專利名稱：過氧化物酶體增殖劑應答性受體配體劑及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及過氧化物酶體增殖劑應答性受體配體劑(增殖剤応答性受容體リガンド剤)及其制備方法，進一步講本發(fā)明涉及含有以過氧化物酶體增殖劑應答性受體配體劑為有效成分的、用于改善胰島素抗性或，預防和/或改善胰島素抗性綜合征(2型糖尿病、高胰島素血癥、脂肪代謝異常、肥胖、高血壓、動脈硬化性疾病)的組合物。
背景技術：
過氧化物酶體增殖劑應答性受體配體劑(peroxisomeproliferator-activated receptor，PPAR)是屬于核內受體家族的配體依賴性轉錄調控因子，作為對維持脂肪代謝的基因組表達起調控作用的轉錄調控因子被鑒定出的。已知哺乳動物中存在PPARα、PPARδ(PPARβ、NUC-1、FAAR)、PPARγ3種亞型，PPARα主要在肝臟中表達，PPARδ普遍存在。PPARγ存在PPARγ1和PPARγ2兩種isoform，PPARγ1除在脂肪組織表達外，還在免疫器官、副腎、小腸等組織表達。PPARγ2在脂肪組織特異表達，是調控脂肪細胞分化、成熟的主要調控子(河田照雄，醫(yī)學のぁゆみ，184，519-523，1998)。
作為PPAR γ配體，合成化合物已知有トロゲリタゾン、ピオゲリタゾン、ロシゲリタゾン等四氫噻唑衍生物。天然化合物已知有15-脫氧-Δ12，14-前列腺素J2和Δ12-前列腺素J2等花生四烯酸代謝物，ω-3多價不飽和脂肪酸，α-亞麻酸，二十碳五烯酸(EPA)、二十碳六烯酸(DHA)等不飽和脂肪酸，9-羥基十ハデカジエン酸和13-羥基十ハデカジエン酸等二十烷類等(J.Auwerx，Diabetologia，42，1033-1049，1999)。特開2000-355538中公開了具有共價トリエン結構或共價四烯化物結構的碳數為10-26的共價不飽和脂肪酸。另外，有這樣的報道，黃酮類化合物中黃酮衍生物白楊黃素(chrysin)和芹黃素(apigenin)，黃酮醇衍生物4，5，7-三羥基黃酮(kaempferol)為PPARγ配體(Y.C.Liang，et al.，F(xiàn)EBS Letters，496，12-18，2001)。黃酮類是植物中廣泛存在的成分，具有抗氧化作用。但是，到目前為止尚不知僅在特定植物中含有的異戊二烯類黃酮為PPARγ配體。
PPARγ配體四氫噻唑衍生物，由于其激動劑活性和血糖降低作用相關，所以人們關注其與胰島素抗性改善作用的關系，作為2型糖尿病(胰島素非依賴性糖尿病，NIDDM)的胰島素抗性改善藥進行開發(fā)。也就是說，PPARγ配體四氫噻唑衍生物通過活化PPARγ而使從前體脂肪細胞分化而來的具有正常功能的小型脂肪細胞增加，通過誘導引發(fā)胰島素抗性的、TNFα和游離脂肪酸產生和分泌亢進的肥大脂肪細胞的凋亡而使之減少，從而改善胰島素抗性(A.Okuno，et al.，Journal of Clinical Investigation，101，1354-1361，1998)。另外，由于PPARγ配體改善胰島素抗性，所以它不僅對2型糖尿病有效，而且對預防、改善高胰島素血癥、脂肪代謝異常、肥胖(特別是內臟脂肪型肥胖)、高血壓、動脈硬化性疾病等胰島素抗性綜合征(R.A.DeFronzo&E.Ferrannini，Diabetes Care，14，173-194，1991)有效。與胰島素抗性綜合征同樣的疾病概念包括綜合征X(G.M.Reaven，Diabetes，37，1595-1607，1988)、致命四重奏(N.M.Kaplan，Archives of Internal Medicine，149，1514-1520，1989)、內臟脂肪綜合征(Y.Matsuzawa，Diabetes/MetabolismReviews，13，3-13，1997)。
再者，由于PPARγ配體可抑制炎癥性細胞因子的產生(C.Jiang，et al.，Nature，391，82-86，1998)，通過誘導凋亡而抑制腫瘤細胞的增殖(Y.Tsubouchi，et al.，BiOCHemical and Biophysical Research Communications，270，400-405，2000)，所以對炎癥和癌癥的預防和改善也有效。
發(fā)明概述鑒于上述，PPARγ配體具有改善胰島素抗性，預防和/或改善以2型糖尿病為首的、高胰島素血癥、脂肪代謝異常、肥胖(特別是內臟脂肪型肥胖)、高血壓、動脈硬化性疾病等胰島素抗性綜合征有效。本發(fā)明的課題是提供源自天然產物的PPAR配體劑，及其簡便且高效的制備方法，還提供含有以此為有效成分的、用于改善胰島素抗性或，預防和/或改善胰島素抗性綜合征的組合物。
本發(fā)明者們從具有食用經驗的天然物中探索具有PPARγ配體活性的物質，結果發(fā)現(xiàn)以甘草為代表的植物提取物中具有PPARγ配體活性。本發(fā)明者們對其活性成分進行了深入研究，結果發(fā)現(xiàn)該提取物中的特定成分具有PPARγ配體活性。本發(fā)明者們還發(fā)現(xiàn)，從甘草中提取這些有效成分時，用有機溶劑，優(yōu)選脂肪酸酯和水溶性有機溶劑，なかんずく尤其是用水溶性有機溶劑可高效抽提。由此，完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明的第1方面涉及過氧化物酶體增殖劑應答性受體配體劑，它由異戊二烯類黃酮化合物(prenylflavonoid)、非異戊二烯類黃酮的黃酮醇衍生物、非異戊二烯類黃酮的查耳酮衍生物、醫(yī)藥上或飲食上許可的其鹽類、糖苷和/或酯化體構成的。
第2方面涉及植物來源的提取物，它含有由異戊二烯類黃酮化合物、非異戊二烯類黃酮的黃酮醇衍生物、非異戊二烯類黃酮的查耳酮衍生物、醫(yī)藥上或飲食上許可的其鹽類、糖苷和/或酯化體構成的過氧化物酶體增殖劑應答性受體配體劑。
第3方面涉及用于改善胰島素抗性或，預防和/或改善胰島素抗性綜合征的組合物，它以異戊二烯類黃酮化合物、非異戊二烯類黃酮的黃酮醇衍生物、非異戊二烯類黃酮的查耳酮衍生物、醫(yī)藥上或飲食上許可的其鹽類、糖苷和/或酯化體作有效成分，該有效成分具有與過氧化物酶體增殖劑應答性受體的配體結合區(qū)域結合的能力。
第4方面涉及用于預防和/或改善炎癥或癌癥的組合物，它以異戊二烯類黃酮化合物、非異戊二烯類黃酮的黃酮醇衍生物、非異戊二烯類黃酮的查耳酮衍生物、醫(yī)藥上或飲食上許可的其鹽類、糖苷和/或酯化體作有效成分，該有效成分具有與過氧化物酶體增殖劑應答性受體的配體結合區(qū)域結合的能力。
第5方面涉及上述提取物的制備方法，它用皮面積的比例占總表面積3成以上的甘草抽提。
第6方面涉及上述提取物的制備方法，它用脂肪酸酯或水溶性有機溶劑從甘草中抽提。
第7方面涉及上述提取物的制備方法，它用含水率在30％(體積比)以下的有機溶劑從甘草中抽提。
發(fā)明詳述以下，詳細說明本發(fā)明的實施方案。
PPAR配體劑(優(yōu)選PPARγ配體劑)是具有PPAR配體活性(優(yōu)選PPARγ配體活性)的化合物，即具有與PPAR(優(yōu)選PPARγ)的配體結合區(qū)域結合的能力。PPARγ配體活性的檢測，例如可以用報告子測定法，該法利用熒光素酶的表達來評價PPARγ配體結合區(qū)域與GAL4的融合蛋白的結合(B.M.Forman，et al.，Cell，83，803-812，1995)；也可利用應用包含PPARγ配體結合區(qū)域的蛋白的競爭性結合測定法(S.A.Kliewer，et al.，Cell，83，813-819，1995)等進行測定。這些測定法中，將樣品的活性與一般的溶劑對照相比較，顯示活性比溶劑對照高，且呈現(xiàn)用量依賴性的樣品評價為“具有PPARγ配體活性”。
本發(fā)明的PPAR配體劑，優(yōu)選PPARγ配體劑，是選自異戊二烯類黃酮化合物、非異戊二烯類黃酮的黃酮醇衍生物、非異戊二烯類黃酮的查耳酮衍生物、醫(yī)藥上或飲食上許可的其鹽類、糖苷和/或酯化體的至少一種化合物。
對醫(yī)藥上或飲食上許可的鹽類無特殊限定，例如鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽等。
對醫(yī)藥上或飲食上許可的糖苷無特殊限定，例如葡萄糖、半乳糖等單糖的糖苷，或二糖和寡糖的糖苷等。
對醫(yī)藥上或飲食上許可的酯化體無特殊限定，例如醋酸酯、丙酸酯、磷酸酯、硫酸酯等。
含有以上述化合物中的至少一種作有效成分的本發(fā)明的組合物，由于能改善胰島素抗性，所以可作為以糖尿病為代表的胰島素抗性綜合征的預防和/或改善劑應用。
對本發(fā)明的PPAR配體，異戊二烯類黃酮化合物無特殊限定，但優(yōu)選選自3-芳基香豆素(arylcoumarin)衍生物、イソフラブ-3-ニン衍生物、異黃烷(isoflavan)衍生物、異黃烷酮(isoflavanon)衍生物、異黃酮(isoflavone)衍生物、黃酮醇衍生物、黃烷酮(flavanone)衍生物、查耳酮衍生物、二苯甲酰甲烷衍生物中的至少一種化合物。
這里所講的異戊二烯類黃酮化合物是指黃酮類的側鏈具有下述(A)或(B)的化合物中至少一個(A)異戊二烯基；(B)異戊二烯基與與之鄰位的羥基結合通過[-CH＝CHC(CH3)2O-]形成6元環(huán)結構。類黃酮化合物是2個苯基靠3個碳原子結合而成的物質的總稱，例如黃酮、黃酮醇、黃烷酮、黃烷酮醇(flavanonol)、異黃酮、異黃酮醇、異黃烷酮、異黃烷(isoflavan)、イソフラブ-3-ニン(isoflav-3-ene)、3-芳基香豆素、查耳酮、二氫查耳酮、二苯甲酰甲烷、クメスタン(coumestan)、紫檀素(pterocarpan)、兒茶素(catechin)、花青素等(anthocyanidin)。
對本發(fā)明中應用的異戊二烯類黃酮化合物3-芳基香豆素衍生物無特殊限定，但優(yōu)選下列普通結構式(1)中代表的化合物，例如グリシクマリン(glycycoumarin)、グリシリン(glycyrin)、(gancaonin W)、glyasperin L、(kanzonol W)等表1中所示的化合物。也可以是其鹽、糖苷和酯化物。其中，優(yōu)選リシクマリン(glycycoumarin)或グリシリン(glycyrin)。
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表1

