專利名稱：通過(guò)施用組織因子途徑抑制劑(tfpi)治療嚴(yán)重性肺炎的制作方法
相關(guān)專利申請(qǐng)的參照本專利申請(qǐng)要求提交于2001年10月15日的臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)60/328,806的優(yōu)先權(quán)，本文全部納入供參考。
發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及治療性處理嚴(yán)重性肺炎的方法。更具體地，它涉及施用組織因子途徑抑制劑蛋白質(zhì)以減弱與嚴(yán)重性肺炎相關(guān)的高度增生或擴(kuò)增生理途徑。
發(fā)明的背景肺炎是由于一種或多種肺功能元件的急性感染引起的，這些元件包括肺泡腔和間質(zhì)組織。在美國(guó)，每年約有200萬(wàn)人患上肺炎，其中有40,000-70,000人死亡。肺炎是第六大致死疾病，且是最常見(jiàn)的致命的醫(yī)院源性(醫(yī)院獲得的)感染。在美國(guó)，社會(huì)獲得性肺炎(CAP)對(duì)衛(wèi)生保健耗費(fèi)有顯著影響，估計(jì)每年的直接花費(fèi)為140億美元，損失高達(dá)90億美元。(Lynch JP，Martinez FJ.Community-acquiredpneumonia.Curr Opin Pulm Med.1998；4162-172)。在發(fā)展中國(guó)家，下呼吸道感染通常是造成死亡的主要原因，或僅次于感染性腹瀉。(The Merck Manual，第6部分，Ch.73，Pneumonia，2000)。
根據(jù)不同組織，包括美國(guó)胸協(xié)(American Thoracic Society)(ATS)，制訂的方針確定了“嚴(yán)重性肺炎”癥狀的特征。(Am J Respir Crit Care Med 2001；1631730-1754)。例如，在診斷嚴(yán)重性肺炎時(shí)，除其它標(biāo)準(zhǔn)外，ATS要求至少一個(gè)主要標(biāo)準(zhǔn)，如機(jī)械換氣或膿毒病性休克。通常，嚴(yán)重性肺炎可能是由于急性肺病、肺部炎性疾病、或因炎癥或血液凝固等因素引起的肺功能的任何紊亂造成的。嚴(yán)重性CAP的診斷基于肺炎ICU的住院患者。流行病學(xué)上，這類患者群體約占所有ICU入院患者的10％。肺炎ICU中的患者在所有CAP患者中死亡率最高(30％-40％)，而一般的CAP住院患者僅為15％。
在美國(guó)，每年約有400萬(wàn)成人被診斷患社會(huì)獲得性肺炎(CAP)，其中有600,000需要住院治療。Fine等，N.Engl.J.Med.336，243-50，1997。總體來(lái)說(shuō)，CAP的發(fā)病率隨年齡增加，在65歲及以上人群在最流行。Marston等，Arch InternMed.19971709-1718。這一發(fā)病率在患有慢性阻塞性肺炎、氣喘、糖尿病、酒精中毒、免疫抑制、腎機(jī)能不全、慢性肝病和心臟病等并發(fā)癥(comorbidities)的患者中更高。Marrie，Curr Opin Pulm Med.1996；2192-197；Niedermann et AL.，Am Rev RESPIRDIS 1993；1481418-1426。
在美國(guó)，肺炎是感染致死的首要原因，總體而言是第六大致死因素。與肺炎有關(guān)的死亡率從1979年到1992年增加了22％，在1992年，89％的年齡較大的患者(65歲及以上)的死亡與肺炎有關(guān)。參見(jiàn)“美國(guó)肺炎和流感死亡率，1979-1994[在MMWR.上刊有更正，1995；44782]。MMWR.1995；44535-537。Fine和他的同事(1997)報(bào)道說(shuō)，一些共存的疾病(腫瘤性疾病、充血性心力衰竭(CHF)、腦血管病、腎病和肝病)和一些身體檢查結(jié)果(精神狀態(tài)改變、心律增加、呼吸率增加、收縮壓降低和體溫異常降低或升高)都與升高的與CAP有關(guān)的發(fā)病率有關(guān)。此外，在美國(guó)，CAP對(duì)保健花費(fèi)有重大影響，估計(jì)每年的直接花費(fèi)為140億，而損失高達(dá)90億。Lynch和Martinez，Curr Opin Pulm Med.1998；4162-172。
組織因子途徑抑制劑(TFPI)是哺乳動(dòng)物血漿中存在的蛋白質(zhì)和絲氨酸蛋白酶抑制劑。Thomas，Bull.Johns Hopkins Hosp.81，26(1947)；Schncider，Am.J.Physiol.149，123(1947)；Broze&Miletich，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84，1886(1987)。TFPI也稱為組織因子抑制劑、組織促凝血酶原激酶抑制劑、因子III抑制劑、外源性途徑抑制劑(EPI)、脂蛋白相關(guān)凝血抑制劑(LACI)。名稱“組織因子途徑抑制劑(TFPI)”在1991年6月30日被血栓癥和止血國(guó)際學(xué)會(huì)接受。
血凝活化是血流轉(zhuǎn)變成固體凝膠或凝塊。此外，凝血蛋白酶的消耗導(dǎo)致過(guò)度出血。主要事件是可溶性纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成不溶性纖維蛋白鏈，盡管纖維蛋白本身僅形成0.15％的總血凝塊。此轉(zhuǎn)變是復(fù)雜酶級(jí)聯(lián)的最后一步。組分(因子)作為酶原存在，酶原是蛋白水解酶的失活前體，通過(guò)在特異性位點(diǎn)蛋白酶裂解而轉(zhuǎn)變成活性酶。少量的一種因子的活化催化較大量的下一因子的形成并以此類推，產(chǎn)生的拉增使纖維蛋白非常迅速地形成。
認(rèn)為凝血通過(guò)管損傷起始，管損傷使因子VIIa接觸內(nèi)皮下面細(xì)胞上表達(dá)的組織因子(TF)。因子VIIa-TF復(fù)合體分解因子X(jué)到因子X(jué)a，且分解因子IX到因子IXa。TFPI結(jié)合因子VIIa和因子X(jué)a。TFPI、因子VIIa(結(jié)合TF)和用于Xa間形成的復(fù)合體進(jìn)一步抑制維持止血所需的因子X(jué)a和Ixa的形成。Broze，Jr.，Ann.Rev.Med.46103(1995)。
通過(guò)直接導(dǎo)入血流的細(xì)菌內(nèi)毒素活化凝血級(jí)聯(lián)可在動(dòng)脈表面上產(chǎn)生廣泛纖維蛋白沉積，以及耗盡纖維蛋白原、前凝血素、因子V和VIII和血小板。此外，刺激纖維蛋白溶解系統(tǒng)進(jìn)一步導(dǎo)致纖維蛋白降解產(chǎn)物的形成。
在凝血活化明顯由細(xì)菌產(chǎn)物(如內(nèi)毒素)起始同時(shí)，違反機(jī)制也似乎被凝血活化，即活化纖維蛋白溶解系統(tǒng)?；罨囊蜃覺(jué)III將纖溶酶原前激活劑轉(zhuǎn)變成纖溶酶原激活劑，纖溶酶原激活劑隨后將纖溶酶原轉(zhuǎn)變成纖溶酶，從而介導(dǎo)血塊裂解。因此活化血漿纖維蛋白溶解系統(tǒng)也提供出血傾向。
內(nèi)毒素血癥與組織纖溶酶原激活劑抑制劑(PAI)的循環(huán)水平增加相關(guān)。此抑制劑迅速使組織纖溶酶原激活劑(TPA)失活，從而阻礙它通過(guò)將纖溶酶原活化成纖溶酶促進(jìn)纖維蛋白溶解的能力。纖維蛋白溶解受損可引起纖維蛋白沉積在血管中，因而產(chǎn)生膿毒性休克相關(guān)的DIC。
正在努力鑒定令人滿意的介入，以防止或治療嚴(yán)重性肺炎和相關(guān)凝血病。阻止凝血途徑的試劑不一定有效治療或預(yù)防治療嚴(yán)重性肺炎。例如，肝素是普遍使用的抗凝血?jiǎng)Ｈ欢?，控制肝素的使用較困難，因?yàn)楦嗡乜烧T導(dǎo)過(guò)度出血或減少凝血，而沒(méi)有存活沒(méi)有任何益處。參見(jiàn)Aoki等，《在治療彌散性血管內(nèi)凝血中活化蛋白質(zhì)C和未分級(jí)肝素的雙盲隨機(jī)試驗(yàn)比較》(A Comparative Double-BLINDrandomized Trial of Activated Protein C and Unfractionated Heparin in theTreatment of Disseminated Intravascular Coagulation)Int.J.Hematol.75，540-47(2002)。一些臨床試驗(yàn)不能證明肝素治療降低膿毒病死亡率，這主要在以暴發(fā)性DIC為顯著特征的腦膜炎球菌內(nèi)毒素血癥中。參見(jiàn)例如Corrigan等，《肝素治療具彌散性血管內(nèi)凝血的膿毒病，對(duì)死亡率和糾正止血缺陷的效果》(HeparinTherapy in Septacemia with Disseminated Intravascular Coagulation.Effecton Mortality and on Correction of Hemostatic Defects)，N.Engl.J.Med.，283778-782(1970)；Lasch等，《肝素治療彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)》(HeparinTherapy of Diffuse Intravascular Coagulation)Thrombos.Diathes.Haemorrh.，33105(1974)；Straub，《抗肝素治療血管內(nèi)凝血的病例》(A Case Against HeparinTherapy of Intravascular Coagulation)，Thrombos.Diathes.Haemorrh.，33107(1974)。
已經(jīng)顯示施用重組人ala-TFPI(一種TFPI類似物)可以提高膿毒病動(dòng)物模型的存活率。參見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)6,063,764。作為內(nèi)源性蛋白質(zhì)，TFPI有很好的耐受性。已經(jīng)通過(guò)靜脈內(nèi)輸注或皮下注射施用TFPI可以降低凝血能力，這如前凝血素時(shí)間(PT)增加所證明。在動(dòng)物和人的研究中，PT延長(zhǎng)與血漿TFPI的增加呈線性相關(guān)。A.A.Creasey，膿毒病3173(1999)。
