化劑的維生素C和E、作為血栓溶解劑的組織纖維蛋白溶酶原激活劑以及其它腦神經(jīng)和心血管保護劑。
包含本發(fā)明化合物的用于治療缺血性疾病的制劑還可以包含用于預(yù)防和治療由局部缺血引起的神經(jīng)細胞和組織(尤其是腦神經(jīng)細胞和大腦組織)損傷或由局部缺血引起的心血管系統(tǒng)細胞損傷的其它組分。
給出下面的實施例和試驗實施例僅是為了舉例說明，而非意圖限制本發(fā)明的范圍。
實施例參考實施例1測定DPPH自由基清除活性試驗樣本的抗氧化活性由它的供電子能力(EDA)來代表，而EDA則由改進的Blois(Nature 1811199，1958)方法測定。也就是說，把試驗樣本溶于99.9％乙醇，然后稀釋至適宜的濃度。將10μl該溶液與190μl DPPH溶液(1，1-二苯基-2-苦基偕腙肼；溶于99.9％乙醇中)混合，攪動5秒鐘，然后在37℃下反應(yīng)30分鐘，之后在515nm測定該混合物的吸收度。通過相對于對照吸收度的樣本吸收度來評估EDA，并由其計算代表50％抑制活性的IC50。
參考實施例2測定超氧化物陰離子自由基清除活性為了測定清除由黃嘌呤與黃嘌呤氧化酶(XOD)之間的反應(yīng)產(chǎn)生的超氧化物陰離子自由基的活性，進行下面由Toda等人描述的方法(Planta，med.578，1991)將不同濃度的試驗樣本溶液分別與0.1mM黃嘌呤、0.1mM EDTA、50μg/ml牛血清白蛋白(BSA)、25mM氮藍四唑(NBT)、40mM Na2CO3和7×10-3單位XOD混合至200μl的最終濃度，然后在25℃反應(yīng)20分鐘。將6.6μl的6mM CuCl2加到反應(yīng)混合物中以終止反應(yīng)，然后在560nm測定該反應(yīng)混合物的吸收度以確定甲簪(formazane)的量。通過相對于對照吸收度的樣本吸收度來評估超氧化物陰離子自由基清除活性，并由其計算代表50％抑制活性的IC50。
參考實施例3大鼠大腦皮層神經(jīng)元的原代培養(yǎng)物將從Sprague-Dswley大鼠胚胎大腦皮層中分離出的神經(jīng)元細胞用Cho等人(Life sci.681567，2001)描述的方法進行培養(yǎng)。即將妊娠16-18天的Sprague-Dswley大鼠胚胎的大腦皮層分離出來，然后使用解剖學顯微鏡把腦膜除去。在含有25mM葡萄糖、5％FBS、5％馬血清和2mM L-谷氨酰胺的培養(yǎng)基(MEM，Gibco BRL)中，通過研制法，用Pasteur移液管將由此獲得的組織分離成單個細胞。將分離的細胞以4-5×105個細胞/孔的密度鋪在預(yù)先包被聚-L-賴氨酸和昆布氨酸的24-孔培養(yǎng)板上，以達到4-5×105個細胞/孔的濃度，然后在37℃的培養(yǎng)器中于95％O2/5％CO2下進行培養(yǎng)。每周用新鮮的培養(yǎng)基更換一部分培養(yǎng)液兩次，然后在鋪板之后7到9天，將培養(yǎng)物用10μM阿糖胞苷處理24到72小時，以抑制非神經(jīng)元細胞的生長。在鋪板之后10到14天，將培養(yǎng)的細胞用于試驗。
參考實施例4用氧化應(yīng)力誘發(fā)神經(jīng)原細胞損傷將培養(yǎng)的大腦皮層細胞用HEPES-控制鹽水溶液(HCSS)洗滌三次，然后將其用包含黃嘌呤(0.5mM)和黃嘌呤氧化酶(10mU/ml)的不含血清的MEM(MEM含有25mM葡萄糖和2mM谷氨酰胺)處理，以誘發(fā)由超氧化物陰離子自由基導(dǎo)致的細胞損傷。將處理的細胞用HCSS反復(fù)洗滌，然后在不含血清的沒有黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶的MEM中，于95％O2/5％CO2、37℃下，培養(yǎng)20-24小時。通過如下方法誘發(fā)由過氧化氫引起的細胞損傷將培養(yǎng)的細胞洗滌，用含有100μM過氧化氫的HCCS處理5分鐘，反復(fù)洗滌，用不含血清的MEM更換培養(yǎng)基，然后再培養(yǎng)20-24小時。將培養(yǎng)物用不同濃度的試驗樣本預(yù)先處理1小時，在試驗樣本存在下，用如上所述的黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶或過氧化氫處理，然后再保持20-24小時。用參考實施例5中描述的方法測定細胞損傷的程度。
