專利名稱：編碼一種g蛋白偶聯(lián)受體的核酸及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及編碼一種目前未知的G蛋白偶聯(lián)受體GAVE18的新型核酸分子，并涉及該核酸分子以及GAVE18的用途。
背景技術(shù)：
G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)是參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的一個(gè)大的整合膜蛋白家族。GPCRs對(duì)多種胞外信號(hào)包括神經(jīng)遞質(zhì)、激素、有味物質(zhì)和光發(fā)生反應(yīng)，并且可轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)以啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的第二信使反應(yīng)。許多治療藥物靶向GPCRs，因?yàn)檫@些受體可介導(dǎo)多種生理反應(yīng)，包括炎癥、血管舒張、心率、支氣管擴(kuò)張、內(nèi)分泌和蠕動(dòng)。
GPCRs的特征表現(xiàn)為具有胞外結(jié)構(gòu)域、七個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。此類受體行使的一些功能如結(jié)合配體和與G蛋白相互作用的功能與關(guān)鍵位置處某些氨基酸的存在有關(guān)。例如，許多研究表明GPCRs中氨基酸序列的差異導(dǎo)致了與天然配體或小分子激動(dòng)劑或拮抗劑親和性的差異。換句話說，序列中小的差異可導(dǎo)致不同的結(jié)合親和性和活性。(參見如Meng等人，生物化學(xué)雜志(J Bio Chem)(1996)271(50)32016-20；Burd等人，生物化學(xué)雜志(J Bio Chem)(1998)273(51)34488-95；和Hurley等人，神經(jīng)化學(xué)雜志(J Neurochem)(1999)72(1)413-21)。具體地說，研究表明在第三胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中氨基酸序列的差異可導(dǎo)致不同的活性。Myburgh等人發(fā)現(xiàn)促性腺素釋放激素受體的第3胞內(nèi)環(huán)中的丙氨酸261對(duì)于G蛋白偶聯(lián)和受體內(nèi)化是關(guān)鍵的(生物化學(xué)雜志(Biochem J)(1998)331(第3部分)893-6)。Wonerow等人研究了促甲狀腺素受體并證明第3胞內(nèi)環(huán)中的基因缺失可導(dǎo)致組成型受體活性(生物化學(xué)雜志(J Bio Chem)(1998)273(14)7900-5)。
一般而言，內(nèi)源配體與受體的結(jié)合作用導(dǎo)致該受體胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象改變，使得胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與胞內(nèi)組分G蛋白之間可偶聯(lián)。存在幾種G蛋白，如Gq、Gs、Gi、Gz和Go(參見如Dessauer等人，臨床科學(xué)(Clin Sci)(Colch)(1996)91(5)527-37)。受體的第三胞內(nèi)環(huán)(IC-3環(huán))及羧基末端與G蛋白相互作用(Pauwels等人，分子神經(jīng)生物學(xué)(Mol Neurobiol)(1998)17(1-3)109-135和Wonerow等人，見上文)。有些GPCRs相對(duì)于G蛋白而言是“泛主結(jié)合的”，即一種GPCR可與一種以上的G蛋白相互作用(參見如Kenakin，生命科學(xué)(Life Sciences)(1988)431095)。
配體激活的GPCR與G蛋白偶聯(lián)起始了信號(hào)級(jí)聯(lián)過程(稱為“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”)。此類信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)最終導(dǎo)致細(xì)胞活化或細(xì)胞抑制。
在細(xì)胞膜中的GPCRs以兩種不同的構(gòu)象平衡存在“無活性”狀態(tài)和“活性”狀態(tài)。處于無活性狀態(tài)的受體不能與胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑連接來產(chǎn)生生物學(xué)反應(yīng)(存在例外，如在轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中受體過表達(dá)時(shí)，參見如www.creighton.edu/Pharmacology/inverse.htm.)。構(gòu)象向活性狀態(tài)的轉(zhuǎn)變使得受體與轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(通過G蛋白)相連并產(chǎn)生生物學(xué)反應(yīng)。激動(dòng)劑結(jié)合并更可能使活性構(gòu)象產(chǎn)生。但有時(shí)如果在不存在任何激動(dòng)劑時(shí)已有相當(dāng)強(qiáng)的反應(yīng)，則稱此類受體具有組成型活性(即已處于活性構(gòu)象或配體不依賴的或自發(fā)的活性狀態(tài))。當(dāng)激動(dòng)劑加至此類體系中時(shí)，通?？捎^察到增強(qiáng)的反應(yīng)。但是，當(dāng)加入經(jīng)典的拮抗劑時(shí)，此類分子的結(jié)合不對(duì)受體產(chǎn)生作用。另一方面，某些拮抗劑可引起受體組成型活性的抑制，這暗示了后一類藥物在技術(shù)上不為拮抗劑，而為具有相反內(nèi)在活性的激動(dòng)劑。這些藥物稱為反向激動(dòng)劑(www.creighton.edu/Pharmacology/inverse.htm.)。
對(duì)受體的常規(guī)研究基于這樣的設(shè)想首先從內(nèi)源配體的鑒定開始，然后繼續(xù)向前推進(jìn)以確定拮抗劑和其它受體效應(yīng)分子。即使在首先發(fā)現(xiàn)了拮抗劑的情況下，教條式的反應(yīng)仍是須確定內(nèi)源配體(WO 00/22131)。但由于活性狀態(tài)對(duì)于測試篩選目的是最有用的，獲得此類組成型受體尤其是組成型GPCRs將允許在缺少內(nèi)源配體信息時(shí)易于分離激動(dòng)劑、部分激動(dòng)劑、反向激動(dòng)劑和拮抗劑。而且，對(duì)于由于受體活性紊亂而導(dǎo)致的疾病，通過使用處于自發(fā)活化狀態(tài)的受體進(jìn)行測試更易于發(fā)現(xiàn)引起組成型活性抑制的藥物，或更具體地降低有效活化受體濃度的藥物。例如作為可被轉(zhuǎn)染入患者體內(nèi)用于治療疾病的受體，此類受體的活性可用通過上述測試發(fā)現(xiàn)的反向激動(dòng)劑精細(xì)調(diào)節(jié)。
通常認(rèn)為疾病如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)具有炎性病因，其中涉及到T輔助細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞。當(dāng)前用皮質(zhì)類固醇進(jìn)行的抗炎治療對(duì)哮喘是有效的，但伴有代謝和內(nèi)分泌方面的副作用。可通過肺或鼻粘膜吸收的吸入制劑也可能有同樣問題。對(duì)RA或COPD目前尚缺乏滿意的經(jīng)口療法。
嗜酸性粒細(xì)胞在過敏及哮喘中介導(dǎo)大部分的呼吸道紊亂。白介素-5(IL-5)是嗜酸性粒細(xì)胞生長及活化的細(xì)胞因子。研究顯示IL-5對(duì)組織嗜酸性粒細(xì)胞增生及對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞介導(dǎo)的組織損傷而造成呼吸道過分反應(yīng)是必要的(Chang等人，J Allergy Clin Immunol(1996)98(5pt 1)922-931及Duez等人，Am J Respir Crit Care Med(2000)161(1)200-206)。在遺傳過敏性哮喘中，當(dāng)暴露于過敏原(例如，屋中塵螨抗原)后，T-輔助細(xì)胞-2(Th2)產(chǎn)生IL-5。
認(rèn)為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是由激活的巨噬細(xì)胞在受侵襲的滑膜中聚集所造成的。γ干擾素(IFNγ)是由T-輔助細(xì)胞-1(Th1)所分泌的具有許多促炎特性的細(xì)胞因子。它是最有效的巨噬細(xì)胞激活細(xì)胞因子并且可引起MHC II類基因轉(zhuǎn)錄而形成樹突細(xì)胞樣表型。
脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中引起炎性反應(yīng)的成分，其中包括腫瘤壞死因子α(TNFα)的釋放。靜脈注射抗TNFα對(duì)治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的效能已在臨床上得到證明。認(rèn)為肺部巨噬細(xì)胞的聚集也是造成慢性阻塞性肺病的原因，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生嗜中性粒細(xì)胞的化學(xué)引誘劑(例如IL-8de Boer等人，J Pathol(2000)190(5)619-626)。巨噬細(xì)胞及嗜中性粒細(xì)胞均釋放組織蛋白酶而造成肺泡壁的降解。認(rèn)為肺上皮細(xì)胞是炎性細(xì)胞化學(xué)引誘劑及其它炎性細(xì)胞活化劑的重要來源(參看例如，Thomas等，J Virol(2000)74(18)8425-8433；Lamkhioued等，Am J Respir Crit Care Med(2000)162(2Pt.1)723-732；及Sekiya等，J Immunol(2000)165(4)2205-2213)。
鑒于GPCRs在疾病中起作用并可通過調(diào)節(jié)GPCRs的活性來治療疾病，對(duì)以前未知的GPCRs的鑒定和描述可為開發(fā)新組合物和方法，用于治療涉及GPCR活性的疾病提供條件。因此，所需要的是發(fā)現(xiàn)、分離及鑒定編碼至今未知GPCRs的新型及有用的核酸分子。
另外亦需要這樣的測定法，所述測定法利用此類目前未知GPCRs去鑒定可作為特定GPCRs的潛在激動(dòng)劑或拮抗劑的分子。這些分子或許可作為調(diào)節(jié)體內(nèi)GPCRs活性的治療劑，且由此，治療與GPCR活性相關(guān)疾病的多血癥。
此處所引用的任何參考文獻(xiàn)不應(yīng)構(gòu)成承認(rèn)對(duì)本申請(qǐng)此類參考文獻(xiàn)可作為現(xiàn)有技術(shù)提供。
發(fā)明概述本發(fā)明鑒定并描述了新的組成型活性GPCR即GAVE18的表達(dá)，并提供了應(yīng)用該發(fā)現(xiàn)鑒定并治療相關(guān)疾病的組合物和方法。
因此廣泛地說，本發(fā)明延伸至這樣的分離的核酸分子，其包含圖5的DNA序列(SEQ ID NO1)、其變體、片段、類似物或衍生物。本發(fā)明的此變體可為等位基因變體、簡并性變體或?yàn)榭稍斐尚蛄泻啿⑿愿淖兊牡任换蜃凅w。
進(jìn)一步地本發(fā)明延伸至可與分離的核酸分子SEQ ID NO1或其變體在嚴(yán)格雜交條件下雜交的分離核酸分子。又進(jìn)一步地，本發(fā)明延伸至可與這樣的核酸分子在嚴(yán)格雜交條件下雜交的分離核酸分子，其中所述核酸分子互補(bǔ)于SEQ ID NO1的DNA序列。嚴(yán)格雜交條件在下文中描述。
進(jìn)一步地，本發(fā)明延伸至包含這樣DNA序列的分離核酸分子，所屬DNA序列編碼的多肽包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
任選地，上述本發(fā)明的分離核酸分子可被可檢測地標(biāo)記。此處應(yīng)用的可檢測標(biāo)記物的例子包括但不限于酶、放射性同位素或化學(xué)熒光物質(zhì)。特定可檢測標(biāo)記物的例子在下文中描述。
本發(fā)明也包含特定多肽。例如，本發(fā)明延伸至包含SEQ ID NO2的氨基酸序列的純化多肽、其保守性變體、其類似物或其衍生物。任選地，本發(fā)明的多肽可被可檢測地標(biāo)記。
此外，本發(fā)明延伸至抗體，其中本發(fā)明的多肽是用于產(chǎn)生抗體的免疫原?？贵w可為單克隆抗體或多克隆抗體。進(jìn)一步地，抗體可為″嵌合的″，例如，它們可包含在不同種動(dòng)物中針對(duì)本發(fā)明純化多肽所產(chǎn)生抗體的蛋白結(jié)構(gòu)域。在一特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可為″人源化的″。當(dāng)然，本發(fā)明的抗體可被可檢測地標(biāo)記。文中應(yīng)用的特定可檢測標(biāo)記物的例子在下文中描述。
本發(fā)明進(jìn)一步延伸至包含可操作地連接表達(dá)調(diào)控元件的核酸分子的表達(dá)載體，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO1的DNA序列、其變體、類似物或衍生物、或其片段。進(jìn)一步地，本發(fā)明的表達(dá)載體克包含這樣的分離核酸分子，其可在嚴(yán)格雜交條件下與包含可操作地連接表達(dá)調(diào)控元件的SEQ ID NO1的DNA序列的分離核酸分子雜交，或可在嚴(yán)格雜交條件下與這樣的雜交探針雜交，其中所述雜交探針互補(bǔ)于包含SEQ ID NO1的DNA序列的分離核酸分子，其中該雜交探針可操作地連接表達(dá)調(diào)控元件的核酸。已于此應(yīng)用的表達(dá)調(diào)控元件的具體例子為啟動(dòng)子?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的特定啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于hCMV的早期啟動(dòng)子、SV40的早期啟動(dòng)子、腺病毒的早期啟動(dòng)子、痘苗病毒的早期啟動(dòng)子、多瘤病毒的早期啟動(dòng)子、SV40的晚期啟動(dòng)子、腺病毒的晚期啟動(dòng)子、痘苗病毒的晚期啟動(dòng)子、多瘤病毒的晚期啟動(dòng)子、lac系統(tǒng)、trp系統(tǒng)、TAC系統(tǒng)、TRC系統(tǒng)、λ噬菌體的主要操縱基因和啟動(dòng)子區(qū)、fd外殼蛋白的調(diào)控區(qū)、3-磷酸甘油激酶啟動(dòng)子、酸性磷酸酶啟動(dòng)子或酵母α交配因子啟動(dòng)子。
可用本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并產(chǎn)生包含SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽、或其變體。宿主細(xì)胞可為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。已于此應(yīng)用的單細(xì)胞宿主的具體例子包括大腸桿菌(E.coli)、假單胞菌屬(Pseudonomas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈霉菌屬(Strepomyces)、酵母、CHO、R1.1、B-W、L-M、COS1、COS7、BSC1、BSC40、BMT10和Sf9細(xì)胞，此處僅提及部分。
進(jìn)一步地，本發(fā)明還延伸至用于產(chǎn)生這樣的經(jīng)純化多肽的方法，其中所述經(jīng)純化的多肽包含SEQ ID NO2的氨基酸序列、其變體或其片段。此類方法包括在提供該純化多肽表達(dá)的條件下，培養(yǎng)用本發(fā)明表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，然后從單細(xì)胞宿主、宿主細(xì)胞周圍的培養(yǎng)物或從這兩者回收純化多肽。
進(jìn)一步地，本發(fā)明延伸至用于鑒定可調(diào)節(jié)GAVE18活性的化合物的測試法。此類化合物可為GAVE18的激動(dòng)劑、拮抗劑或反向激動(dòng)劑。因此，本發(fā)明延伸至用于確定GAVE18的激動(dòng)劑的方法，該方法包括在存在內(nèi)源性配體時(shí)，將潛在的激動(dòng)劑與表達(dá)GAVE18的細(xì)胞接觸，并測定當(dāng)該潛在的激動(dòng)劑存在時(shí)，GAVE18的信號(hào)活性是否相對(duì)于不存在該潛在激動(dòng)劑時(shí)GAVE18的信號(hào)活性增強(qiáng)。
又，本發(fā)明延伸至用于鑒定GAVE18的反向激動(dòng)劑的方法。該方法包括將潛在的反向激動(dòng)劑與表達(dá)GAVE18的細(xì)胞接觸，并測定當(dāng)該潛在的反向激動(dòng)劑和內(nèi)源性配體或激動(dòng)劑存在時(shí)，GAVE18的信號(hào)活性是否相對(duì)于存在內(nèi)源性配體或激動(dòng)劑但不存在該潛在反向激動(dòng)劑時(shí)GAVE18的信號(hào)活性降低，并且在存在內(nèi)源性配體或激動(dòng)劑時(shí)也降低。
自然地，本發(fā)明延伸至用于鑒定GAVE18的拮抗劑的方法，該方法包括使?jié)撛诘霓卓箘┡c表達(dá)GAVE18的細(xì)胞接觸，并確定在所述潛在拮抗劑存在時(shí)GAVE18的信號(hào)活性是否相對(duì)于存在內(nèi)源性配體或激動(dòng)劑時(shí)GAVE18的活性降低。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供編碼GAVE18蛋白、其片段或其變體的分離的核酸序列。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供包含SEQ ID NO1的DNA序列的核酸分子變體，或在嚴(yán)格雜交條件下可與SEQ ID NO1雜交的核酸分子變體。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供GAVE18、其變體、片段、類似物或衍生物的氨基酸序列。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供包含這樣DNA序列的表達(dá)載體，其中所述DNA序列編碼GAVE18、其變體、片段、類似物或衍生物，該DNA序列可操作地連接至表達(dá)調(diào)控元件。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供抗體，所述抗體是以GAVE18、其變體、類似物或衍生物、或其片段作為免疫原產(chǎn)生的。
本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及用于鑒定可調(diào)節(jié)GAVE18活性的化合物的方法。此類調(diào)節(jié)劑可為GAVE18的拮抗劑、GAVE18的激動(dòng)劑或GAVE18的反向激動(dòng)劑。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于調(diào)節(jié)GAVE18活性的藥物組合物。此類調(diào)節(jié)可用于治療多種與GAVE18活性有關(guān)的疾病，例如，多種炎性疾病、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，此處僅提及部分。
通過參考下列詳細(xì)描述和附圖，本發(fā)明的這些和其它方面將更易于理解。
附圖簡述

圖1顯示GAVE18 DNA在不同類型組織中轉(zhuǎn)錄的Northern印跡，其中所述組織尤其是″免疫學(xué)相關(guān)″組織，例如胸腺及肝。
圖2顯示GAVE18 DNA在不同類型細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)的柱狀圖。
圖3顯示GAVE18 DNA在不同類型組織中相對(duì)表達(dá)的柱狀圖。
圖4GAVE18表達(dá)特性圖。該表達(dá)特性圖的數(shù)據(jù)顯示在經(jīng)腫瘤壞死因子α(TNFα)處理的NHBE(正常的人支氣管上皮細(xì)胞)中GAVE18的表達(dá)水平提高。在發(fā)炎組織中總能見到TNFα。此外，支氣管上皮細(xì)胞在哮喘中起重要作用。
圖5GAVE 18的DNA序列(SEQ ID NO1)。
圖6推定的GAVE18氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
發(fā)明詳述如以上所解釋的那樣，本發(fā)明涉及令人吃驚且意外地發(fā)現(xiàn)了一至今未知的核酸分子，其編碼文中稱為GAVE18的一至今未知G蛋白偶聯(lián)受體。具體而言，發(fā)現(xiàn)GAVE18在免疫組織或器官如腎臟、肝臟和小腸中表達(dá)。而且，令人吃驚且意外地發(fā)現(xiàn)在經(jīng)腫瘤壞死因子α(TNFα)處理的NHBE(正常的人支氣管上皮細(xì)胞)中GAVE18的表達(dá)水平提高，其中所述TNFα是在發(fā)炎組織中總能見到的一種蛋白質(zhì)。因此，改變GAVE18的活性可用于治療免疫相關(guān)的疾病和紊亂，如多種炎性疾病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
在本說明書和權(quán)利要求中為了描述本發(fā)明所使用的多種術(shù)語和短語如下此處所用的術(shù)語″調(diào)節(jié)劑″是指調(diào)節(jié)GAVE18活性的分子(例如但不限于配體和侯選化合物)。本發(fā)明的調(diào)節(jié)劑可為GAVE18的激動(dòng)劑、部分激動(dòng)劑、拮抗劑或反向激動(dòng)劑。
此處所用的術(shù)語“激動(dòng)劑”是指當(dāng)與受體結(jié)合時(shí)激活胞內(nèi)反應(yīng)或加強(qiáng)GTP與膜結(jié)合的分子(例如但不限于配體和侯選化合物)。
此處所用的術(shù)語“部分激動(dòng)劑”是指當(dāng)其與受體結(jié)合時(shí)，與激動(dòng)劑相比只在較小程度上激活胞內(nèi)反應(yīng)或只在較小程度上加強(qiáng)GTP與膜結(jié)合的分子(例如但不限于配體和侯選化合物)。
此處所用的術(shù)語“拮抗劑”是指與激動(dòng)劑在同一位點(diǎn)競爭性結(jié)合受體的分子(例如但不限于配體和候選化合物)。但拮抗劑不激活由受體的活性形式啟動(dòng)的胞內(nèi)反應(yīng)，并因此可抑制激動(dòng)劑或部分激動(dòng)劑引起的胞內(nèi)反應(yīng)。在一個(gè)相關(guān)的方面，當(dāng)不存在激動(dòng)劑或部分激動(dòng)劑時(shí)，拮抗劑不降低基線胞內(nèi)反應(yīng)。
此處所用的術(shù)語“反向激動(dòng)劑”是指可結(jié)合組成型活化受體并抑制基線胞內(nèi)反應(yīng)的分子(例如但不限于配體和侯選化合物)?；€反應(yīng)由受體的活性形式啟動(dòng)，該反應(yīng)低于當(dāng)缺乏激動(dòng)劑或部分激動(dòng)劑或減少GTP與膜結(jié)合時(shí)所觀察到的活性的正?；姿?。
此處所用的術(shù)語“侯選化合物”是指易接受篩選技術(shù)處理的分子(例如但不限于化學(xué)化合物)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該術(shù)語不包括選自GAVE18的激動(dòng)劑、部分激動(dòng)劑、反向激動(dòng)劑或拮抗劑的公知化合物。那些化合物是通過傳統(tǒng)的藥物開發(fā)方法鑒定的，所述方法涉及受體特異的內(nèi)源配體的鑒定和/或拮抗受體的侯選化合物的篩選，其中此篩選需用競爭試驗(yàn)來評(píng)估功效。
此處所用術(shù)語“組成型活化受體”或“自發(fā)活化受體”可互換，是指在不存在配體時(shí)被活化的受體。此類組成型活化受體可為內(nèi)源的(如GAVE18)或非內(nèi)源的；即可通過重組方法修飾GPCRs，以產(chǎn)生野生型GPCRs的突變組成型(參見如EP 1071701；WO 00/22129；WO 00/22131；以及美國專利號(hào)6,150,393和6,140,509，此處引用作為參考)。
此處所用術(shù)語“組成型受體活化”是指通過非受體與內(nèi)源配體或其化學(xué)等同物結(jié)合的方式使受體穩(wěn)定在活性狀態(tài)。
此處所用的術(shù)語“配體”是指結(jié)合另一分子的分子，其中所述結(jié)合另一分子的分子為例如但不限于激素或神經(jīng)遞質(zhì)，且進(jìn)一步地其中所述分子立體選擇性地與受體結(jié)合。
當(dāng)談到本發(fā)明的蛋白質(zhì)和核酸分子時(shí)術(shù)語“家族”是指兩種或多種具有表面上共同的結(jié)構(gòu)域并具有此處所定義的足夠的氨基酸或核苷酸序列同一性的蛋白質(zhì)或核酸分子。此類家族成員可天然存在并可來自相同或不同的物種。例如，一個(gè)家族可包含人源的第一種蛋白質(zhì)和鼠源的該蛋白質(zhì)的同系物(homolgue)，以及人源的第二種不同的蛋白質(zhì)和該第二種蛋白質(zhì)的鼠源同系物。家族成員也可具有共同的功能特征。
此處可互換的“GAVE18活性”、“GAVE18的生物活性”或“GAVE18的功能活性”是指根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在體內(nèi)或體外測得的由GAVE18蛋白、多肽或核酸分子對(duì)GAVE18效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生的活性。GAVE18活性可為直接活性或間接活性，其中所述直接活性如與第二蛋白質(zhì)的結(jié)合活性或?qū)Φ诙鞍踪|(zhì)的酶活性，其中所述間接活性如由GAVE18蛋白與第二蛋白質(zhì)相互作用介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)活性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，GAVE18活性包括至少一種或多種下列活性(i)與GAVE18信號(hào)途徑中的蛋白質(zhì)相互作用的能力；(ii)與GAVE18配體相互作用的能力；和(iii)與胞內(nèi)靶蛋白質(zhì)相互作用的能力。
進(jìn)一步地，根據(jù)本發(fā)明可使用本領(lǐng)域內(nèi)常規(guī)的分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。此類技術(shù)在下述文獻(xiàn)中進(jìn)行了全面的說明。參見如Sambrook，F(xiàn)ritsch & Maniatis，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第二版(1989)，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York(文中稱為″Sambrook等人，1989″)；DNA克隆實(shí)用方法(DNA CloningA Practical Approach)，卷I和II(D.N.Glover編輯1985)；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(M.J.Gait編輯1984)；核酸雜交(Nucleic Acid Hybridization)[B.D.Hames& S.J.Higgins編輯(1985)]；轉(zhuǎn)錄和翻譯(Transcription And Translation)[B.D.Hames & S.J.Higgins編輯(1984)]；動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)(Animal CellCulture)[R.I.Freshney編輯(1986)]；固定的細(xì)胞和酶(Immobilized CellsAnd Enzymes)[IRL Press，(1986)]；B.Perbal，分子克隆的實(shí)用指南(APractical Guide To Molecular Cloning)(1984)；F.M.Ausubel等人(編輯)，分子生物學(xué)最新方法(Current Protocols in Molecular Biology)，JohnWiley & Sons，Inc.(1994)。
因此，如果在文中出現(xiàn)，下列術(shù)語具有如下給出的定義。
″載體″為另一DNA片段可與其相連由此引起該連接的DNA片段復(fù)制的復(fù)制子，如質(zhì)粒、噬菌體或粘粒，此處僅提及部分?！鍙?fù)制子″是可作為體內(nèi)DNA復(fù)制的自主單元起作用的任一遺傳元件(例如質(zhì)粒、染色體、病毒)，即可在其自身調(diào)控下復(fù)制。載體的特定例子在下面進(jìn)行描述。
″盒″是指可在特定的限制性位點(diǎn)處插入載體的DNA片段。所述DNA片段編碼目的多肽，對(duì)盒和限制性位點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計(jì)以確保所述盒以正確的閱讀框插入，可進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯。
當(dāng)外源或異源DNA已導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)時(shí)，該細(xì)胞為已被此外源或異源DNA″轉(zhuǎn)染″。當(dāng)外源或異源DNA轉(zhuǎn)染引起了細(xì)胞表型改變，則該細(xì)胞為被所述DNA″轉(zhuǎn)化″。優(yōu)選地，該轉(zhuǎn)化DNA整合(共價(jià)連接)入組成細(xì)胞基因組的染色體DNA中。
″異源″DNA是指非天然存在于該細(xì)胞或細(xì)胞染色體位點(diǎn)中的DNA。優(yōu)選地，異源DNA包括該細(xì)胞的外源基因。
″同源重組″是指將載體的外源DNA序列插入染色體。具體而言，該載體靶向特定的染色體位點(diǎn)進(jìn)行同源重組。對(duì)特定的同源重組，載體包含足夠長的與染色體序列同源的區(qū)域，以允許載體的互補(bǔ)結(jié)合和摻入染色體。較長的同源區(qū)域和較高程度的序列相似性可提高同源重組的效率。
本發(fā)明的分離的核酸分子在一個(gè)方面，本發(fā)明延伸至這樣的分離核酸分子，其包含圖5的DNA序列(SEQ ID NO1)、其變體、片段、類似物或衍生物。
″核酸分子″是指核糖核苷(腺苷、鳥苷、尿苷或胞嘧啶；“RNA分子”)或脫氧核糖核苷(脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胸腺嘧啶或脫氧胞嘧啶；“DNA分子”)的磷酸酯聚合形式，或?yàn)槠淙我涣姿狨ヮ愃莆铮缌虼姿狨ズ土蝓?，以單鏈或雙螺旋形式存在?？蔀殡p鏈DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋。術(shù)語核酸分子，具體地說DNA或RNA分子，僅指該分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)，并且不將其限定為任一特定的三級(jí)結(jié)構(gòu)形式。因此，該術(shù)語包括以線性DNA分子或環(huán)狀DNA分子等存在的雙鏈DNA(如限制性片段)、質(zhì)粒及染色體。在討論特定雙鏈DNA分子的結(jié)構(gòu)時(shí)，根據(jù)常規(guī)慣例，序列在此描述為沿著DNA非轉(zhuǎn)錄鏈的5’至3’方向的序列(即該鏈的序列同源于mRNA)。″重組DNA分子″是經(jīng)分子生物學(xué)操作后的DNA分子。
“分離的”核酸分子是與存在于該核酸的天然源中的其它核酸分子相分離的核酸分子。特別是，“分離的”核酸沒有該核酸所來自的生物體的基因組DNA中編碼GAVE18的核酸的天然側(cè)翼序列(即位于該核酸5′和3′端的序列)。在不同的實(shí)施方案中，分離的GAVE18核酸分子可包含該核酸所來自的細(xì)胞基因組DNA中天然存在于該核酸分子側(cè)翼的小于約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列。而且，當(dāng)通過重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí)，“分離的”核酸分子如cDNA分子可基本上不含有其它細(xì)胞材料或培養(yǎng)基，或當(dāng)通過化學(xué)合成產(chǎn)生時(shí)，“分離的”核酸分子如cDNA分子可基本上不含有化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)。
