專利名稱：在非骨細胞中表達lim礦化蛋白的方法
本專利申請要求2001年11月14日提交的美國臨時專利申請序列號60/331,132的權利。臨時專利申請全部納入本文供參考。
本專利申請涉及提交于1988年7月29日的美國專利申請序列號09/124,238，現(xiàn)在是美國專利申請?zhí)?,300,127，以及提交于2000年4月28日的美國待審批專利申請序列號09/959,578。這些專利申請都全部納入本文供參考。
背景技術：
發(fā)明領域發(fā)明的技術領域一般涉及在非骨細胞中表達LIM礦化蛋白的方法，如椎間盤細胞或髓核細胞。發(fā)明的技術領域更特定涉及用編碼LIM礦化蛋白的核酸轉染非骨細胞，如椎間盤細胞。
背景技術：
認為造骨細胞從多能間質干細胞分化。造骨細胞的成熟導致可礦化和形成骨的胞外基質分泌。沒有充分理解此復雜過程的調節(jié)，但認為它包括稱為骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)的信號糖蛋白組。這些蛋白顯示參與成年動物中的胚胎背腹圖式、肢芽發(fā)育和斷裂修復。B.L.Hogan，Genes&Develop.，10，1580(1996)。此轉化生長因子-β超家族分泌蛋白組在多種不同分化階段的細胞類型中有活性譜；這些緊密相關分子間的生理活性差異未被闡明。D.M.Kingsley，Trends Genet.，10，16(1994)。
為更好確定不同BMP信號蛋白的獨特生理作用，我們最近將BMP-6誘導大鼠顱頂造骨細胞分化的潛能與BMP-2和BMP-4比較。Boden等，Endocrinology，137，3401(1996)。我們研究了在大鼠胎顱頂初次傳代(二級)培養(yǎng)物中的此過程，需要BMP或糖皮質激素用于起始分化。在此膜骨形成的模型中，糖皮質激素(GC)或BMP起始分化成能分泌骨鈣蛋白的礦化骨節(jié)，造骨細胞特異蛋白。此二級培養(yǎng)系統(tǒng)不同于進行同時分化的原代大鼠造骨細胞培養(yǎng)物。在此二級培養(yǎng)系統(tǒng)中，糖皮質激素產(chǎn)生10倍誘導的BMP-6 mRNA和蛋白表達，使造骨細胞分化增加。Boden等，Endocrinology，138，2920(1997)。
除了胞外信號如BMPs，胞內信號或調節(jié)分子也可在導致新骨形成的事件級聯(lián)中發(fā)揮作用。一個廣泛種類的胞內調節(jié)分子是LIM蛋白，這樣命名是因為它們具有稱為LIM結構域的特征結構基序。LIM結構域是半胱氨酸-豐富的結構基序，包括兩個由2-氨基酸間隔區(qū)連接的特殊鋅指。一些蛋白質僅有LIM結構域，而另一些包含多種另外的功能結構域。LIM蛋白形成一個多樣的組，包括轉錄因子和細胞骨架蛋白。LIM結構域的主要作用似乎是調節(jié)蛋白質-蛋白質相互作用，通過形成具相同或不同LIM結構域的二聚體或通過結合不同的蛋白質。
在LIM同源域蛋白即具有LIM結構域和同源域序列的蛋白中，LIM結構域功能是負調節(jié)因子。LIM同源域蛋白參與控制細胞譜系確定和調節(jié)分化，盡管LIM-單獨蛋白可能具有類似作用。
人和其它哺乳動物種易患需要骨修復和/或再生過程的疾病和損傷。例如，改進骨折治療可通過能刺激天然骨修復機制的治療方案，從而減少斷裂骨愈合所需時間。在另一個例子中，患全身骨疾病如骨質疏松癥的個體可從治療方案中獲益，此治療方案導致全身形成新骨。這種治療方案使骨物質損失產(chǎn)生的骨折發(fā)生率降低，骨物質損失是此病的特征。
由于至少這些原因，研究胞外因子如BMPs以使用它們刺激體內新骨形成。盡管用BMPs和其它胞外信號分子獲得早期成功，它們的使用涉及一些劣勢。例如，需要相對大劑量的純化BMPs以提高新骨形成，從而增加這種治療方法的花費。此外，胞外蛋白在引入宿主動物中易受降解。另外，因為它們通常是免疫原性，存在刺激免疫反應針對施用蛋白的可能性。
由于這些考慮，需要有可用的治療方案，使用胞內信號分子誘導新骨形成?；蛑委燁I域的發(fā)展使編碼胞內信號的核苷酸片段能被導入成骨前體細胞，即參與骨形成的細胞或外周血液白細胞，胞內信號構成部分骨形成過程。用于骨形成的基因治療提供一些潛在優(yōu)勢(1)更低的生產(chǎn)成本；(2)與胞外治療方案相比更高的效率，這是由于胞內信號獲得延長表達的能力；(3)繞過可能受阻的胞外信號治療，受阻是由于存在有限數(shù)量的信號受體；(4)它可將轉染的潛在骨原細胞直接傳遞給需要局部骨形成的位置；(5)它允許全身骨形成，從而提供治療方案用于骨質疏松癥和其它代謝骨疾病。
除了骨疾病，人和其它哺乳動物種也易患椎間盤變性，它與下腰痛、盤疝形成(disc herniation)和椎管狹窄相關。盤變性與逐漸失去蛋白聚糖基質相關。這可能使盤更易受生物機械損傷和變性。因此，需要方法刺激適當細胞的蛋白聚糖和/或膠原合成，例如髓核細胞、纖維環(huán)細胞和椎間盤細胞。
發(fā)明概述根據(jù)發(fā)明的第一個方面，提供在哺乳動物非骨細胞中表達LIM礦化蛋白的方法。根據(jù)發(fā)明的此方面，方法包括用分離的核酸轉染細胞，所述核酸包含可操作連接于啟動子的編碼LIM礦化蛋白的核苷酸序列。細胞可以是能產(chǎn)生蛋白聚糖和/或膠原的細胞，從而LIM礦化蛋白的表達刺激細胞中蛋白聚糖和/或膠原合成。根據(jù)發(fā)明此方面的分離核酸可以是一種核酸分子，能在標準條件下和與全長SEQ.IDNO25互補的核酸分子雜交；和/或能在高度嚴格條件下和與全長SEQ.ID NO26互補的核酸分子雜交。細胞可以是干細胞、椎間盤細胞、纖維環(huán)細胞或髓核細胞。
根據(jù)發(fā)明的第二個方面，提供哺乳動物非骨細胞，包括編碼LIM礦化蛋白的分離核酸序列。根據(jù)發(fā)明的此方面，細胞可以是干細胞、髓核細胞、纖維環(huán)細胞或椎間盤細胞。
根據(jù)發(fā)明的第三個方面，提供治療椎間盤損傷或疾病的方法。根據(jù)發(fā)明的此方面，方法包括將分離的核酸轉染到能產(chǎn)生蛋白聚糖和/或膠原的哺乳動物細胞。分離的核酸包含編碼LIM礦化蛋白的核苷酸序列，可操作連接于啟動子。LIM礦化蛋白刺激細胞中蛋白聚糖和/或膠原合成。
根據(jù)發(fā)明的第四個方面，提供椎間盤移植物。根據(jù)發(fā)明的此方面，移植物包括載體物質和哺乳動物細胞集合，細胞含編碼LIM礦化蛋白的分離核苷酸序列。同樣根據(jù)發(fā)明的此方面，載體物質包括生物適合物質的多孔基質且哺乳動物細胞結合到載體物質中。
附圖簡述參考附圖可更好理解本發(fā)明，其中

圖1顯示大鼠椎間盤細胞表達HLMP-1后的硫酸化粘多糖(sGAG)生成，細胞用不同MOIs轉染；圖2是一個圖表，顯示用不同MOI的AdHLMP-1感染6天后，大鼠椎間盤細胞的劑量反應；圖3是一個圖表，顯示用250個病毒粒子/細胞的MOI轉染6天后，AdHLMP-1轉染的大鼠椎間盤細胞的聚集蛋白聚糖和BMP-2 mRNA表達；圖4A是一個圖表，顯示用不同MOIs的Ad-hLMP-1感染12小時后HLMP-1 mRNA的表達；圖4B是一個圖表，顯示來自感染后3到6天的培養(yǎng)基中sGAG的生成；圖5是一個圖表，顯示sGAG生成的時程變化；圖6A是一個圖表，顯示在用于聚集蛋白聚糖的大鼠纖維環(huán)細胞中對LMP-1過量表達的基因反應；圖6B是一個圖表，顯示在用于BMP的大鼠纖維環(huán)細胞中對LMP-1過量表達的基因反應；圖7顯示用25 MOI的AdHLMP-1感染后，大鼠纖維環(huán)細胞中HLMP-1 mRNA水平的時程；圖8是一個圖表，顯示對應于HLMP-1過量表達的BMPs和聚集蛋白聚糖mRNA水平變化；圖9顯示對應于HLMP-1表達的sGAG生成增加的時程；圖10是一個圖表，顯示LMP-1調節(jié)的sGAG生成增加被頭蛋白阻礙；圖11顯示單層培養(yǎng)6天后LMP-1對培養(yǎng)基中sGAG的效果。
優(yōu)選實施方案的詳細描述本發(fā)明涉及用編碼LIM礦化蛋白的核酸轉染非骨細胞。本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)用編碼LIM礦化蛋白的核酸轉染非骨細胞如椎間盤細胞，可導致蛋白聚糖、膠原和其它椎間盤成分及組織合成增加。本發(fā)明也提供治療椎間盤疾病的方法，疾病與蛋白聚糖、膠原或其它椎間盤成分損失相關。
要理解的是上面的一般描述和下列詳細描述作為示范和解釋，旨在提供對權利要求的發(fā)明的進一步解釋。
縮寫和定義BMP 骨形態(tài)發(fā)生蛋白HLMP-1 人LMP-1，也定義為人LIM蛋白或HLMPHLMP-1s 人LMP-1短(截短)蛋白HLMPU人LIM蛋白獨特區(qū)域LMP LIM礦化蛋白MEM 基本培養(yǎng)基Trm 去炎松β-GlyP β-甘油磷酸
RACE迅速擴增cDNA末端RLMP大鼠LIM礦化蛋白，也定義為RLMP-1RLMPU 大鼠LIM蛋白獨特區(qū)域RNAsin RNA酶抑制劑ROB 大鼠造骨細胞10-4含RLMP(SEQ ID NO2)cDNA序列的克隆UTR 未翻譯區(qū)HLMP-2 人LMP剪接變體-2HLMP-3 人LMP剪接變體-3MOI 感染復數(shù)sGAG硫酸化粘多糖AdHLMP-1重組5型腺病毒，包括編碼HLMP-1的核苷酸序列LIM基因(10-4/RLMP)從刺激的大鼠顱頂造骨細胞培養(yǎng)物中分離(SEQ.ID NO1、SEQ.ID NO2)。參見美國專利號6,300,127。此基因被克隆、測序和分析其提高體外骨礦化效率的能力。發(fā)現(xiàn)蛋白RLMP影響骨基質的礦化以及細胞分化成造骨細胞譜系。不像其它已知細胞因子(如BMPs)，RLMP不是分泌蛋白，而是胞內信號分子。此特征的優(yōu)勢是提供胞內信號擴增以及更易評估轉染細胞。它也適于更有效和特異的體內應用。適當臨床應用包括提高骨折、骨缺陷、骨移植中的骨修復和在表現(xiàn)骨質疏松癥的病人中提高正常動態(tài)平衡。
對應的人蛋白名為人LMP-1(”HLMP-1”)，其氨基酸序列被克隆、測序和推斷。參見美國專利號6,300,127。發(fā)現(xiàn)人蛋白顯示提高體外和體內骨礦化效率。
此外，截短(短)形式的HLMP-1名為HLMP-1s，其特征被確定。參見美國專利號6,300,127。此短形式來自一種cDNA克隆來源的點突變，提供截短蛋白質的終止密碼子。發(fā)現(xiàn)HLMP-1s在細胞培養(yǎng)物和體內表達時完全有功能。
用PCR分析人心臟cDNA文庫，鑒定了兩種另外的剪接變體(稱為HLMP-2和HLMP-3)，與HLMP-1的差異在于編碼HLMP-1核苷酸序列中堿基對325-444間的區(qū)域。參見提交于2000年4月28日的美國待審批專利申請序列號09/959,578。HLMP-2序列在此區(qū)域中具有119個堿基對缺失和17個堿基對插入。與HLMP-1相比，編碼HLMP-3的核苷酸序列沒有缺失，但它與HLMP-2一樣有17個堿基對在HLMP-1序列的位置444插入。
LMP是多能分子，調節(jié)或影響一些生物過程。不同的LMP剪接變體預期在哺乳動物中有不同的生物功能。它們可能在多種組織的生長、分化和/或再生中發(fā)揮作用。例如，一些形式的LMP不僅在骨中表達，也在肌肉、腱、韌帶、脊髓、末稍神經(jīng)和軟骨中表達。
根據(jù)一個方面，本發(fā)明涉及刺激哺乳動物中蛋白聚糖和/或膠原合成，通過提供分離的核酸，核酸包含編碼LIM礦化蛋白的核苷酸序列，可操作連接于啟動子；將所述分離核酸序列轉染到能產(chǎn)生蛋白聚糖的哺乳動物細胞中；表達所述編碼LIM礦化蛋白的核苷酸序列，在其中刺激蛋白聚糖合成。哺乳動物細胞可以是非骨細胞，如椎間盤細胞、纖維環(huán)細胞或髓核細胞。轉染可體外或體內發(fā)生，通過直接注射病毒或裸露DNA例如質粒。在一些實施方案中，病毒是重組腺病毒，優(yōu)選AdHLMP-1。
發(fā)明的另一個實施方案包括哺乳動物非骨細胞，含編碼LIM礦化蛋白的分離核酸序列。哺乳動物非骨細胞可以是干細胞(如多能干細胞或間質干細胞)或椎間盤細胞，優(yōu)選髓核細胞或纖維環(huán)細胞。
在另一方面，發(fā)明涉及在哺乳動物非骨細胞中表達編碼LIM礦化蛋白的分離核酸序列的方法，包括提供分離的核酸，核酸包含編碼LIM礦化蛋白的核苷酸序列，可操作連接于啟動子；將所述分離核酸序列轉染到哺乳動物非骨細胞中；表達所述編碼LIM礦化蛋白的核苷酸序列。哺乳動物非骨細胞可以是干細胞或椎間盤細胞(如髓核細胞或纖維環(huán)細胞)。轉染可體外或體內發(fā)生，通過直接注射病毒或裸露DNA例如質粒。病毒可以是重組腺病毒，優(yōu)選AdHLMP-1。