對本發(fā)明中應用的異戊二烯類黃酮化合物イソフラブ-3-ニン衍生物無特殊限定，但優(yōu)選下列普通結構式(2)中代表的化合物，例如デヒドログリアスプリンC(dehydroglyasperin C)、デヒドログリアスプリンD(dehydroglyasperin D)、グラブレン(glabrene)、RL-S等表2中所示的化合物。還包括這些化合物的鹽、糖苷、酯化體等衍生物。其中，更優(yōu)選デヒドログリアスプリンC或デヒドログリアスプリンD或グラブレン。另外，デヒドログリアスプリンD是本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)的新型化合物。
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表2

對本發(fā)明中應用的異戊二烯類黃酮化合物異黃烷衍生物無特殊限定，但優(yōu)選下列普通結構式(3)中代表的化合物，例如グリアスプリンC(glyasperin C)、グリアスプリンD(glyasperin D)、グリアスプリンI(glyasperin I)、licoricidin、licorisoflavan A等表3中所示的化合物。還包括這些化合物的鹽、糖苷、酯化體等衍生物。其中，更優(yōu)選グリアスプリンD、グラブリジン(glabridin)、ヒスパグラブリジン B(hispaglabridin B)、4’-O-甲基グラブリジン(4’-O-methylglabridin)、3’羥基-4’-O-甲基グラブリジン(3’-hydroxy-4’-O-methylglabridin)。


*鹽酸鹽**富馬酸鹽實施例34-(3’-氯苯基)-α，1-二甲基-4-哌啶基甲醇乙酸酯(m＝2；R1，R5＝Me；R4＝3-ClC6H4；R2，R3，R6＝H，R7＝CH3CO)回流加熱1.00g4-(3’-氯苯基)-α，1-二甲基-4-哌啶基甲醇(實施例1)和5mL乙酸酐的混合物90分鐘。除去過量的乙酸酐并對殘余物窄餾分蒸餾(浴溫170℃，1微米)得到1.05g油狀標題化合物。1HNMR(CDCl3)δ7.1-107.4(m，4H)；4.9(四重峰，J＝7Hz，1H)；2.8(m，2H)；2.2(s，3H)；2.0(s，3H)；1.9-2.4(m，6H)；和0.9(d，J＝.7Hz，3H).在異丙醇中結晶后其富馬酸鹽的熔點為194℃(dec.)。C20H26ClNO6計算值C，58.23；H，6.36。測量值C，58.32；H，6.41.
實施例44-(3′-氯苯基)-α，α，1-三甲基-4-哌啶基甲醇乙酸酯(m＝2；R1，R5，R6＝Me；R2，R3＝H；R4＝3-ClC6H4；R7＝CH3CO)回流加熱1.04g4-(3′-氯苯基)-α，α，1-三甲基-4-哌啶基甲醇(實施例2)和10mL乙酸酐的混合物2小時。除去過量的乙酸酐接著窄餾分蒸餾殘余物(浴溫170℃，1微米)得到

對本發(fā)明中應用的異戊二烯類黃酮化合物異黃烷酮衍生物無特殊限定，但優(yōu)選下列普通結構式(4)中代表的化合物，例如グリアスプリンB(glyasperin B)、グリアスプリンK(glyasperin K)、kanzonol G、3’-prenyl-kievitone、グリアスプリンF(glyasperin F)等表4中所示的化合物。還包括這些化合物的鹽、糖苷、酯化體等衍生物。其中，更優(yōu)選グリアスプリンB、甘草異黃烷酮(glycyrrhisoflavanone)。
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表4

對本發(fā)明中應用的異戊二烯類黃酮化合物異黃酮衍生物無特殊限定，但優(yōu)選下列普通結構式(5)中代表的化合物，例如wighteone、gancaonin A、gancaonin B、gancaonin G、gancaonin N等表5中所示的化合物。還包括這些化合物的鹽、糖苷、酯化體等衍生物。其中，更優(yōu)選グリウラリンB(glyurallin B)、ルピヮイテオン(lupiwighteone)、半甘草異黃酮B(semilicoisoflavone B)或甘草異黃酮(glycyrrhisoflavone)。
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表5


對本發(fā)明中應用的異戊二烯類黃酮化合物黃酮醇衍生物無特殊限定，但優(yōu)選下列普通結構式(6)中代表的化合物，例如甘草黃酮醇(licoflavonol)、gancaonin P、トパゾリン(topazolin)、グリアスプリン(glyasperin A)、異甘草黃酮醇(isolicoflavonol)等表6中所示的化合物。還包括這些化合物的鹽、糖苷、酯化體等衍生物。其中，更優(yōu)選甘草異黃酮醇、甘草黃酮醇、或トパゾリン。
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表6


對本發(fā)明中應用的異戊二烯類黃酮化合物黃烷酮衍生物無特殊限定，但優(yōu)選下列普通結構式(7)中代表的化合物，例如6-prenylpinocembrin、6-prenylnaringenin、6-prenyleriodictyol、sinoflavanone B、paratocarpin L等表7中所示的化合物。還包括這些化合物的鹽、糖苷、酯化體等衍生物。其中，更優(yōu)選グラブロ-ル(glabrol)。
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表7


對本發(fā)明中應用的異戊二烯類黃酮化合物查耳酮衍生物無特殊限定，但優(yōu)選下列普通結構式(8)中代表的化合物，例如甘草查耳酮C(licochalconeC)、甘草查耳酮D(licochalcone D)、glyinflanin G、kanzonol B、kanzonol C等表8中所示的化合物。還包括這些化合物的鹽、糖苷、酯化體等衍生物。其中，更優(yōu)選甘草查耳酮C。
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表8

對本發(fā)明中應用的異戊二烯類黃酮化合物二苯甲酰甲烷衍生物無特殊限定，但優(yōu)選下列普通結構式(9)中代表的化合物，例如甘草二酮A(glycyrdione A)、甘草二酮B(glycyrdione B)、甘草二酮C(glycyrdione C)、glyinflanin B、glyinflanin D等表9中所示的化合物。還包括這些化合物的鹽、糖苷、酯化體等衍生物。其中，更優(yōu)選甘草二酮A或甘草二酮C。
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表9