本發(fā)明的核酸分子，如具有SEQ ID NO1核苷酸序列或該核苷酸序列的任一個(gè)片段或互補(bǔ)片段的核酸分子、或其類似物或衍生物，可應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)以及此處提供的序列信息進(jìn)行分離。通過標(biāo)準(zhǔn)的雜交和克隆技術(shù)(如Sambrook等人所描述)，用SEQ ID NO1的全部或部分核酸序列作為雜交探針，可將GAVE18核酸分子分離。
用cDNA、mRNA或基因組DNA作為模板，并使用合適的寡核苷酸引物，按照標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增技術(shù)，可擴(kuò)增本發(fā)明的核酸分子。此類引物利用SEQ ID NO1所示的信息和常規(guī)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)易于制備?？蓪U(kuò)增的核酸克隆入合適的載體并通過DNA序列分析表征。而且，對(duì)應(yīng)于GAVE18核苷酸序列的寡核苷酸可通過標(biāo)準(zhǔn)的合成技術(shù)如通過DNA自動(dòng)合成儀制備。
可與GAVE18 DNA雜交的分離的核酸分子本發(fā)明進(jìn)一步延伸至這樣的分離核酸分子，其可與GAVE18 DNA雜交，可與在嚴(yán)格雜交條件下互補(bǔ)于GAVE18 DNA的雜交探針雜交，或在嚴(yán)格雜交條件下可與這兩者雜交。特別地，本發(fā)明延伸至這樣的分離核酸分子，其在嚴(yán)格雜交條件下可與包含SEQ ID NO1的DNA序列的核酸分子雜交，或與這樣的探針雜交，所述探針互補(bǔ)于包含SEQ ID NO1的DNA序列的分離核酸分子。
當(dāng)核酸分子的單鏈形式可與另一核酸分子如cDNA、基因組DNA或RNA在合適的溫度和溶液離子強(qiáng)度條件下退火時(shí)，則該核酸分子可與另一核酸分子雜交(參見Sambrook等人，見上文)。溫度和離子強(qiáng)度決定了雜交的″嚴(yán)格性″。對(duì)于同源核酸的初步篩選，可使用對(duì)應(yīng)于Tm55℃的低嚴(yán)格雜交條件，如5x SSC，0.1％SDS，0.25％牛奶且無甲酰胺；或30％甲酰胺，5x SSC，0.5％SDS)。中嚴(yán)格雜交條件對(duì)應(yīng)于較高的Tm，如40％甲酰胺，5x或6x SSC。高嚴(yán)格雜交條件對(duì)應(yīng)于最高的Tm，如50％甲酰胺，5x或6x SSC。雜交需要兩核酸包含互補(bǔ)序列，雖然這取決于雜交的嚴(yán)格程度，但堿基間存在錯(cuò)配是可能的。用于核酸雜交的合適嚴(yán)格程度取決于核酸的長度和互補(bǔ)程度、本領(lǐng)域熟知的變量。兩個(gè)核苷酸序列間的相似性或同源性越大，則具有這些序列的核酸進(jìn)行雜交的Tm值越大。核酸雜交的相對(duì)穩(wěn)定性(對(duì)應(yīng)于較高的Tm)按下列順序降低RNARNA，DNARNA，DNADNA。對(duì)長度大于100個(gè)核苷酸的雜交，有用于計(jì)算Tm的等式(參見Sambrook等人，見上文，9.50-0.51)。對(duì)于與較短的核酸即寡核苷酸雜交，錯(cuò)配所在的位置變得重要，且寡核苷酸的長度決定了雜交的特異性(參見Sambrook等人，見上文，11.7-11.8)?？呻s交核酸分子的最小長度為至少約20個(gè)核苷酸；特別地至少約30個(gè)核苷酸；更特別地至少約40個(gè)核苷酸，甚至更特別地至少約50個(gè)核苷酸，且更特別地至少約60個(gè)核苷酸。In a在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的可雜交核酸分子為至少300、325、350、375、400、425、450、500、550、600、650、700、800、900、1000或1100個(gè)核苷酸長，并且在嚴(yán)格雜交條件下與這樣的核酸分子雜交，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO1的核苷酸序列，優(yōu)選地其編碼序列，其互補(bǔ)片段序列，或其片段。
此處所用術(shù)語“在嚴(yán)格條件下雜交”是對(duì)雜交和洗滌條件的描述，在此條件下，當(dāng)核苷酸序列相互間具有至少55％，60％，65％，70％和優(yōu)選地75％或更高互補(bǔ)性時(shí)一般仍保持雜交。此類嚴(yán)格條件為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，并可在“分子生物學(xué)最新技術(shù)”(“Current Protocols in MolecularBiology”)，John Wiley & Sons，N.Y(1989)，6.3.1-6.3.6一書中找到。嚴(yán)格雜交條件的一個(gè)優(yōu)選的非限制性實(shí)例為在約45℃，于6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，然后在50-65℃，于0.2X SSC，0.1％SDS中洗一次或多次。優(yōu)選地，在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO1的序列或其互補(bǔ)序列雜交的本發(fā)明分離核酸分子對(duì)應(yīng)于天然存在的核酸分子。此處所用“天然存在的”核酸分子是指具有自然界中存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子(如編碼天然蛋白質(zhì))。熟練的技術(shù)人員能理解可根據(jù)序列特異性變量(如長度、G-C豐度等)修正條件。
本發(fā)明考慮包括這樣的GAVE18核酸片段，其可用于診斷具有相似特性的GAVE18樣分子。診斷片段可來自GAVE18基因的任一部分，包括側(cè)翼序列。此片段可運(yùn)用公知方法來作為文庫探針。
而且，本發(fā)明的核酸分子可僅包含編碼GAVE18的核酸序列的一部分，如可用作探針或引物的片段或編碼GAVE18生物活性部分的片段。例如，此片段可包括但不限于編碼SEQ ID NO2氨基酸殘基的第約1位至約14位的區(qū)域。從克隆人GAVE18基因而確定的核苷酸序列使得可以產(chǎn)生探針和引物，用于鑒定和/或克隆其它細(xì)胞類型(如來自其它組織)中的GAVE18同系物以及來自其它哺乳動(dòng)物的GAVE18同系物。探針/引物一般包含基本純化的寡核苷酸。寡核苷酸一般包含這樣的核苷酸序列區(qū)域，該區(qū)域在嚴(yán)格條件下可雜交至SEQ ID NO1或SEQ ID NO1的天然突變體的有意或反義序列中的至少約12個(gè)，優(yōu)選地約25個(gè)，更優(yōu)選地約50個(gè)，75個(gè)，100個(gè)，125個(gè)，150個(gè)，175個(gè)，200個(gè)，250個(gè)，300個(gè)，350個(gè)或400個(gè)連續(xù)的核苷酸上?；谌薌AVE18核苷酸序列的探針可用于檢測編碼相似或相同蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄本或基因組序列。
此處所用術(shù)語本發(fā)明的分離核酸分子的″片段″或″部分″包含至少12個(gè)，特別地約25個(gè)，更特別地約50個(gè)，75個(gè)，100個(gè)，125個(gè)，150個(gè)，175個(gè)，200個(gè)，250個(gè)，300個(gè)，350個(gè)或400個(gè)連續(xù)的核苷酸。因此，本發(fā)明的分離核酸分子的″片段″不只是1個(gè)或2個(gè)核苷酸。
同樣，本發(fā)明多肽的″片段″或″部分″包含至少9個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基。本發(fā)明多肽片段的一個(gè)特定實(shí)例包含與GAVE18抗體或其片段結(jié)合的表位。
編碼“GAVE18的生物活性部分”的核酸片段可通過分離SEQ ID NO1的編碼具有GAVE18生物活性的多肽的部分、表達(dá)此GAVE18蛋白的編碼部分(如體外重組表達(dá))并評(píng)估GAVE18的該編碼部分的活性而制備。本發(fā)明還包括這樣的核酸分子，其由于遺傳密碼的簡并性而不同于SEQ IDNO1核苷酸序列并因此與SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列編碼相同的GAVE18蛋白。
同源的核酸分子本發(fā)明還延伸至這樣的分離核酸分子，其與GAVE18 DNA分子同源，例如其與具有SEQ ID NO1 DNA序列的分離核酸分子同源。當(dāng)在一定的DNA序列長度中至少約50％(優(yōu)選地至少約75％，且最優(yōu)選地至少約90或95％)的核苷酸匹配，則兩條DNA序列″實(shí)質(zhì)上同源″或″實(shí)質(zhì)上相似″。實(shí)質(zhì)上同源的序列可通過用在序列數(shù)據(jù)庫中可獲得的標(biāo)準(zhǔn)軟件，使用缺省參數(shù)比較序列而確定，或通過Southern雜交實(shí)驗(yàn)在例如為該特定體系所制定的嚴(yán)格雜交條件下確定。制定合適的雜交條件是在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的。參見例如Maniatis等人，見上文；DNA克隆(DNA Cloning)，卷I和II，見上文；核酸雜交(Nucleic Acid Hybridization)，見上文。進(jìn)一步地，來自其它物種的編碼GAVE18蛋白的、所具有的核苷酸序列不同于人GAVE18的核酸分子(GAVE18同系物)也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的分離核酸分子的變體本發(fā)明還延伸至這樣的分離核酸分子的變體，其中所述分離的核酸分子包含SEQ ID NO1的DNA序列。此類變體可為簡并性變體、等位基因變體或它們的組合。
對(duì)應(yīng)于本發(fā)明GAVE18 cDNA的天然等位基因變體和同系物的核酸分子可基于與此處公開的人GAVE18核酸的同一性，使用人cDNA或其一部分作為雜交探針，按照標(biāo)準(zhǔn)的雜交技術(shù)在嚴(yán)格的雜交條件下分離。
此處所用術(shù)語″對(duì)應(yīng)于″是指相似或同源的序列，無論其精確位置相同或不同于與之進(jìn)行相似性或同源性測定的分子。因此，術(shù)語″對(duì)應(yīng)于″是指序列相似性，而不是氨基酸殘基或核苷酸堿基的編號(hào)方式。
而且，由于遺傳密碼的密碼子具有簡并性特征，本發(fā)明的GAVE18蛋白可被許多分離的核酸分子編碼?！搴啿⑿蕴卣鳌迨侵父鶕?jù)遺傳密碼使用不同的三字母密碼來指定特定的氨基酸。本領(lǐng)域已知下列密碼子可互換地用于編碼每一特定的氨基酸苯丙氨酸(Phe或F)UUU或UUC亮氨酸(Leu或L) UUA或UUG或CUU或CUC或CUA或CUG異亮氨酸(Ile或I)AUU或AUC或AUA甲硫氨酸(Met或M)AUG纈氨酸(Val或V) GUU或GUC或GUA或GUG絲氨酸(Ser或S) UCU或UCC或UCA或UCG或AGU或AGC脯氨酸(Pro或P) CCU或CCC或CCA或CCG蘇氨酸(Thr或T) ACU或ACC或ACA或ACG丙氨酸(Ala或A) GCU或GCG或GCA或GCG酪氨酸(Tyr或Y) UAU或UAC組氨酸(His或H) CAU或CAC谷氨酰胺(Gln或Q)CAA或CAG天冬酰胺(Asn或N)AAU或AAC賴氨酸(Lys或K) AAA或AAG天冬氨酸(Asp或D)GAU或GAC谷氨酸(Glu或E) GAA或GAG半胱氨酸(Cys或C)UGU或UGC精氨酸(Arg或R) CGU或CGC或CGA或CGG或AGA或AGG甘氨酸(Gly或G) GGU或GGC或GGA或GGG色氨酸(Trp或W) UGG終止密碼子 UAA(赭石密碼子)或UAG(琥珀密碼子)或(乳白密碼子)應(yīng)明白上述密碼子是用于RNA序列。對(duì)DNA相應(yīng)的密碼子是用T替換U。
除了在SEQ ID NO1中所示的人GAVE18核苷酸序列外，本領(lǐng)域技術(shù)人員能理解在群體(如人群)中存在導(dǎo)致GAyE18氨基酸序列變化的DNA序列多態(tài)性。由于天然的等位基因變異，在群體中的個(gè)體之間存在GAVE18基因的此類遺傳多態(tài)性。一個(gè)等位基因是在特定基因座處可選擇存在的一組基因中的一個(gè)。此處所用術(shù)語“基因”和“重組基因”是指包含編碼GAVE18蛋白，優(yōu)選地編碼哺乳動(dòng)物GAVE18蛋白的開放讀碼框的核酸分子。此處所用短語“等位基因變體”是指位于GAVE18基因座的核苷酸序列或指由該核苷酸序列編碼的多肽。備選的等位基因能通過對(duì)一些不同個(gè)體進(jìn)行目的基因測序而鑒定。這可以通過在多個(gè)個(gè)體中使用雜交探針鑒定相同的基因座容易地實(shí)施。GAVE18中的源于天然等位基因變異且不改變GAVE18功能活性的任一及所有此類核苷酸變異和所導(dǎo)致的氨基酸多態(tài)性或變異均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
而且，本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)如定點(diǎn)誘變易于制備本發(fā)明的分離核酸分子的變體。
反義核苷酸序列本發(fā)明也延伸至反義核酸分子，即與編碼蛋白質(zhì)的有意核酸互補(bǔ)的分子，如與雙鏈cDNA分子的編碼鏈或與mRNA序列互補(bǔ)的分子。因此反義核酸可通過氫鍵結(jié)合有意核酸。反義核酸可與全長GAVE18編碼鏈或僅與其一部分互補(bǔ)，如與該蛋白質(zhì)編碼區(qū)域(或開放讀碼框)的全部或部分互補(bǔ)。反義核酸分子可與編碼GAVE18的核苷酸序列所在的編碼鏈的非編碼區(qū)反義。非編碼區(qū)(“5′和3′非翻譯區(qū)”)是在編碼區(qū)側(cè)翼的5′和3 ′序列，其不被翻譯為氨基酸。
已知此處公開的編碼GAVE18的編碼鏈序列(例如，SEQ ID NO1)，本發(fā)明的反義核酸可根據(jù)Watson和Crick堿基配對(duì)原則設(shè)計(jì)。反義核酸分子可與GAVE18 mRNA的全長編碼區(qū)互補(bǔ)，但更優(yōu)選地為僅與GAVE18mRNA的編碼區(qū)或非編碼區(qū)的一部分反義的寡核苷酸。例如，反義寡核苷酸可與GAVE18 mRNA翻譯起始位點(diǎn)附近的區(qū)域互補(bǔ)。反義寡核苷酸可長例如約5個(gè)、10個(gè)、15個(gè)、20個(gè)、25個(gè)、30個(gè)、35個(gè)、40個(gè)、45個(gè)或50個(gè)核苷酸。本發(fā)明的反義核酸可通過本領(lǐng)域公知的步驟用化學(xué)合成和酶連接反應(yīng)產(chǎn)生。例如可用天然存在的核苷酸或多種經(jīng)修飾的核苷酸來化學(xué)合成反義核酸(如反義寡核苷酸)，其中所述經(jīng)修飾的核苷酸被設(shè)計(jì)用來增加分子的生物穩(wěn)定性或增加反義和有意核酸之間形成的雙鏈體的物理穩(wěn)定性，如可使用硫代磷酸酯衍生物、磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。
可用于產(chǎn)生反義核酸的修飾核苷酸的實(shí)例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、雙氫尿嘧啶、β-D-半乳糖基queosine、次黃苷、N6-異戊烯腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基次黃苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基queosine、5-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫脲嘧啶、2-硫脲嘧啶、4-硫脲嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、5-甲基-2-硫脲嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶和2，6-二氨基嘌呤?；蛘撸捎帽磉_(dá)載體生物學(xué)產(chǎn)生反義核酸，在該載體中核酸以反義方向亞克隆(即插入的核酸所轉(zhuǎn)錄的RNA與目的靶核酸為反義方向)。
本發(fā)明的反義核酸分子一般被施與受試者或原位產(chǎn)生，以便與編碼GAVE18蛋白的細(xì)胞mRNA和/或基因組DNA雜交或結(jié)合，從而通過如抑制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯來抑制該蛋白質(zhì)的表達(dá)?？赏ㄟ^常規(guī)的核苷酸互補(bǔ)性來雜交形成穩(wěn)定的雙鏈體，或例如當(dāng)用反義核酸分子結(jié)合DNA雙鏈體時(shí)，通過在雙螺旋體大溝中的特異性相互作用來雜交，或雜交至GAVE18的調(diào)節(jié)區(qū)。
本發(fā)明反義核酸分子施用方式的例子包括在組織位點(diǎn)處直接注射。另外，可修飾反義核酸分子以靶向所選擇的細(xì)胞，然后全身施用。例如，對(duì)于全身施用來說，可修飾反義分子，以使該分子與所選細(xì)胞表面上表達(dá)的受體或抗原特異結(jié)合，其中所述修飾如將反義核酸分子連接至可結(jié)合細(xì)胞表面受體或抗原的肽或抗體上。也可用此處描述的載體將反義核酸分子遞送至細(xì)胞。為了達(dá)到足夠的胞內(nèi)反義分子濃度，可以將反義核酸分子置于強(qiáng)啟動(dòng)子控制下，優(yōu)選pol II或pol III啟動(dòng)子。
本發(fā)明的反義核酸分子可為α-異頭核酸(α-anomeric nucleic acid)分子。α-異頭核酸分子與互補(bǔ)RNA形成特殊的雙鏈雜交體，其中的鏈走向相互平行(Gaultier等人，核酸研究(Nucleic Acids Res)(1987)156625-6641)。反義核酸分子也可包含甲基核糖核苷酸(Inoue等人，核酸研究(1987)156131-6148)或嵌合的RNA-DNA類似物(Inoue等人，F(xiàn)EBS Lett(1987)215327-330)。
核酶本發(fā)明也包括核酶。核酶為具有核糖核酸酶活性的催化RNA分子，其可切割與該核酶雜交的單鏈核酸如mRNA。因此，核酶(如錘頭狀核酶(Haselhoff等人，在自然(Nature)(1988)334585-591)中所描述)可用于催化性切割GAVE18 mRNA轉(zhuǎn)錄本，由此抑制GAVE18 mRNA的翻譯。可基于此處公開的GAVE18 DNA的核苷酸序列(如SEQ ID NO1)設(shè)計(jì)對(duì)編碼GAVE18的核酸具特異性的核酶。例如可構(gòu)建四膜蟲L-19 IVS RNA的衍生物，其中活性位點(diǎn)的核苷酸序列與編碼GAVE18的mRNA中欲切割的核苷酸序列互補(bǔ)，參見如美國專利號(hào)4,987,071和5,116,742，或者，可用GAVE18 mRNA從一群RNA分子中選擇具有特異核糖核酸酶活性的催化RNA，參見如Bartel等人，科學(xué)(Science)(1993)2611411-1418。
本發(fā)明的三股螺旋核酸分子以及肽核酸本發(fā)明還包括可形成三股螺旋結(jié)構(gòu)的核酸分子。例如，GAVE18的基因表達(dá)可通過如下方式抑制，即，將核苷酸序列定向互補(bǔ)到GAVE18的調(diào)節(jié)區(qū)域(如GAVE18啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子)上以形成三股螺旋結(jié)構(gòu)來防止GAVE18基因在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄，通常參見Helene，抗癌藥物設(shè)計(jì)(Anticancer Drug Des)(1991)6(6)569；Helene Ann NY Acad Sci(1992)66027；和Maher，生物鑒定(Bioassays)(1992)14(12)807。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子可在堿基部分、糖部分或磷酸酯骨架處進(jìn)行修飾，以提高如分子的穩(wěn)定性、可雜交性或溶解性。例如，可修飾核酸的磷酸脫氧核糖骨架以產(chǎn)生肽核酸(參見Hyrup等人，Bioorganic & Medicinal Chemistry(1996)45)。此處所用術(shù)語“肽核酸”或“PNAs”是指核酸模擬物，如DNA模擬物，其中磷酸脫氧核糖骨架被假肽骨架替換并僅保留了四種天然核苷堿基。已顯示中性PNA骨架使得可以在低離子強(qiáng)度條件下與DNA和RNA進(jìn)行特異性雜交。如Hyrup等人(1996)見上文；Perry-O’Keefe等人，美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc Natl Acad SciUSA)(1996)9314670所述，可通過標(biāo)準(zhǔn)的固相肽合成法進(jìn)行PNA寡聚體的合成。
GAVE18的PNAs可用于治療和診斷應(yīng)用。例如，PNA可作為反義或反基因藥劑，通過如誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄或翻譯停滯或抑制復(fù)制用于基因表達(dá)的序列特異性調(diào)控。也可使用GAVE18的PNA。例如，PNA可通過如PNA-指導(dǎo)的PCR鉗夾術(shù)用于分析基因中的單堿基對(duì)突變；當(dāng)與其它酶如S1核酸酶組合使用時(shí)PNA可用作人工限制性酶(Hyrup等人，(1996)見上文)；或PNA可用作DNA序列和雜交的探針或引物(Hyrup等人，(1996)見上文；Perry-O’Keefe等人，(1996)見上文)。
在另一實(shí)施方案中，可通過將親脂基團(tuán)或其它輔助基團(tuán)與PNA連接、通過形成PNA-DNA嵌合體或通過使用脂質(zhì)體或其它本領(lǐng)域公知的藥物遞送技術(shù)來修飾GAVE18的PNA以便如增強(qiáng)穩(wěn)定性、特異性或細(xì)胞攝入?？扇鏗yrup等人(1996)見上文；Finn等人，核酸研究(1996)24(17)3357-63；Mag等人，核酸研究(1989)175973；和Peterser等人，Bioorganic MedChem Lett(1975)51119所述進(jìn)行PNA-DNA嵌合體的合成。
GAVE18蛋白進(jìn)一步地，本發(fā)明延伸至包含圖6氨基酸序列(SEQ ID NO2)、其變體、片段、類似物或衍生物的分離多肽。
編碼所具有的序列不同于SEQ ID NO2的GAVE18蛋白(如變體)的分離核酸分子可通過在SEQ ID NO1的核苷酸序列中導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)核苷酸的替換、添加或刪除，從而在所編碼的蛋白質(zhì)中導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替換、添加或刪除而產(chǎn)生。
在一特定的實(shí)施方案中，對(duì)突變的GAVE18蛋白可進(jìn)行如下試驗(yàn)(1)與GAVE18信號(hào)途徑中的蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用的能力；(2)結(jié)合GAVE18配體的能力；或(3)結(jié)合胞內(nèi)靶蛋白的能力。在另一實(shí)施方案中，對(duì)突變的GAVE18蛋白可測試其調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖或細(xì)胞分化的能力。
使用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)通過合適的純化策略可自細(xì)胞或組織源分離天然的GAVE18蛋白。備選地，GAVE18蛋白易于通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。包括在本發(fā)明中的另一備選方案是，可用標(biāo)準(zhǔn)的肽合成技術(shù)化學(xué)合成GAVE18蛋白或多肽。
“分離的”或“純化的”蛋白質(zhì)或其生物活性部分基本上不含有GAVE18蛋白所來自的細(xì)胞或組織源中的細(xì)胞物質(zhì)或其它污染蛋白質(zhì)，或當(dāng)通過化學(xué)合成產(chǎn)生時(shí)，基本上不含有化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)。短語“基本上不含細(xì)胞物質(zhì)”包括這樣的GAVE18蛋白制品，其中該蛋白質(zhì)從細(xì)胞的細(xì)胞組分中被分離出來，所述細(xì)胞為用于分離或重組產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的細(xì)胞。因此，基本上不含細(xì)胞物質(zhì)的GAVE18蛋白包括這樣的GAVE18蛋白制品，其具有少于約30％，20％，10％或5％或更少(指干重)的非GAVE18蛋白(此處也稱為“污染蛋白質(zhì)”)。當(dāng)GAVE18蛋白或其生物活性部分是重組產(chǎn)生的時(shí)，還優(yōu)選其基本上不含培養(yǎng)基，即，培養(yǎng)基在蛋白質(zhì)制品中所占有的體積少于約20％、10％、5％或更少。當(dāng)GAVE18蛋白通過化學(xué)合成產(chǎn)生時(shí)，優(yōu)選地基本上不含有有化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)，即該蛋白質(zhì)從參與其合成的化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)中分離出來。因此，此類GAVE18蛋白制品具有少于約30％，20％，10％或5％或更少(指干重)的化學(xué)前體或非GAVE18的化學(xué)物質(zhì)。
GAVE18蛋白的生物活性部分或片段包括這樣的肽，其包含的氨基酸序列與GAVE18蛋白的氨基酸序列(如SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列)具有足夠的同一性或衍生自后者，并且該肽包含少于全長GAVE18蛋白的氨基酸并顯示GAVE18蛋白的至少一種活性。一般來說，生物活性部分包含具有GAVE18蛋白的至少一種活性的結(jié)構(gòu)域或基序。GAVE18蛋白的生物活性部分可為如長10個(gè)、25個(gè)、50個(gè)、100個(gè)或更多氨基酸的多肽。優(yōu)選的生物活性多肽包括一個(gè)或多個(gè)已鑒定的GAVE18結(jié)構(gòu)域。
而且，可通過重組技術(shù)制備其它生物活性部分(其中GAVE18蛋白的其它區(qū)域已刪除)并針對(duì)其評(píng)估天然GAVE18蛋白的一種或多種功能活性。
其它有用的GAVE18蛋白基本上與SEQ ID NO2相同并保留了SEQID NO2蛋白質(zhì)的功能活性，但由于天然等位基因變異或誘變，其氨基酸序列與SEQ ID NO2存在差異。例如，此類GAVE18蛋白和多肽具有至少一種此處描述的生物活性。
因此，有用的GAVE18蛋白為這樣的蛋白質(zhì)，其包括與SEQ ID NO2的氨基酸序列至少約45％，優(yōu)選地55％，65％，75％，85％，95％，99％或100％相同的氨基酸序列，并保留了SEQ ID NO2的GAVE18蛋白的功能活性。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，GAVE18蛋白保留了SEQ ID NO2的GAVE18蛋白的功能活性。
為了確定兩條氨基酸序列或兩條核酸的百分同一性，對(duì)序列進(jìn)行對(duì)比排列以優(yōu)化比較(如可在第一條氨基酸或核酸序列中導(dǎo)入缺口(gap)，以優(yōu)化與第二條氨基酸或核酸序列的序列對(duì)比)。然后在相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置比較氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝粭l序列中的某個(gè)位置與第二條序列中的相應(yīng)位置被同一氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)，則認(rèn)為這些分子在那個(gè)位置是相同的。兩條序列間的百分同一性為兩條序列共有相同位置的數(shù)目的函數(shù)(即百分同一性＝相同位置的數(shù)目/位置的總數(shù)(如重疊位置)×100)。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩條序列長度相同。
可用數(shù)學(xué)算法完成對(duì)兩條序列間百分同一性的確定。用于比較兩條序列的數(shù)學(xué)算法的一個(gè)特定的非限制性例子是Karlin等人，美國國家科學(xué)院院報(bào)(1990)872264提供的算法，改進(jìn)算法見Karlin等人，美國國家科學(xué)院院報(bào)(1993)905873-5877。此算法被引入Altschul等人，分子生物學(xué)雜志(J Mol Bio)(1990)215403的NBLAST和XBLAST程序中?？捎肗BLAST程序進(jìn)行BLAST核苷酸檢索，設(shè)置例如記分＝100，字長＝12，來獲得與本發(fā)明GAVE18核酸分子同源的核苷酸序列?？捎肵BLAST程序進(jìn)行BLAST蛋白質(zhì)檢索，設(shè)置記分＝50，字長＝3，來獲得與本發(fā)明的GAVE18蛋白分子同源的氨基酸序列。為了獲得有缺口的對(duì)比序列用于比較，可使用Altschul等人，核酸研究(1997)253389中描述的GappedBLAST?；蛘撸捎肞SI-Blast進(jìn)行迭代檢索來檢測分子間較遠(yuǎn)的關(guān)系。Altschul等人(1997)見上文。應(yīng)用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序時(shí)，可使用各程序(如XBLAST和NBLAST)的缺省參數(shù)，參見http//www.ncbi.nlm.nih.gov。
用于比較序列的數(shù)學(xué)算法的另一特定的非限制性實(shí)例為Myers等人，CABIOS(1988)411-17提供的算法。此算法被引入GCG序列比較軟件包的ALIGN程序(版本2.0)部分中。應(yīng)用ALIGN程序比較氨基酸序列時(shí)，可使用PAM120權(quán)重殘基表、缺口長度罰分為12且缺口罰分為4。
可用類似于上面所描述的技術(shù)在允許或不允許缺口的情況下確定兩條序列間的百分同一性。在計(jì)算百分同一性時(shí)，只計(jì)數(shù)準(zhǔn)確的匹配。
本發(fā)明進(jìn)一步延伸至GAVE18嵌合體或融合蛋白。如此處所用，GAVE18“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包括可操作地連接非GAVE18多肽的GAVE18多肽?！癎AVE18多肽”是指多肽具有對(duì)應(yīng)于GAVE18的氨基酸序列?！胺荊AVE18多肽”是指多肽具有的氨基酸序列對(duì)應(yīng)于基本上不同于GAVE18蛋白的蛋白質(zhì)，如不同于GAVE18蛋白且來自相同或不同生物體的蛋白質(zhì)。在GAVE18融合蛋白中，GAVE18多肽可對(duì)應(yīng)于GAVE18蛋白的全部或部分，優(yōu)選GAVE18蛋白的至少一個(gè)生物活性部分。在融合蛋白中，術(shù)語“可操作地連接”是指GAVE18多肽和非GAVE18多肽相互間融合在讀碼框內(nèi)?？蓪⒎荊AVE18多肽融合在GAVE18多肽的N-端或C-端。一種有用的融合蛋白是GST-GAVE18，其中GAVE18序列融合至谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的C-端。此融合蛋白使得重組GAVE18的純化易于進(jìn)行。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白延伸至GAVE18-免疫球蛋白融合蛋白，其中全部的GAVE18或其一部分被融合至來自免疫球蛋白家族成員的序列上。可將本發(fā)明的GAVE18-免疫球蛋白融合蛋白摻入藥物組合物并施與受試者以抑制GAVE18配體和細(xì)胞表面的GAVE18蛋白間的相互作用，由此體內(nèi)抑制GAVE18-介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。GAVE18-免疫球蛋白融合蛋白可用于影響GAVE18相關(guān)配體的生物利用度。GAVE18配體-GAVE18相互作用的抑制在治療上是有用的，可用于治療增生和分化紊亂并用于調(diào)節(jié)(如促進(jìn)或抑制)細(xì)胞存活。而且，本發(fā)明的GAVE18-免疫球蛋白融合蛋白可用作免疫原以在受試者體內(nèi)產(chǎn)生抗GAVE18抗體、以純化GAVE18配體和進(jìn)行篩選測試來確定可抑制GAVE18與GAVE18配體間相互作用的分子。