在另外一個實施方案中，發(fā)明涉及通過反轉、延遲或減緩盤變性來治療椎間盤疾病的方法，包括提供分離的核酸，核酸包含編碼LIM礦化蛋白的核苷酸序列，可操作連接于啟動子；將所述分離核酸序列轉染到能產(chǎn)生蛋白聚糖的哺乳動物細胞中；通過表達所述編碼LIM礦化蛋白的核苷酸序列來刺激所述細胞中蛋白聚糖合成，其中盤變性被反轉、中斷或減緩。盤疾病可包括下腰痛、盤疝形成或椎管狹窄。哺乳動物細胞可以是干細胞或椎間盤細胞(如髓核細胞或纖維環(huán)細胞)。
轉染可體外或體內發(fā)生，通過直接注射病毒或裸露DNA例如質粒。在一些實施方案中，病毒是重組腺病毒，優(yōu)選AdHLMP-1。
本發(fā)明涉及一種新的哺乳動物LIM蛋白，本文稱為LIM礦化蛋白或LMPs。本發(fā)明更特定涉及人LMP，稱為HLMP或HLMP-1，或另外的人LMP剪接變體，稱為HLMP-2或HLMP-3。專利申請者發(fā)現(xiàn)這些蛋白質提高體外生長哺乳動物細胞中的骨礦化。當在哺乳動物中生成時，LMP也誘導體內骨形成。
用編碼LIM礦化蛋白(如LMP或HLMP)的核酸體外轉染骨髓細胞、成骨前體細胞、外周血細胞和干細胞(如多能干細胞或間質干細胞)，接著在供體中重移植轉染的細胞，適于治療多種骨相關疾病或損傷。例如，可使用此方法以在骨折修復很久前增強；在部分缺陷中產(chǎn)生骨；提供骨移植取代斷裂；促進腫瘤重建或剌融合；提供局部治療(通過注射)用于弱或骨質疏松的骨，如臀、椎骨或手腕骨質疏松癥。用LMP或編碼HLMP的核酸轉染也用于經(jīng)皮膚注射轉染的骨髓細胞以加速斷裂長骨的修復；治療長骨斷裂的聯(lián)合延遲或不聯(lián)合或者刺融合的假關節(jié)；用于誘導臀或膝無血管壞死中的新骨形成。
除了基因治療的體外方法，可體內完成轉染重組DNA載體，載體包括編碼LMP或HLMP的核酸序列。當編碼LMP或HLMP的DNA片段插入適當病毒載體時，例如腺病毒載體，病毒構建可直接注射到需要軟骨內骨化的身體位置。通過使用直接、經(jīng)皮膚注射以導入LMP或HLMP序列，可完成刺激骨形成而不需手術干預以獲得骨髓細胞(用于體外轉染)或將它們重移植到病人需要新骨的位置。Alden等，Neuro-surgical Focus(1998)證明基因治療的直接注射方法效用，使用編碼BMP-2的cDNA，cDNA克隆到腺病毒載體。
也能完成體內基因治療，通過將裸露即未密封的重組質粒直接注射到適當身體位置，質粒含編碼HLMP的核酸序列。在發(fā)明的此實施方案中，當裸露的質粒DNA被所述適當靶細胞吸收或內在化時，發(fā)生轉染。如用病毒構建的體內基因治療情況中，直接注射裸露的質粒DNA提供的優(yōu)勢是需要很少或不需要手術干預。直接基因治療用編碼內皮細胞有絲分裂原VEGF(血管內皮生長因子)的裸露質粒DNA，在人類患者中被證明成功。Baumgartner等，Circulation，97，12，1114-1123(1998)。
對于椎間盤應用，完成體外轉染通過從椎間盤收集細胞，用編碼LMP的核酸體外轉染細胞，接著將細胞導入椎間盤。細胞可從椎間盤收集或導入其背面，用本領域技術人員已知的任何方法，例如適用于刺的任何手術技術。在一個實施方案中，細胞通過注射導入椎間盤。
同樣根據(jù)發(fā)明，干細胞(如多能干細胞或間質干細胞)可用編碼LIM礦化蛋白的核酸體外轉染并導入椎間盤(如通過注射)。
體外轉染的細胞也能結合載體以形成椎間盤移植物。含轉染細胞的載體隨后可植入試驗者的椎間盤。適當載體物質示于Helm等，《骨移植取代用于促進脊髓關節(jié)固定》(Bone Graft Substitutes for the Promotion of Spinal Arthrodesis)，Neurosurg Focus，第10卷(4)2001年4月。載體優(yōu)選包括生物適合的多孔基質如去礦化的骨基質(DBM)、生物適合的合成聚合基質或蛋白質基質。適當?shù)鞍踪|包括胞外基質蛋白如膠原。移植前，用LMP體外轉染的細胞可結合到載體(即進入多孔基質的孔中)。
類似的，對于體內轉染細胞的椎間盤應用，DNA可用本領域技術人員已知的任何適當方法導入椎間盤。在一個實施方案中，核酸直接注入椎間空間。
通過使用腺病毒載體以傳遞LMP到成骨細胞，獲得LMP的暫時表達。這會發(fā)生是因為腺病毒不結合到轉染的靶細胞基因組。暫時表達LMP即表達發(fā)生在轉染的靶細胞生存期中，它足以達到發(fā)明的目標。然而，當結合到靶細胞基因組的載體被用作傳遞載體時，可發(fā)生LMP的穩(wěn)定表達。例如，以逆轉錄病毒為基礎的載體適于此目的。
穩(wěn)定表達LMP特定用于治療多種全身的骨相關疾病，如骨質疏松癥和成骨不全。對于發(fā)明的此實施方案，除了使用整合到靶細胞基因組的載體以傳遞編碼LMP的核苷酸序列到靶細胞中，LMP表達能置于可調節(jié)啟動子的控制下。例如通過暴露于外源誘導劑而打開的啟動子適合，如四環(huán)素。
使用此方法，可在全身基礎上刺激新骨形成，通過施用有效量的外源誘導劑。一旦獲得足夠量的骨物質，可中止施用外源誘導劑。重復此過程以滿足置換骨物質損失的需要，例如作為骨質疏松癥的結果。特異于HLMP的抗體特定用于測定病人細胞的骨誘導即骨形成潛力。同樣，HLMP特異抗體適用于標記測定以鑒定骨變性疾病中的風險因子，例如骨質疏松癥。
遵循熟知和常規(guī)的方法，制備本發(fā)明的基因通過連接編碼LMP的核酸部分和其它核酸序列，如克隆和/或表達載體。描述了構建和分析這些重組載體所需的方法，例如限制性內切酶消化、克隆操作、突變、有機合成寡核苷酸和DNA測序。對于DNA測序DNA，優(yōu)選雙脫氧終止子(dieoxyterminator)方法。
發(fā)表了許多關于重組DNA方法的條約，包括Sambrook等，《分子克隆實驗室手冊》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第2版，Cold Spring HarborPress(1988)，Dabis等，《分子生物的基本方法》(Basic Methods in MolecularBiology)，Elsevier(1986)和Ausubel等，《分子生物的當前操作》(CurrentProtocols in Molecular Biology)，Wiley Interscience(1988)。這些參考手冊特別納入本文供參考。
以引物為指導擴增DNA或cDNA是表達本發(fā)明基因的一個普通步驟。它一般通過聚合酶鏈式反應(PCR)進行。PCR描述于Mullis等，的美國專利號4,800,159和其它發(fā)表來源。PCR的基本原理是通過連續(xù)循環(huán)的引物延伸來指數(shù)復制DNA序列。一個引物的延伸產(chǎn)物與另一個引物雜交時，成為合成另一個核酸分子的模板。引物-模板復合物作為DNA聚合酶底物，聚合酶行使其復制功能延伸引物。用于PCR應用的常規(guī)酶是分離自棲熱水生菌(Thermus aquaticus)的熱穩(wěn)定DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶。
存在此基本PCR方法的許多變化，選擇構建本發(fā)明重組載體所需特定步驟的特定過程由技術人員進行。例如，為測量10-4/RLMP的細胞表達，提取RNA并在標準和熟知的過程下反轉錄。隨后通過PCR分析所得cDNA的適當mRNA序列。
編碼LIM礦化蛋白的基因在重組表達系統(tǒng)的表達載體中表達。當然，構建的序列不必須與原始或其互補序列相同，而可以是通過DNA密碼子簡并性確定的任何序列，序列表達具骨形成活性的LMP?？墒褂帽Ｊ匕被崛〈蚱渌揎?，如產(chǎn)生氨基末端的甲硫氨酸殘基。
所選宿主表達系統(tǒng)中的活性核糖體結合位點連接嵌合LMP編碼序列的5’末端，形成合成基因。合成基因可插入多種表達載體之一，這是通過連入適當線性化的質粒?？烧{節(jié)啟動子如大腸桿菌lac啟動子，也適用于表達嵌合編碼序列。其它適當?shù)目烧{節(jié)啟動子包括trp、tac、recAT7和λ啟動子。
編碼LMP的DNA通過一些標準的發(fā)表過程轉染到受體細胞，例如磷酸鈣沉淀、DEAE-葡聚糖、電穿孔或原生質體融合，用于形成穩(wěn)定轉化子。磷酸鈣沉淀優(yōu)選，特別當如下進行時。
DNAs轉到細胞前用磷酸鈣共沉淀，根據(jù)Graham和Van Der，Virology，52，456(1973)的方法。40-50μg的等分DNA用于0.5×106個細胞在100mm皿平板培養(yǎng)，鮭精或小牛胸腺DNA作為載體。DNA混合0.5ml 2X Hepes溶液(280mM NaCl、50mMHepes和1.5mM Na2HPO4，pH7.0)，加入等體積的2x CaCl2(250mM CaCl2和10mMHepes，pH7.0)。30-40分鐘后出現(xiàn)白色粒狀沉淀，逐滴均勻分布在細胞上，可在37℃孵育4-16小時。去除培養(yǎng)基且細胞用15％PBS中的甘油振蕩3分鐘。去除甘油后，細胞用含10％胎牛血清的Dulbecco極限必需培養(yǎng)基(DMEM)養(yǎng)。
轉染DNA也可用DEAE-葡聚糖的方法，Kimura等，Virology，49394(1972)和Sompayrac等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78，7575(1981)；電穿孔的方法，Potter，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，7161(1984)；原生質體融合的方法，Sandri-Goddin等，Molec.Cell.Biol.，1，743(1981)。
固相上的亞磷酰胺化學是有機合成雙脫氧核苷酸和聚雙脫氧核苷酸的優(yōu)選方法。此外，可用許多其它有機合成方法。這些方法容易由本領域技術人員修改適于發(fā)明的特定序列。
本發(fā)明也包括核酸分子，在標準條件下與編碼本發(fā)明LIM礦化蛋白的任何核酸序列雜交。“標準雜交條件”隨著探針大小、背景和核酸試劑濃度以及雜交類型而不同，例如原位、DNA印跡或DNA-RNA雜合(RNA印跡)。確定“標準雜交條件”在本領域技術水平內。例如參見Fremeau等，的美國專利5,580,775，由于此目的納入供參考。也參見Southern，J.Mol.Biol.，98503(1975)，Alwine，Meth.Enzymol.，68220(1979)和Sambrook等，《分子克隆實驗室手冊》，第2版，Cold SpringHarbor Press，7.19-7.50(1989)。
一套優(yōu)選的標準雜交條件包括印跡在50％甲酰胺、5X SSPE(150mM NaCl、10mMNa2HPO4[pH7.4]、1mM EDTA[pH8.0])、15X Denhardt溶液(20mg Ficoll、20mg聚乙烯吡咯烷酮和20mg BSA每100ml水)、10％硫酸葡聚糖、1％SDS和100μg/ml鮭精DNA中42℃預雜交2小時。加入32P-標記的cDNA探針，雜交連續(xù)14小時。之后，印跡用2X SSPE、0.1％SDS在22℃洗2次20分鐘，接著在0.1X SSPE、0.1％SDS中65℃洗1小時。隨后干燥印跡并在增光屏存在時對x-光薄膜曝光5天。
在“高度嚴格條件”下，如果兩種序列完全相同，探針與其靶序列雜交。在標準雜交條件的情況中，本領域技術人員可根據(jù)本領域技術水平和特定實驗性質來確定僅完全相同序列會雜交的條件。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供分離的核酸分子，分子包含編碼LIM礦化蛋白的核酸序列。根據(jù)發(fā)明的核酸分子可以是一種核酸分子，在標準條件下和與全長SEQ.ID NO25互補的核酸分子雜交和/或在高度嚴格條件下和與全長SEQ.ID NO26互補的核酸分子雜交。更特定的是，根據(jù)發(fā)明的分離核酸分子可編碼HLMP-1、HLMP-1s、RLMP、HLMP-2或HLMP-3。
發(fā)明的另一個方面包括由核酸序列編碼的蛋白質。在另一個實施方案中，發(fā)明涉及在抗LMP抗體基礎上鑒定這些蛋白質。在此實施方案中，制備用于蛋白質印跡分析的蛋白質樣品是通過裂解細胞和用SDS-PAGE分離蛋白質。蛋白質通過電印跡(electrobloffing)轉移到硝化纖維膜，如Ausubel等到，《分子生物的當前操作》，John Wiley and Sons(1987)所述。濾器用速溶脫脂奶粉(100ml PBS中1gm)封閉后，抗LMP抗體加入濾器并室溫孵育1小時。濾器用磷酸緩沖鹽水(PBS)充分洗并用山葵過氧化物酶(HRPO)-抗體綴合物室溫孵育1小時。濾器再次用PBS充分洗且抗原帶通過加入二胺對二氨基聯(lián)苯(DAB)來鑒定。