本領(lǐng)域仍需要治療方法能抑制嚴(yán)重性肺炎的致死效果，且同時(shí)將潛在的嚴(yán)重副作用減少到最低程度。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是預(yù)防或治療嚴(yán)重性肺炎的方法，包括通過(guò)連續(xù)靜脈內(nèi)輸注將TFPI或TFPI類似物施用給嚴(yán)重性肺炎患者或有患病風(fēng)險(xiǎn)的人。一些實(shí)施方案中，患者患有可證實(shí)的感染。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是治療嚴(yán)重性肺炎的方法，包括通過(guò)連續(xù)靜脈內(nèi)輸注將TFPI或TFPI類似物施用給患者。一些實(shí)施方案中，患者患有可證實(shí)的感染。
其它實(shí)施方案包括任一上述實(shí)施方案，其中所述TFPI或TFPI類似物是以一定的劑量率通過(guò)連續(xù)靜脈內(nèi)輸注給予的，所述劑量率相當(dāng)于以小于約0.66mg/kg/hr的劑量率施用參考ala-TFPI。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述劑量率相當(dāng)于以約0.00025到約0.050mg/kg/小時(shí)的劑量率施用參考ala-TFPI。在再優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述劑量率相當(dāng)于以約0.010到約0.045mg/kg/小時(shí)的劑量率施用參考ala-TFPI。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述TFPI或所述TFPI類似物是以一定的劑量率給予的，該劑量率相當(dāng)于以約0.025mg/kg/hr的劑量率施用參ala-TFPI。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述劑量率可使總劑量相當(dāng)于以約0.024到約4.8mg/kg的總劑量施用參考ala-TFPI。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述劑量率可使日劑量相當(dāng)于以至少約0.006mg/kg且小于約1.2mg/kg的日劑量施用參考ala-TFPI。
其它實(shí)施方案包括任何上述實(shí)施方案，其中所述TFPI或TFPI類似物施用至少72小時(shí)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述TFPI或TFPI類似物施用至少96小時(shí)。
其它實(shí)施方案包括任何上面的實(shí)施方案，其中所述TFPI類似物是未糖基化的ala-TFPI。
其它實(shí)施方案包括任何上面的實(shí)施方案，其中所述TFPI類似物包括由SEQ IDNO1的氨基酸19-89組成的第一個(gè)Kunitz結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)較佳實(shí)施方案中，所述TFPI類似物還包括由SEQ ID NO1的氨基酸90-160組成的第二個(gè)Kunitz結(jié)構(gòu)域。
其它實(shí)施方案包括任何上面的實(shí)施方案，其中所述TFPI類似物包括SEQ IDNO1的氨基酸1-160，或其中所述TFPI類似物包括由SEQ ID NO1的氨基酸90-160組成的第二個(gè)Kunitz結(jié)構(gòu)域。
其它實(shí)施方案包括任何上面的實(shí)施方案，其中所述TFPI或TFPI類似物制備自包含TFPI或TFPI類似物的凍干組合物。
其它實(shí)施方案包括任何上面的實(shí)施方案，其中所述TFPI或TFPI類似物作為含精氨酸的制劑施用。
其它實(shí)施方案包括任何上面的實(shí)施方案，其中所述TFPI或TFPI類似物作為含檸檬酸的制劑施用。
其它實(shí)施方案包括任何上面的實(shí)施方案，其中所述TFPI或TFPI類似物在制劑中的濃度約為0.15mg/ml，包含約300mM鹽酸精氨酸和約20mM檸檬酸鈉，且pH約5.5。
其它實(shí)施方案包括任何上面的實(shí)施方案，還包括在所述施用期或24小時(shí)內(nèi)施用另外的試劑，試劑選自抗生素、抗體、內(nèi)毒素拮抗劑、具抗凝血活性的組織因子類似物、免疫刺激劑、細(xì)胞粘附阻斷劑、肝素、BPI蛋白、IL-1拮抗物、pafase(PAF酶抑制劑)、TNF抑制劑、IL-6抑制劑和補(bǔ)體抑制劑。在一個(gè)較佳實(shí)施方案中，所述另外試劑是抗體，其中，所述與抗原特異結(jié)合的抗體選自TNF、IL-6和M-CSF。
根據(jù)下列參考附圖
結(jié)合詳細(xì)描述，本發(fā)明的更多實(shí)施方案是顯然的。
發(fā)明詳述施用TFPI或TFPI類似物可有效防治嚴(yán)重性肺炎。連續(xù)低劑量施用TFPI或TFPI類似物(以后稱為“低劑量TFPI施用”)也可有效防治嚴(yán)重性肺炎。施用TFPI或TFPI類似物，尤其是低劑量施用，可抑制或減輕急性或慢性炎癥，尤其是嚴(yán)重性肺炎。當(dāng)?shù)蛣┝縏FPI施用持續(xù)至少3天時(shí)，嚴(yán)重性肺炎的死亡率降低，同時(shí)因不良副作用產(chǎn)生并發(fā)癥(尤其是出血性疾病)的速度也被降低。低劑量TFPI施用的再一個(gè)好處是可避免耐受效應(yīng)，這樣，在足夠高的劑量下，可降低TFPI的血漿濃度。在血漿TFPI濃度約為850ng/ml時(shí)耐受效應(yīng)最大，而低劑量TFPI施用的血漿水平通常保持在低于500ng/ml。低劑量TFPI施用通常通過(guò)連續(xù)靜脈內(nèi)輸注TFPI或TFPI類似物進(jìn)行。
TFPI和TFPI類似物“TFPI”在這里是指如SEQ ID NO1所示含有276個(gè)氨基酸殘基的成熟血清糖蛋白，其分子量約為38,000道爾頓。它是組織因子活性的天然抑制劑并因此活化凝血。美國(guó)專利號(hào)5,110,730描述了組織因子(TF)，美國(guó)專利號(hào)5,106,833描述了TFPI。TFPI cDNA的克隆描述于Wun等，美國(guó)專利號(hào)4,966,852。TFPI是一種蛋白酶抑制劑，有3個(gè)Kunitz結(jié)構(gòu)域，已知其中兩個(gè)可分別與因子VII和Xa反應(yīng)。第三個(gè)結(jié)構(gòu)域的功能還未知。據(jù)信TFPI通過(guò)形成一種惰性的Xa:TFPI:因子VIIa:組織因子的四因子復(fù)合物在體內(nèi)發(fā)揮作用，從而限制凝血過(guò)程的開(kāi)始。參見(jiàn)Rapaport，Blood 73359-365(1989)和Broze等，Biochemistry 297539-7546(1990)的綜述。TFPI的許多結(jié)構(gòu)特征可從它與其它充分研究的蛋白酶抑制劑的同源性來(lái)推斷。TFPI不是一個(gè)酶，因此它可能以化學(xué)計(jì)量方式抑制其蛋白酶靶，即一個(gè)TFPI的Kunitz結(jié)構(gòu)域抑制一個(gè)蛋白酶分子。優(yōu)選地，Kunitz結(jié)構(gòu)域1和/或2存在于本發(fā)明的TFPI分子中。Kunitz結(jié)構(gòu)域3的功能未知。
“TFPI類似物”是一種TFPI的衍生物，它通過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加或取代(通常保存其性質(zhì))、一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失(如TFPI片段)或在一個(gè)或多個(gè)氨基酸中加入一個(gè)或多個(gè)化學(xué)部分來(lái)修飾，只要修飾未破壞TFPI的生物學(xué)活性。產(chǎn)生多肽類似物的方法在本領(lǐng)域已知且進(jìn)一步描述于下面。一個(gè)優(yōu)選TFPI類似物是N-L-丙氨酰-TFPI(ala-TFPI)，其氨基酸序列示于SEQ ID NO2。TFPI類似物具有一些TFPI活性測(cè)度，如下述生物活性測(cè)定所確定。一種TFPI和類似物的優(yōu)選生物活性測(cè)定是前凝血素時(shí)間(PT)測(cè)定(如下)。
TFPI和TFPI片段可被糖基化或不被糖基化。TFPI類似物描述于美國(guó)專利號(hào)5,106,833。Ala-TFPI是TFPI類似物，也已知為國(guó)際藥物名“替法可近”(tifacogin)。Ala-TFPI包括成熟、全長(zhǎng)人TFPI的完整氨基基酸序列加上氨基酸未端上的附加丙氨酸殘酸。Ala-TFPI的氨基末端丙氨酸殘基被改造成TFPI序列，以促進(jìn)大腸桿菌表達(dá)，并有效裂解另外會(huì)成為氨基末端甲硫氨酸殘基的部分。參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5,212,091。
尤其優(yōu)選的TFPI類似物包括保守性質(zhì)的取代，即取代發(fā)生在側(cè)鏈相關(guān)的氨基酸類內(nèi)。具體的是，氨基酸一般分成四類(1)酸性-天冬氨酸和谷氨酸；(2)堿性-賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性-丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)不帶電荷的極性-甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時(shí)被分類為芳族氨基酸。例如，有理由預(yù)測(cè)用異亮氨酸或纈氨酸單獨(dú)取代亮氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸、絲氨酸取代蘇氨酸或類似的用結(jié)構(gòu)相關(guān)氨基酸保守取代氨基酸對(duì)于生物活性沒(méi)有大的效果。例如，感興趣的多肽可包括至約1-70個(gè)保守或非保守氨基酸取代，如1、2、3、4、5、6-50、15-25、5-10或任何1-70的整數(shù)，只要所需分子功能保持完整。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易的確定感興趣的分子區(qū)域，可用具有如本文所述保持生物活性的合理可能性來(lái)修飾此區(qū)域。
