專利名稱：用于治療包含免疫失調(diào)的疾病的革蘭氏陽性菌制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含由革蘭氏陽性菌(如革蘭氏陽性兼性胞內(nèi)菌，例如分枝桿菌)制備的成分的組合物，所述的組合物用于治療人和動物的包含免疫失調(diào)的疾病。本發(fā)明還涉及所述成分和組合物的制劑。
背景技術(shù)：
包含免疫失調(diào)(如Th1-Th2失衡)的疾病包括各種癌癥、自身免疫病(如多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克隆氏病(Crohn disease)和糖尿病)、和過敏性疾病(如哮喘、過敏性鼻炎、結(jié)膜炎和特應(yīng)性皮炎)。
例如過敏性哮喘是一種常見疾病，其涉及過敏原誘導(dǎo)的氣道炎癥；T淋巴細胞到達呼吸道并與吸入的過敏原反應(yīng)而激活，其結(jié)果是炎癥性白細胞、嗜酸細胞以及有時中性粒細胞被募集至氣道中。通過產(chǎn)生Th2型細胞因子，CD4+T淋巴細胞在過敏性氣道炎癥的起始過程中發(fā)揮重要作用，Th2型細胞因子促使嗜酸細胞在氣道中募集并可能隨后使之激活。有人認為Th2和Th1效應(yīng)細胞之間的不平衡導(dǎo)致了哮喘的發(fā)生。
因此，有人建議刺激肺部的Th1免疫應(yīng)答，例如通過IFN-γ霧化吸入或通過施用分枝桿菌疫苗；在小鼠中，這種刺激似乎可抑制繼發(fā)性免疫過程的進展。
更具體地，外源性哮喘或特應(yīng)性哮喘(例如職業(yè)性及藥物誘發(fā)性)與Th2型免疫應(yīng)答的增強相關(guān)，伴隨產(chǎn)生特異性免疫球蛋白E(IgE)、常見的空氣過敏原(aeroallergen)皮膚試驗呈陽性、和/或特應(yīng)性癥狀。外源性哮喘中的氣道阻塞涉及由氣道炎癥引起的非特異性支氣管高反應(yīng)性(bronchial hyperresponsiveness，BHR)。這種炎癥是由包括肥大細胞、嗜酸細胞和淋巴細胞在內(nèi)的多種炎癥細胞所釋放的化學(xué)物質(zhì)所介導(dǎo)的。這些介質(zhì)的作用引起血管通透、粘膜分泌以及支氣管平滑肌收縮。在特應(yīng)性哮喘中，引起氣道炎癥的免疫應(yīng)答由分泌IL-4和IL-5的Th2型T細胞引起。內(nèi)源性或隱原性哮喘發(fā)生于上呼吸道感染后，但可新發(fā)于中年或老年人群，這些病人的哮喘較外源性哮喘更難治療。
因此，過敏性疾病由分泌T輔助2(Th2)細胞因子、IL-4、IL-5和IL-13的T淋巴細胞介導(dǎo)，其產(chǎn)生高水平的血清IgE以及嗜酸細胞募集。不過，Th1細胞也參與了這些病理過程；例如，Th1細胞見于慢性特應(yīng)性皮膚病。這種Th1-Th2失衡也見于其他疾病如一些癌癥特別是膀胱癌，或見于自身免疫病。
流行病學(xué)研究，例如Shirakawa等(科學(xué)，1997，275，3)的研究，發(fā)現(xiàn)在結(jié)核菌素應(yīng)答與特應(yīng)性疾病之間存在負相關(guān)。這些結(jié)果提示既往針對某些活的革蘭氏陽性菌如革蘭氏陽性兼性胞內(nèi)菌，例如分枝桿菌如結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)或BCG進行的免疫接種可以產(chǎn)生對特應(yīng)性疾病的保護作用。
一種治療方案是通過誘導(dǎo)針對有關(guān)的免疫原或抗原的T輔助1(Th1)應(yīng)答而下調(diào)Th2成分，這是因為Th1和Th2細胞因子被認為是相互拮抗的。
不同來源的實驗結(jié)果均顯示，以包括分枝桿菌和利斯特氏菌在內(nèi)的已知能夠誘導(dǎo)強Th1免疫應(yīng)答的胞內(nèi)菌對成年小鼠進行免疫接種，可以抗衡(counterbalance)免疫原或抗原誘導(dǎo)的Th2應(yīng)答；例如在過敏反應(yīng)中，其可誘導(dǎo)嗜酸細胞增多癥及相關(guān)的BHR。
這就是有人認為某些分枝桿菌可用于治療過敏性疾病且特別是哮喘的原因。
就這方面而言，已經(jīng)測試了各種不同的包括分枝桿菌的組合物-活BCG疫苗被認為在實驗性哮喘等中具有潛在的作用，特別是在經(jīng)鼻給藥的情況下(KJ.Erb等，實驗醫(yī)學(xué)雜志，1998，187，561-569；MA.Nahori等，疫苗，2001，19，1484-1495)。不過，盡管活BCG疫苗可用于預(yù)防結(jié)核病(JB Milstein等，WHO Bull.OMS，1990，68，93-108)，但其存在一些缺點首先，由于其殘存的毒力，其不能用于免疫抑制的對象(immunodeficient subject)；其次，皮內(nèi)接種BCG疫苗引起局部的反應(yīng)與所用的細菌總量成正比，且可引起局部潰瘍，或在意外注射到皮下的情況下可引起更嚴(yán)重的反應(yīng)(膿腫)。因此，特別是采用鼻內(nèi)施用或氣霧劑途徑時，這種疫苗可能不適合在相當(dāng)長的一段時間內(nèi)反復(fù)施用以用于對呼吸道過敏性疾病或其他涉及Th1-Th2失衡的疾病進行免疫治療。鼻內(nèi)施用或通過氣霧劑施用可能會產(chǎn)生活BCG疫苗在肺部引起的無法接受的不良反應(yīng)；-分枝桿菌熱滅活制劑.BCG或結(jié)核分枝桿菌的熱滅活制劑在用作疫苗時不具有全身性保護作用(R.Janssen等，免疫學(xué)，2001，102，4，441-449；MA Skinner等，免疫學(xué)，2001，102，2，225-233；GA Rook等，Novartis Found Symposium，1998，217，73-87和87-98)。此外，該制劑誘導(dǎo)的針對BCG純化蛋白衍生物(PPD)的遲發(fā)型過敏反應(yīng)可干擾對結(jié)核病的真的。不過，必須注意到，一些研究者認為，在新生兒時期單獨以熱滅活的牛分枝桿菌進行預(yù)接種或在母牛分枝桿菌(Mycobacterium vaccae)基礎(chǔ)上以熱滅活的牛分枝桿菌進行預(yù)接種，有可能有助于下調(diào)IgE應(yīng)答(F.Tukenmez等，Pediatr.Allergy Immunol.，1999，10，2，107-111；F.Tukenmez等，J.哮喘，2000，37，4，329-334；Nahori等，見前)；.母牛分枝桿菌的熱滅活制劑(CC Wang等，免疫學(xué)，1998，93，3，307-313；WO 00/74715)已經(jīng)用于臨床對過敏癥的免疫治療。一些研究結(jié)果證實了熱滅活的分枝桿菌作為Th1佐劑的效力，且顯示重組分枝桿菌在抗原特異性免疫調(diào)制中的潛在用途(R.Janssen等，免疫學(xué)，2001，102，4，441-449；MA Skinner等，免疫學(xué)，2001，102，2，225-233；CC Wang等，免疫學(xué)，1998，93，3，307-313；WO 00/74715)。盡管所述的制劑在免疫治療中具有活性，它們出現(xiàn)了與BCG或結(jié)核分枝桿菌的熱滅活制劑相同的一些缺點，這也妨礙了其在免疫治療這的應(yīng)用。
實際上，所有的分枝桿菌熱滅活制劑-通過肺泡巨噬細胞誘導(dǎo)產(chǎn)生TNF-α，其作為一種毒性和壞死物質(zhì)，妨礙了此類熱滅活制劑在免疫治療中的應(yīng)用，并且-誘導(dǎo)局部不良反應(yīng)(PM Shirtcliffe等，Am.J.Respir.Crit.CareMed.，2001，163，1410-1414)，例如臨床試驗中所見的發(fā)癢水皰、硬結(jié)和壞死伴持久疤痕。
因此，目前仍缺乏有效的來自革蘭氏陽性菌如革蘭氏陽性兼性胞內(nèi)菌、例如分枝桿菌的組合物，以用于治療包含免疫失調(diào)(如Th1-Th2失衡)的疾病，例如過敏性疾病，所述的組合物具有良好的耐受性且不具有上述的缺點。
此外，對于該組合物，必須能夠鑒定出其制劑中的活性成分。而對通過在120℃加熱處理10至30分鐘的熱滅活制劑而言，是不可能鑒定其熱不穩(wěn)定成分的。

發(fā)明內(nèi)容
因此本發(fā)明的一個目的是提供一種新的滅活的革蘭氏陽性菌制劑，如滅活的革蘭氏陽性兼性胞內(nèi)菌制劑，例如一種滅活的分枝桿菌制劑，以及含有所述制劑的組合物，其可用于治療包含免疫失調(diào)(如Th1-Th2失衡)的疾病，例如癌癥、自身免疫病和過敏性疾病，而無嚴(yán)重的不良反應(yīng)。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備所述的滅活的革蘭氏陽性菌制劑的方法，所述的制劑除了能夠治療包括免疫失調(diào)的疾病以外，還保持了來自所述細菌的分子的結(jié)構(gòu)，以便能夠鑒別來自這些細菌細胞的活性分子。
令人驚訝的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，革蘭氏陽性菌如革蘭氏陽性兼性胞內(nèi)菌，例如分枝桿菌，經(jīng)不引起來自這些細菌細胞的分子發(fā)生變性的“溫和方法”滅活后，在將其施用于患有哮喘或其他免疫失調(diào)的對象后，能夠在體內(nèi)刺激白細胞調(diào)節(jié)細胞(CD4+CD25+T細胞和/或B細胞和/或樹突狀細胞)。對這些調(diào)節(jié)細胞的刺激改變了患有哮喘的對象的免疫反應(yīng)性，使其具有長時期的(數(shù)周)局部的和全身的作用；由此，經(jīng)此類滅活的革蘭氏陽性胞內(nèi)菌制劑治療的過敏對象可在長時期內(nèi)不發(fā)作哮喘。
本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，這些保持來自所述細菌細胞的分子結(jié)構(gòu)的滅活的細菌制劑不會引起例如炎癥、貧血、血小板減少和誘導(dǎo)產(chǎn)生TNF-α等不良反應(yīng)。
本發(fā)明涉及一種細菌制劑，其特征在于-其含有通過不引起來自這些細菌細胞的分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生變性的方法而得到的滅活的革蘭氏陽性菌，和-其能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)調(diào)制(modulation)針對一種抗原的免疫應(yīng)答(免疫調(diào)制制劑(immunomodulatory preparation))。