單一特異性抗體是本發(fā)明選擇的試劑，更特定用于分析病人細胞與LMP表達相關的特異性質。如本文所用，“單一特異性抗體”定義為單個抗體種類或多抗體種類，抗體具有LMP同源結合性質。如本文所用，“同源結合”指抗體種類結合特異抗原或抗原表位的能力，例如如上所述與LMP相聯(lián)的。LMP的單一特異性抗體從含抗LMP抗體的哺乳動物抗血清中純化或制備為與LMP反應的單克隆抗體，用Kohler和Milstein、Kohler等，Nature，256，495-497(1975)的技術。LMP特異抗體通過免疫動物培養(yǎng)，例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、山羊或馬，用適當濃度LMP，有或沒有免疫佐劑。
在此過程中，初次免疫前收集預免疫血清。各動物接受約0.1mg和約1000mg間的LMP，如果需要LMP與可接受免疫佐劑相聯(lián)。這種可接受免疫佐劑包括但不限于弗氏完全、弗氏不完全、明礬-沉淀、含棒狀桿菌parvum的油中水乳劑和tRNA佐劑。初次免疫由LMP組成，優(yōu)選弗氏完全佐劑以皮下(SC)、腹膜內(IP)或這兩種方式注射到多個位置。各動物以固定間隔放血以確定抗體效價，優(yōu)選每周。初次免疫后，動物可接受或不接受加強注射。接受加強注射的動物一般通過相同途徑給予等量弗氏不完全佐劑中的抗原。加強注射以約3周間隔給予直到獲得最大效價。各加強免疫后約7天或單次免疫后約一周，動物被放血，收集血清等分樣品保存于約-20℃。
與LMP反應的單克隆抗體(mAb)通過用LMP免疫純合小鼠來制備，優(yōu)選Balb/c小鼠。小鼠通過IP或SC途徑用約0.1mg到約10mg LMP免疫，優(yōu)選約1mg，LMP在約0.5ml緩沖液或鹽水中，如上所述結合等體積的可接受佐劑。優(yōu)選弗氏完全佐劑。小鼠在第0天接受初次免疫并休息約3-30周。給予免疫小鼠一次或多次加強免疫，通過靜脈內(IV)途徑用約0.1到約10mg LMP免疫，LMP在緩沖溶液中如磷酸緩沖鹽水。獲得來自抗體陽性小鼠的淋巴細胞，優(yōu)選脾淋巴細胞，通過本領域已知標準過程從免疫小鼠中取出脾。產(chǎn)生雜交瘤細胞通過脾淋巴細胞在可形成穩(wěn)定雜交瘤的條件下混合適當融合伴侶，優(yōu)選骨髓瘤細胞。融合伴侶可包括但不限于小鼠骨髓瘤P3/NS1/Ag4-1；MPC-11；S-194和Sp2/0，優(yōu)選Sp2/0。抗體生成細胞和骨髓瘤細胞在約1000分子量的聚乙二醇中融合，濃度從約30％到約50％。融合的雜交瘤細胞通過在補給性Dulbecco修改Eagles培養(yǎng)基(DMEM)的次黃嘌呤、胸苷和氨喋呤中生長來選擇，使用本領域已知過程。上清液在約第14、18和21天從生長陽性孔中收集，通過免疫測定如固相免疫放射測定(SPIRA)篩選抗體生成，LMP用作抗原。培養(yǎng)液也在Quchterlony沉淀測定中測試以確定同型mAb。來自抗體陽性孔的雜交瘤細胞通過技術克隆，如軟瓊脂技術，MacPherson，《軟瓊脂技術組織培養(yǎng)方法和應用》(Soft Agar TechniquesTissue Culture Methods andApplications)，Kruse和Paterson(編)，Academic Press(1973)。也參見Harlow等，《抗體實驗室手冊》(AntibodiesA Laboratory Manual)，Cold SpringLaboratory(1988)。
到單克隆抗體也可體內生成，通過在灌注后4天用約2×106到約6×106個雜交瘤細胞注射姥鮫烷灌注的Balb/c小鼠，約0.5ml每只小鼠。腹水液在細胞轉移后約8-12天收集，單克隆抗體通過本領域已知技術純化。
在抗LMP mAb中進行體外生成通過雜交瘤細胞在含約2％胎牛血清的DMEM中生長以獲得足夠量的特異mAb。mAb通過本領域已知技術純化。
腹水或雜交瘤培養(yǎng)液的抗體效價通過多種血清學或免疫測定來確定，包括但不限于沉淀、被動凝集、酶聯(lián)免疫吸收抗體(ELISA)技術和放射性免疫測定(RIA)技術。類似測定用于檢測體液或組織和細胞提取物中LMP的存在。
對于本領域技術人員顯然的是上述產(chǎn)生單一特異性抗體的方法可用于生成特異于LMP多肽片段、全長新生LMP多肽、或其變體或等位基因的抗體。
在另一個實施方案中，發(fā)明涉及另外的HLMP-1剪接變體。PCR分析人心臟cDNA顯示兩種稱為HLMP-2和HLMP-3的另外HLMP-1剪接變體的mRNA，它們與HLMP-1的差異在于HLMP-1序列中堿基對325-444間的區(qū)域。HLMP-2序列在此區(qū)域中具有119個堿基對缺失和17個堿基對插入。這些變化保存閱讀框，產(chǎn)生423個氨基酸的蛋白質，與HLMP-1相比凈失去34個氨基酸(40個氨基酸缺失加6個氨基酸插入)。HLMP-2包含HLMP-1中存在的c-末端LIM結構域。
與HLMP-1相比，HLMP-3沒有缺失，但它確實在位置444有相同的17個堿基對插入。此插入使讀框移位，導致在堿基對459-461的終止密碼子。結果，HLMP-3編碼153個氨基酸的蛋白質。此蛋白質缺乏HLMP-1和HLMP-2中存在的c-末端LIM結構域。由HLMP-2和HLMP-3編碼蛋白質的預測大小通過蛋白質印跡分析確認。
PCR分析三種剪接變體的組織分布顯示它們表達不同，特定同工型在不同組織中占優(yōu)勢。HLMP-1顯然是白細胞、脾、肺、胎盤和胎兒肝中表達的主要形式。HLMP-2似乎是骨骼肌、骨髓和心臟組織中的主要同工型。然而，HLMP-3不是所檢測組織中的主要同工型。
在大鼠造骨細胞二級培養(yǎng)物中過度表達HLMP-3誘導骨節(jié)形成(287±56)，與糖皮質激素(glucicorticoid)(272±7)和HLMP-1(232±200)所見的效果類似。由于HLMP-3缺乏C-末端LIM結構域，有的區(qū)域不需用于骨誘導活性。
然而，過度表達HLMP-2不誘導節(jié)形成(11±3)。這些數(shù)據(jù)表明骨誘導需要由缺失的119個堿基對編碼的氨基酸。數(shù)據(jù)也表明HLMP剪接變體的分布可能對于組織特異性功能是重要的。令人驚訝的是，我們顯示HLMP-2在大鼠造骨細胞二級培養(yǎng)物中抑制類固醇-誘導的造骨細胞形成。因此，HLMP-2可能在臨床情況中有治療效用，其中不需要骨形成。
在1997年7月22日，10-4/RLMP在名為pCMV2/RLMP的載體(它是載體pRc/CMV2，插入10-4克隆/RLMP)中，樣品保存于美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852。此保存的培養(yǎng)物登錄號是209153。在1998年3月19日，載體pHis-A有HLMP-1s插入，樣品保存于美國模式培養(yǎng)物保藏所(“ATCC”)。此保存的培養(yǎng)物登錄號是209698。在2000年4月14日，質粒pHAhLMP-2(載體pHis-A有cDNA插入，cDNA獲得自有HLMP-2的人心肌cDNA)和pHAhLMP-3(載體pHis-A有cDNA插入，cDNA獲得自有HLMP-3的人心肌cDNA)，樣品保存于ATCC，10801 University Blvd.，Manassas，VA，20110-2209，USA，在布達佩斯條約條件下。這些保存的登錄號分別是PTA-1698和PTA-1699。如布達佩斯條約所要求的，這些保存在ATCC中維持至少30年并可在顯示它們的病人同意下對公眾開放。應理解的是保存的可用性不許可實踐試驗發(fā)明去侵犯政府賦予病人的權利。
在評估發(fā)明的核酸、蛋白質或抗體中，使用酶測定、蛋白質純化和其它常規(guī)生化方法。DNA和RNA分別用DNA印跡和RNA印跡技術分析。通常，所分析樣品通過凝膠電泳進行大小分離。隨后膠中的DNA或RNA轉移到硝化纖維或尼龍膜。印跡是膠中樣品模式的復制，隨后與探針雜交。一般，探針用放射性同位素標記，優(yōu)選32P，盡管可用其它本領域已知的信號-產(chǎn)生分子標記探針。感興趣的特定帶可隨后通過檢測系統(tǒng)顯現(xiàn)，如放射自顯影。
為了闡述本發(fā)明較佳實施方案的目的，下列非限制的例子被包括。這些結果證明誘導或提高骨形成的可行性，使用發(fā)明的LIM礦化蛋白、編碼這些蛋白質的分離核酸分子。
實施例1顱頂細胞培養(yǎng)大鼠顱頂細胞也稱為大鼠造骨細胞(“ROB”)，如前所述獲得自20天預分娩的大鼠。Boden等，Endocrinology，137，8，3401-3407(1996)。原代培養(yǎng)物生長到匯合(7天)，胰蛋白酶消化，傳代到6孔板(1×105個細胞/35mm孔)作為初期傳代細胞。傳代細胞在第0天匯合，再生長7天。從第0天開始，每3或4天在層流凈化罩下改變培養(yǎng)基且應用處理(Trm和/或BMPs)。標準的培養(yǎng)操作如下第1-7天，MEM、10％FBS、50μg/ml抗壞血酸、±刺激；第8-14天，BGJb培養(yǎng)基、10％FBS、5mMβ-GlyP(作為無機磷酸來源以允許礦化)。骨節(jié)形成和骨鈣蛋白分泌的終點分析在第14天進行。在此系統(tǒng)預實驗基礎上選擇BMP劑量為50ng/ml，預實驗顯示中部范圍對所有被研究BMPs的劑量反應曲線的效果。
實施例2反義治療和細胞培養(yǎng)為研究LMP-1在膜骨形成中的潛在功能作用，我們合成了反義寡核苷酸以阻斷LMP-1 mRNA翻譯和處理正進行分化的二級造骨細胞培養(yǎng)物，分化由糖皮質激素起始。抑制RLMP表達用高度特異反義寡核苷酸(與已知大鼠序列沒有顯著同源性)完成，反義寡核苷酸對應于橫跨推定翻譯起始位置的25bp序列(SEQ.ID NO42)。對照培養(yǎng)物沒有接受寡核苷酸或接受反義寡核苷酸。
實驗在脂轉染胺存在(預孵育)和缺乏時進行。簡言之，22μg有義或反義RLMP寡核苷酸在MEM中室溫孵育45分鐘。孵育后，加入更多MEM或預孵育的脂轉染胺/MEM(7％v/v；室溫孵育45分鐘)以獲得0.2μM濃度的寡核苷酸。所得混合物室溫孵育15分鐘。隨后寡核苷酸混合物與適當培養(yǎng)基混合，即MEM/抗壞血酸鹽/±Trm，以獲得0.1μM終濃度的寡核苷酸。
細胞用適當培養(yǎng)基在合適寡核苷酸存在或缺乏時培養(yǎng)。原始用脂轉染胺培養(yǎng)的培養(yǎng)物用培養(yǎng)基孵育(37℃；5％CO2)4小時后再養(yǎng)，培養(yǎng)基不含脂轉染胺或寡核苷酸。所有培養(yǎng)物特別是接受寡核苷酸的培養(yǎng)物，每24小時再養(yǎng)以維持寡核苷酸水平。
LMP-1反義寡核苷酸以劑量-依賴方式抑制礦化節(jié)形成和骨鈣蛋白分泌，類似于BMP-6寡核苷酸的效果。造骨細胞分化中的LMP-1反義阻斷不能通過加入外源BMP-6恢復，而BMP-6反義寡核苷酸抑制通過加入BMP-6反轉。此實驗進一步確認LMP-1在造骨細胞分化途徑中相對BMP-6的上游位置。LMP-1反義寡核苷酸也抑制原代大鼠造骨細胞培養(yǎng)物中的自發(fā)造骨細胞分化。
實施例3礦化骨節(jié)形成的定量根據(jù)實施例1和2制備的ROBs培養(yǎng)物在70％乙醇中過夜固定且用馮克普氏銀染染色。半自動計算機化視頻圖象分析系統(tǒng)用于定量各孔中的節(jié)數(shù)和節(jié)面積。Boden等，Endocrinology，137，8，3401-3407(1996)。隨后除以這些值以計算每節(jié)的面積值。此自動化過程根據(jù)手工計數(shù)技術驗證且證明相關系數(shù)為0.92(p＜0.000001)。所有數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±平均數(shù)的標準偏差(S.E.M.)，在各情況下從5或6個孔計算。各實驗用來自不同顱頂制品的細胞確認至少2次。
實施例4骨鈣蛋白分泌的定量培養(yǎng)基中的骨鈣蛋白水平用競爭性放射免疫測定測量，用我們實驗室培養(yǎng)的單一特異性多克隆抗體(Pab)，抗大鼠骨鈣蛋白的C-末端九肽，如Nanes等，Endocrinology，127588(1990)所述。簡言之，1μg九肽用1mCi125I-Na通過乳過氧化物酶方法碘化。含200gl測定緩沖液(0.02M磷酸鈉、1mM EDTA、0.001％硫柳汞、0.025％BSA)的管以測定緩沖液中100gl/管接受培養(yǎng)基，培養(yǎng)基取自細胞培養(yǎng)物或骨鈣蛋白標準(0-12,000 fmole)。隨后加入Pab(1∶40,000；100μl)，接著是碘化肽(12,000cpm；100μl)。測試非特異結合的樣品制備類似，但不含抗體。
