專利名稱：通過rna干擾治療纖維化疾病的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療纖維化疾病的藥物及用途。本發(fā)明還涉及一種雙鏈核糖核酸及其用于制備藥物的用途。
纖維化疾病在這里被理解為是一種具有在胞外基質(zhì)(ECM)的合成與分解之間不平衡的特征的疾病。這種不平衡分別地導(dǎo)致胞外基質(zhì)和結(jié)締組織形成和沉淀的增加。ECM由細(xì)胞，特別是膠原蛋白，非膠原糖蛋白，彈性蛋白，蛋白聚糖，和糖胺聚糖來生成。纖維化疾病例如包括可以在超出愈合所需的內(nèi)臟器官或皮膚損傷之后形成的瘢痕。胞外基質(zhì)的過度形成和沉淀可導(dǎo)致受影響的器官，諸如肺，腎，或肝臟的功能性紊亂或障礙。ECM在腎中，例如，由系膜細(xì)胞和間質(zhì)成纖維細(xì)胞形成。在肝臟中，主要由肝星狀空泡細(xì)胞和門成纖維細(xì)胞形成胞外基質(zhì)。肝星狀空泡細(xì)胞，通常是休眠的，其可通過傷害被激活，諸如毒素或慢性肝炎引起的傷害。結(jié)果它們?cè)诔衫w維細(xì)胞中增殖和轉(zhuǎn)分化，產(chǎn)生了過量的胞外基質(zhì)分子。設(shè)計(jì)通過反義寡核苷酸抑制I型膠原蛋白合成的實(shí)驗(yàn)僅僅產(chǎn)生對(duì)基質(zhì)生成的輕微抑制，其中的I型膠原蛋白是胞外基質(zhì)的一種重要的成分。迄今為止尚沒有發(fā)現(xiàn)有效抑制基質(zhì)形成的分子生物學(xué)方法。
DE100586C1中公開了一種抑制細(xì)胞中靶基因表達(dá)的方法，其中一個(gè)具有雙鏈結(jié)構(gòu)的寡核糖核苷酸被導(dǎo)入到細(xì)胞中。在這里雙鏈結(jié)構(gòu)的一個(gè)鏈互補(bǔ)于靶基因。
本發(fā)明的任務(wù)是克服本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)。具體的，是要獲得一種治療纖維化疾病的有效藥物和用途。此外，制備此種適于抑制胞外基質(zhì)過量生成的藥物和活性物質(zhì)的用途也將被獲得。
此任務(wù)通過權(quán)利要求1，21，22，和43中所述的特征被解決。有利的實(shí)施方案產(chǎn)生于權(quán)利要求2到20，23到42，以及44到61中的特征。
依據(jù)本發(fā)明，目的是設(shè)計(jì)一種含有一種雙鏈核糖核酸(dsRNA)的藥物，其適于通過RNA干擾的方式抑制與胞外基質(zhì)形成有關(guān)的基因的表達(dá)。
當(dāng)由一條或兩條核糖核酸構(gòu)成的核糖核酸具有雙鏈結(jié)構(gòu)時(shí)，存在dsRNA。并非所有dsRNA的核苷酸必須具有標(biāo)準(zhǔn)的Watson-Crick堿基對(duì)。尤其是單鏈的，非互補(bǔ)的堿基對(duì)幾乎沒有有效的作用，即使有的話。堿基對(duì)的最大可能數(shù)是包含在dsRNA中的最短鏈的核苷酸的數(shù)目。
通過反義寡核苷酸治療纖維化疾病的試驗(yàn)使得人們看到利用分子生物學(xué)方法治療該疾病的些許前景。然而，令人驚訝地，人們已經(jīng)表明通過雙鏈核糖核酸分別有效地抑制結(jié)締組織和ECM的新的形成是有可能的。依據(jù)本發(fā)明，與胞外基質(zhì)形成有關(guān)的基因同時(shí)也是導(dǎo)致引起細(xì)胞產(chǎn)生胞外基質(zhì)的因子的形成的基因，或?qū)е罗D(zhuǎn)化到產(chǎn)生胞外基質(zhì)細(xì)胞中的基因。此類因子包括血小板源生長(zhǎng)因子(PDGF)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)，尤其是TGF-β1，TGF-β2，或TGF-β3；結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)；或制瘤素-M。這些因子可，例如，啟動(dòng)和維持肝星狀空泡細(xì)胞和門成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化為類似于肌成纖維細(xì)胞的表型。與原始細(xì)胞相反，此表型顯示出增加的增殖率和基質(zhì)合成，通常同時(shí)通過基質(zhì)-降解蛋白酶降低了胞外基質(zhì)的分解(纖維溶解)。除了肝星狀空泡細(xì)胞或門成纖維細(xì)胞之外的肝細(xì)胞可產(chǎn)生這些因子。
在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，該基因是編碼結(jié)締組織生長(zhǎng)因子CTGF；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)，尤其是TGF-β1，TGF-β2，或TGF-β3；I型或II型TGF-β受體；信號(hào)傳感器smad-2，smad-3，或smad-4；SARA(用于受體激活的smad錨定器)；PDGF；制瘤素-M的基因，與膠原纖維、前膠原、脯氨?；?4-羥化酶、賴氨?；?羥化酶、賴氨?；?氧化酶、N-前肽酶或C-前肽酶的形成有關(guān)的基因。Smad-2，smad-3，smad-4，和SARA與通過連接TGE-β到I型或II型TGF-β受體上而觸發(fā)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。脯氨?；?4-羥化酶，賴氨?；?羥化酶，賴氨?；?氧化酶，N-前肽酶，以及C-前肽酶與從前膠原蛋白-一種前體分子來形成膠原纖維有關(guān)。N-前肽酶裂解前膠原的N-末端前肽且C-前肽酶裂解前膠原的C-末端前肽。
當(dāng)前膠原是α1(I)，α2(I)，α1(II)，α1(III)，α1(V)，α2(V)，α3V)，α1(VI)，α2(VI)，α3(VI)，α1(XI)，α2(XI)，或α3(XI)型時(shí)是特別有利的。在每一情況下，括號(hào)中的羅馬數(shù)字表示由前膠原形成的膠原蛋白的類型。在各種情況下的阿拉伯?dāng)?shù)字表示前膠原蛋白的鏈。
纖維化疾病例如可以為，肝臟纖維化，腎或肺的纖維化，例如，在損傷之后，或超出治愈所需的疤痕形成的疤痕組織的形成。
