專利名稱：基于tcf1基因多態(tài)性治療糖尿病和相關病癥的方法
背景技術：
發(fā)明領域本發(fā)明涉及治療以血糖控制受損為特征的紊亂，特別是糖尿病(Diabetes Mellitus)和相關病癥。尤其是，本發(fā)明涉及使用基因組分析確定受試者對血糖控制劑如二肽基肽酶IV(DPP4)抑制劑和其它血糖控制方法和策略——包括開始治療的時間選擇和最佳藥劑、治療方案和劑量的選擇——的反應性。
相關技術的描述糖尿病是人類一大組紊亂的一種形式，以血糖控制受損或血液中葡萄糖水平控制受損為特征。糖尿病本身是以葡萄糖和其它產(chǎn)能燃料的代謝受損，以及晚期發(fā)展出嚴重的血管和神經(jīng)并發(fā)癥為特征的慢性激素紊亂。糖尿病占美國健康護理費用的近15％，并且是工作年齡人們失明以及終末期腎臟病(ESRD)和非創(chuàng)傷性截肢的主導原因。糖尿病使心臟、腦和外周血管病變的風險增加2-7倍且是新生兒發(fā)病和死亡的主要原因。
糖尿病是一組復雜和多變的紊亂，但是所有形式都與共同的激素缺乏，即胰島素缺乏相關。在抗胰島素性共存時觀察，這種缺乏可以是全部、部分或相對的。相對或絕對胰島素缺乏在糖尿病相聯(lián)系的代謝紊亂中起主要作用，而所導致的高血糖又在該疾病的很多并發(fā)癥中起關鍵作用。
分類表1總結(jié)了糖尿病的最新修訂分類。臨床糖尿病可以分為四個一般亞型，包括(1)1型(由β細胞破壞引起并以絕對胰島素缺乏為特征)，(2)2型(以抗胰島素性和相對胰島素缺乏為特征)，(3)其它特殊類型的糖尿病(與各種可識別的臨床病癥或綜合征相關)，和(4)妊娠糖尿病。除了這些臨床種類，兩種病癥-葡萄糖耐量受損和空腹葡萄糖受損-是指正常葡萄糖內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和明顯糖尿病之間的中間代謝狀態(tài)。這些病癥顯著增加糖尿病的后期風險并且在一些情況下可以是其自然病史的一部分。應該注意，任何形式的糖尿病患者在某個時候可能都需要胰島素治療。由于這個原因，以前使用的術語胰島素依賴型糖尿病(對于1型糖尿病)和非胰島素依賴型糖尿病(對于2型)已經(jīng)取消。
表1.糖尿病的分類臨床糖尿病I.1型糖尿病，以前稱為胰島素依賴型糖尿病(IDDM)或“幼年型糖尿病”A.免疫介導的B.特發(fā)的II.2型糖尿病，以前稱為非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)或“成年型糖尿病”III.其它特殊類型A.β細胞功能的遺傳缺陷(如青春晚期糖尿病[MODY]1-3型和線粒體DNA點突變)B.胰島素作用的遺傳缺陷C.外分泌胰腺病變(如胰腺炎，創(chuàng)傷，胰腺切除術，瘤形成，囊性纖維化，血色素沉著癥，纖維結(jié)石性胰病)D.內(nèi)分泌病(如肢端肥大癥，柯興氏綜合征，甲狀腺機能亢進，嗜鉻細胞瘤，胰胰高血糖素瘤，生長激素釋放抑制因子瘤，醛固酮瘤)E.藥物或化學藥劑誘導的(如糖皮質(zhì)類固醇，噻嗪類，二氮嗪，戊烷脒，滅鼠優(yōu)，甲狀腺激素，苯妥英[大侖丁]，β-激動劑，口服避孕藥)
F.感染(如先天性風疹，巨細胞病毒)G.罕見形式的免疫介導的糖尿病(如“僵人”綜合征，抗胰島素受體抗體)H.其它遺傳綜合征(如唐氏綜合征，克蘭費爾特綜合征，特納綜合征，亨廷頓疾病，肌強直性營養(yǎng)不良，脂肪營養(yǎng)不良，共濟失調(diào)-毛細血管擴張癥)IV.妊娠糖尿病風險類型I.空腹葡萄糖受損II.葡萄糖耐量受損1型 糖尿病具有這種紊亂的患者胰島素分泌能力很低或無并且依賴于外來胰島素預防代謝的代償失調(diào)(如酮癥酸中毒)和死亡。通常但不是總是，以前健康的無肥胖兒童或年輕成人突然出現(xiàn)糖尿病(即數(shù)日和數(shù)周內(nèi))；在較大年齡群中，它可能逐漸起病。在初次估計時，典型患者常常出現(xiàn)疾病，具有明顯癥狀(如多尿，煩渴，貪食和體重減輕)，并且可能證明酮癥酸中毒。據(jù)信1型糖尿病具有很長的無癥狀臨床前期，通常持續(xù)數(shù)年，在此期間胰腺β細胞逐漸由受到HLA和其它遺傳因子以及環(huán)境影響的自身免疫攻擊所破壞。最初，胰島素治療對于使代謝恢復正常是必要的。然而，所謂的蜜月期可能到來并持續(xù)數(shù)周或數(shù)月，在此期間需要較小劑量的胰島素，因為β細胞功能部分恢復和由急性病變引起的抗胰島素性逆轉(zhuǎn)。其后，胰島素分泌能力逐漸喪失(經(jīng)過幾年)。1型糖尿病與特殊免疫反應(HLA)基因的關系和針對胰島細胞及其成分的抗體的存在為1型糖尿病是自身免疫疾病的理論提供了強大支持。在美國這種綜合征占糖尿病的10％以下。
2型 糖尿病發(fā)現(xiàn)糖尿病患者群體中90％以上是2型，即，至今該疾病最普通的形式。這些患者保留了明顯水平的內(nèi)源胰島素分泌能力。然而，胰島素水平相對于抗胰島素性和周圍葡萄糖水平的值為低。2型患者不依賴于胰島素進行立即存活并很少發(fā)展為酮癥，除了在強大身體壓力的情況下。然而，這些患者可能需要胰島素治療來控制高血糖。典型地2型糖尿病在40歲以后出現(xiàn)，與HLA基因不相關的遺傳外顯率的比例高，并且伴有肥胖。2型糖尿病的臨床特征可能是輕微的(疲勞，虛弱，頭暈，視力模糊或其它非特殊主訴可能占優(yōu)勢)或在患者求醫(yī)前可以被忍受很多年。此外，如果高血糖的水平不足以產(chǎn)生癥狀，該疾病可能僅在發(fā)生并發(fā)癥后才變得明顯。
其它特殊類型的糖尿病這類包括特殊疾病、藥物或病況所致的各種糖尿病癥狀。遺傳研究已經(jīng)為以前包括在2型糖尿病形式里的MODY的發(fā)病機理提供了新的認識。MODY包括β細胞功能的幾種遺傳缺陷，其中已經(jīng)鑒定出在不同染色體上幾個基因座位的突變。最普通形式-MODY3型—與染色體12上編碼的被稱為肝細胞核因子1α(HNF1，也稱TCF1)的轉(zhuǎn)錄因子的突變有關，而MODY2型與葡萄糖激酶基因(染色體7上)突變有關。HNF-4α基因(染色體20上)突變引起1型MODY。這些病癥的每一種都以常染色體顯性方式遺傳。兩種新的罕見MODY形式與HNF-1β(染色體17上)和術語稱為PDX-1或1DX-1的胰島素基因轉(zhuǎn)錄因子(染色體13上)的突變有關。
各種糖尿病亞型之間的區(qū)別通常建立在臨床基礎上。然而，少數(shù)患者亞群難于分類，也就是說，他們表現(xiàn)出與1型和2型糖尿病共同的特征。這種患者通常無肥胖并且胰島素分泌能力降低，但不足以使他們產(chǎn)生酮癥傾向。很多最初對口服制劑產(chǎn)生反應，但是隨著時間推移，仍需要胰島素。一些看來是緩慢進展形式的1型糖尿病，然而其它的難于簡單分類。
妊娠糖尿病術語妊娠糖尿病描述了在妊娠期出現(xiàn)或首次檢測到葡萄糖耐量受損的女性。妊娠糖尿病通常在第2和第3個三個月，即，妊娠相關的胰島素拮抗激素峰的時間出現(xiàn)。分娩后，葡萄糖耐量通常(但不總是)恢復正常。診斷當存在多尿、煩渴和體重減輕的典型癥狀時，糖尿病的診斷通常很明確。僅需要的是靜脈血隨機血漿葡萄糖測定是200mg/dl或更高。如果糖尿病是猜測的，由隨機葡萄糖測定不能證實，那么所選擇的篩選測試是過夜空腹血漿葡萄糖水平。如果在至少兩個分開的時間下，空腹葡萄糖等于或高于126mg/dl，那么診斷確立。
相關病癥葡萄糖耐量受損和空腹葡萄糖受損對于葡萄糖水平高于正常(分別在用餐或空腹情況下)但低于診斷糖尿病時所接受的水平的個體，應用術語葡萄糖耐量受損(IGT)和空腹葡萄糖受損(IFG)。兩種情況都伴隨心血管疾病風險增加，但是不產(chǎn)生與糖尿病相關的典型癥狀或微血管和神經(jīng)病變并發(fā)癥。然而，在一個患者亞群(大約25％-30％)中，最終發(fā)展為2型糖尿病。
葡萄糖代謝受損葡萄糖代謝受損(IGM)定義為血液葡萄糖水平高于正常范圍但又不足夠高到滿足2型糖尿病的診斷標準。IGM的發(fā)病率不同國家之間不同，但是通常比明顯糖尿病頻繁2-3倍。直到最近，IGM個體被認為是糖尿病前期，但是幾個流行病學研究資料爭辯有IGM的受試者在糖尿病和心血管發(fā)病率和死亡率方面風險不同。資料提示有IGM的受試者，尤其是葡萄糖耐量受損(IGT)的那些人并不總是發(fā)展為糖尿病，但是無論他們是否是糖尿病，他們的心血管發(fā)病和死亡的風險都高。在IGM受試者中，大約58％具有葡萄糖耐量受損(IGT)，另29％具有空腹葡萄糖受損(IFG)，而13％具有兩種異常(IFG/IGT)。如上討論，IGT以餐后(食后)升高的高血糖為特征，而IFG由ADA基于空腹血糖值定義。
1997年ADA定義了(a)葡萄糖耐量正常(NGT)，(b)葡萄糖代謝受損(IGM)和(c)明顯2型糖尿病的分類如下(a)葡萄糖耐量正常(NGT)＝空腹血漿葡萄糖水平＜6.1mmol/L或低于110mg/dl和餐后2小時葡萄糖水平＜7.8mmol/L或＜140mg/dl。
(b)葡萄糖代謝受損(IGM)是空腹葡萄糖受損(IFG)＝空腹葡萄糖水平6.1-7mmol/L或140-220mg/dl，和/或葡萄糖耐量受損(IGT)＝餐后(75g OGTT)2小時葡萄糖水平7.8-11.1mmol/L或140-220mg/dl。
(c)2型糖尿?。娇崭蛊咸烟歉哂?mmo/L或126mg/dl或餐后(75gOGTT)2小時葡萄糖水平高于11.1mmol/L或200mg/dl。
這些標準使用WHO推薦的用于口服葡萄糖耐量測試的條件((75gOGTT)，即口服給予相當于含有溶于水的75g無水葡萄糖的葡萄糖負荷，2小時后取血液樣品分析餐后葡萄糖)定義。其它OGTT測試條件已經(jīng)證實與IGT和IFG相關的風險，這些條件包括1)使用50g葡萄糖代替75g，2)使用偶然(非空腹)葡萄糖樣品作為分析物，和3)葡萄糖負荷1小時后，而不是2小時后分析餐后葡萄糖。所有這些條件下，上面定義的血糖種類都已經(jīng)與下述風險的增加聯(lián)系起來，但是為了使測試結(jié)果變異最小，優(yōu)選標準化的OGTT。
已知IGM個體，特別是IFG子類的那些個體進展為糖尿病的比例明顯高于血糖正常的個體，并且已知心血管風險高，特別是當他們發(fā)展為糖尿病時。有趣的是，IGM個體，更特別是IFG子類的那些個體還具有癌癥、心血管疾病及死亡的高發(fā)生率，即使他們從不發(fā)生糖尿病。因此，看來IGM且更特別的IFG亞群的心血管風險高，特別是在患者變成明顯糖尿病之后。另一方面，IGT(也稱為餐后高血糖癥(PPHG))還與無糖尿病和糖尿病中的癌癥、心血管疾病及死亡的高風險有關。見Hanefeld M和Temelkova-Kurktschiev T，Diabet.Med 1997；14 Suppl.3S6-S11。
IGT相關的風險增加與所有其它已知的心血管風險因素相獨立，包括年齡、性別、高血壓、低LDL和高LDL膽固醇水平，見Lancet 1999；354617-621。此外，流行病學研究提示餐后高血糖癥(PPHG)或高胰島素血癥是發(fā)展為糖尿病的大血管并發(fā)癥的獨立風險因素。見Mooradian AD和Thurman JE，Drugs 1999；57(1)19-29。PPHG與HbA1c類似，與糖尿病并發(fā)癥，特別是視網(wǎng)膜病和腎病的存在相關。見Pettitt DJ等Lancet 1980；21050-2，Jarrett RJ Lancet 1976；21009-2和Teuscher A等DiabetesCare 1988；11246-51。
使IGM，更特別地，IGT，在不存在糖尿病特征性的異常FPG的情況下與微血管和大血管并發(fā)癥相聯(lián)的一個機制是餐后高血糖癥。已經(jīng)顯示獨立的餐后高血糖癥，甚至在無糖尿病時，可減少血清中存在的天然自由基捕獲物質(zhì)(TRAP)。而在實驗條件下，已經(jīng)證實TRAP水平降低與自由基形成增加和氧化壓力增加有關。而在與動脈粥樣硬化、心血管發(fā)病率和死亡率和癌癥有關的病理微血管和大血管改變中牽涉到這些自由基。見Ceriello，A，Diabetic Medicine 15188-193，1998。餐后高血糖過程中天然抗氧化劑(象TRAP)的降低可解釋不發(fā)展為糖尿病的IGM，特別是IGT個體的心血管風險增加。
IGT是無糖尿病以及糖尿病中的獨立風險因素的事實證明，它是與糖尿病無關的預防和治療心血管發(fā)病和死亡以及癌癥的新指征。因此，IGM與下列潛在疾病或病癥有關1)進展為明顯2型糖尿病(國際疾病分類第9版的代碼250.2＝ICD-9代碼250.2)[Diabetes Research and ClinicalPractice 1998；40S1-S2]；2)增加的糖尿病的微血管并發(fā)癥，特別是糖尿病性視網(wǎng)膜病變和其它眼并發(fā)癥(ICD-9代碼250.5)，腎病(ICD-9代碼250.4)，神經(jīng)病變(ICD-9代碼250.6)[Diabetes Care 2000，，231113-1118]，和外周血管病或壞疽(ICD-9代碼250.7)；3)增加的心血管發(fā)病率(ICD-9代碼410-414)，特別是心肌梗塞(ICD-9代碼410)，冠心病或動脈粥樣硬化(ICD-9代碼414)和其它急性和亞急性形式的冠狀動脈缺血(ICD-9代碼411)；4)過度腦血管疾病象中風(ICD-9代碼430-438)[Circulation 1998，982513-2519])；5)增加的心血管死亡率(ICD-9代碼390-459)[Lancet 1999；354617-621]，和猝死(ICD-9代碼798.1)；6)更高的惡性腫瘤發(fā)生率和死亡率(ICD-9代碼140-208)[Am J Epidemiol.1990，，131254-262，Diabetologia 1999；421050-1054]。與IGIVI有關的其它代謝失調(diào)包括異常脂血癥(ICD-9代碼272)，高尿酸血癥(ICD-9代碼790.6)以及高血壓(ICD-9代碼401-404)和心絞痛(ICD-9代碼413.9)[Ann Int Med1998，128524-533]。很清楚，與IGM，尤其是IGT相關的廣大范圍的疾病和病況代表著一個具有巨大醫(yī)學需要的領域。
很多此類疾病和病癥與IGM和糖尿病都相關，但是僅在最近才可以明確具有IGM，特別是IGT的無糖尿病群體應該是預防和治療的適宜對象。因此，在IGM和特別是IGT和/或IFG受試者中，恢復早期胰島素分泌和/或降低進餐高血糖應該有助于預防或延遲個體進展為明顯糖尿病及通過預防個體發(fā)展為明顯糖尿病來預防或降低糖尿病相關的微血管并發(fā)癥。此外，在IGM，特別是IGT和/或IFG的個體中，恢復早期胰島素分泌和/或降低餐后高血糖應該也預防或降低過多心血管發(fā)病率和死亡率，以及在個體中預防癌癥或降低癌癥死亡率。
胰島素分泌和作用胰島素首先在胰腺β細胞中合成為大單鏈多肽—胰島素原，隨后切割胰島素原導致連接鏈(C肽)切除并出現(xiàn)較小的雙鏈胰島素分子(51個氨基酸殘基)。葡萄糖濃度是胰島素分泌的關鍵調(diào)節(jié)劑。對于葡萄糖激活的分泌，其應該首先被蛋白(GLUT 2)轉(zhuǎn)運到β細胞中，被葡萄糖激酶磷酸化并代謝。直接的觸發(fā)過程現(xiàn)知之甚少，但可能包括信號轉(zhuǎn)導途徑的活化，三磷酸腺苷(ATP)敏感性鉀通道的關閉和鈣進入β細胞。正常情況下，當血液葡萄糖升高，甚至僅稍高于75至100mg/dL的空腹水平時，β細胞即分泌胰島素，該胰島首先來自預先形成的儲存胰島素，隨后來自新胰島素合成。葡萄糖進入的途徑以及其濃度決定反應的大小。由于腸肽(如，胰高血糖素樣肽I、腸抑胃肽)的同時釋放，口服給予葡萄糖比靜脈內(nèi)給予產(chǎn)生更高的胰島素水平。其它胰島素促分泌因素包括氨基酸和迷走神經(jīng)刺激。一旦分泌入門脈血液，胰島素移走近50％的胰島素并降解之。這種吸收的結(jié)果是門靜脈胰島素總是比外周循環(huán)中的胰島素高至少兩至四倍。相反，當血液葡萄糖水平下降，甚至僅稍低(如至70mg/dL)，胰島素分泌迅速減少。
胰島素通過首先穿過血管區(qū)室并到達其目標，結(jié)合其特異性受體，而作用于效應組織。胰島素受體是由二硫鍵橋形成的兩條α-和β-鏈的異源二聚體。α-亞基停留于細胞外表面并且是胰島素結(jié)合部位。β-亞基跨膜并可在細胞質(zhì)表面的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基上被磷酸化。β-亞基的內(nèi)在酪氨酸激酶活性對胰島素受體功能是必需的?？焖俚氖荏w自磷酸化和細胞底物的酪氨酸磷酸化(如胰島素受體底物1和2)是胰島素作用的重要早期步驟。其后，觸發(fā)一系列磷酸化和去磷酸化反應，最終在胰島素敏感性組織(肝臟、肌肉和脂肪組織)中產(chǎn)生胰島素效應。胰島素活化各種受體后信號轉(zhuǎn)導途徑，包括P13(磷脂酰肌醇3’)激酶——看來對葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT4)移位到細胞表面并由此對葡萄糖吸收很關鍵的酶。