在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的GAVE18嵌合或融合蛋白通過標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。例如，將編碼不同多肽序列的DNA片段按照常規(guī)技術(shù)連接在讀碼框內(nèi)，如用鈍末端或粘末端連接、限制性酶消化以提供合適的末端、根據(jù)需要補(bǔ)平粘末端、堿性磷酸酶處理以避免不想要的連接和酶促連接。在另一實(shí)施方案中，可通過常規(guī)技術(shù)包括DNA自動(dòng)合成儀合成融合基因。另外，可用錨定引物進(jìn)行基因片段的PCR擴(kuò)增，這樣在兩個(gè)連續(xù)的基因片段間產(chǎn)生互補(bǔ)的突出端，接下來可退火并再擴(kuò)增以產(chǎn)生嵌合基因序列(參見如Ausubel等人，見上文)。而且，許多已編碼融合部分(如GST多肽)的表達(dá)載體可通過商業(yè)途徑得到?？蓪⒕幋aGAVE18的核酸克隆入此類表達(dá)載體，這樣融合部分與GAVE18蛋白連接在讀碼框內(nèi)。
變體如上所述，本發(fā)明進(jìn)一步延伸至GAVE18蛋白變體。例如，可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如定點(diǎn)誘變和PCR-介導(dǎo)的誘變?cè)赟EQ ID NO2的氨基酸序列中導(dǎo)入突變。優(yōu)選地，在一個(gè)或多個(gè)預(yù)測的非必需氨基酸殘基處進(jìn)行保守氨基酸替換?！氨Ｊ匕被崽鎿Q”是將氨基酸殘基用具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替代。例如，一個(gè)或多個(gè)氨基酸可被作為功能等同物的另一具有類似極性的氨基酸替換，導(dǎo)致沉默改變。在本發(fā)明多肽的氨基酸序列中進(jìn)行替換的氨基酸可選自該氨基酸所屬組別的其它成員。如非極性(疏水的)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。含有芳環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸為苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。極性的中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電荷的(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負(fù)電荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。不期望此類改變影響通過聚丙烯酰胺凝膠電泳所測定的表觀分子量或等電點(diǎn)。
尤其優(yōu)選的替換為用Lys替換Arg，反之亦可，這樣仍維持正電荷；用Glu替換Asp，反之亦可，這樣仍維持負(fù)電荷；用Ser替換Thr，這樣仍維持游離的OH；以及用Gln替換Asn，這樣仍維持游離的NH2。
而且，可導(dǎo)入氨基酸替換以用具特別優(yōu)選特性的氨基酸替換。例如，可將Cys導(dǎo)入可能的位點(diǎn)用于與另一Cys形成二硫橋?？蓪is導(dǎo)入作為特定的“酶促”位點(diǎn)(即His可作為酸或堿，且是生物化學(xué)催化反應(yīng)中最常見的氨基酸)?？蓪?dǎo)入Pro，因?yàn)樗哂刑囟ǖ钠矫娼Y(jié)構(gòu)，可在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中誘導(dǎo)β-轉(zhuǎn)角。
也可在全長或部分的GAVE18編碼序列中隨機(jī)導(dǎo)入突變，如通過飽和誘變導(dǎo)入，并且通過對(duì)所得的突變體篩選GAVE18生物活性來鑒定保留活性的突變體。誘變后，可重組表達(dá)編碼的蛋白質(zhì)并可確定蛋白質(zhì)的活性。
本發(fā)明的變體可起GAVE18激動(dòng)劑(模擬物)的作用或起GAVE18拮抗劑的作用。GAVE18蛋白質(zhì)的變體可通過誘變產(chǎn)生，如GAVE18蛋白質(zhì)的不連續(xù)點(diǎn)突變或截短。GAVE18蛋白質(zhì)的激動(dòng)劑可保留與天然存在的GAVE18蛋白質(zhì)基本上相同的生物學(xué)活性或其中一部分的生物活性。GAVE18蛋白質(zhì)的拮抗劑可通過如競爭性結(jié)合包括GAVE18蛋白質(zhì)的細(xì)胞信號(hào)級(jí)聯(lián)的下游或上游成員來抑制GAVE18蛋白質(zhì)天然存在形式的一種或多種活性。因此，用功能局限的變體來處理可產(chǎn)生特定的生物學(xué)作用。用如下變體處理受試者較用GAVE18蛋白質(zhì)的天然存在形式處理可對(duì)受試者產(chǎn)生較小的副作用，其中所述變體具有該蛋白質(zhì)天然存在形式的一部分生物活性。
作為GAVE18激動(dòng)劑(模擬物)或GAVE18拮抗劑起作用的GAVE18蛋白質(zhì)變體可通過針對(duì)GAVE18激動(dòng)劑或拮抗劑活性篩選GAVE18蛋白質(zhì)突變體如截短突變體的組合文庫而鑒定。在一個(gè)實(shí)施方案中，GAVE18變體的多樣化文庫通過核酸水平的組合誘變產(chǎn)生并由多樣化基因文庫編碼。例如，多樣化GAVE18變體文庫可通過如下方式制備將合成的寡核苷酸混合物酶促連接入基因序列中，以使一組簡并的潛在GAVE18序列可表達(dá)為單獨(dú)的多肽，或備選地，表達(dá)為其中含有該組GAVE18序列的一組較大融合蛋白(例如，噬菌體展示)。有許多方法可用于從簡并的寡核苷酸序列產(chǎn)生潛在的GAVE18變體文庫?？稍贒NA自動(dòng)合成儀上進(jìn)行簡并基因序列的化學(xué)合成，然后將合成的基因連接入合適的表達(dá)載體?；蚝啿⒓系氖褂檬沟每稍谝粋€(gè)混合物中提供編碼所需的潛在GAVE18序列集合的所有序列。用于合成簡并寡核苷酸的方法為本領(lǐng)域公知(參見如Narang，四面體(Tetrahedron)(1983)393；Itakura等人，生物化學(xué)年鑒(Ann RevBiochem)(1984)53323；Itakura等人，科學(xué)(Science)(1984)1981056；Ike等人，核酸研究(1983)11477)。
此外，GAVE18蛋白質(zhì)編碼序列的片段文庫可用于產(chǎn)生多樣化的GAVE18片段群體，用來篩選和接下來選擇GAVE18蛋白質(zhì)變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼序列片段的文庫可如下產(chǎn)生用核酸酶處理GAVE18編碼序列的雙鏈PCR片段(在所述處理進(jìn)行的條件下，在每個(gè)分子中僅發(fā)生大約一次切割)，變性該雙鏈DNA，復(fù)性所得DNA以形成可能包含來自不同缺口產(chǎn)物的有意/反義對(duì)的雙鏈DNA，重新形成的雙鏈體用S1核酸酶處理去除單鏈部分并將所得的片段文庫連接入表達(dá)載體。通過此方法，可獲得編碼GAVE18蛋白質(zhì)N-端和不同大小內(nèi)部片段的表達(dá)文庫。
用于篩選通過點(diǎn)突變或截短制備的組合文庫的基因產(chǎn)物和篩選cDNA文庫以獲得具有所選特性的基因產(chǎn)物的一些技術(shù)在本領(lǐng)域是公知的。此類技術(shù)適用于快速篩選通過組合誘變GAVE18蛋白質(zhì)產(chǎn)生的基因文庫。適于高通量分析篩選大基因文庫的最廣泛使用的技術(shù)一般包括將基因文庫克隆入復(fù)制型表達(dá)載體，用所得的載體文庫轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞并在一定的條件下表達(dá)組合基因，其中對(duì)所需活性的檢測有利于分離編碼基因的載體，其中所述基因的表達(dá)產(chǎn)物已得以檢測。遞歸整體誘變(recursive ensemblemutagenesis；REM)為在文庫中增加功能突變體的頻率的技術(shù)，該技術(shù)可用于與篩選測試結(jié)合來鑒定GAVE18變體(Arkin等人，美國國家科學(xué)院院報(bào)(1992)897811-7815；Delgrave等人，蛋白質(zhì)工程(Protein Engineering)(1993)6(3)327-331)。
GAVE18的類似物和衍生物進(jìn)一步地，本發(fā)明也包括通過化學(xué)修飾產(chǎn)生的GAVE18衍生物或類似物。的GAVE18蛋白可通過連接向該分子連接一個(gè)或多個(gè)分子而衍生。
用于衍生的化學(xué)分子適用于衍生的化學(xué)分子可選自水溶性聚合物，使得GAVE18類似物或衍生物在水性環(huán)境如生理環(huán)境下不沉淀。任選地，聚合物為可藥用的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可基于這樣的考慮是否該聚合物/組分連接物可治療上使用，如果可以的話，再考慮目標(biāo)劑量、循環(huán)時(shí)間、對(duì)蛋白水解作用的抗性等。對(duì)GAVE18，可通過應(yīng)用此處提供的測定法來確定。已于此應(yīng)用的水溶性聚合物的實(shí)例包括但不限于聚乙二醇、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二噁戊烷、聚-1，3，6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酐共聚物、聚氨基酸(同聚物或隨機(jī)共聚物)、葡聚糖、聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇同聚物、聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇或聚乙烯醇。由于聚乙二醇丙醛在水中的穩(wěn)定性，其在制造上具有優(yōu)點(diǎn)。
聚合物可為任何分子量，且可為分支或非分支的。對(duì)于聚乙二醇，優(yōu)選的分子量在約2kDa和約100kDa之間(術(shù)語“約”是指在聚乙二醇制備時(shí)，一些分子的分子量多于所示分子量，一些分子的分子量小于所示分子量)，因?yàn)橐子谔幚砗椭圃?。可使用其他的分子量大小，這取決于所需的治療特性(如所需持續(xù)釋放的時(shí)間、對(duì)生物活性的影響(如果有的話)、易于處理、抗原性的程度或缺乏抗原性以及聚乙二醇對(duì)治療性蛋白質(zhì)或類似物的其它已知作用)。
與GAVE18連接的聚合物分子數(shù)目是可變的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定其對(duì)功能的影響。GAVE18可與相同或不同的化學(xué)分子(如聚合物，諸如具有不同聚乙二醇分子量的聚合物)單衍生化，或可提供二-、三-、四-或一些衍生化作用的組合。聚合物分子與GAVE18分子的比例可不同，該比例將是它們?cè)诜磻?yīng)混合物中的濃度。通常，最適比率(根據(jù)反應(yīng)效率，為無過量未反應(yīng)成分或成分和聚合物)將由下述因素決定例如目標(biāo)衍生化程度(如單衍生化、二衍生化、三衍生化等)、所選擇的聚合物分子量、聚合物是否為分支或非分支的、以及反應(yīng)條件。
聚乙二醇分子(或其它化學(xué)分子)與GAVE18的連接應(yīng)考慮其對(duì)GAVE18功能性結(jié)構(gòu)域或抗原結(jié)構(gòu)域的影響。本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用許多連接方法，如EP 0401 384(此處引用作為參考)(將PEG偶聯(lián)至G-CSF)，也參見Malik等人，1992，Exp.Hematol.201028-1035(報(bào)道了用tresyl氯化物PEG化GM-CSF)。例如，可通過氨基酸殘基的反應(yīng)基團(tuán)如游離氨基或羧基共價(jià)連接聚乙二醇。反應(yīng)基團(tuán)為可連接活化聚乙二醇分子的基團(tuán)。具有游離氨基的氨基酸殘基包括賴氨酸殘基和N-末端氨基酸殘基；具有游離羧基的氨基酸殘基包括天冬氨酸殘基、谷氨酸殘基和C-末端氨基酸殘基。硫氫基也可用作連接聚乙二醇分子的反應(yīng)基團(tuán)。對(duì)于治療目的，優(yōu)選在氨基處連接，如在N-末端或賴氨酸基團(tuán)處連接。
尤其希望的是N-末端經(jīng)化學(xué)修飾的GAVE18。使用聚乙二醇來闡述本組合物，可對(duì)多種聚乙二醇分子進(jìn)行選擇(根據(jù)其分子量、分支等)、聚乙二醇分子與GAVE18分子在反應(yīng)混合物中的比例、欲進(jìn)行的PEG化反應(yīng)類型、以及獲得所選N-末端PEG化蛋白質(zhì)的方法。獲得N-末端PEG化制品的方法(即需要時(shí)從其它單PEG化分子分離N-末端PEG化分子)可以是通過從一群PEG化蛋白質(zhì)分子純化N-末端PEG化物質(zhì)。選擇性N-末端化學(xué)修飾可通過還原性烷基化實(shí)施，其利用了可用于衍生GAVE18的不同類型伯胺基(賴氨酸相對(duì)于N-末端)反應(yīng)性的差異。在合適的反應(yīng)條件下，可用含羧基的聚合物在GAVE18的N-末端實(shí)質(zhì)上選擇性衍生GAVE18。例如，可在這樣的pH進(jìn)行反應(yīng)來選擇性N-末端PEG化GAVE18，所述pH允許利用GAVE18賴氨酸殘基∈-氨基的pKa與GAVE18N-末端殘基α-氨基的pKa之間的差異。通過這樣的選擇性衍生，可控制水溶性聚合物與GAVE18的連接與聚合物的結(jié)合主要發(fā)生在GAVE18的N末端，且其它反應(yīng)基團(tuán)如賴氨酸的側(cè)鏈氨基并沒有發(fā)生明顯的修飾。使用還原性烷基化時(shí)，水溶性聚合物可屬于上述類型并具有用于偶聯(lián)至GAVE18的單一反應(yīng)性醛?？墒褂煤袉我环磻?yīng)性醛的聚乙二醇丙醛。
GAVE18抗體、其變體、片段、類似物或衍生物分離的GAVE18蛋白質(zhì)或其部分或其片段可用作免疫原，使用標(biāo)準(zhǔn)的多克隆和單克隆抗體制備技術(shù)來產(chǎn)生結(jié)合GAVE18的抗體。此處所用術(shù)語“抗體”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子，其中所述抗原結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合抗原如GAVE18或其片段。特異性結(jié)合GAVE18的分子是在天然含有GAVE18的樣本如生物樣本中結(jié)合GAVE18而基本上不結(jié)合其它分子的分子。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的實(shí)例包括用酶如胃蛋白酶處理抗體可產(chǎn)生的F(ab)和F(ab′)2片段。本發(fā)明提供了以GAVE18抗體、其變體、片段、類似物或衍生物作為免疫原的多克隆抗體、單克隆抗體和嵌合抗體。優(yōu)選嵌合抗體用于治療人類疾病或紊亂，因?yàn)榕c異種抗體比較，人抗體或人源化抗體自身遠(yuǎn)不可能誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，特別是遠(yuǎn)不可能誘導(dǎo)過敏反應(yīng)。
可使用全長的GAVE18蛋白質(zhì)，或者，作為備選方案本發(fā)明提供了GAVE18的抗原性肽片段用作免疫原。GAVE18的抗原性肽包含SEQ IDNO2所示氨基酸序列中的至少8個(gè)(優(yōu)選地10個(gè)、15個(gè)、20個(gè)、30個(gè)或更多的)氨基酸殘基并含有GAVE18表位，這樣所產(chǎn)生的針對(duì)該肽的抗體可與GAVE18形成特異的免疫復(fù)合物。
GAVE18免疫原一般通過用該免疫原免疫合適的受試對(duì)象(如兔、山羊、小鼠或其它哺乳動(dòng)物)被用于制備抗體。合適的免疫原性制品可包含如重組表達(dá)的GAVE18蛋白質(zhì)或化學(xué)合成的GAVE18多肽。該制品還可包含佐劑，諸如弗氏完全或不完全佐劑，或類似的免疫刺激劑。用免疫原性GAVE18制品免疫合適的受試對(duì)象可誘導(dǎo)多克隆的抗GAVE18抗體反應(yīng)。
本發(fā)明的抗體可為單克隆抗體、多克隆抗體或嵌合抗體。此處所用術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”是指一群這樣的抗體分子，其只包含一種可與GAVE18特定表位發(fā)生免疫反應(yīng)的抗原結(jié)合位點(diǎn)。這樣單克隆抗體組合物一般顯示出與特定的GAVE18蛋白質(zhì)表位的單一結(jié)合親和性。
多克隆抗GAVE18抗體可如上所述通過用GAVE18免疫原免疫合適的受試對(duì)象而制備?？捎脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如使用固定化GAVE18的酶聯(lián)免疫吸附測試法(ELISA)，在一段時(shí)間內(nèi)監(jiān)測接受免疫的受試對(duì)象體內(nèi)的GAVE18抗體效價(jià)。如果需要，可從哺乳動(dòng)物(如從血液)分離直接針對(duì)GAVE18的抗體分子，并用公知的技術(shù)如蛋白A層析法進(jìn)一步純化，以獲得IgG級(jí)分。免疫后在合適的時(shí)間，如當(dāng)抗GAVE18抗體效價(jià)最高時(shí)，可從受試對(duì)象獲得抗體產(chǎn)生細(xì)胞并通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)利用此細(xì)胞制備單克隆抗體，所述技術(shù)有例如Kohler等人，自然(Nature)(1975)256495-497最初描述的雜交瘤技術(shù)，人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kohler等人，今日免疫學(xué)(ImmunolToday)(1983)472)，EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等人，單克隆抗體和癌治療(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)，(1985)，Alan R.Liss，Inc.，77-96頁)或trioma技術(shù)。產(chǎn)生雜交瘤的技術(shù)是公知的(一般參見免疫學(xué)最新技術(shù)(Current Protocols in Immunology)(1994)Coligan等人編輯，John Wiley & Sons，Inc.，紐約，NY)。簡而言之，將永生細(xì)胞系(通常為骨髓瘤)與來自如上所述的GAVE18免疫原免疫過的哺乳動(dòng)物的淋巴細(xì)胞(通常為脾細(xì)胞)融合，并篩選所得雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清來鑒定產(chǎn)生結(jié)合GAVE18的單克隆抗體的雜交瘤。
可使用任一熟知的用于融合淋巴細(xì)胞和永生細(xì)胞系的方法產(chǎn)生抗GAVE18單克隆抗體(參見如免疫學(xué)最新技術(shù)，見上文；Galfre等人，自然(1977)266550-552；Kenneth，單克隆抗體生物學(xué)分析中的新方面(Monoclonal AntibodiesA New Dimension In Biological Analyses)，Plenum Publishing Corp.，紐約，N.Y (1980)；和Lerner，耶魯生物醫(yī)學(xué)雜志(Yale J Biol Med)(1981)54387-402)。而且，普通技術(shù)人員可以理解也可用此類方法的諸多改變后的方法。一般永生細(xì)胞系(如骨髓瘤細(xì)胞系)來自與淋巴細(xì)胞相同的哺乳動(dòng)物種類。例如，鼠雜交瘤可通過用本發(fā)明免疫原性制品免疫的小鼠的淋巴細(xì)胞與永生小鼠細(xì)胞系如骨髓瘤細(xì)胞系融合而制備，其中骨髓瘤細(xì)胞系對(duì)含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶的培養(yǎng)基(“HAT培養(yǎng)基”)敏感。許多骨髓瘤細(xì)胞系中的任一種都可按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用作融合伙伴(partner)，如P3-NS1/l-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653或Sp2/O-Agl4骨髓瘤細(xì)胞系。這些骨髓瘤細(xì)胞系可從ATCC獲得。一般，用聚乙二醇(“PEG”)使HAT敏感的小鼠骨髓瘤細(xì)胞和小鼠脾細(xì)胞融合。融合所得的雜交瘤細(xì)胞然后用HAT培養(yǎng)基選擇，其中HAT培養(yǎng)基殺死未融合的和非生產(chǎn)性融合的骨髓瘤細(xì)胞(未融合的脾細(xì)胞由于未被轉(zhuǎn)化幾天后死去)。本發(fā)明的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞可通過篩選骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中結(jié)合GAVE18的抗體進(jìn)行檢測(例如應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的ELISA試驗(yàn))。
作為制備分泌單克隆抗體的雜交瘤的備選方案，可以應(yīng)用GAVE18篩選重組組合免疫球蛋白質(zhì)文庫(如抗體噬菌體展示文庫)，由此得以分離結(jié)合GAVE18的免疫球蛋白文庫成員，從而鑒定和分離到抗-GAVE18的單克隆抗體。用于產(chǎn)生和篩選噬菌體展示文庫的試劑盒可從供應(yīng)商處獲得(例如，Pharmacia重組噬菌體抗體系統(tǒng)，目錄號(hào)27-9400-01；以及Stratagene“SURFZAP”噬菌體展示試劑盒，目錄號(hào)240612)。
此外，特別適用于產(chǎn)生和篩選抗體展示文庫的方法和試劑的實(shí)例可在以下文獻(xiàn)中查詢，例如美國專利號(hào)5,223,409；PCT公開號(hào)WO 92/18619；PCT公開號(hào)WO 91/17271；PCT公開號(hào)WO 92/20791；PCT公開號(hào)WO 92/15679；PCT公開號(hào)WO 93/01288；PCT公開號(hào)WO 92/01047；PCT公開號(hào)WO 92/09690；PCT公開號(hào)WO 90/02809；Fuchs等，Bio/Technology(1991)91370-1372；Hay等，Hum Antibody Hybridomas(1992)381-85；Huse等，科學(xué)(Science)(1989)2461275-1281和Griffiths等，EMBO J(1993)25(12)725-734。
此外，重組抗GAVE18抗體，如嵌合的和人源化的單克隆抗體(同時(shí)包含人的和非人的部分)可以使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)制備。該嵌合和人源化單克隆抗體可以通過本領(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)產(chǎn)生，例如使用如下文獻(xiàn)中描述的方法產(chǎn)生PCT公開號(hào)WO 87/02671；歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?84,187；歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?71,496；歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?73,494；PCT公開號(hào)WO 86/01533；美國專利號(hào)4,816,567；歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?25,023；Better等，科學(xué)(1988)2401041-1043；Liu等，美國國家科學(xué)院院報(bào)(1987)843439-3443；Lin等，免疫學(xué)雜志(1987)1393521-3526；Sun等，美國國家科學(xué)院院報(bào)(1987)84214-218；Nishimura等，癌研究(Cane Res)(1987)47999-1005；Wood等，自然(1985)314446-449；Shaw等，國家癌研究所雜志(J Natl Cancer Inst)(1988)801553-1559；Morrison，科學(xué)(1985)2291202-1207；Oi等，生物/技術(shù)(Bio/Techniques)(1986)4214；美國專利號(hào)5,225,539；Jones等，自然(1986)321552-525；Verhoeyan等，科學(xué)(1988)2391534；和Beidler等，免疫學(xué)雜志(J Immunol)(1988)1414053-4060。
特別需要完全人抗體以用于治療人類患者。該抗體可應(yīng)用轉(zhuǎn)基因小鼠制備，所述轉(zhuǎn)基因小鼠不能表達(dá)內(nèi)源免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因，而能夠表達(dá)人的重鏈和輕鏈基因。該轉(zhuǎn)基因小鼠可以用選擇的抗原(如GAVE18的全部或一部分)以標(biāo)準(zhǔn)方式進(jìn)行免疫。直接針對(duì)該抗原的單克隆抗體可由常規(guī)的雜交瘤技術(shù)獲得。位于轉(zhuǎn)基因小鼠中的人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因在B細(xì)胞分化過程中進(jìn)行重排，并隨后經(jīng)歷類型轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變。這樣，應(yīng)用該表位可鑒定出抑制GAVE18活性的抗體。克隆非人抗體的重鏈和輕鏈并用于構(gòu)建噬菌體展示的Fab片段。例如，可將重鏈基因克隆到質(zhì)粒載體中，以使細(xì)菌分泌重鏈?？蓪⑤p鏈基因克隆到噬菌體外殼蛋白基因中以使其可表達(dá)于噬菌體表面。使用與人輕鏈庫(隨機(jī)收集的)融合的噬菌體感染表達(dá)非人重鏈的細(xì)菌。產(chǎn)生的后代噬菌體展示雜合抗體(人輕鏈/非人重鏈)。利用選擇的抗原淘選能結(jié)合所選抗原的噬菌體。為鑒定出該噬菌體可能需要幾輪篩選。
從選出的可結(jié)合所選抗原的噬菌體中分離人輕鏈基因。然后利用選出的人輕鏈基因指導(dǎo)人重鏈基因的篩選，方法如以下所述。將選出的人輕鏈基因插入細(xì)菌表達(dá)載體。表達(dá)所選人輕鏈的細(xì)菌用融合了人重鏈庫的噬菌體進(jìn)行感染。產(chǎn)生的子代噬菌體展示人抗體(人輕鏈/人重鏈)。
接著，使用選出的抗原淘選可結(jié)合選擇抗原的噬菌體。選出的噬菌體展示出完全人抗體，該抗體識(shí)別的表位與最初選擇的非人單克隆抗體所識(shí)別的表位相同。分離編碼重鏈和輕鏈的基因，并可進(jìn)一步操作用于制備人抗體。該技術(shù)參見Jespers等的描述(生物/技術(shù)(Bio/Technology)(1994)12899-903)。
抗-GAVE18抗體(如單克隆抗體)可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(如親和層析或免疫沉淀)用來分離GAVE18?？?GAVE18抗體可以幫助從細(xì)胞中純化天然的GAVE18和表達(dá)于宿主細(xì)胞中的重組產(chǎn)生的GAVE18。此外，抗-GAVE18抗體可用于檢測GAVE18蛋白質(zhì)(如在細(xì)胞裂解物或細(xì)胞上清液中)以評(píng)估GAVE18蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度和表達(dá)方式。抗-GAVE18抗體可用于診斷中作為臨床試驗(yàn)方法的一部分來監(jiān)測組織中的蛋白質(zhì)水平，以便例如，確定特定治療方案的療效。如下所述，將抗體與可檢測的物質(zhì)偶聯(lián)可促進(jìn)檢測的進(jìn)行。
可檢測的標(biāo)記物任選地，本發(fā)明的分離核酸分子、本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的抗體以及上述分子的片段均可被可檢測地標(biāo)記。合適的標(biāo)記物包括酶、熒光團(tuán)(如異硫氰酸熒光素(FITC)、藻紅蛋白(PE)、得克薩斯紅(TR)、羅丹明、游離或螯合的鑭系鹽(特別是Eu3+)，此處只列舉了一些熒光團(tuán))、發(fā)色團(tuán)、放射性同位素、螯合劑、染料、膠體金、乳膠粒、配體(如生物素)、生物發(fā)光材料和化學(xué)發(fā)光劑。當(dāng)使用對(duì)照標(biāo)記時(shí)，對(duì)受體和對(duì)照標(biāo)記可應(yīng)用相同或不同的標(biāo)記物。
當(dāng)使用放射性標(biāo)記物如同位素3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I和186Re時(shí)，可利用目前已知可使用的計(jì)數(shù)方法。當(dāng)使用的標(biāo)記物為酶時(shí)，檢測可通過本領(lǐng)域公知的任何現(xiàn)在可利用的比色技術(shù)、分光光度技術(shù)、熒光分光光度技術(shù)、電流分析技術(shù)或氣體分析技術(shù)完成。
直接標(biāo)記物為本發(fā)明可使用的標(biāo)記物的一種例子。已將直接標(biāo)記物作為實(shí)體進(jìn)行了定義，在其天然狀態(tài)下，用裸眼或在借助于光學(xué)濾器和/或應(yīng)用刺激(如用紫外光激發(fā)熒光)易于見到。在本發(fā)明可使用的顏色標(biāo)記物的例子中包括金屬溶膠粒，如Leuvering(美國專利4,313,734)描述的金溶膠粒；Gribnau等人(美國專利4,373,932)和May等人(WO 88/08534)描述的染料獨(dú)有的粒子(dye sole particles)；May(見上文)和Snyder(EP-A 0 280559和0281 327)描述的著色乳膠(dyed latex)；或Campbell等人(美國專利4,703,017)描述的包封在脂質(zhì)體中的染料。其它直接標(biāo)記物包括放射性核苷酸、熒光分子或發(fā)光分子。除了這些直接標(biāo)記物外，包含酶的間接標(biāo)記物也可用于本發(fā)明。多種類型的酶聯(lián)免疫試驗(yàn)為本領(lǐng)域公知，如堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶、溶菌酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶、乳酸脫氫酶、脲酶，這些和其它酶已由Eva Engvall在酶免疫試驗(yàn)ELISA和EMIT中進(jìn)行了描述(Methods in Enzymology，70，419-439，1980和美國專利4,857,453)。
用于本發(fā)明的其它標(biāo)記物包括磁共振成像標(biāo)記物。
在另一實(shí)施方案中，可在本發(fā)明的分離多肽、本發(fā)明的抗體或其片段上形成磷酸化位點(diǎn)，用于32P標(biāo)記，如在Sidney Pestka的歐洲專利0372707號(hào)(申請(qǐng)?zhí)?9311108.8)，或美國專利5,459,240(1995年l0月17日授權(quán)給Foxwell等人)所述.