分開結合和游離的Pabs通過加入700μl山羊抗兔IgG，接著在4℃孵育18小時。樣品以1200rpm離心15分鐘后，輕輕倒出上清且沉淀在γ計數(shù)器中計數(shù)。骨鈣蛋白值報導為fmole/100μl，隨后通過將這些值除以100轉化成fmole/ml培養(yǎng)基(3-天生成)。值表示為平均數(shù)±各情況中5-6孔三次確定的標準偏差(S.E.M.)。各實驗用來自不同顱頂制品的細胞確認至少2次。
實施例5Trm和RLMP對體外礦化的效果有義或反義寡核苷酸對非刺激細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中總體骨節(jié)生成的明顯效果很小。然而當ROBs用Trm刺激時，RLMP的反義寡核苷酸抑制＞95％的節(jié)礦化。外源BMP-6加入寡核苷酸-處理的培養(yǎng)物不恢復RLMP-反義-處理節(jié)的礦化。
骨鈣蛋白長期與骨礦化同義，骨鈣蛋白水平與節(jié)生成和礦化相關。RLMP-反義寡核苷酸顯著減少骨鈣蛋白生成，但反義-處理培養(yǎng)物中的節(jié)計數(shù)沒有顯著變化。在此情況中，加入外源BMP-6僅恢復RLMP-反義-處理培養(yǎng)物中10-15％的骨鈣蛋白生成。這表明RLMP的作用是下游，更特定是BMP-6下游。
實施例6收集和純化RNA來自兩倍孔ROBs的細胞RNA(根據(jù)實施例1和2在6孔培養(yǎng)皿中制備)用4M異硫氰酸酯(GIT)溶液收集以產(chǎn)生三倍統(tǒng)計。簡言之，培養(yǎng)物上清從孔中吸出，然后覆蓋用0.6ml GIT溶液每雙倍孔收集。加入GIT溶液后，平板渦旋5-10秒(盡可能一致)。進一步加工前，樣品保存于-70℃至多7天。
RNA通過稍微修改的標準方法純化，根據(jù)Sambrook等，《分子克隆實驗室手冊》，7.19，第2版，Cold Spring Harbor Press(1989)。簡言之，解凍樣品接受60μl2.0M乙酸鈉(pH4.0)、550μl酚(水飽和)和150μl氯仿∶異戊醇(49∶1。渦旋后，離心樣品(10000xg；20分鐘；4℃)，水相轉移到新管，加入600μl異丙醇且RNA在-20℃過夜沉淀。
過夜孵育后，離心樣品(10000xg；20分鐘)，溫和吸出上清。沉淀重懸浮于400μl DEPC-處理水，用酚∶氯仿(1∶1)抽提一次，氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提，加入40μl乙酸鈉(3.0M；pH5.2)和1.0ml無水乙醇后，-20℃過夜沉淀。為回收細胞RNA，離心樣品(10000xg；20分鐘)，用70％乙醇洗，空氣干燥5-10分鐘并重懸浮于20μlDEPC-處理水。RNA濃度從分光光度計確定的光密度計算。
實施例7反轉錄酶鏈式反應25加熱的總RNA(5μg在10.5μl總體積DEPC-H2O中，65℃ 10分鐘)加入管，管含4μl 5X MMLV-RT緩沖液、2μl dNTPs、2μl dT17引物(10pmol/ml)、0.5μlRNAsin(40U/ml)和1μl MMLV-RT(200單位/μl)。樣品在37℃孵育1小時，隨后95℃5分鐘以滅活MMLV-RT。加入80μl水來稀釋樣品。
反轉錄樣品(5μl)用標準方法(50μl總體積)進行聚合酶鏈式反應。簡言之，樣品加入管中，管含水和適當量的PCR緩沖液、25mM MgCl2、dNTPs、用于3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAP，管家基因)的正向和反向引物和/或BMP-6、32P-dCTP和Taq聚合酶。除非另有說明，引物標準化以在22個循環(huán)恒定運行(94℃，30”；58℃，30”；72℃，20”)。
實施例8通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)和磷成像儀分析來定量RT-PCR產(chǎn)物RT-PCR產(chǎn)物接受5μl/管的加樣染料，混合，65℃加熱10分鐘并離心。10μl的各反應在標準條件下進行PAGE(12％聚丙烯酰胺bis；15V/孔；恒定電流)。膠隨后在膠保存緩沖液(10％v/v甘油、7％v/v乙酸、40％v/v甲醇、43％去離子水)中孵育30分鐘，真空干燥(80℃)1-2小時，用電子增強的磷光成像系統(tǒng)顯影6-24小時。分析顯現(xiàn)的帶。根據(jù)每條帶的計數(shù)繪圖。
實施例9差異顯示PCRRNA從糖皮質激素(Trm，1nM)刺激的細胞中提取。加熱、DNA酶-處理的總RNA(5μg在10.5μl總體積DEPC-H2O中，65℃10分鐘)，如實施例7所述反轉錄，但H-T11M(SEQ.ID.NO4)用作MMLV-RT引物。如上所述，所得cDNAs用PCR擴增，但用不同商業(yè)引物組(例如H-T11G(SEQ.ID.NO4)和H-AP-10(SEQ.ID.NO5)；GenHunter Corp，Nashville，TN)。放射性標記的PCR產(chǎn)物在DNA測序膠上通過凝膠電泳分離。電泳后，所得膠真空干燥且放射自顯影過夜曝光。表現(xiàn)不同表達cDNAs的帶從膠中切下并通過PCR再擴增，使用Conner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88，278(1983)的方法。PCR再擴增產(chǎn)物克隆到載體PCR-11(TA克隆試劑盒；InVitrogen，Carlsbad，CA)。
實施例10篩選UMR 106大鼠骨肉瘤細胞cDNA文庫UMR 106文庫(2.5×1010pfu/ml)以5×104pfu/ml在瓊指平板(LB底部瓊指)上培養(yǎng)，平板在37℃過夜培養(yǎng)。濾膜覆蓋在平板上2分鐘。一旦取出，濾器被變性、沖洗、干燥和UV-交聯(lián)。隨后濾膜在預雜交緩沖液(2X PIPES[pH6.5]、5％甲酰胺、1％SDS和100μg/ml變性鮭精DNA)中42℃孵育2小時。260個堿基對放射性標記的探針(SEQ.ID.NO3；通過隨機引物標記32P)加入完整的雜交混合物/濾器，接著在42℃雜交18小時。膜在室溫洗1次(10分鐘，1xSSC、0.1％SDS)和55℃洗3次(15分鐘，0.1xSSC、0.1％SDS)。
洗后，膜通過上述放射自顯影分析。陽性克隆用噬斑純化。此過程用第二種濾器重復4分鐘以最小化假陽性。噬斑純化的克隆作為λSK(-)噬菌?；謴汀？寺〉腸DNAs如下所述測序。
實施例11測序克隆克隆的cDNA插入通過標準方法測序。Ausubel等，《分子生物的當前操作》，Wiley Interscience(1988)。簡言之，適當濃度的終止混合物、模板和反應混合物接受合適循環(huán)操作(95℃，30秒；68℃，30秒；72℃，60秒；x25)。加入終止混合物以終止測序反應。92℃加熱3分鐘后，樣品加樣到6％變性聚丙烯酰胺測序膠(29∶1丙烯酰胺∶雙丙烯酰胺)。樣品以60伏、恒定電流電泳約4小時。電泳后，膠在真空干燥并放射自顯影。
放射自顯影用手工分析。所得序列根據(jù)數(shù)據(jù)庫篩選，數(shù)據(jù)庫由國家生物技術信息中心維持(NIH，Bethesda，MD；http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，BLASTN程序用默認參數(shù)。在序列數(shù)據(jù)基礎上，制備新的測序引物且重復此過程直到完整的基因被測序。所有序列以兩個方向最少確認3次。
也用PCGENE軟件包(16.0版本)分析核苷酸和氨基酸序列。核苷酸序列的百分比同源性值由程序NALIGN計算，使用下列參數(shù)非匹配核苷酸重量，10；非匹配缺口重量，10；最大考慮核苷酸數(shù)量，50；最小考慮核苷酸數(shù)量，50。
對于氨基酸序列，計算百分比同源性值用PALIGN。開放缺口成本和單位缺口成本都選擇10的值。
實施例12克隆RLMP cDNA實施例9所述差異顯示的PCR擴增產(chǎn)物包含約260堿基對的主要帶。此序列用于篩選大鼠骨肉瘤(UMR 106)cDNA文庫。陽性克隆進行巢式引物分析以獲得擴增全長cDNA(SEQ.ID Nos11、12、29、30和31)所需的引物序列。用于進一步研究的所選陽性克隆之一命名為克隆10-4。
克隆10-4中全長cDNA的序列分析由巢式引物分析確定，顯示克隆10-4包含通過差異顯示PCR鑒定的原始260堿基對片段?？寺?0-4(1696個堿基對；SEQ.IDNO2)包含1371個堿基對的可讀框，編碼的蛋白質有457個氨基酸(SEQ.ID NO1)。終止密碼子TGA出現(xiàn)在核苷酸1444-1446。核苷酸1675-1680的多腺苷酸信號和相鄰聚(A)+尾存在于3’非編碼區(qū)。有兩個潛在N-糖基化位點天冬酰胺-賴氨酸-蘇氨酸和天冬酰胺-精氨酸-蘇氨酸，分別在SEQ.ID NO1的氨基酸位置113-116和257-259。兩個潛在的cAMP-和cGMP-依賴的蛋白激酶磷酸化位點絲氨酸和蘇氨酸分別發(fā)現(xiàn)于氨基酸位置191和349。有五個潛在的蛋白激酶C磷酸化位點絲氨酸或蘇氨酸，在氨基酸位置3、115、166、219和442。一個潛在的ATP/GTP結合位點基序A(P-環(huán))甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-天冬酰胺-天冬酰胺-甘氨酸-賴氨酸-蘇氨酸，確定在氨基酸位置272-279。
此外，兩個高度保守的推定LIM結構域在氨基酸位置341-391和400-451發(fā)現(xiàn)。此新鑒定大鼠cDNA克隆中的推定LIM結構域顯示與其它已知LIM蛋白的LIM結構域顯著同源。然而，與其它大鼠LIM蛋白的總體同源性小于25％。RLMP(也稱為10-4)與人enigma蛋白(參見美國專利號5,504,192)有78.5％的氨基酸同源性，但與其最近的大鼠同系物CLP-36和RIT-18僅分別有24.5％和22.7％的氨基酸同源性。
實施例13RNA印跡分析RLMP表達來自ROBs的30μg總RNA根據(jù)實施例1和2制備，在1％瓊脂糖平板膠(agaroseflatbed gel)中通過甲醛凝膠電泳分離大小并滲透轉印跡到尼龍膜。印跡用全長10-4cDNA的600堿基對EcoR1片段探測，cDNA通過隨機引物標記32P-dCTP。
RNA印跡分析顯示1.7kb mRNA種類與RLMP探針雜交。暴露于BMP-6 24時后，RLMP mRNA在ROBs中上調約3.7倍。在BMP-2或BMP-4刺激的ROBs中24小時時沒有發(fā)現(xiàn)RLMP表達上調。
實施例14統(tǒng)計方法對于各報導的節(jié)/骨鈣蛋白結果，來自代表實驗5-6孔的數(shù)據(jù)用于計算平均數(shù)±S.E.M.。圖可用相對各參數(shù)最大值標準化的數(shù)據(jù)顯示以同時做出骨計數(shù)、礦化區(qū)域和骨鈣蛋白的圖。
對于各報導的RT-PCR、RNA酶保護測定或蛋白質印跡分析，來自代表實驗三倍樣品的數(shù)據(jù)用于確定平均數(shù)±S.E.M.。顯示的圖可相對第0天或負對照標準化且表示為超過對照值的倍數(shù)。
評估統(tǒng)計顯著性用單向方差分析，適當時可采用Bonferroni的post-hoc多種比較修正。D.V.Huntsberger，“方差分析”(The Analysis of Variance)，《統(tǒng)計方差要素》(Elements of Statistical Variance)，P.Billingsley(編)，Allyn &Bacon Inc.，Boston，MA，298-330(1977)和SigmaStat，Jandel Scientific，CorteMadera，CA。顯著性的α水平定義為p＜0.05。
實施例15通過蛋白質印跡分析檢測大鼠LIM礦化蛋白多克隆抗體根據(jù)England等，Biochim.Biophys.Acta，623，171(1980)和Timmer等，J.Biol.Chem.，268，24863(1993)的方法制成。
海拉細胞用pCMV2/RLMP轉染。蛋白質從轉染細胞中收集，根據(jù)Hair等，Leukemia Research，20，1(1996)的方法。進行蛋白質印跡分析新生RLMP，如Towbin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，764350(1979)所述。