術語稱為反調(diào)節(jié)激素的很多其它激素(胰高血糖素、生長激素、兒茶酚胺和皮質(zhì)醇)可以對抗胰島素的代謝作用。這些當中，胰高血糖素和較低程度地生長激素在糖尿病綜合征的發(fā)展中起重要作用。在對低血糖、氨基酸、自主神經(jīng)系統(tǒng)活化作出反應時胰高血糖素由胰腺α細胞分泌。其主要作用在肝臟上，在那里它通過環(huán)單磷酸腺苷-依賴機制刺激糖原分解、糖異生和生酮作用。正常情況下它由高血糖抑制，但是在1型和2型糖尿病中盡管存在高血糖，它仍絕對或相對增加。
糖尿病以攝取碳水化合物后明顯的餐后高血糖為特征。在2型糖尿病中，胰島素分泌延遲和肝臟抗胰島素性的聯(lián)合作用損害了對肝臟葡萄糖產(chǎn)生的抑制和肝臟儲存葡萄糖作為糖原的能力。接著引起高血糖，即使胰島素水平最終可能升高至超過在無糖尿病個體中見到的水平(相對于占優(yōu)勢的葡萄糖水平，胰島素分泌仍缺乏)，這是因為抗胰島素性降低了肌肉移走肝臟釋放出的過量葡萄糖并在肌細胞中將其儲存為糖原的能力。
糖尿病的藥理學治療傳統(tǒng)包括用胰島素干預或口服降糖藥物。1型糖尿病中，主要焦點是代替胰島素分泌。2型糖尿病中，建立得最好的治療策略旨在增加胰島素的分泌或生理作用。這可通過用促胰島素分泌劑如磺酰脲類或苯甲酸衍生物直接刺激胰島素分泌，或通過用藥劑如PPARγ激動劑噻唑烷二酮類藥物為代表的那些藥劑降低外周抗胰島素性來完成。在一些2型糖尿病中，在穩(wěn)定化過程的早期需要胰島素本身，或與一種或多種其它類藥物聯(lián)合。對于糖尿病的一般綜述見Cecil Textbook of Medicine第21版；Goldman，L.和Bennett J.C.編.Saunders Co.Phili(2000)，尤其是1263-1285頁。
治療糖尿病的幾種新方法利用胰高血糖素樣肽1(GLP-1)的作用。GLP-1是對用餐產(chǎn)生反應從腸道釋放到血流的肽激素。GLP-1具有幾種降低葡萄糖水平的作用，包括直接作用于胰腺β細胞來增加胰島素釋放和促進胰島素的合成。GLP-1來自腸道L細胞中胰高血糖素前體的組織特異性翻譯后加工，見，rskov C.Diabetologia 35701-711(1992)。
在健康受試者中，GLP-1通過很多生理機制，包括胰島素和胰高血糖素濃度的調(diào)節(jié)，有力影響血糖水平，見rskov C.Diabetologia 35701-711(1992)；Holst JJ等，《Glugagon III.Handbook of ExperimentalPharmacology》；Lefevbre PJ，Ed.Berlin，Springer Verlag，311-326(1996)；和Deacon CF等，Diabetes，Vol.47764-769(1998)。GLP-1的胰腺作用是葡萄糖依賴性的，見Kregmann B等，Laneifii 1300-1304(1987)；Weir GC，Diabetes 38338-342(1989)。
這些相同的作用也發(fā)生在糖尿病患者中并使2型糖尿病受試者的血液葡萄糖水平傾向于正?；透纳?型患者的血糖控制，見Gutniak M等，N Engl J Med 2361316-1322(1992)；Nathan DM等，Diabetes Care15270-276(1992)；和Nauck MA等Diabetologia 36741-744(1993)。
內(nèi)源和外源給予的GLP-1被快速代謝，在體內(nèi)血漿半衰期(t1/2)僅1-2分鐘。氨肽酶二肽基肽酶IV(DPP4)是這種快速代謝的主要原因。DPP4對GLP-1的作用產(chǎn)生NH2-末端截短的代謝物GLP-1(9-36)酰胺，見KiefferTJ等Endocrinology 1363585-3596(1995)；MentlienR等，Eur J Biochem214829-835(1993)；Deacon CF等，J Clin Endocrinol Metab 80952-957(1995)；Deacon CF等，Diabetes 441126-1131(1995)。
二肽基肽酶IV(DPP4；EC 3.4.14.5)等同于ADA復合蛋白-2和T細胞活化抗原CD26。DPP4是從多肽的N末端切割X-脯氨酸二肽的絲氨酸外肽酶。它是通過其N末端而錨定在細胞膜中的膜內(nèi)糖蛋白。在腎臟近曲小管和小腸的刷狀緣膜中發(fā)現(xiàn)高水平的該酶，但幾種其它組織也表達該酶。該酶存在于胎兒結(jié)腸，但是出生時消失。它異位表達于一些人的結(jié)腸腺癌和人結(jié)腸癌細胞系。Darmoul等Ann.Hum.Genet.54191-197，(1990)從這些結(jié)腸癌細胞系中分離出腸道DPP4的cDNA探針，并通過體細胞雜種的Southern分析，將該基因分配到染色體2上。Mathew等Genomics 22211-212(1994)證實了這種分配，他們通過熒光原位雜交將DPP4基因更細定位到2q23。Misumi等，Biochim.Biophys.Acta 1131333-336，(1992)分離并測序編碼DPP4的cDNA。cDNA的核苷酸序列(3,465bp)含有編碼包含766個氨基酸的多肽的開放閱讀框架，比大鼠蛋白少1個殘基。預測的氨基酸序列顯示與大鼠酶84.9％的同一性。
Abbott等Immunogenetics 40331-338(1994)證明CD26跨越大約70kb并含有26個外顯子，大小范圍從45bp至1.4kb。編碼絲氨酸識別位點(G-W-S-Y-G)的核苷酸在2個外顯子之間分開。這將丙基寡肽酶家族與典型的絲氨酸蛋白酶家族的基因組結(jié)構清楚區(qū)分開來。CD26編碼大小大約4.2和2.8kb的2個信使。它們在胎盤和腎臟中都以高水平表達，在肺臟和肝臟中以中等水平表達。在骨骼肌、心臟、腦和胰腺中僅4.2kbmRNA以低水平表達。通過熒光原位雜交，前述Abbott等(1994)將該基因制圖到2q24.3。
任何藥學上有活性的DPP4(DPP IV)抑制劑可用于延長GLP-1在體內(nèi)的半衰期并增加其作用。幾個研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)DPP4的抑制提高大鼠內(nèi)的葡萄糖內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定并增加豬對靜脈內(nèi)葡萄糖負載的原位反應，見Deacon F.等，Diabetes 47764-769(1998)；Pauly RP等Regal Pept 643148(1996)；Balkan B等，Diabetologia 40(增刊1)A131(1997)和LiX等，Diabetes 46(增刊1)237A(1997)。
在豬研究中，DPP4的體內(nèi)抑制防止GLP-1的NH2末端降解，因此延長了此生物活性肽的t1/2。DPP4抑制劑的存在加強了對與GLP-1灌注一起給予的靜脈內(nèi)葡萄糖的原位反應，并且還可以通過增強內(nèi)源GLP-1的作用來改善在無外源GLP-1時口服葡萄糖后見到的葡萄糖耐量，見DeaconCF.Diabetes 47764-769(1998)。
在其它研究中，DPP4(或CD26)基因的定向失活產(chǎn)生了在空腹狀態(tài)下血液葡萄糖水平正常，而葡萄糖挑戰(zhàn)后血糖變化范圍降低的健康小鼠。見Marguet D等，Proc Natl Acad Sci USA 976874-6879(2000)。這個小組也發(fā)現(xiàn)DPP4基因失活的純合小鼠中葡萄糖刺激的循環(huán)胰島素水平增加且完整的促胰島形式的GLP-1也增加。
發(fā)現(xiàn)給予DPP4酶活性的藥理學抑制劑可改善野生型小鼠，但不改善DPP4基因失活小鼠的葡萄糖耐量。也發(fā)現(xiàn)這種DPP4抑制劑改善缺乏產(chǎn)生GLP-1受體的基因的小鼠的葡萄糖耐量。這提示DPP4抑制是可以通過控制GLP-1以及其它底物，包括相關腸降血糖素激素——抑胃肽(GIP)的活性來改善血液葡萄糖調(diào)節(jié)的有效藥理學方法，見Marguet D等，前述引文。其它研究也已經(jīng)顯示DPP4酶活性的藥理學抑制可提高2型糖尿病動物的葡萄糖清除率，見Deacon CF等，Diabetes 47764-769(1998)；Pederson RA等，Diabetes 471253-1258(1998)；Paalg RP等，Metab-ClinExp 48385-389(1999)；和Balkan B.Diabetologia 421324-1331(1999)。這些資料揭示DPP4抑制劑在生理葡萄糖內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中具有價值并且DPP4活性的抑制劑或其它調(diào)節(jié)劑具有潛力以有效治療涉及改變的葡萄糖內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性的疾病，包括糖尿病，以及通過酶DPP4的存在、濃度或活性能夠改變的病癥。
預期可以抑制或改變DPP4活性的藥劑將是治療人類糖尿病和其它疾病的獨特和有效藥劑。在多中心、雙盲、隨機、平行臨床研究中已經(jīng)測試了至少一種DPP4抑制劑，即2-吡咯烷甲腈，1-[[[2-[(5-氰基-2-吡啶基)氨基]乙基]氨基]乙?；鵠-，(2S)，比較了各種劑量下的該抑制劑與安慰劑對以前僅以膳食治療的2型糖尿病患者(NIDDM)的作用，見Ahren B等糖尿病50(增刊2)A104(2001)。
X綜合征X綜合征是認為與糖尿病相關的代謝綜合征。術語X綜合征是Reaven等給定的，描述特征是中心性肥胖和包括如下的代謝表現(xiàn)的病癥對胰島素刺激的葡萄糖攝取的抵抗、高胰島素血癥、不耐受葡萄糖(不一定是明顯糖尿病)、極低密度脂蛋白甘油三酯(VLDL)水平增加、高密度脂蛋白膽固醇(HDL)濃度水平降低和高血壓。這些特征性特性的每一種都被認為是發(fā)生動脈粥樣硬化和其它“老年”病的危險因素。據(jù)信X綜合征是由抗胰島素性引起的，但是目前沒有可利用的療法。見Reaven，G.Diabetes.371595-1607，1988和Ferrannini，E.等，Diabetologia.34416-422，1991。
分子生物學和遺傳學發(fā)展在過去二十年中，分子生物學和遺傳學的顯著發(fā)展已經(jīng)革命性地促進了對基因在人類疾病中的含義的理解。已經(jīng)顯示基因是某些疾病狀態(tài)的直接原因。例如，對鐮刀細胞性貧血是人β珠蛋白基因的單一突變引起的已經(jīng)知之很久。在很多其它情況下，一種基因與環(huán)境因素和/或其它基因一起對引起疾病或增加疾病易感性起作用。這種情況的突出實例包括·ApoE中的DNA序列變異在阿爾茨海默氏病中的作用，·CKR5與HIV感染的易感性；·因子V與深靜脈血栓形成的風險；·MTHFR與心血管疾病和神經(jīng)管缺陷；·p53在HPV感染中的作用；·各種細胞色素P450在藥物代謝中的作用；·和HLA在自身免疫疾病中的作用。
令人驚奇的是，導致基因參與人類疾病的遺傳變異相對很小。構成人類基因組的DNA堿基中大約1％是多態(tài)性的，即，它們在個體間是可變的。所有生物體，包括人類的基因組，在它們的連續(xù)進化過程中經(jīng)歷自發(fā)突變。大多數(shù)這種突變產(chǎn)生多態(tài)性，因此該突變的序列和最初的序列共存于種群中。然而，大多數(shù)DNA堿基差異在功能上不重要，因為它們既不影響所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列，也不影響所編碼蛋白質(zhì)的表達水平。基因或它們的啟動子中存在的一些多態(tài)性確實具有表型效應，就是這一小部分基因組變異解釋了個體間所有差異的遺傳成分，如身體外形，疾病易感性，抗病性和藥物治療的反應性。人類遺傳變異性和人類表型之間的關系是現(xiàn)代人類遺傳學研究的中心主題。人類基因組包括大約三十億個DNA堿基。
單核苷酸多態(tài)性人類基因組中的序列變異主要由單核苷酸多態(tài)性(″SNP″)組成，其余序列變異是短串聯(lián)重復(包括微衛(wèi)星)、長串聯(lián)重復(小衛(wèi)星)和其它插入和缺失。SNP是群體中以可測頻率(即＞1％)出現(xiàn)兩個可替換堿基的位置。SNP被稱為是″等位的″，因為由于此多態(tài)性的存在，一個物種的一些成員可能具有未突變序列(即，原始“等位基因”)，而其它成員可能具有突變序列(即變體或突變等位基因)。在最簡單的情況下，可能僅存在一個突變序列，該多態(tài)性被稱為二對等位基因多態(tài)性?？商鎿Q突變的發(fā)生可產(chǎn)生三對等位基因多態(tài)性等。SNP廣泛存在于基因組中，改變基因功能的SNP可能直接有助于表型變異。由于它們的流行和普遍本質(zhì)，SNP有潛力成為定位參與人類疾病情況的基因的重要工具，見如Wang等，Science 2801077-1082(1998)，它公開了一個探索性研究，其中2,227個SNP被作圖定位于一個2.3兆堿基的DNA區(qū)域內(nèi)。
單核苷酸多態(tài)性和特定表型之間的關系不表示或需要SNP是該表型的原因。相反，這種關系可能僅表示SNP位于表型決定因子在基因組上的存在位置的附近，由此更可能被發(fā)現(xiàn)與這些決定因子關聯(lián)和由此與感興趣的表型關聯(lián)。因此，SNP可能與“真正”的功能變異存在連鎖不平衡(LD)。當基因組兩個不同位置上的等位基因的相關性比期望的相關性更高時存在LD，又稱作等位基因相關(allelic association)。因此，SNP可以用作標記，由于其接近引起特定表型的突變而具有價值。
與疾病相關的SNP可能也對它們所處基因的功能具有直接作用。序列變異可能引起氨基酸改變或可能改變外顯子-內(nèi)含子剪接，由此直接改變相關蛋白，或SNP可能存在于調(diào)節(jié)區(qū)域，從而改變表達循環(huán)或mRNA穩(wěn)定性，見Nowotny P，Current Opinions in Neuobiology，2001，11637-641。
載脂蛋白E(APOE)ε4等位基因在阿爾茨海默氏病(AD)中的作用最好地例證了普通基因組變異在疾病易感性中可能起的作用。ε4等位基因與AD的存在和該疾病在較小年齡起病高度相關。在研究的很多群體中見到強烈相關。見St George-Hyslop等，Biol Psychiatry 2000，47183-199。中風和心血管疾病中(見Wu等Am J Cardiol 2001，87；1361-1366)和多發(fā)性硬化中(見Oksenberg等J Neuroimmuol 2001，113171-184)也涉及多態(tài)性變異。
愈來愈清楚，很多常見紊亂的發(fā)生風險和用于治療這些病癥的藥物的代謝都實質(zhì)地受到根本上的基因組變異的影響，盡管任何一個變異的作用可能很小。
因此，SNP與臨床表型之間的相關性將提示，1)SNP在功能上負責表型，或2)基因組上SNP的位置附近有引起該表型的其它突變。第二個可能性以遺傳生物學為基礎。大段DNA遺傳時，彼此緊鄰的標記在很多代無關的個體中可能都不會發(fā)生重組，即，這些標記存在連鎖不平衡(LD)。
可獲得的證據(jù)強烈提示，通過改變或抑制DPP4活性或否則其作用而可以改善血糖控制受損紊亂患者的代謝或血糖控制的化合物或療法在治療以血糖控制受損為特征的紊亂如糖尿病和其它相關疾病中將有用。這些化合物或藥劑包括但不限于DPP4抑制劑、2-吡咯烷甲腈，1-[[[2-[(5-氰基-2-吡啶基)氨基]乙基]氨基]乙?；鵠-，(2S)和(1-[(3-羥基-金剛烷-1-基氨基)-乙?；鵠-吡咯烷-2(S)-甲腈)。
