專利名稱：2－O－(β－D－吡喃葡萄糖基)抗壞血酸、其生產方法以及包含含有它的組合物的食品和 ...的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新的前維生素C，其與公知的前維生素C物質，如2-O-(α-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸相比在體內具有提高的穩(wěn)定性、延長的半衰期和長效活性。本發(fā)明還涉及一種新的中間產物，2-O-(四-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸，還涉及使用2-O-(四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸衍生物作為中間產物生產2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的方法，還涉及從植物中提取2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的生產方法，特別是從枸杞屬植物，枸杞(L.chinense Mill.)、寧夏枸杞(L barbarum L.)或其相關的種中提取2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的生產方法，還涉及包含所得的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的組合物，關于2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的酶生產方法，或者包含6-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸和2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的組合物，以及涉及這些組合物用作食品或化妝品的應用。
現(xiàn)有技術維生素C已知具有多種生理作用，例如膠原合成，其缺乏是壞血病的主要病因因素，其用作一種消除體內產生的自由基的生物抗氧劑，有助于細胞色素C發(fā)生鐵離子氧化-還原反應，并具有抗癌、免疫激活和膽固醇生產抑制以及因此的抗動脈硬化作用。
對于皮膚，它表現(xiàn)出多種作用，包括光老化抑制作用、紫外損害防護作用和色素沉著抑制作用，通過抗氧化和膠原合成促進作用，因此用作化妝品中的一種添加劑(Fragrance Journal，Vol.25，Special Issue，Mar，1997)。還在食品和化妝品中加入它作為抗氧劑。維生素C的一個主要缺點是它對光、熱、氧和金屬離子極不穩(wěn)定。
已研究多種修飾來改善維生素C的穩(wěn)定性或改變它的性能以改善其在體內的停留和吸收(Nihon Rinsho，Vol.57，No.10，p.170，1999)。
已嘗試在作為維生素C的抗氧化部分及其不穩(wěn)定性來源的2，3-烯二醇的羥基處引入取代基，以產生更為穩(wěn)定形式的維生素C，已知為“前維生素C”。實例包括在2-羥基位置引入硫酸酯基(Biochemistry，8，2652，1969)或磷酸酯基(Gazz.Chim.Ital.，91，964，1961和Chem.Pharm.Bull.，17，381，1969)。這些化合物與常規(guī)的維生素C相比具有大大提高的穩(wěn)定性，并已知通過硫酸酯酶或磷酸酶的體內和細胞外水解轉化為維生素C。這些衍生物已用于化妝品和準藥品。維生素C的穩(wěn)定形式也是已知的，其在2-或3-羥基處被糖基化。這些包括用糖基轉移酶得到的2-O-(α-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸(Biochim.Biophys.Acta，1035，44，1990，日本未審專利公開HEI Nos.3-135992、3-139288，3-183492、5-117290)、用半乳糖苷酶得到的2-O-(β-D-吡喃半乳糖基)抗壞血酸(日本未審專利公開HEI No.6-263790)和通過化學合成得到的3-O-(-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸(日本未審專利公開SHONos.53-98954、58-198498)等。
其中，大多數(shù)研究的完成基于2-O-(α-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸，其目前用于化妝品和準藥品并正接受批準作為食物添加劑的審查。2-O-(α-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸類似于抗壞血酸-2-磷酸酯，在多種氧化條件下高度穩(wěn)定，且在酸性條件下在很大程度上更加穩(wěn)定?？诜r，2-O-(α-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸通過胃腸粘膜中存在的α-葡萄糖甙酶水解并轉化成維生素C活性形式。它還通過培養(yǎng)細胞的細胞膜內存在的酶而適度水解，從而持續(xù)表現(xiàn)出維生素C的作用。
雖然與抗氧化穩(wěn)定性的改善無關，但在6-位的抗壞血酸的脂肪酸酯，例如易溶于脂溶性物質的6-O-棕櫚酰和硬脂?？箟难幔米魇称诽砑觿┲械氖称房寡趸瘎?。而且，6-葡萄糖苷已被酶合成(Vitamins，43，205，1971；Biochim.Biophys.Acta，1035，44，1990；日本未審專利公開HEI No.5-320185)。5-葡萄糖苷還被公開為酶合成2-O-(α-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的副產物(日本未審專利公開HEI No.5-112594)。
因此，許多前維生素C物質是已知的，但β-D-葡萄糖苷，特別是2-O-葡萄糖苷物質，尤其是本發(fā)明的新的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸化合物是未知的。而諸如公開β-D-吡喃葡萄糖基L-抗壞血酸衍生物不可能在體內分解的日本未審專利公開HEI No.3-13599等文獻，教導β-葡萄糖苷不可能在體內利用并因此是沒有用的。
日本未審專利申請Sho 53-98954描述了2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸和多種抗壞血酸衍生物，但沒有提供具體的生產實施例，且據信即使采用這些實施例中的方法進行實際合成，3-羥基也將優(yōu)先被糖基化，隨后產生在3-糖基化產物的2位發(fā)生糖基化的2，3-二葡萄糖苷。因此好像不可能獲得僅在2位具有β-葡糖基化的產物。
關于β-D-吡喃葡萄糖基L-抗壞血酸衍生物的酶合成的唯一報道是由來自杏仁的β-葡萄糖苷酶，使用纖維二糖作為β-糖基供體生產6-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸(Agric.Biol.Chem.，54，1697，1990)。在這種情況下，6-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的轉化產率是非常低的數(shù)值1.5％，且2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的生產沒有提及。因此，2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸通過酶法合成的情況完全是未知的。
枸杞(Lycium chinense Mill.)(中國枸杞)，一種茄科植物，在古代中國醫(yī)學文本《本草綱目》(Compendium of Materia Medica)中列為一種精美食品，它的果實已知為枸杞子，其葉子已知為枸杞葉可食用，其根皮稱為地骨皮用作一種中草藥(Genshoku WakanyakuZukan[Illustrated Compendium of Oriental Drugs]，Vol.I，289，1980)。枸杞(Lycium chinense Mill.)包含甜菜堿、胡蘿卜素、煙酸和玉米黃質，并已知具有降血糖、抗高血壓、抗脂肪肝和肝功能保護作用。特別地，抗脂肪肝和肝功能保護作用歸因于甜菜堿，其用作甲基供體(Folia Pharmacol.Japon，56，151，1960)。而且枸杞屬植物提取物已知促進生長和乳酸菌產酸(C.A.6420530b，1965)。
但是，在枸杞屬植物組成中的維生素C衍生物的存在是未知的。
發(fā)明概述作為關注于枸杞屬植物無數(shù)作用及其活性成份的廣泛研究的結果，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)其中含有的一種新的物質，并通過確定該物質為2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸而完成本發(fā)明的一個方面。因此，本發(fā)明提供新的物質2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸，包含從枸杞屬植物提取的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的組合物和它們的生產方法。
本發(fā)明的新的物質用作前維生素C。β-葡萄糖苷酶已知以膜結合形式存在于小腸組織，并以細胞質形式存在于肝和腎組織(FEBSLetters，436，71，1998)，其中由于α-葡萄糖苷酶廣泛分布在唾液、腸消化液和小腸道，其中推測徑口攝取時物質將分解成抗壞血酸。Yamamoto等人(J.Pharmacobio-Dyn.13，688，1990)的報道描述在大鼠口服實驗中僅在血液中檢測到抗壞血酸，因此建議通過較不廣泛分布的β-葡萄糖苷酶分解和活化而不是通過在體內廣泛分布的α-葡萄糖苷酶活化，在轉運進入組織和長期作用方面將更為有利，因此前維生素C的β-葡萄糖苷預期表現(xiàn)出甚至更為理想的性能。