參考實施例5神經(jīng)元細胞損傷的測定按照參考實施例4的方法處理的培養(yǎng)的神經(jīng)細胞的損傷程度可以用相差顯微鏡進行形態(tài)學檢測，或者通過測定釋放到培養(yǎng)基中的乳酸脫氫酶(LDH)的活性來確定。數(shù)據(jù)計算為，在沒有測定樣本存在下，在暴露于各自的氧化損傷的培養(yǎng)基中的對照LDH活性的百分比。根據(jù)相對于未改變的對照物的LDH釋放量來計算試驗樣本對氧化神經(jīng)細胞損傷的抑制活性。將測定重復(fù)二到四次，通過使用Prism(Graphed軟件公司，USA)非線性回歸分析平均值來計算代表50％抑制濃度的IC50。
參考實施例6用于神經(jīng)毒性試驗的大鼠腦海馬細胞和皮層細胞的培養(yǎng)使用顯微鏡，從懷孕的SD大鼠的17天大的胚胎的大腦組織中提取海馬和皮層。用移液管將提取的海馬和皮層各自分離成離散的單一細胞，然后通過離心把由此得到的細胞接種到聚-L-賴氨酸包被的96孔培養(yǎng)板中。海馬細胞以2.5×104個細胞/孔的濃度接種，皮層細胞以5×104個細胞/孔的濃度接種。把含有2％B-27補充營養(yǎng)物、25M谷氨酸和0.5mM谷氨酰胺的200μl Neurobasal培養(yǎng)基(Life technologies)加到每個孔中，然后將該培養(yǎng)板在37℃培養(yǎng)。培養(yǎng)72小時后，將該培養(yǎng)基用相同但缺少谷氨酸的培養(yǎng)基更換，然后進一步培養(yǎng)細胞。7到10天后進行細胞毒性試驗。
參考實施例7防止腦細胞受由NMDA導(dǎo)致的神經(jīng)毒性損傷的活性在有或沒有固定量的試驗樣本存在下，將在參考實施例6中制備的培養(yǎng)細胞用100μM NMDA(Signa)處理2小時，以誘發(fā)大腦細胞損傷。24小時后，用LDH試劑盒(Boehringer Mannheim)測定釋放到培養(yǎng)液中的LDH的量。
參考實施例8防止腦細胞受由生長因子的去除導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷的活性將在參考實施例6中制備的培養(yǎng)細胞在含有2％B27補充營養(yǎng)物的NMDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后用相同但沒有B27補充營養(yǎng)物的NMDA培養(yǎng)基更換培養(yǎng)液，以誘發(fā)由營養(yǎng)不足導(dǎo)致的細胞死亡。24小時后，用LDH試劑盒(Boehringer Mannheim)測定由細胞壞死所釋放的LDH的量來定量細胞死亡的程度。
參考實施例9制備由中間腦動脈閉塞(MACO)和再灌注引起的短暫病灶性腦缺血損傷的大鼠模型將體重250-300g的雄性Sprague-Dawley大鼠(Daehan實驗動物中心，Eumsung)用作實驗動物。用使用70％一氧化氮(N2O)和30％氧氣(O2)作為載體氣體的1.5％異氟烷(Forane，Choong WaePharmaceutical Co.)將每個實驗動物麻醉，然后用由Nagasawa和Kogure(Stroke 201037，1989)描述的方法進行手術(shù)操作，同時用加熱墊和加熱燈將實驗動物的體溫保持在大約37±0.5℃左右。