然而，在過去，沒有方法確定哪個個體將對DPP4修飾劑或其它血糖控制劑產(chǎn)生反應而哪個不產(chǎn)生。因此，需要一種方法來確定罹患血糖控制受損而將對血糖控制劑或療法(包括但不限于DPP4修飾劑或抑制劑或其它抗糖尿病藥)或旨在改善血糖控制的任何藥劑或治療產(chǎn)生反應的那些個體，和不產(chǎn)生反應的個體。而且，需要方法來確定罹患血糖控制受損而將對低劑量治療產(chǎn)生反應的那些個體和那些將需要更高劑量才可獲得最佳結(jié)果的個體，并由此給個體制定個性化療法以提供副作用和藥物相互作用危險最小的有效治療。而且，需要方法以優(yōu)化對血糖控制劑或療法進行的臨床試驗，以便將現(xiàn)在已知的個體間的顯著差異反應考慮進去。
發(fā)明概述如這里以下所述，本發(fā)明通過鑒定與血糖控制劑或療法的臨床反應相關的TCF1座位中的多態(tài)性，克服了用血糖控制劑或療法如DPP4修飾劑或抑制劑治療糖尿病的目前可利用方法中的缺陷，其中所述血糖控制劑或療法如DPP4修飾劑或抑制劑，包括但不限于2-吡咯烷甲腈，1-[[[2-[(5-氰基-2-吡啶基)氨基]乙基]氨基]乙酰基]-，(2S)和1-[(3-羥基-金剛烷-1-基氨基)-乙酰基]-吡咯烷-2(S)-甲腈。這種多態(tài)性的鑒定允許開發(fā)簡單測試來確定哪位患者會對DPP4修飾劑或抑制劑治療(包括用2-吡咯烷甲腈，1-[[[2-[(5-氰基-2-吡啶基)氨基]乙基]氨基]乙?；鵠-，(2S)或1-[(3-羥基-金剛烷-1-基氨基)-乙?；鵠-吡咯烷-2(S)-甲腈進行治療)或其它基于GLP-1的療法、以及通過傾向于使血糖控制正常化的其它作用機制而起作用的療法發(fā)生反應，和預測所需劑量水平。這將允許臨床醫(yī)師對是否用血糖控制劑或療法如DPP4修飾劑或抑制劑治療糖尿病患者和如果治療則使用多大量，作出認識更加全面的決定。
這些藥劑和療法包括但不限于GLP-1或其類似物，包括合成類似物或天然模擬物，包括Exendin-4，和活化GLP-1受體的藥劑，活化GIP、PACAP或胰高血糖素的受體的藥劑，影響胰腺β細胞的胰島素分泌或葡萄糖感知的藥物，包括磺酰脲類藥劑，氯茴苯酸藥劑，影響葡萄糖激酶活性的藥劑，影響磷酸二酯酶活性的藥劑，影響葡萄糖的產(chǎn)生或中間代謝的藥劑，包括胰高血糖素分泌或作用的抑制劑，糖皮質(zhì)激素受體活化調(diào)節(jié)劑，雙胍，乙酰CoA羧化酶抑制劑和其它脂肪酸氧化活化劑，影響胰島素作用的療法，包括活化或調(diào)節(jié)核激素受體的PPAR家族的化合物，蛋白磷酸酶抑制劑，糖原合成酶激酶抑制劑，NFkB途徑抑制劑，SHP2調(diào)節(jié)劑，胰島素模擬劑和雙胍，并包括影響能量平衡的療法，包括膳食脂肪消化或吸收的抑制劑(胰腺脂肪酶、脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白、微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白、膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白、二?；视王ヵ；D(zhuǎn)移酶、或胰腺蛋白酶抑制劑)，和此外，影響碳水化合物消化、葡萄糖吸收或腸道葡萄糖利用的療法，包括α-糖甙酶抑制劑，淀粉酶抑制劑和延遲胃排空的藥劑如糊精或雙胍。
因此，本發(fā)明提供了使用個體的TCF-1基因型評估血糖控制劑或療法(包括DPP4抑制劑)在以血糖控制受損為特征的疾病的處理中的用途的方法，所述疾病包括2型糖尿病，1型糖尿病，葡萄糖耐量受損，空腹葡萄糖受損，X綜合征，進餐脂血癥，高膽固醇血癥，葡萄糖代謝受損，妊娠糖尿病，和指向進餐過程中血清葡萄糖過度或異常增加的進餐血糖反應(PGR)異常(進餐或餐后高血糖)。
因此，本發(fā)明提供了確定罹患以血糖控制受損為特征的紊亂的個體對血糖控制劑或療法治療的反應性的方法，包括確定個體中存在的TCF1基因的兩個拷貝在多態(tài)性位點483A＞G處的核苷酸對的身份，如果兩對都是GC或如果一對是AT而一對是GC則將該個體分配到良好反應組，而如果兩對都是AT則將個體分配到低反應組。
該方法可以使用任何血糖控制劑或療法，包括但不限于二肽基肽酶4(DPP4)抑制劑如2-吡咯烷甲腈，1-[[[2-[(5-氰基-2-吡啶基)氨基]乙基]氨基]乙?；鵠-，(2S)或1-[(3-羥基-金剛烷-1-基氨基)-乙?；鵠-吡咯烷-2(S)-甲腈或式I或式II的任何化合物。
該方法可以用于治療以血糖控制受損為特征的任何紊亂，包括但不限于2型糖尿病，1型糖尿病，葡萄糖耐量受損，空腹葡萄糖受損，X綜合征，妊娠糖尿病或?qū)PP4抑制劑有反應的任何紊亂。
本發(fā)明的另一個實施方案提供了治療罹患以血糖控制受損為特征的紊亂的個體的方法，包括確定個體中存在的TCF1基因的兩個拷貝在多態(tài)性位點483A＞G處的核苷酸對的身份，其中，如果兩個核苷酸對都是CG或如果一對是AT而一對是CG，則用血糖控制劑或療法治療該個體，而如果核苷酸對都是AT，則用替代換療法治療該個體。
這些方法可以使用任何血糖控制劑或療法，包括但不限于二肽基肽酶4(DPP4)抑制劑，如2-吡咯烷甲腈，1-[[[2-[(5-氰基-2-吡啶基)氨基]乙基]氨基]乙?；鵠-，(2S)或1-[(3-羥基-金剛烷-1-基氨基)-乙?；鵠-吡咯烷-2(S)-甲腈或式I或式II的任何化合物。
這些方法可以用于治療以血糖控制受損為特征的任何紊亂，包括但不限于2型糖尿病，1型糖尿病，葡萄糖耐量受損，空腹葡萄糖受損，X綜合征，妊娠糖尿病或?qū)PP4抑制劑有反應的任何紊亂。
本發(fā)明另一實施方案提供了鑒定性狀和TCF1基因的至少一個基因型或單元型之間的相關性的方法，包括比較在表現(xiàn)出該性狀的群體中此基因型或單元型的頻率與在參考群體中此基因型或單元型的頻率，其中所述基因型或單元型包括位于多態(tài)性位點483A＞G的核苷酸對或核苷酸，其中當該性狀群體中基因型或單元型的頻率高于參考群體中的頻率時，表示該性狀與基因型或單元型有關。這個性狀可以是，但不限于對靶向TCF1或DPP4的藥物的臨床反應。
本發(fā)明另一實施方案提供了治療罹患以血糖控制受損為特征的紊亂的個體的方法，該方法包括確定個體中存在的TCF1基因的兩個拷貝在多態(tài)性位點483A＞G處的核苷酸對的身份，其中，如果兩個核苷酸對都是CG或如果一對是AT而一對是CG，則用低劑量血糖控制劑治療該個體，而如果核苷酸對都是AT，則用高劑量血糖控制劑治療該個體。
上面的方法可以使用任何血糖控制劑或療法，包括但不限于，二肽基肽酶4(DPP4)抑制劑，如2-吡咯烷甲腈，1-[[[2-[(5-氰基-2-吡啶基)氨基]乙基]氨基]乙?；鵠-，(2S)或1-[(3-羥基-金剛烷-1-基氨基)-乙?；鵠-吡咯烷-2(S)-甲腈或式I或式II的任何化合物。
上面的方法可以用于治療以血糖控制受損為特征的任何紊亂，包括但不限于2型糖尿病，1型糖尿病，葡萄糖耐量受損，空腹葡萄糖受損，X綜合征，妊娠糖尿病或?qū)PP4抑制劑有反應的任何紊亂。
在更進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了治療罹患以血糖控制受損為特征的紊亂的患者的方法，包括給患者和患者家庭提供遺傳咨詢，確定患者的TCF1基因在多態(tài)性位點483A＞G的基因型，然后基于基因型確定結(jié)果來確定對所述患者的適當治療。
本發(fā)明更進一步的實施方案提供了用于優(yōu)化血糖控制劑的臨床試驗設計的方法，包括確定被考慮包括在臨床試驗中的個體的TCF1基因的兩個拷貝在多態(tài)性位點483A＞G處的核苷酸對的身份，其中，如果兩個核苷酸對都是CG，或如果一對是AT而一對是CG，那么該個體包括在臨床試驗中，而如果核苷酸對都是AT，則不包括該個體。
本發(fā)明更進一步的實施方案提供了鑒定罹患以血糖控制受損為特征的紊亂的個體是否將相對于藥物B而受益于藥物A的方法，包括確定個體中存在的TCF1基因的兩個拷貝在多態(tài)性位點483A＞G處的核苷酸對的身份，其中，如果兩個核苷酸對都是CG，或如果一對是AT而一對是CG，則該個體將受益于血糖控制劑或療法，而如果核苷酸對都是AT，則該個體將受益于替代的血糖控制劑或療法。
本發(fā)明更進一步的實施方案提供了確定罹患以血糖控制受損為特征的紊亂的個體是否可以用血糖控制劑治療而具有減少的副作用的方法，包括確定個體中存在的TCF1基因的兩個拷貝在多態(tài)性位點483A＞G處的核苷酸對的身份，其中，如果兩個核苷酸對都是CG，或如果一對是AT而一對是CG，則可用較低劑量血糖控制劑治療該個體且副作用較少，而如果核苷酸對都是AT，則必須用較高劑量血糖控制劑治療該個體并因此副作用較大。
在更進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了確定罹患以血糖控制受損為特征的紊亂的個體對血糖控制劑或療法治療的反應性的方法，包括針對個體中存在的TCF1基因的兩個拷貝，確定在與TCF1 483A＞G多態(tài)性位點連鎖不平衡的TCF1基因區(qū)域中的多態(tài)性位點處的核苷酸對的身份，如果在與多態(tài)性位點483A＞G連鎖不平衡的TCF1基因區(qū)域中的多態(tài)性位點處核苷酸對顯示在TCF1多態(tài)性位點483A＞G處兩個核苷酸對都是GC或一對是AT而一對是GC，則將該個體分配到良好反應組，而如果所述核苷酸對顯示在TCF1 483A＞G位點處兩對都是AT，則將該個體分配到低反應組。
附圖簡述

圖1之柱形圖顯示了針對于TCF1的483A＞G多態(tài)性的每對等位基因，即AG，AA和GG，用安慰劑或如文中所述的DPP-IV抑制劑治療的受試者的平均(±SEM)進餐血糖反應。圖中指出了在安慰劑和抑制劑治療的相同基因型的受試者之間存在顯著性差異水平。
圖2之柱形圖顯示了針對于TCF1的483A＞G多態(tài)性的每對等位基因，即AG，AA和GG，用安慰劑或如文中所述的DPP-IV抑制劑治療的受試者的平均(±SEM)糖基化血紅蛋白(HbA1c)反應。圖中指出了在安慰劑和抑制劑治療的相同基因型的受試者之間存在顯著性差異水平。
圖3顯示了TCF1基因中483A＞G多態(tài)性所在部分的序列(SEQ IDNO1)。這個序列來自GenBank登記號U72616。此多態(tài)性核苷酸位于SEQ ID NO1的核苷酸第183位，且可以是A或G。圖3的這個序列中也指出了用于PCR擴增的正向和反向引物的序列。SEQ ID NO2是Invader探針，SEQ ID NOS3和4分別是探針1和探針2。在圖3中，*標記的核苷酸是具有多態(tài)性的核苷酸，粗體的核苷酸代表用于PCR擴增的正向和反向引物，下劃線的核苷酸代表延伸引物。
優(yōu)選實施方案的描述DPP4抑制劑研究檢測入選糖尿病患者中DPP4特異抑制劑研究的76個個體的基因型，檢測91個座位的多態(tài)性，以鑒定所研究的DPP4抑制劑的個體反應的遺傳決定因子(如SNP)或遺傳相關性，所述抑制劑即2-吡咯烷甲腈，1-[[[2-[(5-氰基-2-吡啶基)氨基]乙基]氨基]乙?；鵠-，(2S)。所檢測的遺傳座位包括被認為與該化合物的抗糖尿病作用途徑相關的那些基因，以及被認為與糖尿病的遺傳病因?qū)W相關的那些基因。發(fā)現(xiàn)在TCF1座位的483A＞G多態(tài)性和治療反應之間存在高度顯著相關(p＝0.00051)，其中所述治療反應為四小時標準化早餐過程中測定到的對綜合葡萄糖接觸的治療反應。這個反應稱作進餐血糖反應(PGR)，見圖1。
TCF1基因產(chǎn)物是肝臟TCF1轉(zhuǎn)錄因子1。這個轉(zhuǎn)錄因子也被稱作LF-B1、肝核因子1α(HNF-1α)和白蛋白proximal因子，并且已知其調(diào)節(jié)負責胰島素反應的基因的活化。TCF1基因突變以前已與MODY 3型易感性相關，見Urhammer SA，Diabetologia 1997，40(4)473-5。
TCF1基因位于染色體位置12q24.2。本發(fā)明多態(tài)性核苷酸置換的標準命名是483A＞G，因此所表達多肽產(chǎn)物中的氨基酸置換是Asn 487 Ser。1997年報道了這個多態(tài)性，見Urhammer SA，Diabetologia 1997，40(4)473-5(PMID9112026)。該多態(tài)性位于圖3所示的部分序列中，來自GenBank登記號U72616。
在DPP4治療的個體中，GG基因型的個體和AG或AA基因型的個體之間的進餐血糖反應(PGR)有顯著性差異，GG純合患者在治療后葡萄糖內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性改善方面，對2-吡咯烷甲腈，1-[[[2-[(5-氰基-2-吡啶基)氨基]乙基]氨基]乙?；鵠-，(2S)的反應最好。
現(xiàn)在認識到進餐血糖控制是用于降低糖尿病并發(fā)癥的綜合策略的一個元素，糖尿病并發(fā)癥的驅(qū)動因素被認為是由進餐過程與升高的空腹血漿葡萄糖濃度相組合引起的葡萄糖接觸增加。用于改善給定藥劑對整體血糖控制的影響的任何策略都必須考慮到需要改善這種綜合接觸。
這里使用的術語“進餐”是指一餐過程中。
這里使用的術語“餐后”是指攝取一餐后的吸收期(大約0-8小時，取決于膳食的性質(zhì)(sixe)和組成)。
這里使用的術語“吸收后”是指完成營養(yǎng)吸收后或大約餐后4-8小時。
這里使用的術語“空腹”是指長時間，即12-16小時不進食之后。
這里使用的術語“進餐血糖反應”(PGR)是指進餐過程中或餐后期血清葡萄糖的改變。
循環(huán)紅細胞中的糖基化血紅蛋白(HbA1c)水平已被確立為血糖控制的一個綜合標記，其反映了長期接觸的葡萄糖濃度。在本發(fā)明中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)除了進餐血糖反應和GG TCF1基因型之間的關系外，TCF1 AG和TCF1GG兩個基因型都和血糖控制的全面改善有關，證據(jù)是AG和GG TCF1基因型與2-吡咯烷甲腈，1-[[[2-[(5-氰基-2-吡啶基)氨基]乙基]氨基]乙?；鵠-，(2S)(見圖2)治療四周后糖基化血紅蛋白(HbA1c)水平改變的改善相關。
這里使用的術語“以血糖控制受損為特征的紊亂”(IGC)是指代謝紊亂，其中主要疾病表現(xiàn)之一是空腹狀態(tài)或?qū)τ貌突蚩诜咸烟秦摵砂l(fā)生反應時，血液葡萄糖水平的過度或異常升高，其應包括2型糖尿病，1型糖尿病，葡萄糖代謝受損，即葡萄糖耐量受損(餐后高血糖)和/或空腹葡萄糖受損，X綜合征，妊娠糖尿病和指向進餐過程中血清葡萄糖過度或異常增加的異常進餐血糖反應(PGR)(進餐或餐后高血糖)。
這里使用的術語“血糖控制劑或療法”是指傾向于使2型糖尿病或1型糖尿病，葡萄糖耐量受損，空腹葡萄糖受損，X綜合征，餐后高血糖或妊娠糖尿病患者的空腹、進餐或餐后血清葡萄糖水平正?；蛱腔t蛋白(HbA1c)隨時間的反應正?；娜魏位衔铮幬锘蛑委熜问?。
這里使用的術語“DPP4抑制劑”是指能夠抑制酶DPP4(DPP-IV；二肽基肽酶IV；EC 3.4.14.5)的催化作用的化合物，該酶是等同于ADA復合蛋白-2和T細胞活化抗原CD26的絲氨酸外肽酶。
許多具有DPP4酶活性抑制劑作用的化合物是已知的，如2-吡咯烷甲腈，1-[[[2-[(5-氰基-2-吡啶基)氨基]乙基]氨基]乙?；鵠-，(2S)和(1-[(3-羥基-金剛烷-1-基氨基)-乙酰基]-吡咯烷-2(S)-甲腈)，并且包括但不限于美國專利6,011,155、6,124,305、6,166,063、5,602,102、6,110,949、6,274,608 B1、5,462,928、6,172,081、6,107,317、6,110,949、6,172,081、5,939,560、5,543,396和6,107,317以及國際公布WO 01/34594 A1、WO 01/47514A1、WO 00/34241、WO 01/55085 A1、WO 01/52825 A2、WO 01/04156A1、WO 00/10549、WO 01/55105 A1、WO 99/67278、WO 95/15309、WO 98/19998、WO 01/34594、WO 01/62266、WO 97/40832、WO01/72290、WO 01/68603、WO 00/34241、WO 99/61431、WO 99/67279、WO 93/08259、WO 95/11689、WO 91/16339、WO 93/08259、WO95/11689、WO 95/29691、WO 95/34538、WO 99/46272、WO95/29691、WO 00/53171和WO 99/38501和EP1052994、EP1019494、EP0528858、EP0610317、EP1050540、EP1062222和德國專利158109和296075中公開的化合物，這些專利和專利公布的所有內(nèi)容由此為所有目的引入本文作為參考。在上述專利和出版物中公開的任一DPP4抑制劑均可用于本發(fā)明方法中。特別優(yōu)選的DPP4抑制劑是化合物2-吡咯烷甲腈，1-[[[2-[(5-氰基-2-吡啶基)氨基]乙基]氨基]乙?；鵠-，(2S)和(1-[(3-羥基-金剛烷-1-基氨基)-乙?；鵠-吡咯烷-2(S)-甲腈)。