“同源性”指兩種多肽或兩種多肽部分間的百分比相似性。當(dāng)序列表現(xiàn)出至少約50％，優(yōu)選至少約75％，更優(yōu)選至少約80％-85％，優(yōu)選至少約90％，最優(yōu)選至少約95％-98％的序列同源性，或具體范圍間任何百分比同源性超過(guò)定義的分子長(zhǎng)度時(shí)，兩種多肽序列彼此“充分同源”。如本文所用，“充分同源”也指表現(xiàn)出與具體多肽序列完全同一性的序列。
通常，“同一性”指分別對(duì)應(yīng)兩種多肽序列的精確氨基酸-氨基酸。直接比較兩種分子間的序列信息可確定百分比同一性通過(guò)排列序列、計(jì)算兩種排列序列間配對(duì)的確切數(shù)目、除以較短序列的長(zhǎng)度并將結(jié)果乘以100。
優(yōu)選的是，天然或非天然產(chǎn)生的TFPI類似物具有的氨基酸序列與獲得自SEQ IDNO1的TFPI至少70％、80％、85％、90％或95％或更高同源。更優(yōu)選的是，分子是98％或99％同源。百分比同源性用Smith-Waterman同源性搜索算法確定，使用仿射間隔搜索的具有間隔開(kāi)放罰分(gap open penalty)為12，間隔延伸罰分(gapextension penalty)為2，BLOSUM矩陣為62。Smith-Waterman同源性搜索算法教授于Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2482-489(1981)。
TFPI和TFPI類似物的生物活性可通過(guò)前凝血素測(cè)定來(lái)確定。合適的前凝血素測(cè)定描述于美國(guó)專利5,888,968和WO 96/40784。簡(jiǎn)言之，前凝血素時(shí)間可用血凝度計(jì)確定(如來(lái)自O(shè)rganon Teknika的Coag-A-Mate MTX II)。合適的測(cè)定緩沖液是100mM NaCl、調(diào)至pH7.5的50mM Tris，含1mg/ml牛血清白蛋白。所需的另外試劑是正常人血漿(如Organon Teknika的“Verify 1”)、促凝血酶原激酶試劑(如Organon Teknika的“Simplastin Excel”)和TFPI標(biāo)準(zhǔn)溶液(如20μg的100％純ala-TFPI(或其等效物)每ml測(cè)定緩沖液)。通過(guò)分析一系列TFPI標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋的凝固時(shí)間來(lái)獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，如范圍從1到5μg/ml的終濃度。為確定凝固時(shí)間，樣品或TFPI標(biāo)準(zhǔn)首先稀釋到測(cè)定緩沖液中。然后加入正常人血漿。加入促凝血酶原激酶試劑起始凝固反應(yīng)。然后儀器記錄凝固時(shí)間。線性TFPI標(biāo)準(zhǔn)曲線從log凝固時(shí)間相對(duì)logTFPI濃度的圖獲得。在TFPI標(biāo)準(zhǔn)純度對(duì)應(yīng)100％純標(biāo)準(zhǔn)的等效TFPI濃度基礎(chǔ)上調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)曲線。例如，如果標(biāo)準(zhǔn)是97％生化純度的ala-TFPI制劑(即它含3％重量的無(wú)TFPI生物活性的分子種類)，各標(biāo)準(zhǔn)稀釋的濃度乘以0.97得到實(shí)際TFPI濃度。因此，TFPI標(biāo)準(zhǔn)在實(shí)際每ml 97％純制劑的重量基礎(chǔ)上是1.0μg/ml，它相當(dāng)于且處理為1.0×0.97濃度或0.97μg/ml。
獲得TFPI和TFPI類似物用于本發(fā)明方法的TFPI和TFPI類似物可從細(xì)胞或組織中分離并純化、化學(xué)合成或在原核或真核細(xì)胞中通過(guò)重組方法制造。
TFPI可用一些方法分離。例如，分泌TFPI的細(xì)胞包括老化內(nèi)皮細(xì)胞或TNF處理約3到4天的年輕內(nèi)皮細(xì)胞以及肝細(xì)胞或肝臟腫瘤細(xì)胞。TFPI可通過(guò)常規(guī)方法從此細(xì)胞培養(yǎng)物中純化。例如，這些方法包括層析方法，描述于Pedersen等，1990，J.of Biological Chemistry，26516786-16793，Novotny等，1989，J.ofBiological Chemistry，26418832-18837，Novotny等，1991，Blood，78394-400，Wun等，1990，J.of Biological Chemistry，26516096-16101；Broze等，1987，PNAS(USA)，841886-1890。此外，TFPI出現(xiàn)在血流中且可從血液中純化，參見(jiàn)Pedersen等，同上。然而，需要大量血以獲得足夠量的TFPI。
TFPI或TFPI變體可用化學(xué)方法合成其氨基酸序列來(lái)產(chǎn)生，如用固相技術(shù)的直接肽合成法(Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85，2149-2154，1963；Roberge等，Science 269，202-204，1995)。蛋白質(zhì)合成可用手工技術(shù)或自動(dòng)化進(jìn)行。例如，用應(yīng)用生物系統(tǒng)431A肽合成儀(Perkin Elmer)可完成自動(dòng)化合成。任選的是，TFPI片段或TFPI變體可分別合成并用化學(xué)方法組合以產(chǎn)生全長(zhǎng)分子。
TFPI和TFPI類似物可如美國(guó)專利號(hào)4,966,852所示重組產(chǎn)生。例如，所需蛋白質(zhì)的cDNA可摻入在原核或真核中表達(dá)的質(zhì)粒。美國(guó)專利號(hào)4,847,201提供用具體DNA序列轉(zhuǎn)化微生物和表達(dá)它們的細(xì)節(jié)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知許多其它參考文獻(xiàn)，它們提供用微生物表達(dá)蛋白質(zhì)的細(xì)節(jié)。許多文獻(xiàn)被引用于美國(guó)專利號(hào)4,847,201，如Maniatas，T.等，1982《分子克隆》(Molecular Cloning)，Cold SpringHarbor Press。
多種技術(shù)可用于轉(zhuǎn)化微生物并使用它們表達(dá)TFPI和TFPI類似物。下列僅是可能方法的例子。必須分離TFPI DNA序列并與適當(dāng)對(duì)照序列相連。TFPI DNA序列示于美國(guó)專利號(hào)4,966,852且可摻入質(zhì)粒如pUC13或pBR3822，它們可從公司商業(yè)購(gòu)買如Boehringer-Mannheim。一旦TFPI DNA插入載體，它可克隆到合適宿主中?？蓴U(kuò)增DNA的技術(shù)例如示于Mullis的美國(guó)專利號(hào)4,683,202和Mullis等的美國(guó)專利號(hào)4,683,195?？赏ㄟ^(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞如肝臟腫瘤細(xì)胞(例如HepG2和SKHep)產(chǎn)生TFPI mRNA，，然后鑒定和分離mRNA并將它逆轉(zhuǎn)錄以獲得TFPI的cDNA，由此獲得TFPI cDNA。表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主如大腸桿菌后，可發(fā)酵細(xì)菌并表達(dá)蛋白質(zhì)。細(xì)菌優(yōu)選是原核微生物且尤其優(yōu)選大腸桿菌。用于本發(fā)明的優(yōu)選微生物是大腸桿菌K-12、菌株MM294，由ATCC在布達(dá)佩斯條約規(guī)定下于1984年2月14日保存。它的登錄號(hào)是39607。
當(dāng)然，也可能在真核宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)編碼多肽的基因，細(xì)胞培養(yǎng)物獲得自多細(xì)胞生物體。參見(jiàn)例如《組織培養(yǎng)》(Tissue Culture)，1973，Cruz和Patterson編，Academic Press。有用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系包括鼠骨髓瘤N51、VERO、海拉細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、COS、C127、Hep G2和SK Hep。TFPI和TFPI類似物也可在桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞中表達(dá)(也參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)4,847,201；5,348,886和4,745,051)。同樣參見(jiàn)Pedersen等，1990，J.of Biological Chemistry，26516786-16793。用于真核細(xì)胞的表達(dá)載體通常包括啟動(dòng)子和與哺乳動(dòng)物細(xì)胞相容的控制序列，例如普遍使用的猿病毒40(SV40)早期和晚期啟動(dòng)子(Fiers等，1878，Nature，273113)，或其它病毒啟動(dòng)子如獲得自多瘤病毒、腺病毒2、牛乳頭狀瘤病毒或禽類肉瘤病毒，或免疫球蛋白啟動(dòng)子和熱激啟動(dòng)子。哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的一般方面由Axel描述，美國(guó)專利號(hào)4,399,216，1983年8月16日出版?，F(xiàn)在似乎“增強(qiáng)子”區(qū)域在最優(yōu)化表達(dá)中也是重要的；這些一般是在啟動(dòng)子區(qū)域上游發(fā)現(xiàn)的序列。如果需要，復(fù)制起點(diǎn)可從病毒來(lái)源獲得。然而，整合到染色體是真核生物中DNA復(fù)制的普遍機(jī)制。植物細(xì)胞現(xiàn)在也可作為宿主，存在與植物細(xì)胞相容的控制序列如胭脂氨酸合酶啟動(dòng)子和多腺苷酸信號(hào)序列(Depicker，A.等，1982J.Mol.Appl.Gen.，1561)。轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法和載體描述于PCT出版物WO 85/04899，1985年11月7日出版。