免疫調(diào)制制劑是指在誘導(dǎo)針對任何抗原(自身抗原或外來抗原)的免疫應(yīng)答之前或之后，能夠改變免疫調(diào)節(jié)細胞和免疫輔助細胞之間的比例的制劑。免疫調(diào)節(jié)細胞包括白細胞調(diào)節(jié)細胞如CD4+CD25+T細胞和/或B細胞和/或樹突狀細胞。例如，對CD4+CD25+T細胞的描述見于Schevach等，Nat.Rev.Immunol.，2002，2，389-400。
根據(jù)所述的細菌制劑的一個優(yōu)選的實施方式，其含有滅活的革蘭氏陽性兼性胞內(nèi)菌。
革蘭氏陽性兼性胞內(nèi)菌是指能夠在體外生長于合成培養(yǎng)基中、同時也能在體內(nèi)感染來自哺乳動物或非哺乳動物宿主的真核細胞且能夠在這些細胞(例如巨噬細胞)中增殖的革蘭氏陽性菌。
根據(jù)所述的細菌制劑的一個優(yōu)選的實施方式，其含有選自利斯特氏菌(Listeria sp.)，棒桿菌(Corynobacterium sp.)，或包含分枝桿菌、諾卡氏菌(Nocardia sp.)和紅球菌(Rhodococcu sp.)的放線菌類(Actinomycetes)的滅活的革蘭氏陽性兼性胞內(nèi)菌。
優(yōu)選地，所述細菌制劑含有牛分枝桿菌，更優(yōu)選地含有牛分枝桿菌BCG。
不引起來自所述細菌細胞的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變性的方法是指不會引起所述分子的空間構(gòu)型發(fā)生廣泛變性的方法；優(yōu)選地，該方法可保持來自所述細菌細胞的大分子(例如蛋白質(zhì)、多糖和脂質(zhì))的三維結(jié)構(gòu)。
這些稱為“溫和方法”的方法包括但不限于用物理方法破壞細菌的細胞膜而保持其大分子成分的結(jié)構(gòu)。這些方法包括但不限于深度凍干(extended freeze-drying)、在存在二氧化硅或鋯珠的條件下研磨、使用所謂的“細胞均質(zhì)機(French press)”、超聲波裂解和γ-射線照射。其他可用來獲得如上所述的滅活的細菌制劑的方法是本領(lǐng)域人員熟知的。
-例如，深度凍干滅活的細菌制劑是指所述制劑中的水分基本上被完全除去；因此，所述深度凍干滅活的細菌制劑含有少于1.5％的殘留水分，優(yōu)選地少于1％，且更優(yōu)選地少于0.5％。不過，在非最佳的凍干條件下，當(dāng)凍干的細菌制劑含有較多的殘留水分(大約10％)，即尚未滅活所有的增加時，可轉(zhuǎn)而通過將所述制劑與空氣(大氣壓)接觸而滅活殘留的活細菌；此類制劑具有與上述深度凍干滅活的細菌制劑相同的特性和活性。深度凍干滅活的細菌制劑中殘留的水分可通過Karl Fisher的庫侖方法(coulometric method)進行即時的測定。
可通過任何本領(lǐng)域熟知的方法來驗證來自本發(fā)明的滅活的革蘭氏陽性菌制劑的分子未發(fā)生變性。例如，可根據(jù)Laemmli，自然，1970，277，680，通過對滅活的革蘭氏陽性菌制劑提取物在變性和非變性條件下進行凝膠電泳，并對比來自活細菌的蛋白提取物，從而驗證蛋白的結(jié)構(gòu)；通過以適當(dāng)?shù)娜玖蠈δz進行染色可直接對蛋白進行觀察，或者，可將蛋白轉(zhuǎn)移至膜上，并以針對該革蘭氏陽性菌蛋白的適當(dāng)抗體進行染色而觀察。也可用其他方法如凝膠過濾或質(zhì)譜分析來驗證來自本發(fā)明的滅活的革蘭氏陽性菌制劑的純化分子的結(jié)構(gòu)。
根據(jù)所述細菌制劑的另一個優(yōu)選的實施方式，其含有通過深度凍干方法得到的深度凍干的、滅活細菌。
優(yōu)選地，所述深度凍干的、滅活的細菌制劑由如下步驟制備(i)收集活細菌細胞的培養(yǎng)物，(ii)在水中或鹽的水溶液如硼酸鹽的水溶液中洗滌所述的細菌細胞，(iii)在水中或鹽的水溶液如硼酸鹽的水溶液中冷凍所述的細菌細胞，(iv)通過在冷凍干燥器中對所述的冷凍的細菌細胞進行干燥處理而將其滅活，處理的時間足以除去至少98.5％，優(yōu)選地至少99％，且更優(yōu)選地至少99.5％的水分，且(v)收集所述的深度凍干滅活細菌細胞。
或者，所述深度凍干滅活的細菌制劑是通過如上所述的方法而制備的，只是省略了(ii)中洗滌所述細菌細胞的步驟。
優(yōu)選地，步驟(iv)在干燥室壓力為大約0.02mBar至0.2mBar條件下進行；更優(yōu)選地為0.06mBar至0.1mBar，持續(xù)至少10至12小時，更優(yōu)選地為持續(xù)數(shù)天，過程中采用低熱量輸入(low heat input)和低冷蒸氣收集溫度(low cold vapor trap temperature)以保持干燥過程中干燥的滅活的細菌制劑為低溫(細菌細胞分子不發(fā)生變性)。
在凍干過程中，在冷凍干燥儀內(nèi)無空氣泄漏的條件下，當(dāng)制冷裝置和真空泵與真空室切斷數(shù)秒后，如果真空室的壓力不發(fā)生變化，即說明達到了深度凍干狀態(tài)；這說明不再有水分自凍干的細菌中被除去(＝穩(wěn)定的水蒸氣壓力)。例如，當(dāng)冷凝管為-52℃，干燥室內(nèi)的壓力可在0.06-0.120mBar的范圍內(nèi)，通常為大約0.09mBar，以得到被有效深度凍干滅活細菌。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的滅活的細菌制劑的各種成分，其選自如下一組
-成分A，由所述滅活的細菌制劑的有機溶劑提取物組成，以去除磷脂，-成分B，由所述滅活的細菌制劑經(jīng)糖苷酶處理的提取物組成，以去除糖衍生成分如肽聚糖，-成分C，由所述滅活的細菌制劑經(jīng)DNase和/或RNase消化的提取物組成，以去除核酸，-成分D，由所述滅活的細菌制劑經(jīng)蛋白酶處理的提取物組成，以去除蛋白質(zhì)，-成分E，由所述滅活的細菌制劑經(jīng)有機溶劑、糖苷酶、DNase和/或RNase相繼處理、且最后經(jīng)蛋白酶處理得到的提取物組成。
優(yōu)選地-所述成分A通過以甲醇/氯仿混合物提取而得到。
-所述成分B通過以溶菌酶消化而得到。
-所述成分C通過以DNaseI和/或RNaseA消化而得到。
-所述成分D通過以枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)消化而得到。
根據(jù)所述成分的一個優(yōu)選的實施方式，其分離自一種如上所述的深度凍干的細菌制劑。
根據(jù)所述成分的一個優(yōu)選的實施方式，其由分枝桿菌成分組成，優(yōu)選地為牛分枝桿菌成分，更優(yōu)選地為牛分枝桿菌BCG成分。
本發(fā)明還涉及一種用于預(yù)防或治療包含免疫失調(diào)(如Th1-Th2失衡)的疾病的藥物組合物，其包含有效量的如上所述的滅活的細菌制劑和/或至少其一種成分、藥物學(xué)可接受的載體和/或添加劑、和/或佐劑、和/或免疫刺激劑(immunostimulant)和/或不同于本發(fā)明請求保護的細菌制劑的免疫調(diào)制劑(immunomodulator)。
佐劑是指一種天然的或合成的產(chǎn)物，當(dāng)其與抗原聯(lián)合施用時，其可強化針對所述抗原的特異性免疫應(yīng)答(抗體產(chǎn)生、激活B和T細胞)。
免疫刺激劑是指一種天然的或合成的產(chǎn)物，當(dāng)其與抗原聯(lián)合施用時，其誘導(dǎo)非特異性的免疫應(yīng)答(例如增強對該抗原的吞噬作用)。
根據(jù)本發(fā)明，所述組合物可優(yōu)選地用于治療癌癥，自身免疫病如多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克隆氏病和糖尿病，以及過敏性疾病如哮喘、過敏性鼻炎和特應(yīng)性皮炎。
根據(jù)所述組合物的一個優(yōu)選的實施方式，其由分枝桿菌組成，優(yōu)選地為牛分枝桿菌，更優(yōu)選地為牛分枝桿菌BCG。
根據(jù)所述組合物的另一個優(yōu)選的實施方式，其由通過如上所述的深度凍干方法得到的深度凍干滅活的細菌組成；優(yōu)選地，所述深度凍干滅活的細菌是通過如上所述的凍干方法得到的。
根據(jù)所述組合物的另一個優(yōu)選的實施方式，其形式適合于通過鼻內(nèi)途徑而施用。
根據(jù)所述組合物的另一個優(yōu)選的實施方式，其形式適合于通過口服或舌下途徑而施用。
一般而言，該組合物可通過胃腸外注射(例如經(jīng)皮、肌肉、靜脈或皮下)、鼻內(nèi)(如通過吸入或霧化)、口服、舌下或局部、經(jīng)皮膚或經(jīng)直腸而施用。
按照說明，在一個實施方式中，本發(fā)明的組合物的形式適合輸送至支氣管肺粘膜表面。例如，該組合物可懸浮于液體配方中，通過類似于當(dāng)前用于治療哮喘的氣霧裝置(nebuliser device)，以氣霧劑的形式輸送至患者。
按照說明，在另一個實施方式中，本發(fā)明的組合物的形式適合口服施用。例如，該組合物的形式可以是用于口服施用的片劑、普通膠囊、凝膠膠囊或糖漿。這些凝膠膠囊、普通膠囊和片劑形式可含有藥物配制中常規(guī)使用的賦形劑，例如佐劑或粘合劑如淀粉，膠質(zhì)(gum)和凝膠，佐劑如磷酸鈣，解離劑(disintegrating agent)如玉米淀粉或褐藻酸，潤滑劑如硬脂酸鎂、甜味劑或調(diào)味劑?？杉尤胨幬飳W(xué)相容性溶劑，在水性或非水性介質(zhì)中配制溶液或懸液。這些溶劑包括甘油、聚乙二醇、丙二醇、聚乙二醇酯、DMSO和乙醇。
該組合物還額外含有藥物學(xué)可接受的載體和/或添加劑和/或免疫刺激劑和/或佐劑，如含有本發(fā)明的細菌細胞或其成分的脂質(zhì)體；用于制備藥物組合物的所述一或多種添加劑可選自抗聚集劑(antiaggregatingagent)、抗氧化劑、染料、增味劑、或調(diào)勻劑、聚集劑或分離劑，且一般而言選自制藥業(yè)中常規(guī)使用的任何賦形劑。