因此，本發(fā)明部分基于發(fā)現(xiàn)了在以血糖控制受損為特征的疾病的患者中，TCF1基因的遺傳變異或單核苷酸多態(tài)性(″SNP″)與血糖控制劑或療法(包括但不限于給予DPP4抑制劑)的臨床反應的新關系。
正如以下將要詳細描述的，這些變異與用酶DPP4修飾劑或抑制劑治療糖尿病和其它疾病時臨床反應的顯著差異有關，所述其它疾病為應答如下治療的疾病使用酶DPP4活性的抑制劑或修飾劑的療法，包括用2-吡咯烷甲腈，1-[[[2-[(5-氰基-2-吡啶基)氨基]乙基]氨基]乙酰基]-，(2S)的療法和其它基于GLP-1的療法，以及通過傾向于穩(wěn)定血糖控制的其它類似作用機制起作用的療法。在分離自76名個體的基因組DNA中發(fā)現(xiàn)了這些變異，這76名個體是參與DPP4抑制劑——2-吡咯烷甲腈，1-[[[2-[(5-氰基-2-吡啶基)氨基]乙基]氨基]乙?；鵠-，(2S)的2型糖尿病(NIDDM)治療效果研究的個體。
式I的化合物可以用于本發(fā)明的其它DPP4抑制劑包括但不限于下列N-(N′-取代的甘氨酰基)-2-氰基吡咯烷化合物，這些化合物是如下所述的式I化合物；式I 其中R是a)R1R1aN(CH2)m-，其中R1是任選地被(C1-4)烷基、(C1-4)烷氧基、鹵素、三氟甲基、氰基或硝基單取代或彼此獨立地二取代的吡啶基或嘧啶基部分；或任選地被(C1-4)烷基、(C1-4)烷氧基或鹵素單取代或彼此獨立地二取代的苯基；R1a是氫或(C1-8)烷基；并且m是2或3；b)任選地在1位被(C1-3)羥烷基單取代的(C3-12)環(huán)烷基；c)R2(CH2)n-，其中R2是任選地被(C1-4)烷基、(C1-4)烷氧基、鹵素單取代或彼此獨立地二取代或彼此獨立地三取代的苯基，或任選地在苯環(huán)上被羥甲基單取代的苯硫基；或是(C1-8)烷基；任選地被(C1-8)烷基單取代或多取代的[3.1.1]雙環(huán)碳環(huán)部分；任選地被(C1-4)烷基、(C1-4)烷氧基或鹵素單取代或彼此獨立地二取代的吡啶基或萘基部分；環(huán)己烯；或金剛烷基；且n是1至3；或R2是任選地被(C1-4)烷基、(C1-4)烷氧基或鹵素單取代或彼此獨立地二取代的苯氧基；且n是2或3；d)(R3)2CH(CH2)2-，其中每個R3彼此獨立地是任選地被(C1-4)烷基、(C1-4)烷氧基或鹵素單取代或彼此獨立地二取代的苯基；e)R4(CH2)p-，其中R4是2-氧代吡咯烷基或(C2-4)烷氧基并且p是2至4；f)任選地在1位被(C1-3)羥烷基單取代的異丙基；g)R5，其中R5是2，3-二氧化茚基；任選地被芐基取代的吡咯烷基或哌啶基部分；任選地被(C1-8)烷基單取代或多取代的[2.2.1]-或[3.1.1]雙環(huán)碳環(huán)部分；金剛烷基；或任選地被羥基、羥甲基單取代或彼此獨立地多取代的(C1-8)烷基或任選地被(C1-4)烷基、(C1-4)烷氧基或鹵素單取代或彼此獨立地二取代的苯基；其游離形式或酸加成鹽形式。
式I的化合物可以以游離形式或酸加成鹽形式存在。鹽形式可以以已知方式從游離形式獲得，反之亦然。酸加成鹽可以是例如可藥用有機或無機酸的鹽。盡管優(yōu)選的酸加成鹽是鹽酸鹽，但也可以使用甲磺酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽和醋酸鹽。
式I的化合物可以以光學活性異構體或非對映異構體的形式存在，并且可以用常規(guī)技術例如色譜法分離和回收。
“烷基”和“烷氧基”是直鏈或支鏈的，支鏈基團的實例是異丙基和叔丁基。
R優(yōu)選是如上定義的a)、b)或e)。R1優(yōu)選是如上定義的任選被取代的吡啶基或嘧啶基部分。R1a優(yōu)選是氫。R1a優(yōu)選是如上定義的任選被取代的苯基。R3優(yōu)選是未取代的苯基。R4優(yōu)選是如上定義的烷氧基。R5優(yōu)選是如上定義的任選被取代的烷基。m優(yōu)選是2。n優(yōu)選是1或2，特別是2。p優(yōu)選是2或3，特別是3。
吡啶基優(yōu)選是吡啶-2-基；優(yōu)選是未取代或單取代的，優(yōu)選在5位取代。嘧啶基優(yōu)選是嘧啶-2-基。它優(yōu)選是未取代或單取代的，優(yōu)選在4位取代。優(yōu)選的吡啶基和嘧啶基的取代基是鹵素、氰基和硝基，特別是氯。
當被取代時，苯基優(yōu)選是單取代的；優(yōu)選被鹵素取代，優(yōu)選是氯，或被甲氧基取代。優(yōu)選在2-、4-和/或5-位取代，特別是在4-位。(C3-12)環(huán)烷基優(yōu)選是環(huán)戊基或環(huán)己基。當被取代時，它優(yōu)選被羥甲基取代。(C1-4)烷氧基優(yōu)選是1或2個碳原子的烷氧基，特別是甲氧基。(C2-4)烷氧基優(yōu)選是3個碳原子的烷氧基，尤其是異丙氧基。鹵素是氟、氯、溴或碘，優(yōu)選氟、氯或溴，特別是氯。(C1-8)烷基優(yōu)選是1至6個，優(yōu)選1至4個，或3至5個，特別是2或3個碳原子的烷基，或甲基。(C1-4)烷基優(yōu)選是甲基或乙基，特別是甲基。(C1-3)羥烷基優(yōu)選是羥甲基。
如上定義的任選被取代的[3.1.1]雙環(huán)碳環(huán)部分優(yōu)選是任選在6位被甲基二取代的二環(huán)[3.1.1]庚-2-基，或任選在2位被一個甲基和在6位被兩個甲基取代的三取代的二環(huán)[3.1.1]庚-3-基。如上定義的任選被取代的[3.1.1]雙環(huán)碳環(huán)部分優(yōu)選是二環(huán)[2.2.1]庚-2-基。
萘基優(yōu)選是1-萘基。環(huán)己烯優(yōu)選是環(huán)己-1-烯-1-基。金剛烷基優(yōu)選是1-或2-金剛烷基。
如上定義的任選被取代的吡咯烷基或哌啶基部分優(yōu)選是吡咯烷-3-基或哌啶-4-基。當它被取代時，優(yōu)選是N-取代的。
一組優(yōu)選的式I化合物是其中R是R′的化合物(化合物Ia)，其中R′是R1′NH(CH2)2-，其中R1′是任選地被鹵素、三氟甲基、氰基或硝基單取代或彼此獨立地二取代的吡啶基；或未取代的嘧啶基；任選地在1位被(C1-3)羥烷基單取代的(C3-7)環(huán)烷基；R4’(CH2)3-，其中R4’是(C2-4)烷氧基；或R5，其中R5如上所定義；其游離形式或酸加成鹽形式。
更優(yōu)選的式I化合物是其中R是R”的化合物(化合物Ib)，其中R”是R1”NH(CH2)2-，其中R1”是被鹵素、三氟甲基、氰基或硝基單取代或彼此獨立地二取代的吡啶基；在1位被(C1-3)羥烷基單取代的(C4-6)環(huán)烷基；R4’(CH2)3-，其中R4’如上所定義；或R5’，其中R5’是任選地被(C1-8)烷基單取代或多取代的[2.2.1]-或[3.1.1]雙環(huán)碳環(huán)部分；或金剛烷基；其游離形式或酸加成鹽形式。
甚至更優(yōu)選的式I的化合物是其中R是R的化合物(化合物Ic)，其中R是R1”NH(CH2)2-，其中R1”如上所定義；在1位被羥甲基單取代的(C4-6)環(huán)烷基；R4’(CH2)3-，其中R4’如上所定義；或R5”，其中R5”是金剛烷基；其游離形式或酸加成鹽形式。
另一組化合物是Ip，其中R是Rp，它是
a)R1pNH(CH2)2-，其中R1p是任選地被鹵素、三氟甲基氰基或硝基單取代或彼此獨立地二取代的吡啶基或嘧啶基部分；b)任選地在1位被(C1-3)羥烷基單取代的(C3-7)環(huán)烷基；c)R2p(CH2)2-，其中R2p是任選地被鹵素或(C1-3)烷氧基單取代或彼此獨立地二取代或彼此獨立地三取代的苯基；d)(R3p)2CH(CH2)2-，其中每個R3p彼此獨立地是任選地被鹵素或(C1-3)烷氧基單取代的苯基；e)R4(CH2)3-，其中R4如上所定義；或f)任選地在1位被(C1-3)羥烷基單取代的異丙基；其游離形式或可藥用酸加成鹽的形式。
另一組化合物是其中R是Rs的化合物，所述Rs是a)R1sR1as(CH2)ms-，其中R1s是任選地被氯、三氟甲基、氰基或硝基單取代或彼此獨立地二取代的吡啶基；任選地被氯或三氟甲基單取代的嘧啶基；或苯基；R1as是氫或甲基；ms是2或3；b)任選地在1位被羥甲基單取代的(C3-12)環(huán)烷基；c)R2s(CH2)ms-，其中R2s是任選地被鹵素、1或2個碳原子的烷氧基單取代或彼此獨立地二取代或彼此獨立地三取代的苯基或在苯環(huán)上被羥甲基單取代的苯硫基；(C1-6)烷基；6，6-二甲基二環(huán)[3.1.1]庚-2-基；吡啶基；萘基；環(huán)己烯；或金剛烷基；且ns是1至3；或R2s是苯氧基；且ns是2；d)(3，3-二苯基)丙基；e)R4s(CH2)ps，其中R4s是2-氧代吡咯烷-1-基或異丙氧基且ps是2或3；f)任選地在1位被羥甲基單取代的異丙基；g)R5s，其中R5s是2，3-二氧化茚基；任選地被芐基N-取代的吡咯烷基或哌啶基部分；二環(huán)[2.2.1]庚-2-基；2，6，6-三甲基二環(huán)-[3.1.1]庚-3-基；金剛烷基；或任選地被羥基、羥甲基或苯基單取代或彼此獨立地二取代的(C1-8)烷基；其游離形式或酸加成鹽形式。
式II的化合物此外，其它可用于本發(fā)明的DPP4抑制劑包括但不限于下列N-(取代的甘氨?；?-2-氰基吡咯烷化合物，這些化合物是如下所述的式II化合物；式II 其中R是取代的金剛烷基；并且n是0至3；其游離形式或酸加成鹽形式。
式II的化合物可以以游離形式或酸加成鹽的形式存在。優(yōu)選可藥用的(即無毒、生理學上可接受的)鹽，但其它的鹽也是有用的，例如用于分離或純化本發(fā)明的化合物。盡管優(yōu)選的酸加成鹽是鹽酸鹽，但是也可以使用甲磺酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽和醋酸鹽。
本發(fā)明的化合物可以以光學活性異構體或非對映異構體的形式存在，并且可以用常規(guī)技術例如色譜法分離和回收。
下面列出的是用于描述本發(fā)明的各種術語的定義。這些定義應用于整個本說明書中使用的術語，無論是單獨的還是作為大基團的一部分，除非在具體情況下另有限定。術語“烷基”是指具有1至10個碳原子的直鏈或支鏈烴基，優(yōu)選1至7個碳原子，最優(yōu)選1至5個碳原子。示例的烷基包括甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、異丁基、戊基、己基等等。術語“烷酰基”是指烷基-C(O)-。術語“取代的金剛烷基”是指被一個或多個，例如兩個選自烷基、-OR1或-NR2R3的取代基取代的金剛烷基，即，1-或2-金剛烷基；其中R1、R2和R3彼此獨立地是氫、烷基、(C1-C8-烷?；?、氨基甲?；?CO-NR4R5；其中R4和R5彼此獨立地是烷基、取代或未取代的芳基并且其中R4和R5之一還可以是氫，或者R4和R5一起代表C2-C7亞烷基。術語“芳基”優(yōu)選代表苯基。取代的苯基優(yōu)選是被一個或多個，如兩個選自如烷基、烷氧基、鹵素和三氟甲基的取代基取代的苯基。術語“烷氧基”是指烷基-O-。術語“鹵素”或“鹵代”是指氟、氯、溴和碘。術語“亞烷基”是指2至7個碳原子的直鏈橋，優(yōu)選3至6個碳原子，最優(yōu)選5個碳原子。
一組優(yōu)選的本發(fā)明化合物是其中金剛烷基上的取代基結(jié)合在橋頭或與橋頭相鄰的亞甲基上的式I的化合物。在其中甘氨?；?2-氰基吡咯烷部分與橋頭結(jié)合的式II化合物中，金剛烷基上的R′取代基優(yōu)選是3-羥基。在其中甘氨?；?2-氰基吡咯烷部分結(jié)合在與橋頭相鄰的亞甲基上的式II化合物中，金剛烷基上的R′取代基優(yōu)選是5-羥基。
特別優(yōu)選的DPP4抑制劑是化合物2-吡咯烷甲腈，1-[[[2-[(5-氰基-2-吡啶基)氨基]乙基]氨基]乙?；鵠-，(2S)和(1-[(3-羥基-金剛烷-1-基氨基)-乙?；鵠-吡咯烷-2(S)-甲腈)。
因此，在第一個方面，本發(fā)明提供了確定罹患2型糖尿病、葡萄糖耐量受損、空腹葡萄糖受損、X綜合征、進餐脂血癥、高膽固醇血癥、高血壓、妊娠糖尿病或1型糖尿病或任何DPP4抑制劑反應性疾病的個體對用DPP4抑制劑化合物或血糖控制劑或療法治療的反應性的方法。這些方法包括包括確定TCF1基因的基因型或單元型，并基于TCF1基因的一種或多種多態(tài)性的存在或缺乏確定反應性。本發(fā)明的這個方面也提供了確定糖尿病或相關代謝紊亂的個體對意欲改善代謝控制的其它藥劑或療法的治療反應性的方法。對這些多態(tài)性的檢測可用于確定或預測個體對特定藥物或其它治療的反應性。一個本領域的技術人員將容易認識到，除了這里公開的具體多態(tài)性外，與所述多態(tài)性連鎖不平衡的任何多態(tài)性也可以用作替代標記，以和其連鎖不平衡的SNP一樣用于指示對相同的藥物或治療的反應性。因此，與本說明書公開的SNP連鎖不平衡的任何SNP都可以使用并且意欲包括在本發(fā)明的方法中。
SNP的鑒定和表征很多不同的技術可以用于鑒定和表征SNP，包括單鏈構象多態(tài)性分析，采用變性高效液相色譜(DHPLC)的異源雙鏈分析，直接DNA測序和計算方法，見Shi MM，Clin Chem 2001，47164-172?；诠姅?shù)據(jù)庫中豐富的序列信息，通過獨立比對提交的給定基因序列(eDNA或基因組序列)，計算機工具可以用于in silico鑒定SNP。實驗獲得的SNP和通過in silico方法獲得的SNP的比較顯示SNPFinder(http//Ipgws.nci.nih.gov82/perl/snp/snp_cgi.pl)發(fā)現(xiàn)的候選SNP中55％通過實驗也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，見Cox等Hum Mutal 2001，17141-150。然而，這些in silico方法僅能找到27％的真正SNP。
最普通的SNP分型方法目前包括雜交、引物延伸和切割方法。這些方法的每一種都必須與適當檢測系統(tǒng)聯(lián)系起來。檢測技術包括熒光極化(見Chan X等Genome Res 1999，9492-499)，焦磷酸鹽釋放的發(fā)光計檢測(焦磷酸測序，Pyrosequencing)(見Ahmadiian A等Anal Biochem 2000，280103-10)，基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的切割方法，DHPLC和質(zhì)譜分析(見Shi MM，Clin Chem 2001，47164-172和美國專利6,300,076 B1)。檢測和描述SNP特征的其它方法是美國專利6,297,018 B1和6,300,063 B1中公開的那些。上述參考文獻公開的全部內(nèi)容并入這里作為參考。
在特別優(yōu)選的實施方案中，可以依靠所謂的INVADERTM技術(可得自Third Wave Technologies Inc.Madison，Wis.)完成多態(tài)性的檢測。在這個實驗中，當結(jié)合互補DNA模板時，特殊上游″invader″寡核苷酸和部分重疊的下游探針一起形成特殊結(jié)構。這個結(jié)構被Cleavase酶識別并在特異位點切割，這引起探針寡核苷酸的5’翼的釋放。這個片段接著用作反應混合物中所含的第二合成靶和第二熒光標記的信號探針的″invader″寡核苷酸。這引起Cleavase酶對第二信號探針的特異切割。當用能夠發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移的染料分子標記的這第二探針被切割時，產(chǎn)生熒光信號。對于由重疊DNA序列或翼形成的結(jié)構，Cleavase有嚴格要求，并因此可以用于特異性檢測位于下游DNA鏈上的切割位點緊上游的單堿基對錯配。見Ryan D等，Molecular Diagnosis Vol.4 No 2 1999135-144和LyamichevV等Nature Biotechnology Vol 17 1999292-296，也見美國專利5,846,717和6,001,567(其公開的全部內(nèi)容并入這里作為參考)。