優(yōu)選的，dsRNA的S1鏈顯示出一個(gè)至少部分地與尤其是，少于25個(gè)連續(xù)核苷酸構(gòu)成的基因互補(bǔ)的區(qū)域。此處的“基因”被理解為是指編碼一個(gè)蛋白質(zhì)或肽的雙鏈DNA的DNA鏈，其與包括所有用于間質(zhì)轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄區(qū)域的DNA鏈互補(bǔ)。對(duì)于此基因我們通常只談及有意義鏈。S1鏈可與RNA轉(zhuǎn)錄本或其加工產(chǎn)物，諸如在基因表達(dá)期間形成的mRNA互補(bǔ)。此處的蛋白質(zhì)或肽與胞外基質(zhì)的形成有關(guān)。
dsRNA的互補(bǔ)區(qū)域可按照遞升的優(yōu)選順序，具有19到24，20到24，21到23個(gè)，且特別優(yōu)選具有22或23個(gè)核苷酸。具有此結(jié)構(gòu)的dsRNA在抑制基因方面是尤其有效的。dsDNA的鏈S1可按照遞升的優(yōu)選順序，具有少于30，少于25，21到24個(gè)，且尤其優(yōu)選具有23個(gè)核苷酸。這些核苷酸的數(shù)目也是dsRNA中堿基對(duì)的最大可能的數(shù)目。
已經(jīng)顯示，當(dāng)至少dsRNA的一個(gè)末端具有一個(gè)由1到4個(gè)，尤其是2或3個(gè)核苷酸構(gòu)成的單鏈突出端時(shí)是特別有利的。與在至少一個(gè)末端不具有單鏈突出端的dsRNA相比，此種dsRNA在抑制基因的表達(dá)方面顯示出優(yōu)越的效果。在這里，一個(gè)末端是其中存在一個(gè)5′-和一個(gè)3′-鏈-末端的dsRNA區(qū)域。僅僅由S1鏈構(gòu)成的dsRNA相應(yīng)地具有一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)和僅僅一個(gè)末端。由S1鏈和S2鏈構(gòu)成的dsRNA具有兩個(gè)末端。在這里，在每種情況下，一個(gè)末端是通過S1鏈上的一個(gè)鏈末端和S2鏈上的一個(gè)鏈末端形成的。
單鏈突出端優(yōu)選地位于S1鏈的3′-末端。單鏈突出端的這種位置進(jìn)一步增加藥物的效率。在一個(gè)實(shí)例中，dsRNA僅僅在一個(gè)末端，尤其是在位于S1鏈的3′-末端的末端處具有一個(gè)單鏈突出端。在具有兩個(gè)末端的dsRNA中，另一個(gè)末端是平端的，也即沒有突出端。為了增強(qiáng)dsRNA的干擾作用，已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)在一個(gè)末端具有一個(gè)突出端對(duì)于dsRNA是已經(jīng)足夠了，它不會(huì)將穩(wěn)定性降低到象帶有兩個(gè)突出端時(shí)的那種程度。僅僅具有一個(gè)突出端的dsRNA已被證明在各種細(xì)胞培養(yǎng)基、以及血液、血清和細(xì)胞中是充分穩(wěn)定和特別有效的。當(dāng)突出端位于S1鏈的3’末端時(shí)，表達(dá)的抑制是尤其有效的。
除了S1鏈，dsRNA優(yōu)選地還具有S2鏈，即，其由兩個(gè)單獨(dú)的單鏈組成。當(dāng)S1鏈(反義鏈)是23個(gè)核苷酸長(zhǎng)，S2是21個(gè)核苷酸長(zhǎng)，且S1鏈的3’末端具有由兩個(gè)核苷酸構(gòu)成的一個(gè)單鏈突出端時(shí)，該藥物是尤其有效的。位于S1鏈的5′-末端的dsRNA末端是平截的。S1鏈可互補(bǔ)于該基因的初級(jí)的或已加工的RNA轉(zhuǎn)錄本。優(yōu)選的，根據(jù)所附的序列表，dsRNA由具有序列No.3的S2鏈和具有序列No.4的S1鏈構(gòu)成，或由具有序列No.5的S2鏈和具有序列No.6的S1鏈構(gòu)成。此dsRNA在抑制為與胞外間質(zhì)形成有關(guān)的α1(I)型前膠原或CTGF編碼的基因的表達(dá)方面是尤其有效的。
該藥物可以為適于吸入，口服，灌注或注射，尤其是用于靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)的灌注或注射，或直接灌注或注射到受纖維化疾病影響的組織中的制劑。適于吸入，灌注，或注射的制劑可以最簡(jiǎn)單地由，尤其是僅僅由，dsRNA和生理可耐受的溶劑，優(yōu)選生理鹽水或生理可耐受的緩沖液，尤其是磷酸鹽緩沖鹽水溶液構(gòu)成。令人驚訝地，已經(jīng)顯示僅僅溶解在此緩沖液或溶劑中并給藥的dsRNA被表達(dá)該基因的細(xì)胞吸收?；虻谋磉_(dá)以及疾病受到抑制而不需要dsRNA必須被包裝在一個(gè)特定載體中。dsRNA可存在于一種溶液，尤其是一種生理可耐受的緩沖液或一種生理鹽水溶液中的藥物中，由膠束結(jié)構(gòu)，優(yōu)選脂質(zhì)體，殼體，類衣殼體，或聚合物毫微膠囊或微膠囊包圍，或與聚合物毫微膠囊或微膠囊結(jié)合。生理可耐受緩沖液可以是一種磷酸緩沖鹽水溶液。膠束結(jié)構(gòu)，殼體，類衣殼體，或聚合物毫微膠囊或微膠囊可促進(jìn)表達(dá)基因的細(xì)胞中的dsRNA的吸收。聚合物毫微膠囊或微膠囊由至少一種可生物降解的聚合物諸如聚丁基氰基丙烯酸酯構(gòu)成。聚合物毫微膠囊或微膠囊可轉(zhuǎn)運(yùn)和釋放其中包含的或與其結(jié)合的dsRNA。
dsRNA可與一種能使受纖維化疾病影響的器官，尤其是肝臟，腎臟，肺，或皮膚的細(xì)胞中的dsRNA被定向吸收的因子相結(jié)合。結(jié)合是指dsRNA可與因子或，如包圍該dsRNA的脂質(zhì)體或毫微或微膠囊相結(jié)合。分子可被包埋在那些使定向吸收(通常所說的靶向)成為可能的脂質(zhì)體或毫微或微膠囊中。優(yōu)選的，因子是一種介導(dǎo)與尤其是肝星狀空泡細(xì)胞或肌成纖維細(xì)胞的VI型膠原蛋白受體或PDGFβ-受體連接的因子。肝星狀空泡細(xì)胞或肌成纖維細(xì)胞可被激活。根據(jù)所附序列表的序列No.25的環(huán)肽C*GRGDSPC*，特別適用于VI型膠原蛋白受體。C*代表半胱氨酸殘基，其通過二硫鍵來誘導(dǎo)肽環(huán)的形成。