對本發(fā)明中應用的非異戊二烯類黃酮查耳酮衍生物無特殊限定，如包括刺凌德草堿(echinatin)、イソリクイリチゲニン(isoliquiritigenin)、甘草查耳酮A(licochalconeA)、甘草查耳酮B(licochalconeB)等。還包括這些化合物的鹽、糖苷、酯化體等衍生物。
對本發(fā)明中應用的非異戊二烯類黃酮黃酮醇無特殊限定，如莰非醇3-O-甲基酯(kaempferol 3-O-methylester)。還包括這些化合物的鹽、糖苷、酯化體等衍生物。
此外，這些化合物的名稱參照平賀敬夫及梶山喜一郎的報告(明治藥科大學紀要，27，9-57，1997)和T.Nomura，T.Fukai的報告(Fortschritte derChemie organischer Naturstoffe，73，1-158，1998)。
本發(fā)明的PPAR配體劑若是上述化合物的話，無論是植物等天然來源的，還是化學合成或通過細胞培養(yǎng)等生物合成的化合物均可使用，但優(yōu)選有食用經驗的天然來源的。對獲得這些化合物的方法無特殊限定，可從有食用經驗的豆科的甘草獲得，也可從其它植物獲得。對其它植物無特殊限定，只要是含有PPAR配體劑，優(yōu)選含有PPARγ配體劑的植物即可，除了豆科植物以外，包括如桑樹科、杜仲科、大麻科、イラクサ科(Urticaceae family)的植物。
以下，以從甘草中獲得為例，對本發(fā)明的PPAR配體劑的制備方法進行說明，但并不限定于甘草。
所使用的甘草使用豆科甘草屬(Glycyrrhiza屬)的植物較好，例如甘草(Glycyrrhizauralensis Fisch.et DC，ウラル甘草)，(G.inflate BAT，脹果甘草)、(G.glabra L.，洋甘草)，(G.glabra L.var glandu rifera Regel et Herder，ナンキン甘草)，(G.echinata L.，シナ甘草)，(G.pallidiflora Maxim，刺果甘草)和其它同屬植物(Leguminosae)。產地有，例如新疆產、中國東北產、中國西北產、蒙古產、俄羅斯產、阿富汗產、伊朗產、土耳其產等。尤其優(yōu)選如上所述的PPAR配體活性成分的含量高的G.ウラレンシス(產地中國東北、中國西北、蒙古、新疆等)、G.グラブラ(產地俄羅斯、阿富汗、伊朗、土耳其等)、G.インフラタ((產地新疆等)，特別優(yōu)選應用G.ウラレンシス(G.uralensis)。
本發(fā)明中優(yōu)選應用上述甘草的根、根莖或桿，可應用它們的微粉碎品、粉碎品、切斷品或上述甘草的周皮。這里所講的微粉碎品是指所謂的粉末或接近粉末的物品，粉碎品指絲狀或纖維狀或綿狀的物品(例如，長度5mm-10cm的物品)。切斷品是指將甘草的根、根莖或桿等切斷而形成的物品(例如，切成長度普通情況下1-10cm，優(yōu)選1-5cm，更優(yōu)選2-4cm，厚度普通的大約3cm以下，優(yōu)選2cm以下，更優(yōu)選1cm以下)，具有普通圓柱狀或與之基本上類似的形態(tài)。使用普通的機器可獲得微粉碎品、粉碎品、切斷品。微粉碎品可通過例如，大容量裝填粉碎機、石臼式粉碎機等獲得粉末或接近粉末的物品；粉碎品可通過例如，錘密耳式粉碎機獲得。另外，切斷品可利用通常的裁斷機將上述甘草的根切成上述長度而獲得。
另外，上述甘草其有效成分的組成和含有量會因其種類、產地、采集時間等而有所差異，所以優(yōu)選使用通過預實驗確定出含有效成分多的甘草。
作為提取方法包括用有機溶劑從甘草進行抽提的方法，也可用有機溶劑從預先用水等抽提的水抽提殘渣、或使殘渣干燥后從中進行抽提。
這里所應用的有機溶劑無特殊限制，但優(yōu)選醫(yī)藥品和食品、食品添加物等制備、加工中所使用的安全的有機溶劑，例如丙酮、碳原子數1-4個的1元醇、甘油、脂肪酸酯、二乙基乙醚、環(huán)己烷、二氧化碳、丙二醇等，也可將這些溶劑中至少2種以上混合使用。其中，適于使用的溶劑為醋酸乙酯等脂肪酸酯和碳原子數1-4個的1元醇、丙酮、丙二醇、甘油等水溶性有機溶劑，特別優(yōu)選上述水溶性有機溶劑。
抽提后用活性炭和樹脂等進行吸附處理，和/或通過分級進行純化，以使提取物中活性成分含量高。通過硅膠、ODS、離子交換樹脂等柱層析法可從提取物濃縮、分級或分離出目的化合物。
當然也可利用其它化學合成的方法得到這些目的化合物。
以下，以用脂肪酸酯或水溶性有機溶劑抽提甘草的方法作為含有本發(fā)明中PPAR配體劑的甘草提取物的優(yōu)選制備方法，對其進行詳細說明。用脂肪酸酯或水溶性有機溶劑抽提出的甘草提取物有顯示良好的PPAR配體活性的趨勢，特別是使用水溶性有機溶劑可有效獲得PPAR配體活性物質，所以優(yōu)選之。
用脂肪酸酯或水溶性有機溶劑從甘草提取目的物質時，可直接從甘草的微粉碎品、粉碎品、切斷品或周皮等進行抽提，也可如上所述，預先用其它溶劑(例如，水、堿性水溶液等)進行抽提，然后通過用脂肪酸酯或水溶性有機溶劑從預抽提后的甘草預抽提殘渣進行抽提，以除去不純物等。
用其它溶劑(水、堿性水溶液等)對甘草進行抽提后，通過一般的分離操作(例如，加壓過濾、減壓過濾、濾器加壓、離心、沉降等)可分離出抽提液和甘草預抽提殘渣，得到甘草預抽提殘渣。在上述分離操作中，必要時可使用活性炭、活性白土等常規(guī)使用的過濾輔助劑和吸附劑等。
直接或經過一般的干燥操作(例如，靜置干燥、攪拌干燥、混合干燥、流動干燥、氣流干燥、噴霧干燥、冷凍干燥、冷凍濃縮等)從所得甘草預抽提殘渣中全部或部分除去所使用的其它溶劑(水、堿性水溶液等)，然后用脂肪酸酯或水溶性有機溶劑進行抽提。
對本抽提方法中適于應用的脂肪酸酯或水溶性有機溶劑無特殊限制，如乙酸乙酯等醋酸酯、碳原子數1-4個的1元醇、丙酮、丙二醇、甘油等，或其混合物，優(yōu)選乙醋酸等醋酸酯、碳原子數1-4個的1元醇、丙酮或其混合物，更優(yōu)選乙酸乙酯、乙醇、丙酮或其混合物。特別是從溶劑對人體安全的觀點出發(fā)優(yōu)選乙醇。從后述降低甘草皂苷等水溶性雜質的混入這一點考慮，優(yōu)選碳原子數2-4個的1元醇、脂肪酸酯、丙酮，特別優(yōu)選脂肪酸酯和丙酮，還優(yōu)選醋酸酯和丙酮，尤其優(yōu)選乙酸乙酯和丙酮。不用說，在不帶來負面影響的范圍內，與其它溶劑共存也無妨。
因此，本發(fā)明中增加甘草提取物中有效成分的含量，且降低甘草皂苷等水溶性雜質的含量非常重要。
甘草皂苷作為醫(yī)藥利用的話有血壓升高作用、心肌障礙、水血癥(Harders，H.&Rausch-Stroomann，J.G.，Munch.Med.Wschr.95，580(1953))、低鈣血癥、血漿腎素活性減少、偽性醛固酮癥、四肢遲緩性麻痹(Conn，J.W.，Rovner，D.R.&Cohen，E.L.，J.Am.Med.Assoc.205，492(1968))、尿中醛固酮排泄減少、浮腫、頭痛、嗜睡(Epatein，M.T.，et al.，Brit.Med.J.，1，488(1977))等副作用，另外，其甜度是生糖的150倍。混入甘草皂苷后不僅阻礙甘草提取物的各種效果，而且由于其副作用和高甜度不利于作為食品等利用。
為了增加甘草提取物中有效成分的含量，且降低甘草皂苷等水溶性雜質的含量，在用有機溶劑進行抽提時，優(yōu)選降低共存的水分含量。因此，一般應用極其干燥的甘草，再者使用不含水分的有機溶劑很重要。
但是，不用說甘草是植物體，為了獲得極其干燥的甘草，不僅通常進行的太陽曬干十分必要，而且有必要使用干燥器。這在工業(yè)規(guī)模的生產上是個大難點。
另外，即便使用不含水分的有機溶劑，從所用的甘草和作業(yè)環(huán)境中完全防止水分混入是很困難的，所以作為水分含量增加了的有機溶劑進行回收。直接將這種有機溶劑進行再循環(huán)很難，要么放棄使用，要么要用特殊的高價純化設備進行無水化處理，無論哪種情況均會升高制備成本。
因此，若能極其簡便且廉價地制備有效成分含量高、水溶性雜質含量低的高品質甘草提取物，將是非常大的優(yōu)點，這是大家所期待的。
為了獲得上述高品質的甘草提取物，本發(fā)明者們進行了深入研究，結果發(fā)現(xiàn)從甘草的形態(tài)講，使用皮面積占總表面積的比例高的甘草較好，普通在3成(30％)以上，優(yōu)選使用5成以上，更優(yōu)選7成以上，尤其優(yōu)選8成以上，特別是9成以上的甘草(具體而言，上述切斷品(cut product)和周皮(periderm)(包括以周皮為主的))。而且，若使用上述形態(tài)的甘草，即便使用含水的水溶性有機溶劑也可獲得高品質的甘草提取物。
上述切斷品和周皮(包括以周皮為主的)中，優(yōu)選使用加工較容易的切斷品，使用切斷品時，皮面積占總表面積的比例普通在5成以上，優(yōu)選使用7成以上，更優(yōu)選8成以上，尤其優(yōu)選9成以上的。
依照該方法，特別是使用上述水溶性有機溶劑時，優(yōu)選使用碳原子數2-4個的1元醇、更優(yōu)選使用乙醇，可最大限度發(fā)揮其效果。
所用有機溶劑的含水率，普通的在30％(體積)以下，優(yōu)選約20％以下，更優(yōu)選10％以下，特別優(yōu)選8％以下的。對其下限無特殊限制，從實用的觀點出發(fā)，普通的約3％，優(yōu)選4％。
通過該方法，適宜獲得有效成分含量高、水溶性雜質含量低的高品質甘草提取物。所得提取物中甘草皂苷的含量優(yōu)選最小化到0.5％以下。另外，(不用特別干燥甘草)即便使用廉價地含水的水溶性有機溶劑作抽提溶劑也適宜獲得高品質甘草提取物。