在一些實施方案中，一種組合物含有用于同時探測兩個或更多個多態(tài)性位點的寡核苷酸身份的兩個或更多個不同標記的基因分型寡核苷酸。也可考慮含有兩套或更多套等位基因特異性引物對以允許同時靶向和擴增含多態(tài)性位點的兩個或更多個區(qū)域的引物組合物。
本發(fā)明的TCF1基因分型寡核苷酸也可以固定在固體表面或在固體表面合成，如芯片、珠或玻片(如見WO 98/20020和WO 98/20019)。這種固定的基因分型寡核苷酸可以用于各種多態(tài)性檢測試驗，包括但不限于探針雜交和聚合酶延伸試驗。本發(fā)明的固定的TCF1基因分型寡核苷酸可以包括為同時快速篩選DNA樣品在多個基因中的多態(tài)性而設計的有序寡核苷酸陣列。
本發(fā)明等位基因特異性寡核苷酸引物具有與特定SNP的僅一種核苷酸互補的3’末端核苷酸，或優(yōu)選地3’倒數(shù)第二個核苷酸，由此只有存在含該核苷酸的等位基因時其才可以用作聚合酶介導的延伸反應的引物。與編碼鏈或非編碼鏈雜交的等位基因特異性寡核苷酸引物包括在本發(fā)明中。使用本領域技術人員已知的技術可以開發(fā)檢測TCF1基因多態(tài)性的ASO引物。
本發(fā)明其它基因分型寡核苷酸與位于這里所鑒定的新多態(tài)性位點之一下游一個至幾個核苷酸處的靶區(qū)域雜交。這種寡核苷酸可用于聚合酶介導的引物延伸方法中以檢測這里所描述的新多態(tài)性之一，因此這種基因分型寡核苷酸這里稱作“引物延伸寡核苷酸”。在優(yōu)選實施方案中，引物延伸寡核苷酸的3’末端是與多態(tài)性位點緊臨的核苷酸互補的脫氧核苷酸。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了包括包裝在分開容器中的至少兩個基因分型寡核苷酸的試劑盒。該試劑盒也可以含有包裝在分開容器中的其它成分如雜交緩沖液(此時寡核苷酸待用作探針)?？晒┻x擇地，當寡核苷酸待用于擴增靶區(qū)域時，該試劑盒可以含有包裝在分開容器中的聚合酶和用于聚合酶介導的引物延伸如PCR的經(jīng)優(yōu)化反應緩沖液。
上述寡核苷酸組合物和試劑盒在個體TCF1基因的基因分型和/或單元型分型方法中有用。這里使用的術語“TCF1基因型”和“TCF1單元型”分別是指包含這里描述的一個或多個新多態(tài)性位點處存在的核苷酸對或核苷酸的基因型或單元型，其也可以任選地包括在TCF1基因的另外一個或多個多態(tài)性位點處存在的核苷酸對或核苷酸。另外的多態(tài)性位點可以是目前已知的多態(tài)性位點或以后發(fā)現(xiàn)的位點。
基因分型方法的一個實施方案包括從個體分離包含個體中存在的兩個TCF1基因拷貝或其片段的核酸混合物，并確定兩個拷貝在一個或多個多態(tài)性位點處的核苷酸對的身份，從而確定個體的TCF1基因型。如本領域技術人員容易理解的，個體中基因的兩個“拷貝”可以是相同的等位基因或可以是不同的等位基因。在特別優(yōu)選的實施方案中，該基因分型方法包括確定每個多態(tài)性位點的核苷酸對的身份。
典型地，核酸混合物分離自取自個體的生物學樣品，如血液樣品或組織樣品。合適的組織樣品包括全血、精液、唾液、淚液、尿液、糞便物質(zhì)、汗液、口腔粘膜涂片、皮膚和頭發(fā)。該核酸混合物可以由基因組DNA、mRNA或cDNA組成，并且在后兩種情況下，生物學樣品必須得自表達TCF1基因的器官。而且，本領域技術人員會理解mRNA或cDNA制品不能用于檢測位于內(nèi)含子或5’和3’非轉(zhuǎn)錄區(qū)域的多態(tài)性。如果分離TCF1基因片段，它必須含有待基因分型的多態(tài)性位點。
單元型分型方法的一個實施方案包括從個體分離僅包含個體中存在的兩個TCF1基因拷貝之一或其片段的核酸分子，在那個拷貝中確定一個或多個多態(tài)性位點的核苷酸身份，從而確定個體的TCF1單元型?？梢允褂媚軌蚍蛛xTCF1基因或其片段之兩個拷貝的任何方法分離該核酸，包括但不限于上述制備TCF1同源基因的方法之一，體內(nèi)定向克隆是優(yōu)選方法。如本領域技術人員容易領會的，任何單個克隆將僅提供個體中存在的兩個TCF1基因拷貝之一上的單元型信息。如果想要個體的另一拷貝上的單元型信息，則需要檢測另外的TCF1克隆。典型地，應該檢測至少五個克隆，以便有90％以上的可能性對個體中的兩個TCF1基因拷貝均實現(xiàn)單元型分型。在特別優(yōu)選的實施方案中，鑒定每個多態(tài)性位點的核苷酸。
在優(yōu)選實施方案中，通過鑒定個體中存在的每個TCF1基因拷貝在一個或多個多態(tài)性位點的核苷酸定相序列(phased sequence)來確定個體的TCF1單元型對。在特別優(yōu)選的實施方案中，單元型分型方法包括鑒定TCF1基因每個拷貝的每個多態(tài)性位點的核苷酸定相序列。當對兩個基因拷貝進行單元型分型時，優(yōu)選對位于分開容器中的每個基因拷貝實施鑒定步驟。然而，也可以預想到當用不同標簽標記兩個拷貝，或否則當兩個拷貝可分別區(qū)分或鑒定時，在有些情況下可以在相同容器中實施該方法。例如，如果分別用不同的第一和第二熒光染料標記該基因的第一和第二拷貝，而用以第三不同的熒光染料標記的等位基因特異性寡核苷酸檢測多態(tài)性位點，則可以通過檢測第一和第三染料的組合來鑒定第一基因拷貝中的多態(tài)性，而通過檢測第二和第三染料的組合來鑒定第二基因拷貝中的多態(tài)性。
在基因分型和單元型分型方法中，可以直接從一個或兩個拷貝的TCF1基因或其片段擴增含多態(tài)性位點的靶區(qū)域，并以常規(guī)方法確定擴增區(qū)域的序列，由此確定多態(tài)性位點的核苷酸(核苷酸對)的身份。本領域技術人員將容易領會到，對于多態(tài)性位點純合的個體，將僅在多態(tài)性位點處檢測到一個核苷酸，而對于該位點是雜合的個體，將檢測到兩個不同的核苷酸?？梢灾苯予b定多態(tài)性，稱作正向鑒定，或通過推斷鑒定稱作反向鑒定。例如，當已知SNP在參考群體中是鳥嘌呤和胞嘧啶時，對于那個位點純合的所有個體，可以正向確定該位點是鳥嘌呤或胞嘧啶，或如果該個體在那個位點是雜合的，則是鳥嘌呤和胞嘧啶?？晒┻x擇地，可以反向確定該位點不是鳥嘌呤(因此是胞嘧啶/胞嘧啶)或不是胞嘧啶(因此是鳥嘌呤/鳥嘌呤)。
此外，對與感興趣的多態(tài)性位點連鎖不平衡的這里未公開的多態(tài)性位點進行基因分型，可以間接確定在這里描述的任何一個新多態(tài)性位點中存在的等位基因的身份。如果一個位點的特定變異的存在增強了第二位點的另一個變異的預知性，兩個位點被稱為是連鎖不平衡(見，Stevens，JC 1999，Mol Diag 4309-317)。與目前公開的多態(tài)性位點連鎖不平衡的多態(tài)性位點可能位于該基因的區(qū)域或這里未檢測的其它基因組區(qū)域中?？梢酝ㄟ^但不限于任何上面提及的檢測多態(tài)性位點的等位基因身份的方法進行與這里描述的新多態(tài)性位點連鎖不平衡的多態(tài)性位點的基因分型。
可以使用任何寡核苷酸定向擴增方法擴增靶區(qū)域，包括但不限于聚合酶鏈式反應(PCR)(美國專利4,965,188)，連接酶鏈式反應(LCR)(Barany等，Proc Natl Acad Sci USA 88189-193，1991；WO 90/01069)，和寡核苷酸連接試驗(OLA)(Landegren等，Science 2411077-1080，1988)。在這種方法中用作為引物或探針的寡核苷酸應該與含有或相鄰于多態(tài)性位點的核酸區(qū)域雜交。典型地該寡核苷酸長度在10和35個核苷酸之間，優(yōu)選長度在15和30個核苷酸之間。最優(yōu)選，該寡核苷酸是20至25個核苷酸長。該寡核苷酸的確切長度將依賴于本領域技術人員常規(guī)認為和實踐的很多因素。
其它已知的核酸擴增步驟可以用于擴增靶區(qū)域，包括基于轉(zhuǎn)錄的擴增系統(tǒng)(美國專利5,130,238；EP 329,822；美國專利5,169,766，WO 89/06700)和等溫方法(Walker等，Proc Natl AcadSci USA 89392-396，1992)。
也可以在擴增前或后，使用本領域已知的幾種基于雜交的方法之一檢測靶區(qū)域中的多態(tài)性。典型地，實施這種方法時利用等位基因特異性寡核苷酸。等位基因特異性寡核苷酸可以以不同標記的探針對使用，這一對中的一個成員顯示出與靶序列的一個變異完好匹配，另一個成員顯示與不同變異完好匹配。在一些實施方案中，使用一組等位基因特異性寡核苷酸或寡核苷酸對可以一次檢測一個以上多態(tài)性位點。優(yōu)選，當與檢測的每個多態(tài)性位點雜交時，該組的成員彼此之間具有5℃以內(nèi)的解鏈溫度，更優(yōu)選2℃以內(nèi)。
等位基因特異性寡核苷酸與靶多核苷酸的雜交可以以兩個實體都在溶液中實施，或可以當寡核苷酸或靶多核苷酸共價或非共價固定于固相載體時，實施這種雜交?？梢岳缤ㄟ^抗體-抗原相互作用，聚-L-Lys，鏈霉抗生物素或抗生物素蛋白-生物素，鹽橋，疏水相互作用，化學鍵，UV交聯(lián)烤焙等介導此固定。等位基因特異性寡核苷酸可以在固相載體上直接合成或在合成后結(jié)合于固相載體上。適合用于本發(fā)明檢測方法的固相載體包括由硅、玻璃、塑料、紙等制造的底物，它們可以形成例如孔(如96孔板)、載片、薄片、膜、纖維、芯片、盤和珠?？梢蕴幚?、包被或衍生化固相載體以利于等位基因特異性寡核苷酸或靶核酸固定。
個體的TCF1基因的基因型或單元型也可以通過含該基因的一個或兩個拷貝的核酸樣品與如WO 95/11995所述的核酸陣列和亞陣列雜交確定。該陣列將含有代表包括在該基因型或單元型中的每個多態(tài)性位點的一組等位基因特異性寡核苷酸。
也可以使用錯配檢測技術確定多態(tài)性的身份，包括但不限于使用riboprobe的RNA酶保護方法(Winter等，Proc Natl Acad Sci USA 827575，1985；Meyers等Science 2301242，1985)和識別核苷酸錯配的蛋白，如大腸桿菌mutS蛋白(Modrich P.Ann Rev Genet 25229-253，1991)?？晒┻x擇地，單鏈構象多態(tài)性(SSCP)分析(Orita等，Genomics 5874-879，1989；Humphries等，《Molecular Diagnosis of Genetic Diseases》，R.Elles，ed.，pp.321-340，1996)或變性梯度凝膠電泳(DGGE)(Wartell et at.，Nucl Acids Res182699-2706，1990；Sheffield等，Proc Natl Acad Sci USA 86232-236，1989)可鑒定等位基因變體。
聚合酶介導的引物延伸方法也可以用于鑒定多態(tài)性。專利和科學文獻中已經(jīng)公開了幾個這種方法，包括“遺傳二進制分析”方法(WO 92/15712)和連接酶/聚合酶介導的遺傳二進制分析(美國專利5,679,524)。WO91/02087，WO 90/09455，WO 95/17676，美國專利5,302,509和5,945,283中公開了相關方法?？梢匀缑绹鴮＠?,605,798所述用質(zhì)譜分析儀檢測含多態(tài)性的延伸引物。另外的引物延伸方法是等位基因特異性PCR(Ruafio等，Nucl Acids Res 178392，1989；Ruafio等，Nucl Acids Res 19，6877-6882，1991；WO 93/22456；Turki等，I Clin Invest 951635-1641，1995)。此外，使用Wallace等(WO 89/10414)所述的等位基因特異性引物組同時擴增核酸的多個區(qū)域可以研究多個多態(tài)性位點。
在優(yōu)選的實施方案中，檢測每個地理種群組的單元型頻率數(shù)據(jù)，確定它是否與哈迪-溫伯格平衡一致。哈迪-溫伯格平衡(D.L Hartl等，Principles of Population Genomics，Sinauer Associates(Sunderland，MA)，3rd Ed.，1997)假定發(fā)現(xiàn)單元型對H1/H2的頻率等于當H1≠H2，PH-W(H1/H2)＝2p(H1)p(H2)；當H1＝H2，PH-W(H1/H2)＝p(H1)p(H2)。觀察到的和預期的單元型頻率之間的統(tǒng)計學顯著差異可能是由于一個或多個因素引起，包括該組群體中的明顯近親交配，對基因的強大選擇壓力，取樣偏差，和/或基因分型方法中的誤差。如果在一個地理種群組中觀察到與哈迪溫伯格平衡大的偏差，那么可以增加那個組的個體數(shù)量看看該偏差是否由于取樣偏差引起。如果更大的樣本量不降低觀察到的和預期的單元型對頻率之間的差異，那么可能希望考慮使用直接單元型分型方法對個體進行單元型分型，如CLASPER SystemTM技術(美國專利5,866,404)，SMD或等位基因特異性長距離PCR(Michalotos-Beloin等，Nucl Acids Res244841-4843，1996)。
在預測TCF1單元型對的這個方法的一個實施方案中，單元型確定步驟包括實施下列分析。第一，每個可能的單元型對與參考群體的單元型對進行比較。通常，參考群體中僅一個單元型對與可能的單元型對匹配，故該個體被確定為該單元型對。偶爾，參考單元型對中僅一個單元型與個體可能的單元型對一致，在這種情況下，該個體的單元型對被確定為包含這個已知單元型和從該可能單元型對中減去此已知單元型得到的新單元型。在很少的情況下，參考群體中無單元型與可能的單元型對一致，或可替換地，多個參考單元型對與可能的單元型對一致。在這種情況下，優(yōu)選使用直接分子單元型分型方法對個體進行單元型分型，例如，CLASPERSystemTM技術(美國專利5,866,404)，SMD或等位基因特異性長距離PCR(Michalotos-Beloin等，Nucl Acids Res 244841-4843，1996)。
本發(fā)明也提供了確定群體中TCF1基因型或TCF1單元型頻率的方法。該方法包括確定群體中每個成員的TCF1基因的基因型或單元型對，其中所述基因型或單元型包括在TCF1基因的一個或多個多態(tài)性位點檢測到的核苷酸對或核苷酸，包括但不限于483A＞G；和計算群體中發(fā)現(xiàn)的任何特定基因型或單元型的頻率。該群體可以是參考群體，家族群體，相同性別群體，群體組，性狀群體(如，顯示出感興趣性狀，如醫(yī)學疾病或?qū)χ委熖幚淼姆磻膫€體組)。
在本發(fā)明的另一個方面，參考群體中發(fā)現(xiàn)的TCF1基因型和/或單元型的頻率數(shù)據(jù)被用于鑒定性狀和TCF1基因型或TCF1單元型之間關系的方法中。該性狀可以是任何可檢測表型，包括但不限于對疾病的易感性或?qū)χ委煹姆磻?。該方法包括獲得參考群體以及顯示出該性狀的群體中感興趣基因型或單元型的頻率數(shù)據(jù)。參考和性狀群體之一或二者的頻率數(shù)據(jù)可以使用上述方法之一對群體中每個個體的基因型或單元型進行分型而獲得。性狀群體的單元型可以直接確定或可供選擇地通過上述預測性基因型或單元型方法確定。
在另一個實施方案中，通過訪問書面或電子形式的以前確定的頻率數(shù)據(jù)獲得參考和/或性狀群體的頻率數(shù)據(jù)。例如，該頻率數(shù)據(jù)可以存在于計算機可進入的數(shù)據(jù)庫中。一旦獲得該頻率數(shù)據(jù)，就比較參考和性狀群體中感興趣的基因型或單元型的頻率。在優(yōu)選實施方案中，比較群體中觀察到的所有基因型和/或單元型的頻率。如果在性狀群體中TCF1基因的特定基因型或單元型的頻率與參考群體中的頻率相比高出統(tǒng)計學顯著量，那么可以預測該性狀與此TCF1基因型或單元型有關。
在優(yōu)選實施方案中，使用標準ANOVA檢驗及Bonferoni Correction法和/或模擬很多次基因型表型關系并計算顯著性值的boot-strapping方法實施統(tǒng)計學分析。當分析很多多態(tài)性時，可以實施針對因素的校正來糾正可能因偶然而存在的顯著性關系。對于用于本發(fā)明方法中的統(tǒng)計學方法，見Statistical Methods in Biology，第3版，Bailey NTJ，Cambridge Univ.Press(1997)；Introduction to Computational Biology，Waterman MS，CRCPress(2000)和Bioinformatics，Baxevanis AD及Ouellette BFF編(2001)John Wiley & Sons，Inc。