沿著麻醉動物的脖頸中部把頸切開，然后小心地從中分離出右頸總動脈、內(nèi)頸動脈和外頸動脈，同時注意不要損傷迷走神經(jīng)。將共同頸動脈和外頸動脈結(jié)扎，把一根17mm長的探針從內(nèi)和外頸動脈的分叉點處插入內(nèi)頸動脈，然后在插入部位的正上方結(jié)扎，以隔斷大腦中動脈的底部。通過如下方法預(yù)先制備探針通過加熱將一根4-0尼龍縫線(Nitcho Kogyo Co.，Ltd.，Japan)的一端制成球形，并切割成17mm的長度(該長度不包括球形端)，然后把另一端大約7-9mm長的部分浸入硅酮(Bayer Dental，Xantopren)和硬化劑(Optosil-Xantopren Activator，Bayer Dental)的混合物中，以形成具有0.3-0.4mm厚度的包被。將該包衣端插到外頸動脈中以阻斷通過此處的血流。在誘發(fā)大腦局部缺血大約25到30分鐘后，測定神經(jīng)缺陷，并且把顯示神經(jīng)缺陷癥狀的實驗動物包括在局部缺血組。當提起大鼠的尾巴將其懸于空中時，通過觀察其左前臂是否彎曲，或者其身體是否自發(fā)地向左轉(zhuǎn)，來判定神經(jīng)缺陷。大腦中動脈被隔斷120分鐘后，在該動物由于異氟烷而處于麻醉狀態(tài)的同時，通過切開縫合部位，然后把探針的球狀端拉出大約10mm長，以使其再灌注，來制備短暫病灶性腦缺血大鼠模型。然后把手術(shù)部位縫合，一天后測定神經(jīng)缺陷。將腦組織從動物中取出并進行組織學染色。
誘發(fā)局部缺血30分鐘后，腹膜內(nèi)給藥0.9％鹽水(載體，1ml/kg)或10mg/kg槲皮素-3甲基醚或二氫槲皮素。
實施例1仙人掌果實提取物的制備及其保護神經(jīng)細胞的活性把新鮮的仙人掌果實(產(chǎn)自韓國Cheju島，在Kyeongdong市場上購得)精細切碎，并除去種子。室溫下，將7.8kg切碎的果實在40L甲醇中浸泡4到5天，然后過濾。將這樣的提取進行兩次以上，然后，把甲醇溶液合并在一起，在40℃用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮以獲得甲醇提取物。然后將498g仙人掌果實的甲醇提取物溶解入1L水中，并依次用二氯甲烷(CH2Cl2，600ml×3)、乙酸乙酯(EtOAC，600ml×3)和丁醇(BuOH，600ml×3)提取該所得水溶液。從相應(yīng)的有機提取物和最終水相中獲得若干不同的溶劑級份。按照參考實施例1-5中描述的方法，分別對DPPH自由基清除活性以及抑制黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶誘發(fā)的或過氧化氫誘發(fā)的神經(jīng)毒性進行測定。
如附圖1、2和表1所示，仙人掌果實的二氯甲烷(GD)級份、丁醇級份(GB)和水級份(GH)顯示了DPPH自由基清除活性或?qū)S嘌呤/黃嘌呤氧化酶誘發(fā)的或過氧化氫誘發(fā)的神經(jīng)毒性的抑制作用。另一方面，乙酸乙酯級份(GE)分別在IC5060.0μg/ml、IC5067.7μg/ml和IC50115.9μg/ml能夠有效地清除DPPH自由基，并顯著地抑制黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶誘發(fā)的或過氧化氫誘發(fā)的神經(jīng)毒性。這些結(jié)果證實，仙人掌果實的乙酸乙酯提取物在大腦皮層神經(jīng)元中表現(xiàn)出顯著的神經(jīng)保護作用，因此，能夠用于治療中風或阿爾茨海默氏病。