用上述脂肪酸酯或水溶性有機溶劑進行抽提時，可按照一般的方法實施，對此無特殊限制。對抽提溫度無特殊限制，從系統(tǒng)的固化溫度到沸點，一般為-20℃-100℃，普通1-80℃，優(yōu)選20-60℃。
對上述甘草或甘草預抽提殘渣進行抽提操作時，可應用例如1-20倍體積的上述脂肪酸酯或水溶性有機溶劑，優(yōu)選2-10倍體積(基于甘草體積或預提取殘余物體積)，如抽提0.1小時以上，優(yōu)選0.2小時以上，更優(yōu)選0.5小時以上。通常，每1次的抽提時間適宜在1-10小時。對上限無特殊限制，可以是1天，或更長時間。必要的情況下可進行1次或數次抽提，或適當組合應用所用的溶劑進行。對抽提的壓力無特殊限制，可在常壓-加壓狀態(tài)(1-數個大氣壓)下進行，若希望的話也可在減壓下進行。在環(huán)流下或加壓狀態(tài)下實施。
上述抽提后，通過一般的分離操作(例如，加壓過濾、減壓過濾、離心、沉降等)分離抽提液和甘草抽提殘渣，根據需要用上述溶劑進行洗滌，可獲得甘草抽提液。在上述分離操作中，必要時可使用活性炭、活性土、樹脂等常規(guī)使用的過濾輔助劑和吸附劑等。
通過一般的溶劑去除操作(例如，常壓濃縮、減壓濃縮、噴霧干燥、冷凍干燥、冷凍濃縮等)從所得的甘草抽提液中去除所使用的溶劑，獲得去除了溶劑的甘草提取物。另外，優(yōu)選如上抽提后，通過用活性炭和樹脂等進行吸附處理和/或分級等進行純化，以提高提取物中活性成分的含有量。
另外，本發(fā)明的制備方法中，從活性成分的穩(wěn)定性方面考慮，上述的一系列操作，尤其是用溶劑進行抽提，或用溶劑進行抽提及其后面的操作(抽提液的分離、溶劑去除、用活性炭和樹脂等進行吸附處理和/或分級等)優(yōu)選在應用氮氣等惰性氣體等脫氧氛圍下進行?？稍诳箟难?、抗壞血酸鈉、抗壞血酸棕櫚酸酯、抗壞血酸硬脂酸酯、維生素E等抗氧化劑共存下實施，達到抑制氧化的目的。
通常，除去溶劑后獲得的甘草提取物為褐色(例如，黃褐色到黑褐色)。
用上述方法所得的干甘草提取物與甘草的重量比(干重基準)普通約0.01以上。
本發(fā)明的提取物中甘草皂苷的含量通常在0.5％(重量)以下(干體基準)，優(yōu)選0.3％(重量)以下，更優(yōu)選0.2％(重量)以下，尤其是0.1％以下的為低含量。事實上，當本發(fā)明的提取物中甘草皂苷的含量達0.001-0.5％(干體基準)時，上述副作用和利用上的不利就不成問題。
提取物中甘草皂苷的含量可通過，例如以市售的甘草皂苷或甘草皂苷酸鹽作標準物質，經HPLC等分析進行定量。提取物中PPAR配體劑成分的含量可通過，例如以本發(fā)明的PPAR配體劑作標準物質，經HPLC等分析進行定量。用作標準物質的PPAR配體劑，可以應用從甘草等植物分離出的化合物，也可應用化學合成的化合物。提取物中PPAR配體劑成分的總量可作為定量的PPAR配體劑成分的含量總合算出來。
本發(fā)明的提取物中所含PPAR配體劑成分的總量以干體為基準，通常在0.5％(重量)以上，優(yōu)選1％以上，更優(yōu)選2％以上。特別是，用碳原子數為1-4的一元醇抽提時，其總量通常在5％(重量)以上，優(yōu)選6％以上，更優(yōu)選7％以上，可高效回收有效成分。另外，本發(fā)明的提取物中所含PPAR配體劑成分的總量以干體為基準，通常最大在50％(重量)以下，但抽提后經過用活性炭和樹脂等進行吸附處理和/或分級等純化處理的，可進一步提高其含有量。
本發(fā)明的提取物，作為主要成分，如選自グリシクマリン、グリシリン、デヒドログリアスプリンC、デヒドログリアスプリンD、グリアスプリンB和グリアスプリンD中的至少一種成分，在提取物中的含量以干體為基準，通常在0.5％(重量)以上，優(yōu)選1％以上。再者，優(yōu)選グリシクマリン、グリシリン、デヒドログリアスプリンC、デヒドログリアスプリンD、及グリアスプリンD在提取物中的含量以干體為基準，通常各在0.5％(重量)以上，優(yōu)選1％以上。這些成分在甘草尤其是G.ウラレンシス提取物中含有許多。
另外，如選自甘草異黃烷酮(glycyrrhisoflavanone)、甘草異黃酮(glycyrrhisoflavone)、グリウラリンB、セミリコ異黃酮及イソリクイリチゲニン中的至少一種成分，在提取物中的含量以干體為基準，通常在0.01％(重量)以上，優(yōu)選0.02％以上。優(yōu)選提取物中包含甘草異黃烷酮(glycyrrhisoflavanone)、甘草異黃酮(glycyrrhisoflavone)、グリウラリンB、セミリコ異黃酮及イソリクイリチゲニンt通常各為0.01％以上，優(yōu)選0.02％以上，以干重計。
另外，如選自グラブレン、グラブリジン、グラブロ-ル、3’羥基-4’-O-甲基グラブリジン、4’-O-甲基グラブリジン及ヒスパグラブリジンB中的至少一種成分，在提取物中的含量以干體為基準，在0.5％(重量)以上，優(yōu)選1％以上。更優(yōu)選グラブレン、グラブリジン、グラブロ-ル、3’羥基-4’-O-甲基グラブリジン、4’-O-甲基グラブリジン及ヒスパグラブリジンB在提取物中的含量以干體為基準，分別在0.5％(重量)以上，優(yōu)選1％以上。這些成分，尤其是G.ウラレンシス，在甘草提取物中含有許多。
另外，如選自甘草查耳酮A、甘草查耳酮B、甘草查耳酮C、甘草二酮A及甘草二酮C中的至少一種成分，在提取物中的含量以干體為基準，在0.5％(重量)以上，優(yōu)選1％以上。更優(yōu)選甘草查耳酮A、甘草查耳酮B、甘草查耳酮C、甘草二酮A及甘草二酮C在提取物中的含量以干體為基準，分別在0.5％(重量)以上，優(yōu)選1％以上。這些成分在甘草尤其是G.ウラレンシス提取物中含有許多。
本發(fā)明的改善胰島素抗性或，預防和/或改善胰島素抗性綜合征的組合物，以及本發(fā)明的預防和/或改善炎癥或癌癥的組合物，是含有本發(fā)明的PPAR配體劑的組合物。即，含有選自異戊二烯類黃酮化合物、非異戊二烯類黃酮的查耳酮衍生物、非異戊二烯類黃酮的黃酮醇衍生物、醫(yī)藥上或飲食上許可的其鹽類、糖苷和/或酯化體中的至少一種化合物的組合物。
同樣，對異戊二烯類黃酮化合物無特殊限制，但優(yōu)選選自3-芳基香豆素衍生物、イソフラブ-3-ニン衍生物、異黃烷衍生物、異黃烷酮衍生物、異黃酮衍生物、黃酮醇衍生物、黃烷酮衍生物、查耳酮衍生物、二苯甲酰甲烷衍生物中的至少一種化合物。
這里，上述化合物使用純的化合物較好，另外，作為醫(yī)藥品和食品也可使用半純品或粗制品，只要其不含有不適當的不純物即可。該情況下，既可直接使用上述提取物，又可對其選一步純化使用。對其形態(tài)無限定，例如可作為保健功能食品(特定保健用食品、營養(yǎng)功能食品)和健康食品、營養(yǎng)補助食品等飲食品，醫(yī)藥品，準藥品(quasi drug)等使用。
本發(fā)明的組合物既可用于人，又可用于狗、貓、牛、馬、豬、雞、羊、山羊、小鼠、大鼠等家畜或寵物。
作為飲食品使用時，可直接攝取，或應用公知的載體和輔助試劑制備成膠囊、片劑、顆粒劑、散劑等易于服用的劑型進行攝取。還可按常規(guī)方法適當添加本發(fā)明的PPAR配體劑以外的制劑材料進行混合。對此無特殊限制，例如包括賦形劑、崩解劑、潤滑劑、結合劑、防氧化劑、著色劑、抗凝劑、促吸收劑、穩(wěn)定劑等。這些成型劑中，本發(fā)明的PPAR配體劑的含有量在0.1-100％(重量)，優(yōu)選在10-90％。再者，混入飲食原料中，可在口香糖、巧克力、糖果、果子醬、餅干、クラツか等糖果類，冰激凌、冰糕等冷品類，茶、非酒精飲料、營養(yǎng)飲料、美容飲料等飲料，混沌、中華面、通心粉、即席面等面類；魚醬食品，如魚肉末，蒸魚(kamaboko)，魚腸(chikuwa)，肉末(hannpen)；白色調味料、蛋黃醬、醬油等調味料，人造黃油、奶油、色拉油等油脂類，面包、火腿、湯、甑煮食品、冷凍食品等所有飲食物中使用。攝取這些飲食用組合物時，其攝取量以本發(fā)明的PPAR配體劑計，成人每人每日的攝取量為0.1-3000mg/kg體重，優(yōu)選1-300mg/kg體重。另外，也可作為家畜和寵物用的飼料和寵物食品使用，其攝取量以本發(fā)明的PPAR配體劑計，優(yōu)選0.1-3000mg/kg體重。
作為醫(yī)藥品使用時，對其劑型無特殊限制，例如膠囊、片劑、顆粒劑、散劑、注射劑、坐劑、貼附劑等。在進行劑型制備中可適當添加藥劑學上許可的其它制劑材料，如賦形劑、崩解劑、潤滑劑、結合劑、防氧化劑、著色劑、抗凝劑、促吸收劑、溶解輔助劑、穩(wěn)定劑等。這些制劑的施用量，以本發(fā)明的PPAR配體劑計，成人每人每日0.1-3000mg/kg體重，優(yōu)選1-300mg/kg體重，一次或分數次施用。另外，也可作為家畜和寵物用的醫(yī)藥品使用，其施用量以本發(fā)明的PPAR配體劑計，優(yōu)選每日0.1-3000mg/kg體重。
本發(fā)明的組合物以片劑、膠囊、或散劑形式存在，且以上述提取物為PPAR配體劑時，優(yōu)選每劑中含有0.1-1000mg上述提取物。
本發(fā)明的PPAR配體劑是植物來源的提取物成分及其類似物，我們認為其毒性低。另外，根據本發(fā)明而得的提取物可添加到無糖食品中。并且與已報道的PPARγ配體劑高度不飽和脂肪酸類相比其優(yōu)點是穩(wěn)定性高，具有適于食品和醫(yī)藥組合物的性狀。