在該方法的優(yōu)選實施方案中，感興趣的性狀是患者對某種治療處理顯示出的臨床反應，例如，對靶向TCF1的藥物的反應或?qū)︶t(yī)學疾病治療處理的反應。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，與感興趣的TCF1基因型或單元型連鎖不平衡的可檢測基因型或單元型可以用作替代標記。與TCF1基因型連鎖不平衡的基因型可通過如下方式發(fā)現(xiàn)確定在也顯示潛在替代標記基因型的群體中TCF1基因的特定基因型或單元型的頻率是否比參考群體中的頻率高出統(tǒng)計學顯著量，然后可預測該標記基因型與此TCF1基因型或單元型有關并可代替此TCF1基因型用作替代標記。
這里使用的術語“醫(yī)學病癥”包括但不限于表現(xiàn)出一種或多種身體和/或心理癥狀的期望進行治療的任何病癥或疾病，并包括以前和新近鑒定的疾病和其它紊亂。
這里使用的術語“臨床反應”是指下列任何一個或全部定量測定的反應，無反應和副反應(即副作用)。
為了推出對治療的臨床反應和TCF1基因型或單元型之間的關系，需要獲得接受該治療的一群個體(下文稱“臨床群體”)顯示出的臨床反應的數(shù)據(jù)。這個臨床數(shù)據(jù)可以由分析已經(jīng)運行的臨床試驗的結(jié)果而獲得和/或可以由設計并實施一種或多種新臨床試驗而獲得。
這里使用的術語“臨床試驗”是指為收集對特定治療的反應的臨床數(shù)據(jù)而設計的任何研究，并包括但不限于I期、II期和III期臨床試驗?？梢允褂脴藴史椒▉硐薅ɑ颊呷后w和入選受試者。
優(yōu)選已經(jīng)就感興趣的醫(yī)學病癥的存在對臨床群體包括的個體進行了分級。這在患者表現(xiàn)的癥狀可以由一種以上的病根所引起，和這些病根的治療不同時很重要。一個這樣的例子是由于哮喘或呼吸道感染，患者遭受呼吸困難。如果兩組都用哮喘藥物治療，將有一個實際未患哮喘的明顯無反應者的假組。這些人將影響檢測單元型和治療結(jié)果之間任何關系的能力。潛在患者的這種分級可以使用標準身體檢查或一種或多種實驗室檢測?？晒┻x擇地，當單元型對和疾病易感性或嚴重性之間有強烈關系時，患者的分級可以使用單元型分型進行。
將感興趣的治療處理給予試驗群體的每個個體，使用一種或多種預先確定的標準測定每個個體對該治療的反應?？梢钥紤]到，在很多情況下，該試驗群體將表現(xiàn)出一個反應范圍，研究者可以選擇由各種反應組成的反應者組的數(shù)量(如低、中、高)。此外，試驗群體每個個體的TCF1基因的基因分型和/或單元型分型可在給予治療前或后進行。
在臨床和多態(tài)性數(shù)據(jù)都獲得之后，建立個體反應和TCF1基因型或單元型內(nèi)容之間的關系。幾種方法可以產(chǎn)生相關性。在一個方法中，根據(jù)個體的TCF1基因型或單元型(或單元型對)對個體進行分組(也稱作多態(tài)性組)，接著計算每個多態(tài)性組成員所顯示的臨床反應的平均數(shù)和標準差。
接著分析這些結(jié)果以確定多態(tài)性組之間任何觀察到的臨床反應差異是否有統(tǒng)計學顯著性。L.D.Fisher和G.vanBelle，“BiostatisticsAMethodology for the Health Sciences”，Wiley-lnterscience(New York)1993描述了可以使用的統(tǒng)計學分析方法。這種分析也可以包括回歸計算TCF1基因中哪個多態(tài)性位點對表型差異有最顯著性貢獻。2000年6月26日提交的名為“Methods for Obtaining and Using Haplotype Data”的PCT申請中描述了本發(fā)明中有用的一個回歸模型。
找到TCF1單元型內(nèi)容和臨床反應之間的關系的第二個方法使用基于誤差最小化優(yōu)化算法的預測性模型。很多可能的優(yōu)化算法中的一個是遺傳算法(R.Judson，“遺傳算法及其在化學中的應用”，《Reviews inComputational Chemistry》，Vol.10，pp.1-73，K.B.Lipkowitz和D.B.Boyd，eds.(VCH Publishers，New York，1997)。也可以使用模擬退火(Press等，“Numerical Recipes in CThe Art of Scientific Computing”，CambridgeUniversity Press(Cambridge)1992，Ch.10)，神經(jīng)網(wǎng)絡(E.Rich和K.Knight，“Artificial Intelligence”，2nd Edition(McGraw-Hill，New York，1991，Ch.18)，標準梯度下降方法(Press等，上引文，Ch.10)，或其它全局或局部優(yōu)化方法(見Judson討論，前述引文)。優(yōu)選，使用2000年6月26日提交的名為“Methods for Obtaining and Using Haplotype Data”的PCT申請中描述的遺傳計算法則方法找到相關性。
也可以使用方差分析(ANOVA)技術確定TCF1基因的不同多態(tài)性位點亞組解釋了臨床數(shù)據(jù)中的多少差異來分析相關性。如2000年6月26日申請的名為“Methods for Obtaining and Using Haplotype Data”的PCT申請中所述，ANOVA可以用于檢驗關于反應變量是否由一種或多種性狀或可測定的變量引起或是否與之相關的假說(Fisher和vanBelle，同上引文，Ch.10)。
根據(jù)上述分析，本領域技術人員可以很容易構建數(shù)學模型，以將臨床反應作為TCF1基因型或單元型內(nèi)容的函數(shù)來加以預測。優(yōu)選，在一個或多個為檢驗該模型設計的隨訪臨床試驗中驗證該模型。
臨床反應和TCF1基因的基因型或單元型(或單元型對)之間關系的鑒定可以作為基礎用于設計診斷方法以確定會或不會對治療產(chǎn)生反應，或可供選擇地，會以低水平反應并因此需要更多治療，即更大劑量藥物的那些個體。診斷方法可以采用幾種形式之一例如，直接DNA檢測(即對TCF1基因之一個或多個多態(tài)性位點進行基因分型或單元型分型)，血清學檢測，或身體檢查測定。唯一的需要是診斷檢測結(jié)果和根源性TCF1基因型或單元型之間要有好的相關性，而此基因型或單元型又與臨床反應有關。在優(yōu)選實施方案中，這個診斷方法使用上述預測性單元型分型方法。
計算機可以實施本發(fā)明方法中涉及的任何或全部分析和數(shù)學操作。而且，計算機可以執(zhí)行程序，該程序產(chǎn)生顯示裝置上顯示的視圖(或屏幕)，通過和該界面的互作，使用者可以瀏覽和分析與TCF1基因及其基因組變異相關的大量信息，包括染色體位置、基因結(jié)構和基因家族、基因表達數(shù)據(jù)、多態(tài)性數(shù)據(jù)、基因序列數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)、群體數(shù)據(jù)(如，一個或多個群體的地理種群來源、臨床反應、基因型和單元型的數(shù)據(jù))。這里所述的TCF1多態(tài)性數(shù)據(jù)可以保存為關系數(shù)據(jù)庫的一部分(如，Oracle數(shù)據(jù)庫的一個實例或一組ASCII平面文件)。這些多態(tài)性數(shù)據(jù)可以保存在計算機硬驅(qū)或可以保存在例如CD-ROM或計算機可使用的一個或多個其它存儲裝置上。例如，數(shù)據(jù)可以保存在通過網(wǎng)絡可與計算機相通訊的一個或多個數(shù)據(jù)庫中。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供了對個體中TCF1基因的單元型和/或基因型進行分型的方法、組合物和試劑盒。該方法包括鑒定GenBank登記號U72616的核苷酸483A＞G位所存在的核苷酸或核苷酸對。這個核苷酸置換使個體TCF1基因的一個或兩個拷貝中的氨基酸Asn 487改變?yōu)镾er。該組合物含有設計與含有多態(tài)性位點或與之相鄰的一個和多個靶區(qū)域特異性雜交的寡核苷酸探針和引物。建立個體在這里所描述的新多態(tài)性位點處的基因型或單元型的方法和組合物可用于研究該多態(tài)性在TCF1蛋白表達和功能所影響的疾病的病因?qū)W中的作用，研究靶向TCF1的藥物的功效，預測個體對TCF1蛋白表達和功能所影響的疾病的易感性和預測個體對靶向TCF1的藥物的反應性。
仍在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了鑒定基因型或單元型和性狀之間關系的方法。在優(yōu)選實施方案中，該性狀是對疾病的易感性，疾病的嚴重性，疾病的時期或?qū)λ幬锏姆磻?。這種方法可用于開發(fā)診斷檢測和治療處理，以用于基因型和治療結(jié)果之間可能存在關系的所有藥物遺傳學應用中，包括功效確定、PK確定和副作用確定。
本發(fā)明提供了存儲和顯示針對TCF1基因確定的多態(tài)性數(shù)據(jù)的計算機系統(tǒng)。該計算機系統(tǒng)包括計算機處理器；顯示器；和含有多態(tài)性數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫。該多態(tài)性數(shù)據(jù)包括在參考群體中鑒定的TCF1基因的多態(tài)性、基因型和單元型。在優(yōu)選實施方案中，該計算機系統(tǒng)能夠顯示根據(jù)進化關系而組織的TCF1單元型。
在另一個方面，本發(fā)明提供了SNP探針，它在根據(jù)人們的遺傳變異類型而對人們進行分類時有用。根據(jù)本發(fā)明的SNP探針是寡核苷酸，它可在傳統(tǒng)等位基因辨別試驗中對SNP核酸的兩個等位基因進行辨別。
這里使用的“SNP核酸”是核酸序列，它包括一個核苷酸序列內(nèi)在個體或個體組之間可變，因此，以等位基因存在的核苷酸。這種SNP核酸長度優(yōu)選大約15至大約500個核苷酸。該SNP核酸可以是染色體的一部分，或它們可以是一部分染色體的確切拷貝，如，通過PCR或通過克隆得到的這一部分染色體的擴增物。SNP核酸以下簡稱為“SNP”。根據(jù)本發(fā)明的SNP探針是與SNP核酸互補的寡核苷酸。
這里使用的術語“互補”是指在Watson和Crick的字義上的全長寡核苷酸確切互補。
在某些優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明這個方面的寡核苷酸與SNP核酸的一個等位基因互補，但不與SNP核酸的任何其它等位基因互補。根據(jù)本發(fā)明這個實施方案的寡核苷酸可以以各種方法區(qū)分SNP核酸的兩個等位基因。例如，在嚴格雜交條件下，適當長度的寡核苷酸將與SNP核酸的一個等位基因雜交，但是不與SNP核酸的任何其它等位基因雜交?？梢杂梅派湫詷擞浕驘晒鈽擞泚順擞浽摴押塑账??？晒┻x擇地，適當長度的寡核苷酸可以用作PCR引物，其中3’末端核苷酸與SNP核酸的一個等位基因互補，但是不與其它任何等位基因互補。在這個實施方案中，由PCR擴增的存在或缺乏可以確定SNP核酸的單元型。
因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了分離的多核苷酸，其包含是TCF1基因或其片段的參考序列的多態(tài)性變體的核苷酸序列。參考序列包括UniGene Cluster Hs.73888，多態(tài)性變體包含至少一個多態(tài)性，包括但不限于核苷酸483A＞G。特別優(yōu)選的多態(tài)性變體是TCF1基因天然存在的同種型(這里也稱作“同源基因”)。
本發(fā)明的基因組和cDNA片段包含至少一個這里鑒定的新多態(tài)性位點，具有至少10個核苷酸的長度，并且范圍可以達到基因全長。優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的片段的長度在100和3000個核苷酸之間，更優(yōu)選長度在200和2000個核苷酸之間，最優(yōu)選長度在500和1000個核苷酸之間。
在描述這里鑒定的多態(tài)性位點時，為了方便，提及該基因的有義鏈。然而，如本領域技術人員認識的，含有TCF1基因的核酸分子可以是互補雙鏈分子，因此提及到有義鏈上的特定位點時同樣也指互補反義鏈上的相應位點。因此，可以提及任何一條鏈上的相同多態(tài)性位點，并可以設計寡核苷酸與任何一條鏈上含該多態(tài)性位點的靶區(qū)域特異性雜交。因此，本發(fā)明也包括與這里所述的TCF1基因組變體的有義鏈互補的單鏈多核苷酸。
在本發(fā)明更進一步的方面，提供了鑒定患者TCF1多態(tài)性位點483A＞G的多態(tài)性模式的試劑盒，所述試劑盒包含確定TCF1多態(tài)性位點483A＞G的遺傳多態(tài)性模式的工具。
在優(yōu)選實施方案中，這種試劑盒可以進一步包括DNA樣品收集工具。
在優(yōu)選實施方案中，確定TCF1多態(tài)性位點483A＞G的遺傳多態(tài)性模式的工具中包含至少一個TCF1基因分型寡核苷酸。特別地，確定TCF1多態(tài)性位點483A＞G的遺傳多態(tài)性模式的工具中包含兩個TCF1基因分型寡核苷酸。而且，確定TCF1多態(tài)性位點483A＞G的遺傳多態(tài)性模式的工具中可以包含至少一個含有至少一個TCF1基因分型寡核苷酸的TCF1基因分型引物組合物。特別地，TCF1基因分型引物組合物可以包含至少兩組等位基因特異性引物對。優(yōu)選，兩個TCF1基因分型寡核苷酸包裝在分開的容器中。
應該理解的是，這里描述的本發(fā)明的方法通常還可以包括使用根據(jù)本發(fā)明的試劑盒。通常，本發(fā)明的方法可以離體實施，并且本發(fā)明特別考慮這種離體方法。而且，當本發(fā)明的方法可以包括可以在人或動物體上實施的步驟時，本發(fā)明特別考慮僅包含不在人或動物體上實施的那些步驟的方法。
制備含TCF1基因的多態(tài)性變體的重組細胞和/或生物體，優(yōu)選重組動物，可以研究這里鑒定的多態(tài)性對TCF1表達的作用。這里使用的“表達”包括但不限于下列一種或多種基因轉(zhuǎn)錄為mRNA前體；前體mRNA的剪接和其它加工以產(chǎn)生成熟mRNA；mRNA穩(wěn)定性；成熟mRNA翻譯為TCF1蛋白(包括密碼子使用和tRNA利用率)；和翻譯產(chǎn)物的糖基化和/或其它修飾，如果為正確的表達和功能所需要的話。
為了制備本發(fā)明的重組細胞，期望的TCF1同源基因可以在載體中導入細胞，使得同源基因保持在染色體外。在這種情況下，細胞從染色體外位置表達該基因。在優(yōu)選實施方案中，TCF1同源基因以與細胞中存在的內(nèi)源TCF1基因重組的方式導入細胞。這種重組需要發(fā)生雙重組事件，由此產(chǎn)生期望的TCF1基因多態(tài)性。用于基因?qū)脒M行重組和染色體外保持的載體是本領域已知的，任何合適的載體或載體構建體都可以用于本發(fā)明。DNA導入細胞的方法如電穿孔，粒子轟擊，磷酸鈣共沉淀和病毒轉(zhuǎn)導是本領域已知的；因此，方法的選擇在于熟練技術人員的能力和喜好。
可以導入TCF1同源基因的細胞實例包括但不限于連續(xù)培養(yǎng)細胞，如COS，NIH/3T3和相關組織類型(即，它們表達TCF1同源基因)的原代或培養(yǎng)細胞。這種重組細胞可以用于比較不同蛋白變異體的生物學活性。
使用本領域標準程序制備表達變異TCF1基因變體的重組生物體，即轉(zhuǎn)基因動物。優(yōu)選，包含該變體基因的構建體在胚胎期，即一細胞期或通常不晚于大約八細胞期導入非人動物或動物祖先。用本領域技術人員已知的幾種方法可以制備攜帶本發(fā)明構建體的轉(zhuǎn)基因動物。一種方法包括用構建含有一個或多個絕緣子(insulator)元件、感興趣的一個或多個基因和本領域技術人員已知的其它成分的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染胚胎，此病毒提供了一個完整的包含被隔絕的基因作為轉(zhuǎn)基因的穿梭載體，如見美國專利5,610,053。另一種方法包括直接將轉(zhuǎn)基因注射到胚胎中。第三種方法包括使用胚胎干細胞。