盡管本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的任何合適的載體均可用于本發(fā)明的藥物組合物，但載體的類型依施用方式的不同而變化。對于胃腸外施用，如皮下注射，載體優(yōu)選地包含水、鹽溶液、乳糖、谷氨酸鹽、一種油或一種蠟。對于口服施用，可采用任何上述載體或一種固相載體，例如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉(sodium saccharine)、滑石粉、纖維素、葡萄糖、蔗糖、和碳酸鎂。生物可降解的微球(Biodegradablemicrosphere)(如polylactic galactide)也可用作本發(fā)明的藥物組合物的載體。合適的生物可降解的微球在例如美國專利4,897,268和5,075,109中有揭示。
所述的多種佐劑中的任何一種均可用于本發(fā)明的組合物以增強免疫應(yīng)答。大多數(shù)佐劑含有用來保護抗原不被快速代謝或用來實現(xiàn)可控炎癥反應(yīng)的物質(zhì)例如氫氧化鋁或礦物油，以及免疫應(yīng)答的非特異性刺激物例如脂質(zhì)A、百日咳桿菌(Bordetella pertussis)毒素。合適的佐劑是商品化的，例如弗氏不完全佐劑和弗氏完全佐劑，但其不能用來注射給人。其他可用于人類的合適的佐劑包括氫氧化鋁、生物可降解的微球、單磷酰脂A(monophosphoryl A)和Quil A。
優(yōu)選的施用頻率和有效劑量隨物種的不同以及對象的不同而變化。例如，深度凍干滅活的分枝桿菌制劑及其成分的劑量范圍相當(dāng)于在小鼠中為大約1μg至10000μg物質(zhì)(大約106至1010CFU)；優(yōu)選地為大約10μg至1000μg；更優(yōu)選地為大約10μg至100μg。劑量可更高或更低，這取決于物種或?qū)ο蟮捏w表面積，還取決于施用的頻率。例如，在哮喘的治療中，每2個月施用1或2劑可能更加有效。
本發(fā)明還涉及作為一種同時、單獨或序貫用于預(yù)防和/或治療包含免疫失調(diào)的疾病的聯(lián)合制劑的制品，其含有本發(fā)明的細菌制劑或其成分以及一種選自抗癌藥物、抗糖尿病藥物或免疫調(diào)制藥物的產(chǎn)品。
優(yōu)選地，所述制品選自抗組胺藥物或抗炎藥物。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的細菌制劑或其成分在制備用于通過口服、胃腸外、舌下或鼻內(nèi)途徑施用以治療哮喘的藥物中的用途，其中所述藥物的施用劑量范圍相當(dāng)于在小鼠中為1μg至10 000μg，優(yōu)選地為10μg至1 000μg，最優(yōu)選地為10μg至100μg，該藥物至少自通常接觸免疫原之前2周開始施用，每間隔2個月一次。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的細菌制劑或其成分在制備用于通過口服、胃腸外、舌下或鼻內(nèi)途徑施用以預(yù)防人類嬰兒的哮喘的藥物中的用途，其中所述藥物的施用劑量范圍相當(dāng)于在小鼠中為1μg至10000μg，優(yōu)選地為10μg至1000μg，最優(yōu)選地為10μg至100μg。
本發(fā)明還涉及制備所述深度凍干滅活的細菌制劑的方法，其特征在于其至少包含以下步驟(i)收集活細菌細胞的培養(yǎng)物，(ii)在水中或鹽的水溶液如硼酸鹽的水溶液中洗滌所述的細菌細胞，(iii)在水中或鹽的水溶液如硼酸鹽的水溶液中冷凍所述的細菌細胞，(iv)通過在冷凍干燥器中對所述的冷凍的細菌細胞進行干燥處理而將其滅活，處理的時間足以除去至少98.5％，優(yōu)選地至少99％，且更優(yōu)選地至少99.5％的水分，且(v)收集所述的深度凍干滅活細菌細胞。
一種制備所述深度凍干滅活的細菌制劑的替代方法，包含步驟(i)、(iii)、(iv)和(v)；省略了步驟(ii)的洗滌細菌細胞的步驟。
優(yōu)選地，在干燥室壓力為大約0.02mBar至0.2mBar的條件下，更優(yōu)選地為大約0.06mBar至0.1mBar的條件下進行步驟(iv)至少10至12小時，以便除去至少98.5％的水分同時防止所述冷凍的細菌發(fā)生融化并將所述干燥的滅活的細菌維持在使細菌細胞分子發(fā)生變性的溫度以下。
根據(jù)所述方法的一個優(yōu)選的實施方式，其由制備深度凍干滅活的分枝桿菌組成。
本發(fā)明還涉及所述滅活的細菌細胞制劑或其成分在制備一種用于預(yù)防和/或治療包含免疫失調(diào)的疾病的藥物中的用途，所述包含免疫失調(diào)的疾病例如為Th1-Th2失衡，例如為癌癥，自身免疫病如多發(fā)性硬化，糖尿病和克隆氏病，過敏性疾病如哮喘、過敏性鼻炎或特應(yīng)性皮炎。
根據(jù)所述的用途，所述滅活的細菌制劑或其成分聯(lián)合了藥物學(xué)可接受的載體、和/或免疫刺激劑、和/或佐劑和/或如上所述的任何常規(guī)的添加劑。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式，分枝桿菌優(yōu)選地使用了牛分枝桿菌，更優(yōu)選地使用了牛分枝桿菌BCG。
根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方式，使用了通過一種深度凍干方法獲得的深度凍干滅活的細菌。
本發(fā)明的滅活的細菌制劑具有以下優(yōu)點-它們保護對象不發(fā)生包含免疫失調(diào)(如Th1-Th2失衡)的疾病，例如哮喘。
-它們不具有感染性且可以施用于免疫抑制的對象。
-它們不引起炎癥性不良反應(yīng)，這可能特別是由于它們不誘導(dǎo)產(chǎn)生TNF-α，TNF-α可引起毒性和壞死活性。此外，它們不產(chǎn)生包括貧血和血小板減少在內(nèi)的其他副作用。
-使用它們不會誘導(dǎo)針對BCG純化蛋白衍生物(PPD)的遲發(fā)型過敏反應(yīng)，因此不會干擾對結(jié)核病的診斷。
-并且它們的制備方法可保護來自細菌細胞的分子結(jié)構(gòu)(分子不發(fā)生廣泛的變性)，因此能夠鑒定來自所述滅活的細菌制劑的免疫調(diào)制分子。
本發(fā)明還涉及用于治療包含免疫失調(diào)的疾病的試劑盒，其特征在于其包含至少一種本發(fā)明的藥物組合物、用來施用所述藥物組合物的手段和/或用來保證對所建議的治療具有依從性的手段。
下面通過隨后的描述和附圖對本發(fā)明做進一步說明，隨后的描述和附圖引用實施例說明深度凍干滅活BCG在小鼠中對哮喘的保護性作用、分析了深度凍干滅活BCG、熱滅活BCG和活BCG所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答、或分析了深度凍干滅活BCG及其成分的產(chǎn)生。不過，應(yīng)該理解，這些實施例僅僅用于對本發(fā)明進行說明，且不以任何方式對本發(fā)明構(gòu)成限制。


-圖1顯示了制備凍干的活BCG疫苗的標(biāo)準(zhǔn)方法(A)，并與本發(fā)明的制備深度凍干滅活BCG的方法進行對照(B)圖中所示為壓力(mBar)(-Δ-)和樣品(-o-)或托盤(-●-)的溫度(攝氏度)隨時間的變化(小時)。
-圖2顯示了深度凍干滅活BCG(Lyoph滅活BCG)對特別嚴(yán)格的(高Th2)BP2小鼠哮喘模型的支氣管肺高反應(yīng)性的保護作用，通過通氣量的下降進行評測。BP2小鼠對Th2/哮喘軸具有高度的反應(yīng)性。這些小鼠還以O(shè)VA和明礬(已知其是一種Th2刺激劑)進行致敏。通過比較，在這種嚴(yán)格的小鼠模型中，活BCG處理組或熱滅活BCG處理組均未觀察到顯著的作用。圖中給出了曲線下面積(cm2)個體(-o-)，各組小鼠的平均值±SEM(-●-)。
-圖3顯示了深度凍干滅活BCG(Lyoph滅活BCG)對以O(shè)VA為免疫原的BP2小鼠哮喘模型的支氣管肺高反應(yīng)性的保護作用，通過支氣管肺阻力進行評測。通過比較，活BCG處理組或熱滅活BCG處理組均未觀察到顯著的作用。圖中給出了1分鐘內(nèi)測量得到的增強暫停(Enhancedpause(Penh))個體數(shù)據(jù)(-o-)，各組小鼠的平均值±SEM(-●-)。***在深度凍干滅活BCG處理組中觀察到對支氣管肺高反應(yīng)性的顯著的保護作用(p＜0.001)。
-圖4顯示了深度凍干滅活BCG(Lyoph滅活BCG)對BP2小鼠哮喘模型的肺中嗜酸細胞增多的保護作用，通過支氣管肺泡灌洗液(BAL)細胞計數(shù)進行評測。通過比較，活BCG處理組或熱滅活BCG處理組均未觀察到顯著的作用。圖中給出了個體數(shù)據(jù)(-o-)和各組小鼠的平均值±SEM(-●-)。
-圖5顯示了深度凍干滅活BCG(Lyoph滅活BCG)對BP2小鼠哮喘模型的肺中中性粒細胞增多的保護作用，通過支氣管肺泡灌洗液(BAL)細胞計數(shù)進行評測。通過比較，活BCG處理組或熱滅活BCG處理組均未觀察到顯著的作用。圖中給出了個體數(shù)據(jù)(-o-)和各組小鼠的平均值±SEM(-●-)。**在深度凍干滅活BCG處理組中觀察到中性粒細胞的數(shù)量顯著減少(p＜0.01)。
-圖6顯示了在深度凍干滅活BCG(Lyoph滅活BCG)處理的BP2小鼠哮喘模型中，優(yōu)選的無肺部炎癥或組織損傷，通過支氣管肺泡灌洗液中的纖連蛋白的水平進行評測。通過比較，活BCG處理組或熱滅活BCG處理組的BAL中的纖連蛋白的水平均明顯較高。圖中數(shù)據(jù)以IU/ml表示；給出了個體數(shù)據(jù)(-o-)和各組小鼠的平均值±SEM(-●-)。***深度凍干滅活BCG處理組的纖連蛋白水平顯著降低(p＜0.001)。
-圖7顯示了以活BCG、熱滅活BCG或深度凍干滅活BCG(Lyoph滅活BCG)處理的或未處理的各組小鼠的支氣管肺泡灌洗液中的IL-5的水平。圖中數(shù)據(jù)以pg/ml表示；給出了個體數(shù)據(jù)(-o-)和各組小鼠的平均值±SEM(-●-)。
-圖8顯示了以活BCG、熱滅活BCG或深度凍干滅活BCG(Lyoph滅活BCG)處理的或未處理的各組小鼠的血清中的IL-5的水平。圖中數(shù)據(jù)以pg/ml表示；給出了個體數(shù)據(jù)(-o-)和各組小鼠的平均值±SEM(-●-)。