實施發(fā)明的最佳方案以下，列舉實施例對本發(fā)明進一步進行具體說明，但本發(fā)明并不限于這些實施例。
(實施例1)從甘草提取、分離化合物(1)將1.2kg甘草(G.ウラレンシス東北甘草)的微粉碎品浸到5.5L醋酸乙酯中，室溫、避光抽提7天后，通過過濾獲得抽提液。對其抽提液進行減壓濃縮除去溶劑，獲得74.0g提取物。將提取物加到硅膠色譜柱上(1500ml)，用氯仿∶甲醇＝19∶1(v/v)進行洗脫，得到級分。對洗脫級分進行減壓濃縮除去溶劑，獲得55.4g粗級分。通過反復進行硅膠柱色譜、ODS硅膠柱色譜、裝了ODS柱的高效液相色譜、凝膠過濾色譜、分相薄層色譜，對所得粗級分進行純化，得到化合物1(225mg)、化合物2(80.7mg)、化合物3(19.6mg)、化合物4(22.2mg)、化合物5(3.9mg)、化合物6(72.8mg)、化合物7(28. mg)、化合物8(12.1mg)、化合物9(6.8mg)、化合物10(8.5mg)、化合物11(58.7mg)、化合物12(10.2mg)。
進行結構分析的結果是，化合物1-3和5-12是已知的化合物，它們分別是化合物1為グリシクマリン(glycycoumarin)、化合物2為グリシリン(glycyrin)、化合物3為グリウラリンB(glyurallin B)、化合物5為刺凌德草堿(echinatin)、化合物6為異甘草黃酮醇(isolicoflavonol)、化合物7為デヒドログリアスプリンC(dehydroglyasperin C)、化合物8為グリアスプリンB(glyasperin B)、化合物9為甘草異黃烷酮(glycyrrhisoflavanone)、化合物10為ルピヮイテオン(lupiwighteone)、化合物11為グリアスプリンD(glyasperin D)、化合物12為半甘草異黃酮B(semilicoisoflavone B)。這些化合物結構的鑒定過程中，化合物1參考S.Demizu，et al.，Chemical andPharmaceutical Bulletin，36，3474-3479，化合物2參考T.Kinoshita，et al.，Chemical and Pharmaceutical Bulletin，26，135-140(1978)，化合物3及7參考M.Shibano，et al.，Heterocycles，45，2053-2060(1997)，化合物5參考K.Kajiyama，et al.，PhytOCHemistry，31，3229-3232(1992)，化合物6及9參考T.Hatano，et al.，Chemical and Pharmaceutical Bulletin，36，2090-2097((1988)，化合物8及11參考L.Zeng，et al.，Heterocycles，34，575-587(1992)，化合物10參考Y.Hashidoko，et al.，Agricultural and Biological Chemistry，50，1797-1807(1986)，化合物12參考F.Kiuchi，et al.，Heterocycles，31，629-636(1990)中記載的光譜數據。
化合物4是新型化合物，以二元NMR(1H-1HCOSY，HMQC，HMBC，PHNOESY)為中心進行光譜解析，鑒定出其結構為3-(2’，4’-dihydroxyphenyl)-6-(3”，3”-dimethylallyl)5，7-dimethoxy-2H-chromene，將之命名為デヒドログリアスプリンD(dehydroglyasperin D)。
化合物4的性狀及光譜數據如下Dehydroglyasperin D，褐色粉末狀，C22H24O5。
E1-MS m/z368.1610[M]+(計算值，C22H24O5368.1624)。
Uvλmax(甲醇)nm330(logε＝4.25)，243 sh(logε＝4.21)。
IR(KBr片)cm-13375，2929，1613，1516，1458，1308，1198，1164，1114，1092，1024，978，837。
1H-NMR(二甲基亞砜)ppm7.06(1H，d，J＝8.4Hz，H-6’)，6.68(1H，s，H-4)，6.34(1H，d，J＝2.3Hz，H-3’)，6.33(1H，s，H-8)，6.26(1H，dd，J＝8.4，2.3Hz，H-5’)，5.09(1H，br t，J＝6.9Hz，H-10)，4.90(2H，s，H-2)，3.75(3H，s，C-7-Ome)，3.67(3H，s，C-5-Ome)，3.18(2H，br d，J＝6.7Hz，H-9)，1.71(3H，s，Me-13)，1.63(3H，s，Me-12)。
13C-NMR(二甲基亞砜)ppm67.9(C-2)，128.8(C-3)，114.7(C-4)，110.4(C-4a)，154.9(C-5)，115.6(C-6)，158.0(C-7)，95.8(C-8)，153.2(C-8a)，22.6(C-9)，124.1(C-10)，130.4(C-11)，26.0(C-12)，18.1(C-13)，11.68(C-1’)，156.7(C-2’)，103.3(C-3’)，158.7(C-4’)，107.4(C-5’)，129.2(C-6’)，62.3(C-5-Ome)，56.3(C-7-Ome).
(實施例2)從甘草提取、分離化合物(2)與實施例1同樣，從甘草(G.ウラレンシス)的微粉碎品進行乙醇萃取，進行各種色譜，得到化合物13-17。進行結構分析的結果，鑒定出化合物13是イソリクイリチゲニン(isoliquiritigenin)，化合物14是莰非醇-3-O-甲基酯(kaempferol 3-O-methylester)，化合物15是甘草黃酮醇(licoflavonol)，化合物16是トパゾリン(topazolin)，化合物17是甘草異黃酮。
(實施例3)從甘草提取、分離化合物(3)與實施例1或實施例2同樣，從甘草(G.グラブラ)的微粉碎品進行乙醇萃取，得到化合物18-23，從甘草(G.インフラ-タ)的微粉碎品進行乙醇萃取，得到化合物24-28。進行結構分析的結果，鑒定出化合物18是グラブリジン(glabridin)，化合物19是グラブレン(glabrene)，化合物20是ヒスパグラブリジンB(hispaglabridin B)，化合物21是4’-O-甲基グラブリジン(4’-O-methylglabridin)，化合物22是3羥基-4’-O-甲基グラブリジン(3’-hydroxy-4’-O-methylglabridin)，化合物23是グラブロ-ル(glabrol)，化合物24是甘草查耳酮A(licochalcone A)，化合物25是甘草查耳酮B(licochalcone B)，化合物26是甘草查耳酮C(licochalcone C)，化合物27是甘草二酮A(glycyrdione A)，化合物28是甘草二酮C(glycyrdione C).
化合物1-28的結構式如表10-13所示。
表10
表11
表12
表13
(實施例4)PPARγ配體活性的測定將CV-1細胞(來源于雄性非洲綠猴腎臟的培養(yǎng)細胞)接種到96孔培養(yǎng)板中，6×103細胞/孔，37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)24小時。應用含10％FBS(胎牛血清)、10ml/L青霉素-鏈霉素溶液(分別為5000IU/ml，5000ug/ml，GIBCO)、37mg/L抗壞血酸(和光純藥工業(yè)株式會社)的DMEM(Dulbecco’s ModifiedEagle Medium，GIBCO)培養(yǎng)基。用OPTI-MEM(GIBCO)洗滌細胞后，用lipofectamine plus(GIBCO)轉化pM-mPPARγ和4×UASg-luc。pM-mPPARγ是表達結合了酵母來源的轉錄因子GAL4基因(氨基酸序列1-147)和小鼠PPARγ配體結合部位基因(氨基酸序列174-475)的嵌合蛋白用的質粒。4×UASg-luc是將GAL4的應答序列(UASg)4次插入到熒光素酶基因上游的報告質粒。轉染大約24小時后，換成含樣品的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24小時(n＝4)。將溶解到二甲基亞砜(DMSO)的樣品，無處置對照用DMSO，以1/1000量添加到培養(yǎng)基中。用含Ca，Mg的磷酸緩沖生理鹽水(PBS+)洗滌細胞后，添加ルツクライト(Packard)，用Topcount-microplate scintillation/luminescenecounter(Packard)測定熒光素酶的熒光強度。
對照組應用pM(去除了PPARγ配體結合部位基因的質粒)代替pM-mPPARγ進行與測定組同樣地測定。計算出測定組及對照組的熒光強度的均值(n＝4)的比值(測定組/對照組)，將對無處置對照的比活性作為樣品的PPARγ配體活性。
測定實施例1-3中所得化合物1-28的PPARγ配體活性的結果示于表14-17。另外，以甘草成分甘草酸(glycyrrhizic acid和光純藥工業(yè)株式會社)、甘草次酸(glycyrrhetinic acid和光純藥工業(yè)株式會社)、クエルセチン(quercetinSigma)作為比較化合物，測定其PPARγ配體活性。
表14