可用于純化哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的TFPI和TFPI類似物的方法包括連續(xù)應(yīng)用肝素-瓊脂糖，MonoQ，MonoS和反相HPLC色譜。參見(jiàn)Pedersen等，同上；Novotny等，1989，J.Biol.Chem.26418832-18837，Novotny等，1991，Blood，78394-400，Wun等，1990，J.Biol.Chem.26516096-16101；Broze等，1987，PNAS(USA)，841886-1890；美國(guó)專利號(hào)5,106,833和美國(guó)專利號(hào)5,466,783。這些參考文獻(xiàn)描述了多種純化哺乳動(dòng)物產(chǎn)生的TFPI的方法。
TFPI也可用哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主表達(dá)為重組糖基化蛋白質(zhì)，如小鼠C127細(xì)胞(Day等，Blood 761538-1545，1990)、幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(Pedersen等，1990)、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞和人SK肝臟腫瘤細(xì)胞。C127 TFPI用于動(dòng)物研究并顯示有效抑制兔中組織因子誘導(dǎo)的血管內(nèi)凝血(Day等，同上)、防止狗中血栓溶解后動(dòng)脈再阻塞(Haskel等，Circulation 84821-827(1991))、以及減少狒狒中大腸桿菌膿毒病模型的死亡率(Creasey等，J.Clin.Invest.912850(1993))。Ala-TFPI可用大腸桿菌宿主細(xì)胞表達(dá)為重組非糖基化蛋白質(zhì)。所述方法通過(guò)體外再折疊大腸桿菌產(chǎn)生的重組蛋白來(lái)產(chǎn)生高活性ala-TFPI。參見(jiàn)例如WO 96/40784。
TFPI和TFPI類似物也可在細(xì)菌或酵母中生產(chǎn)成隨后純化。通常，可使用的方法示于美國(guó)專利號(hào)5,212,091；6,063,764和6,103,500或WO 96/40784。純化、溶解和重折疊ala-TFPI和其它TFPI類似物可根據(jù)WO 96/40784和Gustafson等，Prot.Express.Pur.5233(1994)，本文納入供參考。例如，當(dāng)根據(jù)WO 96/40784的實(shí)施例9制備時(shí)，所得ala-TFPI制備物包含約85％到90％總蛋白重量是成熟、適當(dāng)折疊、生物活性ala-TFPI，約10％到15％具有一個(gè)或多個(gè)氧化甲硫氨酸殘基。如前凝血素測(cè)定所確定，這些氧化形式的生物活性與未衍生的ala-TFPI的生物活性相等，且預(yù)期在本文所示發(fā)明中有活性。剩余物質(zhì)包含多種ala-TFPI的修飾形式，包括二聚化、聚集和乙?；问?。
TFPI和TFPI類似物可有顯著數(shù)量的半胱氨酸殘基，且美國(guó)專利號(hào)4,929,700所示方法與TFPI重折疊相關(guān)。TFPI和類似物可通過(guò)多種層析方法從緩沖溶液中純化，如上面所述方法。另外，可使用美國(guó)專利號(hào)4,929,700所示方法?？捎糜诩兓疶FPI和TFPI類似物的任何方法產(chǎn)生一定程度的純度和一定水平的活性，適用于施用給人。
治療方法和組合物通常，TFPI和TFPI類似物可有效治療或預(yù)防由于組織因子表達(dá)的正調(diào)節(jié)而使TF活性取決于TNF、IL-1或其他細(xì)胞因子而造成的疾病。施用TFPI，尤其是低劑量TFPI施用，可降低患者中細(xì)胞因子如IL-6的濃度。低劑量TFPI施用通常可有效治療炎癥和血液凝固異常，包括急性和慢性炎性癥狀，如嚴(yán)重性肺炎。
″嚴(yán)重性肺炎″由美國(guó)胸協(xié)制訂的方針定義。特別地，嚴(yán)重性肺炎要求對(duì)肺炎進(jìn)行診斷并存在a)兩個(gè)主要標(biāo)準(zhǔn)之一，b)三個(gè)次要標(biāo)準(zhǔn)之二，或c)英國(guó)胸協(xié)(BritishThoracic Society)制訂的四個(gè)標(biāo)準(zhǔn)之二(Thorax 2001；56[增補(bǔ)本IV]1-64)。所述主要標(biāo)準(zhǔn)是1)需要機(jī)械換氣和2)膿毒病性休克，或需要加壓4小時(shí)以上。次要標(biāo)準(zhǔn)是1)收縮壓≤90mmHg，2)多葉肺炎，以及3)低氧血標(biāo)準(zhǔn)(PaO2/FiO2)＜250。英國(guó)胸協(xié)的標(biāo)準(zhǔn)是1)呼吸率≥30次/分鐘，2)舒張壓≤60mmHg，3)血尿氮(BUN)＞7.0mM(＞19.6mg/dL)和4)意思錯(cuò)亂。根據(jù)此領(lǐng)域的理解，低氧血標(biāo)準(zhǔn)(PaO2/FiO2)是指動(dòng)脈氧占吸入的氧氣的分壓，它說(shuō)明了氣體交換病損的水平。
優(yōu)選地，嚴(yán)重性肺炎患者可被此領(lǐng)域已知的任何方式感染。這些方法包括但不限于通過(guò)例如GRAM菌株、培養(yǎng)物、組織化學(xué)染色、免疫化學(xué)測(cè)定或核酸測(cè)定來(lái)檢測(cè)血液或其他正常無(wú)菌體液或組織培養(yǎng)物中的病原生物。感染還可通過(guò)胸部X圖像來(lái)證實(shí)，其中包括肺炎的診斷，這構(gòu)成了全身性抗感染治療以及任何感染臨床癥狀的前提，其中包括但不限于呼吸率的增加＞/＝30/分鐘或PaO2/FiO2＜250，血壓降低和體溫升高。
TFPI和TFPI類似物制劑TFPI和TFPI類似物的制劑優(yōu)選通過(guò)靜脈內(nèi)輸注施用?；旧蟽?yōu)選連續(xù)的靜脈內(nèi)注注。完成此施用的方法對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是已知的。輸注可經(jīng)中線或外周線進(jìn)行。當(dāng)要避免劑量率的大波動(dòng)時(shí)，短期偏離本發(fā)明的劑量率是可接受的，只要所得施用TFPI的血漿水平在連續(xù)輸注預(yù)期的20％內(nèi)，連續(xù)輸注根據(jù)發(fā)明較佳實(shí)施方案以恒定劑量率進(jìn)行。
施用給患者前，配方制劑(formulant)可加入TFPI和TFPI類似物。優(yōu)選液體制劑。TFPI和TFPI類似物可以不同濃度配制，在與TFPI蛋白施用途徑、溶解性和穩(wěn)定性相容的任何生理合適pH下使用不同配方劑。靜脈內(nèi)輸注的優(yōu)選制劑包括達(dá)約0.6mg/ml的ala-TFPI、達(dá)300mM的鹽酸精氨酸、pH5.0-6.0的檸檬酸鈉緩沖液。一些溶質(zhì)如精氨酸、NaCl、蔗糖和甘露醇用于溶解和/或穩(wěn)定ala-TFPI。參見(jiàn)WO 96/40784。尤其優(yōu)選的靜脈內(nèi)輸注制劑含約0.15mg/ml參考ala-TFPI、300mM鹽酸精氨酸和pH5.5的20mM檸檬酸鈉。TFPI和TFPI類似物也可以達(dá)約0.15mg/ml的濃度配制，這是在150mM NaCl和20mM檸檬酸鈉或pH5.5-7.2的另一種緩沖液中，任選具有0.005％或0.01％(w/v)聚山梨醇酯80(吐溫80)。其它制劑在pH5.5的10mM乙酸鈉中含達(dá)約0.5mg/ml TFPI或TFPI類似物，乙酸鈉中含150mM NaCl、8％(w/v)蔗糖或4.5％(w/v)甘露醇。TFPI和TFPI類似物也可用高鹽以高達(dá)幾個(gè)mg/ml的濃度配制。例如，在500mM NaCl和20mM磷酸鈉(pH7.0)中，一種制劑含達(dá)約6.7mg/ml ala-TFPI。
用于TFPI和TFPI類似物的更多配方劑例子包括油、聚合物、維生素、碳水化合物、氨基酸、鹽、緩沖液、白蛋白、表面活性劑或膨脹劑。優(yōu)選碳水化合物包括糖或糖醇如單、二或多糖或水溶性葡聚糖。糖類或葡聚糖可包括果糖、右旋糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麥芽糖、蔗糖、右旋糖苷、支鏈淀粉、糊精、α和β環(huán)糊精、可溶性淀粉、羥乙基淀粉和羧甲基纖維素或它們的混合物。最優(yōu)選蔗糖。糖醇定義為具有-OH基團(tuán)的C4-C8烴，且包括半乳糖醇、肌醇、甘露醇、木糖醇、山梨糖醇、甘油和阿拉伯糖醇。最優(yōu)選甘露醇。上述這些糖或糖醇可單獨(dú)或組合使用。用量沒(méi)有限制，只要糖或糖醇可溶于含水制備物中。糖或糖醇濃度優(yōu)選在1.0w/v％和7.0w/v％間，更優(yōu)選在2.0w/v％和6.0w/v％間。
優(yōu)選的氨基酸包括左旋(L)形式的肉堿、精氨酸和甜菜堿；然而可加入其它氨基酸。優(yōu)選的聚合物包括平均分子量在2000和3,000間的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或平均分子量在3,000和5,000間的聚乙二醇(PEG)。同樣優(yōu)選使用組合物中的緩沖液使凍干前或重建后溶液的pH變化成極小?？墒褂么蟛糠秩我馍砭彌_液，但優(yōu)選檸檬酸、磷酸、琥珀酸和谷氨酸緩沖液或它們的混合物。緩沖液濃度優(yōu)選從0.01到0.3摩爾?？杉尤胫苿┑谋砻婊钚詣┦居贓P號(hào)270,799和268,110。