實施例2仙人掌加工過的果實提取物的制備及其保護神經(jīng)細胞的活性在室溫將15kg通過蒸汽、干燥和粉碎而獲得的仙人掌的加工過的果實(產(chǎn)自韓國Cheju島，在Kyeongdong市場購買)在20L甲醇中浸泡4到5天，然后過濾。在40℃將甲醇溶液下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮以獲得甲醇濃縮物。把412g甲醇提取物溶解入1.5L水中，然后依次用二氯甲烷(CH2Cl2，800ml×3)、乙酸乙酯(EtOAc，800ml×3)和丁醇(BuOH，800ml×3)提取該水溶液，以獲得各種溶劑級份。按照參考實施例1-5中描述的方法，分別對DPPH自由基清除活性，以及抑制黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶誘發(fā)的或過氧化氫誘發(fā)的神經(jīng)毒性進行測定。
除了水級份(SH)以外，所有得自仙人掌加工過的果實的級份都具有活性(表1)。在各種級份中，乙酸乙酯級份(SE)清除DPPH自由基最有效，并抑制黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶誘發(fā)的或過氧化氫誘發(fā)的神經(jīng)毒性。各自的IC50為58.0μg/ml、22.2μg/ml和21.2μg/ml。這些結(jié)果證實，仙人掌加工過的果實的乙酸乙酯提取物在大腦皮層神經(jīng)元中表現(xiàn)出了顯著的神經(jīng)保護作用，因此能夠用于治療中風或阿爾茨海默氏病。
實施例3仙人掌莖的提取物的制備及其保護神經(jīng)細胞的活性在室溫下，把36.2kg新鮮的仙人掌莖(產(chǎn)自韓國Cheju島，在Kyeongdong市場上購得)在20L甲醇中浸泡4到5天，然后過濾。將該提取重復(fù)兩次以上，然后在40℃將合并在一起的甲醇溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮以獲得甲醇濃縮物。把819.9g甲醇提取物溶解入1L水中，然后依次用二氯甲烷(CH2Cl2，600ml×3)、乙酸乙酯(EtOAc，800ml×3)和丁醇(BuOH，800ml×3)提取該水溶液，以獲得各種溶劑級份。按照參考實施例1-5中描述的方法，在每一級份中，分別對DPPH自由基清除活性，以及抑制黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶誘發(fā)的或過氧化氫誘發(fā)的神經(jīng)毒性進行測定。
如附圖3、4和表1所示，仙人掌莖的二氯甲烷級份(FD)、丁醇級份(FB)和水級份完全沒有顯示出DPPH自由基清除活性和抑制由黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶誘發(fā)的或由過氧化氫誘發(fā)的神經(jīng)毒性。從另一方面，乙酸乙酯級份(FE)顯著地清除DPPH自由基，并且有效地抑制由黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶誘發(fā)的或由過氧化氫誘發(fā)的神經(jīng)毒性，IC50分別為60.0μg/ml、15.2μg/m l和17.5μg/ml。得自莖的乙酸乙酯級份(FE)在抑制由黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶誘發(fā)的或由過氧化氫誘發(fā)的神經(jīng)毒性方面，與得自加工過的果實的乙酸乙酯級份相似，并且優(yōu)于得自果實的乙酸乙酯級份(GE)。這些結(jié)果顯示，仙人掌莖或加工過的果實的乙酸乙酯提取物在大腦皮層神經(jīng)元中表現(xiàn)出顯著有效的抑制神經(jīng)保護作用，因此能夠用于治療腦神經(jīng)系統(tǒng)疾病例如中風、腦震蕩、阿爾茨海默氏病或帕金森病。
實施例1-3中獲得的每一提取物級份的DPPH自由基清除活性，以及抑制黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶誘發(fā)的或過氧化氫誘發(fā)的神經(jīng)毒性列在表1中。
表1.