在研究本發(fā)明的新的化合物，2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的活性時，發(fā)現(xiàn)它由于與2-O-(α-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸相比在體內具有改善的穩(wěn)定性和延長的作用而作為一種非常有用的前維生素C。此外，研究了其用于食品和化妝品的工業(yè)生產方法，并在通過建立化學合成和提取天然植物的生產方法以及酶生產方法而完成本發(fā)明。
因此，本發(fā)明提供新的物質2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸，其具有優(yōu)于2-O-(α-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的生理作用，并預期用于化妝品、準藥品、藥品和食品領域；本發(fā)明還提供2-O-(四-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸作為新的中間產物，還提供通過中間產物化學合成2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的生產方法，包含通過從植物，特別是枸杞屬植物，枸杞(L.chinense Mill.)，寧夏枸杞(L.barbarum L.)中提取的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的組合物的生產方法，用β-D-糖基轉移酶生產包含2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的組合物的方法，還提供包含所得的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的組合物，和包含此組合物的食品和化妝品。
本發(fā)明還提供包含通過用糖基轉移酶反應而得到的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸或6-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的組合物。它還進一步提供一種用于容易地從含有2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的溶液中除去污染物的方法以及以較高含量和較高純度工業(yè)化規(guī)模生產2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸產品的方法。
在本說明書通篇中，術語“組合物”指任何包含2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的不同組合物，包括來自含有2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的植物的具有增大的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸含量的提取物，或者通過使用β-糖基轉移酶使抗壞血酸與β-D-葡萄糖苷化合物反應得到的包含2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的反應產物。
在本說明書通篇中，術語“前維生素C”總體上指本身表現(xiàn)出微弱的或無維生素C活性，但在體內分解產生維生素C的化合物，以及包含這些化合物的組合物。
附圖的簡要說明

圖1是表示從枸杞子中提取的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的離子交換色譜的結果的圖。
圖2表示通過使用圖1的級分19-25的部分進行高效液相色譜處理而進一步純化2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸，并將1H-NMR與化學合成產品進行比較的結果。上圖是來自枸杞子的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的圖譜，而下圖是化學合成的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的圖譜。
圖3表示酶合成的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸(物質Y)與化學合成的產物進行1H-NMR比較的結果。上圖是化學合成的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的圖譜，而下圖是酶反應產物2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸(物質Y)的圖譜。
圖4表示酶合成6-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸(物質X)與化學合成2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的HSQC譜比較結果。上圖是酶反應產物6-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸(物質X)的光譜，而下圖是化學合成2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的譜。
圖5表示先施用2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸對抗由紫外線B(UVB)照射誘導人皮膚表皮角質細胞(HaCaT)的細胞死亡的保護作用。
圖6表示2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸對人皮膚表皮角質細胞的細胞內抗壞血酸濃度的作用。
圖7表示2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸對正常人真皮成纖維細胞(NHDF)的膠原合成的促進作用。
圖8表示在口服100mg/kg的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸之后的大鼠門脈血和血漿濃度。
圖9表示2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸對正常人真皮成纖維(NHDF)細胞的群體倍增水平(PDLs)的作用。2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸表現(xiàn)出顯著的壽命支持作用。即，在不存在抗壞血酸衍生物的情況下在NHDF在老化至PDL 20.1而死亡時，而存在該抗壞血酸衍生物的情況下NHDF的PDL增大2.62倍。結果表明NHDF的終身細胞供應能力增大22.62，而本發(fā)明的抗壞血酸衍生物將對保護皮膚以防老化和補充皮膚死亡細胞有重要的貢獻。
圖10表示2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸對端粒長度減小速度的作用。加入2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸將在不存在任何抗壞血酸衍生物的情況下平均降低速度225bp/PDL縮小至94bp/PDL。由于細胞老化致死時的臨界端粒長度已知恒定，因此認為本發(fā)明抗壞血酸衍生物通過將端粒長度縮小至臨界長度的速度縮小大約42％而表現(xiàn)出對細胞系壽命的延長作用。
描述本發(fā)明者對2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的合成方法進行廣泛地研究，以產生含有在枸杞屬植物中發(fā)現(xiàn)的新的物質2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的理想的前維生素C，并發(fā)現(xiàn)可使用2-O-(四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸作為中間產物進行化學生產。在進一步熱心考察以找尋含有2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的植物和微生物時，發(fā)現(xiàn)2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸存在于枸杞屬植物和枸杞子中。
他們還發(fā)現(xiàn)，2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸通過纖維素酶的糖基轉移反應產生，而2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸實際上是優(yōu)越的前維生素C，其與2-O-(α-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸相比，在紫外B照射人皮膚表皮角質細胞時抑制細胞死亡并顯著地促進正常人真皮成纖維細胞的膠原合成。本發(fā)明在這些發(fā)現(xiàn)的基礎上完成，并以以下為基礎。
作為一種前維生素C表現(xiàn)出比2-O-(α-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸更優(yōu)越的性能的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的生產可以通過使用2-O-(四-O-酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸作為中間產物合成方法，從包含2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的天然物質中提取的方法，和酶合成方法來實現(xiàn)。
在合成方法中，將相應的抗壞血酸衍生物的3-羥基選擇性芐基化得到3-O-芐基-5，6-O-異亞丙基抗壞血酸，將其與酯保護的葡萄糖1-碳酸酯縮合，然后脫異亞丙基和脫芐基得到產物。