優(yōu)選的，該藥物至少以一個(gè)含有一定量的dsRNA的劑量單位存在，按照遞升的優(yōu)越順序，其最大劑量為5mg，2.5mg，200pg，100pg，50pg，且最佳劑量為25pg/公斤體重/每天。令人驚訝地，已經(jīng)顯示以此日劑量給藥的dsRNA在抑制基因的表達(dá)方面顯示出杰出的效果，且顯示出抗纖維化的活性。劑量單位可設(shè)計(jì)為用于以單日服劑量給藥或口服。在這種情況下，整個(gè)日服劑量被包含在一個(gè)單劑量單位中。如果劑量單位被設(shè)計(jì)成每天給藥或吸收若干次，則每一劑量包含的dsRNA的量相對(duì)地較小以便能夠達(dá)到總的日劑量。還可以將劑量單位設(shè)計(jì)成幾天一次單一的給藥或攝入，例如，以便dsRNA被釋放持續(xù)幾天。劑量單位因而相應(yīng)地包括多個(gè)日劑量。dsRNA以充分的量包含在劑量單位中以抑制與胞外基質(zhì)形成有關(guān)的基因表達(dá)。還可以設(shè)計(jì)藥物使得幾個(gè)單位的藥物的總和一起包含充分的量。充分的量也可取決于劑量單位的藥物配方。為了確定什么是充分的量，dsRNA可分別以逐步增加的量或劑量來給藥。隨后，可利用已知的方法評(píng)價(jià)來自受影響的纖維化組織的樣品來評(píng)估是否上述基因的表達(dá)抑制在此量時(shí)發(fā)生。此方法可包括，例如，分子生物學(xué)的，生物化學(xué)的，或免疫學(xué)的方法。
此外，本發(fā)明的目的是利用雙鏈核糖核酸產(chǎn)生一種藥物來治療纖維化疾病，由此dsRNA適于通過RNA干擾來抑制與胞外基質(zhì)形成有關(guān)的基因的表達(dá)。此外，本發(fā)明的目的是利用雙鏈核糖核酸來治療纖維化疾病，由此dsRNA適于通過RNA干擾來抑制與胞外基質(zhì)形成有關(guān)的基因的表達(dá)。此外，本發(fā)明的目的是雙鏈核糖核酸，它是一種適用于通過RNA干擾來抑制與纖維化疾病中胞外基質(zhì)形成有關(guān)的基因表達(dá)的活性因子。
本發(fā)明的用途和dsRNA的其它有益的實(shí)施方案，參見前面的討論。
現(xiàn)在將根據(jù)圖表對(duì)本發(fā)明進(jìn)行解釋。它們顯示

圖1取決于治療中所用的前膠原-α1(I)-特異性的dsRNA的量，RD細(xì)胞的前膠原-α1(I)轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)水平，圖2取決于治療中所用的CTGF-特異性的dsRNA的量，RD細(xì)胞的CTGF轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)水平，圖3取決于治療中所用的CTGF-特異性的dsRNA的量，CFSC-2G細(xì)胞的CTGF轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)水平，以及圖4取決于用CTGF-特異性的dsRNA的治療，分離自大鼠的肝星狀空泡細(xì)胞的CTGF轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)水平。
下列具有序列表中序列No.1到No.6的雙鏈寡核糖核苷酸被用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)HCV s5/as5，其S1鏈互補(bǔ)于丙型肝炎病毒(HCV)基因組的序列S25′-acg gcu agc ugu gaa ugg ucc gu-3′(序列No.1)S13′-ag ugc cga ucg aca cuu acc agg -5′(序列No.2)PCA1+2，其S1鏈與人前膠原α1(I)基因的序列互補(bǔ)，且與來自褐家鼠(Rattus norvegicus)的前膠原α1(I)基因互補(bǔ)，在此區(qū)域中與它100％-同源S25′-caa gag ccu gag cca gca gau cg-3(序列No.3)S13′-ga guu cuc gga cuc ggu cgu cua-5′(序列No.4)CTG1+2，其S1鏈與人CTGF基因的序列互補(bǔ)且與來自褐家鼠(Rattus norvegicus)的CTGF基因互補(bǔ)，在此區(qū)域與它100％-同源S25′-ccu gug ccu gcc auu aca acu gu-3′(序列No.5)S13′-cu gga cac gga cgg uaa ugu uga -5′(序列No.6)下列細(xì)胞被用于實(shí)驗(yàn)RD細(xì)胞這些是人胚胎橫紋肌肉瘤細(xì)胞系的細(xì)胞。此細(xì)胞系可獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物中心(American Type Culture Collection(ATCC))的No.CCL136，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，USA。
CFSC-2G細(xì)胞這些是來自大鼠肝星狀空泡細(xì)胞系的細(xì)胞，可獲自Dr.Marcos Rojkind(肝臟研究中心，艾伯特愛因斯坦醫(yī)學(xué)院，Bronx，紐約市，紐約，USA)。CFSC干細(xì)胞的分離描述在實(shí)驗(yàn)室研究(Laboratory Investigation)65(1991)，644-53。CFSC-2G亞克隆的分離和鑒定描述在Patricia Greenwel等，實(shí)驗(yàn)室研究(Laboratory Investigation)69(1993)，210-26。
初級(jí)的肝星狀空泡細(xì)胞分離自大鼠肝臟，依據(jù)Knook，D.等，Exp.Cell Res.139(1982)，第468到471頁。