實施例16獲得自人PCR產(chǎn)物的大鼠LMP-獨特(RLMPU)的合成在大鼠LMP-1 cDNA序列基礎上，合成正向和反向PCR引物(SEQ.ID NO15和16)，獨特的223堿基對序列從大鼠LMP-1 cDNA中PCR擴增。類似的PCR產(chǎn)物用相同的PCR引物從人MG63骨肉瘤細胞cDNA中分離。
RNA從生長于T-75瓶的MG63骨肉瘤細胞中收集。吸出培養(yǎng)物上清，瓶用3.0mlGIT溶液每雙倍覆蓋，渦旋5-10秒，所得溶液轉移到1.5ml離心管(6管，0.6ml/管)。RNA通過稍微修改的標準方法純化，例如參見Sambrook等，《分子克隆實驗室手冊》，第7章，19頁，Cold Spring Harbor Press(1989)和Boden等，Endocrinology，138，2820-2828(1997)。簡言之，0.6ml樣品接受60μl 2.0M乙酸鈉(pH4.0)、550μl水飽和的酚和150μl氯仿∶異戊醇(49∶1)。加入這些試劑后，渦旋樣品，離心(10000xg；20分鐘；4℃)，水相轉移到新管。加入異丙醇(600μl)且RNA在-20℃過夜沉淀。離心樣品(10000xg；20分鐘)，溫和吸出上清。沉淀重懸浮于400μl DEPC-處理水，用酚∶氯仿(1∶1)抽提一次，氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提，在40μl乙酸鈉(3.0M；pH5.2)和1.0ml無水乙醇中-20℃過夜沉淀。沉淀后，離心樣品(10000xg；20分鐘)，用70％乙醇洗一次，空氣干燥5-10分鐘并重懸浮于20μl DEPC-處理水。RNA濃度從光密度獲得。
總RNA(5μg在10.5μl總體積DEPC-H2O中)在65℃加熱5分鐘，隨后加入管，管含4μl 5X MMLV-RT緩沖液、2μl dNTPs、2μl dT17引物(10pmol/ml)、0.5μlRNAsin(40U/ml)和1μl MMLV-RT(200單位/μl)。反應在37℃孵育1小時。之后95℃加熱5分鐘以滅活MMLV-RT。加入80μl水來稀釋樣品。
反轉錄樣品(5μl)用標準方法(50μl總體積)進行聚合酶鏈式反應。Boden等，Endocrinology，138，2820-2828(1997)；Ausubel等，“通過聚合酶鏈式反應定量稀有DNA”(Quantitation of Rare DNAs by the Polymerase Chain Reaction)《分子生物的當前操作》，15.31-1章，Wiley & Sons，Trenton，NJ(1990)。簡言之，樣品加入管中，管含水和適當量的PCR緩沖液(25mM MgCl2、dNTPs、正向和反向引物(用于RLMPU；SEQ.ID NOS15和16)、32P-dCTP和DNA聚合酶。設計引物恒定運行22個循環(huán)用于放射性帶檢測以及33循環(huán)用于擴增PCR產(chǎn)物用作篩選探針(94℃，30”；58℃，30”；72℃，20”)。
測序瓊脂糖膠-純化、獲得自MG63骨肉瘤的PCR產(chǎn)物顯示序列與RLMPU PCR產(chǎn)物同源性大于95％。此序列命名為HLMP獨特區(qū)(HLMPU；SEQ.ID NO6)。
實施例17篩選逆轉錄酶獲得的MG63 cDNA篩選用PCR進行，使用實施例17所述特異引物(SEQ.ID NOS16和17)。717個堿基對的MG63 PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖膠純化并用特定引物(SEQ.ID NOs12、15、16、17、18、27和28)測序。序列以兩個方向最少確認2次。MG63序列相互排列，隨后相對全長大鼠LMP cDNA序列排列以獲得部分人LMP cDNA序列(SEQ.ID NO7)。
實施例18篩選人心臟cDNA文庫在RNA印跡實驗基礎上，確定不同組織以不同水平表達LMP-1，包括人心肌。因此檢測人心臟cDNA文庫。文庫以5×104pfu/ml在瓊指平板(LB底部瓊指)上培養(yǎng)，平板在37℃過夜培養(yǎng)。濾膜覆蓋在平板上2分鐘。一旦取出，濾器被變性、沖洗、干燥和UV-交聯(lián)并在預雜交緩沖液(2X PIPES[pH6.5]；5％甲酰胺、1％SDS和100μg/ml變性鮭精DNA)中42℃孵育2小時。加入放射性標記、LMP-獨特的223個堿基對探針(32P，隨機引物標記；SEQ.ID.NO6)且42℃雜交18小時。雜交后，膜在室溫洗1次(10分鐘，1xSSC、0.1％SDS)和55℃洗3次(15分鐘，0.1xSSC、0.1％SDS)。雙重陽性噬斑純化的心臟文庫克隆通過放射自顯影鑒定，根據(jù)廠商操作恢復為λ噬菌粒。
限制性消化陽性克隆產(chǎn)生不同大小的cDNA插入。通過測序選擇長度大于600個堿基對的插入用于初始篩選。這些插入通過實施例11所述標準方法測序。
7號克隆也進行自動序列分析，所用引物對應于SEQ.ID NOS11-14、16和27。這些方法所得序列一般是97-100％同源。克隆7(來自心臟文庫的部分人LMP-1 cDNA序列；SEQ.ID.NO8)包含的序列與大鼠LMP cDNA序列在翻譯區(qū)同源性大于87％。
實施例19確定全長人LMP-1 cDNAMG63人骨肉瘤細胞cDNA序列和人心臟cDNA克隆7序列的重疊區(qū)用于排列這兩個序列并獲得1644個堿基對的完整人cDNA序列。PCGENE軟件包中的程序NALIGN用于這兩個序列。兩個序列的重疊區(qū)構成約360個堿基對，完全同源，除了MG63cDNA的核苷酸672有單核苷酸取代(SEQ.ID.NO7)而克隆7在對應核苷酸516是”A”而不是”G”(SEQ.ID.NO8)。
兩個排列序列用另一種PCGENE子程序SEQIN連接，用”G”取代MG63骨肉瘤cDNA克隆。所得序列示于SEQ.ID.NO9。排列來自于人的新序列和大鼠LMP-1 cDNA用NALIGN完成。全長人LMP-1 cDNA序列(SEQ.ID.NO9)與大鼠LMP-1 cDNA序列翻譯部分87.3％同源。
實施例20確定人LMP-1的氨基酸序列人LMP-1的推定氨基酸序列用PCGENE子程序TRANSL確定。SEQ.ID.NO9中可讀框編碼的蛋白質含457個氨基酸(SEQ.ID.NO10)。用PCGENE子程序Palign，發(fā)現(xiàn)人LMP-1氨基酸序列與大鼠LMP-1氨基酸序列94.1％同源。
實施例21確定人LMP-1 cDNA的5引物(Prime)未翻譯區(qū)MG63 5’cDNA通過MG63總RNA的巢式RT-PCR擴增，用5’迅速擴增cDNA末端(5’RACE)操作。此方法包括用鎖-對接(lock-docking)寡(dT)引物合成第一條cDNA鏈，引物在3’末端有兩個簡并核苷酸位置(Chenchik等，CLONTECHniques，X5(1995)；Borson等，PC Methods Applic.，2，144(1993))。合成第二條鏈根據(jù)Gubler等，Gene，2，263(1983)的方法進行，用大腸桿菌DNA聚合酶1、RNase H和大腸桿菌DNA連接酶的混合物。用T4 DNA聚合酶產(chǎn)生鈍端后，雙鏈cDNA連接到片段(5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3’)(SEQ.ID.NO19)。RACE前，銜接子連接的cDNA稀釋到適于Marathon RACE反應的濃度(1∶50)。隨后可特異克隆銜接子連接的雙鏈cDNA。
進行第一輪PCR，銜接子特異性寡核苷酸5’-CCATCCTAATACGACTCACTATA GGGC-3’(AP1)(SEQ.ID.NO20)作為有義引物，基因特異引物(GSP)來自實施例16所述獨特區(qū)(HLMPU)。進行第二輪PCR，用巢式引物GSP1-HLMPU(反義/反向引物)(SEQ.ID.NO23)和GSP2-HLMPUF(SEQ.ID.NO24)(參見實施例16；有義/正向引物)。PCR用商業(yè)試劑盒(優(yōu)勢cDNA PCR核心試劑盒；CloneTech Laboratories Inc.，PaloAlto，CA)進行，此試劑盒使用抗體-調節(jié)但卻標準、熱啟動的操作。M663 cDNA的PCR條件包括開始的熱啟動變性(94℃，60秒)，接著94℃，30秒；60℃，30秒；68℃，4分鐘；30個循環(huán)。第一輪PCR產(chǎn)物長度約750個堿基對而巢式PCR產(chǎn)物約230個堿基對。第一輪PCR產(chǎn)物克隆到線性pCR2.1載體(3.9Kb)。插入用M13正向和反向引物(SEQ.ID.NO11；SEQ.ID.NO12)以兩個方向測序。
實施例22確定具5端UTR的全長人LMP-1 cDNA排列重疊的M663人骨肉瘤細胞cDNA 5’-UTR序列(SEQ.ID.NO21)、MG63 717個堿基對序列(實施例17；SEQ.ID.NO8)和人心臟cDNA克隆7序列(實施例18)以獲得1704個堿基對的人cDNA新序列(SEQ.ID.NO22)。排列用NALIGN(PCGENE和Omiga 1.0；Intelligenetics)完成。重疊序列幾乎100％同源構成完整的717個堿基對序列(實施例17)。排列序列的連接用SEQIN完成。
實施例23構建LIM蛋白表達載體構建pHIS-5ATG LMP-1s表達載體用實施例17和18所述序列完成。717個堿基對克隆(實施例17；SEQ.ID.NO7)用ClaI和EcoRV消化。膠純化小片段(約250個堿基對)?？寺?(實施例18；SEQ.ID.NO8)用ClaI和XbaI消化且1400個堿基對片段用膠純化。連接分離的250個堿基對和1400個堿基對限制性片段以形成約1650個堿基對片段。
由于克隆7中的單核苷酸取代(相對717個堿基對PCR序列和原始大鼠序列)，在翻譯的堿基對672產(chǎn)生終止密碼子。由于此終止密碼子，截短(短)蛋白被編碼，因此命名為LMP-1s。這是用于表達載體的構建(SEQ.ID.NO32)。具5’UTR的全長cDNA序列通過排列SEQ.ID.NO32和5’RACE序列(SEQ.ID.NO21)而產(chǎn)生。隨后LMP-1s的氨基酸序列推斷為223個氨基酸蛋白并通過蛋白質印跡確認(如實施例15)，跑在約23.7kD的預計分子量。
pHis-ATG載體(InVitrogen，Carlsbad，CA)用EcoRV和XbaI消化。回收載體，隨后650個堿基對的限制性片段連入線性pHis-ATG?？寺〔U增連接產(chǎn)物。pHis-ATG-LMP-1s表達載體也命名為插入HLMP-1s的pHIS-A，通過標準方法純化。
實施例24用LIM表達載體體外誘導骨節(jié)形成和礦化根據(jù)實施例1分離大鼠顱頂細胞并生長于二級培養(yǎng)物。不刺激培養(yǎng)物或用實施例1所述糖皮質激素(GC)刺激。根據(jù)實施例25，修改的Superfect試劑(Qiagen，Valencia，CA)轉染操作用于將3μg/孔的各載體轉染到大鼠顱頂造骨細胞二級培養(yǎng)物中。
礦化節(jié)通過馮克普氏染色呈現(xiàn)，如實施例3所述。人LMP-1s基因產(chǎn)物過度表達單獨誘導體外骨節(jié)形成(約230個節(jié)/孔)。節(jié)的水平約為GC正對照(約412個節(jié)/孔)的50％。其它正對照包括pHisA-LMP-大鼠表達載體(約152個節(jié)/孔)和pCMV2/LMP-大鼠-正向表達載體(約206個節(jié)/孔)，而負對照包括pCMV2/LMP-大鼠-反向表達載體(約2個節(jié)/孔)和未處理(NT)平板(約4個節(jié)/孔)。這些數(shù)據(jù)證明人cDNA至少和大鼠cDNA一樣誘導骨。效果小于GC刺激所觀察到的，最有可能是因為表達載體劑量不最理想。
實施例25LIM-誘導的體外和體內細胞分化克隆10-4中的大鼠LMP cDNA(參見實施例12)從載體中切下，這是通過NotI和ApaI 37℃過夜雙重消化克隆。載體pCMV2 MCS(InVitrogen，Carlsbad，CA)用相同的限制性酶消化。來自克隆10-4的線性cDNA片段和pCMV2都用膠純化，提取和T4連接酶連接。連接的DNA用膠純化，提取和用于轉化大腸桿菌JM109細胞以擴增。挑出陽性瓊脂菌落，用NotI和ApaI消化，限制性消化通過凝膠電泳檢測。保存培養(yǎng)物由陽性克隆制備。