在從天然物質提取的方法中，可以通過用熱水或水-醇提取茄科植物，特別是枸杞屬植物的新鮮或干燥的果料(枸杞子)而得到含有2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的組合物。如果需要的話，可以由這種組合物進一步純化2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸。2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸還通過纖維素酶的糖基轉移反應進行酶合成而得到包含2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的組合物。如果需要的話，還可以由這種組合物純化2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸。
本發(fā)明表明，2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸在紫外B照射人皮膚表皮角質細胞時顯著抑制細胞死亡，并顯著促進正常人真皮成纖維細胞的膠原合成，它在細胞內轉化成維生素C且通過口攝入吸收，因此預期用于皮膚化妝品或皮膚保護劑，并作為維生素C用于食品。
優(yōu)選實施方案本發(fā)明提供2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸，其具有優(yōu)于2-O-(α-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的生理作用，并預期用于化妝品、準藥品、藥品和食品領域；本發(fā)明還提供2-O-(四-O-乙?；?p-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸作為它的中間產物，還提供一種通過中間產物化學合成2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的生產方法，還提供包含通過從植物，特別是枸杞屬植物，枸杞(L.chinense Mill.)，寧夏枸杞(L.barbarum L.)或其相關的含有2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的種中提取的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的組合物。
本發(fā)明還提供包含通過糖基轉移酶反應得到的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸或6-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的組合物。本發(fā)明還提供一種易于從含2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的溶液中除去污染物的方法和以工業(yè)化規(guī)模生產具有較高含量和較高純度的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的產品的方法。
現(xiàn)在將更為詳細地解釋本發(fā)明。
1)合成中間產物2-O-(2，3，4，6-四-O-?；?β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸中間產物2-O-(2，3，4，6-四-O-酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸可以下述方式合成。具體而言，通過已知方法(J.Med.Chem.，31，793，1988)將商購得到的5，6-O-異亞丙基抗壞血酸在3-羥基位選擇性芐基化，以產生3-O-芐基-5，6-O-異亞丙基抗壞血酸。通過常規(guī)的糖基化反應將作為糖苷配基的這種3-O-芐基化化合物糖基化，得到2-O-(2，3，4，6-四-O-?；?β-D-吡喃葡萄糖基)-3-O-芐基-5，6-O-異亞丙基抗壞血酸。例如，(2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖基)碳酸酯(Komura，H.，Tokyo Institute of Technologydoctoral thesis，1977)可以通過在100-200℃下與在非極性溶劑中的或不含溶劑的3-O-芐基化化合物一起加熱而得到。所用的碳酸酯可以是烷基、鹵代烷基或任選取代的芳基-碳酸酯?；蛘?，(2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖基)鹵化物可以用于在鹵代烴溶劑如氯仿或二氯甲烷或芳烴溶劑如苯或甲苯中，在汞鹽或銀鹽存在下，并在加入脫水試劑的情況下進行反應(Lodd′s Chemistry of CarbonCompounds IF，320，1967，Elsevier)。
2-O-(2，3，4，6-四-O-?；?β-D-吡喃葡萄糖基)-3-O-芐基-5，6-O-異亞丙基抗壞血酸的異亞丙基可以用酸性催化劑水解除去。例如，脫異亞丙基反應可以在40-100℃下，在30-80％乙酸水溶液中進行?；蛘?，它可以在室溫至回流溫度下，在丙酮或甲基乙基酮中，在對甲苯磺酸存在下完成。實際上可以將水用于該反應。
2-O-(2，3，4，6-四-O-?；?β-D-吡喃葡萄糖基)-3-O-芐基抗壞血酸的芐基可以通過常規(guī)的氫解除去。例如，脫芐基化反應可以在質子極性溶劑如乙酸或醇，或者非極溶劑如苯、甲苯或乙酸乙酯中，在氫存在下，使用鈀-碳、鈀黑、鈀-碳或鈀黑作為催化劑來完成。
脫保護步驟可以相反的順序完成。也就是，在2-O-(2，3，4，6-四-O-?；?β-D-吡喃葡萄糖基)-3-O-芐基-5，6-O-異亞丙基抗壞血酸的脫芐基化反應之后，所得的2-O-(2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖基)-5，6-O-異亞丙基抗壞血酸可以用酸催化劑脫異亞丙基化。
標題中間產物，2-O-(2，3，4，6-四-O-?；?β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸，可以與上述相同的方式獲得。
乙?；鶅?yōu)選作為標題中間產物的酰基。
2)化學合成2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸可以通過堿水解2-O-(2，3，4，6-四-O-?；?β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的?；@得。所用的堿可以是氫氧化鈉或氫氧化鉀水溶液，碳酸鹽如碳酸鉀、碳酸鈉、碳酸氫鉀或碳酸氫鈉的水溶液，或者金屬醇化物如甲基化鈉。溶液可以包含醇，例如甲醇和乙醇以溶解原料2-O-(2，3，4，6-四-O-酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸。反應溫度最佳為0℃至室溫。反應溶液用鹽酸、硫酸或陽離子交換樹脂中和。在鹽酸或硫酸的情況下，需要除去產生的鹽，但在陽離子交換樹脂的情況下由于鈉和鉀鹽的吸附因而不需要脫鹽步驟。中和的溶液可以凍干或減壓濃縮得到目標化合物。根據目的，化合物還可以通過柱色譜法純化。
3)通過從枸杞屬植物枸杞、寧夏枸杞提取而生產包含2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的組合物直接或在粉碎后將枸杞屬植物枸杞、寧夏枸杞的新鮮或干燥的果實(枸杞子)浸泡在含水溶劑，例如熱水或乙醇水溶液，通過固體/液體分離得到的提取物減壓濃縮或凍干，或者噴霧干燥，以得到含有2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的提取物。浸泡期間的醇濃度優(yōu)選為10-95％，而浸泡優(yōu)選持續(xù)3-7天。
枸杞子提取物中的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸含量一般為0.86-1.2％，但具有甚至更高含量的組合物可以由下述的方法獲得。具體而言，將枸杞子提取物溶于蒸餾水，或者將通過將原料浸泡在5-50體積，優(yōu)選8-10體積的溶劑而得到的提取物用蒸餾水稀釋，然后通過強堿性離子交換樹脂，例如DowexTM1-X8(Dow ChemicalCo.)或Amberlite IRA-400(Rohm & Haas Co.)以吸附2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸。
在用水完全洗滌之后，通過使用乙酸等酸溶液逐步洗脫或梯度洗脫得到含有目標物質的級分。將此級分減壓濃縮或凍干以除去乙酸，由此產生含有大約30-50％的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的組合物。
4)通過酶法生產包含2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的組合物對商購酶制劑進行廣泛研究發(fā)現(xiàn)酶制劑纖維素酶″Onozuka″和Pancelase BR(Yakult Pharmaceutical Ind.Co.，Ltd.)、Cellulosin(Hankyu Kyoei Bussan)、纖維素酶(Sigma)、β-葡萄糖苷酶(Toyobo)和β-葡萄糖苷酶(Nacalai Tesque)表現(xiàn)出β-糖基轉移酶活性。用于本發(fā)明的糖基轉移酶可以是任何作用于包括含β-糖基化合物和抗壞血酸的溶液而由糖基化反應合成2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的糖基轉移酶，且其來源和類型沒有限制；但是從產率的立場來看，優(yōu)選來自木霉屬(Trichoderma)的纖維素酶和來自杏的β-葡萄糖苷酶。
用于轉移酶反應的纖維二糖和抗壞血酸濃度優(yōu)選盡可能地高，優(yōu)選分別為大約0.3M和0.2M。作為酶底物的纖維二糖可以另一種含β-糖基的化合物提供，例如與適宜水解酶組合的高分子量葡聚糖，如纖維素或羧甲基纖維素。