實施例4從仙人掌的乙酸乙酯提取物中分離對于神經(jīng)細胞表現(xiàn)出神經(jīng)保護活性的化合物由于仙人掌的果實、加工過的果實和莖的乙酸乙酯提取物對于神經(jīng)細胞顯示出高的保護活性，如下所述，分離具有這樣的活性的化合物。
<4-1>從仙人掌莖的乙酸乙酯提取物中分離出對神經(jīng)細胞具有保護活性的化合物使用甲醇作為展開溶劑，以Sephadex LH-20(目錄號LH-20-100，Sigma)作為固定相，對4.98g仙人掌的乙酸乙酯提取物進行柱色譜(4×5cm)純化。用正相硅膠TLC(使用二氯甲烷∶甲醇＝5∶1作為展開劑)和反相硅膠TLC(使用水∶甲醇＝40∶60作為展開劑)分析級份后，收集具有類似極性的化合物以獲得17個亞級份(亞級份1-17)。對具有較低極性的亞級份12進行反相柱色譜(LiChropreprp-18，40-63μm，2.5×35cm，目錄號13900，Merck)純化。用含水甲醇進行柱色譜純化，其中甲醇含量從40％逐漸增加至60％，然后將洗脫液按照極性分成12個亞級份(亞級份12A至12L)。使用含水甲醇作為展開劑，對亞級份12B進行Sephadex LH-20柱色譜(2.5×35cm)純化，獲得了3-氧代-α-ionol β-D-葡糖苷(90mg)。從級份12E中分離出純凈的二氫山柰酚(30.7mg)。使用含水甲醇作為展開劑，對亞級份12C進行Sephadex LH-20柱色譜(2.5×35cm)純化，獲得二氫槲皮素(77.5mg)。并且依次地，在相同的條件下對亞級份12I進行Sephadex LH-20柱色譜純化，使用50％的甲醇對其進行反相柱色譜純化(LiChroprepRP-18，40-63μm，2.5×35cm，目錄號13900，Merck)，獲得槲皮素3-甲基醚(59.3mg)。使用甲醇作為展開劑，對亞級份12K進行Sephadex LH-20柱色譜純化，并用制備RP-18 TLC(10×10cm×0.25cm，目錄號15423，Merck，50％MeOH)進行純化，獲得山柰酚3-甲基醚(5.2mg)。
此外，對具有較低極性的亞級份15進行Sephadex LH-20柱色譜(2.0×30cm，甲醇)和制備RP-18 TLC(10×10cm×0.25cm，目錄號15423，Merck，60％MeOH)純化，獲得了山柰酚(10mg)和槲皮素(10mg)。
<4-2>從仙人掌果實和加工過的果實中的乙酸乙酯提取物中分離出對神經(jīng)細胞具有保護活性的化合物對1.82g仙人掌果實的乙酸乙酯提取物進行Sephadex LH-20柱色譜(4.0×26.5cm，甲醇)純化。將獲得的級份進行正相硅膠TLC和反相硅膠TLC純化，同時改變展開劑的極性。收集具有類似極性的化合物，獲得了13個亞級份(亞級份1’-13’)。從亞級份11’中分離出2.4mg山柰酚，從亞級份12’中分離出3.6mg槲皮素。使用硅膠，對亞級份8’進行柱色譜(2×30cm)純化。當用二氯甲烷和甲醇的混合物(20/1)洗脫而同時逐漸增加極性時，獲得了二氫山柰酚(6.1mg)。使用硅膠，對亞級份9’進行色譜純化(1×18.5cm)。當用二氯甲烷和甲醇的混合物(20/1)洗脫而同時逐漸增加極性時，獲得了二氫槲皮素(2.2mg)、山柰酚3-甲基醚(0.6mg)和槲皮素3-甲基醚(3.0mg)。將仙人掌加工過的果實的乙酸乙酯提取物進行相同的分離步驟，獲得與仙人掌果實的乙酸乙酯提取物所得到的結(jié)果相同的結(jié)果。
實施例5對神經(jīng)細胞具有保護活性的化合物的結(jié)構(gòu)分析在Bruker 300光譜儀上記錄NMR光譜。用通常的脈沖序列獲得1H-1H COSY、HMQC和HMBC NMR。1H-NMR(300MHz)、13C-NMR(75MHz)和HMBC的相關(guān)光譜數(shù)據(jù)顯示于表2和3。
表2.