反向載體以類似方式制備，除了所用的限制性酶是XbaI和HindIII。由于使用這些限制性酶，來自克隆10-4的LMP cDNA片段以反(即不能翻譯)方向插入pRc/CMV2。生成的重組載體名為pCMV2/RLMP。
適當量的pCMV10-4(60nM終濃度最佳[3μg]；對于此實驗，優(yōu)選0-600nM/孔
的終濃度范圍)重懸浮于基本Eagle培養(yǎng)基(MEM)至450μl終體積，渦旋10秒。加入Superfect(7.5μl/ml終溶液)，溶液渦旋10秒，隨后室溫孵育10分鐘。孵育后，加入添加10％FBS的MEM(1ml/孔；6ml/平板)并通過抽吸混合。
然后所得溶液迅速吸到(1ml/孔)洗過的ROB培養(yǎng)物上。培養(yǎng)物在含5％CO2的潮濕空氣中37℃孵育2小時。之后，細胞用無菌PBS溫和洗一次且加入適當?shù)恼７跤囵B(yǎng)基。
結果證明用pCMV10-4誘導的所有大鼠細胞培養(yǎng)物中骨節(jié)形成顯著。例如，pCMV10-4轉染的細胞產(chǎn)生429個節(jié)/孔。暴露于Trm的正對照培養(yǎng)物產(chǎn)生460個節(jié)/孔。相反，沒有接受處理的負對照產(chǎn)生1個節(jié)/孔。類似的，培養(yǎng)物用pCMV10-4(反向)轉染，沒有觀察到節(jié)。
為證明體內重新骨形成，骨髓從4-5周大正常大鼠(rnu/+；隱性無胸腺雜合)后肢中吸出。吸出的骨髓細胞在αMEM中洗，離心，裂解RBCs，這是通過沉淀重懸浮于10mM Tris(pH7.4)中的0.83％NH4Cl。剩余骨髓細胞用MEM洗3次，用9μgpCMV-LMP-1s(正或反向)每3×106個細胞轉染2小時。隨后，轉染細胞用MEM洗2次并以3×107個細胞/ml的濃度重懸浮。
細胞懸浮液(100μl)經(jīng)無菌移液管應用到無菌2×5mm I型牛膠原盤(SulzerOrthopaedics，Wheat Ridge，CO)。盤通過手術皮下移植到4-5周大無胸腺大鼠(rnu/rnu)的頭骨、胸、腹或背鰭鰭棘。動物在第3-4周殺死，此時切下盤或手術區(qū)域并固定在70％乙醇中。固定樣本通過放射顯影分析，在5μm厚切片上進行未脫鈣組織檢測，切片用三色Goldner染色。實驗也用早衰(胍提取)去礦化骨基質(Osteotech，Shrewsbury，NJ)取代膠原盤進行。
放射顯影顯示高水平的礦化骨形成，與形成原始膠原盤符合，膠原盤含LMP-1s轉染的骨髓細胞。在負對照(用反向形式的LMP-1s cDNA轉染細胞，此cDNA不編碼翻譯蛋白)中沒有觀察到礦化骨形成，載體吸收似乎進行很好。
組織學顯示新骨小梁在LMP-1s轉染移植中沿造骨細胞排列。在負對照中沒有發(fā)現(xiàn)骨與部分重吸收載體一起。
放射顯影進一步的實驗，其中18組(9個負對照pCMV-LMP-反向&9個實驗性pCMV-LMP-1s)移植加入無胸腺大鼠腰或胸脊柱位置，證明0/9負對照移植表現(xiàn)出椎骨間的骨形成(脊柱融合)。所有9個pCMV-LMP-1s處理的移植表現(xiàn)出椎骨間的固體骨融合。
實施例26來自實施例2和3所示序列的pHIS-5’ATG LIM-1s表達載體的合成717個堿基對的克隆(實施例17)用ClaI和EcoRV(New England Biologicals，city，MA)消化。膠純化小片段(約250個堿基對)?？寺?(實施例18)用ClaI和XbaI消化。1400個堿基對的片段從此消化中膠純化。通過標準方法連接分離的250個堿基對和1400個堿基對cDNA片段以形成約1650bp片段。pHisA載體(InVitrogen)用EcoRV和XbaI消化?；厥站€性載體并連入嵌合的1650個堿基對cDNA片段。通過標準方法克隆并擴增連接產(chǎn)物，pHis-ATG-LMP-1s表達載體也命名為插入HLMP-1s的pHIS-A，如前所述保存于ATCC。
實施例27用pHis-5’ATG LIM-1s表達載體體外誘導骨節(jié)形成和礦化根據(jù)實施例1分離大鼠顱頂細胞并生長于二級培養(yǎng)物。不刺激培養(yǎng)物或根據(jù)實施例1用糖皮質激素(GC)刺激。如實施例25所述，培養(yǎng)物用3μg重組pHis-A載體DNA/孔轉染。根據(jù)實施例3，礦化節(jié)通過馮克普氏染色呈現(xiàn)。
人LMP-1s基因產(chǎn)物過度表達單獨(即沒有GC刺激)體外誘導顯著骨節(jié)形成(約203個節(jié)/孔)。這約為暴露于GC正對照的細胞所產(chǎn)生節(jié)數(shù)量(約412個節(jié)/孔)的50％。用pHisA-LMP-大鼠表達載體(約152個節(jié)/孔)和pCMV2/LMP-大鼠-正向(約206個節(jié)/孔)轉染培養(yǎng)物獲得類似結果。相反，負對照pCMV2/LMP-大鼠-反向產(chǎn)生(約2個節(jié)/孔)，而未處理平板中發(fā)現(xiàn)約4個節(jié)/孔。這些數(shù)據(jù)證明在此模型系統(tǒng)中人LMP-1 cDNA至少和大鼠LMP-1 cDNA一樣誘導骨。此實驗的效果小于GC刺激所觀察到的；但某些效果可以相比。
實施例28LMP誘導可溶骨誘導因子的分泌如實施例24所述，在大鼠顱頂造骨細胞培養(yǎng)物中過度表達RLMP-1或HLMP-1s導致節(jié)形成顯著高于負對照中所觀察到的。為研究LIM礦化蛋白作用機制，在不同時間點收集條件培養(yǎng)基，濃縮到10X，無菌過濾，在含新鮮血清的培養(yǎng)基中稀釋到其原始濃度，應用于未轉染細胞4天。
條件培養(yǎng)基在第4天從RLMP-1或HLMP-1s轉染的細胞中收集，它誘導節(jié)形成的有效性幾乎與轉染細胞中直接過量表達RLMP-1一樣。來自轉染反向RLMP-1或HLMP-1的細胞的條件培養(yǎng)基對節(jié)形成沒有明顯效果。第4天之前從LMP-1轉染培養(yǎng)物中收集的條件培養(yǎng)基也不誘導節(jié)形成。這些數(shù)據(jù)表明LMP表達引起可溶因子的合成和/或分泌，可溶因子不以有效量出現(xiàn)在培養(yǎng)基中，直到轉染后4天。
由于過度表達rLMP-1導致骨誘導因子分泌到培養(yǎng)集中，蛋白質印跡分析用于確定LMP-1蛋白是否存在于培養(yǎng)集中。RLMP-1蛋白的存在用特異于LMP-1(QDPDEE)的抗體評估并通過常規(guī)方法檢測。LMP-1蛋白僅在培養(yǎng)的細胞層發(fā)現(xiàn)且培養(yǎng)基中沒有檢測到。
完成骨誘導可溶因子的部分純化通過標準25％和100％硫酸銨切，接著用DE-52陰離子交換分批層析(100mM或500mM NACl)。所有活性在高硫酸銨、高NaCl部分觀察到。這種局部化與單個因子限制培養(yǎng)基的可能性一致。
實施例29基因治療低劑量腺病毒調節(jié)的腰脊柱融合此研究確定腺病毒傳遞LMP-1 cDNA(SEQ.ID.NO2)的最佳劑量，用于促進正常即免疫感受態(tài)兔中的脊柱融合。
復制-缺陷的人重組腺病毒用LMP-1 cDNA(SEQ.ID.NO2)構建，由CMV啟動自驅動，使用Adeno-QuestTM試劑盒(Quantum Biotechnologies，Inc.，Montreal)。商業(yè)購買(Quantum Biotechnologies，Inc.，Montreal)的重組腺病毒包含β-半乳糖苷酶基因，用作對照。
最初，進行體外劑量反應實驗以確定腺病毒-傳遞LMP-1(”AdV-LMP-1”)的最佳濃度以誘導大鼠顱頂造骨細胞培養(yǎng)物中的骨分化，用0.025、0.25、2.5或25噬斑形成單位(pfu)病毒每細胞的感染復數(shù)(”MOI”)轉導60分鐘。正對照培養(yǎng)物通過7天暴露于109M糖皮質激素(”GC”)分化。負對照培養(yǎng)物不處理。在第14天，馮克普氏染色培養(yǎng)物后計算礦化骨節(jié)數(shù)量，分泌到培養(yǎng)基的骨鈣蛋白水平(pmol/mL)通過放射免疫測定測量(平均數(shù)±SEM)。
此實驗結果示于表1。在未處理的負對照培養(yǎng)物中幾乎沒有自發(fā)節(jié)形成。數(shù)據(jù)顯示相當于0.25pfu/細胞的MOI對于誘導骨節(jié)最有效，達到的水平可與正對照(GC)相比。更低和更高劑量的腺病毒效果更小。
表1
隨后進行體內實驗以確定最佳體外劑量是否能促進骨骼成熟的新西蘭白兔中橫突間加工(intertransverse process)脊柱融合。麻醉9只兔，3cc骨髓用18規(guī)格針經(jīng)髁間凹口從末梢腿節(jié)吸出。然后分離淡黃色外層，用Adv-LMP-1轉導10分鐘，細胞返回到手術室用于移植。單一水平的后外側腰脊柱關節(jié)固定術通過去橫皮質過程和插入載體(兔早衰骨基質或膠原海綿)進行，載體含800到1500萬自身有核淡黃色包被細胞，細胞用Adv-LMP-1(MOI＝0.4)或AdV-BGal(MOI＝0.4)轉導。5周后兔被施以安樂死，脊柱融合通過手工觸診、簡單的x光、CT掃描和不脫鈣組織學評估。
在所有9只兔中，接受Adv-LMP-1的脊柱融合位置誘導固體、連續(xù)的脊柱融合塊。相反，接受AdV-Bgal或更低劑量Adv-LMP-1(MOI＝0.4)的位置產(chǎn)生很少或沒有骨，導致脊柱融合速度可與單獨載體相比(＜40％)。這些結果與手工觸診、CT掃描和組織學評估一致。然而，簡單的放射顯影有時過高估計骨存在的量，特別在對照位置。兩種測試載體物質的LMP-1 cDNA傳遞和骨誘導都成功。沒有證據(jù)表明對腺病毒載體的全身或局部免疫反應。
這些數(shù)據(jù)證明在以前確認的兔脊柱融合模型中的恒定骨誘導，這是很挑戰(zhàn)性的。此外，在外科手術體外基因轉導時用自身骨髓細胞的操作(10分鐘)比其它方法更具臨床可行性，其它方法需要過夜轉導或細胞擴增幾周培養(yǎng)。另外，最有效的重組腺病毒劑量(MOI＝0.25)顯著低于其它基因治療應用(MOI 40-500)報導的劑量。我們認為這是由于LMP-1是胞內信號分子且可能有強大的的信號擴大級聯(lián)。此外，在細胞培養(yǎng)中誘導骨的相同濃度Adv-LMP-1在體內有效，此發(fā)現(xiàn)也令人驚訝，因為從細胞培養(yǎng)轉移到動物實驗時，通常需要增加其它生長因子劑量。結合到一起，這些觀察說明用腺病毒傳遞LMP-1 cDNA的局部基因治療是可行的且所需低劑量可能最小化免疫反應對腺病毒載體的負效果。
實施例30使用外周靜脈血有核細胞(淡黃色包被)以通過LMP-1 cDNA基因治療產(chǎn)生骨我們在4只兔中如上進行脊柱融合手術(實施例29)，除了轉導細胞是來自靜脈血的淡黃色包被，而不是骨髓。這些細胞用腺-LMP或pHIS-LMP質粒轉染，具有的成功結果與用骨髓細胞時相同。發(fā)現(xiàn)普通靜脈血細胞用于基因傳遞使基因治療在臨床上更可行，因為它避免了全身麻醉下痛苦的骨髓收集且產(chǎn)生2倍細胞每mL起始物質。
實施例31分離人LMP-1剪接變體內含子/外顯子mRNA轉錄剪接變體在信號轉導和細胞/組織發(fā)育中是相對普通的調節(jié)機制。不同基因的剪接變體顯示改變蛋白質-蛋白質、蛋白質-DNA、蛋白質-RNA和蛋白質-底物相互作用。剪接變體也能控制基因表達的組織特異性，使不同形式(以及因而的功能)可在多種組織中表達。剪接變體是細胞中普遍的調節(jié)現(xiàn)象?？赡躄MP剪接變體能在其它組織中產(chǎn)生效果，如神經(jīng)再生、肌肉再生或其它組織的發(fā)育。
為篩選人心臟cDNA文庫中HLMP-1序列的剪接變體，制備一對PCR引物對應于SEQ.ID NO22部分。正向PCR引物用標準技術合成，對應于SEQ.ID NO22的核苷酸35-54。它具有下列序列5’GAGCCGGCATCATGGATTCC 3’(SEQ.ID NO35)反向PCR引物是SEQ.ID NO22中核苷酸820-839的反向互補，具有下列序列5’GCTGCCTGCACAATGGAGGT 3’(SEQ.ID NO36)正向和反向PCR引物用于通過標準技術篩選人心臟cDNA(ClonTech，貨號7404-1)中類似HLMP-1的序列，使用循環(huán)操作94℃30秒，64℃30秒和72℃1分鐘，重復30次，接著72℃孵育10分鐘。cDNA序列擴增用膠純化并提交Emory DNA序列核心設備以測序。克隆用標準技術測序，序列用PCGENE(intelligenetics；程序SEQUIN和NALIGN)檢測以確定與SEQ.ID NO22的同源性。與SEQ.ID NO22相比，具另外剪接位置的兩種同源核苷酸序列隨后用Intelligenetic的程序TRANSL翻譯成它們各自的蛋白質產(chǎn)物。