可以通過常規(guī)方法將各種酶固定在適宜的載體上以形成酶反應器，從而促進有效地生產2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸。另一方面，從穩(wěn)定性和反應轉移產率的立場來看，用作轉移反應中的受體的抗壞血酸優(yōu)選為游離酸，但抗壞血酸還可以鹽如堿金屬鹽或堿土金屬鹽或者它們的混合物的形式使用。進一步發(fā)現(xiàn)，異抗壞血酸，游離酸形式或其鹽，同樣用作轉移反應的受體。因此，根據目的抗壞血酸或抗壞血酸衍生物可用于葡萄糖基轉移反應，并在大部分情況下可以根據需要適宜使用抗壞血酸鈉、抗壞血酸鈣等代替單獨的游離抗壞血酸。
考慮酶的最佳pH，酶反應在pH范圍為2-8，優(yōu)選pH 4-6的水溶液中進行?？紤]酶的穩(wěn)定性和最佳溫度，反應溫度為20-60℃，但優(yōu)選保持在在約30-40℃。
加入酶的量優(yōu)選為20-400單位(其中1單位是每分鐘釋放1μmol對硝基酚的酶活性)每克纖維二糖。
酶可以一次性加入，但也可以加入數(shù)次，同時通過高效液相色譜法監(jiān)測反應。還可以通過將酶固定在作為酶反應器的適宜的樹脂支持物如離子交換樹脂或疏水樹脂上進行反應。大約1-4天的反應時間是充足的，但反應完成點可以在監(jiān)測反應時確定。
如果需要的話，反應完成時產生的組合物中的抗壞血酸衍生物可以通過常規(guī)分離方法如膜分離法、離子交換柱色譜法、活性碳柱色譜法、液相色譜法、硅膠柱色譜法等進一步純化。例如，作為強酸性陽離子交換樹脂，可以適宜地使用堿金屬鹽類型、堿土金屬鹽類型或H+-類型磺化苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物樹脂。商購的產品包括Dowe×TM50W×8(the Dow Chemical Company)、AmberliteTMCG-120(Rohm & Haas Co.)和DiaionTMSK104(Mitsubishi ChemicalIndustries Co.，Ltd.)。通過色譜法分離的未反應的抗壞血酸和含β-糖基的化合物可以用作下一輪酶反應的原料。
為了獲得較高的產物純度，可以通過高效液相色譜法進行純化。具體而言，可以通過使用糖/有機酸分析柱和揮發(fā)性酸如乙酸、三氟乙酸等或者ODS柱與升華甲酸銨的組合，以及用于分析酸性物質的揮發(fā)性離子對試劑二正丁基胺乙酸鹽得到純產物。目標物質的鑒定可以通過相對于化學合成的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸比較分析質譜或核磁共振譜來完成。
2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸可以適于食品、化妝品或藥物的鹽形式使用。鹽的實例可以提及無機或有機堿鹽，包括鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽和胺鹽。2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸可以在羥基上被容易在體內降解的離去基團取代。這些離去基團可以提及乙?；?C2)、丙?；?C3)、丁?；?C4)、辛?；?C8)、棕櫚酰基(C16)和硬脂?；?C18)。
5)2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸活性(1)對紫外照射損害的抑制作用與相同濃度的抗壞血酸或2-O-(α-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸相比，2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸明顯表現(xiàn)出較強的阻止紫外B(UVB)照射誘導人皮膚表皮角質細胞(HaCaT)的細胞死亡的效果。
已知如果用接近陽光波長光譜(290-400nm)的光照射無毛小鼠皮膚部分，則在小鼠皮膚的抗氧化因素中抗壞血酸(維生素C)的減少發(fā)生最快速(Photodermatol.Photoimmunol.Photomed.，10(5)，183，1994)。而且，由UVB照射去毛的豚鼠背部皮膚而誘導的皮膚炎癥可以通過外部應用抗壞血酸或2-O-(α-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸而得到抑制，其中2-O-(α-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的效果較大(Fragrance Journal，Vol.25，No.3，p.55，1997)。已報道持續(xù)3天至1周每天給豬皮膚施用10％抗壞血酸水溶液緩解紫外光損害(Br.J.Dermatol.，121，247，1992)。
但是，本發(fā)明2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸抗由紫外照射誘導的皮膚炎癥或其它紫外光損害的效果大于抗壞血酸或2-O-(a-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的效果。如上述，據信此原因是它與2-O-(α-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸相比具有優(yōu)越的組織滲入性能和具有較長的活性期。
在人皮膚表皮角質細胞的細胞內抗壞血酸濃度方面，2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸還在最長的時間內保持較高濃度。這種由2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸導致的細胞內抗壞血酸的高濃度保持貢獻于它保護細胞抵抗UVB照射的活性。同樣清楚的是2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸用作在細胞內轉化為抗壞血酸的前維生素C。
2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的活性(2)防止皺紋和下垂檢查正常人真皮成纖維細胞(NHDF)的膠原合成表明與2-O-(α-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸或抗壞血酸相比2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸活性增大。這還認為是由于較高的細胞內抗壞血酸濃度延長導致的。也就是，認為抗壞血酸的膠原合成促進作用甚至發(fā)生在來自皮膚的成纖維細胞，發(fā)揮皮膚再生和重建的功能。實際上已報道，作為一種穩(wěn)定形式的抗環(huán)血酸，抗壞血酸2-磷酸酯應用于燒傷受害者促進無瘢痕愈合(Lecture Summaries of theJapanese Cosmetic Science Society，p.50，1998)。另一方面，抗壞血酸還已知抑制膠原降解酶，和降解皮膚彈性必需的彈性蛋白的酶(Bioantioxidant Provitamin C，p.63，1999，F(xiàn)ragranceJournal Co.)。這些數(shù)據表明2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸抗皺紋和下垂的效果。
2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的活性(3)增白根據抗壞血酸抑制酪氨酸酶從而抑制黑色素合成，和人應用含2-O-(α-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的乳膏抑制由紫外照射導致的色素沉著(Fragrance Journal，Vol.25，No.3，p.55，1997)的事實，強烈暗示2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸具有類似的增白效果，并且其強于2-O-(α-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的效果。
2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的活性(4)經口攝入的動力學在大鼠口攝入2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸時，在血液檢測到未轉化的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸，這表明它以未轉化的形式通過腸道吸收。另一方面，如上述，大鼠口攝入2-O-(α-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸導致在血液中檢測不到未轉化的形式，因而在吸收時它幾乎在腸道中完全分解并在血液中作為抗壞血酸存在(J.Pharmacobio-Dyn.，13，688，1990)。也就是說，在口攝入時，2-O-(α-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸作為抗壞血酸被吸收，且更可能在血液中快速降解。另一方面，2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸仍以其未轉化的形式存在于血液并未經轉化遷移進入組織，因而它更有可能在組織和細胞中被活化成抗壞血酸。
以上的實驗結果和觀察清楚地表明，2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸和包含它的組合物作為允許將抗壞血酸有效遷移至身體和組織中的前維生素C是用于保護皮膚并保持健康皮膚的前維生素C的優(yōu)良形式，并可以用于皮膚化妝品和皮膚保護劑或食品。
6)包含2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的組合物當包含本發(fā)明的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的組合物用作皮膚化妝品或皮膚保護劑時，其數(shù)量可以在寬范圍之內并沒有特別限制，但通常占組合物總量的0.1-30wt％，優(yōu)選0.5-10wt％。在組合物形式中，可以適宜地將其與其它常用于化妝品的組分，例如油組分、表面活性劑、紫外吸收劑、低級醇、防腐劑、殺菌劑、著色劑、粉末、芳香劑、水溶性聚合物、緩沖劑等組合，只要不損害本發(fā)明的效果。這些組合物不僅可以用作皮膚化妝品，還可以用作洗液、乳液、乳膏、包裝、肥皂或其它藥用化妝品等形式的準藥品，或者用作洗液、乳液、乳膏、軟膏或其它皮膚外用形式的藥物。