所有的細(xì)胞被培養(yǎng)在含有862mg/l 1-丙氨?；?1-谷氨酰胺和4.5g/l葡萄糖(Invitrogen GmbH，Technology Park Karisruhe，Emmy-Noether Strasse 10，D-76131 Karisruhe)的Dulbecco′Modified Eagle′s培養(yǎng)基(DMEM)中，另外加入了10％熱滅活的胎牛血清(FCS)，100IU/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素(細(xì)胞培養(yǎng)基)。在37℃，在由8％CO2和92％空氣構(gòu)成的潮濕的氣氛中的溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
用dsRNA對(duì)RD細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染是通過用來自陽離子脂類的負(fù)載了DNA的脂質(zhì)體進(jìn)行脂轉(zhuǎn)染而達(dá)到的。來自Invitrogen的Lipofectamine Plus試劑盒被用于此目的。其包含一種脂轉(zhuǎn)染胺-和一種正試劑。每一轉(zhuǎn)染依據(jù)生產(chǎn)商說明平行進(jìn)行四次。為了進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將大約70,000個(gè)RD細(xì)胞/孔接種于無菌的12-孔平皿。二十四小時(shí)后，5μl的含有相應(yīng)dsRNA的20μmol/l水溶液被稀釋在12-孔平皿中，每2孔100μl的DMEM中。每種情況下加入10μl的正試劑，混合，并在室溫下培養(yǎng)15分鐘。隨后，加入100μl新鮮的1∶25稀釋度的在DMEM中的脂轉(zhuǎn)染胺試劑(相當(dāng)于240μg脂類混合物/ml)，混合，且通過室溫下溫育15分鐘使得負(fù)載DNA的脂質(zhì)體的形成成為可能。然后，去除細(xì)胞所附的細(xì)胞培養(yǎng)基，且洗滌細(xì)胞兩次，每次每孔用1ml DMEM。每個(gè)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)用1ml DMEM進(jìn)行稀釋，且按0.6ml/孔轉(zhuǎn)移到細(xì)胞上(每個(gè)試驗(yàn)2個(gè)孔)。在溫箱中培養(yǎng)4小時(shí)之后，向每個(gè)孔中添加1ml的細(xì)胞培養(yǎng)基并再培養(yǎng)44個(gè)小時(shí)。
為進(jìn)行肝星狀空泡細(xì)胞和CFSC-2G細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，通過寡轉(zhuǎn)染胺將dsRNA(Invitrogen)導(dǎo)入到細(xì)胞中。為達(dá)到此目的，把分離自大鼠的CFSC-2G或肝星狀空泡細(xì)胞以20,000細(xì)胞/孔的密度接種在無菌的12-孔平皿中。接種24小時(shí)后，在每個(gè)試驗(yàn)中將4μl的寡轉(zhuǎn)染胺稀釋在11μl的DMEM中，且在室溫下培養(yǎng)10分鐘。此外，在每個(gè)試驗(yàn)中將5μl含有dsRNA的20mol/l水溶液稀釋在185μl DMEM中(12-孔平皿的2個(gè)孔)。將15μl的每一預(yù)稀釋的寡轉(zhuǎn)染胺移液到稀釋的dsRNA中，混合，并在室溫下培養(yǎng)20分鐘。最后，將1050μl的DMEM加到試驗(yàn)中。在用1ml的DMEM每孔洗滌兩次之后，將600μl的每一種所得的混合物添加于細(xì)胞中。在溫箱中培育4小時(shí)之后，向每個(gè)孔中添加1ml的細(xì)胞培養(yǎng)基并培養(yǎng)44小時(shí)。
在所有研究的細(xì)胞中的dsRNA對(duì)涉及胞外基質(zhì)形成的基因的轉(zhuǎn)錄本水平的作用被通過定量PCR進(jìn)行測(cè)定。在溫箱中44小時(shí)后，細(xì)胞被溶解，利用PeqGold RNAPure試劑盒(PEQLAB Biotechnologie GmbH，Carl-Thiersch-Str.2b，D-91052 Erlangen，Order No.30-1010)依據(jù)生產(chǎn)商的說明將其含有的RNA分離出來。
在每一情況下通過利用相同量的RNA(100-1000ng)，使用Superscript II(invitrogen GmbH，Technology Park，Karlsruhe，EmmyNoether Strasse 10，D-76131 Karisruhe；目錄號(hào)18064-014)反轉(zhuǎn)錄形成cDNA。100pmol的寡-dT引物和50pmol的隨機(jī)引物被用作引物。將10μl的RNA(100-1000ng)，0.5μl的寡-dT引物(100pmol)，和1μl的隨機(jī)引物(50pmol)在70℃溫育10分鐘，然后在冰上短暫貯藏。隨后，加入7μl逆轉(zhuǎn)錄酶混合物(4μl的5X緩沖液；2μl的0.1mol/l DTT；各1μl的10mmol/l dNTP)，1μl的Superscript II，和1μl的核糖核酸酶抑制劑RNAsin_(Promega GmbH，Schildkrbtstr.15，D68199 Mannheim)?；旌衔锶缓蟊槐３衷?5℃達(dá)10分鐘，然后在42℃保持1小時(shí)，且最后在70℃保持15分鐘。
在被dsRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的dsRNA對(duì)編碼前膠原α1(I)和CTGF的基因表達(dá)的作用被通過定量″實(shí)時(shí)″RT-PCR測(cè)定這些基因的轉(zhuǎn)錄本的量(轉(zhuǎn)錄本水平)來證明。為了做到這一點(diǎn)，在″Light-Cycler″(RocheDiagnostics GmbH)中依據(jù)生產(chǎn)商的說明，按照″TaqMan″法(PerkinElmer，F(xiàn)erdinand-Porsche-Ring 17，D-63110 Rodgau-Jugesheim)，利用LightCycler Fast Start DNA MasterHybridization Probes試劑盒(Roche Diagnostics GmbH)對(duì)相同體積的所形成的cDNA的特異性cDNA的量進(jìn)行定量分析。