這兩種新的人cDNA序列之一(SEQ.ID NO37)包括1456bpCGACGCAGAG CAGCGCCCTG GCCGGGCCAA GCAGGAGCCG GCATCATGGA TTCCTTCAAG60GTAGTGCTGG AGGGGCCAGC ACCTTGGGGC TTCCGGCTGC AAGGGGGCAA GGACTTCAAT120GTGCCCCTCT CCATTTCCCG GCTCACTCCT GGGGGCAAAG CGGCGCAGGC CGGAGTGGCC180GTGGGTGACT GGGTGCTGAG CATCGATGGC GAGAATGCGG GTAGCCTCAC ACACATCGAA240GCTCAGAACA AGATCCGGGC CTGCGGGGAG CGCCTCAGCC TGGGCCTCAG CAGGGCCCAG300X XCCGGTTCAGA GCAAACCGCA GAAGGTGCAG ACCCCTGACA AACAGCCGCT CCGACCGCTG 360GTCCCAGATG CCAGCAAGCA GCGG CTGATG GAGAACACAG A GGACTGGCG GCCGCGGCCG 420GGGACAGGCC AGTCGCGTTC CTTC CGCATC CTTGCCCACC T CACAGGCAC CGAGTTCATG 480CAAGACCCGG ATGAGGAGCA CCTG AAGAAA TCAAGCCAGG T GCCCAGGAC AGAAGCCCCA 540GCCCCAGCCT CATCTACACC CCAG GAGCCC TGGCCTGGCC C TACCGCCCC CAGCCCTACC 600AGCCGCCCGC CCTGGGCTGT GGAC CCTGCG TTTGCCGAGC G CTATGCCCC GGACAAAACG 660AGCACAGTGC TGACCCGGCA CAGC CAGCCG GCCACGCCCA C GCCGCTGCA GAGCCGCACC 720TCCATTGTGC AGGCAGCTGC CGGA GGGGTG CCAGGAGGGG G CAGCAACAA CGGCAAGACT 780CCCGTGTGTC ACCAGTGCCA CAAG GTCATC CGGGGCCGCT A CCTGGTGGC GTTGGGCCAC 840GCGTACCACC CGGAGGAGTT TGTG TGTAGC CAGTGTGGGA A GGTCCTGGA AGAGGGTGGC 900TTCTTTGAGG AGAAGGGCGC CATC TTCTGC CCACCATGCT A TGACGTGCG CTATGCACCC 960AGCTGTGCCA AGTGCAAGAA GAAG ATTACA GGCGAGATCA T GCACGCCCT GAAGATGACC 1020TGGCACGTGC ACTGCTTTAC CTGT GCTGCC TGCAAGACGC C CATCCGGAA CAGGGCCTTC 1080TACATGGAGG AGGGCGTGCC CTAT TGCGAG CGAGACTATG A GAAGATGTT TGGCACGAAA 1140TGCCATGGCT GTGACTTCAA GATC GACGCT GGGGACCGCT T CCTGGAGGC CCTGGGCTTC 1200AGCTGGCATG ACACCTGCTT CGTC TGTGCG ATATGTCAGA T CAACCTGGA AGGAAAGACC 1260TTCTACTCCA AGAAGGACAG GCCT CTCTGC AAGAGCCATG C CTTCTCTCA TGTGTGAGCC 1320CCTTCTGCCC ACAGCTGCCG CGGT GGCCCC TAGCCTGAGG G GCCTGGAGT CGTGGCCCTG 1380CATTTCTGGG TAGGGCTGGC AATG GTTGCC TTAACCCTGG C TCCTGGCCC GAGCCTGGGC 1440TCCCGGGCCC TGCCCA1456缺失119bp片段和加入17bp片段(下劃線)(在X間)引起可讀框移位，產(chǎn)生截短基因產(chǎn)物，產(chǎn)物具有下列導出的氨基酸序列(SEQ.ID NO38)Met Asp Ser Phe Lys Val Val Leu Glu Gly Pro Ala Pro Trp Gly Phe1 5 10 15Arg Leu Gln Gly Gly Lys Asp Phe Asn Val Pro Leu Ser Ile Ser Arg20 25 30
Leu Thr Pro Gly Gly Lys Ala Ala Gln Ala Gly Val Ala Val Gly Asp35 40 45Trp Val Leu Ser Ile Asp Gly Glu Asn Ala Gly Ser Leu Thr His Ile50 55 60Glu Ala Gln Asn Lys Ile Arg Ala Cys Gly Glu Arg Leu Ser Leu Gly65 70 75 80Leu Ser Arg Ala Gln Pro Val Gln Asn Lys Pro Gln LysVal Gln Thr85 90 95Pro Asp LysGln Pro Leu Arg Pro Leu Val Pro Asp Ala Ser Lys Gln100 105 110Arg Leu Met Glu Asn Thr Glu Asp Trp Arg Pro Arg Pro Gly Thr Gly115 120 125Gln Ser Arg Ser Phe Arg Ile Leu Ala His Leu Thr Gly Thr Glu Phe130 135 140Met Gln Asp Pro Asp Glu Glu His Leu Lys Lys Ser Ser Gln Val Pro145 150 155 160Arg Thr Glu Ala Pro Ala Pro Ala Ser Ser Thr Pro Gln Glu Pro Trp165 170 175Pro Gly Pro Thr Ala Pro Ser Pro Thr Ser Arg Pro Pro Trp Ala Val180 185 190Asp Pro Ala Phe Ala Glu Arg Tyr Ala Pro Asp Lys Thr Ser Thr Val195 200 205Leu Thr Arg His Ser Gln Pro Ala Thr Pro Thr Pro Leu Gln Ser Arg210 215 220Thr Ser Ile Val Gln Ala Ala Ala Gly Gly Val Pro Gly Gly Gly Ser225 230 235 240Asn Asn Gly Lys Thr Pro Val Cys His Gln Cys His Gln Val Ile Arg245 250 255Ala Arg Tyr Leu Val Ala Leu Gly His Ala Tyr His Pro Glu Glu Phe260 265 270Val Cys Ser Gln Cys Gly Lys Val Leu Glu Glu Gly Gly Phe Phe Glu275 280 285Glu Lys Gly Ala Ile Phe Cys Pro Pro Cys Tyr Asp Val Arg Tyr Ala290 295 300Pro Ser Cys Ala Lys Cys Lys Lys Lys Ile Thr Gly Glu Ile Met His305 310 315 320Ala Leu Lys Met Thr Trp His Val Leu Cys Phe Thr Cys Ala Ala Cys325 330 335Lys Thr Pro Ile Arg Asn Arg Ala Phe Tyr Met Glu Glu Gly Val Pro340 345 350Tyr Cys Glu Arg Asp Tyr Glu Lys Met Phe Gly Thr Lys Cys Gln Trp355 360 365Cys Asp Phe Lys Ile Asp Ala Gly Asp Arg Phe Leu Glu Ala Leu Gly370 375 380
Phe Ser Trp His Asp Thr Cys Phe Val Cys Ala Ile Cys Gln Ile Asn385 390 395 400Leu Glu Gly Lys Thr Phe Tyr Ser Lys Lys Asp Arg Pro Leu Cys Lys405 410 415Ser His Ala Phe Ser His Val420此423個氨基酸的蛋白質證明與SEQ.ID NO10所示蛋白質100％同源，除了突出區(qū)域(氨基酸94-99)中的序列，這是由于上述核苷酸變化。
第二個新的人心臟cDNA序列(SEQ.ID NO39)包括1575bpCGACGCAGAG CAGCGCCCTG GCC GGGCCAA GCAGGAGCCG GCATCATGGA TTCCTTCAAG 60GTAGTGCTGG AGGGGCCAGC ACC TTGGGGC TTCCGGCTGC AAGGGGGCAA GGACTTCAAT 120GTGCCCCTCT CCATTTCCCG GCT CACTCCT GGGGGCAAAG CGGCGCAGGC CGGAGTGGCC 180GTGGGTGACT GGGTGCTGAG CAT CGATGGC GAGAATGCGG GTAGCCTCAC ACACATCGAA 240GCTCAGAACA AGATCCGGGC CTG CGGGGAG CGCCTCAGCC TGGGCCTCAG CAGGGCCCAG 300CCGGTTCAGA GCAAACCGCA GAA GGCCTCC GCCCCCGCCG CGGACCCTCC GCGGTACACC 360TTTGCACCCA GCGTCTCCCT CAA CAAGACG GCCCGGCCCT TTGGGGCGCC CCCGCCCGCT 420GACAGCGCCC CGCAACAGAA TGGGTGCAGA CCCCTGACAAACAGCCGCTC CGACCGCTGG 480TCCCAGATGC CAGCAAGCAG CGG CTGATGG AGAACACAGA GGACTGGCGG CCGCGGCCGG 540GGACAGGCCA GTCGCGTTCC TTC CGCATCC TTGCCCACCT CACAGGCACC GAGTTCATGC 600AAGACCCGGA TGAGGAGCAC CTG AAGAAAT CAAGCCAGGT GCCCAGGACA GAAGCCCCAG 660CCCCAGCCTC ATCTACACCC CAG GAGCCCT GGCCTGGCCC TACCGCCCCC AGCCCTACCA 720GCCGCCCGCC CTGGGCTGTG GAC CCTGCGT TTGCCGAGCG CTATGCCCCG GACAAAACGA 780GCACAGTGCT GACCCGGCAC AGC CAGCCGG CCACGCCCAC GCCGCTGCAG AGCCGCACCT 840CCATTGTGCA GGCAGCTGCC GGA GGGGTGC CAGGAGGGGG CAGCAACAAC GGCAAGACTC 900CCGTGTGTCA CCAGTGCCAC AAG GTCATCC GGGGCCGCTA CCTGGTGGCG TTGGGCCACG 960CGTACCACCC GGAGGAGTTT GTG TGTAGCC AGTGTGGGAA GGTCCTGGAA GAGGGTGGCT 1020TCTTTGAGGA GAAGGGCGCC ATC TTCTGCC CACCATGCTA TGACGTGCGC TATGCACCCA 1080GCTGTGCCAA GTGCAAGAAG AAG ATTACAG GCGAGATCAT GCACGCCCTG AAGATGACCT 1140GGCACGTGCA CTGCTTTACC TGT GCTGCCT GCAAGACGCC CATCCGGAAC AGGGCCTTCT 1200ACATGGAGGA GGGCGTGCCC TAT TGCGAGC GAGACTATGA GAAGATGTTT GGCACGAAAT 1260GCCATGGCTG TGACTTCAAG ATC GACGCTG GGGACCGCTT CCTGGAGGCC CTGGGCTTCA 1320GCTGGCATGA CACCTGCTTC GTC TGTGCGA TATGTCAGAT CAACCTGGAA GGAAAGACCT 1380TCTACTCCAA GAAGGACAGG CCT CTCTGCA AGAGCCATGC CTTCTCTCAT GTGTGAGCCC 1440CTTCTGCCCA CAGCTGCCGC GGT GGCCCCT AGCCTGAGGG GCCTGGAGTC GTGGCCCTGC 1500ATTTCTGGGT AGGGCTGGCA ATG GTTGCCT TAACCCTGGC TCCTGGCCCG AGCCTGGGCT 1560CCCGGGCCCT GCCCA 1575加入17bp片段(粗體、斜體和下劃線)引起可讀框移位，在位置565-567(下劃線)產(chǎn)生早期翻譯終止密碼子。