當包含本明的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的組合物用作食物時，它可以與關于2-O-(α-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的日本專利2832848所述的相同的方式應用于食品，以制備維生素C強化食品。具體引述日本專利2832848，由于它與包括酸、咸、澀、辛、苦等多種不同滋味的不同物質相容，且它具有高酸耐受性和熱耐受性，因此它可以用作多同常規(guī)食品和調料，例如以下不同類型的調味品中的維生素C強化劑、調味增強劑、酸調料、品質改良劑、穩(wěn)定劑、抗氧劑等如醬油、粉狀醬油、腌豆醬、粉狀腌豆醬、非精制清酒、腌肉、魚粉、蛋黃醬、調味料、醋、清酒/大豆/醋醬、粉狀壽司醋、中國調料、天麩羅肉湯、面湯、醬油、蕃茄醬、烤肉汁、咖哩粉、燉料、湯料、儲備料、混合調味品、甜清酒、低醇甜清酒、蔗糖和咖啡糖；日本甜料如大米餅干、大米餅干塊、小米/大米餅、干燥生面團餅、淀粉糊、大米糕、填豆醬的面包、甜大米凝膠、黃豆凝膠、甜黃豆糊、軟甜豆糊、甜球狀物、凝膠、castella海綿蛋糕和咖啡；甜食，例如面包、餅干(biscuit)、餅干(cracker)、小甜點、餡餅、布丁、奶油膨脹糕、華夫餅干、海綿蛋糕、油炸圈餅、巧克力、口香糖、焦糖和糖果；冰凍甜點如冰淇淋和冰凍果子露；糖漿，例如果漿和冷凍甘露；敷劑和糊劑，例如加糖奶油漿、乳蛋糕乳脂、花糊、花生糊和果實糊；壓榨的顆?；蚴卟水a品，例如果子醬、果醬、糖漿和增甜果實；加工的谷產物，例如面包、面條、米產品和人工肉產品；脂肪和油產品，例如色拉油和人造黃油；腌汁如腌制的蔬菜片、新鮮的蘿卜泡菜、腌制的蕪菁和腌制的青蔥；腌制的儲備物如腌制的蘿卜儲備物和腌制的卷心菜儲備物；家畜產品如火腿和香腸；魚肉產品如魚火腿、魚香腸、水煮魚醬、搗爛魚糕和海膽子醬；精美食品如腌墨魚或魷魚、醋泡昆布、干燥的墨魚帶和曬干的河豚；醬油煮的蔬菜或由紫菜制成的魚、可食用野生植物、干燥的墨魚、小魚或牡蠣；蔬菜食物，例如水煮黃豆、馬鈴薯沙拉、昆布卷和天婦羅；奶產品，例如煮雞蛋、牛奶飲料、奶油和干酪；瓶裝或罐裝魚肉、家畜肉、果實和蔬菜；液劑，例如合成清酒、調味清酒、果子酒和西方酒精飲料；軟飲料，例如咖啡、可可、果汁、碳酸飲料、乳酸飲料和乳酸菌飲料；和多種瞬時產品，例如布丁混合物、烤餅混合物、果汁混合物、咖啡混合物、紅豆湯混合物、湯混合物等。它還可以方便地用作飼料或者草料中的維生素C強化劑、調味增強劑、抗氧化劑、味覺改善劑等，用于飼養(yǎng)動物如牲畜、家禽、蜜蜂、蠶、魚等。
發(fā)明效果本發(fā)明提供新的物質2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸，其具有優(yōu)于2-O-(α-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的生理作用，并預期用于化妝品、準藥品、藥品和食品領域；本發(fā)明還提供2-O-(四-O-乙?；?p-D-比喃葡萄糖基)抗壞血酸作為它的新中間產物，和使用中間產物生產2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的方法，和通過提取和純化枸杞屬植物而生產含有2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的組合物的方法，和包含來自枸杞屬植物的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的組合物。
本發(fā)明還提供包含通過糖基轉移酶反應得到的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸或6-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的組合物。它還提供易于從含有2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的溶液中除去污染的方法和工業(yè)大規(guī)模生產具有較高含量和較高純度的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的產品的方法。
實施例現(xiàn)在將通過實施例更為詳細地解釋本發(fā)明，且本發(fā)明的范圍根本不受這些實施例的限制。
實施例1合成2-O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸在將5，6-O-異亞丙基抗壞血酸(2g，9.3mmol)溶于DMSO(20ml)之后，加入碳酸鉀(1.3g，9.4mmol)和芐基溴(1.1ml，9.3mmol)，并將混合物于50℃下攪拌4小時。將水加到反應溶液，然后用1NHCl酸化，用乙酸乙酯萃取，用水洗滌，然后用飽和鹽水洗滌，用無水MgSO4干燥，減壓濃縮，并用硅膠色譜法(AcOEt/正己烷＝3∶1)純化得到1.1g 3-O-芐基-5，6-O-異亞丙基抗壞血酸(39％產率)。
將此芐基衍生物(0.6g，2.0mmol)和2，3，4，6-四-O-乙?；?1-O-(2，2，2-三氯乙氧基羰基)-β-D-吡喃葡萄糖(2.1g，4.0mmol)的混合物在120-130℃下加熱熔化。反應3小時后，通過柱色譜法(25％-50％AcOEt/正己烷的梯度)純化反應溶液得到850mg 2-O-(2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖基)-3-O-芐基-5，6-O-異亞丙基抗壞血酸(67％產率)。
將此葡萄糖苷(850mg，1.3mmol)溶于乙酸乙酯(40ml)，并加入10％Pd-C(200mg)進行氫解。2小時后，濾出催化劑，并將濾液濃縮得到大約750mg 2-O-(2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖基)-5，6-O-異亞丙基抗壞血酸。
將脫芐基化合物(500mg，0.9mmol)溶于乙酸(5ml)、加入水(5ml)，并將混合物于50-60℃下加熱1.5小時，同時進行攪拌。在濃縮反應溶液之后，用乙酸乙酯萃取所得的殘余物，用水洗滌，然后用飽和鹽水洗滌，用無水MgSO4干燥，并減壓濃縮，然后用乙酸乙酯/己烷重結晶所得的殘余物得到320mg 2-O-(2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸(48％產率)。
1H-NMR(δppm，DMSO-d6)；1.94-2.01(12H)，3.42(3H，m)，3.7-4.3(4H，m)，4.7-5.1(4H，m)，5.3-5.4(2H，m)，12.00(1H，br)。
FABMS(+)m/z507。
實施例2合成2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸在將2-O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸(300mg，0.6mmol)溶于甲醇(10ml)之后，加入在水(9ml)中的碳酸鉀(600mg)的溶液，并將混合物攪拌30分鐘。用IR-120(H+)中和反應溶液，濾出樹脂，并用甲醇和50％甲醇水溶液進行洗滌。
合并并濃縮濾液和洗滌液，然后加入水，并將混合物凍干得到2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸，為無定形結晶(190mg，100％產率)。
1H-NMR(δppm，D2O)；3.1-3.3(4H，m)，3.4-3.5(3H，m)，3.58(1H，d)，3.80(1H，t)，4.61(1H，d)，4.66(1H，d)。
FABMS(-)m/z337。
實施例3測定枸杞屬植物的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸含量將通過室溫下將3g不同的干燥植物在10倍體積的70％乙醇中浸泡7天得到的提取物用1.5％偏磷酸/5M KOH(pH3.5)稀釋10倍，并將其用作鑒定天然存在的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的試驗樣品，其依據是化學合成的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸在高效液相色譜法中的保留時間為2.63分鐘(Shimadzu Co.，Ltd.的LC-10Ai系統(tǒng)；柱Inertsil ODS-3(GL Science Co.，Ltd.，4.6×150mm，5μm)，流動相20％MeOH-20mM磷酸鹽-5mM四正戊基溴化銨，流速1.0mL/分，柱溫35℃，檢測波長254nm)。結果是，在來自內蒙古枸杞(Lycium barbarum L.)、寧夏枸杞(Lyciumbarbarum L.)和河北枸杞(Lycium Chinese Mill)的提取物中發(fā)現(xiàn)對應于2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的峰。在通過加入2倍量的70％的乙醇至100g寧夏枸杞(Lycium barbarum L.)的新鮮果實而類似制備的樣品中發(fā)現(xiàn)相同的峰。在減壓濃縮5ml液體萃取物之后通過凍干和體重測定來測定各固體提取物。考慮使用固體提取物和化學合成產品所得的校準曲線、提取物的濃度和稀釋程度，確定提取物的含量為0.86％-1.2％。