用在5′末端用熒光基團(tuán)6′-FAM(羧基熒光素)標(biāo)記，以及在3′末端用猝滅劑分子TAMRA(羧基-四甲基-羅丹明)標(biāo)記的探針進(jìn)行檢測(cè)。熒光基團(tuán)被光激發(fā)。它轉(zhuǎn)移激發(fā)能量到3′-側(cè)面的也即直接鄰近的猝滅劑分子。在PCR的延伸階段中，Tag DNA聚合酶的5′-3′核酸外切酶活性導(dǎo)致探針的水解，且因此也導(dǎo)致熒光基團(tuán)與猝滅劑分子的空間分離。6′-FAM的熒光的猝滅漸漸地變少了。熒光因此增加并被定量測(cè)定。通過利用已知的轉(zhuǎn)錄本量或參照cDNA的稀釋系列而形成的標(biāo)準(zhǔn)曲線來進(jìn)行定量分析。此外，測(cè)定了管家基因β2-微球蛋白的轉(zhuǎn)錄本水平并用作標(biāo)準(zhǔn)。β2-微球蛋白是一種以恒定量結(jié)構(gòu)表達(dá)的蛋白質(zhì)。測(cè)定前膠原α1(I)-或CTGF-cDNA的量，表示為與β2微球蛋白-cDNA的量的比率，且用圖表顯示在圖表1到4中，作為相對(duì)的轉(zhuǎn)錄本水平。
下列的引物和TaqMan探針被用于通過實(shí)時(shí)RT-PCR來測(cè)定前膠原α
1(I)和CTGF在大鼠細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄本水平
下列的引物和TaqMan探針被用于通過實(shí)時(shí)RT-PCR來測(cè)定前膠原α1(I)和CTGF在人細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄本水平
附圖1到4顯示了dsRNA的作用。為了保證實(shí)驗(yàn)中的恒定的轉(zhuǎn)染率，用100nmol/l dsRNA轉(zhuǎn)染所有的細(xì)胞。為了做到這一點(diǎn)，將0到100nmol/l的定向抗前膠原α1(I)或CTGF的特異性dsRNA用非特異性的HCV s5/as5 dsRNA補(bǔ)足到100nmol/l的濃度，并在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染。用0nmol/l特異性ds RNA測(cè)定的轉(zhuǎn)錄本的水平被專斷地定義為100％。
用濃度逐漸增加的定向抗前膠原α1(I)的dsRNA轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞的結(jié)果顯示于附圖1中。dsRNA的作用取決于濃度。使用100nmol/l PCA1+2dsRNA可將前膠原α1(I)轉(zhuǎn)錄本的水平減少到20％。β2-微球蛋白的表達(dá)沒有被所述dsRNA所改變。這些證明了所使用的dsRNA的特異性。
附圖2顯示了CTGF基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄本水平隨轉(zhuǎn)染所用的CTG1+2dsRNA濃度的變化。在這里，所使用的dsRNA的作用也取決于濃度。100nmol/l的CTG1+2dsRNA將轉(zhuǎn)錄本水平降低到10％，而50nmol的dsRNA則將轉(zhuǎn)錄本水平降低到用非特異性的HCV s5/as5 dsRNA處理的細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本水平的32％。在這里，β2-微球蛋白的表達(dá)也沒有變化。
附圖3顯示了轉(zhuǎn)染48小時(shí)之后CFSC-2G細(xì)胞中CTGF基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄本水平。在這里，也有轉(zhuǎn)錄本水平通過所使用的dsRNA而發(fā)生濃度-依賴性的減少。
附圖4顯示了分別分離自大鼠的肝星狀空泡細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞中CTGF基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄本水平。將細(xì)胞在塑料上培養(yǎng)7天。結(jié)果它們已經(jīng)被激活。用100nmol/l dsRNA轉(zhuǎn)染48小時(shí)之后，轉(zhuǎn)錄有大約50％的減少。
序列表<110>Ribopharma AG<120>通過RNA干擾治療纖維化疾病的藥物<130>422394EH<160>25<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>23<212>RNA<213>丙型肝炎病毒<400>1acggcuagcu gugaaugguc cgu 23<210>2<211>23<212>RNA<213>丙型肝炎病毒<400>2ggaccauuca cagcuagccg uga 23<210>3<211>23<212>RNA<213>人<400>3caagagccug agccagcaga ucg 23<210>4<211>23<212>RNA
<213>人<400>4aucugcuggc ucaggcucuu gag 23<210>5<211>23<212>RNA<213>人<400>5ccugugccug ccauuacaac ugu 23<210>6<211>23<212>RNA<213>人<400>6aguuguaaug gcaggcacag guc 23<210>7<211>20<212>DNA<213>褐家鼠<400>7tccggctcct gctcctctta 20<210>8<211>23<212>DNA<213>褐家鼠<400>8ttcttggcca tgcgtcagga ggg 23<210>9<211>24
<212>DNA<213>褐家鼠<400>9gtatgcagct gacttcaggg atgt24<210>10<211>20<212>DNA<213>褐家鼠<400>10atccctgcga cccacacaag 20<210>11<211>21<212>DNA<213>褐家鼠<400>11ctcccccgcc aaccgcaaga t 21<210>12<211>22<212>DNA<213>褐家鼠<400>12caactgcttt ggaaggactc gc 22<210>13<211>25<212>DNA<213>褐家鼠<400>13ccgatgtata tgcttgcaga gttaa 25<210>14