另外，可化學(xué)修飾TFPI和TFPI類似物，例如通過(guò)共價(jià)綴合到聚合物以增加其循環(huán)半衰期。優(yōu)選的聚合物和使它們附于肽的方法示于美國(guó)專利號(hào)4,766,106、4,179,337、4,495,285和4,609,546。優(yōu)選的聚合物是聚氧乙烯化多元醇和聚乙二醇(PEG)。PEG在室溫可溶于水且具有通式R(O-CH2-CH2)n-O-R，其中R可以是氫或保護(hù)性基團(tuán)如烷基或烷醇基團(tuán)。保護(hù)性基團(tuán)優(yōu)選有1到8個(gè)碳，更優(yōu)選它是甲基。符號(hào)n是正整數(shù)，優(yōu)選1和1,000間，更優(yōu)選2和500間。PEG的平均分子量?jī)?yōu)選在1000和40,000間，更優(yōu)選2000和20,000間，最優(yōu)選3,000和12000間。PEG優(yōu)選有至少一個(gè)羥基，更優(yōu)選它是一個(gè)末端羥基。此羥基被優(yōu)選活化以與抑制劑上的游離氨基反應(yīng)。然而，要理解的是可改變反應(yīng)基團(tuán)的類型和量以獲得本發(fā)明共價(jià)共軛的PEG/TFPI。
水溶性聚氧乙烯化多元醇也用于本發(fā)明。它們包括聚氧乙烯化山梨糖醇、聚氧乙烯化葡萄糖、聚氧乙烯化甘油(POG)等。優(yōu)選POG。一個(gè)原因是聚氧乙烯化甘油的甘油主鏈與例如動(dòng)物和人的甘油一、二、三酸酯中天然產(chǎn)生的主鏈相同。因此，該分支不一定看成體內(nèi)的外來(lái)試劑。POG的優(yōu)選分子量范圍與PEG相同。POG結(jié)構(gòu)示于Knauf等，1988，J.Biol.Chem.26315064-15070，POG-蛋白質(zhì)綴合物的討論發(fā)現(xiàn)于美國(guó)專利號(hào)4,766,106，本文全部納入供參考。
液體藥物組合物被制備后，可凍干以防止降解并保持無(wú)菌。凍干藥物組合物的方法對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是已知的。組合物僅在使用前用無(wú)菌稀釋液重建(例如林格溶液、蒸餾水或無(wú)菌鹽水)，稀釋液可包括另外的成分。重建后，組合物優(yōu)選通過(guò)連續(xù)靜脈內(nèi)輸注施用給受試者。
TFPI和TFPI類似物的劑量TFPI或TFPI類似物是以有效治療和預(yù)防嚴(yán)重性肺炎的濃度施用的。這也對(duì)其他急性或慢性感染，以及細(xì)胞因子正調(diào)節(jié)組織因子表達(dá)的常規(guī)疾病有效。為實(shí)現(xiàn)這一目的，TFPI或TFPI類似物優(yōu)選靜脈內(nèi)施用。實(shí)現(xiàn)這種施用的方法是精通此領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的。通常，TFPI或TFPI類似物的給藥劑量在1μg/kg至20mg/kg之間，更優(yōu)選在20μg/kg至15mg/kg之間，最優(yōu)選在1至10mg/kg之間。
上述劑量一般是在至少約1天的時(shí)間內(nèi)施用的，通常要幾天，這樣就可以統(tǒng)計(jì)以單劑量或均分劑量給予宿主的總?cè)談┝?，例如，每天每千克體重約2-15毫克，優(yōu)選約4-10mg/kg。劑量單位組合物可含有上述量或其因數(shù)以構(gòu)成日劑量。較低的日劑量可用于預(yù)防或其他目的，如約1μg/kg至2mg/kg?；钚猿煞值牧靠膳c載體物質(zhì)相結(jié)合以制得單劑量形式，這將根據(jù)被治療患者的狀況和特定治療模式而定。
無(wú)論采用何種藥物輸遞系統(tǒng)以及無(wú)論所述化合物是否作為藥物組合物的一部分施用，給藥方案都需根據(jù)各種因素來(lái)選定，其中包括患者的類型、年齡、體重、性別、飲食狀況和身體狀況，癥狀的嚴(yán)重性，給藥途徑，藥理學(xué)情況，如活性、有效性、藥代動(dòng)力學(xué)和毒理學(xué)特征。因此，實(shí)際采用的給藥方案可變性很大，因此可能與上述優(yōu)選的給藥方案差別很大。優(yōu)選地，TFPI或TFPI類似物的劑量不能超過(guò)ala-TFPI 0.66mg/kg/小時(shí)的劑量率。
低劑量施用當(dāng)TFPI和TFPI類似物給予的劑量率相當(dāng)于以至少約0.00025mg/kg/小時(shí)(0.00417μg/kg/分鐘)和小于約0.050mg/kg/小時(shí)(0.833μg/kg/分鐘)的劑量率施用參考ala-TFPI時(shí)，治療膿毒病和其它炎癥情況的功效被保持且不利副作用如出血被減至最低程度。為最佳結(jié)合功效和安全，劑量率優(yōu)選相當(dāng)于以至少約0.010mg/kg/小時(shí)(0.167μg/kg/分鐘)和小于約0.045mg/kg/小時(shí)(0.833μg/kg/分鐘)的劑量率施用參考ala-TFPI，或相當(dāng)于以至少約0.020mg/kg/小時(shí)和小于約0.040mg/kg/小時(shí)的劑量率施用參考ala-TFPI，最優(yōu)選相當(dāng)于以約0.025mg/kg/小時(shí)(0.417μg/kg/分鐘)的劑量率施用參考ala-TFPI。施用途徑一般是靜脈內(nèi)施用，優(yōu)選連續(xù)靜脈內(nèi)輸注。輸注可施用至少約72、96、120或240小時(shí)。連續(xù)輸注優(yōu)選施用3到8天，更優(yōu)選3到6天，最優(yōu)選約4天。
“通過(guò)連續(xù)輸注”施用是指輸注維持在接近指定速度而沒(méi)有顯著中斷大部分規(guī)定的持續(xù)時(shí)間。另外，可使用間歇的靜脈內(nèi)輸注。如果使用間歇輸注，然后應(yīng)使用時(shí)間平均的劑量率，此速度相當(dāng)于上述連續(xù)輸注所用劑量率。此外，間歇輸注的程序必須使最高血清濃度不比使用輸注所得最高濃度大約20％。為避免患者的不利反應(yīng)，具體是包括出血的副作用，劑量率應(yīng)小于的速度相當(dāng)于以約0.050mg/kg/小時(shí)連續(xù)靜脈內(nèi)輸注參考ala-TFPI。
所有本文所述劑量包括劑量率和總劑量，在實(shí)踐中受到至多10％的變化，由于定量測(cè)定中無(wú)法避免不精確如前凝血素測(cè)試中的蛋白質(zhì)濃度和生物活性。即任何實(shí)際施用劑量比本文所述劑量至多高10％或低10％被認(rèn)為是在所述劑量范圍內(nèi)。由于此原因，所有劑量表示為“大約”一個(gè)具體劑量。例如，描述為“約0.025mg/kg/小時(shí)”的劑量被認(rèn)為相當(dāng)于范圍從0.0225到0.0275mg/kg/小時(shí)的任何實(shí)際劑量。
如果繼以低劑量TFPI施用，推注注射或TFPI或TFPI類似物的短暫較高的輸注速度也可在本發(fā)明實(shí)踐中使用。例如，推注注射或較高灌輸速度可用于減少患者循環(huán)中施用TFPI或TFPI類似物的平衡時(shí)間。這樣做，可更迅速達(dá)到最終穩(wěn)態(tài)的TFPI血漿水平，TFPI受體可更快飽和。以約0.025mg/kg/小時(shí)施用參考ala-TFPI給人2小時(shí)使TFPI血漿水平(加ala-TFPI)從約80ng/ml增加到約125ng/ml，或增加約50％。如果提高輸注速度或使用推注注射，可更快達(dá)到相同水平。如果輸注持續(xù)到獲得穩(wěn)態(tài)，較高輸注速度會(huì)產(chǎn)生較高水平。在膿毒病患者中，以約0.050mg/kg/小時(shí)施用參考ala-TFPI的穩(wěn)態(tài)水平是約300ng/ml，以約0.33或約0.66mg/kg/小時(shí)施用參考ala-TFPI的穩(wěn)態(tài)水平是至少約2μg/ml。
以單次連續(xù)輸注或分開(kāi)輸注施用給受體的總?cè)談┝靠衫缦喈?dāng)于施用至少約0.006mg/kg/天到小于約1.2mg/kg/天的參考ala-TFPI，更常相當(dāng)于施用至少約0.24mg/kg/天到小于約1.2mg/kg/天的參考ala-TFPI，優(yōu)選相當(dāng)于約0.6mg/kg/天的參考ala-TFPI。此范圍內(nèi)的更低劑量可用于預(yù)防或其它目的。發(fā)明的劑量方案也可表示為施用給患者的總劑量。總劑量是輸注速度和總輸注時(shí)間的數(shù)學(xué)乘積。例如，在優(yōu)選劑量率約為0.025mg/kg/小時(shí)參考ala-TFPI和優(yōu)選輸注時(shí)間為96小時(shí)時(shí)，總劑量約為2.4mg參考ala-TFPI每kg體重。根據(jù)發(fā)明施用的TFPI總劑量相當(dāng)于至少約0.75μg/kg和小于約4.8mg/kg的參考ala-TFPI?？倓┝?jī)?yōu)選相當(dāng)于至少約1mg/kg和小于約4.8mg/kg的參考ala-TFPI?？倓┝扛鼉?yōu)選相當(dāng)于至少約2.4mg/kg的參考ala-TFPI。
一個(gè)可用于調(diào)節(jié)劑量方案的因素是單個(gè)患者的凝血功能，通常用前凝血素時(shí)間(PT)測(cè)定或國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比例(INR)測(cè)量。INR是PT測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)化，其中測(cè)試根據(jù)國(guó)際參考促凝血酶原激酶試劑來(lái)校準(zhǔn)。參見(jiàn)例如R.S.Riley等，J.Clin.Lab.Anal.14101-114(2000)。健康人類志愿者中INR對(duì)ala-TFPI的反應(yīng)在所見(jiàn)血漿濃度范圍上大致為線性(圖3)。INR的總變化是1.2個(gè)單位每1μg/ml血漿ala-TFPI濃度增加。
在藥代動(dòng)力學(xué)模型中，對(duì)ala-TFPI的INR應(yīng)答最好用log-線性模型描述，其中l(wèi)og INR與TFPI血漿濃度呈線性相關(guān)。應(yīng)答的log-線性特性意味著INR基線升高的受試者比具有較低基線值的受試者可能能耐受更多抗凝血藥，后者有類似的循環(huán)sls-TFPI水平。