如此處所示例的，蛋白質(zhì)(包括抗體)可用代謝標(biāo)記物標(biāo)記。在體外將表達(dá)蛋白的細(xì)胞在補(bǔ)充有代謝標(biāo)記物如[35S]-甲硫氨酸或[32P]-正磷酸(orthphosphate)的培養(yǎng)基中孵育期間可發(fā)生代謝標(biāo)記。除了用[35S]-甲硫氨酸進(jìn)行代謝(或生物合成)標(biāo)記，本發(fā)明還考慮用[14C]-氨基酸和[3H]-氨基酸(在不易發(fā)生變化的位點(diǎn)用氚替換)。
重組表達(dá)載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明另一方面涉及含編碼GAVE18(或其一部分)的核酸的載體，優(yōu)選表達(dá)載體。如上所述，一種類型的載體為“質(zhì)?！保錇榭蛇B入額外DNA區(qū)段的環(huán)狀雙鏈DNA。另一類型的載體為病毒載體，其中可以將額外的DNA區(qū)段連入病毒基因組中。某些載體可在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如，具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和游離型哺乳動(dòng)物載體)。其他的載體(如非游離型的哺乳動(dòng)物載體)在導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)時(shí)整合到宿主細(xì)胞基因組中，并因此隨宿主基因組一同復(fù)制。此外，某些載體(表達(dá)載體)能夠指導(dǎo)與其可操作地連接的基因的表達(dá)。一般，重組DNA技術(shù)中應(yīng)用的表達(dá)載體常為質(zhì)粒(載體)形式。然而，本發(fā)明意在包括其他形式的表達(dá)載體，如可執(zhí)行等同功能的病毒載體(如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒)。
本發(fā)明的重組表達(dá)載體包含本發(fā)明的核酸，所述核酸以適于在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的形式存在。這意味著本發(fā)明的重組表達(dá)載體包括一段或多段基于用于表達(dá)的宿主細(xì)胞而選出的調(diào)控序列，該序列與待進(jìn)行表達(dá)的核酸可操作地連接。在重組表達(dá)載體內(nèi)，“可操作地連接”意指目的核苷酸序列連接到調(diào)控序列上，其連接方式允許該核苷酸序列表達(dá)(例如，在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中或當(dāng)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中后在該宿主細(xì)胞中表達(dá))。術(shù)語“調(diào)控序列”旨在包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其他表達(dá)控制元件(如多聚腺苷酸化信號(hào))。該調(diào)控序列在如Goeddel，基因表達(dá)技術(shù)酶學(xué)方法(Gene ExpressionTechnologyMethods in Enzymology)，185卷，Academic Press，San Diego，CA(1990)中有描述。調(diào)控序列包括那些指導(dǎo)核苷酸序列在多種宿主細(xì)胞中進(jìn)行組成型表達(dá)的序列(如組織特異的調(diào)控序列)。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，表達(dá)載體的設(shè)計(jì)將取決于選擇進(jìn)行轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞、所需蛋白質(zhì)的表達(dá)水平等因素。可以將本發(fā)明的表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中以產(chǎn)生此處描述的核酸編碼的蛋白質(zhì)或肽(如GAVE18蛋白質(zhì)、突變體形式的GAVE18和融合蛋白等)。
本發(fā)明的重組表達(dá)載體可設(shè)計(jì)用于在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)GAVE18，所述細(xì)胞有例如，細(xì)菌細(xì)胞(如大腸桿菌)、昆蟲細(xì)胞(用桿狀病毒表達(dá)載體)、酵母細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞在之前的Goeddel的文獻(xiàn)中有討論。備選地，重組表達(dá)載體可應(yīng)用如噬菌體的調(diào)控元件和蛋白質(zhì)在體外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，其中所述元件和蛋白質(zhì)如T7啟動(dòng)子和/或T7聚合酶。
蛋白質(zhì)在原核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)大都在大腸桿菌中使用載體進(jìn)行，所述載體含有指導(dǎo)融合或非融合蛋白表達(dá)的組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。融合載體可在其編碼的蛋白質(zhì)上添加一些氨基酸，這些氨基酸通常添加到重組蛋白的氨基端。此類融合載體一般有三種用途1)提高重組蛋白的表達(dá)；2)提高重組蛋白的溶解度；和3)在親和純化中作為配體協(xié)助重組蛋白的純化。通常，融合表達(dá)載體中在融合部分和重組表達(dá)蛋白的連接處導(dǎo)入有一個(gè)蛋白水解切割位點(diǎn)，從而使得可以在純化融合蛋白后使重組蛋白得以和融合部分分離。此類酶和關(guān)聯(lián)識(shí)別序列包括Xa因子、凝血酶和腸激酶。典型的融合表達(dá)載體包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith等，基因(Gene)(1988)6731-40)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRITS(Pharmacia，Piscataway，NJ)，三者分別將谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E結(jié)合蛋白或蛋白A融合到靶重組蛋白上。
合適的誘導(dǎo)型非融合大腸桿菌表達(dá)載體的實(shí)例包括pTrc(Amann等，基因(Gene)(1988)69301-315)和pET 11d(Studier等，基因表達(dá)技術(shù)酶學(xué)方法(Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology)，AcademicPress，San Diego，California(1990)18560-89)。pTrc載體上靶基因的表達(dá)依賴于宿主RNA聚合酶從雜合trp-lac融合啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄。
使大腸桿菌中重組蛋白表達(dá)最大化的一個(gè)策略是在蛋白水解切割重組蛋白的能力被削弱的宿主中表達(dá)蛋白(Gottesman，基因表達(dá)技術(shù)酶學(xué)方法，Academic Press，San Diego，California(1990)185119-128)。另一策略是改變待插入表達(dá)載體的核酸的核酸序列，以使編碼每一氨基酸的各密碼子都為優(yōu)選在大腸桿菌中應(yīng)用的密碼子(Wada等，核酸研究(1992)202111-2118)。對(duì)本發(fā)明核酸序列進(jìn)行此類改變可通過標(biāo)準(zhǔn)的DNA合成技術(shù)完成。
在另一實(shí)施方案中，GAVE18表達(dá)載體為酵母表達(dá)載體。用于在酵母(如釀酒酵母(S.cerevisiae))中實(shí)現(xiàn)表達(dá)的載體的實(shí)例包括pYepSecl(Baldari等，EMBO J(1987)6229-234)、pMFa(Kurjan等，細(xì)胞(Cell)(1982)30933-943)、pJRY88(Schultz等，基因(Gene)(1987)54113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)和pPicZ(Invitrogen Corp，SanDiego，CA)。
備選地，可應(yīng)用桿狀病毒表達(dá)載體在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)GAVE18?，F(xiàn)有可用于在培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞(如Sf 9細(xì)胞)中表達(dá)蛋白的桿狀病毒載體包括pAc系列(Smith等，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol Cell Biol)(1983)32156-2165)和pVL系列(Lucklow等，病毒學(xué)(Virology)(1989)17031-39)。
而在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸使用哺乳動(dòng)物表達(dá)載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的實(shí)例包括pCDM8(Seed，自然(Nature)(1987)329840)和pMT2PC(Kaufman等，EMBO J(1987)6187-195)。當(dāng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，表達(dá)載體的控制功能常由病毒調(diào)控元件提供。例如，通常應(yīng)用的啟動(dòng)子來自多瘤病毒、腺病毒2、巨細(xì)胞病毒和猿病毒40。對(duì)于其他適用于原核和真核細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)，見之前Sambrook等的文獻(xiàn)的第16和17章。
在另一實(shí)施方案中，重組哺乳動(dòng)物表達(dá)載體能夠指導(dǎo)核酸優(yōu)選地在特定的細(xì)胞類型中表達(dá)(例如，應(yīng)用組織特異的調(diào)控元件來表達(dá)核酸)。組織特異的調(diào)控元件在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。合適的組織特異性啟動(dòng)子的非限定實(shí)例包括白蛋白啟動(dòng)子(肝臟特異；Pinkert等，基因進(jìn)展(Genes Dev)(1987)1268-277)，淋巴特異的啟動(dòng)子(Calame等，Adv Immunol(1988)43235-275)，特別是T細(xì)胞受體(Winoto等，EMBO J(1989)8729-733)和免疫球蛋白(Banerji等，細(xì)胞(Cell)(1983)33729-740；Queen等，細(xì)胞(Cell)(1983)33741-748)的啟動(dòng)子，神經(jīng)元特異的啟動(dòng)子(如神經(jīng)絲啟動(dòng)子；Byrne等，美國國家科學(xué)院院刊(Proe Natl Acad USA)(1989)865473-5477)，胰腺特異的啟動(dòng)子(Edlund等，科學(xué)(Science)(1985)230912-916)和乳腺特異的啟動(dòng)子(如奶乳清蛋白啟動(dòng)子；美國專利號(hào)4,873,316和歐洲申請(qǐng)?zhí)?64,166)。發(fā)育調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子也包括在內(nèi)，如鼠hox啟動(dòng)子(Kessel等，科學(xué)(Science)(1990)249374-379)和甲胎蛋白啟動(dòng)子(Campes等，基因進(jìn)展(Genes Dev)(1989)3537-546)。
本發(fā)明還提供含本發(fā)明的DNA分子的重組表達(dá)載體，其中該DNA分子以反義方向克隆在表達(dá)載體中。也就是，DNA分子可操作地連接到調(diào)控序列上，該連接方式使得可以表達(dá)(通過轉(zhuǎn)錄該DNA分子)產(chǎn)生與GAVE18mRNA反義的RNA分子。可以對(duì)與反義方向克隆的核酸可操作連接的調(diào)控序列進(jìn)行選擇以指導(dǎo)反義RNA分子在多種細(xì)胞類型中持續(xù)表達(dá)。例如，可選擇病毒啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子或調(diào)控序列以指導(dǎo)反義RNA實(shí)現(xiàn)組成型、組織特異性或細(xì)胞類型特異性表達(dá)。反義表達(dá)載體的形式可為重組質(zhì)粒、噬菌粒或減毒病毒，其中反義核酸被置于高效調(diào)控區(qū)域的控制下，其活性由載體所導(dǎo)入的細(xì)胞的類型決定。使用反義基因進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控的討論見Weintraub等(Reviews-Trends in Genetics，Vol.1(1)1986)。
本發(fā)明的另一方面涉及已導(dǎo)入本發(fā)明的重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。術(shù)語“宿主細(xì)胞”和“重組宿主細(xì)胞”在此處可互換使用。應(yīng)當(dāng)理解，該術(shù)語不僅指特定的受試細(xì)胞，也指該細(xì)胞的后代或潛在后代。由于突變或環(huán)境影響在傳代過程中可發(fā)生某些改變，這樣，后代實(shí)際上可能并非與親代細(xì)胞相同，但其仍包括在此處所用術(shù)語的范圍之內(nèi)。
宿主細(xì)胞可為任意的原核或真核細(xì)胞。例如，GAVE18蛋白質(zhì)可在細(xì)菌細(xì)胞(如大腸桿菌)、昆蟲細(xì)胞、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、293細(xì)胞或COS細(xì)胞)中表達(dá)。其他合適的宿主細(xì)胞為本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員公知。載體DNA可通過常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入原核或真核細(xì)胞中。如此處所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”意指本領(lǐng)域內(nèi)公知的各種將外源核酸(如DNA)導(dǎo)入宿主細(xì)胞的技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、轉(zhuǎn)導(dǎo)、DEAE-葡聚糖-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或電穿孔。
對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，已知根據(jù)應(yīng)用的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)染技術(shù)，僅一小部分的細(xì)胞可將外源DNA整合到基因組中。為鑒定和篩選整合體，一般將編碼選擇標(biāo)記的基因(如抗生素抗性基因)與目的基因一同導(dǎo)入宿主細(xì)胞。優(yōu)選的選擇標(biāo)記包括那些可賦予藥物抗性的基因，所述藥物如G418、潮霉素和氨甲蝶呤。編碼選擇標(biāo)記的核酸可與編碼GAVE18的基因位于同一載體上被導(dǎo)入宿主細(xì)胞或可以位于不同的載體上導(dǎo)入。被導(dǎo)入的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可通過藥物篩選進(jìn)行鑒定(例如，摻入了選擇標(biāo)志基因的細(xì)胞將存活，而其他細(xì)胞死亡)。
本發(fā)明的宿主細(xì)胞(如培養(yǎng)的原核或真核宿主細(xì)胞)可用于產(chǎn)生(即表達(dá))GAVE18蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了通過應(yīng)用本發(fā)明的宿主細(xì)胞產(chǎn)生GAVE18蛋白質(zhì)的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞(編碼GAVE18的重組表達(dá)載體已經(jīng)導(dǎo)入了該細(xì)胞)，由此使GAVE18蛋白質(zhì)得以產(chǎn)生。在另一實(shí)施方案中，該方法還包括從培養(yǎng)基或宿主細(xì)胞中分離GAVE18。
在另一實(shí)施方案中，GAVE18被包含在誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)中，用于其他亞克隆到修飾表達(dá)載體上的蛋白質(zhì)的重組表達(dá)。例如，包含突變G蛋白的宿主細(xì)胞(例如，酵母細(xì)胞、Y2腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞和cyc-S49，見美國專利號(hào)6,168,927 B1，5,739,029和5,482,835；Mitchell等，美國國家科學(xué)院院刊(ProcNatl Acad USA)(1992)89(19)8933-37和Katada等，生物化學(xué)雜志(J BiolChem)(1984)259(6)3586-95)用含有編碼GAVE18的核酸序列的第一表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中該GAVE18在宿主細(xì)胞中進(jìn)行功能表達(dá)。盡管表達(dá)的GAVE18具有組成型活性，但突變的存在不允許信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生；即，不能激活G蛋白指導(dǎo)的下游級(jí)聯(lián)放大(例如，不能激活腺苷酰環(huán)化酶)。隨后，用第二表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包含GAVE18的宿主細(xì)胞。除待通過此誘導(dǎo)型系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)的目的基因外，第二載體還包含與宿主細(xì)胞G蛋白突變體互補(bǔ)的結(jié)構(gòu)基因(即，哺乳動(dòng)物或酵母的功能性Gs、Gi、Go或Gq，例如，見PCT公開號(hào)WO 97/48820；美國專利號(hào)6,168,927 B1、5,739,029和5,482,835)。第二載體的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)基因?yàn)榭烧T導(dǎo)的；即，處于外源添加的化合物(如四環(huán)素、IPTG、小分子等，見之前的Sambrook等的文獻(xiàn))的控制下，所述化合物可以激活與所述互補(bǔ)結(jié)構(gòu)基因可操作連接的啟動(dòng)子。加入誘導(dǎo)劑后，該互補(bǔ)結(jié)構(gòu)基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能性表達(dá)，結(jié)果具有組成型活性的GAVE18將形成復(fù)合體，導(dǎo)致適當(dāng)?shù)南掠瓮返募せ?例如，形成第二信使)。第二載體包含的目的基因具有可操作連接的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子可以由合適的第二信使(如CREB和AP1元件)激活。這樣，當(dāng)?shù)诙攀狗e聚時(shí)，目的基因上游的啟動(dòng)子被激活以表達(dá)所述基因的產(chǎn)物。缺乏誘導(dǎo)劑時(shí)，目的基因的表達(dá)關(guān)閉。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于此誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞包括但不限于，S49(cyc-)細(xì)胞。盡管本發(fā)明考慮包含G-蛋白突變的細(xì)胞系，但也可以人工制備/構(gòu)建出合適的突變體(見針對(duì)酵母細(xì)胞的美國專利號(hào)6,168,927 B1、5,739,029和5,482,835)。
在相關(guān)的方面，細(xì)胞用與如下cDNA可操作連接的載體轉(zhuǎn)化，所述cDNA包含編碼SEQ ID NO2中所示蛋白質(zhì)的序列。該系統(tǒng)包含的第一和第二載體可以考慮包括但不限于，pCDM8(Seed，自然(Nature)(1987)329840)和pMT2PC(Kaufman等，EMBO J(1987)6187-195)、pYepSecl(Baldari等，EMBO J(1987)6229-234)、pMFa(Kurjan.，細(xì)胞(Cell)(1982)30933-943)、pJRY88(Schultz等，基因(Gene)(1987)54113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)和pPicZ(Invitrogen Corp，SanDiego，CA)。
在一個(gè)相關(guān)的方面，宿主細(xì)胞可通過適宜的方法轉(zhuǎn)染，其中轉(zhuǎn)染可導(dǎo)致功能性GAVE18蛋白質(zhì)的表達(dá)(例如，Sambrook等，同上和Kriegler，基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)實(shí)驗(yàn)室指南(Gene Transfer and ExpressionALaboratory Manual)，Stockton Press，New York，NY，1990)。該“功能性蛋白質(zhì)”包括但不限于，一經(jīng)表達(dá)即可與G-蛋白形成復(fù)合體的蛋白質(zhì)，其中該G-蛋白調(diào)節(jié)第二信使的形成。此處已應(yīng)用的轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的其他方法包括但不限于轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(溶酶體融合)、基因槍的使用或DNA載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(參見如Wu等人，1992，J.Biol.Chem.267963-967；Wu和Wu，1988，J.Biol.Chem.26314621-14624；Hartmut等人，加拿大專利申請(qǐng)?zhí)?,012,311，申請(qǐng)日1990年3月15日)。
本發(fā)明使用了多種啟動(dòng)子。的確本發(fā)明多肽的表達(dá)可被本領(lǐng)域已知的任一啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件調(diào)控，但這些調(diào)控元件必須在所選的用于表達(dá)的宿主中是有功能的?？捎糜谡{(diào)控GAVE18表達(dá)的啟動(dòng)子包括但不限于SV40早期啟動(dòng)子區(qū)(Benoist和Chambon，1981，Nature 290304-310)、勞斯肉瘤病毒3′長末端重復(fù)中含有的啟動(dòng)子(Yamamoto等人，1980，Cell 22787-797)、皰疹胸苷激酶啟動(dòng)子(Wagner等人，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.781441-1445)、金屬硫蛋白基因的調(diào)控序列(Brinster等人，1982，Nature 29639-42)；原核表達(dá)載體如β-內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子(Villa-Kamaroff等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.753727-3731)或tac啟動(dòng)子(DeBoer等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8021-25)；也參見ScientificAmerican，1980，4274-94，″來自重組細(xì)菌的有用蛋白質(zhì)″；來自酵母或其他真菌的啟動(dòng)子元件如Gal 4啟動(dòng)子、ADC(醇脫氫酶)啟動(dòng)子、PGK(磷酸甘油激酶)啟動(dòng)子、堿性磷酸酶啟動(dòng)子；以及顯示組織特異性并已用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的動(dòng)物轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)在胰腺泡細(xì)胞中有活性的彈性蛋白酶I基因調(diào)控區(qū)(Swift等人，1984，Cell 38639-646；Ornitz等人，1986，Cold SpringHarbor Symp.Quant.Biol.50399-409；MacDonald，1987，Hepatology 7425-515)；在胰臟β細(xì)胞中有活性的胰島素基因調(diào)控區(qū)(Hanahan，1985，Nature 315115-122)、在淋巴樣細(xì)胞中有活性的免疫球蛋白基因調(diào)控區(qū)(Grosschedl等人，1984，Cell 38647-658；Adames等人，1985，Nature 318533-538；Alexander等人，1987，Mol.Cell.Biol.71436-1444)、在睪丸、乳腺、淋巴樣和肥大細(xì)胞中有活性的小鼠乳癌病毒調(diào)控區(qū)(Leder等人，1986，Cell 45485-495)、在肝臟中有活性的白蛋白基因調(diào)控區(qū)(Pinkert等人，1987，Genes and Devel.1268-276)、在肝臟中有活性的甲胎蛋白基因調(diào)控區(qū)(Krumlauf等人，1985，Mol.Cell.Biol.51639-1648；Hammer等人，1987，Science 23553-58)、在肝臟中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因調(diào)控區(qū)(Kelsey等人，1987，Genes and Devel.1161-171)、在髓樣細(xì)胞中有活性的β-球蛋白基因調(diào)控區(qū)(Mogram等人，1985，Nature 315338-340；Kollias等人，1986，Cell 4689-94)、在腦的少突膠質(zhì)細(xì)胞中有活性的髓鞘堿性蛋白調(diào)控區(qū)(Readhead等人，1987，Cell 48703-712)、在骨骼肌中有活性的肌球蛋白輕鏈-2基因調(diào)控區(qū)(Sani，1985，Nature 314283-286)、以及在下丘腦中有活性的促性腺素釋放激素基因調(diào)控區(qū)(Mason等人，1986，Science 2341372-1378)。
包含本發(fā)明核酸分子的表達(dá)載體可通過四種常用方法鑒定(a)目標(biāo)質(zhì)粒DNA或特定mRNA的PCR擴(kuò)增，(b)核酸雜交，(c)存在或缺乏選擇性標(biāo)記基因功能，以及(d)表達(dá)插入序列。在第一種方法中，可通過PCR擴(kuò)增核酸來提供用于檢測的擴(kuò)增產(chǎn)物。在第二種方法中，可使用探針通過核酸雜交檢測表達(dá)載體中存在插入的外源基因，其中所述探針包含與插入的標(biāo)記基因同源的序列。在第三種方法中，基于存在或缺乏某些“選擇性標(biāo)記”基因功能可鑒定并選擇重組載體/宿主系統(tǒng)，其中所述“選擇性標(biāo)記”基因功能是由于在載體中插入外源基因所致(如β-半乳糖苷酶活性、胸苷激酶活性、抗生素抗性、轉(zhuǎn)化表型、在桿狀病毒中形成包涵體等)。在另一例子中，如果編碼GAVE18蛋白、其變體、其類似物或其衍生物的核酸插入在載體的″選擇性標(biāo)記″基因序列中，則包含該插入片段的重組子可通過GAVE18基因功能的缺乏而鑒定。在第四個(gè)方面，如果所表達(dá)的蛋白具有功能上活化的構(gòu)象，可通過測定被該重組子表達(dá)的基因產(chǎn)物的活性、生物化學(xué)或免疫學(xué)特性來鑒定重組表達(dá)載體。