<211>27<212>DNA<213>褐家鼠<400>14aaccgtcacc tgggaccgag acatgta 27<210>15<211>23<212>DNA<213>褐家鼠<400>15cagatgattc agagctccat aga 23<210>16<211>25<212>DNA<213>人<400>16cagaagaact ggtacatcag caaga 25<210>17<211>27<212>DNA<213>人<400>17accgatggat tccagttcga gtatggc 27<210>18<211>19<212>DNA<213>人<400>18gtcagctgga tggccacat 19
<210>19<211>17<212>DNA<213>人<400>19aaccgcaaga tcggcgt17<210>20<211>22<212>DNA<213>人<400>20tgcaccgcca aagatggtgc tcc 22<210>21<211>19<212>DNA<213>人<400>21ccgtaccacc gaagatgca 19<210>22<211>23<212>DNA<213>人<400>22tgactttgtc acagcccaag ata 23<210>23<211>27<212>DNA<213>人<400>23tgatgctgct tacatgtctc gatccca 27
<210>24<211>20<212>DNA<213>人<400>24aatccaaatg cggcatcttc 20<210>25<211>8<212>PRT<213>人工的<400>25Cys Gly Arg Gly Asp Ser Pro Cys1 51權(quán)利要求
1.治療纖維化疾病的藥物，其中藥物含有適于通過RNA干擾而抑制與胞外基質(zhì)形成有關(guān)的基因的表達(dá)的雙鏈核糖核酸(dsRNA)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物，其中所述的基因是編碼CTGF，TGF-β，I型或II型TGF-β受體，smad-2，smad-3，或smad-4，SARA，PDGF，制瘤素-M的基因；是與膠原纖維，前膠原，脯氨?；?4-羥化酶，賴氨?；?羥化酶，賴氨酰基-氧化酶，N-前肽酶，或C-前肽酶形成有關(guān)的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的藥物，其中所述的前膠原是α1(I)型，α2(I)，α1(II)，α1(III)，α1(V)，α2(V)，α3(V)，α1(VI)，α2(VI)，α3(VI)，α1(XI)，α2(XI)，或α3(XI)。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的藥物，其中所述的纖維化疾病是肝臟纖維化，腎臟或肺的纖維化，或超過了痊愈所需瘢痕形成的瘢痕組織的形成。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的藥物，其中dsRNA的S1鏈具有一個(gè)尤其是由至少部分地與所述基因互補(bǔ)的少于25個(gè)連續(xù)的核苷酸組成的區(qū)域。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的藥物，其中所述的互補(bǔ)區(qū)域具有19到24個(gè)，優(yōu)選20到24個(gè)，尤其優(yōu)選21到23個(gè)，特別是22或23個(gè)核苷酸。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的藥物，其中所述的S1鏈具有少于30個(gè)，優(yōu)選少于25個(gè)，特別優(yōu)選21到24個(gè)，特別是23個(gè)核苷酸。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的藥物，其中所述dsRNA的至少一個(gè)末端具有一個(gè)由1到4個(gè)，特別是2或3個(gè)核苷酸構(gòu)成的單鏈突出端。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的藥物，其中所述的單鏈突出端位于S1鏈的3′末端。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的藥物，其中所述dsRNA僅僅在一個(gè)末端，特別是在位于S1鏈的3′-末端的末端具有一個(gè)單鏈的突出端。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的藥物，其中所述的dsRNA除S1鏈之外還具有S2鏈。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的藥物，其中所述的S1鏈?zhǔn)?3個(gè)核苷酸長(zhǎng)，S2鏈?zhǔn)?1個(gè)核苷酸長(zhǎng)，且所述S1鏈的3′-末端具有一個(gè)由兩個(gè)核苷酸組成的單鏈突出端，而所述的位于S1鏈5′-末端的dsRNA的末端是平截的。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的藥物，其中所述S1鏈與基因的初級(jí)或加工的RNA轉(zhuǎn)錄本互補(bǔ)。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的藥物，其中根據(jù)所附的序列表，所述的dsRNA由具有序列No.3的S2鏈和具有序列No.4的S1鏈構(gòu)成，或由具有序列No.5的S2和具有序列No.6的S1鏈構(gòu)成。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的藥物，其中所述的藥物是一種適于吸入，口服，灌注或注射，特別是適于靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)灌注或注射，或直接用于灌注或注射到受纖維化疾病影響的組織中的制劑。