實施例4純化枸杞子中的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸在用Tosho Co.，Ltd.提供的Model TS-10M片劑粉碎機粉碎100g寧夏枸杞(Lycium barbarum L.)之后，加入800mL 30％乙醇以在室溫下浸泡6天，然后過濾，減壓濃縮并凍干得到65.7g產品。將1.94g部分提取物(2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸含量0.86％)溶于蒸餾水以制成40mL(pH4.5，電導率1.7mS/cm)。使樣品在SV＝1下通過Dowex 1-X8柱(乙酸酯形式，1.5×12cm)。然后用大約10個柱體積(200mL)的蒸餾水洗滌，用0-0.1M乙酸進行線性梯度洗脫(100mL×2)，用0.1-1.0M乙酸進行線性梯度洗脫(100mL×2)，然后用1.0M乙酸洗脫。測定280nm下的吸光率，并通過高效液相色譜法與化學合成產品的保留時間進行比較來檢查2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的洗脫。儀器和柱溫與實施例1相同，但其它條件改成以下。柱Inertsil ODS-3(GL Science Co.，Ltd.，3.0×150mm，5μm)，流速0.3mL/分，檢測波長245nm，流動相2％MeOH-0.2 M KH2PO4/H3PO4(pH 3.0)-0.2mM EDTA-0.5mM十二烷基三甲基氯化銨。在這些條件下化學合成的產品2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的保留時間為6.5分鐘。高效液相色譜法檢測的結果是，發(fā)現(xiàn)如果采用0.1-1.0M乙酸線性洗脫(26mg，對級分19-25的總產率為78％，50％純度)，則吸附到柱上的物質在級分19-25中洗脫。結果如圖1所示。
將對應于2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的級分19-25部分供給高效液相色譜以得到高純度產物。條件如下。Gilson Co.的LC系統(tǒng)(Type 305主泵，Type 116 UV檢測器)，柱ODS-UG-5(4.6×250mm，5μm，Nomura Chemical Co.，Ltd.的產品)，流動相5％甲醇/20mM甲酸銨/5mM二丁基胺乙酸鹽，流速0.5mL/分，檢測波長254nm，以0.5分鐘增量使用FC-203 Type B FractionCollector(Gilson Co.)進行分級收集。減壓濃縮并凍干對應的級分，將其溶于氧化氘，測定其核磁共振光譜，并與化學合成產物比較。結果如圖2所示。
實施例5酶合成2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸根據化學合成的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸在GilsonCo.的LC系統(tǒng)中的保留時間為5.2分鐘來檢查商購得到的纖維素酶，β-葡萄糖苷酶和β-葡聚糖酶試劑(Type 305主泵，Type 116 UV檢測器)，柱Inertsil ODS-3(DL Science Co.，Ltd.，4.6×150mm，5pm)，流動相20％MeOH-20mM磷酸鹽-5mM四正戊基溴化銨，流速0.5ml/分，檢測波長254nm)。用10mM乙酸鹽緩沖液(pH5.0)將酶反應系統(tǒng)溶解至1ml，其中0.3M纖維二糖和0.2M抗壞血酸。然后往其中加入50μl酶溶液部分，并將于37℃下啟動反應。在100℃下加熱5分鐘以終止反應之后，用高效液相色譜法分析產生的β-D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸。結果是，在纖維素酶(Sigma)、β-葡萄糖苷酶(Toyobo，Nacalai Tesque)、Cellulosin T2(Hankyu KyoeiBussan)、纖維素酶″Onozuka″RS、″Onozuka″FA和PancelaseBR(Yakult Pharmaceutical Ind.Co.，Ltd.)中發(fā)現(xiàn)β轉葡糖基活性。游離抗壞血酸出現(xiàn)在4.0分鐘的位置，但在與3.6分鐘和5.2分鐘的相鄰的位置也觀察到峰，且這些峰分別指代物質X和物質Y。物質X的轉葡糖基率為15.7％，而物質Y為0.8％。當物質X和Y與化學合成產物共同進行色譜處理時，物質X符合6-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的保留時間，而物質符合r2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的保留時間。
在通過使用截留分子量為10,000的UF膜除去污染的蛋白之后，通過使用高效液相色譜法進行分級而除去游離抗壞血酸[Gilson Co.的LC系統(tǒng)(Type 305主泵，Type 116 UV檢測器)，柱SUGARSH1011(Showa Denko Co.，Ltd.)，流動相0.1M乙酸，流速0.5mL/分，柱溫30℃，檢測微分折射計，0.25ml級分]。在級分29-31中洗脫含有物質X和物質Y的級分，并以96％產率獲得24.7μg樣品。
然后將其應用于高效液相色譜法以得到高純度產品。條件如下。Gilson Co.的LC.系統(tǒng)(Type 305主泵，Type 116UV檢測器)，柱ODS-UG-5(4.6×250mm，5μm，Nomura Chemical Co.，Ltd.的產品)，流動相5％甲醇/20mM甲酸銨/5mM二正丁基胺乙酸鹽，流速0.5mL/分，檢測波長254nm，以0.5分鐘增量使用FC-203 TypeB Fraction Collector(Gilson Co.)進行分級。將對應于物質X和物質Y的級分減壓濃縮、凍干并溶于氧化氘，測定核磁共振光譜，并與化學合成2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸進行比較。在HSQC光譜中，化學合成產物的抗壞血酸部分的4位、5位和6位碳的化學位移分別為73、73和66ppm，而物質X的4位、5位和6位的化學位移均為73ppm，因此較低磁場的位移僅見于6位碳。因此斷定物質X為6-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸。
因此斷定在與化學合成的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的一維NMR光譜進行比較中匹配的物質Y是2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸。結果如圖3和圖4所示。
實施例6轉移酶反應條件1)硫酸銨分級將纖維素酶試劑(Sigma)溶于20mM乙酸鹽緩沖液(pH5.0)至濃度為4％，連續(xù)加入20％梯度飽和的硫酸銨溶液以制備0-20％、20-40％、40-60％和60-80％飽和硫酸銨沉淀級分。在將各級分溶于20mM乙酸鹽緩沖液(pH5.0)之后，根據實施例5確認轉移產物。結果發(fā)現(xiàn)硫酸銨中的轉移活性為20-40％飽和的級分。
2)pH的作用對于0.3M纖維二糖和0.2M游離抗壞血酸的濃縮物，將試驗物質溶于1ml，并用0.1M乙酸鹽緩沖液調節(jié)至不同的pH水平。往其中加入50μl部分酶溶液以在37℃下反應40小時。反應后，通過高效液相色譜法分析產生的(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸。
結果如表1所示。在pH3或更高的pH時發(fā)現(xiàn)轉葡糖基化產物，且在pH5下反應產生0.8％的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸，在pH6下反應產生1.0％的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸。而且在pH5下反應產生11.8％的6-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸，而在pH6下反應產生11.2％的6-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸。
表1
3)與抗壞血酸衍生物的反應對于0.3M纖維二糖和游離抗壞血酸、抗壞血酸鈉、抗壞血酸鈣、游離異抗壞血酸和異抗壞血酸鈉各0.2M，將試驗物質溶于1ml，并用0.1M乙酸鹽緩沖液調節(jié)至不同的pH水平。往其中加入50μl部分酶溶液以在37℃下反應20小時，然后以與上述相同的方式分析(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸。
結果如表2所示。每種抗壞血酸衍生物用作轉移反應受者，且各種都產生2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)衍生物。
表2
4)部分純化在硫酸銨沉淀酶蛋白之后將纖維素酶試劑(Sigma)、纖維素酶″Onozuka″RS和Pancelase BR(Yakult Pharmaceutical Ind.Co.，Ltd.)各自應用于用20mM乙酸鹽緩沖液(pH5.0)平衡的Q-瓊脂糖離子交換樹脂(Amersham Pharmacia Biotech Co.)，并在流過的級分中發(fā)現(xiàn)轉移活性。結果如表3所示。
表3
5)酶固定作為食物添加劑銷售的酶試劑Pancelase BR除了酶(5％)之外包含95％的乳糖。
在將6g Pancelase BR酶試劑加到60ml 20mM乙酸鹽緩沖液(pH5.0)之后，將混合物應用于用相同的緩沖液平衡的MarathonWBA(2ml樹脂，Dow Chemical Co.的產品)，得到流過的級分。然后將硫酸銨加到20％飽和，并將混合物固定在用20％飽和硫酸銨/20mM乙酸鹽緩沖液(pH5.0)平衡的Chitopearl BCW3510(2ml樹脂，F(xiàn)ujiSpinning Co.，Ltd.的產品)，以制備固定的酶。將固定的酶樹脂加到溶解0.35g抗壞血酸和1g纖維二糖的10ml 20％飽和的硫酸銨/20mM乙酸鹽緩沖液(pH5.0)，并在37℃下反應。結果如表4所示。
表4