-圖9顯示了以活BCG、熱滅活BCG或深度凍干滅活BCG(Lyoph滅活BCG)處理的或未處理的各組小鼠的肺培養(yǎng)物中的IFN-γ的水平(pg/ml)；該培養(yǎng)物已經(jīng)在體外以純化的BCG分泌蛋白(A)或抗CD3抗體(B)進行刺激。圖中給出了個體數(shù)據(jù)(-o-)和各組小鼠的平均值±SEM(-●-)。
-圖10顯示了以活BCG、熱滅活BCG或深度凍干滅活BCG(Lyoph滅活BCG)治療方案處理的或未處理的各組小鼠的血清中的OVA特異性IgE的水平。圖中給出了個體數(shù)據(jù)(-o-)和各組小鼠的平均值±SEM(-●-)。
-圖11A和12A顯示了分別來自以O(shè)VA免疫接種的BP2和BALB/c小鼠的、經(jīng)熱滅活BCG(加熱的)(-◆-)或深度凍干滅活BCG(凍干的)(....■....)體外刺激的肺泡巨噬細胞產(chǎn)生的IL-12(p70和p40)。數(shù)據(jù)表示為pg/ml每100000細胞。
-圖11B(BP2)和12B(BALB/c)顯示來自以深度凍干滅活BCG(凍干的)刺激的小鼠的巨噬細胞中無TNF-α產(chǎn)生，相比之下，來自以熱滅活BCG(加熱的)刺激的小鼠的巨噬細胞產(chǎn)生的TNF-α水平很明顯。數(shù)據(jù)表示為ng/ml每100000細胞。
-圖13顯示以深度凍干滅活BCG(Lyoph滅活BCG)處理的小鼠中未觀察到針對BCG純化蛋白衍生物(PPD)的遲發(fā)型過敏反應(yīng)(DTH)。相比之下，以活BCG或熱滅活BCG處理的小鼠中觀察到DTH。圖中給出了個體數(shù)據(jù)(-o-)和各組小鼠的平均值±SEM(-●-)。***在深度凍干滅活BCG處理組中無明顯爪墊腫脹(p＜0.001)。
-圖14顯示在豚鼠哮喘模型中，深度凍干滅活BCG(EFD-BCG)對組胺引起的支氣管肺高反應(yīng)性的保護作用。以10μg(圖14B)或100μg(圖14C)的深度凍干滅活BCG對接種了OVA的動物進行處理或不處理(圖14A)。圖中給出在施用氣霧劑形式的OVA之前(黑色符號)和之后(白色符號)，在各動物中能夠產(chǎn)生支氣管收縮的組胺的濃。***10μg(p＜0.01)或100μg(p＜0.001)深度凍干滅活BCG處理組產(chǎn)生了明顯的保護作用(Kruskal-Wallis非變量檢驗)。
-圖15A顯示了深度凍干滅活BCG(EFD1)在BP2小鼠哮喘模型中對肺中嗜酸細胞升高的保護作用，通過支氣管肺泡灌洗液細胞計數(shù)進行評測。相比之下，在活BCG或熱滅活BCG處理組未觀察到明顯的作用。各組小鼠的數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM；各組n＝7。*深度凍干滅活BCG處理組中的嗜酸細胞數(shù)明顯減少(p＜0.05)。
-圖15B顯示了來自以活BCG、熱滅活BCG、深度凍干滅活BCG(EFD1)處理或未處理的各組小鼠的支氣管肺泡灌洗液中IL-5的水平。各組小鼠的數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM；各組n＝7。
-圖16顯示了深度凍干滅活BCG制劑中蛋白結(jié)構(gòu)的保留，通過SDS-PAGE并(A)在轉(zhuǎn)移至PVDF膜后以抗分枝桿菌抗體染色或(B)以Aurodye染色進行評測。蛋白質(zhì)表現(xiàn)為不連續(xù)的條帶，沒有降解帶。
-圖17顯示了在以一種水溶性ray-grass花粉提取物作為免疫原的BP2小鼠哮喘模型中，深度凍干滅活BCG(EFD1)對支氣管肺高反應(yīng)性的保護作用，通過支氣管肺高反應(yīng)性進行評測。圖中給出了在施用乙酰甲膽堿(methacholine)后，在3至8分鐘之間測定的增強暫停(Penh)各組小鼠的數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM；各組n＝8。**深度凍干滅活BCG處理組對支氣管肺高反應(yīng)性具有明顯的保護作用(p＜0.01)。
-圖18A和B顯示了在BP2小鼠哮喘模型中，深度凍干滅活BCG(EFD1)對肺中多形核白細胞和嗜酸細胞增多的保護作用，通過支氣管肺泡灌洗液細胞計數(shù)進行評測。各組小鼠的數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。在1mg和10mg的深度凍干滅活BCG處理組中多形核白細胞數(shù)明顯減少(**p＜0.01)；100μg、1mg和10mg的深度凍干滅活BCG處理組中嗜酸細胞分別明顯減少**p＜0.01、*p＜0.05和*p＜0.05。
-圖18C顯示了深度凍干的BCG(EFD1)處理組(10μg，100μg，1mg和10mg)中肺部多形核白細胞和嗜酸細胞數(shù)減少與IL-4產(chǎn)生減少的相關(guān)性，通過支氣管肺泡灌洗液細胞和細胞因子分析進行評測。各組小鼠的數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。10μg，100μg，1mg和10mg的深度凍干滅活BCG處理組中IL-4水平顯著降低(**p＜0.01)。
-圖19顯示了在BP2小鼠哮喘模型中，深度凍干滅活BCG(EFD1)處理組中阻止了白細胞對肺的浸潤，通過肺細胞浸潤計數(shù)評測。各組小鼠的數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM；各組n＝5。10μg深度凍干滅活BCG處理組中細胞數(shù)明顯減少(**p＜0.001)。
-圖20顯示了在BP2小鼠哮喘模型中，深度凍干滅活BCG(EFD)處理組阻止了白細胞對肺的浸潤，通過流式細胞儀分析巨噬細胞(CD11b+)、多形核白細胞(Gr1+)和樹突狀細胞(CD11c+)進行評測。各組小鼠的數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM；各組n＝5。所有深度凍干滅活BCG(10μg、100μg、1mg和10mg)處理組中巨噬細胞和樹突狀細胞均明顯減少(i)，而多形核白細胞僅在100μg、1mg和10mg深度凍干滅活BCG處理組中明顯減少(ii)。
-圖21顯示了在活BCG、熱滅活BCG、深度凍干滅活BCG(EFD1)處理或未處理、且有或沒有OVA攻擊的各組小鼠的肺培養(yǎng)物中IFN-γ和IL-10(pg/肺)的水平；培養(yǎng)物經(jīng)純化BCG分泌蛋白體外刺激。各組小鼠的數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM；各組n＝4。僅在深度凍干滅活BCG處理組中出現(xiàn)IL-10產(chǎn)生的明顯增加(***p＜0.001)。
-圖22顯示了靜脈施用深度凍干滅活BCG(EFD-BCG)后未出現(xiàn)貧血(A)和血小板減少(B)，而同樣途徑施用活BCG或熱滅活BCG則與此不同。
-圖23顯示了皮下注射深度凍干滅活BCG(EFD1)后皮下注射部位的炎癥反應(yīng)最小，而活BCG和熱滅活BCG與此不同，通過注射后連續(xù)10周每周測量爪墊增大的情況進行評測。箭頭指示注射日；EFD和熱滅活BCG為D0和D36，活BCG僅在D0。
-圖24顯示了靜脈注射深度凍干滅活BCG(EFD1)后18天，LPS刺激肺外植體后，TNF-α產(chǎn)生減少，而同樣途徑注射活BCG或熱滅活BCG則與此不同。深度凍干滅活BCG組與未處理組相比未見明顯TNF-α產(chǎn)生(***p＜0.001)。與此不同，在活BCG和熱滅活BCG處理組觀察到TNF-α產(chǎn)生明顯。
-圖25顯示，BALB/c小鼠先在90天前以卵清蛋白免疫接種，然后在45天和65天用或不用深度凍干滅活BCG(EFD1)處理，并用或不用卵清蛋白進行攻擊實驗，來自上述BALB/c小鼠的脾臟內(nèi)的CD11c+Gr1+B220+漿細胞樣樹突狀細胞的數(shù)量增加。***處理組中CD11c+Gr1+B220+細胞數(shù)明顯增加(p＜0.001)，處理組中CD11c+CD8α+細胞數(shù)無增加。
-圖26顯示，BALB/c小鼠先在90天前以卵清蛋白免疫接種，然后在45天和65天用或不用深度凍干滅活BCG(EFD1)處理，并用或不用卵清蛋白進行攻擊實驗，來自上述BALB/c小鼠的脾臟內(nèi)的CD4+CD25+IL-10+細胞的數(shù)量增加；在分析白細胞群之前，以O(shè)VA或BCG培養(yǎng)物上清液在體外對脾臟細胞進行刺激或不進行刺激。***處理組中CD4+CD25+IL-10+細胞數(shù)明顯增加(p＜0.001)。
-圖27顯示了口服途徑給予深度凍干滅活BCG(EFD1)在小鼠哮喘模型中的保護作用，通過肺部細胞浸潤計數(shù)評測。***處理組肺部細胞數(shù)明顯減少(p＜0.001)。
-圖28顯示了皮下注射單劑深度凍干滅活BCG(EFD)的保護作用，通過預(yù)防BALB/c哮喘模型的支氣管肺高反應(yīng)性進行評測。
-圖29顯示了皮下注射深度凍干滅活BCG(EFD)的延遲作用，通過預(yù)防BP2哮喘模型的支氣管肺高反應(yīng)性進行評測。僅在施用深度凍干滅活BCG和攻擊實驗之間存在2-3周的延遲時才出現(xiàn)對支氣管肺高反應(yīng)性的預(yù)防作用。
-圖30顯示了皮下注射深度凍干滅活BCG(EFD1)的作用過程，通過預(yù)防BP2哮喘模型的支氣管肺高反應(yīng)性進行評測；深度凍干滅活BCG的保護作用持續(xù)至少2個月。
具體實施例方式
實施例1制備深度凍干滅活的分枝桿菌1)材料與方法牛分枝桿菌BCG細胞(BCG巴斯德疫苗株1173P2，于1978年4月24日保藏于法國微生物保藏中心(CNCM)，25 rue du Docteur Roux，75724巴黎Cedex 15(法國)，保藏號n°I-059(M.Gheorghiu等，1983，Bull.Inst.Pasteur，81，281-288)生長于無菌Sauton培養(yǎng)基中(HOOCCH(NH2O)CH2CONH2H2O(天冬酰胺)，4g/l；C6H8O7；H2O(檸檬酸)，2g/l；K2HPO4(磷酸氫二鉀)，0.5g/l；MgSO4-H2O(硫酸鎂)，0.50g/l；檸檬酸鐵III，0.05g/l；甘油，60ml；硫酸鋅溶液(0.155g硫酸鋅溶于10ml無致熱原的水中)，240μl/l，pH7)。更具體地，1173 P2株生長于含130ml無菌Sauton培養(yǎng)基的250ml球形培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)14天，相當(dāng)于培養(yǎng)物達到對數(shù)生長期的盡頭。