表15

表16

表17

以トログリタゾン(三共株式會社)作陽性對照，比較各化合物的PPARγ配體活性。結果在化合物1-19、21-24、26和27中可看到比0.5uMトログリタゾン強的PPARγ配體活性?；衔?0、25和28中可看到比0.5uMトログリタゾン稍弱的PPARγ配體活性。但甘草的主要成分和親水成分甘草皂苷(glycyrrhizin)、甘草皂苷糖殘基水解的甘草酸及クエルセチン(化合物6的異戊二烯基置換成OH基的黃酮醇衍生物)中未看到PPARγ配體活性。クエルセチン無PPARγ配體活性與文獻報道(Liang，Y.C.，et al.，F(xiàn)EBSLetters，496，12-18，2001)一致。
(實施例5)對2型糖尿病模型小鼠的效果用呈現(xiàn)遺傳性肥胖的2型糖尿病發(fā)病性模型動物KK-Ay小鼠評價化合物2對2型糖尿病的效果。用胰島素抗性改善藥-2型糖尿病治療藥ピオグリタゾン作為陽性對照。
將KK-Ay小鼠(♀，15周齡)分為3組(每組5只)，以粉末CE-2作為基本飼料(日本クレア)，給予無添加組(對照組)、ピオグリタゾン添加組、化合物2添加組，進行自由攝取。將ピオグリタゾン的アクトス片(每片中含有30mgピオグリタゾン武田藥品工業(yè)株式會社)在瑪瑙乳缽中粉碎，以0.02％的添加量將ピオグリタゾン添加到基本飼料中。與實施例1同樣制備的化合物2，以0.1％的添加量添加到基本飼料中。施用前及施用后4天從小鼠尾靜脈少量取血，用簡式血糖測定儀ゲルテストエ-ス(株式會社三和化學研究所)測定血糖值。其結果如表18所示。
給予混和飼料一周后，小鼠絕食一晚，進行糖負荷試驗。即，給絕食了的小鼠強制經口施用懸浮于0.5％羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)的ピオグリタゾン，20mg/kg，或給予化合物2,100mg/kg。無添加組(對照組)施用0.5％CMC-Na溶液，5ml/kg。施用30分鐘后，以2g/kg的負荷給予小鼠40％蔗糖溶液。糖負荷前、糖負荷后30分鐘、1小時、2小時，從小鼠尾靜脈少量取血，用簡式血糖測定儀ゲルテストエ-ス(株式會社三和化學研究所)測定血糖值。其結果如表19所示。
表18

**(p＜0.01)
表19

*(p＜0.05)，**(p＜0.01)如表18所示，與ピオグリタゾン同樣，給予添加了化合物2的飼料的小鼠的血糖值(均值±SE，n＝5)在施用第4天統(tǒng)計學上顯著性降低血糖值。如表19所示，與ピオグリタゾン同樣，化合物2可統(tǒng)計學上顯著性抑制糖負荷后血糖值的急劇上升。這些結果表明，化合物2具有血糖降低作用和血糖升高抑制作用，提示它具有與ピオグリタゾン同樣的胰島素抗性改善作用。
(實施例6)將500g甘草(G.ウラレンシス東北甘草)的微粉碎品浸到5kg(99.5％體積比)乙醇中，25℃、萃取5小時后，過濾殘渣獲得抽提液。對其抽提液進行減壓濃縮除去溶劑，獲得45g黃褐色-黑褐色的甘草提取物。該甘草提取物顯示良好的PPARγ配體活性。該甘草提取物中所含PPARγ配體活性成分及甘草酸的含量如表20所示。
其活性成分和甘草酸的含量可用下述條件下的HPLC分析求出。
(甘草皂苷分析條件)柱J’sphere ODS-H80(ワイエムシン)4.6mm(內徑)×250mm(長度)；柱溫40℃；移動相乙腈∶10mM磷酸水溶液＝33∶67(v/v)；流速1ml/min；檢測波長254nm；甘草皂苷的保留時間27.1min。
(活性成分分析條件)柱J’sphere ODS-H80(ワイエムシン)4.6mm(內徑)×250mm(長度)；柱溫40℃；移動相乙腈對10mM磷酸水溶液的比率梯度為從分析開始到15min保持在35％，15min-65min后以一定比率上升到70％，65min-70min保持在70％；流速1ml/min；檢測波長254nm。各成分的保留時間為甘草查耳酮B 5.2min，甘草異黃烷酮13.3min，イソリクイリチゲニン14.7min，グリシクマリン32.7min，半甘草異黃酮B 34.2min，グラブレン35.9min，甘草異黃酮36.3min，デヒドログリアスプリンC 37.2min，甘草查耳酮C 39.1min，甘草查耳酮A40.2min，グラブリジン44.7min，グリシリン48.1min，グリアスプリン B 51.1min，グラブロ-ル51.8min，グリアスプリンD 52.7min，甘草二酮A 53.4min，3’羥基-4’-O-甲基グラブリジン 53.5min，デヒドログリアスプリン D55.2min，グリウラリンB 58.7min，4’-O-甲基グラブリジン59.8min，甘草二酮C 63.0min，ヒスパグラブリジン B 74.1min。
表20

活性成分 計 13.10％(實施例7)除用丙酮代替乙醇進行萃取以外，與實施例6同樣進行抽提，得到甘草提取物18g。所得甘草提取物顯示良好的PPARγ配體活性。該甘草提取物中所含PPARγ配體活性成分及甘草酸的含量與實施例6同樣進行檢測，結果如表21所示。
表21