上述劑量方案包括以mg/kg/小時(shí)為基礎(chǔ)的劑量率和總?cè)談┝?，表示為“相?dāng)于施用參考ala-TFPI”的劑量。這是指它們通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化到“參考ala-TFPI”劑量來(lái)定量確定，“參考ala-TFPI”劑量定義為成熟、100％純(在蛋白質(zhì)基礎(chǔ)上)、適當(dāng)折疊、生物活性、非糖基化ala-TFPI。Ala-TFPI是氨基酸序列示于SEQ ID NO2的TFPI類似物。其它形式的TFPI也可用于發(fā)明，包括成熟、全長(zhǎng)TFPI和其類似物。為確定用除了ala-TFPI的TFPI形式和ala-TFPI制劑或另一個(gè)小于100％純的TFPI類似物實(shí)踐發(fā)明的適當(dāng)劑量范圍，本文所述參考ala-TFPI的劑量范圍可在TFPI具體形式的內(nèi)在生物活性的基礎(chǔ)上調(diào)節(jié)，且在制劑的生化純度基礎(chǔ)上進(jìn)一步調(diào)節(jié)。
TFPI或TFPI類似物的內(nèi)在生物活性指成熟、100％純、適當(dāng)折疊TFPI或TFPI類似物的特異活性，如前凝血素測(cè)定所定義。因此等效劑量計(jì)算為(參考ala-TFPI劑量)/((相對(duì)內(nèi)在活性)×(生化純度))，其中相對(duì)內(nèi)在活性指(類似物的內(nèi)在活性)/(參考ala-TFPI的內(nèi)在活性)。例如，如果具體TFPI類似物的內(nèi)在生物活性是參考ala-TFPI的80％，將參考ala-TFPI的劑量值除以0.8得到具體TFPI類似物的等效劑量。此外，如果施用給患者的制劑是例如僅90％生化純度即包含10％缺乏TFPI生物活性的分子種類，通過(guò)將劑量值除以0.9對(duì)ala-TFPI的參考劑量值進(jìn)行另外修正。因此，對(duì)于具有80％ala-TFPI的內(nèi)在活性且以90％生化純度施用的假定TFPI類似物，相當(dāng)于以0.025mg/kg/小時(shí)施用參考ala-TFPI的劑量率為0.0347mg/kg/小時(shí)(即0.025/(0.8×0.9))。
也可通過(guò)相對(duì)生物活性來(lái)確定具體制劑的等效劑量而不需知道內(nèi)在活性或生化純度。相對(duì)生物活性可使用前凝血素時(shí)間測(cè)定通過(guò)比較TFPI類似物具體制劑與TFPI生物活性標(biāo)準(zhǔn)來(lái)確定。例如，根據(jù)WO 96/40784實(shí)施例9的方法產(chǎn)生的ala-TFPI含約85％生物活性ala-TFPI分子種類，可用作TFPI生物活性標(biāo)準(zhǔn)。在前凝血素測(cè)定中，根據(jù)WO 96/40784實(shí)施例9的方法產(chǎn)生的ala-TFPI具有約85％的參考ala-TFPI的活性。在前凝血素時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)曲線作圖時(shí)，凝固時(shí)間的對(duì)數(shù)相對(duì)TFPI濃度的對(duì)數(shù)作圖。如果TFPI生物活性標(biāo)準(zhǔn)具有85％的參考ala-TFPI的活性，若作圖前TFPI生物活性標(biāo)準(zhǔn)濃度乘以0.85，可制成相當(dāng)于參考ala-TFPI的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而繪出的活性相當(dāng)于100％純參考ala-TFPI的活性。當(dāng)具體TFPI類似物制劑的凝固時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較時(shí)，可從曲線讀出參考ala-TFPI的等價(jià)濃度。另外，如果通過(guò)線性回歸分析獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性部分的斜率，斜率可在TFPI生物活性標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)參考ala-TFPI的活性基礎(chǔ)上修正。因此具體TFPI類似物制劑的相對(duì)生物活性相當(dāng)于參考ala-TFPI活性與類似物制劑活性的比例。例如，如果具體類似物需要1.43μg以產(chǎn)生與1.00μg參考ala-TFPI相同的前凝血素時(shí)間活性，類似物制劑的相對(duì)生物活性是1.00/1.43或0.7。對(duì)于此類似物制劑，將參考ala-TFPI劑量除以類似物制劑的相對(duì)生物活性得到參考ala-TFPI的等效劑量。例如，0.025mg/kg/小時(shí)的參考ala-TFPI劑量相當(dāng)于0.0357mg/kg/小時(shí)的類似物制劑(即0.025/0.7)。
盡管TFPI和TFPI類似物可作為單獨(dú)活性抗凝血藥劑施用，它也可與一種或多種另外的治療劑組合使用。這些另外的治療劑包括用于治療嚴(yán)重性肺炎的抗體，例如抗內(nèi)毒素、單克隆抗體(如結(jié)合內(nèi)毒素的Mabs)和抗TNF產(chǎn)物如抗TNF的鼠Mab。TFPI和TFPI類似物也可結(jié)合白介素-1受體拮抗劑、殺菌/滲透性增加(BPI)蛋白質(zhì)、免疫刺激劑、具抗炎癥活性的化合物如PAF拮抗劑以及細(xì)胞粘附阻斷劑(例如抗血小板劑如GPIIb/IIIa抑制劑)。當(dāng)組合施用時(shí)，治療劑可作為在相同或不同時(shí)間給予的單獨(dú)組合物配制，或治療劑可作為單組合物給予。優(yōu)選地，其它治療劑是同時(shí)(即在施用TFPI或TFPI類似物同時(shí))或在施用TFPI或TFPI類似物24小時(shí)之內(nèi)(即在開(kāi)始施用TFPI或TFPI類似物前24小時(shí)之內(nèi)，或在結(jié)束施用TFPI或TFPI類似物后24小時(shí)之內(nèi))給予的。其它治療劑也可和TFPI或TFPI類似物一起作為單獨(dú)的組合物給予。
TFPI和TFPI類似物可聯(lián)合其它有效治療嚴(yán)重性肺炎的試劑。例如，下列可聯(lián)合TFPI和TFPI類似物施用能治療潛在細(xì)菌感染的抗生素；針對(duì)抗細(xì)菌細(xì)胞壁成分的單克隆抗體；可和參與嚴(yán)重性肺炎途徑的細(xì)胞因子形成復(fù)合物的受體；以及一般任何試劑或蛋白質(zhì)，它們可與細(xì)胞因子或補(bǔ)體蛋白質(zhì)相互作用以減少它們的效果并削弱嚴(yán)重性肺炎和/或其癥狀。
用于本發(fā)明的抗生素包括一般類別的抗生素β-內(nèi)酰胺環(huán)(青霉素)、糖苷鍵中的氨基糖(氨基糖苷)、大環(huán)內(nèi)酯環(huán)(大環(huán)內(nèi)酯)、并西苯羧酰胺(氨甲酰并四苯(naphthacenecarboxamide)的多環(huán)衍生物(四環(huán)素)、二氯乙酸硝基苯衍生物、肽(桿菌肽、短桿菌肽和多粘菌素)、具綴合雙鍵系統(tǒng)的大環(huán)(多烯)、獲得自磺胺的磺胺類藥物(磺胺藥物)、5-硝基-2-呋喃基(硝基呋喃)、喹啉羧酸(萘啶酸)和許多其它抗生素。其它抗生素和上面具體抗生素的更多形式可發(fā)現(xiàn)于《化學(xué)技術(shù)百科全書》(Encyclopedia of Chemical Technology)，第3版，Kirk-Othymer(編)，第2卷，782-1036頁(yè)(1978)和第3卷，1-78頁(yè)，Zinsser，《微生物學(xué)》(Microbiology)，第17版，W.Joldik等，(編)，235-277頁(yè)(1980)，或《Dorland圖解醫(yī)學(xué)辭典》(Dorland’s Illustrated Medical Dictionary)，第27版，W.B.Saunders Company(1988)。
其它可結(jié)合TFPI和TFPI類似物的試劑包括內(nèi)毒素拮抗劑如E5531(一種脂質(zhì)A的類似物，參見(jiàn)Asai等，Biol.Pharm.Bull.22432(1999))；具抗凝血活性的TF類似物(參見(jiàn)例如Kelley等，Blood 893219(1997)和Lee&Kelley，J.Biol.Chem.2734149(1998))；針對(duì)參與膿毒病途徑的細(xì)胞因子的單克隆抗體，如針對(duì)IL-6、M-CSF的單克隆抗體，參見(jiàn)Creasey等于1989年12月15日提交的美國(guó)序列號(hào)07/451,218，以及針對(duì)TNF的單克隆抗體，參見(jiàn)Cerami等，美國(guó)專利號(hào)4603,106；從產(chǎn)生TNF激素原的細(xì)胞中切割成熟TNF激素原的蛋白質(zhì)抑制劑，參見(jiàn)Kriegler等。于1989年8月16日提交的美國(guó)序列號(hào)07/395,253；IL-1的拮抗劑，如Haskili等于1990年5月1日提交的美國(guó)序列號(hào)07/517,276所示；IL-6細(xì)胞因子表達(dá)的抑制劑例如抑制素，如Warren等于1999年8月24日提交的美國(guó)專利號(hào)5,942220；以受體為基礎(chǔ)的多種細(xì)胞因子的抑制劑如IL-1?？墒褂醚a(bǔ)體或補(bǔ)體的蛋白質(zhì)抑制劑的抗體，如CR1、DAF和MCP。
本說(shuō)明書中提到的所有專利、專利申請(qǐng)和參考資料在此全文并入以供參考。
現(xiàn)在通過(guò)以下例子闡述本發(fā)明，例子列出具體有利的實(shí)施方案。然而，應(yīng)指出這些實(shí)施方案是說(shuō)明性的，不用于以任何方式限制發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1.用Ala-TFPI治療嚴(yán)重性肺炎患者評(píng)價(jià)嚴(yán)重性肺炎患者以在基本相同的組中研究用ala-TFPI治療的潛在效果。如果調(diào)查人員證明一項(xiàng)膿毒病來(lái)源為肺炎則可斷定為肺炎患者?？梢杂衅渌腥疚稽c(diǎn)。由于難以區(qū)別化學(xué)藥品后遺癥的影響，故未包括吸入性肺炎患者。按培養(yǎng)物陽(yáng)性(任何感染證據(jù)，如培養(yǎng)物或革蘭氏菌株)或培養(yǎng)物陰性(陰性培養(yǎng)物或未處理的培養(yǎng)物)將肺炎患者歸類。通過(guò)連續(xù)靜脈內(nèi)輸注在大腸桿菌中表達(dá)的未糖基化的ala-TFPI制品治療患者，施用劑量為0.025mg/kg/h，該制品配制在含300mM L-精氨酸、20mM檸檬酸鈉，pH5.5的緩沖液中，其滲量為560+/-110mOsm。以相同速度輸注含相同緩沖液但不含ala-TFPI的安慰劑作為研究藥物。分析結(jié)果證實(shí)，用ala-TFPI治療陽(yáng)性培養(yǎng)物肺炎患者是有效的(表1)。那些沒(méi)有感染源證據(jù)的患者被證明是無(wú)效的。表1.肺炎指標(biāo)—死亡率