將培養(yǎng)物2000g離心10分鐘，4℃，以沉淀BCG細胞。棄細胞培養(yǎng)物上清液，以蒸餾水充分洗滌沉淀(3次)；每次洗滌包括將所述沉淀重懸于蒸餾水(每體積細胞沉淀加20體積的水)并離心細胞2000g達10分鐘，4℃。
末次洗滌后，將沉淀重懸于與沉淀等體積或2倍體積的蒸餾水中。使50ml水中的20g細菌分層并在瓶壁上凍結(jié)，以形成大約1cm厚的一層。將混合物冷凍于-60℃。
然后將凍結(jié)于水中的細胞懸液在圖1B所述的深度凍干方案的條件下進行深度凍干，以除去基本上所有的水分(殘留水分＜1.5％)。簡言之，將壓力快速降至0.150mBar，冰制冷裝置(ice condenser)的溫度大約為-50℃至-54℃，并開始凍干過程。樣品保持凍結(jié)，不必精確監(jiān)測溫度。然后將壓力維持在0.1mBar達34小時，以除去基本上所有的水分(殘留水分＜1.5％)。逐漸升至室溫(大約20℃)。干燥過程結(jié)束時，壓力緩慢恢復(fù)為大氣壓，室溫(大約20℃)，并收集深度凍干滅活BCG細胞(大約2g)，大氣壓下室溫存放。
可使用Karl Fisher的庫侖方法和756 KF Coulometer(METHROM)，根據(jù)制造商的說明書來確定深度凍干滅活BCG制劑中的殘留水分。
深度凍干滅活制劑存在的活細胞可通過以下方法驗證-確定每毫升中的集落形成單位(CFU)；將0.2ml的深度凍干滅活制劑懸液(1mg，例如為大約109個深度凍干滅活BCG細胞懸于水中)接種在Middlebrook 7H10瓊脂培養(yǎng)基(DIFCO)，將培養(yǎng)盤在37℃孵育1個月，和/或-以熒光染料CFDA-SE(羧基二乙酸熒光素琥珀酰亞胺基酯(Carboxyfluorescein diacetate-Succimidyl Ester)；MOLECULAR PROBES目錄號C-1157)進行染色，該染料只染色活細胞；將1ml深度凍干滅活制劑懸液(大約108深度凍干滅活BCG細胞懸于水)與100μl的1/100稀釋于PBS的CFDA試劑(儲存液1mg/ml溶于DMSO)混合。將混合物避光室溫孵育60min。將標(biāo)記的細菌3000rpm離心15分鐘，PBS洗滌2次，并重懸于PBS。然后通過熒光顯微鏡檢測活細胞的存在。
2)結(jié)果根據(jù)材料與方法所述并概括于圖1B中的深度凍干方案將BCG細胞深度凍干滅活。相比之下，按照制備活BCG疫苗的標(biāo)準(zhǔn)方法對BCG細胞進行凍干將BCG細胞(1173P2株)培養(yǎng)在Sauton培養(yǎng)基中，37℃，并于對數(shù)生長期結(jié)束時離心收集細胞，BCG細胞沉淀重懸于谷氨酸鈉中(1.5g/100ml H2O)，BCG濃度為4mg/ml。將BCG懸液分裝于小管中(0.25ml/管)，根據(jù)圖1A所示方案進行凍干每管含有1.5±0.5％的H2O，室溫真空儲存(0.06mBar)。
如材料與方法中所述分析不同制劑中的BCG細胞的活力。
通過Karl Fisher的庫侖方法、培養(yǎng)物分析以及CFDA-SE染色得到如下結(jié)果-200mg的深度凍干滅活BCG制劑含有1.073mg水(一次代表性的測定值)，相對于殘留水分少于0.5％，-根據(jù)本發(fā)明的方法制備的深度凍干滅活BCG樣品中未檢測到活細菌，-按照標(biāo)準(zhǔn)的BCG疫苗制備方法制備的凍干的滅活BCG制劑中存在50％至60％的活細菌。
實施例2制備深度凍干滅活的分枝桿菌成分1)去脂質(zhì)成分(Delipidated fraction)(成分A)將10mg/ml的大約1010深度凍干滅活BCG細胞懸浮于硼酸緩沖液(Na2B4O710H2O 0.363％；H3BO30.525％；NaCl 0.619％和Tween 200.0005％，溶于蒸餾水，pH8)，12000g離心10分鐘，棄上清液。將沉淀重懸于1ml的氯仿/甲醇(9/1)中，室溫作用24h以提取脂質(zhì)。12000g離心10min以除去氯仿/甲醇。將來自氯仿/甲醇提取物的去脂質(zhì)沉淀真空干燥。
2)去糖基化成分(Deglycosylated fraction)(成分B)將10mg/ml的大約1010深度凍干滅活BCG細胞懸浮于硼酸緩沖液(Na2B4O710H2O 0.363％；H3BO30.525％；NaCl 0.619％和Tween 200.0005％溶于蒸餾水，pH8)，12000g離心10分鐘，棄上清液。將沉淀重懸于含有1mg溶菌酶的1ml的0.1 M乙酸鈉中，37℃作用24h，以除去肽聚糖。將消化產(chǎn)物在96℃加熱2min，12000g離心1h收集沉淀。
3)DNase和RNase處理的成分(成分C)將10mg/ml的大約1010深度凍干滅活BCG細胞懸浮于硼酸緩沖液，12000g離心10分鐘，棄上清液。將沉淀重懸于含有1mg DNase和1mgRNase以及5mM MgCl2的1ml的40mM Tris-HCl緩沖液中，37℃作用24h，以除去核酸。將消化產(chǎn)物在96℃加熱2min，12000g離心1h收集沉淀。
4)蛋白酶處理的成分(成分D)將10mg/ml的大約1010深度凍干滅活BCG細胞懸浮于硼酸緩沖液，12000g離心10分鐘，棄上清液。將沉淀重懸于含有0.1mg枯草桿菌蛋白的1ml的0.1M醋酸銨緩沖液中，37℃作用23h。為完全除去蛋白質(zhì)，隨后將0.1mg枯草桿菌蛋白酶加到反應(yīng)混合物中，37℃孵育7h。將消化產(chǎn)物在96℃加熱2min，12000g離心1h收集沉淀。
5)相繼處理(Successive treatments)(成分E)將10mg/ml的大約1010深度凍干滅活BCG細胞12000g離心10分鐘，棄上清液。將沉淀重懸于硼酸緩沖液中并相繼以上述氯仿/甲醇(9/1)、溶菌酶、DNase-RNase混合物和枯草桿菌蛋白酶進行處理。將消化產(chǎn)物在96℃加熱2min，12000g離心1h收集沉淀。
6)檢測深度凍干滅活BCG制劑的蛋白質(zhì)和多糖含量。
a)材料與方法將深度凍干滅活BCG制劑(10mg)懸浮于1ml的4％丁醇水溶液中，并分裝至2個eppendorf管(每管500μl)中，管中有1g氧化鋯/二氧化硅珠(0.1mm)(BIOSPEC PRODUCTS，INC.)。將管放置于Mixer Mills(MM301，RESCH)中，在5，15，30，60，120，180，240，300或470分鐘內(nèi)放入25次。然后將管以10000 rpm離心30 min；回收上清液，過濾(0.22μm濾膜，MILLIPORE)，如下所述測定蛋白質(zhì)、氨基酸和多糖的濃度-以Micro BCA Protein試劑盒(PIERCE)測定總蛋白濃度，-通過質(zhì)譜法分析測定氨基酸濃度，-使用S.Melvin，Anal.Biochem.1953，25，1656-所述的蒽酮方法測定總多糖濃度。
在5、60或300min收集細菌提取物，將細菌提取物的樣品(5μg蛋白質(zhì))以SDS-PAGE分離，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，并以Aurodye(Pharmacia)或抗分枝桿菌蛋白質(zhì)的多克隆抗體染色。
b)結(jié)果提取后5、60或300 min收集的細菌提取物分別含有280、500和1258μg蛋白質(zhì)；190、420和880μg氨基酸和697、1267和1765μg的多糖。
圖16顯示的結(jié)果說明，如蛋白質(zhì)為不連續(xù)的條帶且沒有降解帶所示，深度凍干方法可保留滅活BCG制劑中的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)；深度凍干滅活BCG制劑提取物的蛋白質(zhì)分布圖與活BCG制劑的蛋白質(zhì)分布圖相似。
實施例3深度凍干滅活的分枝桿菌在小鼠模型中對哮喘的保護作用1)材料與方法a)動物雄性成熟(6至7周齡)BP2(H-2q)小鼠來自Centre d′élevage R.Janvier(Le Genest，Saint Isle，法國)并在無特異性病原體的條件下的動物飼養(yǎng)設(shè)施中飼養(yǎng)。
b)哮喘樣免疫原特異性疾病的小鼠模型在第0天(D0)和第7天(D7)，以1μg卵清蛋白(OVA；ICNLaboratories)和1.6mg氫氧化鋁佐劑(溶于鹽水，終體積0.4ml)對雄性成熟BP2小鼠經(jīng)皮下途徑(頸部背側(cè))進行免疫接種。通過在第96-98天以溶于50μl鹽水的10μg OVA進行鼻內(nèi)攻擊實驗以誘發(fā)過敏反應(yīng)。或者，將一種水溶性ray-grass花粉提取物用作免疫原，免疫接種的添加與OVA相同，但提取物的量為10μg。
c)制備分枝桿菌免疫調(diào)制組合物將如實施例1所述制備的深度凍干滅活BCG作為BP2小鼠的哮喘疫苗進行測試，并與以下BCG制劑相比較-活BCG牛分枝桿菌BCG巴斯德疫苗株1173P2分散生長于Beck-Proskauer培養(yǎng)基(Gheorghiu等，1988，J.Biol.Standard.，16，15-26)中，培養(yǎng)基補充了0.05％Triton WR 1339(SIGMA)和6％葡萄糖。在對數(shù)生長期收集細菌(5至7天)并在-70℃存放于Beck-Proskauer培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中補充了0.05％Triton和6％甘油。將以PBS適當(dāng)稀釋的細菌懸液接種在Middlebrook 7H10瓊脂培養(yǎng)基(DIFCO)中以測定每毫升的集落形成單位(CFU)數(shù)量。臨注射前將懸液按照108、109或1010CFU/ml的濃度以PBS稀釋以注射(100μl)。
熱滅活BCG將如上制備的活BCG以3000 rpm離心15分鐘，棄上清液。將沉淀重懸于鹽水中，例如含有硼酸的緩沖液(Na2B4O710H2O 0.363％；H3BO30.525％；NaCl 0.619％和Tween-20 0.0005％，溶于蒸餾水，pH 8)中，將懸液在115℃高壓滅菌15分鐘。