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的藥物，其中所述dsRNA存在于溶液，特別是生理可耐受的緩沖液或生理鹽水溶液中的藥物中，被一種膠束結(jié)構(gòu)，優(yōu)選脂質(zhì)體、殼體、類衣殼體、或一種聚合物毫微膠囊或微膠囊所包圍，或與聚合物毫微膠囊或微膠囊結(jié)合。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的藥物，其中使所述dsRNA與能使dsRNA被定向吸收到受纖維化疾病影響的器官，尤其是肝臟，腎臟，肺或皮膚的細(xì)胞中的因子結(jié)合。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的藥物，其中所述的因子是介導(dǎo)與VI型膠原受體或PDGFβ-受體，尤其是肝星狀空泡細(xì)胞或肌成纖維細(xì)胞的VI型膠原受體或PDGFβ-受體的連接的因子。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的藥物，其中所述的因子是環(huán)肽C*GRGDSPC*。
20.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的藥物，其中所述的藥物以至少含有一定量的dsRNA的劑量單位存在，按照遞升的優(yōu)選順序，最大劑量為5mg，2.5mg，200μg，100μg，50μg，最佳為25μg/公斤體重/天。
21.雙鏈核糖核酸(dsRNA)用于制備治療纖維化疾病的藥物的用途，其中所述的dsRNA適于通過RNA干擾而抑制與胞外基質(zhì)形成有關(guān)的基因的表達(dá)。
22.雙鏈核糖核酸(dsRNA)用于治療纖維化疾病的用途，其中所述的dsRNA適于通過RNA干擾而抑制與胞外基質(zhì)形成有關(guān)的基因的表達(dá)。
23.根據(jù)權(quán)利要求21或22的用途，其中所述基因是編碼CTGF，TGF-β，I型或II型TGF-β受體，smad-2，smad-3，或smad-4，SARA，PDGF，制瘤素-M的基因，是與膠原纖維，前膠原，脯氨?；?4-羥化酶，賴氨?；?羥化酶，賴氨?；?氧化酶，N-前肽酶，或C-前肽酶的形成有關(guān)的基因。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的用途，其中所述的前膠原是α1(I)，α2(I)，α1(II)，α1(III)，α1(V)，α2(V)，α3(V)，α1(VI)，α2(VI)，α3(VI)，α1(XI)，α2(XI)，或α3(XI)型。
25.根據(jù)權(quán)利要求21至24之一的用途，其中所述的纖維化疾病是肝臟纖維化，腎臟或肺的纖維化，或超過了痊愈所需的瘢痕形成的瘢痕組織的形成。
26.根據(jù)權(quán)利要求21至25之一的用途，其中dsRNA的S1鏈具有一個(gè)尤其是由至少部分地與所述基因互補(bǔ)的少于25個(gè)連續(xù)核苷酸構(gòu)成的區(qū)域。
27.根據(jù)權(quán)利要求21至26之一的用途，其中所述的互補(bǔ)區(qū)域具有19到24個(gè)，優(yōu)選的20到24個(gè)，特別優(yōu)選21到23個(gè)，尤其是22或23個(gè)核苷酸。
28.根據(jù)權(quán)利要求21至27之一的用途，其中所述的S1鏈具有少于30個(gè)，優(yōu)選少于25個(gè)，特別優(yōu)選21到24個(gè)，尤其是23個(gè)核苷酸。
29.根據(jù)權(quán)利要求21至28之一的用途，其中所述dsRNA的至少一個(gè)末端具有一個(gè)由1到4個(gè)，尤其是2或3個(gè)核苷酸構(gòu)成的單鏈突出端。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的用途，其中所述的單鏈突出端位于S1鏈的3′末端。
31.根據(jù)權(quán)利要求21至30之一的用途，其中所述dsRNA僅僅在一個(gè)末端，尤其是在位于S1鏈3′-末端的末端具有一個(gè)單鏈的突出端。
32.根據(jù)權(quán)利要求21到31之一的用途，其中所述的dsRNA除S1鏈之外還具有S2鏈。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的用途，其中所述的S1鏈為23個(gè)核苷酸長(zhǎng)，S2鏈?zhǔn)?1個(gè)核苷酸長(zhǎng)，且所述S1鏈的3′-末端具有一個(gè)由兩個(gè)核苷酸構(gòu)成的單鏈突出端，而位于S1鏈的5′-末端的dsRNA末端是平截的。
34.根據(jù)權(quán)利要求21至33之一的用途，其中所述S1鏈與基因的初級(jí)的或加工的RNA轉(zhuǎn)錄本互補(bǔ)。
35.根據(jù)權(quán)利要求21至34之一的用途，其中根據(jù)所附的序列表，所述的dsRNA由具有序列No.3的S2鏈和具有序列No.4的S1鏈構(gòu)成，或由具有序列No.5的S2和具有序列No.6的S1鏈構(gòu)成。
36.根據(jù)權(quán)利要求21至35之一的用途，其中所述的dsRNA存在于適于吸入，口服，注灌或注射，尤其是靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)灌注或注射，或適于直接灌注或注射到受纖維化疾病組織影響的組織的制劑中。
37.根據(jù)權(quán)利要求21至36之一的用途，其中所述dsRNA存在于溶液，尤其是生理可耐受的緩沖液或生理鹽水溶液中，被一種膠束結(jié)構(gòu)，優(yōu)選脂質(zhì)體，殼體，類衣殼體，或一種聚合物毫微膠囊或微膠囊包圍，或與聚合物毫微膠囊或微膠囊結(jié)合。
38.根據(jù)權(quán)利要求21至37之一的用途，其中所述的dsRNA是通過口服，吸入，灌注，或注射，尤其是靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)灌注或注射，或直接灌注或注射到受纖維化疾病影響的組織中而給藥的。