大量的宿主/表達(dá)載體組合可用于表達(dá)本發(fā)明的DNA序列。有用的表達(dá)載體例如可由染色體片段、非染色體片段和合成DNA序列組成。合適的載體包括SV40衍生物和已知的細(xì)菌質(zhì)粒，如大腸桿菌質(zhì)粒col El、pCR1、pBR322、pMal-C2、pET、pGEX(Smith等人，1988，Gene 6731-40)、pMB9以及它們的衍生物、質(zhì)粒(如RP4)；噬菌體DNAs，如λ噬菌體的許多衍生物(如NM989)和其他噬菌體DNA(如M13和絲狀單鏈?zhǔn)删wDNA)；酵母質(zhì)粒，如2μ質(zhì)?；蚱溲苌?；用于真核細(xì)胞中的載體，如用于昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的載體；衍生自質(zhì)粒和噬菌體DNAs的組合的載體，如經(jīng)修飾可利用噬菌體DNA或其他表達(dá)調(diào)控序列的質(zhì)粒；等等。
例如，在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中，可使用非融合轉(zhuǎn)移載體和融合轉(zhuǎn)移載體，其中所述非融合轉(zhuǎn)移載體如(但不限于)pVL941(BamHI克隆位點(diǎn)；Summers)、pVL1393(BamHI、SmaI、XbaI、EcoRI、NotI、XmaIII、BglII和PstI克隆位點(diǎn)；Invitrogen)、pVL1392(BglII、PstI、NotI、XmaIII、EcoRI、XbaI、SmaI和BamHI克隆位點(diǎn)；Summers和Invitrogen)、以及pBlueBacIII(BamHI、Bgl II、PstI、NcoI和HindIII克隆位點(diǎn)，具有藍(lán)/白重組篩選的可能；Invitrogen)，其中所述融合轉(zhuǎn)移載體如(但不限于)pAc700(BamHI和KpnI克隆位點(diǎn)，其中BamHI識(shí)別位點(diǎn)開始于起始密碼子；Summers)、pAc701和pAc702(與pAc700相同，但具有不同的讀碼框)、pAc360(BamHI克隆位點(diǎn)位于多角體蛋白起始密碼子下游的36堿基對(duì)處；Invitrogen(195))和pBlueBacHisA，B，C(三種不同的讀碼框，具有BamHI、Bgl II、PstI、NcoI和HindIII克隆位點(diǎn)，具有用于ProBond純化的N-末端肽，并具有藍(lán)/白斑重組篩選；Invitrogen(220))。
考慮用于本發(fā)明的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體包括具有誘導(dǎo)型啟動(dòng)子如二氫葉酸還原酶(DHFR)啟動(dòng)子的載體，如具有DHFR表達(dá)載體或DHFR/氨甲喋呤共擴(kuò)增載體的任一表達(dá)載體，如pED(PstI、SalI、SbaI、SmaI和EcoRI克隆位點(diǎn)，該載體表達(dá)克隆基因和DHFR兩者；參見Kaufman，最新分子生物學(xué)方法(Current Protocols in Molecular Biology)，16.12(1991)。備選地，谷氨酰胺合成酶/methionine sulfoximine共擴(kuò)增載體，如pEE14(HindIII、XbaI、SmaI、SbaI、EcoRI和BclI克隆位點(diǎn)，其中載體表達(dá)谷氨酰胺合成酶和克隆基因；Celltech)。在另一實(shí)施方案中，可使用在EB病毒(EBV)調(diào)控下指導(dǎo)游離表達(dá)的載體，如pREP4(BamHI、SfiI、XhoI、NotI、NheI、HindIII、NheI、PvuII和KpnI克隆位點(diǎn)，組成型RSV-LTR啟動(dòng)子，潮霉素選擇性標(biāo)記；Invitrogen)、pCEP4(BamHI、SfiI、XhoI、NotI、NheI、HindIII、NheI、PvuII和KpnI克隆位點(diǎn)，組成型hCMV立即早期基因，潮霉素選擇性標(biāo)記；Invitrogen)、pMEP4(KpnI、PvuI、NheI、HindIII、NotI、XhoI、SfiI、BamHI克隆位點(diǎn)，誘導(dǎo)型金屬硫蛋白Iia基因啟動(dòng)子，潮霉素選擇性標(biāo)記；Invitrogen)、pREP8(BamHI、XhoI、NotI、HindIII、NheI和KpnI克隆位點(diǎn)，RSV-LTR啟動(dòng)子，組氨醇選擇性標(biāo)記；Invitrogen)、pREP9(KpnI、NheI、HindIII、NotI、XhoI、SfiI和BamHI克隆位點(diǎn)，RSV-LTR啟動(dòng)子，G418選擇性標(biāo)記；Invitrogen)、以及pEBVHis(RSV-LTR啟動(dòng)子，潮霉素選擇性標(biāo)記，通過ProBond樹脂可純化并可被腸激酶切割的N-末端肽；Invitrogen)。可選擇用于本發(fā)明的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體包括pRc/CMV(HindIII、BstXI、NotI、SbaI和ApaI克隆位點(diǎn)，G418選擇；Invitrogen)、pRc/RSV(HindIII、SpeI、BstXI、NotI、XbaI克隆位點(diǎn)，G418選擇；Invitrogen)等。用于本發(fā)明的痘苗病毒哺乳動(dòng)物表達(dá)載體(參見Kaufman，1991，見上文)包括但不限于pSC11(SmaI克隆位點(diǎn)，TK-和β-gal選擇)、pMJ601(SalI、SmaI、AflI、NarI、BspMII、BamHI、ApaI、NheI、SacII、KpnI和HindIII克隆位點(diǎn)，TK-和β-gal選擇)、以及pTKgptF1S(EcoRI、PstI、SalI、AccI、HindII、SbaI、BamHI和Hpa克隆位點(diǎn)，TK或XPRT選擇)。
酵母表達(dá)系統(tǒng)也可用于本發(fā)明表達(dá)GAVE18蛋白、其變體、其類似物或衍生物?？捎糜诒景l(fā)明的載體僅提及兩種載體，例如非融合pYES2載體(XbaI、SphI、ShoI、NotI、GstXI、EcoRI、BstXI、BamHI、SacI、KpnI和HindIII克隆位點(diǎn)；Invitrogen)或融合pYESHisA，B，C(XbaI、SphI、ShoI、NotI、BstXI、EcoRI、BamHI、SacI、KpnI和HindIII克隆位點(diǎn)，用ProBond樹脂純化并可被腸激酶切割的N-末端肽；Invitrogen)。
一旦鑒定并分離出特定的重組DNA分子，本領(lǐng)域已知有幾種方法可對(duì)它進(jìn)行增殖。一旦建立了合適的宿主系統(tǒng)和生長條件，可增殖并大量制備重組表達(dá)載體。如以前所解釋的，可使用的表達(dá)載體包括但不限于下列載體或它們的衍生物人類或動(dòng)物病毒如痘苗病毒或腺病毒；昆蟲病毒如桿狀病毒；酵母載體；噬菌體載體(如，λ噬菌體)；以及質(zhì)粒和粘粒DNA載體，在此僅提及部分。
此外，可選擇調(diào)節(jié)插入序列表達(dá)或以所需的特定方式修飾并加工基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞株。不同的宿主細(xì)胞具有特征性的和特異的機(jī)制用于蛋白質(zhì)的翻譯和翻譯后加工和修飾(如糖基化、切割[如信號(hào)序列])?？蛇x擇合適的細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)以確保對(duì)被表達(dá)的外源蛋白進(jìn)行所需的修飾和加工。例如，在細(xì)菌系統(tǒng)中的表達(dá)可用于產(chǎn)生非糖基化的核蛋白產(chǎn)物。
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物本發(fā)明的宿主細(xì)胞也可用于制備非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的宿主細(xì)胞為受精的卵母細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞，所述細(xì)胞中已導(dǎo)入編碼GAVE18的序列。然后該宿主細(xì)胞可以用于產(chǎn)生基因組中導(dǎo)入了外源GAVE18序列的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，或產(chǎn)生其內(nèi)源GAVE18序列已被改變的同源重組動(dòng)物。該動(dòng)物可用以研究GAVE18的功能和/或活性，以及用于鑒定和/或評(píng)估GAVE18活性的調(diào)節(jié)劑。如此處所用，“轉(zhuǎn)基因動(dòng)物”為非人動(dòng)物，優(yōu)選地為哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選地為嚙齒類動(dòng)物如大鼠或小鼠，其中動(dòng)物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞包含轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的其他實(shí)例包括非人靈長類、綿羊、狗、牛、山羊、雞和兩棲動(dòng)物等。
如此處所用，術(shù)語″轉(zhuǎn)基因″是指被整合入細(xì)胞基因組(由所述細(xì)胞發(fā)育出轉(zhuǎn)基因動(dòng)物)并仍然在成熟動(dòng)物基因組中存在的外源DNA。該轉(zhuǎn)基因指導(dǎo)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一種或多種細(xì)胞類型或組織中表達(dá)所編碼的基因產(chǎn)物。如此處所用，“同源重組動(dòng)物”為非人動(dòng)物，優(yōu)選地為哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選地為小鼠，其內(nèi)源GAVE18基因已通過同源重組發(fā)生改變。這在動(dòng)物發(fā)育之前，在內(nèi)源基因以及導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞(如動(dòng)物的胚胎細(xì)胞)的外源DNA分子間完成。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以使用上述的轉(zhuǎn)染方法之一將編碼GAVE18的核酸導(dǎo)入受精卵母細(xì)胞的雄性原核。然后允許卵母細(xì)胞在假孕的雌性代孕動(dòng)物體內(nèi)發(fā)育。GAVE18 cDNA序列(如(SEQ ID NO1)中的序列)可作為轉(zhuǎn)基因?qū)敕侨藙?dòng)物的基因組中。備選地，人GAVE18基因的非人同系物(如小鼠GAVE18基因)可基于與人GAVE18 cDNA的雜交進(jìn)行分離，并用作轉(zhuǎn)基因。內(nèi)含子序列和聚腺苷酸化信號(hào)也可包括在轉(zhuǎn)基因內(nèi)，以提高轉(zhuǎn)基因的表達(dá)效率。組織特異的調(diào)控序列可以以可操作方式連接GAVE18轉(zhuǎn)基因以指導(dǎo)GAVE18蛋白在特定細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。用于通過胚胎操作和顯微注射產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(特別是諸如小鼠等動(dòng)物)的方法是本領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)操作，且可參見如美國專利號(hào)4,736,866和4,870,009、美國專利號(hào)4,873,191和Hogan，小鼠胚胎的操作(Manipulating the MouseEmbryo)(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。可以使用相似的方法產(chǎn)生在基因組中存在轉(zhuǎn)基因和/或在動(dòng)物的組織或細(xì)胞內(nèi)表達(dá)GAVE18 mRNA的其它轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。起始的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可用來繁殖其它的攜帶轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物。此外，攜帶編碼GAVE18轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可進(jìn)一步被培育成攜帶其他轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
為生成同源重組動(dòng)物，制備出含至少部分GAVE18基因(例如，人或非人GAVE18基因同系物，如鼠GAVE18基因)的載體，所述部分GAVE18基因中已經(jīng)導(dǎo)入缺失、添加或替代因而可以改變(如功能性破壞)GAVE18基因。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)載體，以致在同源重組后可破壞內(nèi)源GAVE18基因的功能(即，不再編碼功能蛋白質(zhì)；也稱為“敲除”載體)。
備選地，可設(shè)計(jì)載體，以便在同源重組后內(nèi)源GAVE18基因發(fā)生突變或改變但仍編碼功能蛋白質(zhì)(例如，可改變上游調(diào)控區(qū)域由此改變內(nèi)源GAVE18蛋白的表達(dá))。
在此同源重組載體中，改變的GAVE18基因部分在5′和3′端被GAVE18基因的其它核酸包圍，從而允許在載體攜帶的外源GAVE18基因和存在于胚胎干細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源GAVE18基因之間發(fā)生同源重組。此其它的兩翼GAVE18核酸的長度應(yīng)足以使與內(nèi)源基因的重組成功進(jìn)行。一般地，載體內(nèi)包括幾千堿基的側(cè)翼DNA(5′及3′端)(例如參見，Thomas等，細(xì)胞(Cell)(1987)51503中對(duì)同源重組載體的描述)。
將載體導(dǎo)入(如通過電穿孔)胚胎干細(xì)胞系，且篩選出導(dǎo)入的GAVE18基因與內(nèi)源GAVE18基因發(fā)生同源重組的細(xì)胞(例如參見，Li等，細(xì)胞(Cell)(1992)69915)。然后將篩選出的細(xì)胞注射到動(dòng)物(如小鼠)的胚泡中以形成嵌合集合體(例如參見，Bradley，畸胎癌和胚胎干細(xì)胞實(shí)用方法(Teratocarcinomas and Embryonic Stem CellsA Practical Approach)，Robertson編輯，IRL，Oxford，(1987)，113-152頁)。然后將嵌合胚胎植入合適的假孕雌性代孕動(dòng)物，并使胚胎生長足月。在生殖細(xì)胞中帶有同源重組DNA的子代可用于繁殖動(dòng)物，通過轉(zhuǎn)基因的生殖系傳送，所繁殖的動(dòng)物的所有細(xì)胞都將含有同源重組的DNA。
用于構(gòu)建同源重組載體和同源重組動(dòng)物的方法可以進(jìn)一步參見Bradley，生物/技術(shù)中的最新觀點(diǎn)(Current Opinion in Bio/Technology)(1991)2823-829和PCT公開號(hào)WO 90/11354、WO 91/01140、WO 92/0968和WO 93/04169中的描述。
在另一實(shí)施方案，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物可含有所選系統(tǒng)以允許調(diào)控轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。該系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)例為噬菌體P1的cre/loxP重組酶系統(tǒng)。對(duì)cre/loxP重組酶系統(tǒng)的描述參見如Lakso等，美國國家科學(xué)院院刊(ProcNatl Acad USA))(1992)896232-6236。重組酶系統(tǒng)的另一實(shí)例為釀酒酵母(S.cerevisiae)的FLP重組酶系統(tǒng)(O′Gorrnan等，科學(xué)(Science)(1991)2511351-1355)。如果cre/loxP重組酶系統(tǒng)被用于調(diào)控轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，則需要同時(shí)含有編碼cre重組酶和選定蛋白的轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物。該動(dòng)物可通過構(gòu)建“雙重”轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，例如通過兩轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的交配(所述動(dòng)物中一個(gè)含有編碼選定蛋白的轉(zhuǎn)基因而另一個(gè)含有編碼重組酶的轉(zhuǎn)基因)來提供。
此處描述的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的克隆可根據(jù)以下文獻(xiàn)描述的方法制備，Wilmut等，自然(Nature)(1997)385810-813和PCT公開號(hào)WO 97/07668和WO 97/07669。簡言之，可以分離轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的細(xì)胞如體細(xì)胞，誘導(dǎo)其脫離生長周期并進(jìn)入G0期。然后，通過應(yīng)用如電脈沖將此靜止細(xì)胞與去除細(xì)胞核的卵母細(xì)胞融合，所述去核卵母細(xì)胞與分離的靜止細(xì)胞來自同一動(dòng)物物種。然后培養(yǎng)重建的卵母細(xì)胞以使其發(fā)育成桑椹胚或胚細(xì)胞，然后將其轉(zhuǎn)移到假孕的雌性代孕動(dòng)物體內(nèi)。雌性代孕動(dòng)物生育的后代即是分離細(xì)胞(如體細(xì)胞)所來源的動(dòng)物的克隆。
藥物組合物本發(fā)明的GAVE18核酸分子、GAVE18蛋白和抗-GAVE18抗體(此處也稱作“活性化合物”)可摻入到適于施用的藥物組合物中。該組合物一般包含此核酸分子、蛋白質(zhì)或抗體，以及可藥用載體。如此處所用，術(shù)語“可藥用載體”意在包括任何及所有適合藥物施用的溶劑、分散介質(zhì)、賦形劑、載體、稀釋劑、包衣材料、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和延遲吸收劑等。對(duì)藥物活性物質(zhì)應(yīng)用這些介質(zhì)和藥劑是本領(lǐng)域熟知的。除了與活性化合物不相容的外，任何常規(guī)介質(zhì)或藥劑均可考慮應(yīng)用在組合物內(nèi)。還可以將輔助活性化合物摻入組合物中。
將本發(fā)明的藥物組合物進(jìn)行配制以使其適合于預(yù)定的施用途徑。施用途徑的實(shí)例包括腸胃外用藥，例如靜脈內(nèi)、皮內(nèi)和皮下、經(jīng)口(如吸入)、經(jīng)皮(局部的)、經(jīng)粘膜和直腸用藥。用于腸胃外、皮內(nèi)和皮下給藥的溶液或混懸液可包括以下成分無菌稀釋劑(如用于注射的水)、鹽溶液、不揮發(fā)油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑如芐基醇或羥苯甲酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如EDTA；緩沖劑如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽以及用于調(diào)整滲透壓的試劑如氯化鈉或葡萄糖。pH的調(diào)整可應(yīng)用酸或堿，如HCl或NaOH進(jìn)行。腸胃外制劑可封閉在安瓿瓶、一次性注射器或多劑量小瓶(玻璃或塑料制成)中用以存儲(chǔ)。
適于注射用藥的藥物組合物包括無菌水性溶液(水可混溶的)或分散液，以及用于隨時(shí)制備無菌注射液或分散液的無菌粉末。對(duì)于靜脈內(nèi)施用，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、“Cremophor EL””(BASF；Parsippany，NJ)或磷酸鹽緩沖溶液(PBS)。在所有的情況中，組合物必須無菌且應(yīng)是易于注射的流體。組合物在生產(chǎn)和儲(chǔ)存條件下必須穩(wěn)定，且必須避免微生物(如細(xì)菌和真菌)的污染。載體可為溶劑或分散介質(zhì)，含有如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)和其適宜的混合物。適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性可通過例如使用包衣材料(如卵磷脂)，在分散劑的情況下保持所需的粒子大小和應(yīng)用表面活性劑來維持。多種抗菌劑和抗真菌劑可用來預(yù)防微生物的作用，如對(duì)羥苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗壞血酸、乙基汞硫代水楊酸鈉等。在許多情況下，組合物中優(yōu)選包括等滲劑，例如糖、聚醇(如甘露醇、山梨糖醇)或氯化鈉?？勺⑸浣M合物的延時(shí)吸收可以通過在組合物中加入延緩吸收的試劑實(shí)現(xiàn)，所述試劑如單硬脂酸鋁和明膠。
無菌注射溶液的制備可以按如下進(jìn)行將活性化合物(如GAVE18蛋白或抗-GAVE18抗體)以所需數(shù)量與以上所列成分中的一種或其組合(按需要)摻入到適當(dāng)?shù)娜軇┲?，之后過濾除菌。一般地，分散劑的制備方式是將活性化合物摻入到含堿性分散介質(zhì)和所需其他成分(來自以上列舉的成分)的無菌賦形藥中。對(duì)于用于配制無菌注射溶液的無菌粉末，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，從預(yù)先過濾除菌的溶液產(chǎn)生含有活性成分及任何額外所需成分的粉末。
口服組合物一般包括惰性稀釋液或可食用的載體。組合物可密封于明膠膠囊中或壓成片劑。為用于口服治療性施用目的，可以將活性化合物加入賦形劑中并以片劑、錠劑或膠囊形式使用?？诜M合物也可用流體載體制備以用作漱劑，其中化合物在流體載體中經(jīng)口應(yīng)用、漱口然后吐出或咽下。
可包括藥學(xué)相容的粘合劑和/或輔藥作為組合物的一部分。片劑、丸劑、膠囊、錠劑等可含有以下任一種成分或具有類似性質(zhì)的化合物粘合劑，如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑如淀粉或乳糖；崩解劑如藻酸，Primogel或玉米淀粉；潤滑劑如硬脂酸鎂或Sterotes；助流劑如膠體二氧化硅；甜味劑如蔗糖或糖精；或調(diào)味劑如薄荷、水楊酸甲基酯或橙味調(diào)味品。用于吸入施用時(shí)，化合物以氣溶膠噴霧形式遞送，氣溶膠可由含合適拋射劑(例如，氣體如二氧化碳)的加壓容器或給藥器(dispenser)或噴霧器產(chǎn)生。
全身施用也可通過經(jīng)皮或經(jīng)粘膜途徑進(jìn)行。對(duì)于經(jīng)皮或經(jīng)粘膜施用，可將對(duì)待滲透的屏障而言適宜的滲透劑用于制劑中。該滲透劑一般在本領(lǐng)域內(nèi)公知，且包括如用于經(jīng)粘膜施用的去污劑、膽鹽和梭鏈孢酸衍生物。經(jīng)粘膜施用可通過應(yīng)用鼻噴霧或栓劑完成。對(duì)于經(jīng)皮施用，活性化合物的劑型可以為本領(lǐng)域內(nèi)公知的軟膏、油膏、凝膠或霜?jiǎng)?br> 化合物也可以制備成栓劑(例如，應(yīng)用常規(guī)栓劑基質(zhì)，熔融溫度為哺乳動(dòng)物體溫的潤滑材料，如可可油或其他甘油酯)或灌腸滯留劑形式直腸遞送。
在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，活性化合物應(yīng)用可以保護(hù)化合物避免其從體內(nèi)被快速清除的載體進(jìn)行配制，例如控釋制劑，包括植入物和微囊化遞送系統(tǒng)?？梢詰?yīng)用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。
用于制備這些制劑的方法對(duì)本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員而言是顯而易見的。材料也可從供應(yīng)商處獲得，如Alza公司和Nova Pharmaceuticals，Inc.。也可用脂質(zhì)體懸液(包括帶有單克隆抗體靶向感染細(xì)胞的脂質(zhì)體)作為可藥用載體。這些可根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員公知的方法制備，如參見美國專利號(hào)4,522,811中的描述。
配制單位劑量形式的口服或腸道外用藥組合物是特別有利的，這可以利于施用及劑量的一致性。此處應(yīng)用的單位劑量形式指在物理上不連續(xù)的適用于作為整體給予待治療患者的單位；每一單位含預(yù)定量的活性化合物，該數(shù)量的活性化合物經(jīng)計(jì)算與所需的藥物載體聯(lián)合可產(chǎn)生所需的治療效應(yīng)。根據(jù)疾病的類型及嚴(yán)重程度，施用給患者的起始候選劑量為約1μg/kg到15mg/kg(如0.1-20mg/kg的抗體，無論是通過例如一次或多次單獨(dú)施用或是通過連續(xù)輸注。根據(jù)以上提及的因素，典型的每日劑量可為約1μg/kg到100mg/kg或更大。對(duì)于超過幾天或更長時(shí)間的重復(fù)施用，根據(jù)疾病，治療可持續(xù)進(jìn)行直到獲得了所需的對(duì)疾病癥狀的抑制。但是，也可以使用其他給藥方案。治療的進(jìn)程由常規(guī)的技術(shù)和試驗(yàn)可以容易地進(jìn)行監(jiān)測。一示例性劑給藥方案在WO 94/04188中公開。用于本發(fā)明單位劑量形式的規(guī)格決定于且直接取決于活性化合物的獨(dú)特特性、待獲得的具體治療效果以及復(fù)合該活性化合物用于個(gè)體治療時(shí)本領(lǐng)域所固有的限制。
而且，可將本發(fā)明的核酸分子插入載體并用作基因治療載體。將基因治療載體遞送給患者可通過如靜脈注射、局部施用(美國專利號(hào)5,328,470)或通過立體定位注射(例如參見，Chen等，美國國家科學(xué)院院刊(Proc NatlAcad USA)(1994)913054-3057)進(jìn)行。基因治療載體的藥物制劑可以在可接受稀釋劑中包括基因治療載體；或可以包含其中埋植有基因遞送工具的緩釋基質(zhì)。備選地，當(dāng)整個(gè)基因遞送載體可以從重組細(xì)胞中完整產(chǎn)生時(shí)，例如反轉(zhuǎn)錄病毒載體，藥物制劑可包括一個(gè)或多個(gè)產(chǎn)生此基因遞送系統(tǒng)的細(xì)胞。
藥物組合物可與施用說明書一起包括在容器、包裝或分配器內(nèi)。
本發(fā)明的應(yīng)用和方法本發(fā)明的核酸分子、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)同系物和抗體可用于一種或多種以下的方法中a)篩選試驗(yàn)；b)檢測試驗(yàn)(例如，染色體作圖、組織分型、法醫(yī)生物學(xué))；c)預(yù)測醫(yī)學(xué)(例如，診斷試驗(yàn)、預(yù)后試驗(yàn)、臨床監(jiān)測試驗(yàn)和藥物基因組學(xué))；和d)治療方法(如治療性和預(yù)防性的)。GAVE18蛋白與其他細(xì)胞蛋白質(zhì)相互作用，因此可用于(i)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖；(ii)調(diào)節(jié)細(xì)胞分化；和(iii)調(diào)節(jié)細(xì)胞存活。本發(fā)明的分離的核酸分子可用于表達(dá)GAVE18蛋白(例如，在基因治療應(yīng)用中在宿主細(xì)胞中通過重組表達(dá)載體表達(dá))，用于檢測GAVE18 mRNA(如在生物樣本中)或用于檢測GAVE18基因中的遺傳損傷以及用于調(diào)節(jié)GAVE18活性。此外，GAVE18蛋白可用于篩選能調(diào)節(jié)GAVE18活性或表達(dá)的藥物或化合物；以及用于治療紊亂，所述紊亂的特征為GAVE18蛋白產(chǎn)生不足或過量，或產(chǎn)生的GAVE18蛋白形式與GAVE18野生型蛋白質(zhì)相比活性降低或異常。此外，本發(fā)明抗-GAVE18抗體可用于檢測和分離GAVE18蛋白，以及用于調(diào)節(jié)GAVE18活性。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過以上描述的篩選試驗(yàn)鑒定到的新型藥劑，及其在此處描述的治療中的用途。