d)對小鼠哮喘模型施用深度凍干滅活的分枝桿菌的治療方案如上所述，以O(shè)VA對雄性成熟BP2小鼠進行免疫接種。給每組25只小鼠注射100μl的如上所述制備的BCG組合物。
-活BCG疫苗株1173P2(107CFU)，-熱滅活BCG(108菌體，相當(dāng)于107CFU)，-深度凍干滅活BCG(10μg至10mg；10μg相當(dāng)于107CFU)，和-PBS，在首次接種OVA后的D42-45和D65-70，通過皮下途徑(尾根部)注射。
通過在第96-98天以溶于50μl鹽水的100μg OVA進行鼻內(nèi)攻擊實驗以誘發(fā)過敏反應(yīng)；鼻內(nèi)施用PBS作為對照。
e)支氣管肺(BHR)分析使用了一種可對非麻醉動物進行BHR研究的氣壓體積描記裝置(barometric plethysmographic equipment(BUXCO))。以O(shè)VA免疫接種的動物經(jīng)不同的BCG制劑處理或不處理，以O(shè)VA或水溶性ray-grass花粉提取物進行攻擊實驗，24h后對動物進行測試。將動物置于體積描記室中。記錄其基礎(chǔ)通氣參數(shù)，然后在20秒或1分鐘內(nèi)使用標(biāo)準(zhǔn)的氣霧裝置使小鼠吸入100 mM乙酰甲膽堿(ALDRICH)的水溶液，在施用乙酰甲膽堿氣霧劑后的10分鐘內(nèi)記錄小鼠的通氣參數(shù)。報告該段時間內(nèi)通氣的下降(曲線下面積)并將支氣管肺阻力表示為增強暫停(Penh)，按照制造商的說明如下計算(呼氣時間(tE)/40％的松弛時間(trel)-1)x呼氣峰流速(PEF)/吸氣峰流速(PIF)x 0.67。每分鐘記錄Penh的平均值。作圖時表示出相應(yīng)于每分鐘的每個值。
f)支氣管肺泡灌洗液(BAL)通過腹腔注射致死量的氨基甲酸乙酯(urethane)(1.5g/kg；SIGMA)將小鼠麻醉。自腹主動脈放血，將連接于注射器的導(dǎo)管放置于氣管內(nèi)，以0.7ml PBS洗滌肺3次，將灌洗液收集到試管中并置于冰上。
以COULTER的自動計數(shù)裝置(ZBI)測定BAL中的細胞數(shù)。為測定各種細胞類型(嗜酸細胞、中性粒細胞、巨噬細胞)的百分?jǐn)?shù)，將BAL中的細胞離心至玻片上，以DIFF QUICK(BAXTER)進行染色。
g)纖連蛋白分析將BAL以1000rpm離心10min，4℃，按照標(biāo)準(zhǔn)方案(Rennard等，Anal.Biochem.，1980，205-214)，通過競爭性酶免疫測量分析(EnzymeImmunometric Assay(EIA))測定上清液中的纖連蛋白。
h)肺外植體的制備和分析將肺每隔3mm切成大約1mm的小片，來自每個肺的4或5條組織被放置在組織培養(yǎng)盤的孔中，其中含有1ml的AIM V培養(yǎng)基(LifeTechnologies)。將肺外植體單獨培養(yǎng)在培養(yǎng)基中以進行基礎(chǔ)水平測定；或者將BCG培養(yǎng)物濾出液(10μg/ml)加入到培養(yǎng)物中，以顯示分枝桿菌特異性細胞；或者將抗CD3單克隆抗體加入到培養(yǎng)物中，以顯示T淋巴細胞的反應(yīng)性。24h后，通過ELISA法測定各種淋巴因子(IFN-γ、TNF-α、IL-10…)的存在，使用的是商品化試劑盒，按照制造商的說明檢測。
將整個肺(無支氣管)在含膠原酶和DNase的培養(yǎng)基中進行解離，然后用不同熒光標(biāo)記的各種單克隆抗體，通過流式細胞儀測定浸潤細胞。
i)肺的組織病理學(xué)分析將整個肺固定于甲醛緩沖液中并處理以便進行組織病理學(xué)分析。Schiff染色用于染色粘液和含有粘液的細胞，蘇木精-曙紅(hematoxy-eosin)染色用作本底染色。由同一個觀察者進行玻片的檢測和細胞浸潤和粘液含量的評價，該觀察者對玻片進行積分時并不知道培樣品的來源(盲法分析)。
j)細胞因子分析細胞因子存在于來自免疫接種小鼠組的血清和BAL樣品中，或者由來自這些小鼠的肺外植體培養(yǎng)物分泌，如下測定細胞因子IFN-γ、IL-10和IL-12由ELISA檢測；TNF-α和IL-5通過EIA(Enzyme ImmunometricAssay)檢測。
k)OVA特異性IgE分析按照標(biāo)準(zhǔn)方案(Hansen等，J.Immunol.，2000，223-230)，通過ELISA分析血清中OVA特異性IgE的水平。
1)統(tǒng)計學(xué)分析每組動物的數(shù)量(n)為4＜n＜8。對獨立事件進行student’st檢驗。
2)結(jié)果a)支氣管肺(BHR)分析動物以O(shè)VA或一種水溶性ray-grass花粉提取物進行免疫接種，并以不同的BCG制劑處理或者不處理，以O(shè)VA或ray-grass花粉進行攻擊實驗后24h，對動物進行測試。
這些研究中采用的模型為具有Th2背景的BP2小鼠，以卵清蛋白聯(lián)合氫氧化鋁對小鼠進行免疫接種，氫氧化鋁是一種較弗氏不完全佐劑效力更高的一種過敏反應(yīng)的佐劑，因此這些動物模型較CC W等采用弗氏不完全佐劑內(nèi)的卵清蛋白進行免疫接種的BALB/c小鼠模型更加嚴(yán)格，見前。
圖2和3的數(shù)據(jù)說明，在這種嚴(yán)格的哮喘模型中，深度凍干滅活BCG(10μg)具有顯著的支氣管肺保護作用(p＜0.001)，如與對照相比，其使得對乙酰甲膽堿的反應(yīng)性降低。與此不同，在這種樣的哮喘模型中，以活BCG(107CFU)或熱滅活BCG(108菌體)處理的動物中未觀察到明顯的保護作用。當(dāng)使用一種水溶性ray-grass花粉提取物作為免疫原時，深度凍干滅活BCG(EFD)制劑顯示出相似的對哮喘的保護作用(p＜0.01)(圖17)。
b)支氣管肺泡灌洗液(BAL)在10μg、100μg、1mg或10mg深度凍干滅活BCG處理組的小鼠觀察到嗜酸細胞數(shù)(p＜0.05)和中性粒細胞數(shù)下降(p＜0.05)(圖4，5，15A，18A和18B)。
氣道滲出液中纖連蛋白的水平代表炎癥反應(yīng)，深度凍干滅活BCG處理組(10μg，圖6)的纖連蛋白水平顯示出非常明顯的下降。
IL-5是一種淋巴因子，其在過敏反應(yīng)中涉及嗜酸細胞數(shù)的增高，在深度凍干滅活BCG處理組，BAL和血中的IL-5均下降(圖7，8和15)。
IL-4是一種Th2細胞因子，在10μg，100μg，1mg或10mg深度凍干滅活BCG處理組的小鼠中，BAL中的IL-4明顯下降，具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖18C)。
相比之下，在以活BCG(107CFU)或熱滅活BCG(108菌體)處理的小鼠中未發(fā)現(xiàn)明顯的作用。
這些結(jié)果說明，深度凍干滅活BCG可誘導(dǎo)能夠治療哮喘癥狀的免疫應(yīng)答，如肺部炎癥反應(yīng)降低所示(嗜酸細胞和中性粒細胞的產(chǎn)生，纖連蛋白滲出物)。在這種具有Th2背景的嚴(yán)格的哮喘模型(BP2小鼠)中，活BCG或熱滅活BCG處理組均未出現(xiàn)保護作用。
c)組織病理學(xué)和肺部浸潤細胞分析肺部組織病理學(xué)分析顯示，深度凍干滅活BCG(EFD)處理可防止肺部白細胞浸潤和支氣管上皮的粘膜轉(zhuǎn)化。
通過流式細胞儀分析肺組織內(nèi)的細胞，證實了上述結(jié)果，流式細胞儀分析顯示，深度凍干滅活BCG處理可顯著降低肺部白細胞浸潤(p＜0.001)(圖19)；對各種白細胞群體的分析(圖20)顯示，深度凍干滅活BCG處理組的肺部的巨噬細胞(CD11b+)、多形核白細胞(Gr1+)和樹突狀細胞(CD11c+)的數(shù)量均降低。
d)細胞因子分析將以不同BCG制劑處理的各組小鼠的肺組織在有或沒有BCG分泌的非純化蛋白或抗CD3mAb的條件下培養(yǎng)，分析上清液中產(chǎn)生的IFN-γ和IL-10。
圖9和21顯示的結(jié)果說明，IFN-γ的產(chǎn)生需要BCG免疫接種(圖9A)。觀察到深度凍干滅活BCG組中IFN-γ水平較低(圖9A)，但與其他BCG免疫接種組沒有顯著性差別。以抗CD3抗體非特異性刺激T淋巴細胞顯示各組(用或不用BCG處理)的IFN-γ水平相似，提示BCG免疫接種沒有改變肺部T淋巴細胞數(shù)量(圖9B)。
圖21所示的結(jié)果顯示，與活BCG和熱滅活BCG處理組相比，深度凍干滅活BCG處理組中的IL-10明顯較高(p＜0.001)。
深度凍干滅活BCG處理組與其他BCG制劑處理組之間在肺部細胞因子表達分布圖上存在差異，這提示深度凍干滅活BCG的活性與施用免疫原后肺組織內(nèi)的白細胞群體的變化相關(guān)。肺外植體釋放的高水平的IL-10和低水平的IFN-γ表明，施用免疫原后，深度凍干滅活BCG處理組的肺組織中存在調(diào)控細胞。
e)抗OVA特異性IgE的水平先以O(shè)VA進行免疫接種，隨后以不同BCG制劑(治療方案)處理，抗OVA IgE水平在各組中相同(圖10)，提示深度凍干滅活BCG的保護作用不直接影響IgE濃度。
實施例4分析由熱滅活或深度凍干滅活BCG刺激引起的肺泡巨噬細胞產(chǎn)生的細胞因子1)材料與方法如實施例3所述得到并飼養(yǎng)BP2和BALB/c(H-2d)小鼠，如實施例3b所述以O(shè)VA進行免疫接種。末次注射OVA后1周，通過腹腔途徑用致死量的氨基甲酸乙酯(1.5g/kg；SIGMA)將小鼠麻醉。自腹主動脈放血，將連接于注射器的導(dǎo)管放置于氣管內(nèi)，以0.5ml含有2％胎牛血清的HBSS培養(yǎng)基(Life Technologies)洗滌肺2次，隨后以1ml同樣培養(yǎng)基洗滌5次，將灌洗液收集到試管中并置于冰上。通過COULTER的自動計數(shù)裝置(ZBI)測定BAL中存在的巨噬細胞數(shù)量。將巨噬細胞在室溫1000rpm離心20min收集，將其濃度調(diào)整為340.103細胞/ml，培養(yǎng)基為RPMI 1640培養(yǎng)基，含有3％胎牛血清，2mM谷氨酰胺，100UI/ml青霉素和10μg/ml鏈霉素。然后將巨噬細胞分配至96孔板進行組織培養(yǎng)(100 000細胞/孔)，并在37℃，5％CO2條件下孵育至少2小時。而后以RPMI培養(yǎng)基洗滌數(shù)次以便去除非貼壁細胞，將巨噬細胞在存在熱滅活BCG或深度凍干滅活BCG的條件下培養(yǎng)(相當(dāng)于5 CFU/巨噬細胞，例如兩種BCG制劑均為1.6106CFU/ml)；以E.coli脂多糖(LPS；1μl/ml)和OVA(10μg/ml)作為對照。在加入各種制劑后2，4，6，8，12，24，48，72和96小時收集細胞培養(yǎng)物上清液，并立即冷凍于-20℃。