實施例7(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的純化將20mg部分纖維素酶試劑(Sigma)溶于1ml 20mM乙酸鹽緩沖液(pH5.0)，將混合物應用于用相同緩沖液平衡的Marathon WBA(0.5ml樹脂，Dow Chemical Co.的產品)，獲得流過的級分。將酶溶液加到已溶解0.35g抗壞血酸和1g纖維二糖的10ml 20mM乙酸鹽緩沖液(pH5.0)，并將混合物于37℃下反應2天以得到含有11.8％的6-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸和0.8％的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的反應溶液。用UF膜過濾溶液，除去酶，并使所得的溶液(pH4.3，電導率1.6mS/cm)以SV＝2.5通過Dowex 1-X8柱(乙酸酯形式，1.5×12cm)。然后用大約10柱體積(200mL)的蒸餾水洗滌，用0-0.1M乙酸進行線性梯度洗脫(80mL×2)，并用0.1-1.0M乙酸進行線性梯度洗脫(80mL×2)。分級連續(xù)產生高6-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸含量的級分(級分65-68)、高的未反應抗壞血酸含量的級分和高的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸含量的級分(級分101-108)。收集級分101-108作為高2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸含量級分(2.4mg，45％產率)。
實施例82-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸對紫外線B(UVB)照射誘導的人皮膚表皮角質細胞(HaCaT)的細胞死亡的保護作用將人皮膚表皮角質細胞系HaCaT(一種由海德堡大學Fusenig教授提供的細胞系)以10,000細胞/孔于具有包含10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)的24孔平板培養(yǎng)，并在18小時后用UVB(最大波長312nm)以35毫焦耳/平方厘米(mJ/cm2)照射細胞。在照射前2小時，加入20-100μM的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸，并在照射前沖洗除去。在PBS中，在不存在化學試劑的情況下進行照射，然后在包含10％FBS的DMEM中繼續(xù)培養(yǎng)，并在照射后24小時通過使用2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓一鈉鹽(WST-1)測定線粒體脫氫酶活性而測定存活細胞數(shù)。結果如表5所示。關于比較，以類似的方式檢查2-O-(α-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸和抗壞血酸，其結果也如圖5所示。
實施例92-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸對人皮膚表皮角質細胞的細胞內抗壞血酸濃度的作用將人皮膚表皮角質細胞HaCaT以370,000的細胞數(shù)于100mm直徑的皿中培養(yǎng)。培養(yǎng)16小時后，加入溶于含有10％FBS和40％的24小時無血清的HaCaT培養(yǎng)液的DMEM的100μM 2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸。在加入后3-24小時移出培養(yǎng)基，用冰冷的PBS進行二次沖洗，并用胰蛋白酶處理細胞片得到分離的細胞。將其懸浮在包含50μM二硫蘇糖醇(DTT)的PBS中，并通過離心沖洗3次。用Potter類型聚四氟乙烯均化器將接受二次冷凍-融化的細胞在冰上破碎30秒。在5℃下將細胞勻漿離心，并將如此分離的上清液保存在冰上。用Molcut(Nihon Millipore Co.，Ltd.的產品；高壓超過濾單元，名義上的分子量限制(NMWL)10,000，聚醚砜膜)處理上清液，并通過高效液相色譜法(TOSO Co.，Ld.提供的AS-8020系統(tǒng)，柱Shodex ODSpak(4.6×150mm，Showa Denko Co.，Ltd.的產品)，流動相0.1M KH2PO4-H3PO4(pH2.35)-0.1mM EDTA-2Na，流速1.5mL/分)，使用電量電化學檢測器(ESA Co.Bedford，MA，200mV)分析細胞內抗壞血酸的數(shù)量。結果如圖6所示。關于比較，以類似的方式檢查2-O-(α-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸和抗壞血酸，結果也如圖6所示。
實施例102-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸對正常人真皮成纖維細胞(NHDF)的膠原合成的促進作用將正常人真皮成纖維細胞(NHDF)以370,000的細胞數(shù)量置于100mm直徑的培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)16小時后，加入100μM溶于包含10％FBS和40％的24小時-無血清的NHDF培養(yǎng)溶液的DMEM培養(yǎng)基的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸。再過1小時后，加入0.12mL(120μCi)L-[2，3-3H]脯氨酸，并繼續(xù)培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)后除去移出培養(yǎng)基，并有PBS沖洗細胞片4次。然后用胰蛋白酶處理細胞，用堿溶解，然后中和得到細胞內蛋白。根據用液體閃爍計數(shù)器使用Scintisol EX-H測放射性來測定用梭狀芽胞桿菌膠原酶消化此蛋白所得的級分。未用膠原酶處理的細胞內蛋白質級分也根據使用液體閃爍計數(shù)器得到的放射性來測定。放射性的差異計算和/或記錄為膠原合成活性。結果如圖7所示。關于比較，以類似的方式檢查2-O-(α-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸和抗壞血酸，結果也如圖7所示。
實施例11大鼠腸吸收2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸使用飼養(yǎng)管讓購自Nihon Charles River Co.的過夜挨餓且清醒的10周大Wistar雄性大鼠(n＝3)口服劑量為100mg/kg的在Milli-Q超純水(Millipore Corporation)(100mg/4mL)中的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的溶液。在0、0.5、2和4小時之后從肝門靜脈中收集肝素化血樣并通過離心(6000×g，10min)分離各樣品的血漿。在加入當量的冰冷的10％偏磷酸(包含40mM去鐵胺甲磺酸鹽之后，將混合物離心(10,000×g，10分鐘)以得到除去蛋白的肝靜脈血漿，其中未轉化的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸和抗壞血酸濃度通過高效液相色譜法(Shimadzu Co.，Ltd.的LC-10Ai系統(tǒng)，柱Inertsil ODS-3(GL Science Co.，Ltd.，3.0×150mm，5μM)，流動相15％MeOH-17mM KH2PO4/H3PO4(pH3.5)-5mM四正戊基溴化銨，流速0.3mL/分，柱溫35℃，檢測波長254nm)測定。在施用之后最大數(shù)量的30分鐘內發(fā)現(xiàn)存在未轉化的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸和代謝產物(抗壞血酸)。結果示于圖8。
這些結果表明本發(fā)明的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸是從穩(wěn)定性和延時的活性的立場看具有比2-O-(α-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸優(yōu)越的生理作用的前維生素C。因此，它預期用于食品、化妝品和準藥品或藥品領域。此外，2-O-(四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸是一種用于生產2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的新的中間產物。包含2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的組合物可以通過提取枸杞屬植物得到。除了化學合成之外，2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸還可以通過糖基轉移酶反應得到。
實施例122-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸對人真皮成纖維細胞群體倍增(PDL)水平的作用將正常人真皮成纖維細胞(NHDF)以370,000的細胞密度置于100mm直徑培養(yǎng)皿。在補充10％FBS的DMEM中培養(yǎng)16小時后，以10％FBS強化并補充40％含100μM 2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的家常條件(domestic-conditioned)培養(yǎng)基的DMEM代替培養(yǎng)基。持續(xù)培養(yǎng)46-188小時直至細胞達到接近匯合狀態(tài)。通過單獨培養(yǎng)NHDF至接近匯合狀態(tài)，進一步在不含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時，并收集培養(yǎng)上清液而制備家常條件培養(yǎng)基，在冰箱中儲存，并在3天內使用。關于以上46-188小時的培養(yǎng)，每3天用新鮮的以10％FBS強化并補充含有100μM 2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的40％家常條件培養(yǎng)基的DMEM更換培養(yǎng)基。當更換培養(yǎng)基時，計算舊培養(yǎng)基中的細胞數(shù)，并將其用于PDL評價。粘附在平板上的細胞數(shù)通過Coulter計數(shù)器計算。將培養(yǎng)開始時的PDL值看作0，然后由以下方程計算PDL值PDL＝log2(回收細胞數(shù)/接種細胞數(shù))。