表2.低INR肺炎指標(biāo)—死亡率
高INR陰性培養(yǎng)物組升高的死亡率似乎出現(xiàn)在有或沒(méi)有額外施用肝素的患者群體中，盡管需要注意的是，陰性肺炎培養(yǎng)物的非肝素組中受試者數(shù)目相對(duì)較少(表3)。在陽(yáng)性培養(yǎng)物/無(wú)肝素組中觀察到強(qiáng)積極治療效果。
表3.肺炎指標(biāo)—死亡率和肝素
實(shí)施例2.研究疾病變化的基線嚴(yán)格性(severity)評(píng)價(jià)了許多疾病變化的基線嚴(yán)格性，以確定是否可用組間不平衡來(lái)解釋觀察到的結(jié)果。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明，這些結(jié)果的差異與培養(yǎng)物狀況有關(guān)不是由于基線不平衡。因此，這些結(jié)果似乎代表了TFPI治療的不同效果，這是由于被感染或未被感染患者的生物學(xué)差異造成的。無(wú)論在經(jīng)TFPI處理的陰性肺炎培養(yǎng)物組中嚴(yán)格性指標(biāo)(例如APACHE II記分或器官功能障礙記分)等于安慰劑或較低，陰性培養(yǎng)物組證實(shí)有最高的總死亡率(表4)。
表4.肺炎指標(biāo)—疾病的基線嚴(yán)格性
IL-6是在膿毒病早期升高的炎性細(xì)胞因子，它反應(yīng)了炎性應(yīng)答的強(qiáng)度且與結(jié)果有關(guān)。在基線時(shí)，IL-6水平在臨床上證實(shí)患有肺炎但無(wú)感染證據(jù)的患者中較低(表5)。這說(shuō)明經(jīng)證實(shí)帶有肺炎感染源的患者與無(wú)明顯感染源的患者之間是有生物學(xué)差異的。奇怪的是，陰性TFPI培養(yǎng)物組有最低的基線IL-6水平，但有最高的死亡率。在膿毒病群體中，IL-6水平隨時(shí)間降低。IL-6降低的速度在經(jīng)TFPI治療的陰性肺炎培養(yǎng)物個(gè)體中下降(表5)。這說(shuō)明TFPI的生物效應(yīng)在被感染或未被感染的患者中可能是不同的。
表5.肺炎指標(biāo)—IL-6
*％Δ＝相對(duì)基線變化的百分比(幾何平均數(shù))實(shí)施例3.用經(jīng)證實(shí)的感染類型分析嚴(yán)重性肺炎患者如上所述，在最可能被感染的患者(即血液培養(yǎng)物呈陽(yáng)性的患者)中觀察了ala-TFPI治療的總功效。在用經(jīng)證實(shí)的感染類型分析嚴(yán)重性肺炎患者時(shí)，在血液培養(yǎng)物呈陽(yáng)性的個(gè)體和具有其他證據(jù)的患者中觀察了ala-TFPI治療的功效(表6)。該效果在細(xì)菌組，即最可能被感染或有最強(qiáng)感染源的患者中最強(qiáng)。
表6.培養(yǎng)物指標(biāo)和肺炎指標(biāo)—死亡率
如上所示，在沒(méi)有肝素時(shí)，被感染的患者(血液+“其他”)可從TFPI治療中受益。該結(jié)果最可能是由于肺炎組的益處(表7)。這一發(fā)現(xiàn)似乎說(shuō)明，內(nèi)源抗凝血藥對(duì)嚴(yán)重性肺炎感染患者的好處最大。
表7.感染指標(biāo)、肺炎指標(biāo)—死亡率，使用肝素
為進(jìn)一步限制異質(zhì)性，進(jìn)一步的試驗(yàn)可集中在社會(huì)獲得性肺炎(CAP)。在醫(yī)院中患上肺炎的患者(醫(yī)院肺炎)更可能用來(lái)收集病原生物，并具有其他使對(duì)感染性肺炎的診斷更加困難的肺部疾病。此外，與非醫(yī)院肺炎患者相比，CAP患者暴露于肝素的可能性較小。當(dāng)用治療前住院時(shí)間的長(zhǎng)短來(lái)分析數(shù)據(jù)時(shí)，需要注意住院≤2天的培養(yǎng)物陽(yáng)性患者(社會(huì)獲得性肺炎)和住院超過(guò)2天的患者(醫(yī)院肺炎)有類似的益處。培養(yǎng)物陰性患者中的不良效果主要在醫(yī)院肺炎組中觀察到(表8)。
表8.肺炎指標(biāo)—死亡率以及住院時(shí)間
然而，本專利申請(qǐng)想要涵蓋的變化和取代可由本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行而不背離所附權(quán)利要求的精神和范圍。
序列表<110>希龍公司(Chiron Corporation)<120>通過(guò)施用組織因子途徑抑制劑(TFPI)治療嚴(yán)重性肺炎<130>012441.00029<150>US 60/328,806<151>2001-10-15<160>2<170>FastSEQ，Windows版本4.0<210>1<211>276<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>1Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu Leu1 5 10 15Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp20 25 30Gly Pro Cys Lys Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr35 40 45Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn50 55 60Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn65 70 75 80Ala Asn Arg Ile Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp Phe85 90 95Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg100 105 110Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly115 120 125Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys130 135 140Asn Ile Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr Gly145 150 155 160Thr Gln Leu Asn Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser Thr Lys165 170 175Val Pro Ser Leu Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro180 185 190Ala Asp Arg Gly Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn
195 200 205Ser Val Ile Gly Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly210 215 220Asn Glu Asn Asn Phe Thr Ser Lys Gln Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lys225 230 235 240Lys Gly Phe Ile Gln Arg Ile Ser Lys Gly Gly Leu Ile Lys Thr Lys245 250 255Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr Glu Glu Ile Phe260 265 270Val Lys Asn Met275<210>2<211>277<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Ala Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu1 5 10 15Leu Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp20 25 30Asp Gly Pro Cys Lys Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe35 40 45Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln50 55 60Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp65 70 75 80Asn Ala Asn Arg Ile Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp85 90 95Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr100 105 110Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr115 120 125Gly Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys130 135 140Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr145 150 155 160Gly Thr Gln Leu Asn Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser Thr165 170 175Lys Val Pro Ser Leu Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr180 185 190Pro Ala Asp Arg Gly Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr195 200 205Asn Ser Val Ile Gly Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly210 215 220