2)結(jié)果圖11和12所示結(jié)果說明1)IL-12參與Th1細胞的成熟和抗過敏細胞因子(IFN-γ)的產(chǎn)生，經(jīng)深度凍干滅活BCG制劑和熱滅活BCG制劑刺激，BALB/c和BP2小鼠肺泡巨噬細胞產(chǎn)生IL-12，2)TNF-α是一種與嚴(yán)重的炎癥性副作用(壞死、潰瘍…)相關(guān)的細胞因子，其僅由熱滅活BCG制劑刺激的BALB/c和BP2小鼠肺泡巨噬細胞產(chǎn)生；在本實驗所使用的濃度下，深度凍干滅活BCG制劑刺激的肺泡巨噬細胞未產(chǎn)生TNF-α。
這些結(jié)果支持注射深度凍干的BCG后產(chǎn)生極少的不良反應(yīng)，這不同于注射熱滅活BCG和活BCG引起的不良反應(yīng)。
實施例5施用深度凍干滅活BCG不誘導(dǎo)針對BCG純化蛋白衍生物(PPD)的遲發(fā)型過敏反應(yīng)(DTH)1)材料與方法如實施例3d所述，以O(shè)VA對小鼠進行免疫接種，以不同的BCG制劑處理，或不處理。在首次皮下注射各種BCG制劑后100天，在各組小鼠進行針對BCG純化蛋白衍生物(PPD)的遲發(fā)型過敏反應(yīng)(DTH)，BCG純化蛋白衍生物(PPD)在人類用于診斷結(jié)核病。更確切地，將50μl溶于鹽水的PPD(4μg)注射于小鼠爪墊，24h后測量該爪墊的腫脹。
2)結(jié)果圖13所示結(jié)果表明，以深度凍干滅活BCG(相當(dāng)于107CFU或10μg)免疫接種的小鼠不出現(xiàn)針對BCG純化蛋白衍生物的遲發(fā)型過敏反應(yīng)，如陰性的皮試結(jié)果所示。僅在注射大劑量深度凍干滅活BCG(1mg和10mg)時，小鼠才出現(xiàn)針對PPD的輕度過敏。相比之下，即使以低劑量活BCG或熱滅活BCG(107CFU的活BCG或相當(dāng)于108菌體的熱滅活BCG)免疫接種的小鼠也出現(xiàn)了針對BCG純化蛋白衍生物的遲發(fā)型過敏反應(yīng)，如陽性皮試結(jié)果所示。這些結(jié)果與前面的結(jié)果(圖9和21)一致，前面的結(jié)果(圖9和21)顯示，在深度凍干滅活BCG處理組，特異性刺激僅產(chǎn)生少量的IFN-γ，與此不同，其他BCG制劑處理組經(jīng)特異性刺激產(chǎn)生較高水平的IFN-γ。相似地，深度凍干滅活BCG處理的豚鼠對PPD產(chǎn)生臨界的反應(yīng)。
這些結(jié)果說明，以深度凍干滅活BCG免疫接種后，選擇出了一種特定亞型的特異性T淋巴細胞，或者，特異性T細胞被局限在一些特定的組織中。結(jié)果是，與用活BCG或熱滅活BCG免疫接種不同，以深度凍干滅活BCG免疫接種不會影響通過DTH皮試對結(jié)核病進行診斷。
實施例6深度凍干的(EFD)滅活的分枝桿菌在豚鼠模型中對哮喘的保護作用1)材料與方法以10μg卵清蛋白(OVA；ICN Laboratories)和1mg溶于鹽水的明礬(0.4ml終體積)通過皮下途徑接種雄性成熟豚鼠(350g)。
3周后，給所述豚鼠(3組，10只動物/組)經(jīng)皮注射深度凍干滅活BCG(107或108CFU相當(dāng)于，即10μg或100μg)或PBS(對照)。
分析豚鼠的支氣管肺反應(yīng)性采用與小鼠不同的方法；在進行免疫原攻擊實驗前24h，逐漸增加組胺氣霧劑的劑量(20，50，100或400μg)以評價每只動物的敏感性，使Penh值升高的組胺的最高濃度被視為組胺敏感性的基礎(chǔ)水平。
在免疫原攻擊實驗后24h進行相似的檢測；以O(shè)VA免疫接種的豚鼠對組胺的敏感性較高，因此達到相同Penh值所需要的組胺少于攻擊實驗前。
更具體地注射BCG或?qū)φ债a(chǎn)品7至10周(例如卵清蛋白免疫接種后10至13周)進行組胺測試，以評價每組6只豚鼠的支氣管肺反應(yīng)性。
對于每只豚鼠，均使用氣壓體積描記法測定誘發(fā)明顯支氣管收縮的組胺的劑量。
每只豚鼠均以其自身作為對照，基礎(chǔ)反應(yīng)性在測試的第1天測定。
24小時后，施用一種卵清蛋白氣霧劑。第3天再次測定組胺反應(yīng)性。
施用卵清蛋白增加了對組胺的支氣管肺高反應(yīng)性。
2)結(jié)果圖14所示的結(jié)果說明，經(jīng)10μg(與107CFU相當(dāng))(圖14B)或100μg(與108CFU相當(dāng))(圖14C)本發(fā)明的深度凍干滅活BCG處理后，分別有5/6和6/6豚鼠產(chǎn)生了針對支氣管肺高反應(yīng)性的保護作用(組胺敏感性沒有增加)，而對照組(圖14A)(無BCG處理組)對組胺的支氣管肺高反應(yīng)性明顯升高(x4)。
實施例7深度凍干滅活BCG的副作用輕微a)無貧血且無血小板減少如實施例3d所述給小鼠靜脈注射深度凍干滅活BCG(10μg)或不同的BCG制劑，或不進行處理。注射后18天，測定血樣中的紅細胞和血小板數(shù)量。
圖22所示的結(jié)果說明，與活BCG和熱滅活BCG處理組不同，在深度凍干的BCG處理組沒有觀察到貧血和血小板減少。
b)注射部位的炎癥反應(yīng)輕微在第0天，如實施例3d所述，給各組小鼠皮下注射各種BCG制劑(在爪墊部位)?；頑CG僅至少一次，而熱滅活BCG和深度凍干滅活BCG至少兩次(第0天和第36天)。每周測量爪墊增大的情況，連續(xù)10周。
圖23所示的結(jié)果說明，深度凍干滅活BCG引起最小的炎癥副作用。
c)降低LPS刺激引起的TNF-α產(chǎn)生肺外植體來自如上所述經(jīng)不同BCG制劑預(yù)先處理18天的小鼠，將肺外植體體外培養(yǎng)于有或沒有LPS的條件下，然后使用商品化的ELISA試劑盒按照制造商的說明測定TNF-α的產(chǎn)生情況。圖24所示的結(jié)果說明，不同于活BCG和熱滅活BCG處理，深度凍干滅活BCG處理不誘導(dǎo)產(chǎn)生和/或激活巨噬細胞。
實施例8分析皮下注射深度凍干滅活BCG后引流淋巴結(jié)內(nèi)和脾臟內(nèi)的細胞1)材料與方法以實施例3d所述的不同BCG制劑皮下注射處理小鼠，48小時后取小鼠的引流淋巴結(jié)，用標(biāo)記了各種熒光的針對不同白細胞群體的細胞表面標(biāo)記物的單克隆抗體，通過流式細胞儀分析引流淋巴結(jié)內(nèi)的細胞。
取經(jīng)皮下注射深度凍干滅活BCG處理的小鼠的脾臟的細胞，經(jīng)或不經(jīng)OVA或BCG培養(yǎng)物上清液體外刺激后，按照如上所述檢測。
2)結(jié)果a)引流淋巴結(jié)對引流淋巴結(jié)內(nèi)的細胞進行分析顯示，與活BCG和熱滅活BCG處理組相比，皮下注射深度凍干滅活BCG后48h，淋巴結(jié)內(nèi)的細胞數(shù)量高處3至5倍。注射深度凍干滅活BCG后，對各種白細胞群體進行4天的動態(tài)分析，結(jié)果顯示樹突狀細胞(CD11c+)數(shù)量在48小時時出現(xiàn)一過性升高，且發(fā)現(xiàn)B220+和CD4+淋巴細胞的數(shù)量自6至96小時出現(xiàn)升高。
b)脾臟對脾臟內(nèi)的細胞進行分析發(fā)現(xiàn)-CD11c+Gr1+B220+漿細胞樣樹突狀細胞的數(shù)量在深度凍干滅活處理組明顯升高，該組中未觀察到CD8α+細胞升高(圖25)。
-無論是以O(shè)VA或BCG培養(yǎng)物上清液進行體外刺激，還是不進行刺激，深度凍干滅活處理組中CD4+CD25+IL-10+細胞數(shù)量均明顯增多(圖26)。
這些結(jié)果說明，在小鼠哮喘模型中，深度凍干滅活BCG能夠在預(yù)先以免疫原(OVA或水溶性ray-grass花粉)致敏的小鼠中誘導(dǎo)一些細胞數(shù)量明顯升高，所述的細胞能誘導(dǎo)免疫調(diào)制細胞(CD11c+Gr1+B220+漿細胞樣樹突狀細胞)或其本身即為免疫調(diào)制細胞(CD4+CD25+IL-10+細胞)，由此導(dǎo)致產(chǎn)生抗哮喘癥狀的保護作用。
實施例9口服途徑的深度凍干滅活BCG具有活性如實施例3d所述，預(yù)先以O(shè)VA免疫小鼠，然后在第42，44，46和62，64和66天口服1mg深度凍干的制劑，或者不處理，然后在第96天以O(shè)VA進行攻擊實驗。如實施例3所述，通過計數(shù)肺部細胞浸潤而評測深度凍干滅活BCG的保護作用。
結(jié)果顯示，與未處理組(圖27)相比，深度凍干滅活BCG處理組的肺部細胞總數(shù)明顯降低(p＜0.001)。白細胞群體分析顯示，處理組的肺內(nèi)巨噬細胞、多形核白細胞和樹突狀細胞數(shù)量明顯下降。
實施例10確定深度凍干滅活BCG的作用劑量、施用周期(rhythm)、作用持續(xù)時間和作用的延遲給預(yù)先免疫的小鼠皮下途徑注射深度凍干滅活BCG，然后以O(shè)VA進行攻擊實驗，然后如實施例3所述測定深度凍干滅活BCG的活性。
a)作用劑量和施用次數(shù)在第0天和第7天以O(shè)VA將成熟小鼠致敏，在第45天皮下注射深度凍干滅活BCG一次，或者在第45天和第65天兩次皮下注射深度凍干滅活BCG，然后在第96天以卵清蛋白進行攻擊實驗。如實施例3所述，通過對BP2哮喘模型的支氣管肺高反應(yīng)性的預(yù)防作用檢測深度凍干滅活BCG的活性。
最小的劑量(10μg)仍有活性，但劑量超過100μg并未進一步增加活性。
僅單劑(10μg)深度凍干滅活BCG顯示出具有保護作用(圖28)。
b)深度凍干滅活BCG的作用的延遲為了確定獲得深度凍干滅活BCG的功效的施用時序，在第0天和第7天以O(shè)VA將成熟小鼠(每組6只)致敏，在第14天皮下注射100μg深度凍干滅活BCG，然后在第21、28或35天以O(shè)VA進行攻擊。如實施例3所述，通過對BP2哮喘模型的支氣管肺高反應(yīng)性的預(yù)防作用檢測深度凍干滅活BCG的活性。