篩選試驗(yàn)存在內(nèi)源配體時(shí)激活G蛋白受體將允許G蛋白受體復(fù)合體形成，由此導(dǎo)致GTP結(jié)合G蛋白。G蛋白的GTPase結(jié)構(gòu)域可以將GTP緩慢水解為GDP，在正常情況下導(dǎo)致受體失活。但組成型激活的受體會(huì)持續(xù)將GDP轉(zhuǎn)變成GTP。
G蛋白的不可水解底物[35S]GTPγS可用于監(jiān)測G蛋白與如下胞膜增強(qiáng)的結(jié)合作用，其中所述胞膜表達(dá)組成型激活的受體。Traynor和Nahorski報(bào)道，[35S]GTPγS可用于監(jiān)測在存在和缺乏配體時(shí)與膜偶聯(lián)的G蛋白(MolPharmacol(1995)47(4)848-54)。該試驗(yàn)系統(tǒng)優(yōu)選用于候選化合物的起始篩選，因?yàn)樵撓到y(tǒng)可通用于所有G蛋白偶聯(lián)受體，而不必考慮與受體結(jié)合的具體G蛋白的種類。
Gs20刺激腺苷酰環(huán)化酶，而Gi和Go抑制該酶。如在本領(lǐng)域內(nèi)所公知的，腺苷酰環(huán)化酶催化ATP向cAMP轉(zhuǎn)化；因而，偶聯(lián)Gs蛋白的組成型活化GPCR將與提高的cAMP細(xì)胞水平相關(guān)聯(lián)。備選地，偶聯(lián)Gi(或Go)蛋白的組成型活化GCPRs將與降低的cAMP細(xì)胞水平相關(guān)聯(lián)，參見“突觸傳導(dǎo)的間接機(jī)制(Indirect Mechanism of Synaptic Transmission)”，第8章，從神經(jīng)元到腦(第三版)，Nichols等編，Sinauer Associates，Inc.，1992。因此，檢測cAMP的試驗(yàn)可用于判定候選化合物是否為受體的反向激動(dòng)劑。本領(lǐng)域內(nèi)已知的多種測定cAMP的方法均可以使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗-cAMP抗體用于基于ELISA的試驗(yàn)中。在另一實(shí)施方案中，則考慮全細(xì)胞第二信使報(bào)告系統(tǒng)(見PCT公開號(hào)WO 00/22131)。
在一個(gè)相關(guān)的方面，環(huán)AMP通過促進(jìn)cAMP效應(yīng)DNA結(jié)合蛋白或轉(zhuǎn)錄因子(CREB)的結(jié)合而驅(qū)使基因表達(dá)，其中cAMP效應(yīng)DNA結(jié)合蛋白或轉(zhuǎn)錄因子(CREB)然后在稱為cAMP效應(yīng)元件的特異性位點(diǎn)結(jié)合啟動(dòng)子并驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)。因此可構(gòu)建這樣的報(bào)告體系，其在報(bào)告基因如β-半乳糖苷酶或螢光素酶之前具有包含多個(gè)cAMP效應(yīng)元件的啟動(dòng)子。進(jìn)一步地，當(dāng)組成型活化的Gs-連接受體引起cAMP的累積時(shí)，則可激活基因并表達(dá)報(bào)告蛋白。然后可用標(biāo)準(zhǔn)的生物化學(xué)試驗(yàn)檢測報(bào)告蛋白如β-半乳糖苷酶或螢光素酶(PCT公開號(hào)WO 00/22131)。
其它G蛋白，如Go和Gq，與磷脂酶C的激活相關(guān)，所述磷脂酶又可水解磷脂PIP2釋放出兩個(gè)胞內(nèi)信使甘油二酯(DAG)和1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)。IP3積聚的增加與Gq-相關(guān)受體和Go-相關(guān)受體的激活相關(guān)聯(lián)(PCT公開號(hào)WO 00/22131)。檢測IP3積聚的試驗(yàn)可用于判定候選化合物是否為Gq-相關(guān)受體或Go-相關(guān)受體的反向激動(dòng)劑。Gq-相關(guān)受體還可用AP1報(bào)告試驗(yàn)檢測，該試驗(yàn)在于檢測Gq-依賴的磷脂酶C是否引起了含AP1元件的基因的激活。這樣，激活的Gq-相關(guān)受體將顯示為該基因表達(dá)的增強(qiáng)，而反向激動(dòng)劑將顯示為該表達(dá)的減弱。
本發(fā)明也提供了用于鑒定調(diào)節(jié)劑的方法(此處也稱作“篩選試驗(yàn)”)，所述調(diào)節(jié)劑即能結(jié)合GAVE18蛋白或?qū)鏕AVE18表達(dá)或GAVE18活性具有刺激或抑制效應(yīng)的候選或測試化合物或試劑(例如，肽、肽模擬物(peptidomimetics)、小分子或其他藥物)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于篩選如下候選或測試化合物的試驗(yàn)，所述化合物能結(jié)合膜結(jié)合形式的GAVE18蛋白、多肽或其生物活性部分或調(diào)節(jié)其活性。本發(fā)明的測試化合物可應(yīng)用眾多手段之任一種在本領(lǐng)域內(nèi)公知的組合文庫方法中獲得，包括生物文庫；可空間尋址的平行固相或液相文庫；需要去回旋(deconvolution)的合成文庫方法；“單珠單化合物”文庫方法；和應(yīng)用親和層析選擇的合成文庫方法。生物文庫方法限于肽文庫，而其他四種方法適用于肽、非肽寡聚體或小分子化合物文庫(Lam，抗癌藥物研究(Anticancer Drug Des)(1997)12145)。
用于合成分子文庫的方法的實(shí)例可在本領(lǐng)域內(nèi)找到，例如DeWitt等，美國國家科學(xué)院院刊(Proc Natl Acad USA)(1993)906909；Erb等，美國國家科學(xué)院院刊(Proc Natl Acad USA)(1994)9111422；Zuckermann等，醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志(J Med Chem)(1994)372678；Cho等，科學(xué)(Science)(1993)2611303；Carrell等，Angew Chem Int Ed Engl(1994)332059；Carell等，Angew Chem Int Ed Engl(1994)332061和Gallop等，醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志(JMed Chem)(1994)371233。
化合物文庫可呈現(xiàn)在溶液中(例如，Houghten Bio/Techniques(1992)13412-421)或珠子上(Lam，自然(Nature)(1991)35482-84)、芯片上(Fodor，自然(Nature)(1993)364555-556)、或細(xì)菌(美國專利號(hào)5,223,409)、孢子(美國專利號(hào)5,571,698；5,403,484和5,223,409)、質(zhì)粒(Cull等，美國國家科學(xué)院院刊(Proc Natl Acad USA)(1992)891865-1869)或噬菌體上(Scott等，科學(xué)(Science)(1990)249386-390；Devlin，科學(xué)(Science)(1990)249404-406；Cwirla等，美國國家科學(xué)院院刊(Proc Natl Acad USA)(1990)876378-6382；和Felici，分子生物學(xué)雜志(J Mol Biol)(1991)222301-310)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，試驗(yàn)為基于細(xì)胞的試驗(yàn)，其中使細(xì)胞表面表達(dá)膜結(jié)合形式的GAVE18蛋白(或其生物活性部分)的細(xì)胞與受試化合物接觸，并測定受試化合物結(jié)合GAVE18蛋白的能力。例如，細(xì)胞可為酵母細(xì)胞或哺乳動(dòng)物來源的細(xì)胞。測試化合物與GAVE18蛋白的結(jié)合能力的測定可以通過例如以下方式進(jìn)行將測試化合物與放射性同位素或酶標(biāo)記偶聯(lián)，這樣測試化合物與GAVE18蛋白或其生物活性部分的結(jié)合可通過檢測復(fù)合物中的標(biāo)記化合物進(jìn)行確定。例如，測試化合物可直接或間接標(biāo)記125I、35S、14C或3H，放射性同位素的檢測可通過直接計(jì)數(shù)放射量或通過閃爍計(jì)數(shù)進(jìn)行。備選地，測試化合物可應(yīng)用如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶或螢光素酶進(jìn)行酶標(biāo)記，且酶標(biāo)記的檢測可通過測定適宜的底物向產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化來實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，試驗(yàn)包括將在細(xì)胞表面表達(dá)膜結(jié)合形式的GAVE18蛋白或其生物活性部分的細(xì)胞與可以結(jié)合GAVE18的已知化合物接觸以形成試驗(yàn)混合物，將試驗(yàn)混合物與測試化合物接觸并測定測試化合物與GAVE18蛋白質(zhì)相互作用的能力，其中對(duì)測試化合物與GAVE18蛋白質(zhì)相互作用的能力的測定包括測定測試化合物與已知化合物相比優(yōu)先與GAVE18或其生物活性部分結(jié)合的能力。
在另一實(shí)施方案中，試驗(yàn)為基于細(xì)胞的試驗(yàn)，包括使細(xì)胞表面表達(dá)膜結(jié)合形式的GAVE18蛋白或其生物活性部分的細(xì)胞與測試化合物接觸，并測定測試化合物調(diào)節(jié)(如刺激或抑制)GAVE18蛋白或其生物活性部分的活性的能力。測試化合物調(diào)節(jié)GAVE18或其生物活性部分的活性的能力可通過，例如，測定GAVE18蛋白結(jié)合GAVE18靶分子或與其相互作用的能力來確定。如此處所用，“靶分子”是指天然與GAVE18蛋白結(jié)合或作用的分子，如表達(dá)GAVE18蛋白的細(xì)胞的表面分子、在第二細(xì)胞的表面上的分子、在細(xì)胞外周圍區(qū)域中的分子、與胞膜內(nèi)表面關(guān)聯(lián)的分子或細(xì)胞質(zhì)分子。GAVE18靶分子可不為本發(fā)明的GAVE18分子或GAVE18蛋白或多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，GAVE18靶分子為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的成分，所述途徑促進(jìn)胞外信號(hào)(例如由化合物結(jié)合膜結(jié)合形式的GAVE18分子所產(chǎn)生的信號(hào))通過胞膜向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)。例如，靶分子可為具有催化活性的第二胞內(nèi)蛋白質(zhì)或促進(jìn)下游信號(hào)分子與GAVE18關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)。
GAVE18蛋白與GAVE18靶分子結(jié)合或作用的能力可通過以上描述的用于測定直接結(jié)合的其中一種方法來測定。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，GAVE18蛋白與GAVE18靶分子結(jié)合或作用的能力可通過測定靶分子的活性來確定。靶分子活性的測定方法有例如檢測靶分子對(duì)胞內(nèi)第二信使(如胞內(nèi)Ca2+、甘油二酯、IP3等)的誘導(dǎo)、檢測靶分子對(duì)合適底物的催化/酶促活性、檢測報(bào)告基因(例如可操作地連接編碼可檢測標(biāo)記(如螢光素酶)的核酸的GAVE18效應(yīng)調(diào)控元件)的誘導(dǎo)或檢測細(xì)胞反應(yīng)，例如細(xì)胞分化或細(xì)胞增殖。
本發(fā)明還延伸至無細(xì)胞試驗(yàn)，包括將GAVE18蛋白或其生物活性部分與測試化合物接觸，并測定測試化合物結(jié)合GAVE18蛋白或其生物活性部分的能力。測試化合物與GAVE18蛋白的結(jié)合可以如以上所描述的方式直接或間接進(jìn)行檢測。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，試驗(yàn)包括將GAVE18蛋白或其生物活性部分與能結(jié)合GAVE18的已知化合物接觸以形成試驗(yàn)混合物，將試驗(yàn)混合物與測試化合物接觸并測定測試化合物與GAVE18蛋白相互作用的能力，其中對(duì)測試化合物與GAVE18蛋白相互作用的能力的測定包括測定測試化合物與已知化合物相比優(yōu)先結(jié)合GAVE18或其生物活性部分的能力。
本發(fā)明的另一無細(xì)胞試驗(yàn)涉及將GAVE18蛋白或其生物活性部分與測試化合物接觸并測定測試化合物調(diào)節(jié)(如刺激或抑制)GAVE18蛋白或其生物活性部分的活性的能力。對(duì)測試化合物調(diào)節(jié)GAVE18的活性的能力的測定可通過，例如利用以上描述的用于測定直接結(jié)合的其中一種方法測定GAVE18蛋白結(jié)合GAVE18靶分子的能力來實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，對(duì)測試化合物調(diào)節(jié)GAVE18活性的能力的測定可通過測定GAVE18蛋白進(jìn)一步調(diào)節(jié)GAVE18靶分子的能力來實(shí)現(xiàn)。例如，可以按前述測定靶分子對(duì)適當(dāng)?shù)孜锏拇呋?酶促活性。
又本發(fā)明的另一無細(xì)胞試驗(yàn)包括將GAVE18蛋白或其生物活性部分與能結(jié)合GAVE18的已知化合物接觸以形成試驗(yàn)混合物，將試驗(yàn)混合物與測試化合物接觸并測定測試化合物與GAVE18蛋白相互作用的能力，其中對(duì)測試化合物與GAVE18蛋白相互作用的能力的測定包括測定GAVE18蛋白優(yōu)先結(jié)合GAVE18靶分子或調(diào)節(jié)GAVE18靶分子的活性的能力。
受體可由非配體分子激活，所述非配體分子并不一定抑制配體結(jié)合但可引起受體結(jié)構(gòu)改變以致造成G蛋白結(jié)合或，可能的受體聚集、二聚化或簇集，從而引起激活作用。例如，可以由暴露于細(xì)胞表面的GAVE18的多個(gè)部位產(chǎn)生抗體。這些抗體通過G蛋白級(jí)聯(lián)激活細(xì)胞，這一點(diǎn)可通過標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)(如監(jiān)測cAMP水平或胞內(nèi)Ca2+水平)確定。由于涉及分子作圖，特別是表位作圖，單克隆抗體可能是優(yōu)選的。單克隆抗體可由表達(dá)于細(xì)胞表面的完整受體以及已知形成在細(xì)胞表面的肽引起?？蓱?yīng)用Geysen等，美國專利號(hào)5,998,577的方法以獲得大量的相關(guān)肽。所發(fā)現(xiàn)的可激活GAVE18的抗體可經(jīng)過修飾以最小化與激活GAVE18無關(guān)的活性，如補(bǔ)體結(jié)合。這樣，可對(duì)抗體分子實(shí)行截短或突變以使激活GAVE18以外的活性最小或喪失。例如，對(duì)某些抗體，僅需要抗原結(jié)合部分。這樣，可去除抗體的Fc部分。
將表達(dá)GAVE18的細(xì)胞暴露于抗體以激活GAVE18。然后使激活的細(xì)胞暴露于多種分子以期鑒定出那些改變受體活性(無論是提高激活水平還是降低激活水平)的分子。然后可對(duì)達(dá)此目的的分子在無抗體的情況下在表達(dá)GAVE18的細(xì)胞上進(jìn)行試驗(yàn)，以觀察對(duì)非激活細(xì)胞的效應(yīng)。然后可以用公知的技術(shù)檢測靶分子并將其修飾為候選藥物，用于治療與GAVE18代謝改變相關(guān)的紊亂。
本發(fā)明的無細(xì)胞試驗(yàn)適于應(yīng)用可溶形式和膜結(jié)合形式的GAVE18。對(duì)于包括膜結(jié)合形式的GAVE18的無細(xì)胞試驗(yàn)，可能需要利用增溶劑以使膜結(jié)合形式的GAVE18維持在溶液中。該增溶劑的實(shí)例包括非離子去污劑，如正辛基葡糖苷、正十二烷基葡糖苷、正十二烷基麥芽糖苷、辛?；?N-甲基葡糖酰胺、癸?；?N-甲基葡糖酰胺、Triton X-100、Triton X-114、Thesit、異三癸基聚(乙二醇醚)n、3-[(3-氯氨基丙基)二甲基銨]-1-丙磺酸(CHAPS)、3-[(3-氯氨基丙基)二甲基銨]-2-羥基-1-丙磺酸(CHAPSO)或N-十二烷基-N，N-二甲基-3-銨-1-丙磺酸。
在本發(fā)明以上試驗(yàn)方法的不止一個(gè)實(shí)施方案中，可能需要固定GAVE18或其靶分子以易于從非復(fù)合形式的一種或全部兩種所述蛋白質(zhì)中分離出復(fù)合形式，以及適于試驗(yàn)的自動(dòng)化。在存在或缺乏候選化合物時(shí)測試化合物與GAVE18的結(jié)合或GAVE18與靶分子的相互作用可在任何適用于容納反應(yīng)物的容器內(nèi)完成。該容器的實(shí)例包括微滴板、試管和微離心管。在一個(gè)實(shí)施方案中，可提供融合蛋白，該融合蛋白添加有允許其中一種或全部兩種上述蛋白質(zhì)結(jié)合到基質(zhì)上的結(jié)構(gòu)域。例如可將谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶/GAVE18融合蛋白或谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶/靶融合蛋白吸附到谷胱甘肽SEPHAROSE珠(Sigma Chemical，St.Louis，MO)上。備選地，可應(yīng)用谷胱甘肽衍生的微滴板，然后使微滴板接觸測試化合物，或測試化合物和非吸附靶蛋白或GAVE18蛋白，且在利于形成復(fù)合物的條件下孵育混合物(例如在生理性鹽和pH條件下)。孵育后，洗滌珠子或微滴板孔以移去任何未結(jié)合成分，且直接或間接地測定復(fù)合體的形成，參見以上描述。備選地，可以使復(fù)合物與基質(zhì)解離，且用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測定GAVE18的結(jié)合或活性水平。
其他用于固定蛋白質(zhì)于基質(zhì)上的技術(shù)也可用于本發(fā)明的篩選試驗(yàn)。例如，可利用生物素或鏈霉親和素固定GAVE18或其靶分子。生物素化的GAVE18或靶分子可應(yīng)用本領(lǐng)域內(nèi)公知的技術(shù)(如生物素化試劑盒，PierceChemicals，Rockford，IL)從生物素-NHS(N-羥基-丁二酰亞胺)制備產(chǎn)生，并固定在鏈霉親和素包被的96孔板(Pierce Chemicals)的孔內(nèi)。備選地，可使用與GAVE18或靶分子反應(yīng)但不阻礙GAVE18蛋白結(jié)合靶分子的抗體對(duì)平板的孔進(jìn)行衍生，通過抗體結(jié)合，將未結(jié)合的靶標(biāo)或GAVE18捕獲在孔內(nèi)。除了以上描述的用于檢測GST-固定的復(fù)合物的方法外，用于檢測復(fù)合物的方法還包括應(yīng)用與GAVE18或靶分子反應(yīng)的抗體對(duì)復(fù)合物進(jìn)行的免疫檢測以及依賴于檢測與GAVE18或靶分子連結(jié)的酶促活性的酶聯(lián)試驗(yàn)。
在另一實(shí)施方案中，GAVE18表達(dá)的調(diào)節(jié)劑可通過如下方法鑒定，其中，使細(xì)胞與候選化合物接觸并測定胞內(nèi)GAVE18 mRNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)。將存在候選化合物時(shí)GAVE18 mRNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)水平與缺乏候選化合物時(shí)GAVE18 mRNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)水平進(jìn)行比較。然后，基于該比較，可以鑒定候選化合物是否為GAVE18表達(dá)的調(diào)節(jié)劑。例如，當(dāng)GAVE18 mRNA或蛋白質(zhì)在存在候選化合物時(shí)的表達(dá)大于(統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著大于)缺乏該化合物時(shí)的表達(dá)，則候選化合物被鑒定為GAVE18 mRNA或蛋白質(zhì)表達(dá)的刺激劑或激動(dòng)劑。備選地，當(dāng)GAVE18 mRNA或蛋白質(zhì)在存在候選化合物時(shí)的表達(dá)低于(統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著低于)缺乏該化合物時(shí)的表達(dá)，則候選化合物被鑒定為GAVE18 mRNA或蛋白質(zhì)表達(dá)的抑制劑或拮抗劑。如果GAVE18活性在存在配體或激動(dòng)劑時(shí)減少，或在組成型GAVE18的情況下低于基線，則候選化合物被鑒定為反向激動(dòng)劑。胞內(nèi)GAVE18 mRNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)水平可由此處描述的用于檢測GAVE18 mRNA或蛋白質(zhì)的方法進(jìn)行測定。
而在本發(fā)明另一方面，GAVE18蛋白可在雙雜交或三雜交試驗(yàn)中用作“誘餌蛋白”(例如參見美國專利號(hào)5,283,317；Zervos等，細(xì)胞(Cell)(1993)72223-232；Madura等，生物化學(xué)雜志(J Biol Chem)(1993)26812046-12054；Barrel等，Bio/Techniques(1993)14920-924；Iwabuchi等，癌基因(Oncogene)(1993)81693-1696；和PCT公開號(hào)WO 94/10300)，以鑒定其他與GAVE18結(jié)合或作用(“GAVE18結(jié)合蛋白”或“GAVE18-bp”)并調(diào)節(jié)GAVE18活性的蛋白質(zhì)。該GAVE18-結(jié)合蛋白也可能通過GAVE18蛋白作為如GAVE18途徑的上游或下游元件參予信號(hào)傳播。
由于可制備出大量的純GAVE18，故可以確定出可能功能區(qū)域的構(gòu)象的物理特征，用于合理的藥物設(shè)計(jì)。例如，該分子的IC3區(qū)域和EC結(jié)構(gòu)域?yàn)樘貏e有意義的區(qū)域。一旦確定了區(qū)域的形狀和離子構(gòu)型，可與這些區(qū)域作用的候選藥物即可成型，然后可以在完整細(xì)胞、動(dòng)物和患者中進(jìn)行試驗(yàn)。能夠獲得此3-D結(jié)構(gòu)信息的方法包括X射線晶體學(xué)、NMR光譜學(xué)、分子模建等。3-D結(jié)構(gòu)也可導(dǎo)致鑒定出其他已知蛋白中的類似構(gòu)象位點(diǎn)，而對(duì)于所述蛋白已存在作用于此位點(diǎn)的已知藥物。這些藥物或其衍生物可能能用于GAVE18。
本發(fā)明還涉及由以上篩選試驗(yàn)鑒定到的新藥劑，以及其在此處描述的治療中的應(yīng)用。
本發(fā)明的試驗(yàn)
A.檢測試驗(yàn)本發(fā)明DNA序列的部分或片段可在多個(gè)方面用作多核苷酸試劑。例如，序列可用于(i)在染色體上對(duì)相應(yīng)的基因繪圖并，由此定位與遺傳疾病相關(guān)的基因區(qū)域；(ii)從微小量生物樣本中對(duì)個(gè)體實(shí)施鑒定(組織分型)；和(iii)為生物樣本的法醫(yī)鑒定提供幫助。這些應(yīng)用在以下的分段中描述。
1.染色體作圖一旦分離出基因的序列(或序列的一部分)，則該序列可用于在染色體上定位GAVE18基因。因此，此處描述的GAVE18核酸分子或其片段可用于在基因組中作圖定位GAVE18。在基因組特別是人基因組中對(duì)GAVE18序列的作圖定位是確定該序列與疾病相關(guān)基因之間的關(guān)系的重要第一步。簡言之，通過從GAVE18序列中制備PCR引物(優(yōu)選的長度為15-25bp)，可以對(duì)GAVE18基因在基因組中作圖。該引物可用于對(duì)包含單個(gè)人染色體的體細(xì)胞雜合體進(jìn)行PCR篩選。僅有包含與GAVE18序列對(duì)應(yīng)的人類基因的那些雜合體能產(chǎn)生擴(kuò)增片段。
通過融合不同哺乳動(dòng)物來源的體細(xì)胞(例如，人和小鼠的細(xì)胞)制備體細(xì)胞雜合體。人和小鼠細(xì)胞的雜合體在生長和分裂時(shí)，一般人的染色體會(huì)出現(xiàn)隨機(jī)丟失，而小鼠染色體保留。通過應(yīng)用小鼠細(xì)胞(由于缺乏特定的酶)不能但人細(xì)胞可以在其中生長的培養(yǎng)基，含編碼所需酶的基因的一條人染色體將得以保留。通過應(yīng)用多種培養(yǎng)基，可以建立一組雜合細(xì)胞系。組內(nèi)每一細(xì)胞系含單一的人染色體或小數(shù)目的人染色體及一整套鼠染色體，從而使得可以容易地將單獨(dú)的基因作圖定位于特定的人染色體上(D′Eustachio等，科學(xué)(Science)(1983)220919-924)。還可通過應(yīng)用帶有易位和缺失的人染色體制備僅含人染色體片段的體細(xì)胞雜合體。
體細(xì)胞雜合體的PCR作圖是一種將特定序列定位于特定染色體上的快速方法。每臺(tái)熱循環(huán)儀每天可定位三段或更多的序列。
其他作圖策略可同樣用于在基因組中特定染色體上對(duì)GAVE18序列進(jìn)行作圖，包括原位雜交(描述于Fan等，美國國家科學(xué)院院刊(Proc NatlAcad USA)(1990)876223-27)、用標(biāo)記的流式分揀染色體預(yù)篩選和通過與染色體特異的cDNA文庫雜交進(jìn)行預(yù)選擇。
可使用DNA序列與中期染色體鋪展物的熒光原位雜交(FISH)一步提供精確的染色體定位。染色體鋪展物的制備可應(yīng)用被化學(xué)物阻滯在分裂中期的細(xì)胞進(jìn)行，所述化學(xué)物如可破壞有絲分裂紡錘體的秋水仙堿。染色體可以用胰蛋白酶短暫處理然后進(jìn)行Giemsa染色。每條染色體上會(huì)出現(xiàn)亮帶和暗帶圖案，由此可鑒定出各染色體。FISH技術(shù)可應(yīng)用500或600個(gè)堿基的DNA序列進(jìn)行。但是，大于1,000個(gè)堿基的克隆更有可能結(jié)合獨(dú)特的染色體位置并產(chǎn)生足夠的信號(hào)強(qiáng)度以便簡單檢測。優(yōu)選地1,000個(gè)堿基且更優(yōu)選地2,000個(gè)堿基將足以在合理的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生好的結(jié)果。參見Verma等的有關(guān)該技術(shù)的綜述(人類染色體基礎(chǔ)操作手冊(cè)(Human ChromosomesA Manual of Basic Techniques)(Pergamon Press，New York，1988))。染色體作圖可以在硅片上(in silico)考慮統(tǒng)計(jì)學(xué)因素，如優(yōu)勢對(duì)數(shù)得分或單純接近度(mere proximity)進(jìn)行推斷。
用于染色體作圖的試劑可單個(gè)應(yīng)用以定位染色體上的單一位點(diǎn)。而且可應(yīng)用一組試劑標(biāo)記多個(gè)位點(diǎn)和/或多條染色體。對(duì)作圖目的，實(shí)際上優(yōu)選對(duì)應(yīng)于GAVE18基因兩翼區(qū)域的試劑。編碼序列在基因家族內(nèi)更可能保守，因此增加了染色體作圖中交叉雜交的機(jī)會(huì)。
一旦將序列繪制在精確的染色體位置，則可以將序列在染色體上的物理位置與遺傳圖譜數(shù)據(jù)聯(lián)系起來(該數(shù)據(jù)存放在例如McKusick，人類的孟德爾遺傳(Mendelian Inheritance in Man)中，可在線從Johns Hopkins大學(xué)的Welch醫(yī)學(xué)圖書館獲得)。然后，基因和繪圖定位于同一染色體區(qū)域的疾病之間的關(guān)系，可通過連鎖分析進(jìn)行確定(物理上鄰近基因的共遺傳)，如參見Egeland等，自然(Nature)(1987)325783-787中的描述。