(實施例8) 活性成分 計 17.18％除用醋酸乙酯代替乙醇進行萃取以外，與實施例6同樣進行抽提，得到甘草提取物18g。所得甘草提取物顯示良好的PPARγ配體活性。該甘草提取物中所含PPARγ配體活性成分及甘草酸的含量與實施例6同樣進行檢測，結果如表22所示。
表22

(比較例1)活性成分 計 17.97％除用水代替乙醇進行萃取以外，與實施例6同樣得到甘草提取物。所得甘草提取物不顯示PPARγ配體活性。
(實施例9)將500g甘草(G.ウラレンシス東北甘草)(株式會社カネカサンスパイス)的微粉碎品浸到5kg水中，60℃、萃取1天后，過濾，獲得殘渣，對其進行減壓干燥。向所得抽提殘渣中加入2.5kg乙醇(99.5％體積比)乙醇中，25℃、萃取5小時后，過濾殘渣獲得抽提液。減壓下從抽提液中除去溶劑，獲得47g黃褐色-黑褐色的甘草提取物。該甘草提取物顯示良好的PPARγ配體活性。甘草提取物中所含PPARγ配體活性成分及甘草酸的含量與實施例6同樣進行檢測，結果如表23所示。
表23

活性成分 計 11.52％(實施例10)與實施例6同樣，用99.5％和95％(體積比)的乙醇(含水率0.5％和5.0％)，從甘草(G.ウラレンシス東北甘草)的切斷品(皮面積占總表面積的比例約8成)進行抽提，分別得到25.8g、29.5g甘草提取物。所得甘草提取物顯示良好的PPARγ配體活性。甘草提取物中所含PPARγ配體活性成分及甘草酸的含量與實施例6同樣進行檢測，結果如表24所示。
表24

活性成分 計 28.79％ 21.89％(實施例11)與實施例6同樣，從甘草(G.グラブラ)的微粉碎品中獲得甘草提取物。所得甘草提取物顯示良好的PPARγ配體活性。甘草提取物中所含PPARγ配體活性成分及甘草酸的含量與實施例6同樣進行檢測，結果如表25所示。
表25

活性成分 計36.12％(實施例12)與實施例6同樣，從甘草(G.インフラ-タ)的微粉碎品中獲得甘草提取物。所得甘草提取物顯示良好的PPARγ配體活性。甘草提取物中所含PPARγ配體活性成分及甘草酸的含量與實施例6同樣進行檢測，結果如表26所表26