僅在施用深度凍干滅活BCG和攻擊實驗之間存在2-3周的延遲時才出現(xiàn)對支氣管肺高反應(yīng)性的預(yù)防作用(圖29)；此結(jié)果提示深度凍干滅活BCG的作用的產(chǎn)生需要一個特定細胞群體的募集和擴增的過程。此結(jié)果也證實單劑的深度凍干滅活BCG足以在小鼠產(chǎn)生抗哮喘的保護作用。
c)深度凍干滅活BCG的作用持續(xù)時間為了確定深度凍干滅活BCG的作用持續(xù)時間，在第0天和第7天以O(shè)VA將成熟小鼠(每組6只)致敏，在第45天和第65天皮下注射100μg深度凍干滅活BCG，然后在第96或42天以O(shè)VA進行攻擊。如實施例3所述，通過對BP2哮喘模型的支氣管肺高反應(yīng)性的預(yù)防作用以及計數(shù)肺部細胞浸潤情況來評測深度凍干滅活BCG的活性。
結(jié)果顯示深度凍干滅活BCG的保護作用可持續(xù)至少2個月(圖30)。
d)施用深度凍干的BCG的預(yù)防與治療方案上述結(jié)果證明了深度凍干滅活BCG在“治療方案”(在以免疫原接種后施用)中的功效。因此，為了評價深度凍干滅活BCG在預(yù)防方案中的功效，將小鼠進行如下處理-在進行OVA免疫接種前14、21或28天(第-14、-21和-28天)，給成熟小鼠(6-7周齡；每組6只小鼠)皮下注射深度凍干滅活BCG(100μg)，在第0和7天以O(shè)VA進行免疫接種，然后在第14天以O(shè)VA進行攻擊實驗。
-在進行OVA免疫接種前56天(第-56天)，給新生小鼠(7-8日齡，每組6-8只小鼠)皮下注射或鼻內(nèi)施用深度凍干滅活BCG(100μg)，在第0天和第7天以O(shè)VA進行免疫接種，然后在第14天以O(shè)VA進行攻擊實驗。
如實施例3所述，通過對BP2哮喘模型的支氣管肺高反應(yīng)性的預(yù)防作用來評測深度凍干滅活BCG在預(yù)防方案中的作用。
成熟小鼠中的結(jié)果顯示，僅在進行致敏之前的某幾天(2周和3周)注射深度凍干的BCG制劑時，該制劑才在預(yù)防方案產(chǎn)生保護作用。
新生小鼠中的結(jié)果顯示，僅在皮下施用時，深度凍干的BCG才在預(yù)防方案中產(chǎn)生保護作用；在所述條件下，鼻內(nèi)施用作用不佳。
權(quán)利要求
1.一種細菌制劑，其特征在于-其含有滅活的革蘭氏陽性菌，所述滅活的革蘭氏陽性菌可通過一種不引起來自所述細菌細胞的分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生變性的方法而獲得，且-其能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)調(diào)制針對一種抗原的免疫應(yīng)答。
2.權(quán)利要求1的細菌制劑，其特征在于所述的革蘭氏陽性菌選自革蘭氏陽性兼性胞內(nèi)菌。
3.權(quán)利要求2的細菌制劑，其特征在于所述的革蘭氏陽性兼性胞內(nèi)菌選自利斯特氏菌(Listeria sp.)，棒桿菌(Corynobacterium sp.)，或包含分枝桿菌、諾卡氏菌(Nocardia sp.)和紅球菌(Rhodococcus sp.)的放線菌類(Actinomycetes)。
4.權(quán)利要求3的細菌制劑，其特征在于所述的分枝桿菌是牛分枝桿菌，更優(yōu)選地為牛分枝桿菌BCG。
5.權(quán)利要求1至4中任一項的細菌制劑，其特征在于其含有通過一種深度凍干方法而得到的深度凍干滅活的細菌。
6.權(quán)利要求4的細菌制劑，其特征在于其含有深度凍干滅活的分枝桿菌。
7.權(quán)利要求5或6的細菌制劑，其特征在于其含有的殘留水分低于1.5％、優(yōu)選地低于1％、更優(yōu)選地低于0.5％。
8.權(quán)利要求5至7中任一項的細菌制劑，其特征在于其是通過一種深度凍干方法而制備的，所述的方法至少包含如下步驟(i)收集活細菌細胞的培養(yǎng)物，(ii)在水中或鹽的水溶液如硼酸鹽的水溶液中洗滌所述的細菌細胞，(iii)在水中或鹽的水溶液如硼酸鹽的水溶液中冷凍所述的細菌細胞，(iv)通過在冷凍干燥器中對所述的冷凍的細菌細胞進行干燥處理而將其滅活，處理的時間足以除去至少98.5％、優(yōu)選地至少99％、且更優(yōu)選地至少99.5％的水分，且(v)收集所述的深度凍干滅活的細菌細胞。
9.權(quán)利要求5至7中任一項的細菌制劑，其特征在于其是通過一種包含權(quán)利要求8的步驟(i)、(iii)、(iv)和(v)的深度凍干方法而制備的。
10.權(quán)利要求8或9的細菌制劑，其特征在于其是通過在干燥室壓力為大約0.02mBar至0.2mBar；更優(yōu)選地為大約0.06mBar至0.1mBar的條件下進行步驟(iv)而制備的。
11.權(quán)利要求1至10中任一項的細菌制劑的成分，所述成分選自如下一組-成分A，其由所述滅活的細菌制劑的一種有機溶劑提取物組成，-成分B，其由所述滅活的細菌制劑經(jīng)糖苷酶處理的一種提取物組成，-成分C，其由所述滅活的細菌制劑經(jīng)DNase和/或RNase消化的一種提取物組成，-成分D，其由所述滅活的細菌制劑經(jīng)蛋白酶處理的一種提取物組成，-成分E，其由所述滅活的細菌制劑經(jīng)有機溶劑、糖苷酶、DNase和/或RNase相繼處理、且最后經(jīng)蛋白酶處理得到的一種提取物組成。
12.權(quán)利要求11的成分，其特征在于-所述成分A通過以甲醇/氯仿混合物提取而得到，-所述成分B通過以溶菌酶消化而得到，-所述成分C通過以DNase I和/或RNase A消化而得到，且-所述成分D通過以枯草桿菌蛋白酶消化而得到。
13.一種藥物組合物，其特征在于其包含有效量的如權(quán)利要求1至10中任一項所述的一種細菌制劑和/或至少一種如權(quán)利要求11或12所述的成分、藥物學(xué)可接受的載體和/或添加劑、和/或免疫刺激劑、和/或佐劑和/或不同于權(quán)利要求1的細菌制劑的免疫調(diào)制劑。
14.權(quán)利要求1至10中任一項所述的細菌制劑或權(quán)利要求11或12所述的成分在制備一種用于預(yù)防和/或治療包含免疫失調(diào)的疾病的藥物中的用途。
15.權(quán)利要求14的用途，其中所述的包含免疫失調(diào)的疾病選自癌癥、自身免疫病或過敏癥。
16.權(quán)利要求15的用途，其中所述的自身免疫病選自多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克隆氏病或糖尿病。
17.權(quán)利要求15的用途，其中所述的過敏癥選自哮喘、過敏性鼻炎、結(jié)膜炎或特應(yīng)性皮炎。
18.權(quán)利要求14至17中任一項的用途，其中所述的藥物可經(jīng)口服、舌下、胃腸外，且優(yōu)選地經(jīng)皮下或鼻內(nèi)而施用。
19.一種制備如權(quán)利要求5至10中任一項所述的深度凍干滅活的細菌制劑的方法，其特征在于其至少包含以下步驟(i)收集活細菌細胞的培養(yǎng)物，(ii)在水中或鹽的水溶液中洗滌所述的細菌細胞，(iii)在水中或鹽的水溶液中冷凍所述細菌細胞，(iv)通過在冷凍干燥器中對冷凍的細菌細胞進行干燥處理而將其滅活，處理的時間足以除去至少98.5％、優(yōu)選地至少99％、且更優(yōu)選地至少99.5％的水分，且(v)收集所述的深度凍干滅活的細菌細胞。
20.一種制備如權(quán)利要求5至10中任一項所述的深度凍干滅活的細菌制劑的方法，其特征在于其包含如權(quán)利要求19所述的步驟(i)、(iii)、(iv)和(v)。
21.權(quán)利要求19或20的方法，其特征在于步驟(iv)是在干燥室壓力為大約0.02mBar至0.2mBar，更優(yōu)選地為0.06mBar至0.1mBar的條件下進行的。
22.用于治療包含免疫失調(diào)的疾病的試劑盒，其特征在于其包含至少一種如權(quán)利要求13所述的藥物組合物、用來施用所述藥物組合物的手段和/或用來保證對所建議的治療具有依從性的手段。
23.作為一種同時、單獨或序貫用于預(yù)防和/或治療包含免疫失調(diào)的疾病的聯(lián)合制劑的制品，其含有如權(quán)利要求1至10中任一項所述的細菌制劑或權(quán)利要求11或12所述的成分以及一種選自抗癌藥物、抗糖尿病藥物或免疫調(diào)制藥物的產(chǎn)品。
24.權(quán)利要求23的制品，其特征在于所述制品是一種抗組胺藥物或一種抗炎藥物。
25.權(quán)利要求1至10中任一項所述的細菌制劑或權(quán)利要求11或12所述的成分在制備用于通過口服、胃腸外、舌下或鼻內(nèi)途徑，至少自通常接觸免疫原之前2周開始，每間隔2個月施用以治療哮喘的藥物中的用途，其中所述藥物的施用劑量范圍相當(dāng)于在小鼠中為1μg至10 000μg、優(yōu)選地為10μg至1 000μg、最優(yōu)選地為10μg至100μg。
26.權(quán)利要求1至10中任一項所述的細菌制劑或權(quán)利要求11或12所述的成分在制備用于通過口服、胃腸外、舌下或鼻內(nèi)途徑施用以預(yù)防人類嬰兒的哮喘的藥物中的用途，其中所述藥物的施用劑量范圍相當(dāng)于在小鼠中為1μg至10 000μg、優(yōu)選地為10μg至1 000μg、最優(yōu)選地為10μg至100μg。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含自革蘭氏陽性菌、如革蘭氏陽性兼性胞內(nèi)菌例如分枝桿菌制備的成分的組合物，所述組合物包括深度凍干滅活的革蘭氏陽性菌，涉及其制備方法以及其在預(yù)防和/或治療人類和動物的包含免疫失調(diào)的疾病如癌癥、自身免疫病、過敏癥和結(jié)核病中的用途。
文檔編號A61K39/02GK1602199SQ02824733
公開日2005年3月30日 申請日期2002年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月11日
發(fā)明者瑪麗-安妮·拿獲里, 米舍利娜·拉格朗迪, 吉勒·馬沙爾, 貝爾納多·鮑里斯·瓦爾加夫季格, 讓·勒福爾, 費利克斯·羅曼, 喬治·海基梅因, 菲利普·佩爾特 申請人:巴斯德研究院, 國家健康與醫(yī)學(xué)研究院