結果如圖9所示。關于比較，進行類似的試驗，用2-O-(α-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸和抗壞血酸代替2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸，結果也如圖9所示。
實施例132-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸對端粒長度減小速度的作用用不裂解端粒序列的限制酶處理來自NHDF細胞的基因組DNA提取物，并制備含有完整長度的端粒的DNA片段(末端限制片斷，TRF)。通過電泳分離TRF，并用與端粒特異性結合的標記探針測量端粒DNA長度。用于此研究的方法的細節(jié)如Life Sciences，Vol.63，No.11，935-948(1998)所述。
由NHDF細胞制備TRF和瓊脂糖凝膠電泳通過胰蛋白酶處理分散來自人皮膚表皮的成纖維細胞(NHDF)，將其以106/管加到1.5ml管中，以1,200rpm在4℃下離心2分鐘，并棄去上清液。用1ml不含RNase的PBS(-)將沉淀洗滌二次，盡可能充分地移出上清液，并將細胞于-80℃下保存。將冷凍的樣品恢復至室溫，利用IsoQuick核酸提取試劑盒(ORCA Research Inc.)提取基因組DNA。將提取的DNA溶于在4℃下保存的10mM Tris-HCl、1mMEDTA，pH8.0。通過熒光讀數(shù)器(Cytofluor 2350，MilliporeCorporation)和DNA結合試劑Hoechist 33258測定DNA含量，并通過用HinfI處理進行限制消化而制備TRF。限制消化如下完成。往1.5ml試管中加入2μl 10×H緩沖液(TakaRa，Kyoto)、提取的基因組DNA(2μg)、無菌水補充至19μl，和最后加入1μl HinfI(6U/μl，TaKaRa，Kyoto)。反慶在37℃下進行3-4小時，并在-20℃下保存混合物。制備瓊脂糖(I型，Sigma)凝膠平板，以橋和底床上瓊脂糖濃度分別為1％和0.8％。使用1×Boyer緩沖液(50mM Tris-Hcl，20mM乙酸鈉，2mM EDTA，18mM NaCl，pH8.0)。將0.5μg/通道的1kb DNA梯(GIBCO BRL)作為尺寸標記和與3μl上樣緩沖液混合的樣品加于凝膠，并在35V/cm下進行20小時的電泳。
轉印(Transblot)在電泳之后，切下瓊脂糖凝膠，并用溴化乙錠(2μg/ml)染色15分鐘，在UV透照器上完成凝膠照相。將凝膠浸泡在變性溶液(0.2NNaOH，0.6M NaCl)，并在室溫下振蕩25分鐘，然后用蒸餾水沖洗一次。再次將凝膠浸泡在中和溶液并振蕩30分鐘。將凝膠置于設置在有6x SSC的印跡裝置中的3MM濾紙上，并注意不引入任何空氣。然后連續(xù)地將用6xSSC預浸泡的硝化纖維濾膜(OPTITRAN BA-S85，Schleicher & Schuel)、3MM用6x SSC預浸泡的濾紙、紙巾、玻璃平板和重物(2kg)置于凝膠，并過夜完成印跡。在印跡之后，將濾膜浸泡在3x SSC中，并快速的排出水，然后用UV透照器檢查孔的位置。濾膜在濾紙之間，然后在80℃下將其加熱過夜(烘焙)。
標記(TTAGGG)4探針和雜交將烘焙的濾膜浸泡在3x SSC中，然后將其浸泡在雜交緩沖液(10xDenhart溶液，1MNaCl，50mM Tris-HCl(pH7.4)，10mM EDTA，0.1％SDS，50μg/ml變性鮭魚精液DNA)并通過在65℃下振蕩3-4小時而進行預雜交。在預雜交之后，將濾膜置于保護袋內，然后置于2ml已加入[32p]5′-末端標記的(TTAGGG)4探針(TakaRa)和1μl 10mg/ml變性鮭魚精液DNA的雜交緩沖液。將此袋封閉，以不引入泡沫。然后通過在50℃下將此袋培養(yǎng)過夜而完成雜交。
自動射線照相術在雜交之后，將濾膜浸泡在洗滌緩沖液(4x SSC，0.1％SDS)，并在55℃下振蕩15分鐘。在重復以上步驟4次以后，充分地排干濾膜上的水，然后在具有增光屏的盒內將濾膜與X射線膠片(Scientific Imaging Film，Kodak)裝在一起，過夜完成自動射線照相術。用激光密度計(Ultroscan XL，Pharmacia)檢測產生帶的TRF密度峰，并測定移動性。
結果如圖10所示。關于比較，得到2-O-(α-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸和抗壞血酸的結果并將其納入圖10。
權利要求
1.下式(1)代表的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸 或其生物可接受的鹽或酯。
2.一種包含從植物中提取的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的前維生素C組合物。
3.根據權利要求2的組合物，其中植物為茄科植物。
4.根據權利要求3的組合物，其中植物為枸杞屬植物，或者枸杞屬的新鮮或干燥果實。
5.一種通過提取植物而生產2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的方法。
6.根據權利要求5的生產方法，其中植物為茄科植物。
7.根據權利要求5或6的生產方法，其中植物為枸杞屬植物，或者枸杞屬的新鮮或干燥果實。
8.下式(2)代表的2-O-(四-O-?；?β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸 其中式中的各個R獨立地代表C1-5烷基。
9.權利要求8的化合物，其中式(2)中的所有R基團為乙?；?br> 10.一種使用2-O-(四-O-?；?β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸衍生物作為中間產物生產2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的方法。
11.一種通過使用β-D-糖基轉移酶進行抗壞血酸和β-D-糖基化合物的反應而生產2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的方法。
12.根據權利要求11的制備方法，其特征在于2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸是與6-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸一起產生產的。
13.根據權利要求11的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的生產方法，其特征在于β-D-糖基轉移酶是纖維素酶。
14.一種包含通過權利要求10-13之任一項的生產方法生產的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的前維生素C組合物。
15.一種包含通過權利要求10-13之任一項的生產方法生產的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸和6-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的前維生素C組合物。
16.一種包含根據權利要求1、2、3、4、14或15之任一項的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸或者含有它的組合物作為前維生素C的食品。
17.根據權利要求16的食品，所述食品是維生素C強化食品。
18.一種包含根據權利要求1、2、3、4、14或15之任一項的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸或者含有它的組合物作為前維生素C的紫外損害保護劑。
19.一種包含根據權利要求1、2、3、4、14或15之任一項的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸或者含有它的組合物作為前維生素C的增白化妝品。
20.一種包含根據權利要求1、2、3、4、14或15之任一項的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸或者含有它的組合物作為前維生素C的防皺紋/下垂化妝品。
21.一種包含權利要求1的2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)抗壞血酸或其生物可接受的鹽或酯或者權利要求2、3、4、14或15之任一項的組合物作為前維生素C組分的預防皮膚老化的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種新的作為前維生素C的抗壞血酸衍生物，其與公知的2－O－(α－D－吡喃葡萄糖基)抗壞血酸相比具有改善的體內穩(wěn)定性和延長的體內周期。已從植物如寧夏枸杞(Lycium barbarum L.)和/或枸杞(Lycium chinense Mi11.)中提取了包含新的化合物2－O－(β－D－吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的組合物。包含2－O－(β－D－吡喃葡萄糖基)抗壞血酸的組合物可以用β－D－糖基轉移酶酶合成。純2－O－(β－D－吡喃葡萄糖基)抗壞血酸可以由這種組合物生產?；蛘?，2－O－(β－D－吡喃葡萄糖基)抗壞血酸可以通過化學合成生產。與對應的α－D－吡喃葡萄糖基衍生物相比，2－O－(β－D－吡喃葡萄糖基)抗壞血酸導致維生素C在被身體攝取時具有較高的穩(wěn)定性和較長的周期，因而極適于作為前維生素C用于化妝品和食品。
文檔編號A61K8/60GK1610691SQ0282631
公開日2005年4月27日 申請日期2002年12月27日 優(yōu)先權日2001年12月28日
發(fā)明者前田滿, 中尾正宏, 深見治一 申請人:三得利株式會社