39.根據(jù)權(quán)利要求21至38之一的用途，其中使所述dsRNA與能使dsRNA被定向吸收到受纖維化疾病影響的器官，尤其是肝臟，腎臟，肺，或皮膚的細(xì)胞中的因子結(jié)合。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的用途，其中所述的因子是介導(dǎo)與VI型前膠原受體或PDGFβ-受體，尤其是肝星狀空泡細(xì)胞或肌成纖維細(xì)胞的VI型前膠原受體或PDGFβ-受體連接的因子。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的用途，其中所述的因子是環(huán)肽C*GRGDSPC*。
42.根據(jù)權(quán)利要求21至41之一的用途，其中按照遞升的優(yōu)選順序，所述dsRNA的最大使用劑量為5mg，2.5mg，200μg，100μg，50μg，且最佳為25μg/公斤體重/天。
43.適于通過RNA干擾而抑制與纖維化疾病中胞外基質(zhì)的形成有關(guān)的基因表達(dá)的雙鏈核糖核酸(dsRNA)。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的dsRNA，其中所述基因是編碼CTGF，TGF-β，I型或II型TGF-β受體，smad-2，smad-3，或smad-4，SARA，PDGF，制瘤素-M的基因，是與膠原纖維，前膠原，脯氨?；?4-羥化酶，賴氨?；?羥化酶，賴氨?；?氧化酶，N-前肽酶，或C-前肽酶形成有關(guān)的基因。
45.根據(jù)權(quán)利要求44的dsRNA，其中所述的前膠原是α1(I)，α2(I)，α1(II)，α1(III)，α1(V)，α2(V)，α3(V)，α1(VI)，α2(VI)，α3(VI)，α1(XI)，α2(XI)，或α3(XI)型。
46.根據(jù)權(quán)利要求43至45之一的dsRNA，其中所述的纖維化疾病是肝臟纖維化，腎臟或肺的纖維化，或不需要的瘢痕形成。
47.根據(jù)權(quán)利要求43至46之一的dsRNA，其中dsRNA的S1鏈具有一個(gè)尤其是由至少部分地與所述基因互補(bǔ)的少于25個(gè)連續(xù)核苷酸構(gòu)成的區(qū)域。
48.根據(jù)權(quán)利要求43至47之一的dsRNA，其中所述的互補(bǔ)區(qū)域具有19到24個(gè)，優(yōu)選20到24個(gè)，特別優(yōu)選43到23個(gè)，尤其是22或23個(gè)核苷酸。
49.根據(jù)權(quán)利要求43至48之一的dsRNAa，其中所述的S1鏈具有少于30個(gè)，優(yōu)選少于25個(gè)，特別優(yōu)選21到24個(gè)，尤其是23個(gè)核苷酸。
50.根據(jù)權(quán)利要求43至49之一的dsRNA，其中所述dsRNA的至少一個(gè)末端具有一個(gè)由1到4個(gè)，尤其是2或3個(gè)核苷酸構(gòu)成的單鏈突出端。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的dsRNA，其中所述的單鏈突出端位于S1鏈的3′末端。
52.根據(jù)權(quán)利要求43至51之一的dsRNA，其中所述dsRNA僅僅在一個(gè)末端，尤其是在位于S1鏈3′-末端的末端具有一個(gè)單鏈的突出端。
53.根據(jù)權(quán)利要求43至52之一的dsRNA，其中所述的dsRNA除S1鏈之外還具有S2鏈。
54.根據(jù)權(quán)利要求53的dsRNA，其中的S1鏈為23個(gè)核苷酸長(zhǎng)，S2鏈?zhǔn)?1個(gè)核苷酸長(zhǎng)，且所述S1鏈的3′-末端具有一個(gè)由兩個(gè)核苷酸構(gòu)成的單鏈突出端，而位于S1鏈的5′-末端的dsRNA末端是平截的。
55.根據(jù)權(quán)利要求43至54之一的dsRNA，其中所述的S1鏈與基因的初級(jí)的或加工的RNA轉(zhuǎn)錄本互補(bǔ)。
56.根據(jù)權(quán)利要求43至55之一的dsRNA，其中根據(jù)所附的序列表，所述的dsRNA由具有序列No.3的S2鏈和具有序列No.4的S1鏈構(gòu)成，或由具有序列No.5的S2和具有序列No.6的S1鏈構(gòu)成。
57.根據(jù)權(quán)利要求43至56之一的dsRNA，其中所述的dsRNA存在于適于吸入，口服，灌注或注射，尤其是靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)灌注或注射，或適于直接灌注或注射到受纖維化疾病影響的組織的制劑中。
58.根據(jù)權(quán)利要求43至57之一的dsRNA，其中所述dsRNA存在于溶液，尤其是生理可耐受的緩沖液或生理鹽水溶液中，被一種膠束結(jié)構(gòu)，優(yōu)選脂質(zhì)體，殼體，類衣殼體，或一種聚合物毫微膠囊或微膠囊包圍，或與聚合物毫微膠囊或微膠囊結(jié)合。
59.根據(jù)權(quán)利要求43至58之一的dsRNA，其中使所述dsRNA與能使ds RNA被定向吸收到受纖維化疾病影響的器官，尤其是肝臟，腎臟，肺，或皮膚的細(xì)胞中的因子結(jié)合。
60.根據(jù)權(quán)利要求59的dsRNA，其中所述因子是介導(dǎo)與VI型骨膠原受體或PDGFβ-受體，尤其是肝星狀空泡細(xì)胞或肌成纖維細(xì)胞的VI型骨膠原受體或PDGFβ-受體連接的因子。
61.根據(jù)權(quán)利要求60的dsRNA，其中所述的因子是環(huán)肽C*GRGDSPC*。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于治療纖維化疾病的藥物，其中所述的藥物含有一種適于通過RNA干擾而抑制與胞外基質(zhì)形成有關(guān)的基因的表達(dá)的雙鏈核糖核酸(dsRNA)。
文檔編號(hào)A61P13/00GK1604783SQ02825163
公開日2005年4月6日 申請(qǐng)日期2002年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月26日
發(fā)明者R·克羅伊策爾, S·林默, D·舒潘, M·約翰, M·鮑爾 申請(qǐng)人:里伯藥品公司