1H信號(δ)*
表3.
13C信號
以上結(jié)果的分析顯示，每一化合物的相應(yīng)結(jié)構(gòu)與先前所報道的是完全一樣的山柰酚(Okuyama等人，Chem.Pharm.Bull.263701，1978)；槲皮素(Grande等人，Planta Medica.51414，1985)；二氫山柰酚(Shen等人，Phytochemistry 24155，1985)；二氫槲皮素(Nonaka等人，Chem.Pharm.Bull.351105，1987)；山柰酚3-甲基醚(Grande等人，Planta Medica 51414，1985)；槲皮素3-甲基醚(Barbera等人，Phytochemistry 252357，1986)；以及3-氧代-α-ionolβ-D-葡糖苷(Pabst等人，Phytochemistry 311649，1992)。
實施例6從仙人掌果實、加工過的果實和莖分離出的化合物的抗氧化和神經(jīng)保護活性物用參考實施例1-8中描述的方法，分別評價DPPH自由基清除活性、超氧化物陰離子自由基清除活性，以及在培養(yǎng)的神經(jīng)元中抑制由黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶、過氧化氫、NMDA或生長因子的去除誘發(fā)的神經(jīng)毒性的活性。
發(fā)現(xiàn)槲皮素、二氫槲皮素和槲皮素3-甲基醚顯示出有效的DPPH自由基清除活性，二氫槲皮素和槲皮素3-甲基醚顯示出通過黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)有效地清除來自黃嘌呤的超氧化物陰離子自由基的活性(表4)。如表5以及附圖5和6所示，已經(jīng)證明了山柰酚、槲皮素、二氫槲皮素和槲皮素3-甲基醚可以很強地抑制由過氧化氫或黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶誘發(fā)的神經(jīng)毒性。此外，結(jié)果表明二氫槲皮素和槲皮素3-甲基醚能抑制由NMDA誘發(fā)的神經(jīng)毒性，特別是，槲皮素3-甲基醚還抑制了由生長因子的去除(withdrawal)而誘發(fā)的神經(jīng)毒性。
表4.
表5.
實施例7槲皮素3-甲基醚的體內(nèi)神經(jīng)保護活性用TTC(2，3，5-三苯基四唑氯化物)染色法(Bederson等人，Stroke171304，1986)測定由短暫病灶性腦缺血引起的腦損傷。將大腦中動脈閉塞一天后，用鍘除刀將鼠處死，然后從中取出腦。使用腦基質(zhì)(ASIInstruments，Warren，MI，USA)，從距離額極1mm的點開始，將取出的腦依次切割至2mm厚度來制備腦冠狀切片。在37℃，將每一切片用2％的TTC在0.9％的鹽水溶液中處理并培養(yǎng)60分鐘以便染色。將用TTC染色的每一切片用磷酸鹽緩沖的福爾馬林溶液固定，并用裝備了CCD照相機的電腦獲得其反側(cè)影象。使用影象分析軟件(Optimas，Edmonds，WA，USA)來測定沒有發(fā)生深紅色染色的大腦皮層和紋狀體的梗塞面積(cm2)，然后乘以切片的厚度來計算梗塞的體積(mm3)。最后，計算全部梗塞體積作為大腦皮層和紋狀體的梗塞總量。在這個時候，如下計算校正的梗塞以便對腫脹作校正通過從左大腦半球(對側(cè)的非局部缺血側(cè))的總面積中扣除右大腦半球(同側(cè)的局部缺血側(cè))的正常組織面積，計算每一切片的校正的總梗塞面積，然后按照上面所述的相同方法，從校正的總梗塞面積計算校正的總梗塞體積。
另外，用下面的公式計算由局部缺血誘發(fā)的大腦半球的腫脹率。
A所有冠狀切片中同側(cè)缺血腦半球的體積(mm3)B所有冠狀切片中對側(cè)正常腦半球的體積(mm3)表6.