此外，可測定受到或未受到GAVE18相關(guān)疾病影響的個(gè)體之間DNA序列的差異。如果在一些或全部的受影響個(gè)體中觀察到突變而未在任何未受影響的個(gè)體中觀察到此突變，則該突變可能為特定疾病的致病因子。對(duì)受到影響和未受到影響的個(gè)體的比較一般包括首先在染色體中尋找結(jié)構(gòu)的改變，如缺失或易位，所述改變可在染色體鋪展物中觀察到或可應(yīng)用基于該DNA序列的PCR檢測到。最終，可對(duì)來自幾個(gè)個(gè)體的基因進(jìn)行完整測序，以證實(shí)突變的存在并將突變與多態(tài)性區(qū)分開來。
2.組織分型本發(fā)明的GAVE18序列也可用于從少量生物樣本出發(fā)對(duì)個(gè)體進(jìn)行鑒定。例如，美國部隊(duì)正考慮將限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)用于人員的鑒定。該技術(shù)中，用一種或多種限制性酶消化個(gè)體的基因組DNA，在Southern印跡中用探針探測以產(chǎn)生獨(dú)特的條帶用于鑒定。該方法避免了目前身份識(shí)別標(biāo)識(shí)(Dog Tags)方法的局限性，所述局限性為可丟失、轉(zhuǎn)換或被竊，這使得陽性鑒定變得困難。本發(fā)明的序列可用作RFLP的額外DNA標(biāo)記(在美國專利號(hào)5,272,057中描述)。
此外，本發(fā)明的序列可用于提供備選的技術(shù)以逐個(gè)堿基確定個(gè)體基因組中選定部位的實(shí)際DNA序列。這樣，此處描述的GAVE18序列可用于制備針對(duì)序列的5’和3′末端的兩段PCR引物。然后可以使用所述引物擴(kuò)增個(gè)體的DNA并隨后提供其序列。
由此方式從個(gè)體得到的相應(yīng)DNA序列組將提供獨(dú)特的個(gè)體身份辨識(shí)方法，這是因?yàn)橛捎诘任换虻牟町愂沟妹恳粋€(gè)體將具有獨(dú)特的一套該DNA序列?？蓱?yīng)用本發(fā)明的序列從個(gè)體和組織獲得此身份辨識(shí)序列。本發(fā)明的GAVE18序列是人類基因組中的一個(gè)獨(dú)特部分。在該序列的編碼區(qū)有一定程度的等位基因變異，且在非編碼區(qū)有程度更高的變異。據(jù)估計(jì)人類個(gè)體間等位基因變異的頻率為每500個(gè)堿基約發(fā)生一次。此處描述的每個(gè)序列均可在某種程度上作為標(biāo)準(zhǔn)，與來自個(gè)體的DNA比較用于鑒定的目的。由于非編碼區(qū)有更多數(shù)目的多態(tài)性，故區(qū)分個(gè)體只需要較少的序列。應(yīng)用一組約10到1,000個(gè)引物(每條引物產(chǎn)生100個(gè)堿基的非編碼擴(kuò)增序列)，SEQ ID NO1的非編碼序列可提供陽性的個(gè)體鑒定。如果應(yīng)用預(yù)測的編碼序列如SEQ ID NO1中的那些，對(duì)于陽性個(gè)體鑒定，更為合適的引物數(shù)目將為500-2,000。
如果使用來自GAVE18序列的一組試劑(如此處所描述)來產(chǎn)生個(gè)體的獨(dú)特身份辨識(shí)數(shù)據(jù)庫，則同樣的試劑可隨后用于鑒定來自該個(gè)體的組織。應(yīng)用此獨(dú)特身份辨識(shí)數(shù)據(jù)庫，可從極其少量的組織樣本出發(fā)實(shí)現(xiàn)個(gè)體(存活的或死亡的)的陽性鑒定。
3.GAVE18部分序列在法醫(yī)生物學(xué)中的應(yīng)用基于DNA的鑒定技術(shù)也可用于法醫(yī)生物學(xué)中。法醫(yī)生物學(xué)為應(yīng)用對(duì)犯罪現(xiàn)場發(fā)現(xiàn)的生物證據(jù)進(jìn)行遺傳分型來作為陽性鑒定(如犯罪者)手段的一個(gè)科學(xué)領(lǐng)域。為進(jìn)行鑒定，可應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增取自很少量生物樣本的DNA序列，所述生物樣本如發(fā)現(xiàn)于犯罪現(xiàn)場的組織(如頭發(fā)或皮膚)或體液(如血液、唾液或精液)。然后可與標(biāo)準(zhǔn)品比較擴(kuò)增序列，由此允許鑒定出生物樣本的來源。
本發(fā)明的序列可用于提供靶向人類基因組特定位點(diǎn)的多核苷酸試劑如PCR引物，可增加基于DNA的法醫(yī)鑒定的可靠性。例如，目的核酸可提供另一“鑒定標(biāo)記”(即，特定個(gè)體所特有的另一DNA序列)。如以上提到的，實(shí)際的堿基序列信息可作為由限制性酶產(chǎn)生的片段圖形的一個(gè)精確備選方案用于鑒定目的。靶向SEQ ID NO1非編碼區(qū)的序列特別適用于此用途，因?yàn)樵摲蔷幋a區(qū)存在大量數(shù)目的多態(tài)性，從而提高了應(yīng)用該技術(shù)區(qū)分個(gè)體的辨別力。多核苷酸試劑的實(shí)例包括GAVE18序列或其部分，例如來自SEQ ID NO1非編碼區(qū)且長度為至少20到30個(gè)堿基的片段。
此處描述的GAVE18序列還可用于提供如下多核苷酸試劑，如被標(biāo)記的探針或標(biāo)記探針，所述試劑可用于如原位雜交技術(shù)中以鑒定特定的組織(如腦組織)。當(dāng)提供給法醫(yī)病理學(xué)家的是未知來源的細(xì)胞或降解組織時(shí)，這會(huì)十分有用。該GAVE18探針組可用于鑒定組織的物種和/或器官類型。
以類似的方式，諸如GAVE18引物或探針等試劑可用于篩選受污染的組織培養(yǎng)物(即在培養(yǎng)物中甄別不同類型細(xì)胞混合物的存在)。
B.預(yù)測醫(yī)學(xué)本發(fā)明也涉及預(yù)測醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，其中診斷試驗(yàn)、預(yù)后試驗(yàn)、藥物基因組學(xué)和臨床監(jiān)測試驗(yàn)被用于預(yù)后(預(yù)測性)目的以預(yù)防性治療個(gè)體。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及診斷試驗(yàn)，該試驗(yàn)用于在生物樣本(如血、尿、糞、痰、血清、細(xì)胞和組織)環(huán)境中測定GAVE18蛋白和/或核酸的表達(dá)以及GAVE18的活性?？蓱?yīng)用此試驗(yàn)確定個(gè)體是否患有與異常GAVE18表達(dá)或活性相關(guān)的疾病或紊亂或存在疾病發(fā)生危險(xiǎn)性。
本發(fā)明也提供預(yù)后(或預(yù)測性)試驗(yàn)，以確定個(gè)體是否存在罹患與GAVE18蛋白、核酸表達(dá)或活性有關(guān)的紊亂的危險(xiǎn)。例如，可以在生物樣本中測試GAVE18基因中的突變。該試驗(yàn)可用于預(yù)后或預(yù)測性的目的，由此可以在以GAVE18蛋白、核酸的表達(dá)或活性為特征或與其相關(guān)的紊亂發(fā)作之前預(yù)防性治療個(gè)體。
本發(fā)明另一方面提供了用于測定個(gè)體的GAVE18蛋白、核酸的表達(dá)或GAVE18的活性以便由此選擇合適的治療性或預(yù)防性藥劑用于該個(gè)體的方法(此處稱為“藥物基因組學(xué)”)。藥物基因組學(xué)允許基于個(gè)體的基因型(如檢查個(gè)體基因型以判定個(gè)體對(duì)特定藥劑的反應(yīng)能力)選擇藥劑(如藥物)用于治療性或預(yù)防性治療個(gè)體。
而在本發(fā)明另外的方面，涉及到在臨床試驗(yàn)中監(jiān)測藥劑(如藥物或其他化合物)對(duì)GAVE18表達(dá)或活性的影響。這些以及其他的藥劑在以下的部分中作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
1.診斷試驗(yàn)用于檢測生物樣本中GAVE18存在與否的示例性方法包括從受試對(duì)象中獲得生物樣本，并將生物樣本與可檢測GAVE18蛋白或編碼GAVE18蛋白的核酸(如mRNA或基因組DNA)的化合物或試劑接觸，以檢測生物樣本中GAVE18的存在。用于檢測GAVE18 mRNA或基因組DNA的優(yōu)選試劑為能夠與GAVE18 mRNA或基因組DNA雜交的標(biāo)記核酸探針。核酸探針可為，例如全長GAVE18核酸，如SEQ ID NO1的核酸或其部分，如長度為至少15、30、50、100、250、500或更多個(gè)核苷酸并且足于在嚴(yán)格的條件下足以特異雜交到GAVE18 mRNA或基因組DNA上的寡核苷酸?？捎糜诒景l(fā)明診斷試驗(yàn)的其它合適探針在本文中有描述。
用于檢測GAVE18蛋白的優(yōu)選試劑為能夠結(jié)合GAVE18蛋白的抗體，優(yōu)選地為帶有可檢測標(biāo)記的抗體?？贵w可為多克隆的或更優(yōu)選地為單克隆的。可應(yīng)用完整的抗體或其片段(例如Fab或F(ab′)2)。術(shù)語“生物樣本”意在包括從受試對(duì)象分離的組織、細(xì)胞和生物體液，以及存在于受試對(duì)象體內(nèi)的組織、細(xì)胞和體液。即，本發(fā)明的檢測方法可用于在體外及體內(nèi)檢測生物樣本中的GAVE18 mRNA、蛋白質(zhì)或基因組DNA。例如，用于體外檢測GAVE18 mRNA的技術(shù)包括Northern雜交和原位雜交。用于在體外檢測GAVE18蛋白的技術(shù)包括ELISA、Western印跡、免疫沉淀和免疫熒光。用于體外檢測GAVE18基因組DNA的技術(shù)包括Southern雜交。此外，用于體內(nèi)檢測GAVE18蛋白的技術(shù)包括向受試者體內(nèi)導(dǎo)入標(biāo)記的抗-GAVE18抗體。例如，可給抗體標(biāo)記上放射活性標(biāo)志，其在受試者體內(nèi)的存在和部位可通過標(biāo)準(zhǔn)成象技術(shù)檢測。
在一個(gè)實(shí)施方案中，生物樣本含有來自受試對(duì)象的蛋白質(zhì)分子?；蛘撸飿颖究梢院衼碜允茉噷?duì)象的mRNA分子或來自受試對(duì)象的基因組DNA分子。優(yōu)選的生物樣本是利用常規(guī)手段從受試對(duì)象分離到的外周血白細(xì)胞樣本。
因此，在開發(fā)預(yù)后或診斷實(shí)驗(yàn)時(shí)，將鑒定核酸或蛋白質(zhì)的多態(tài)性與疾病聯(lián)系起來用于診斷攜帶者或患者可能是有益的。例如，對(duì)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、節(jié)段性回腸炎等，進(jìn)行預(yù)后或診斷試驗(yàn)將是有益的。GAVE18表達(dá)水平在激活或炎性狀態(tài)的細(xì)胞中上升。與炎性有關(guān)的紊亂包括過敏性疾病、結(jié)腸炎、節(jié)段性回腸炎、水腫、接觸性過敏、過敏反應(yīng)、其他形式的關(guān)節(jié)炎、腦膜炎及其中免疫系統(tǒng)對(duì)損害產(chǎn)生反應(yīng)的其它疾病，所述反應(yīng)為通過血管擴(kuò)張、發(fā)熱、細(xì)胞聚集、體液等而在某位點(diǎn)造成腫脹等。因此，GAVE18代謝的紊亂可用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的診斷。而且，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的分子機(jī)制可能是可檢測的，例如，可能存在可以在組織樣本(如血液樣本)中進(jìn)行檢測的診斷性SNP、RFLP、表達(dá)水平的變化性、功能的變化性等等。
在另一實(shí)施方案中，這些方法還包括從對(duì)照受試者獲得生物樣本；使對(duì)照樣本與能夠檢測GAVE18蛋白、mRNA或基因組DNA的化合物或試劑接觸，以便檢測生物樣本中GAVE蛋白質(zhì)、mRNA或基因組DNA的存在和數(shù)量；和將對(duì)照樣本中GAVE18蛋白、mRNA或基因組DNA的存在和數(shù)量與測試樣本中GAVE18蛋白、mRNA或基因組DNA的存在和數(shù)量進(jìn)行比較。
化學(xué)文庫的高通量鑒定法對(duì)可調(diào)節(jié)GAVE18活性的化合物的任一鑒定法均可采用高通量篩選。高通篩選系統(tǒng)可從商業(yè)途徑獲得(參見如Zymark Corp.，Hopkinton，MA；Air Technical Industries，Mentor，OH；Beckman Instruments，Inc.，F(xiàn)ullerton，CA；Precision Systems，Inc.，Natick，MA等)。這些系統(tǒng)一般在適用于鑒定法的檢測器中自動(dòng)操作全部步驟，包括所有樣本和試劑的移液、液體分發(fā)、定時(shí)孵育和最后微量板的讀數(shù)。這些裝配系統(tǒng)提供了高通量和快啟動(dòng)，并提供了高度的靈活性和用戶化。此類系統(tǒng)的生產(chǎn)商提供了多種高通量的詳細(xì)方法。因此，如Zymark Corp.提供了描述以下篩選系統(tǒng)的技術(shù)公告，所述篩選系統(tǒng)用于檢測對(duì)基因轉(zhuǎn)錄、配體結(jié)合等的調(diào)節(jié)。
試劑盒本發(fā)明還包括檢測生物樣本(測試樣本)中GAVE18存在的試劑盒。該試劑盒可以用于確定受試者是否患有或有增加的危險(xiǎn)性患有與GAVE18異常表達(dá)有關(guān)的疾病(例如惡性腫瘤)。例如，該試劑盒可以包含能夠檢測生物樣本中的GAVE18蛋白或mRNA的標(biāo)記化合物或試劑以及用于檢測樣本中GAVE18數(shù)量的手段(例如，抗GAVE18抗體或能與GAVE18的編碼DNA(例如SEQ ID NO1)結(jié)合的寡核苷酸探針)。當(dāng)GAVE18蛋白或mRNA的數(shù)量高于或低于正常水平時(shí)，試劑盒還可以用于得出受試對(duì)象是否患有或有危險(xiǎn)患有與GAVE18異常表達(dá)相關(guān)的疾病的結(jié)果。
對(duì)于基于抗體的試劑盒，其可以包含例如(1)可與GAVE18蛋白結(jié)合的第一抗體(例如附著在固相支持物上)；和，任選地，(2)可與GAVE18蛋白或與第一抗體結(jié)合并綴合有可檢測試劑的不同第二抗體。如果不存在第二抗體，則可以使用能與第一抗體結(jié)合并可以被標(biāo)記的另一分子，或標(biāo)記該第一抗體。正如本領(lǐng)域已知的，無論如何都應(yīng)包括已標(biāo)記的結(jié)合部分以充當(dāng)可檢測報(bào)道分子。
對(duì)于基于寡核苷酸的試劑盒，其可以包含，例如(1)可與GAVE18核酸序列雜交的寡核苷酸，例如可檢測標(biāo)記的寡核苷酸或(2)可用于擴(kuò)增GAVE18核酸分子的引物對(duì)。
試劑盒還可以包含例如緩沖劑、防腐劑或蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。試劑盒還可以包含在探測可檢測試劑(例如酶或底物)時(shí)所必需的成分。而且，試劑盒還可以含有可以進(jìn)行分析和與測試樣本進(jìn)行比較的對(duì)照樣本或一系列對(duì)照樣本。試劑盒的每一個(gè)成分通常裝在不同的容器中，并且所有這些不同容器被放在一個(gè)包裝中。包裝中也可包括用于觀察受試對(duì)象是否患有或有危險(xiǎn)患有GAVE18表達(dá)異常相關(guān)疾病的說明書。
2.預(yù)后實(shí)驗(yàn)本文中所描述的方法可進(jìn)一步用作診斷或者預(yù)后試驗(yàn)以鑒定受試者是否患有或有危險(xiǎn)患有與異常GAVE18表達(dá)或活性有關(guān)的疾病或病癥。例如，本文中所描述的試驗(yàn)，例如前瞻性診斷試驗(yàn)或后隨試驗(yàn)，可用于鑒定患有或者有危險(xiǎn)患有與GAVE18蛋白、核酸的表達(dá)或活性有關(guān)的病癥的受試者。例如，近來與細(xì)菌的接觸或患有與哮喘、慢性阻塞性肺病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有關(guān)的炎癥易于用這個(gè)試驗(yàn)來檢驗(yàn)。作為一種備選方案，可以使用預(yù)后試驗(yàn)鑒定患有或有危險(xiǎn)患有此疾病或病癥的受試者。
因此，本發(fā)明提供了一個(gè)方法，其中從受試者獲得測試樣本，并檢測GAVE18蛋白或核酸(例如mRNA或基因組DNA)。GAVE18蛋白或核酸的存在可以用于診斷患有或有危險(xiǎn)患有與異常GAVE18表達(dá)或活性有關(guān)的疾病或病癥的受試者。本文中所用的“測試樣本”指來自目的受試者的生物樣本。例如，測試樣本可以是生物液體(例如血清)、細(xì)胞樣本或組織。
此外，此處所描述的預(yù)后試驗(yàn)可用于判定能否給受試者施用藥劑(例如，激動(dòng)劑，拮抗劑，肽模擬物，蛋白質(zhì)，肽，核酸，小分子或其他候選藥物)以治療與異常GAVE18表達(dá)或活性有關(guān)的疾病或病癥。例如，這些方法可用于判定特定藥劑或藥劑類(例如降低GAVE18活性的藥劑類)能否有效地治療受試者。因此，本發(fā)明提供了一種方法，由此可以判定藥劑是否能有效地治療患者的與異常GAVE18表達(dá)或活性相關(guān)的病癥，其中獲取測試樣本，并檢測GAVE18蛋白或核酸(例如，其中，GAVE18蛋白或核酸的存在可以用于診斷受試者是否可以通過給予藥劑治療與異常GAVE18表達(dá)或活性有關(guān)的病癥)。
本發(fā)明的方法還可用于檢測GAVE18基因的遺傳損傷或者突變，由此確定帶有損傷基因的受試者是否有出現(xiàn)如下病癥的危險(xiǎn)性，所述病癥的特征在于異常細(xì)胞增殖和/或分化。在優(yōu)選實(shí)施方案中，此方法包括在來自受試者的細(xì)胞樣本中檢測如下遺傳損傷或突變存在與否，所述損傷或突變的特征在于存在至少一個(gè)影響編碼GAVE18蛋白的基因的完整性的改變或者造成GAVE18基因錯(cuò)誤表達(dá)的改變。例如，這些遺傳損傷或突變可以通過確定至少一種如下情況的存在來檢測1) GAVE18基因中一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失；2) GAVE18基因中一個(gè)或多個(gè)核苷酸的增加；3) GAVE18基因中一個(gè)或多個(gè)核苷酸的替換；4) 涉及GAVE18基因的染色體重排；5) GAVE18基因的信使RNA轉(zhuǎn)錄本水平的改變；6) GAVE18基因的異常修飾，例如基因組DNA的甲基化模式的異常改變；7) GAVE18蛋白的非野生型水平；8) GAVE18基因的等位基因丟失；以及9) GAVE18蛋白的不恰當(dāng)?shù)姆g后修飾。
如本文所述，在本領(lǐng)域中有大量已知的實(shí)驗(yàn)技術(shù)可用于檢測GAVE18基因中的損傷。優(yōu)選的生物樣本是用常規(guī)方法從受試者分離得到的外周血白細(xì)胞樣本。
在某些實(shí)施方案中，損傷的檢測涉及在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)(見，例如美國專利號(hào)4,683,195和4,683,202)，例如錨定PCR或RACE PCR中，或者，作為一種選擇，在連接鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)(見，例如Landegran等，科學(xué)(Science)(1988)2411077-1080；和Nakazawa等，美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc Natl Acad Sci USA)(1994)91360-364)中使用探針/引物，其中后者在檢測GAVE18基因中的點(diǎn)突變時(shí)尤其有用(見，例如Abravaya等，核酸研究(Nucleic Acids Res)(1995)23675-682)。該方法可以包括如下步驟從患者收集細(xì)胞樣本，分離樣本細(xì)胞的核酸(例如，基因組，mRNA或者兩者)，在一定條件下使核酸樣本與一個(gè)或多個(gè)可與GAVE18基因特異雜交的引物接觸以實(shí)現(xiàn)GAVE18基因(如果存在的話)的雜交和擴(kuò)增，然后檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的存在與否或者檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的大小并將此長度與對(duì)照樣本比較。預(yù)期可能有利的是將PCR和/或LCR用作初始擴(kuò)增步驟與本文中描述的用于檢測突變的任何技術(shù)相結(jié)合。
可選擇的擴(kuò)增方法包括自動(dòng)維持的序列擴(kuò)增(Guatelli等，美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc Natl Acad Sci USA)(1990)871874-1878)，轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增系統(tǒng)(Kwoh等，美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc Natl Acad Sci USA) (1989)861173-1177)，Q-β復(fù)制酶(Lizardi等，Bio/Technology(1988)61197)或任何其他核酸擴(kuò)增方法，之后可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)檢測擴(kuò)增的分子。這些檢測方案對(duì)檢測以非常低數(shù)量存在的核酸分子尤其有用。
在一個(gè)備選實(shí)施方案中，樣本細(xì)胞中GAVE18基因的突變可以通過限制性酶切割式樣的改變而得以鑒定。例如，可以分離樣本和對(duì)照DNA，進(jìn)行擴(kuò)增(任選地)，用一個(gè)或多個(gè)限制性內(nèi)切酶消化，通過凝膠電泳來測定片段的長度尺寸并進(jìn)行對(duì)比。在樣本與對(duì)照DNA之間片段長度的差異指示出樣本DNA中有突變。另外，序列特異的核酶(見，例如美國專利號(hào)5,498,531)也可以用于通過核酶酶切位點(diǎn)的產(chǎn)生或丟失評(píng)判特異突變的存在。
在其他實(shí)施方案中，可通過樣本和對(duì)照核酸(例如DNA或RNA)與含有成百或上千的寡核苷酸探針的高密度陣列(Cronin等，HumanMutation(1996)7244-255；Kozal等，自然醫(yī)藥(Nature Medicine)(1996)2753-759)雜交的方法來鑒定GAVE18的遺傳突變。例如，GAVE18的遺傳突變可以用含有發(fā)光DNA探針的二維陣列來鑒定，參見如Cronin等，同上。簡言之，第一雜交探針陣列可用于對(duì)樣本和對(duì)照中的長鏈DNA進(jìn)行掃描，通過產(chǎn)生順序重疊探針線形陣列來鑒定兩序列間的堿基改變。該步驟允許鑒定點(diǎn)突變。這個(gè)步驟之后為第二雜交陣列，它通過使用能與所有檢測的變體或突變體互補(bǔ)的較小特異化探針的陣列，可以對(duì)具體突變進(jìn)行表征。每個(gè)突變陣列都由平行探針組構(gòu)成，一個(gè)與野生型基因互補(bǔ)而另一個(gè)與突變基因互補(bǔ)。
又在另一個(gè)實(shí)施方案中，本領(lǐng)域已知的任何一種測序反應(yīng)都可用于直接地對(duì)GAVE18基因測序，以及通過樣本GAVE18序列與相應(yīng)野生型(對(duì)照)序列的比較來檢測突變。測序反應(yīng)的實(shí)例包括以Maxam和Gilbert(美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc Natl Acad Sci USA)(1977)74560)或者Sanger(美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc Natl Acad Sci USA)(1977)745463)開發(fā)的技術(shù)為基礎(chǔ)的那些反應(yīng)。也可以考慮利用任何一種自動(dòng)測序方法實(shí)施診斷試驗(yàn)(Bio/Techniques(1995)19448)，包括用質(zhì)譜進(jìn)行測序(見，例如，PCT公開號(hào)WO 94/16101；Cohen等，Adv Chromatogr(1996)36127-162；和Griffin等，應(yīng)用生物化學(xué)與生物技術(shù)(Appl BiochemBiotechnol)(1993)38147-159)。
其他可用于檢測GAVE18基因中的突變的方法包括如下方法，在該方法中通過保護(hù)作用防止切割劑的切割，得以檢測RNA/RNA或RNA/DNA異源雙鏈體中的堿基錯(cuò)配(Myers等，科學(xué)(Science)(1985)2301242)。一般，“錯(cuò)配切割”技術(shù)中必須提供由含有野生型GAVE18序列的(標(biāo)記的)RNA或DNA與獲自組織樣本的潛在突變RNA或DNA雜交形成的異源雙鏈體。用切割雙鏈體中的單鏈區(qū)域的試劑處理此雙鏈體，所述雙鏈體中的單鏈區(qū)域可以因?yàn)槔鐚?duì)照與樣本鏈之間的堿基對(duì)錯(cuò)配而存在。RNA/DNA雙鏈體可以用RNAase來處理以消化錯(cuò)配區(qū)域，DNA/DNA雜合體可以用S1核酸酶來處理以消化錯(cuò)配區(qū)域。在其他實(shí)施方案中，DNA/DNA或者RNA/DNA雙鏈體可以用羥胺或鋨酸及哌啶來處理以消化錯(cuò)配區(qū)域。消化錯(cuò)配區(qū)域之后，所得物質(zhì)在變性聚丙烯酰胺凝膠上根據(jù)大小分離，從而確定出突變的位點(diǎn)，參見例如Cotton等，美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc Natl Acad Sci USA)(1988)854397；Saleeba等，酶學(xué)方法(Methods Enzymol)(1992)217286-295。在優(yōu)選實(shí)施方案中，可以標(biāo)記對(duì)照DNA或RNA以利于檢測。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，錯(cuò)配切割反應(yīng)使用一個(gè)或多個(gè)能識(shí)別雙鏈DNA中錯(cuò)配堿基對(duì)的蛋白(所謂的“DNA錯(cuò)配修復(fù)酶”)在規(guī)定系統(tǒng)中檢測從樣本細(xì)胞獲得的GAVE18 cDNA中的點(diǎn)突變并對(duì)其作圖。例如，大腸桿菌的mutY酶切割G/A錯(cuò)配處的A，來自Hela細(xì)胞的胸苷DNA糖基化酶切割G/T錯(cuò)配處的T(Hsu等，Carcinogenesis(1994)151657-1662)。根據(jù)一個(gè)示范實(shí)施方案，基于GAVE18序列(例如野生型GAVE18序列)的探針與來自測試細(xì)胞的cDNA或其他DNA產(chǎn)物雜交。用DNA錯(cuò)配修復(fù)酶處理雙鏈，切割產(chǎn)物(如果有的話)可以在電泳方案或類似的方案中檢測到，參見，例如美國專利號(hào)5,459,039。
在其他實(shí)施方案中，可以使用電泳遷移率的改變鑒定GAvE18基因中的突變。例如，單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)可用于檢測突變與野生型核酸之間電泳遷移率的差異(Orita等，美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc Natl Acad SciUSA)(1989)862766；也見Cotton，突變研究(Mutat Res)(1993)285125-144；Hayashi，Genet Anal Tech Appl(1992)973-79)。使樣本和對(duì)照GAVE18核酸的單鏈DNA片段變性然后使之復(fù)性。單鏈核酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因序列不同而不同，由此導(dǎo)致的電泳遷移率的改變使得即使單個(gè)堿基變化也可得以檢測?？梢詷?biāo)記DNA片段或者用標(biāo)記的探針對(duì)其進(jìn)行檢測。使用RNA(比DNA)可以增強(qiáng)試驗(yàn)的靈敏度，因?yàn)镽NA二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)序列的改變更為敏感。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，此主題方法利用異源雙鏈分析基于電泳遷移率的改變來分離異源雙鏈分子。(Keen等，Trends Genet(1991)75)在另一個(gè)實(shí)施方案中，用變性梯度凝膠電泳(DGGE)(Myers等，自然(Nature)(1985)313495)來分析突變型或野生型片段在含有梯度變性劑的聚丙烯酰胺凝膠中的運(yùn)動(dòng)。當(dāng)DGGE用作分析方法時(shí)，DNA將被修飾以保證它不會(huì)完全變性，例如，用PCR添加約40bp的高熔點(diǎn)富含GC的DNA，即GC夾。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用溫度梯度代替變性梯度來鑒定對(duì)照與樣本DNA的遷移率差異(Rosenbaum等，Biophys Chem(1987)26512753)。