可以導入TCF1同源基因的動物實例包括但不限于小鼠、大鼠、其它嚙齒動物和非人靈長類動物(見“The Introduction of Foreign Genes intoMice”和其中引用的文獻，在《Recombinant DNA》，Eds.J.D.Watson，M.Gilman，J.Witkowski，和M.Zoller；W.H.Freeman and Company，NewYork，254-272頁)。穩(wěn)定表達人TCF1同源基因并產(chǎn)生人TCF1蛋白的轉(zhuǎn)基因動物可以用作生物學模型，用于研究與TCF1表達和/或活性異常相關的疾病，篩選和檢測各種候選藥物、化合物和治療方案以減少這些疾病的癥狀或作用。
此外，使用血糖控制劑或療法進行的治療可以用于血糖控制受損的受試者，包括2型和1型糖尿病，葡萄糖代謝受損(葡萄糖耐量受損和/或空腹葡萄糖受損)，X綜合征，進餐脂血癥，妊娠糖尿病，來預防或延遲個體進展為明顯2型糖尿病；預防、減少或延遲選自下組的情況的發(fā)生微血管并發(fā)癥增加；心血管發(fā)病率增加；過度腦血管疾病；心血管死亡率和猝死增加；惡性腫瘤的發(fā)生率和死亡率增高；和其它與IGM相關的代謝失衡。
此外，血糖控制劑或療法可以用于血糖控制受損(IGC)的受試者來預防、減少或延遲選自如下組的疾病的發(fā)生視網(wǎng)膜病、糖尿病的其它眼并發(fā)癥、腎病、神經(jīng)病變、外周血管病、壞疽、心肌梗塞、冠心病、動脈粥樣硬化、其它急性和亞急性形式的冠狀動脈缺血、中風、異常脂血癥、高尿酸血癥、高血壓、心絞痛、導致截肢的微血管病變、癌癥、癌癥死亡、肥胖、尿酸血癥、抗胰島素性、動脈閉塞疾病和動脈粥樣硬化。
根據(jù)本發(fā)明，血糖控制劑或治療藥劑可以用于IGC患者，以在IGC個體中預防或延遲進展為明顯糖尿病，減少糖尿病的微血管并發(fā)癥，減少血管，特別是心血管死亡率和發(fā)病率，特別是心血管發(fā)病率和死亡率，和減少與癌癥相關的死亡率的增加。
因此，本發(fā)明涉及在IGC個體中用于預防或延遲個體進展為明顯2型糖尿病；預防、減少或延遲選自下組的情況的發(fā)生的方法微血管并發(fā)癥增加；心血管發(fā)病率增加；過度腦血管疾??；心血管死亡率和猝死增加；惡性腫瘤的發(fā)生率和死亡率增加；和其它與IGM相關的代謝失衡。特別地，本發(fā)明涉及用于在IGC個體中預防，減少或延遲選自例如如下的病癥發(fā)生的方法視網(wǎng)膜病、糖尿病的其它眼并發(fā)癥、腎病、神經(jīng)病變、外周血管病、外周血管病壞疽、心肌梗塞、冠心病、動脈粥樣硬化、其它急性和亞急性形式的冠狀動脈缺血、中風、異常脂血癥、高尿酸血癥、高血壓、心絞痛、導致截肢的微血管病變、癌癥、癌癥死亡、肥胖、尿酸血癥、抗胰島素性、動脈閉塞疾病和動脈粥樣硬化。
因此，本發(fā)明涉及在IGM個體，特別是IFG和IGT個體中預防或延遲個體進展為明顯糖尿病，特別是2型(ICD-9代碼250.2)，預防或減少微血管并發(fā)癥樣視網(wǎng)膜病(ICD-9代碼250.5)，神經(jīng)病變(ICD-9代碼250.6)，腎病(ICD-9代碼250.4)和外周血管病變或壞疽(ICD9代碼250.7)(后者術語稱為“微血管并發(fā)癥”)的方法。本發(fā)明進一步涉及在IGC個體中在每種情況下預防或減少過度心血管發(fā)病率(ICD-9代碼410-414)，如心肌梗塞(ICD-9代碼410)，動脈閉塞疾病，動脈粥樣硬化和其它急性和亞急性形式的冠狀動脈缺血(ICD-9代碼411-414)(后者術語稱為“心血管發(fā)病”)的情況；預防、減少或延遲過度腦血管疾病樣中風(ICD-9代碼430-438)的起病，減少心血管死亡率(ICD-9代碼390-459)和猝死(ICD-9代碼798.1)增加；預防發(fā)展為癌癥(ICD-9代碼140-208)和減少癌癥死亡的方法。
該方法還涉及預防或減少IGC個體在每種情況下與IGC相關的其它代謝紊亂的方法，所述紊亂包括高血糖(包括單獨的餐后高血糖)、異常脂血癥(ICD-9代碼272)、高尿酸血癥(ICD-9代碼790.6)以及高血壓(ICD-9代碼401-404)和心絞痛(ICD-9代碼413.9)。根據(jù)國際疾病分類第9版在上文和下文標記的代碼及分配給它的相應定義在此并入作為參考并同樣成為本發(fā)明的一部分。
本發(fā)明方法包括將有效量血糖控制劑或療法或這種藥劑或化合物的藥物可接受鹽給予需要之的受試者。需要這種方法的受試者是恒溫動物，包括人。本發(fā)明也涉及用于IGC和相關疾病和病癥如單獨進餐高血糖個體中以預防或延遲發(fā)展為明顯糖尿病，特別是2型糖尿病，預防、降低或延遲微血管并發(fā)癥的起病，預防或減少導致截肢的壞疽或微血管病變，預防或減少過度心血管發(fā)病率和心血管死亡率，預防癌癥和減少癌癥死亡的方法。
本發(fā)明同樣也涉及治療IGC(包括單獨進餐高血糖)相關病癥和疾病的方法，包括肥胖、老化增加、妊娠期間糖尿病、異常脂血癥(dyslipide-mia)、高血壓、尿酸血癥、抗胰島素性、動脈閉塞疾病、動脈粥樣硬化、視網(wǎng)膜病、腎病、心絞痛、心肌梗塞和中風。優(yōu)選，所述預防應該對葡萄糖水平處于大流行病學研究中已經(jīng)證明可增加心血管、微血管和癌癥風險的范圍內(nèi)的個體起作用。這些水平包括OGTT或隨機葡萄糖評價后血漿葡萄糖水平7.8mmol/L和/或空腹血漿葡萄糖在IFG范圍(空腹血漿葡萄糖在6.1和7mmol/l之間)。當新的流行病學資料加入降低了勿庸置疑與上面提及的風險相關的血糖水平時，或當定義風險組的國際標準改變時，本發(fā)明也同樣有理由可以用于治療這些風險組。
本發(fā)明也涉及用于IFG個體的方法，包括給需要它的個體施與治療有效量的血糖控制劑，包括但不限于DPP-IV抑制劑。
本發(fā)明涉及血糖控制劑或其藥物可接受鹽在制備預防或延遲IGC受試者進展為明顯2型糖尿病，預防、減少或延遲選自下組的情況的發(fā)生的藥物中的應用微血管并發(fā)癥增加；心血管發(fā)病率增加；過度腦血管疾病；心血管死亡率和猝死增加；惡性腫瘤的發(fā)生率和死亡率增高；和與IGC相關的其它代謝紊亂。
本發(fā)明涉及血糖控制劑包括DPP4抑制劑或其藥物可接受鹽在制備在IGC和相關疾病和病癥如單獨進餐高血糖的受試者中用于下列情況的藥物中的應用預防或延遲進展為明顯糖尿病，特別是2型糖尿病，預防或減少微血管并發(fā)癥，預防或減少過度心血管發(fā)病率和心血管死亡率，預防癌癥和減少癌癥死亡。
相應的活性成分或其藥物可接受鹽也可以以水合物形式使用或包括用于結(jié)晶的其它溶劑。此外，本發(fā)明涉及組合，如組合的制劑或藥物組合物，其分別包含一種以上血糖控制劑，用于在IGM個體，特別是IFG和/或IGT個體中預防或延遲進展為明顯2型糖尿??；預防、減少或延遲選自下組的情況的發(fā)生微血管本發(fā)明增加；心血管發(fā)病率增加；過度腦血管疾病；心血管死亡率和猝死增加；惡性腫瘤的發(fā)生率和死亡率增高；和與IGM相關的其它代謝紊亂。
應用本發(fā)明的組合時的其它益處是根據(jù)本發(fā)明進行組合的各單個藥物的較低給藥可用于減少劑量，例如，需要的劑量通常不僅更少而且施用頻率更小，或可用于減少副作用的發(fā)生。這是符合待治療患者的愿望和需要的。優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的組合，可以將聯(lián)合治療有效量的活性劑同時地或以任何順序相繼地、分開地或以固定組合給予。
這里使用的術語“治療有效量”是指藥物或組合的量會在恒溫動物(包括人)中引起為達到根據(jù)本發(fā)明所說明的治療效果所需的生物學或醫(yī)學反應。當給予單一藥劑和兩種或兩種以上化合物的固定或自由組合時，可以給予“治療有效量”。
這里使用的“聯(lián)合有效量”是指當聯(lián)合給予(固定或自由的)多種藥劑可達到整體治療作用時，聯(lián)合中的一種或多種成分的量，該量本身可能無效，但當根據(jù)本發(fā)明與一種或多種其它藥劑組合聯(lián)合使用時，卻可以是治療有效的。上文和下文所述根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以同時使用或以任何順序相繼使用，分開使用或以固定組合使用。
優(yōu)選的血糖控制劑包括但不限于DPP4抑制劑，如化合物2-吡咯烷甲腈，1-[[[2-[(5-氰基-2-吡啶基)氨基]乙基]氨基]乙?；鵠-，(2S)和(1-[(3-羥基-金剛烷-1-基氨基)-乙?；鵠-吡咯烷-2(S)-甲腈)，或如果適當，在每種情況下，其藥物可接受鹽。
在變通方案中，本發(fā)明也涉及“多部分試劑盒”，例如，如下意義上的“多部分試劑盒”根據(jù)本發(fā)明組合的成分可以單獨給藥或使用具有可區(qū)分量的這些成分的不同固定組合給藥，即同時或在不同時間點給藥。因此多部分試劑盒的各部分可以例如同時或按時間順序交錯給予，即在不同時間點和以相同或不同時間間隔給予多部分試劑盒的任何部分。優(yōu)選，選擇時間間隔使得這些部分的聯(lián)合使用對被治療的疾病或病癥的作用大于僅使用任何一種成分時獲得的作用。本發(fā)明進一步涉及包括根據(jù)本發(fā)明的組合連同用于同時、分開或相繼使用的說明書的商業(yè)包。待組合的化合物可以以藥物可接受鹽存在。如果這些化合物具有例如至少一個堿性中心，那么它們可形成酸加成鹽。如果期望，也可以形成具有另外存在的堿性中心的相應酸加成鹽。具有酸性基團(例如COOH)的化合物也可以與堿形成鹽。藥物可接受鹽為例如與堿形成的鹽，即陽離子鹽如堿和堿土金屬鹽，以及銨鹽。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以以本身已知的方式制備，并可以是適合腸道內(nèi)，如口服或直腸，和非腸道給予哺乳動物(恒溫動物)，包括人，的那些，其包括單獨或與一種或多種藥物可接受載體，特別是適合腸道內(nèi)或非腸道應用的載體組合的治療有效量的藥理學活性化合物。
新的藥物制劑含有，例如，大約10％至大約100％，優(yōu)選80％，最優(yōu)選大約90％至大約99％的活性成分。根據(jù)本發(fā)明的腸道內(nèi)或非腸道給予的藥物制劑是例如以單位劑量形式存在的那些，如糖衣片劑、片劑、膠囊或栓劑，或安瓿。以本領域技術人員熟知的方式可以制備這些制劑，例如利用常規(guī)混和、成粒、包糖衣、溶解或凍干方法。因此，口服使用的藥物制劑可以通過活性成分與固體載體混合，如果期望，將所得混合物成粒，并加工該混合物或顆粒——如果期望或需要，在添加適當賦形劑后加工——得到片或糖衣片核芯而獲得。
待用于治療以血糖控制受損為特征的疾病或紊亂的本發(fā)明化合物和它們相應的藥物可接受酸加成鹽的精確劑量依賴于幾個因素，包括宿主、所治療疾病的性質(zhì)和嚴重性，使用的給藥方式和特定化合物。然而通常，當腸道內(nèi)如口服，或非腸道如靜脈內(nèi)(但優(yōu)選口服)，以每日0.002-10mg/kg體重的劑量，優(yōu)選0.02-2.5mg/kg體重，或?qū)τ谧畲蟮撵`長目，每日0.1-250的劑量，優(yōu)選1-100mg給予本發(fā)明的化合物或相應藥物可接受酸加成鹽時，可有效治療以血糖控制受損為特征的疾病或紊亂。典型的口服劑量單位是0.01-0.75mg/kg，每日一至三次。
通常，最初以小劑量給予，逐步增加劑量直到確定治療下對宿主的最佳劑量。劑量上限受副作用影響，可通過試驗確定正治療的宿主的劑量上限。
本發(fā)明的化合物和它們相應的藥物可接受酸加成鹽可以與一種或多種藥物可接受載體，和任選地一種或多種其它常規(guī)藥物輔料組合，并以片劑、膠囊、囊片(Caplet)等形式腸道內(nèi)給予，如口服，或以無菌注射液或懸液形式非腸道給予，如靜脈內(nèi)給予。
本發(fā)明的化合物和它們相應的藥物可接受酸加成鹽可以配制成含有對于治療以血糖控制受損為特征的疾病或紊亂有效的量的活性物質(zhì)和藥物可接受載體的腸道內(nèi)和非腸道藥物組合物，這種組合物可以配制成單位劑量形式。
本發(fā)明的化合物(包括其每個亞范圍和每個實施例的化合物)可以以純對映體形式(如一種對映體純度大于98％和優(yōu)選純度大于99％)或兩種對映體同時存在的形式，如外消旋形式給予。上述劑量范圍基于本發(fā)明化合物的單一對映體。(不包括活性較小的對映體的量，即使其存在的話)本領域技術人員完全能夠基于其知識確定具體血糖控制劑，包括DPP4抑制劑的具體劑量，無論其是單獨或組合使用。
實施例在下列實施例中描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。根據(jù)對這里公開的本發(fā)明說明書或?qū)嵤┑睦斫?，在權利要求范圍?nèi)的其它實施方案對本領域技術人員來說很明顯。意思是認為說明書，連同實施例僅是示例性的，實施例后的權利要求表示本發(fā)明的范圍和精神。
實施例1常規(guī)篩選中，發(fā)現(xiàn)一位40歲女性有升高的血液葡萄糖水平。她的醫(yī)師進行口服葡萄糖耐量測試并確定該患者為葡萄糖耐量受損。該醫(yī)師與患者討論葡萄糖耐量受損的短和長期結(jié)果和進展為明顯糖尿病的可能性。該醫(yī)師也討論了可使用的治療形式，包括膳食、減重、鍛煉和藥物，包括各種血糖控制劑如DPP4抑制劑。此外，該醫(yī)師與該患者商議關于測試她的TCF1基因中多態(tài)性存在的可能性并解釋了對于使用藥物包括DPP4抑制劑，這個結(jié)果將意味著什么。
該患者同意測試，基因分型顯示存在GG基因型?；谶@些結(jié)果，該醫(yī)師推薦并且該患者同意藥物如DPP4抑制劑試驗來幫助校正她的異常葡萄糖耐量和餐后高血糖。
實施例2醫(yī)師觀察到一位52歲II型糖尿病男性。該患者正在服用血糖控制劑并且葡萄糖水平控制很好，但是該患者遭受著來自該藥物的很多副作用。醫(yī)師推薦基因分型并且與該患者商議了基因分型結(jié)果將允許的治療選擇。該患者經(jīng)過測試被確定具有與對DPP4抑制劑產(chǎn)生最有利反應相關的基因型?；谶@個結(jié)果和預期對DPP4抑制劑的高敏感性，該醫(yī)師能夠推薦伴減少的副作用可能性的低劑量DPP4抑制劑治療方案。這種治療可以補充使用降低劑量的以前治療這個患者時使用的且不能耐受的血糖控制劑進行的連續(xù)治療，或可代替為單獨低劑量DPP抑制劑方案。
定義本公開物的上下文中，除非另有說明，下列術語定義如下等位基因一種特定形式的遺傳座位，其以特定的核苷酸序列和其它形式相區(qū)別。
候選基因假定為對疾病、病癥或治療反應負責，或與這些中的一種相關的基因。
基因含有使RNA產(chǎn)物受調(diào)節(jié)地生物合成的所有信息的DNA片段，包括啟動子、外顯子、內(nèi)含子和控制表達的其它非翻譯區(qū)域。
基因型個體的一對同源染色體上一個座位中的一個或多個多態(tài)性位點處存在的無定相的(unphased)5’至3’核苷酸對序列。這里使用的基因型包括如下所述的全基因型和/或亞基因型。
全基因型單個個體的一對同源染色體上一個座位中的所有已知多態(tài)性位點上存在的無定相的5’至3’核苷酸對序列。
亞基因型單個個體的一對同源染色體上一個座位中的一個已知多態(tài)性位點亞組上存在的無定相的5’至3’核苷酸序列。
基因分型確定個體基因型的過程。
單元型單個個體的一條染色體上一個座位中的一個或多個多態(tài)性位點上存在的5’至3’核苷酸序列。這里使用的單元型包括如下所述的全單元型和/或亞單元型。
全單元型單個個體的一條染色體上一個座位中的所有已知多態(tài)性位點上存在的5’至3’核苷酸序列。
亞單元型單個個體的一條染色體上一個座位中的一個已知多態(tài)性位點亞組上存在的5’至3’核苷酸序列。
單元型對單個個體的一個座位中發(fā)現(xiàn)的兩個單元型。
單元型分型確定個體的一個或多個單元型的過程，包括使用家族譜系，分子技術和/或統(tǒng)計學推論。
單元型數(shù)據(jù)關于一個特定基因的一個或多個下列情況的信息群體中每個個體的單元型對列表；群體中不同單元型的列表；這個或其它群體中每個單元型的頻率；和一個或多個單元型和性狀之間的任何已知關系。
同種型一種特定形式的基因、mRNA、cDNA或由此編碼的蛋白，其以特定序列和/或結(jié)構與其它形式相區(qū)別。