實施例8槲皮素3-甲基醚的神經(jīng)恢復(fù)作用如下所述，使用測量神經(jīng)評分的方法(Relton等人，Stroke 281403，1997)，測定槲皮素3-甲基醚在按照實施例7的方法治療的大鼠中的神經(jīng)恢復(fù)作用。
檢測前肢彎曲(當提起大鼠的尾巴將其完全懸在空中時)、前肢彎曲的持續(xù)時間(在10秒期間前肢彎曲的時間)和運動的對稱性(當使大鼠僅用前肢行走的同時通過提起尾巴將其后肢懸在空中時)，將觀察到的分數(shù)概括于表7中。
表7.
通過把表7顯示的分數(shù)加起來，將每一組的最終神經(jīng)分數(shù)顯示于表8(每一試驗分數(shù)用平均值±標準誤差的形式表示)，并且還將其描繪于附圖12中。10分表示正常(無神經(jīng)缺陷)，分數(shù)越低，神經(jīng)缺陷的程度就越大。
表8
如表8和圖12所示，用槲皮素3-甲基醚治療的組與對照組比較，表現(xiàn)出顯著較高的神經(jīng)分數(shù)，證明槲皮素3-甲基醚發(fā)揮了神經(jīng)恢復(fù)作用。
盡管對本發(fā)明的實施方案進行了描述和舉例說明，但很明顯，在不背離本發(fā)明的實質(zhì)的前提下，可以對其做出各種變化和修改，其應(yīng)當僅由權(quán)利要求書來限制。
權(quán)利要求
1.仙人掌的乙酸乙酯提取物在預(yù)防和治療腦疾病、缺血性疾病和心血管系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用。
2.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述仙人掌的乙酸乙酯提取物包含山柰酚、二氫槲皮素或槲皮素3-甲基醚作為有效成分。
3.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述仙人掌的乙酸乙酯提取物是仙人掌莖、果實或加工過的果實的乙酸乙酯提取物。
4.權(quán)利要求3的應(yīng)用，其中所述仙人掌的乙酸乙酯提取物是通過包括下列步驟的方法獲得的1)在室溫下，將仙人掌的莖、果實或加工過的果實在0.1-10L的醇類溶劑中浸泡4-5天，以獲得提取混合物，2)過濾該提取混合物，然后從濾液中除去醇以獲得醇提取物，和3)將0.1-10L水加到醇提取物中，用0.5-2L乙酸乙酯(EtOAc)提取生成的水溶液。
5.權(quán)利要求4的應(yīng)用，其中所述醇類溶劑是C1-3醇或C1-3醇的水溶液。
6.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述疾病是中風、腦震蕩、阿爾茨海默氏病、帕金森病、心肌梗塞或腦梗塞。
7.選自下列的化合物在預(yù)防和治療腦疾病、缺血性疾病和心血管系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用山柰酚、二氫槲皮素、槲皮素3-甲基醚、它們的可藥用鹽、水合物、溶劑化物、立體異構(gòu)體及其混合物。
8.權(quán)利要求7的應(yīng)用，其中所述疾病是中風、腦震蕩、阿爾茨海默氏病、帕金森病、心肌梗塞或腦梗塞。
全文摘要
本發(fā)明涉及仙人掌的乙酸乙酯提取物和由其分離的化合物在預(yù)防和治療腦疾病例如阿爾茨海默氏病、中風和帕金森病，由局部缺血引起的細胞和組織損傷，或心血管系統(tǒng)疾病例如心肌梗塞中的應(yīng)用。
文檔編號A61P25/28GK1596110SQ02823663
公開日2005年3月16日 申請日期2002年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月29日
發(fā)明者李龍燮, 樸虎君, 秦昶培, 金亨子, 趙貞淑, 樸美貞, 宋侖宣 申請人:韓國科學技術(shù)研究院