Gly Asn Glu Asn Asn Phe Thr Ser Lys Gln Glu Cys Leu Arg Ala Cys225 230 235 240Lys Lys Gly Phe Ile Gln Arg Ile Ser Lys Gly Gly Leu Ile Lys Thr245 250 255Lys Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr Glu Glu Ile260 265 270Phe Val Lys Asn Met27權(quán)利要求
1.一種治療或預(yù)防嚴(yán)重性肺炎的方法，所述方法包括施用TFPI或TFPI類似物給患此病或有可能患病的患者。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述TFPI類似物是非糖基化ala-TFPI。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述患者被證實(shí)感染。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述TFPI或TFPI類似物是以一定的劑量率通過(guò)連續(xù)靜脈內(nèi)輸注給予的，所述劑量率相當(dāng)于以小于約0.66mg/kg/hr的劑量率施用參考ala-TFPI。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述劑量率相當(dāng)于以約0.00025到約0.050mg/kg/小時(shí)的劑量率施用參考ala-TFPI，其中所述TFPI或TFPI類似物施用至少約72小時(shí)。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述劑量率相當(dāng)于以約0.010到約0.045mg/kg/小時(shí)的劑量率施用參考ala-TFPI。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述TFPI類似物是非糖基化ala-TFPI。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述劑量率相當(dāng)于以約0.025mg/kg/小時(shí)的劑量率施用參考ala-TFPI。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述TFPI類似物是非糖基化ala-TFPI。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述TFPI或TFPI類似物施用至少約96小時(shí)。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述TFPI類似物是非糖基化ala-TFPI。
12.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，通過(guò)連續(xù)靜脈注射施用所述TFPI或TFPI類似物，提供相當(dāng)于以約0.024到約4.8mg/kg的總劑量施用參考ala-TFPI的總劑量。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述TFPI類似物是非糖基化ala-TFPI。
14.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，通過(guò)連續(xù)靜脈注射施用所述TFPI或TFPI類似物，施用的劑量率相當(dāng)于以約0.025mg/kg/小時(shí)的劑量率施用參考ala-TFPI。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述TFPI類似物是非糖基化ala-TFPI。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過(guò)連續(xù)靜脈注射施用所述TFPI或TFPI類似物，提供相當(dāng)于以約0.006mg/kg到約1.2mg/kg的日劑量施用參考ala-TFPI的日劑量。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述TFPI類似物是非糖基化ala-TFPI。
18.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述TFPI類似物包括由SEQ ID NO1的氨基酸19-89組成的第一個(gè)Kunitz結(jié)構(gòu)域。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述TFPI類似物還包括由SEQ IDNO1的氨基酸90-160組成的第二個(gè)Kunitz結(jié)構(gòu)域。
20.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述TFPI類似物包括SEQ ID NO1的氨基酸1-160。
21.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述TFPI類似物進(jìn)包括由SEQ IDNO1的氨基酸90-160組成的第二個(gè)Kunitz結(jié)構(gòu)域。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述TFPI類似物是非糖基化ala-TFPI。
23.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述TFPI或TFPI類似物由凍干組合物制備，所述組合物包含TFPI或TFPI類似物。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述TFPI類似物是非糖基化ala-TFPI。
25.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述TFPI或TFPI類似物作為含精氨酸的制劑施用。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述TFPI類似物是非糖基化ala-TFPI。
27.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述TFPI或TFPI類似物作為含檸檬酸的制劑施用。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述TFPI類似物是非糖基化ala-TFPI。
29.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述TFPI或TFPI類似物在制劑中的濃度約為0.15mg/ml，所述制劑包含約300mM鹽酸精氨酸和約20mM檸檬酸鈉，其pH約5.5。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述TFPI類似物是非糖基化ala-TFPI。
31.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括在所述施用期或24小時(shí)內(nèi)施用另外的試劑，所述試劑選自抗生素、抗體、內(nèi)毒素拮抗劑、具抗凝血活性的組織因子類似物、免疫刺激劑、細(xì)胞粘附阻斷劑、肝素、BPI蛋白、IL-1拮抗劑、pafase(PAF酶抑制劑)、TNF抑制劑、IL-6抑制劑和補(bǔ)體抑制劑。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述TFPI類似物是非糖基化ala-TFPI。
33.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述另外的試劑是抗體，所述與抗原特異結(jié)合的抗體選自TNF、IL-6和M-CSF。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述TFPI類似物是非糖基化ala-TFPI。
35.一種治療嚴(yán)重性肺炎的方法，所述方法包括施用給患者(i)TFPI或TFPI類似物和(ii)另外試劑，所述試劑選自抗生素、單克隆抗體、細(xì)胞因子抑制劑和補(bǔ)體抑制劑。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述TFPI類似物是非糖基化ala-TFPI。
37.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述患者被證實(shí)感染。
38.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述TFPI或TFPI類似物是以一定的劑量率通過(guò)連續(xù)靜脈內(nèi)輸注給予的，所述劑量率相當(dāng)于以小于約0.66mg/kg/hr的劑量率施用參考ala-TFPI。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述劑量率相當(dāng)于以約0.00025到約0.050mg/kg/小時(shí)的劑量率施用參考ala-TFPI。
全文摘要
預(yù)防或治療嚴(yán)重性肺炎的方法，包括施用組織因子途徑抑制劑(TFPI)或TFPI類似物給患此病或有可能患病的患者。所說(shuō)方法包括使用連續(xù)靜脈內(nèi)輸注低劑量TFPI或TFPI類似物以避免不利的副作用。
文檔編號(hào)A61P31/04GK1604790SQ02824900
公開(kāi)日2005年4月6日 申請(qǐng)日期2002年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月15日
發(fā)明者A·A·克里西 申請(qǐng)人:希龍公司