(實施例13)將玉米淀粉、乳糖、羧甲基纖維素、硬脂酸鎂混和到實施例6中所得的甘草提取物中，再加入聚乙烯吡咯烷酮的水溶液作為結合劑，按常規(guī)方法使之顆粒化。向其中加入滑石后，打片，獲得如下組成的片劑。
甘草提取物10重量份玉米淀粉 25重量份乳糖 15重量份羧甲基纖維素 10重量份硬脂酸鎂 3重量份聚乙烯吡咯烷酮5重量份滑石10重量份產業(yè)上利用的可能性本發(fā)明簡便且高效地提供過氧化物酶體增殖劑應答性受體(PPAR)配體劑，及含有此成分的組合物。本發(fā)明的組合物作為胰島素抗性的改善或，胰島素抗性綜合征的預防和/或改善劑有用。
權利要求
1.一種過氧化物酶體增殖劑應答性受體配體劑，它包含至少一種選自異戊二烯類黃酮化合物，或其醫(yī)藥上或飲食上許可的鹽類、糖苷和酯化體的成分。
2.權利要求1的過氧化物酶體增殖劑應答性受體配體劑，其中異戊二烯類黃酮化合物為選自3-芳基香豆素衍生物、イソフラブ-3-ニン衍生物、異黃烷衍生物、異黃烷酮衍生物、異黃酮衍生物、黃酮醇衍生物、黃烷酮衍生物、查耳酮衍生物、二苯甲酰甲烷衍生物中的至少一種化合物。
3.權利要求1或2的過氧化物酶體增殖劑應答性受體配體劑，其中異戊二烯類黃酮化合物是用結構式(1)代表的3-芳基香豆素衍生物， R1-R7含有異戊二烯基或鄰近的2個R通過-CH＝CHC(CH3)2O-形成6元環(huán)結構的中的至少一個以上，此外為H、OH或OCH3。
4.權利要求3的過氧化物酶體增殖劑應答性受體配體劑，其中用結構式(1)代表的3-芳基香豆素衍生物為グリシクマリン或グリシリン。
5.權利要求1或2的過氧化物酶體增殖劑應答性受體配體劑，其中異戊二烯類黃酮化合物包含結構式(2)代表的イソフラブ-3-ニン衍生物， R1-R7中含有異戊二烯基或鄰近的2個R通過-CH＝CHC(CH3)2O-形成6元環(huán)結構中的至少一個，此外為H、OH或OCH3。
6.權利要求5的過氧化物酶體增殖劑應答性受體配體劑，其中用結構式(2)代表的イソフラブ-3-ニン衍生物為デヒドログリアスプリンC、デヒドログリアスプリンD或グラブレン。
7.權利要求1或2的過氧化物酶體增殖劑應答性受體配體劑，其中異戊二烯類黃酮化合物包含結構式(3)代表的異黃烷類衍生物， R1-R7含有異戊二烯基或鄰近的2個R通過-CH＝CHC(CH3)2O-形成6元環(huán)結構中的至少一個，此外為H、OH或OCH3。
8.權利要求7的過氧化物酶體增殖劑應答性受體配體劑，其中用結構式(3)代表的異黃烷類衍生物是グリアスプリンD、グラブリジン、ヒスパグラブリジンB、4’-O-甲基グラブリジン、3’羥基-4’-O-甲基グラブリジン。
9.權利要求1或2的過氧化物酶體增殖劑應答性受體配體劑，其中異戊二烯類黃酮化合物包含結構式(4)代表的異黃烷酮衍生物， R1-R8含有異戊二烯基或鄰近的2個R通過-CH＝CHC(CH3)2O-形成6元環(huán)結構中的至少一個，此外為H、OH或OCH3。
10.權利要求9的過氧化物酶體增殖劑應答性受體配體劑，其中用結構式(4)代表的異黃烷酮衍生物是グリアスプリンB或甘草異黃烷酮。
11.權利要求1或2的過氧化物酶體增殖劑應答性受體配體劑，其中異戊二烯類黃酮化合物是用結構式(5)代表的異黃酮衍生物， R1-R9含有異戊二烯基或鄰近的2個R通過-CH＝CHC(CH3)2O-形成6元環(huán)結構中的至少一個，此外為H、OH或OCH3。
12.權利要求11的過氧化物酶體增殖劑應答性受體配體劑，其中用結構式(5)代表的異黃酮衍生物是グリウラリンB、ルピワイテオン、半甘草異黃酮B或甘草異黃酮。
13.權利要求1或2的過氧化物酶體增殖劑應答性受體配體劑，其中異戊二烯類黃酮化合物包含結構式(6)代表的黃酮醇衍生物， R1為OH或OCH3，R2-R9至少含有一個以上的異戊二烯基或鄰近的2個R通過-CH＝CHC(CH3)2O-形成6元環(huán)結構，此外為H、OH或OCH3。
14.權利要求13的過氧化物酶體增殖劑應答性受體配體劑，其中用結構式(6)代表的黃酮醇衍生物是異甘草黃酮醇、甘草黃酮醇或トパゾリン。
15.權利要求1或2的過氧化物酶體增殖劑應答性受體配體劑，其中異戊二烯類黃酮化合物包含結構式(7)代表的黃烷酮衍生物， R1-R8至少含有一個異戊二烯基或鄰近的2個R通過-CH＝CHC(CH3)2O-形成6元環(huán)結構，此外為H、OH或OCH3。
16.權利要求15的過氧化物酶體增殖劑應答性受體配體劑，其中用結構式(7)代表的黃烷酮衍生物是グラブロ-ル。
17.權利要求1或2的過氧化物酶體增殖劑應答性受體配體劑，其中異戊二烯類黃酮化合物包含結構式(8)代表的查耳酮衍生物， R1-R9含有異戊二烯基或鄰近的2個R通過-CH＝CHC(CH3)2O-形成6元環(huán)結構中的至少一個，此外為H、OH或OCH3。
18.權利要求17的過氧化物酶體增殖劑應答性受體配體劑，其中用結構式(8)代表的查耳酮衍生物是甘草查耳酮C。
19.權利要求1或2的過氧化物酶體增殖劑應答性受體配體劑，其中異戊二烯類黃酮化合物包含結構式(9)代表的二苯甲酰甲烷衍生物， R1-R7含有異戊二烯基或鄰近的2個R通過-CH＝CHC(CH3)2O-形成6元環(huán)結構中的至少一個，此外為H、OH或OCH3。
20.權利要求19的過氧化物酶體增殖劑應答性受體配體劑，其中用結構式(9)代表的二苯甲酰甲烷衍生物是甘草二酮A或甘草二酮C。
21.一種過氧化物酶體增殖劑應答性受體配體劑，它包含至少一種選自非異戊二烯類黃酮的查耳酮衍生物，及其醫(yī)藥上或飲食上許可的鹽類、糖苷和/或酯化體的成分。
22.權利要求21的過氧化物酶體增殖劑應答性受體配體劑，其中非異戊二烯類黃酮的查耳酮衍生物是刺凌德草堿、イソリクイリチゲニン、甘草查耳酮A、甘草查耳酮B等。
23.一種過氧化物酶體增殖劑應答性受體配體劑，它由至少一種選自非異戊二烯類黃酮的黃酮醇衍生物，及其醫(yī)藥上或飲食上許可的其鹽類、糖苷和/或酯化體的成分構成。
24.權利要求23的過氧化物酶體增殖劑應答性受體配體劑，其中非異戊二烯類黃酮的黃酮醇衍生物是莰非醇-3-O-甲基酯。
25.權利要求1-24中任意一項的過氧化物酶體增殖劑應答性受體配體劑，其中過氧化物酶體增殖劑應答性受體是過氧化物酶體增殖劑應答性受體γ。
26.一種用如下結構式代表的化合物。
27.一種植物來源的提取物，其特征在于，它含有權利要求1-25中任意一項中的過氧化物酶體增殖劑應答性受體配體劑。
28.權利要求27的提取物是用有機溶劑提取出的。
29.權利要求27或28中的提取物，其提取物中所含過氧化物酶體增殖劑應答性受體配體劑占干體重量的5％以上。
30.權利要求27-29中任意一項的提取物，其提取物中含有選自グリシクマリン、グリシリン、デヒドログリアスプリンC、デヒドログリアスプリンD、グリアスプリンB和グリアスプリンD中的至少一種成分，該成分占干體重量的0.5％以上。
31.權利要求27-29中任意一項的提取物，其提取物中含有グリシクマリン、グリシリン、デヒドログリアスプリンC、デヒドログリアスプリンD、及グリアスプリンD，它們各占干體重量的0.5％以上。
32.權利要求27-29中任意一項的提取物，其提取物中含有選自甘草異黃烷酮、甘草異黃酮、グリウラリンB、セミリコ異黃酮及イソリクイリチゲニン中的至少一種成分，該成分占干體重量的0.01％以上。
33.權利要求27-29中任意一項的提取物，其提取物中含有甘草異黃烷酮、甘草異黃酮、グリウラリンB、セミリコ異黃酮及イソリクイリチゲニン，它們各占干體重量的0.01％以上。
34.權利要求27-29中任意一項的提取物，其提取物中含有選自グラブレン、グラブリジン、グラブロ-ル、3’羥基-4’-O-甲基グラブリジン、4’-O-甲基グラブリジン及ヒスパグラブリジン B中的至少一種成分，該成分占干體重量的0.5％以上。
35.權利要求27-29中任意一項的提取物，其提取物中含有グラブレン、グラブリジン、グラブロ-ル、3’羥基-4’-O-甲基グラブリジン、4’-O-甲基グラブリジン及ヒスパグラブリジンB，它們各占干體重量的0.5％以上。
36.權利要求27-29中任意一項的提取物，其提取物中含有選自甘草查耳酮A、甘草查耳酮B、甘草查耳酮C、甘草二酮A及甘草二酮C中的至少一種成分，該成分占干體重量的0.5％以上。
37.權利要求27-29中任意一項的提取物，其提取物中含有甘草查耳酮A、甘草查耳酮B、甘草查耳酮C、甘草二酮A及甘草二酮C，它們各占干體重量的0.5％以上。
38.權利要求27-37中任意一項的提取物，其甘草皂苷的含量占干體重量的0.001％以上，0.5％以下。
39.權利要求27-38中任意一項的提取物來源于甘草。
40.權利要求39的提取物，其中甘草是選自ウラレンシス甘草、洋甘草、脹果甘草及エチナ-タ甘草中的至少一種。
41.權利要求39的提取物，其中甘草是ウラレンシス甘草。
42.權利要求39的提取物，其中甘草是洋甘草。
43.權利要求39的提取物，其中甘草是脹果甘草。
44.一種用于改善胰島素抗性，或預防和/或改善胰島素抗性綜合征的組合物，其特征在于，它以異戊二烯類黃酮作有效成分，該成分具有與過氧化物酶體增殖劑應答性受體的配體結合區(qū)域結合的能力。
45.權利要求44的組合物，其中胰島素抗性綜合征是選自高胰島素血癥、糖尿病、脂肪代謝異常、肥胖、高血壓及動脈硬化性疾病中的至少一種癥狀或疾病。
46.權利要求45的組合物，其中癥狀或疾病是糖尿病。
47.一種用于預防和/或改善炎癥或癌癥的組合物，其特征在于，它以異戊二烯類黃酮作有效成分，該成分具有與過氧化物酶體增殖劑應答性受體的配體結合區(qū)域結合的能力。
48.一種用于改善胰島素抗性，或預防和/或改善胰島素抗性綜合征的組合物，其特征在于，它以權利要求1-25中任意一項的過氧化物酶體增殖劑應答性受體配體劑作有效成分。
49.權利要求48的組合物，其中胰島素抗性綜合征是選自高胰島素血癥、糖尿病、脂肪代謝異常、肥胖、高血壓及動脈硬化性疾病中的至少一種癥狀或疾病。
50.權利要求49的組合物，其中癥狀或疾病是糖尿病。
51.一種用于預防和/或改善炎癥或癌癥的組合物，其特征在于，它以權利要求1-25中任意一項的過氧化物酶體增殖劑應答性受體配體劑作有效成分。
52.權利要求44-51中任意一項的組合物，它含有權利要求27-43中任意一項的提取物作為具有與過氧化物酶體增殖劑應答性受體的配體結合區(qū)域結合能力的異戊二烯類黃酮化合物或過氧化物酶體增殖劑應答性受體配體劑。
53.權利要求44-52中任意一項的組合物，其特征在于，它為飲食用。
54.權利要求44-52中任意一項的組合物，其特征在于，它為醫(yī)藥用。
55.權利要求44-52中任意一項的組合物，其特征在于，它為家畜或寵物用。
56.權利要求44-55中任意一項的組合物，它為片劑、膠囊、顆粒劑或散劑形式。
57.權利要求56中的組合物，其每劑中含有0.1-1000mg權利要求27-43中任意一項的提取物。
58.權利要求39-43中任意一項提取物的制備方法，其特征在于，從皮面積占整個表面積的比例達3成以上的甘草中抽提。
59.權利要求58的制備方法，其中甘草為切斷品或周皮。
60.權利要求58的制備方法，其中甘草為切斷品。
61.權利要求39-43中任意一項提取物的制備方法，其特征在于，用脂肪酸酯萃取甘草。
62.權利要求61的制備方法，其中脂肪酸酯為醋酸乙酯。
63.權利要求39-43中任意一項提取物的制備方法，其特征在于，用水溶性有機溶劑萃取甘草。
64.權利要求63的制備方法，其中水溶性有機溶劑為碳原子數1-4的1元醇、酮或其混合物。
65.權利要求63的制備方法，其中水溶性有機溶劑為乙醇、丙酮或其混合物。
66.權利要求63的制備方法，其中水溶性有機溶劑為乙醇。
67.權利要求39-43中任意一項提取物的制備方法，其特征在于，用含水率在30％(體積)以下的有機溶劑從甘草中抽提。
68.權利要求58-67中任意一項的制備方法，還包括抽提后，通過吸附處理和/或分級進行純化的操作。
69.權利要求58-68中任意一項的制備方法，從甘草進行抽提，和/或其后的操作在脫氧氛圍下進行。
全文摘要
本發(fā)明涉及簡便且高效地提供過氧化物酶體增殖劑應答性受體配體劑，及含有以此為有效成分的、用于改善胰島素抗性或，預防和/或改善胰島素抗性綜合征的組合物。由異戊二烯類黃酮化合物、非異戊二烯類黃酮的黃酮醇衍生物、非異戊二烯類黃酮的查耳酮衍生物、醫(yī)藥上或飲食上許可的其鹽類、糖苷和/或酯化體構成的過氧化物酶體增殖劑應答性受體配體劑；含有該配體劑的組合物；含有該配體劑的植物來源的提取物；該提取物的制備方法。
文檔編號A61P3/06GK1599602SQ0282401
公開日2005年3月23日 申請日期2002年10月11日 優(yōu)先權日2001年10月11日
發(fā)明者前辰正, 塚川美壽, 北原干郎, 中川格, 北村志郎, 上田恭義, 黑田明平, 三卷祥浩, 指田豐 申請人:鐘淵化學工業(yè)株式會社