同源基因群體中發(fā)現(xiàn)的一個基因的同種型中的一種。一個同源基因含有該基因的該特定同種型中存在的所有多態(tài)性。
分離的當應用于生物學分子如RNA、DNA、寡核苷酸或蛋白時，分離的是指該分子基本上不含其它生物學分子如核酸、蛋白、脂類、碳水化合物或其它物質(zhì)如細胞碎片和生長培養(yǎng)基。通常，術語“分離的”不旨在指完全缺乏這些物質(zhì)或缺乏水、緩沖液或鹽，但條件是它們存在的量不實質(zhì)上干擾本發(fā)明的方法。
連鎖描述由于基因在相同染色體上的位置而將一起被遺傳的趨勢；由座位之間的重組百分比測定。
連鎖不平衡描述遺傳標記的一些組合在群體中的發(fā)生頻率比由它們的間隔距離所預期的頻率高或低的情況。它意味著一組標記協(xié)同遺傳。它可以由該區(qū)域中降低的重組或建立者效應——其中自一個標記被導入群體，還沒有足夠時間達到平衡——而引起。
座位與基因或身體或表型特征相對應的染色體或DNA分子上的位置。
天然存在該術語用于指它所應用的對象，如天然存在的多核苷酸或多肽，可從自然的來源分離且尚未被人有意改變。
核苷酸對個體染色體的兩個拷貝上的多態(tài)性位點上存在的核苷酸。
定相的(Phased)當應用于一個座位中兩個或兩個以上多態(tài)性位點的核苷酸對的序列時，它是指該座點的單一拷貝上的那些多態(tài)性位點上存在的核苷酸組合是已知的。
多態(tài)性位點(PS)座位中的位置，在此位置群體中存在至少兩個可替換的序列，它的最大頻率是至多99％的頻率。
多態(tài)性變體由于基因中多態(tài)性的存在，具有與參考序列不同的核苷酸或氨基酸序列的基因、mRNA、cDNA、多肽或肽。
多態(tài)性在個體的多態(tài)性位點上觀察到的序列變異。多態(tài)性包括核苷酸置換、插入、缺失和微衛(wèi)星，并且可以但不是必須引起基因表達或蛋白功能的可檢測差異。
多態(tài)性數(shù)據(jù)關于一個特定基因的一個或多個下列情況的信息多態(tài)性位點的位置；那些位點的序列變異；一個或多個群體中多態(tài)性的頻率；所確定的基因的不同基因型和/或單元型；一個或多個群體中這些基因型和/或單元型中的一個或多個的頻率；性狀和基因的基因型或單元型之間的任何已知關系。
多態(tài)性數(shù)據(jù)庫以系統(tǒng)的或有系統(tǒng)的方式排列的多態(tài)性數(shù)據(jù)集合，其能夠通過電子或其它方法逐個獲取。
多核苷酸由單鏈RNA或DNA組成，或由互補的雙鏈DNA組成的核酸分子。
群體組具有共同特征，如地理種群來源、醫(yī)學疾病、對治療的反應等......的個體組。
參考群體預測可以代表群體組的1個或多個特征的受試者或個體的組。典型地，參考群體代表群體中至少85％，優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％和甚至更優(yōu)選至少99％確定水平的遺傳變異。
單核苷酸多態(tài)性(SNP)典型地，單一多態(tài)性位點上觀察到的特定核苷酸對。在很少情況下，可以發(fā)現(xiàn)三或四個核苷酸。
受試者待確定基因型或單元型或?qū)χ委煹姆磻蚣膊顩r的人類個體。
治療從內(nèi)部或外部給予受試者的刺激。
無定相的(Unphased)當應用于一個座位中兩個或兩個以上多態(tài)性位點的核苷酸對的序列時，它是指該座位的單一拷貝上的那些多態(tài)性位點上存在的核苷酸組合是未知的。
DPP4抑制劑-這里使用的術語DPP4抑制劑是指能夠抑制DPP4酶(DPP-IV；二肽基肽酶IV；EC 3.4.14.5)的催化作用的化合物，DPP4酶是等同于ADA復合蛋白2和T細胞活化抗原CD26的絲氨酸外肽酶。
引用的參考文獻這里引用的所有參考文獻的全部內(nèi)容為所有目的并入這里作為參考，如同每個出版物或?qū)＠驅(qū)＠暾埖娜績?nèi)容被專門地單獨指出為所有目的并入作為參考一樣。這里的參考文獻的討論僅意欲概括它們的作者的主張，而不承認任何參考文獻都構成現(xiàn)有技術。申請人保留挑戰(zhàn)所引用參考文獻的準確性和中肯性的權利。
此外，這里引用的所有GenBank登記號，Unigene Cluster號和蛋白登記號的全部內(nèi)容為所有目的并入這里作為參考，程度如同為了所有目的將每個編號的全部內(nèi)容專門單獨指出并入作為參考一樣。
本發(fā)明不限于本申請中描述的具體實施方案，具體實施方案旨在單獨舉例闡述本發(fā)明的單個方面。如對本領域技術人員很明顯的，可以在不背離本發(fā)明精神和范圍的情況下，對本發(fā)明作出很多修改和變形。除了這里列舉的那些外，根據(jù)前面的說明書和所附附圖，本發(fā)明范圍內(nèi)的功能等同方法和裝置對本領域技術人員來說很明顯。這些修改和變形意欲包括在所附權利要求的范圍內(nèi)。本發(fā)明僅由所附權利要求，連同這些權利要求有權要求的等同物的全部范圍來限定。
序列表<110>諾瓦提斯公司<120>基于TCF1基因多態(tài)性治療糖尿病和相關病癥的方法<130>4-32215/PROV/USN<160>4<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>300<212>DNA<213>人(Homo sapien)<400>1ggcccagctg attccctccc cttccactcc aggcctggcc tccacgcagg cacagagtgt 60gccggtcatc aacagcatgg gcagcagcct gaccaccctg cagcccgtcc agttctccca120gccgctgcac ccctcctacc agcagccgct catgccacct gtgcagagcc atgtgaccca180gaaccccttc atggccacca tggctcagct gcagagcccc cacggtgagc accctgtgcc240ccacacagca ggagatgatg atagaggttg gctgtcaatg gatgcagggg aaaggggtgc300<210>2<211>26<212>DNA<213>人<400>2ctgagccatg gtggccatga agggga 26<210>3<211>26<212>DNA<213>人<400>3cgcgccgagg ttctgggtca catggc26
<210>4<211>30<212>DNA<213>人<400>4atgacgtggc agacctctgg gtcacatggc30
權利要求
1.一種確定患有以血糖控制受損為特征的紊亂的個體對血糖控制劑或療法的反應性的方法，包括(a)確定個體中存在的TCF1基因的兩個拷貝在多態(tài)性位點483A＞G處的核苷酸對的身份，和(b)如果兩對都是GC或如果一對是AT而一對是GC，則將該個體分配到良好反應組，如果兩對都是AT，則分配到低反應組。
2.權利要求1的方法，其中血糖控制劑或療法包括給予二肽基肽酶4(DPP4)抑制劑。
3.權利要求1的方法，其中血糖控制劑或療法包括給予2-吡咯烷甲腈，1-[[[2-[(5-氰基-2-吡啶基)氨基]乙基]氨基]乙?；鵠-，(2S)。
4.權利要求1的方法，其中血糖控制劑或療法包括給予1-[(3-羥基-金剛烷-1-基氨基)-乙?；鵠-吡咯烷-2(S)-甲腈。
5.權利要求1的方法，其中血糖控制劑或療法選自式I或式II的化合物。
6.權利要求1，2，3，4或5的方法，其中以血糖控制受損為特征的紊亂是2型糖尿病。
7.權利要求1，2，3，4或5的方法，其中以血糖控制受損為特征的紊亂是1型糖尿病。
8.權利要求1，2，3，4或5的方法，其中以血糖控制受損為特征的紊亂是葡萄糖耐量受損。
9.權利要求1，2，3，4或5的方法，其中以血糖控制受損為特征的紊亂是空腹葡萄糖受損。
10.權利要求1，2，3，4或5的方法，其中以血糖控制受損為特征的紊亂是X綜合征。
11.權利要求1，2，3，4或5的方法，其中以血糖控制受損為特征的紊亂是妊娠糖尿病。
12.權利要求1，2，3，4或5的方法，其中以血糖控制受損為特征的紊亂是葡萄糖代謝受損(IGM)。
13.權利要求1，2，3，4或5的方法，其中以血糖控制受損為特征的紊亂是對DPP4抑制劑有反應的紊亂。
14.一種患有以血糖控制受損為特征的紊亂的個體的治療方法，包括(a)確定個體中存在的TCF1基因的兩個拷貝在多態(tài)性位點483A＞G處的核苷酸對的身份，其中，(b)如果兩個核苷酸對都是CG或如果一對是AT而一對是CG，則用血糖控制劑或療法治療該個體，而如果兩個核苷酸對都是AT，則用替代療法治療該個體。
15.權利要求14的方法，其中血糖控制劑或療法包括給予二肽基肽酶4(DPP4)抑制劑。
16.權利要求14的方法，其中血糖控制劑或療法包括給予2-吡咯烷甲腈，1-[[[2-[(5-氰基-2-吡啶基)氨基]乙基]氨基]乙?；鵠-，(2S)。
17.權利要求14的方法，其中血糖控制劑或療法包括給予1-[(3-羥基-金剛烷-1-基氨基)-乙酰基]-吡咯烷-2(S)-甲腈。
18.權利要求14的方法，其中血糖控制劑選自式I或式II的化合物。
19.權利要求14，15，16，17或18的方法，其中以血糖控制受損為特征的紊亂是2型糖尿病。
20.權利要求14，15，16，17或18的方法，其中以血糖控制受損為特征的紊亂是1型糖尿病。
21.權利要求14，15，16，17或18的方法，其中以血糖控制受損為特征的紊亂是葡萄糖耐量受損。
22.權利要求14，15，16，17或18的方法，其中以血糖控制受損為特征的紊亂是空腹葡萄糖受損。
23.權利要求14，15，16，17或18的方法，其中以血糖控制受損為特征的紊亂是X綜合征。
24.權利要求14，15，16，17或18的方法，其中以血糖控制受損為特征的紊亂是妊娠糖尿病。
25.權利要求14，15，16，17或18的方法，其中以血糖控制受損為特征的紊亂是葡萄糖代謝受損(IGM)。
26.權利要求14，15，16，17或18的方法，其中以血糖控制受損為特征的紊亂是對DPP4抑制劑有反應的紊亂。
27.一種鑒定性狀和TCF1基因的至少一個基因型或單元型之間的相關性的方法，包括比較顯示該性狀的群體中所述基因型或單元型的頻率和參考群體中所述基因型或單元型的頻率，其中基因型或單元型包括位于多態(tài)性位點483A＞G的核苷酸對或核苷酸，其中性狀群體的基因型或單元型頻率高于參考群體的，表明該性狀與該基因型或單元型相關。
28.權利要求26的方法，其中性狀是對靶向TCF1或DPP4的藥物的臨床反應。
29.一種治療患有以血糖控制受損為特征的紊亂的個體的方法，包括(a)確定個體中存在的TCF1基因的兩個拷貝在多態(tài)性位點483A＞G處的核苷酸對的身份，其中，(b)如果兩個核苷酸對都是CG或如果一對是AT而一對是CG，則用低劑量血糖控制劑治療該個體，而如果核苷酸對都是AT，則用高劑量血糖控制劑治療該個體。
30.權利要求29的方法，其中血糖控制劑是二肽基肽酶4(DPP4)抑制劑。
31.權利要求29的方法，其中血糖控制劑或療法包括給予2-吡咯烷甲腈，1-[[[2-[(5-氰基-2-吡啶基)氨基]乙基]氨基]乙?；鵠-，(2S)。
32.權利要求29的方法，其中血糖控制劑或療法包括給予1-[(3-羥基-金剛烷-1-基氨基)-乙?；鵠-吡咯烷-2(S)-甲腈。
33.權利要求29的方法，其中血糖控制劑或療法選自式I或式II的化合物。
34.權利要求29，30，31，32或33的方法，其中以血糖控制受損為特征的紊亂是2型糖尿病。
35.權利要求29，30，31，32或33的方法，其中以血糖控制受損為特征的紊亂是1型糖尿病。
36.權利要求29，30，31，32或33的方法，其中以血糖控制受損為特征的紊亂是葡萄糖耐量受損。
37.權利要求29，30，31，32或33的方法，其中以血糖控制受損為特征的紊亂是空腹葡萄糖受損。
38.權利要求29，30，31，32或33的方法，其中以血糖控制受損為特征的紊亂是X綜合征。
39.權利要求29，30，31，32或33的方法，其中以血糖控制受損為特征的紊亂是妊娠糖尿病。
40.權利要求29，30，31，32或33的方法，其中以血糖控制受損為特征的紊亂是葡萄糖代謝受損(IGM)。
41.權利要求29，30，31，32或33的方法，其中以血糖控制受損為特征的紊亂是對DPP4抑制劑有反應的紊亂。
42.一種治療患有以血糖控制受損為特征的紊亂的患者的方法，包括(a)給患者和患者家庭提供遺傳咨詢，(b)確定該患者TCF1基因在多態(tài)性位點483A＞G的基因型，(c)基于基因型確定結(jié)果，確定所述患者的適當療法。
43.一種優(yōu)化血糖控制劑的臨床試驗設計的方法，包括(a)確定考慮包括在臨床試驗中的個體中存在的TCF1基因的兩個拷貝在多態(tài)性位點483A＞G的核苷酸對的身份，其中，(b)如果兩個核苷酸對都是CG，或如果一對是AT而一對是CG，那么該個體包括在臨床試驗中，如果核苷酸對都是AT，則不包括該個體。
44.一種鑒定患有以血糖控制受損為特征的個體將受益于藥物A還是B的方法，包括(a)確定個體中存在的TCF1基因的兩個拷貝在多態(tài)性位點483A＞G的核苷酸對的身份，其中，(b)如果兩個核苷酸對都是CG，或如果一對是AT而一對是CG，那么該個體將受益于血糖控制劑或療法，如果核苷酸對都是AT，該個體將受益于替代性血糖控制療法。
45.一種用于確定哪些患有以血糖控制受損為特征的紊亂的個體可以用血糖控制劑治療而具有降低的副作用的方法，包括確定個體中存在的TCF1基因的兩個拷貝在多態(tài)性位點483A＞G的核苷酸對的身份，其中，如果兩個核苷酸對都是CG，或如果一對是AT而一對是CG，那么可以用較低劑量血糖控制劑治療該個體并伴隨較少的副作用，而如果核苷酸對都是AT，則必須用較高劑量血糖控制劑治療該個體且因此副作用較大。
46.一種確定患有以血糖控制受損為特征的紊亂的個體對血糖控制劑或療法治療的反應性的方法，包括(a)確定個體中存在的TCF1基因的兩個拷貝在與TCF1 483A＞G多態(tài)性位點連鎖不平衡的TCF1基因區(qū)域中的多態(tài)性位點處的核苷酸對的身份，和(b)如果與多態(tài)性位點483A＞G連鎖不平衡的TCF1基因區(qū)域中的多態(tài)性位點處的核苷酸對指示，在TCF1多態(tài)性位點483A＞G處兩個核苷酸對都是GC或一對是AT而一對是GC，則將該個體分配到良好反應組，而如果所述核苷酸對指示在TCF1483A＞G位點處兩對核苷酸都是AT，則將該個體分配到低反應組。
47.一種鑒定患者TCF1多態(tài)性位點483A＞G的多態(tài)性模式的試劑盒，所述試劑盒包括用于確定TCF1多態(tài)性位點483A＞G的遺傳多態(tài)性模式的工具。
48.根據(jù)權利要求47的試劑盒，其還包括DNA樣品收集工具。
49.根據(jù)權利要求47或48的試劑盒，其中用于確定TCF1多態(tài)性位點483A＞G的遺傳多態(tài)性模式的工具包括至少一個TCF1基因分型寡核苷酸。
50.根據(jù)權利要求47至49之任一的試劑盒，其中用于確定TCF1多態(tài)性位點483A＞G的遺傳多態(tài)性模式的工具包括兩個TCF1基因分型寡核苷酸。
51.根據(jù)權利要求47至50之任一的試劑盒，其中用于確定TCF1多態(tài)性位點483A＞G的遺傳多態(tài)性模式的工具包括至少一個含有至少一個TCF1基因分型寡核苷酸的TCF1基因分型引物組合物。
52.根據(jù)權利要求51的試劑盒，其中TCF1基因分型引物組合物包括至少兩組等位基因特異性引物對。
53.根據(jù)權利要求50至52之任一的試劑盒，其中兩個TCF1基因分型寡核苷酸包裝在分開的容器中。
54.根據(jù)權利要求1，14，29，43，44或46之任一的方法，其中確定步驟(a)還包括使用根據(jù)權利要求47-53之任一的試劑盒。
55.根據(jù)權利要求1-46之任一的方法，其中所述方法離體實施。
全文摘要
本發(fā)明涉及應用TCF1基因的483 A＞G單核苷酸多態(tài)性和血糖控制紊亂，特別是糖尿病和葡萄糖代謝受損患者對血糖控制劑如DPPIV抑制劑的臨床反應之間的新的相關性。本發(fā)明提供了對患者進行分類以進行治療和/或優(yōu)化臨床研究的方法和基于此相關性治療患者的方法。
文檔編號A61K31/4439GK1604968SQ02825179
公開日2005年4月6日 申請日期2002年10月30日 優(yōu)先權日2001年10月31日
發(fā)明者T·E·休斯, C·N·拉韋丹, M·H·波利梅羅普羅斯 申請人:諾瓦提斯公司