其他可用于檢測點(diǎn)突變的技術(shù)的實(shí)例包括但不限于，選擇性寡核苷酸雜交，選擇性擴(kuò)增或選擇性引物延伸。例如，可以制備寡核苷酸引物，其中將已知的突變置于中央，然后在只有完全匹配才可發(fā)生雜交的條件下，使引物與靶DNA雜交(Saiki等，自然(Nature)(1986)324163；Saiki等，美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc Natl Acad Sci USA)(1989)866230)。在使這些等位特異性寡核苷酸與PCR擴(kuò)增的靶DNA或者許多不同的突變體雜交時(shí)，可以將寡核苷酸結(jié)合在雜交膜上然后與標(biāo)記的靶DNA雜交。
或者，可以在本發(fā)明中使用依賴于選擇性PCR擴(kuò)增的等位特異性擴(kuò)增技術(shù)。在特異擴(kuò)增中用作引物的寡核苷酸可以在分子中央(以致擴(kuò)增依賴于差異雜交)(Gibbs等，核酸研究(Nucleic Acids Res)(1989)172437-2448)或在一個(gè)引物的3’最末端(此時(shí)，在適合的條件下，錯(cuò)配能阻止或延緩聚合酶的延伸)(Prossner，Tibtech(1993)11238)攜帶令人感興趣的突變。另外，也可能期望向突變區(qū)域中引入新的限制性位點(diǎn)以創(chuàng)造基于切割的檢測(Gasparini等，Mol Cell Probes(1992)61)。預(yù)期，在某些實(shí)施方案中擴(kuò)增也可以使用Taq連接酶進(jìn)行(Barany，美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc NatlAcad Sci USA)(1991)88189)。在這種情況下，只有在5’序列的3’末端有完全的匹配時(shí)，連接反應(yīng)才可以發(fā)生，這就使得可以通過尋找擴(kuò)增物的有無來檢測特異位點(diǎn)處已知突變的存在。
此處所描述的方法可以，例如，使用含有此處所描述的至少一個(gè)探針核酸或抗體試劑的預(yù)先包裝診斷試劑盒來執(zhí)行。此方法和試劑盒可以方便的應(yīng)用于，例如，臨床條件下，對(duì)顯示出GAVE18基因有關(guān)疾病或病癥的征兆的患者或具有該疾病家族史的患者進(jìn)行診斷。
另外，表達(dá)GAVE18的任何細(xì)胞類型和組織都可以在此處所描述的預(yù)后試驗(yàn)中使用。
3.藥物基因組學(xué)通過本文描述的篩選試驗(yàn)鑒定的對(duì)GAVE18活性(例如GAVE18基因表達(dá))具有刺激或抑制影響的試劑或調(diào)節(jié)劑，可以施用給個(gè)體以治療(預(yù)防性或治療性)與GAVE18活性有關(guān)的疾病(例如，與哮喘、慢性阻塞性肺病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有關(guān)的炎癥)?？梢钥紤]將此治療與個(gè)體的藥物基因組學(xué)結(jié)合起來，所述藥物基因組學(xué)研究的是個(gè)體基因型與個(gè)體對(duì)外來化合物或藥物的反應(yīng)性之間的關(guān)系。對(duì)治療物代謝的差異可以通過改變藥理學(xué)活性藥物的血液濃度和劑量之間關(guān)系，導(dǎo)致嚴(yán)重毒性或治療失敗。因此，個(gè)體的藥物基因組學(xué)使得可以基于對(duì)個(gè)體基因型的考慮來選擇有效的預(yù)防或治療劑(例如藥物)。此藥物基因組學(xué)還可以用于確定適當(dāng)?shù)膭┝亢椭委煼桨?。因此，可以通過確定個(gè)體的GAVE18蛋白的活性、GAVE18核酸的表達(dá)或GAVE18基因的突變內(nèi)容，選擇對(duì)個(gè)體適宜的治療或預(yù)防藥劑。
藥物基因組學(xué)所處理的問題是患者在藥物應(yīng)答方面存在的臨床顯著遺傳差異，這種差異是由患者體內(nèi)藥物處置的不同和異常作用導(dǎo)致的。見，例如，Linder，臨床化學(xué)(Clin Chem)(1997)43(2)254-266。一般，可以區(qū)分兩類藥理學(xué)遺傳情況(pharmacogenetic conditions)。作為能改變藥物作用于身體的途徑的單因素而傳遞的遺傳情況，稱作“改變的藥物作用”。作為能改變身體對(duì)藥物的作用途徑的單因素而傳遞的遺傳情況，稱作“改變的藥物代謝”。這些藥理學(xué)遺傳情況可以以罕見缺陷或多態(tài)性的形式存在。例如，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)缺陷是常見的遺傳酶病，其中主要的臨床并發(fā)癥是吞食氧化劑藥物(抗瘧疾藥物、磺酰胺、止痛劑或硝基呋喃)和食用蠶豆后出現(xiàn)的溶血。
作為舉例說明性實(shí)施方案，藥物代謝酶的活性是藥物作用強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間的一個(gè)主要決定因素。對(duì)藥物代謝酶(例如N-乙酰轉(zhuǎn)移酶2(NAT2)和細(xì)胞色素P450酶，CYP2D6和CYP2C19)遺傳多態(tài)性的發(fā)現(xiàn)解釋了，為什么服用標(biāo)準(zhǔn)和安全藥物劑量后，一些患者不能獲得預(yù)期的藥物效果或表現(xiàn)出過度的藥物反應(yīng)和嚴(yán)重毒性。在群體中這些多態(tài)性表現(xiàn)為兩種表型，強(qiáng)代謝者(extensive metabolizer，EM)和弱代謝者(PM)。PM的普遍性在不同群體之間是不同的。例如，編碼CYP2D6的基因具有高度多態(tài)性，在PM中已鑒定到幾種突變，所有均導(dǎo)致CYP2D6功能的缺乏。CYP2D6和CYP2C19的弱代謝者在接受標(biāo)準(zhǔn)劑量后十分頻繁地出現(xiàn)過度藥物反應(yīng)和副反應(yīng)。正如通過可待因的止痛作用(由CYP2D6形成的代謝物嗎啡介導(dǎo)的)所證實(shí)的，如果代謝物是活性治療部分，則PM將不會(huì)表現(xiàn)出治療反應(yīng)。另一極端是對(duì)標(biāo)準(zhǔn)劑量不起反應(yīng)的所謂超快代謝者。近來，超快代謝的分子基礎(chǔ)已得以鑒定，其是由CYP2D6基因擴(kuò)增導(dǎo)致的。
因此，通過確定個(gè)體中GAVE18蛋白的活性、GAVE18核酸的表達(dá)或GAVE18基因的突變內(nèi)容，可以選擇出對(duì)于預(yù)防或治療個(gè)體適宜的藥劑。此外，可以使用藥物基因組學(xué)研究，通過對(duì)編碼藥物代謝酶的多態(tài)性等位基因進(jìn)行基因分型鑒定個(gè)體的藥物應(yīng)答表型。當(dāng)使用GAVE18調(diào)節(jié)劑(如，通過本文所述其中一種示例性篩選試驗(yàn)鑒定的調(diào)節(jié)劑)治療對(duì)象時(shí)，在給藥或選擇藥物方面，此信息可以避免不良反應(yīng)或治療失敗，由此增強(qiáng)治療或預(yù)防的功效。
4.在臨床試驗(yàn)過程中監(jiān)測療效監(jiān)測藥劑(例如，藥物或化合物)對(duì)GAVE18表達(dá)或活性的影響(例如，調(diào)節(jié)異常細(xì)胞增殖和/或分化的能力)既可以應(yīng)用于基礎(chǔ)藥物篩選中也可以應(yīng)用于臨床試驗(yàn)中。例如，可以在表現(xiàn)出降低的GAVE18基因表達(dá)、蛋白質(zhì)水平或蛋白質(zhì)活性的對(duì)象的臨床試驗(yàn)中，監(jiān)測藥劑(通過本文描述的篩選試驗(yàn)確定的)在增加GAVE18基因表達(dá)、蛋白質(zhì)水平或蛋白質(zhì)活性方面的有效性?；蛘?，可以在表現(xiàn)出增加的GAVE18基因表達(dá)、蛋白質(zhì)水平或蛋白質(zhì)活性的對(duì)象的臨床試驗(yàn)中，監(jiān)測藥劑(通過本文描述的篩選試驗(yàn)確定的)在降低GAVE18基因表達(dá)、蛋白質(zhì)水平或蛋白質(zhì)活性方面的有效性。在這些臨床試驗(yàn)中，GAVE18的表達(dá)或活性以及，優(yōu)選地，其它基因的表達(dá)或活性(例如，細(xì)胞增殖疾病所涉及的基因)可以用作特定細(xì)胞的免疫應(yīng)答性的標(biāo)志。例如，但不限于，可以鑒定當(dāng)用調(diào)節(jié)GAVE18活性的藥劑(例如，化合物、藥物或小分子)(例如，本文所述篩選試驗(yàn)鑒定的藥劑)處理時(shí)細(xì)胞中可以被調(diào)節(jié)的基因(包括GAVE18)。因此，例如，在臨床試驗(yàn)中，為了研究藥劑對(duì)細(xì)胞增殖疾病的作用，可以分離細(xì)胞，制備RNA并分析GAVE18及參與該疾病的其它基因的表達(dá)水平?；虮磉_(dá)水平(即，基因表達(dá)式樣)可以通過如下方式定量按本文所述進(jìn)行Northern印跡分析或RT-PCR，或者，作為備選方案，利用本文所述方法之一測量產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的量或測量GAVE18或其它基因的活性水平。以此方式，基因表達(dá)式樣可以作為標(biāo)志指示細(xì)胞對(duì)藥劑的生理反應(yīng)。由此，可以在使用藥劑治療個(gè)體之前以及治療過程中的不同點(diǎn)上，確定反應(yīng)狀態(tài)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種方法，由此可以監(jiān)測使用藥劑(例如，通過本文所述篩選試驗(yàn)鑒定的激動(dòng)劑、拮抗劑、肽模擬物、蛋白質(zhì)、肽、核酸、小分子或其它候選藥物)治療受試者的療效，該方法包括步驟(i)在施用藥劑前從受試者獲得用藥前樣本；(ii)檢測用藥前樣本中GAVE18蛋白、mRNA或基因組DNA的表達(dá)水平；(iii)從受試者獲得一個(gè)或多個(gè)用藥后樣本；(iv)檢測用藥后樣本中GAVE18蛋白、mRNA或基因組DNA的表達(dá)或活性水平；(v)對(duì)用藥前樣本中GAVE18蛋白、mRNA或基因組DNA的表達(dá)或活性水平與一個(gè)或多個(gè)用藥后樣本中GAVE18蛋白、mRNA或基因組DNA的表達(dá)或活性水平進(jìn)行比較；和(vi)據(jù)此改變患者的藥劑施用方案。例如，可能期望增加藥劑施用以增加GAVE18的表達(dá)或活性水平，使之超過所檢測到的水平，即，增加藥劑的效力?；蛘撸赡芷谕档退巹┦┯靡越档虶AVE18的表達(dá)或活性水平，使之低于所檢測到的水平，即，降低藥劑的效力。
D.治療方法本發(fā)明為有危險(xiǎn)患有(或易感)或已患有與異常GAVE18表達(dá)或活性相關(guān)的疾病的患者提供了預(yù)防和治療方法。所述疾病包括但不限于如炎性疾病，例如哮喘、慢性阻塞性肺病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
1.預(yù)防方法一方面，本發(fā)明提供預(yù)防方法，該方法通過給受試者施用調(diào)節(jié)GAVE18表達(dá)或至少一種GAVE18活性的藥劑，預(yù)防受試者患上與異常GAVE18表達(dá)或活性有關(guān)的疾病或病癥?？梢酝ㄟ^，例如，本文所述任一種診斷或預(yù)后試驗(yàn)或其組合，鑒定個(gè)體是否有危險(xiǎn)罹患可由異常GAVE18表達(dá)或活性引起的或促成的疾病?？梢栽谝訥AVE18異常為特征的癥狀顯現(xiàn)之前施用預(yù)防劑，以便預(yù)防疾病或病癥，或作為備選方案阻滯疾病或病癥的進(jìn)程。例如，根據(jù)GAVE18異常的類型，可以使用GAVE18激動(dòng)劑或GAVE18拮抗劑治療個(gè)體。適宜的藥劑可以根據(jù)本文所述篩選試驗(yàn)確定。
2.治療方法本發(fā)明另一方面涉及調(diào)節(jié)GAVE18表達(dá)或活性用于治療目的的方法。本發(fā)明的調(diào)節(jié)方法涉及使細(xì)胞與能調(diào)節(jié)和細(xì)胞有關(guān)的一種或多種GAVE18蛋白活性的藥劑接觸。能夠調(diào)節(jié)GAVE18蛋白活性的藥劑可以是本文所述的藥劑，例如核酸或蛋白質(zhì)、GAVE18蛋白的天然關(guān)聯(lián)配體、肽、GAVE18肽模擬物或其它小分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，該藥劑刺激GAVE18蛋白的一種或多種生物學(xué)活性。此刺激劑的實(shí)例包括活性GAVE18蛋白和已導(dǎo)入細(xì)胞中的編碼GAVE18的核酸分子。在另一實(shí)施方案中，該藥劑抑制GAVE18蛋白的一種或多種生物學(xué)活性。此抑制劑的實(shí)例包括反義GAVE18核酸分子和抗GAVE18抗體?？梢泽w外(例如，通過使用藥劑培養(yǎng)細(xì)胞)或，作為備選方案，體內(nèi)(例如，通過向患者施用藥劑)執(zhí)行此調(diào)節(jié)方法。由此，本發(fā)明提供治療罹患疾病或病癥(其特征在于GAVE18蛋白或核酸分子的異常表達(dá)或活性)的個(gè)體的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本方法涉及施用可調(diào)節(jié)(例如，上調(diào)或下調(diào))GAVE18表達(dá)或活性的藥劑(例如，通過本文所述篩選試驗(yàn)鑒定的藥劑)或藥劑組合。在另一實(shí)施方案中，本方法涉及施用GAVE18蛋白或核酸分子作為治療物以彌補(bǔ)降低的或異常的GAVE18表達(dá)或活性。
當(dāng)GAVE18被異常下調(diào)和/或當(dāng)增加的GAVE18活性可能具有有益作用時(shí)，刺激GAVE18活性是有利的。相反，當(dāng)GAVE18被異常上調(diào)和/或當(dāng)降低的GAVE18活性可能具有有益作用時(shí)，抑制GAVE18活性是有利的。
對(duì)本發(fā)明通過參考如下非限制性實(shí)施例可更好地理解，其中所述實(shí)施例作為本發(fā)明的示例提供。給出以下實(shí)施例是為了更充分地闡述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。但是它不用于構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
實(shí)施例GAVE18的鑒定用FASTA算法(Wisconsin GCG軟件包，版本10.1)對(duì)人基因組序列數(shù)據(jù)庫HTG(NCBI/NIH)通過查詢多個(gè)GPCR進(jìn)行同源性搜索。將所返回的統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著同源性的基因組DNA序列翻譯為三種前移框架，用于BLASTp搜索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。經(jīng)確定，來自第7條染色體的基因組DNA序列AC083865包含推定的GPCR序列，接下來將其命名為GAVE18。GAVE18的染色體定位作圖于p14.1。
克隆編碼GAVE18的基因組DNA設(shè)計(jì)了對(duì)預(yù)測的GAVE18 5′和3′序列特異的引物。正向引物HP271，AAA ACT GCA TGC TGT GGCTGC(SEQ ID NO3)，和反向引物HP272，TTT CAG CTG AGC CCAGAA CTC(SEQ ID NO4)，用于通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增GAVE18基因組DNA，使用人基因組DNA作為模板。PCR條件如下94℃變性30秒，55℃退火30秒，并于72℃延伸1分鐘，上述過程進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸5分鐘。將所擴(kuò)增的DNA片段克隆入來自Invitrogen的pCRII-TOPO載體。該克隆的DNA插入片段通過DNA測序證實(shí)。所有PCR擴(kuò)增在DNA Engine Tetrad(MJ Research，型號(hào)PTC-225)中進(jìn)行。
Northern印跡分析來自Clontech的人多種組織Northern印跡用材料按照廠商的說明書與用[α-32P]dCTP標(biāo)記的全長開放讀碼框DNA片段雜交。雜交后的印跡用材料用2XSSPE和0.1％SDS在50℃洗30分鐘，并用0.1XSSPE和0.1％SDS在50℃洗1小時(shí)。然后將印跡用材料在存在增感屏下-70℃曝光于X-射線膠片。
Taqman分析來自人組織的總RNA購自Clontech。在產(chǎn)生cDNA之前，將總RNA用DNAseI處理，以避免潛在的基因組DNA污染。簡而言之，將總RNA與5μl 10x DNAseI緩沖液(20mM Hepes pH 7.5；10mMCaCl2；10mM MgCl2；1mM DTT和50％(v/v)甘油)(Ambion)，RNAse抑制劑和1μl無Rnase的DNAseI(2U/μl；Ambion)以終體積50μl混合于37℃1小時(shí)。在酚沉淀步驟后，使用Superscript選擇系統(tǒng)如LifeTechnologies所述進(jìn)行cDNA合成。用Primer Express 1.0軟件(ABI)設(shè)計(jì)Taqman引物/探針。GAVE18擴(kuò)增子跨越開放讀碼框的72個(gè)核苷酸，具有的正向引物為5′GATTCTGTTGGTCTTCCAGGTCTT 3′(SEQ IDNO5)，反向引物為5′CCAGAACTCCTGGTGGGATAGT 3′(SEQ IDNO6)，且Taqman探針序列為5′FAM-TGGCGTAGCTTCTGCACCATCAACA-TAMRA 3′(SEQ ID NO7)。Fam用作報(bào)告染料，Tamra用作淬滅劑。Taqman探針由Operon Technologies按要求合成。Taqman反應(yīng)在96-孔板MicroAmp光學(xué)管(PE)中進(jìn)行，終體積為50μl，包含25μl Taqman PCR混合物(Perkin Elmer)；1μl正向引物，終濃度為900nM；lμl反向引物，終濃度為900nM；以及1μl Taqman探針，終濃度為200nM；5μl cDNA模板(計(jì)算的濃度為10ng/μl)和17μl水。Taqman PCR條件如PE Applied Biosystem所述進(jìn)行。人β肌動(dòng)蛋白引物探針(設(shè)計(jì)并購自PE applied Biosystem)用作內(nèi)部對(duì)照。對(duì)每一組織，靶基因和內(nèi)部對(duì)照均進(jìn)行雙份的Taqman反應(yīng)。此外，使用增加模板量的腦總cDNA，對(duì)人β肌動(dòng)蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線兩次。這允許我們獲得被擴(kuò)增的擴(kuò)增子的相對(duì)數(shù)。靶基因的表達(dá)表示為相對(duì)于腦cDNA的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)。
cDNA文庫的PCR篩選GAVE18編碼區(qū)的特異性PCR引物5′AAA ACT GCA TGC TGT GGC TGC 3′(SEQ ID NO8)，和5′TTT CAGCTG AGC CCA GAA CTC 3′(SEQ ID NO9)用于篩選合并的脾臟、胎盤和腎cDNA文庫。用下列PCR法在96-孔板進(jìn)行PCR篩選94℃，維持3分鐘；然后94℃30秒，52℃30秒，68℃45秒進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。陽性的亞合并物接下來稀釋用于下一輪的PCR篩選。來自陽性亞合并物的有限數(shù)量的菌落鋪于瓊脂板上，并通過PCR證實(shí)陽性質(zhì)粒，然后進(jìn)行DNA序列測定分析。
結(jié)果的說明GAVE18在免疫系統(tǒng)中具有受限制的表達(dá)模式，主要在骨髓、外周血白細(xì)胞、脾臟和胸腺中表達(dá)。抑制或活化GAVE18 GPCR受體可調(diào)節(jié)炎癥期間免疫細(xì)胞的成熟、發(fā)育和反應(yīng)。在粒細(xì)胞中GAVE18被細(xì)胞因子TNF-α上調(diào)。對(duì)許多炎性疾病TNF-α起到重要作用。在支氣管上皮細(xì)胞中GAVE18也被TNF-α誘導(dǎo)，對(duì)呼吸道疾病如哮喘GAVE18是極好的藥物靶。對(duì)其他炎性疾病如RA、COPD等，GAVE18也是很好的靶。
本發(fā)明不限于此處所述具體實(shí)施方案的范圍。確實(shí)，除了此處所描述的之外，顯然對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言通過前面的描述和附圖可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行多種改變。此類改變也在后附權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。
還應(yīng)知道的是對(duì)核酸或多肽給出的所有堿基大小或氨基酸大小，以及所有分子量值均為近似的，并且是為了用于描述而提供的。
文中引用了多篇公開，對(duì)它們的公開內(nèi)容完整地并入文中作為參考。
權(quán)利要求
1.分離的核酸分子，其包含圖5的DNA序列(SEQ ID NO1)。
2.在嚴(yán)格雜交條件下可與權(quán)利要求1所述的分離核酸分子雜交的分離核酸分子，或在嚴(yán)格雜交條件下與權(quán)利要求1所述的分離核酸分子互補(bǔ)的雜交探針。
3.權(quán)利要求1或2的分離核酸分子，其編碼具有圖6氨基酸序列(SEQID NO2)的多肽。
4.權(quán)利要求2的分離核酸分子，其編碼的多肽所具有的氨基酸序列與SEQ ID NO2的氨基酸序列至少30％相同。
5.權(quán)利要求1或2的分離核酸分子，其被可檢測地標(biāo)記。
6.權(quán)利要求5的被可檢測地標(biāo)記的分離核酸分子，其中所述可檢測標(biāo)記物包含酶、放射性同位素或熒光化學(xué)物質(zhì)。
7.分離的多肽，其包含圖6的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
8.分離的核酸分子，其編碼權(quán)利要求7所述的純化多肽。
9.權(quán)利要求7的純化多肽，其被可檢測地標(biāo)記。
10.權(quán)利要求9的純化多肽，其中所述可檢測標(biāo)記物包含酶、放射性同位素或熒光化學(xué)物質(zhì)。
11.抗體，其為以權(quán)利要求7所述的純化多肽作為免疫原而產(chǎn)生的。
12.權(quán)利要求11的抗體，其中所述抗體選自單克隆抗體、多克隆抗體或嵌合抗體。
13.權(quán)利要求11的抗體，其被可檢測地標(biāo)記。
14.權(quán)利要求13的抗體，其中可檢測標(biāo)記物包含酶、放射性同位素或熒光化學(xué)物質(zhì)。
15.表達(dá)載體，其包含可操作地與表達(dá)調(diào)控元件連接的權(quán)利要求1所述的分離核酸分子。
16.表達(dá)載體，其包含可操作地與表達(dá)調(diào)控元件連接的權(quán)利要求2所述的分離核酸分子。
17.權(quán)利要求15或16的表達(dá)載體，其中所述表達(dá)調(diào)控元件選自組成型調(diào)控序列、細(xì)胞特異性調(diào)控序列和誘導(dǎo)型調(diào)控序列。
18.權(quán)利要求17的表達(dá)載體，其中所述表達(dá)調(diào)控元件為啟動(dòng)子。
19.權(quán)利要求18的表達(dá)載體，其中所述啟動(dòng)子包含hCMV的立即早期啟動(dòng)子、SV40的早期啟動(dòng)子、腺病毒的早期啟動(dòng)子、痘苗病毒的早期啟動(dòng)子、多瘤病毒的早期啟動(dòng)子、SV40的晚期啟動(dòng)子、腺病毒的晚期啟動(dòng)子、痘苗病毒的晚期啟動(dòng)子、多瘤病毒的晚期啟動(dòng)子、lac系統(tǒng)、trp系統(tǒng)、TAC系統(tǒng)、TRC系統(tǒng)、λ噬菌體的主要操縱基因和啟動(dòng)子區(qū)、fd外殼蛋白的調(diào)控區(qū)、3-磷酸甘油激酶啟動(dòng)子、酸性磷酸酶啟動(dòng)子或酵母α交配因子啟動(dòng)子。
20.用權(quán)利要求15或16的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
21.權(quán)利要求20的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞包含原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
22.權(quán)利要求21的宿主細(xì)胞，其中所述宿主包含大腸桿菌(E.coli)、假單胞菌屬(Pseudonomas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈霉菌屬(Strepomyces)、酵母、CHO、R1.1、B-W、L-M、COS1、COS7、BSC1、BSC40、BMT10或Sf9細(xì)胞。
23.用于產(chǎn)生權(quán)利要求7的分離多肽的方法，其包括以下步驟a)在提供所述分離多肽表達(dá)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求20的宿主細(xì)胞；以及b)從所述宿主、所述培養(yǎng)物或它們的組合物中回收所述的分離多肽。
24.治療方法，其用于對(duì)需要治療的患者調(diào)節(jié)GAVE18的信號(hào)活性或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，所述治療方法包括給所述患者施用GAVE18的激動(dòng)劑、拮抗劑或反向激動(dòng)劑。
25.用于鑒定GAVE18的激動(dòng)劑的方法，其包括使?jié)撛诘募?dòng)劑與表達(dá)GAVE18的細(xì)胞接觸，并確定在所述潛在激動(dòng)劑存在時(shí)GAVE18的信號(hào)活性是否相對(duì)于無所述潛在激動(dòng)劑時(shí)GAVE18的活性增加。
26.用于鑒定GAVE18的反向激動(dòng)劑的方法，其包括使?jié)撛诘姆聪蚣?dòng)劑與表達(dá)GAVE18的細(xì)胞接觸，并確定在所述潛在反向激動(dòng)劑存在時(shí)，GAVE18的活性是否相對(duì)于無所述潛在反向激動(dòng)劑時(shí)GAVE18的活性降低，并且在存在內(nèi)源性配體或激動(dòng)劑時(shí)也降低。
27.用于鑒定GAVE18的拮抗劑的方法，其包括使?jié)撛诘霓卓箘┡c表達(dá)GAVE18的細(xì)胞接觸，并確定在所述潛在拮抗劑存在時(shí)GAVE18的信號(hào)活性是否相對(duì)于存在內(nèi)源性配體或激動(dòng)劑時(shí)GAVE18的活性降低。
28.治療組合物，其包含能夠調(diào)節(jié)GAVE18的信號(hào)活性或轉(zhuǎn)導(dǎo)的GAVE18的激動(dòng)劑、拮抗劑或反向激動(dòng)劑。
29.治療疾病的方法，其包括對(duì)需要治療的患者施用治療組合物，其中所述治療組合物包含能夠調(diào)節(jié)GAVE18的信號(hào)活性或轉(zhuǎn)導(dǎo)的GAVE18的激動(dòng)劑、拮抗劑或反向激動(dòng)劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新型和有用的G蛋白偶聯(lián)受體，其參與與炎癥和生理免疫反應(yīng)有關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。本發(fā)明也提供了使用所述受體篩選可調(diào)節(jié)該受體活性的分子的方法。此類分子易用于治療炎癥以及免疫相關(guān)疾病和紊亂的多血癥。
文檔編號(hào)A61P11/06GK1636070SQ02826555
公開日2005年7月6日 申請(qǐng)日期2002年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月13日
發(fā)明者H·埃辛德雷羅, 蔡濟(jì)東, S·J·布什, J·加森胡貝爾 申請(qǐng)人:安萬特藥物公司