所得氨基酸序列(SEQ.ID NO40)由153個氨基酸組成
Met Asp Ser Phe Lys Val Val Leu Glu Gly Pro Ala Pro Trp Gly Phe1 5 10 15Arg Leu Gln Gly Gly Lys Asp Phe Asn Val Pro Leu Ser Ile Ser Arg20 25 30Leu Thr Pro Gly Gly Lys Ala Ala Gln Ala Gly Val Ala Val Gly Asp35 40 45Trp Val Leu Ser Ile Asp Gly Glu Asn Ala Gly Ser Leu Thr His Ile50 55 60Glu Ala Gln Asn Lys Ile Arg Ala Cys Gly Glu Arg Leu Ser Leu Gly65 70 75 80Leu Ser Arg Ala Gln Pro Val Gln Ser Lys Pro Gln LysAla Ser Ala85 90 95Pro Ala Ala Asp Pro Pro Arg Tyr Thr Phe Ala Pro Ser Val Ser Leu100 105 110Asn Lys Thr Ala Arg Pro Phe Gly Ala Pro Pro Pro Ala Asp Ser Ala115 120 125Pro Gln Gln Asn Gly Cys Arg Pro Leu Thr Asn Ser Arg Ser Asp Arg130 135 140Trp Ser Gln Met Pro Ala Ser Ser Gly145 150此蛋白質證明與SEQ.ID NO10 100％同源，直到氨基酸94，其中加入核苷酸序列所示的17bp片段導致移框。在氨基酸94-153，蛋白質不與SEQ.ID NO10同源。由于核苷酸序列所示的早期終止密碼子，SEQ.ID NO10中氨基酸154-457不存在。
實施例32基因組HLMP-1核苷酸序列專利申請者鑒定了編碼HLMP-1的基因組DNA序列，包括與HLMP-1表達相關的推定調節(jié)元件。完整基因組序列示于SEQ.ID NO41。此序列獲得自AC023788(克隆RP11-564G9)，基因組測序中心，Washington University School of Medicine，St.Louis，MO。
HLMP-1的推定啟動子區(qū)域橫跨SEQ.ID NO41的核苷酸2,660-8,733。此區(qū)域包括至少10個潛在糖皮質激素反應元件(”GREs”)(核苷酸6148-6153、6226-6231、6247-6252、6336-6341、6510-6515、6552-6557、6727-6732、6752-6757、7738-7743和8255-8260)、12個與Mothers同源的潛在Sma-2，相對果蠅decapentaplegic(”SMAD”)結合元件位置(核苷酸3569-3575、4552-4558、4582-4588、5226-5232、6228-6234、6649-6655、6725-6731、6930-6939、7379-7384、7738-7742、8073-8079和8378-8384)以及3個TATA盒(核苷酸5910-5913、6932-6935和7380-7383)。3個TATA盒、所有GREs和8個SMAD結合元件(”SBEs”)聚集在SEQ.ID NO41中跨核苷酸5,841-8,733的區(qū)域。這些調節(jié)元件可用于例如調節(jié)外源核苷酸序列表達，序列編碼的蛋白質參與骨形成過程。這允許全身施用涉及骨形成和修復的治療因子或基因以及與組織分化和發(fā)育相關的因子或基因。
除了推定調節(jié)元件外，鑒定了13個外顯子，對應于編碼HLMP-1的核苷酸序列。這些外顯子橫跨下列SEQ.ID NO41中的核苷酸外顯子1 8733-8767外顯子2 9790-9895外顯子3 13635-13787外顯子4 13877-13907外顯子5 14387-14502外顯子6 15161-15297外顯子7 15401-15437外顯子8 16483-16545外顯子9 16689-16923外顯子1018068-18248外顯子1122117-22240外顯子1222323-22440外顯子1322575-22911在HLMP-2中有另一個外顯子(外顯子5A)，它跨核苷酸14887-14904。
實施例33在椎間盤細胞中表達HLMP-1LIM礦化蛋白-1(LMP-1)是胞內蛋白，能指導骨和非骨組織中的細胞分化。此例子證明在椎間盤細胞中表達人LMP-1(”HLMP-1”)增加蛋白聚糖合成且促進更多軟骨細胞表型。此外，HLMP-1對細胞基因表達的效果通過測量聚集蛋白聚糖和BMP-2基因表達來證明。腰椎間盤細胞通過溫和酶消化從Sprague-Darley大鼠中收集并單層培養(yǎng)于添加10％FBS的DMEM/F12中。這些細胞隨后以約200,000個細胞每孔分到6孔板中，培養(yǎng)約6天直到細胞達到約300,000個細胞每孔。培養(yǎng)基變成1％FBS DMEM/F12且這被認為是第0天。
上述復制缺陷5型腺病毒包括HLMP-1 cDNA，可操作連接于巨細胞病毒(”CMV”)啟動子，例如描述于美國專利號6,300,127。負對照腺病毒相同，除了HLMP-1 cDNA被LacZ cDNA取代。對于正對照，未感染的培養(yǎng)物在連續(xù)存在100納克/毫升濃度的BMP-2時培養(yǎng)。
在第0天，培養(yǎng)物在300微升培養(yǎng)基中37℃感染腺病毒30分鐘，培養(yǎng)基含1％FBS。用熒光激活細胞分選儀(”FACS”)分析腺病毒處理的細胞以確定表達轉基因的最佳劑量范圍，腺病毒含綠色熒光蛋白(”GFP”)基因(”AdGFP”)。用含人LMP-1cDNA(AdHLMP-1)(MOIs為0、100、300、1000或3000)的腺病毒或含LacZ標記基因(AdLacZ MOI為1000)(負對照)的腺病毒處理細胞。培養(yǎng)基在感染后第3天和第6天改變。
蛋白聚糖生成通過測量培養(yǎng)基中硫酸化粘多糖(sGAG)的存在來估計，使用二甲基-亞甲藍(”DMMB”)量熱測定。
為定量聚集蛋白聚糖和BMP-2 mRNA，細胞在第6天收集且通過Trizol技術提取RNA。mRNA用反轉錄酶轉變成cDNA并用于實時PCR，實時PCR可確定聚集蛋白聚糖和BMP-2信使的相對豐度。設計實時引物并在以前實驗中測試聚集蛋白聚糖和BMP-2。使用Cybergreen技術。標準化曲線用于定量mRNA豐度。
對于轉染細胞，細胞形態(tài)用光學顯微鏡記錄。細胞用AdHLMP-1(MOI 1000)處理變成圓形，而不是用AdLacZ處理。AdLacZ感染不顯著改變細胞形態(tài)。
FACS分析以1000 MOI感染ADGFP的大鼠盤細胞顯示最高百分比的感染細胞(45％)sGAG生成和AdHLMP-1 MOI間的劑量依賴增加。這些數(shù)據(jù)見于圖1，顯示在大鼠盤細胞單層培養(yǎng)中以不同MOIs過量表達HLMP-1后的sGAG生成。結果根據(jù)第0天未處理細胞來標準化。誤差條(error bar)代表平均數(shù)的標準誤差。如圖1所示，第3天觀察到的sGAG生成相對較少，說明轉染和細胞生成GAG間有延遲時間。用AdLacZ處理不顯著改變sGAG生成。也如圖1所示，AdHLMP-1最佳劑量是1000MOI，使sGAG生成在第6天相對未處理對照提高260％。更高或更低劑量的AdHLMP-1導致反應減小。
AdHLMP-1劑量(MOI)對sGAG生成的效果進一步闡明于圖2。圖2是一個圖表，顯示用AdHLMP-1以不同MOIs處理后第6天的大鼠盤sGAG水平。如圖1所示，AdHLMP-1最佳劑量是1000MOI。
聚集蛋白聚糖和BMP-2 mRNA生成可見于圖3。此圖證明過量表達HLMP-1后聚集蛋白聚糖和BMP-2 mRNA增加。對從大鼠盤細胞第6天提取的mRNA進行實時PCR，比較未處理(”NT”)細胞和用AdHLMP-1以250MOI處理的細胞。圖3的數(shù)據(jù)代表相對未處理樣品的百分比增加。如圖3所示，注意到AdHLMP-1處理后聚集蛋白聚糖和BMP-2 mRNA顯著增加。BMP-2表達提高說明BMP-2是下游基因，調節(jié)蛋白聚糖合成的HLMP-1刺激。
這些數(shù)據(jù)證明用AdHLMP-1轉染有效增加椎間盤細胞的蛋白聚糖合成。病毒劑量產(chǎn)生最高的轉基因表達(MOI 1000)，也導致最高的sGAG誘導，表明HLMP-1表達和sGAG生成間有關聯(lián)。這些數(shù)據(jù)說明HLMP-1基因治療是增加椎間盤細胞中蛋白聚糖合成的方法，HLMP-1是治療盤疾病的試劑。
圖4A是一個圖表，顯示用Ad-hLMP-1以不同MOIs感染12小時后HLMP-1 mRNA的表達。在圖4A中，外源LMP-1表達用不同劑量(MOI)的Ad-hLMP-1病毒誘導并用實時PCR定量。數(shù)據(jù)根據(jù)來自Ad-LMP-1 MOI 5的HLMP-1 mRNA水平標準化，用于比較目的。在負對照組即未處理(”NT”)或AdLacZ處理(”LacZ”)中沒有檢測到HLMP-1。HLMP-1 mRNA水平以劑量依賴方式用MOI 25和50達到約8倍的平臺(pleateau)。
圖4B是一個圖表，顯示來自感染后3到6天的培養(yǎng)基中sGAG的生成。DMMB測定用于定量感染后3到6天間的總sGAG生成。圖4B中的數(shù)據(jù)根據(jù)對照(即未處理)組標準化。如圖4B可見，sGAG的劑量依賴增加，用MOI 25和50達到約為對照3倍的峰值。負對照AdLacZ在MOI 25時不導致sGAG增加。在圖4B中，各結果表示為平均數(shù)和3個樣品的SD。
圖5是一個圖表，顯示sGAG生成的時程變化。如圖5可見，在第3天，MOI 25和50的sGAG生成顯著增加。在第6天，sGAG生成的劑量依賴對應于AdLMP-1上升。MOI 25達到sGAG的平臺水平增加。也如圖5可見，用AdLacZ處理(”LacZ”)不顯著改變sGAG生成。各結果表示為平均數(shù)和6到9個樣品的SD。在圖5中，”**”表示相對未處理對照P值＜0.01的數(shù)據(jù)點。
圖6A和6B是圖表，分別顯示在用于聚集蛋白聚糖和BMP-2的大鼠纖維環(huán)細胞中對LMP-1過量表達的基因反應。用Ad-LMP-1(”LMP-1”)以MOI 25感染后3天進行定量實時PCR。如圖6A和6B可見，用Ad-LMP-1感染后，聚集蛋白聚糖和BMP-2的基因表達相對未處理對照(”NT”)顯著增加。此外，與未處理對照相比，用AdLacZ處理(”LacZ”)以MOI 25處理不顯著改變聚集蛋白聚糖或BMP-2的基因表達。在圖6A和6B中，各結果表示為平均數(shù)和6個樣品的SD。在圖6A和6B中，”**”表示P值＜0.01的數(shù)據(jù)點。
圖7顯示用AdHLMP-1以MOI 25感染后，大鼠纖維環(huán)細胞中HLMP-1 mRNA水平的時程。數(shù)據(jù)表示為用18S和過量表達LMP-1引物的復制系數(shù)標準化后，相對MOI5 AdHLMP-1的增加倍數(shù)。也如圖7可見，HLMP-1 mRNA早在感染后12小時顯著上調。此外，第1和第3天間表達水平顯著增加。圖7中的各結果表示為平均數(shù)和6個樣品的SD。
圖8是一個圖表，顯示對應于HLMP-1過量表達的BMPs和聚集蛋白聚糖mRNA水平變化。BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP7和聚集蛋白聚糖mRNA水平用實時PCR在Ad-hLMP-1 MOI 25感染后的不同時間點確定。如圖8可見，BMP-2 mRNA早在AdLMP-1感染后12小時顯著上調。各結果表示為平均數(shù)和6個樣品的SD。在圖8中，”**”表示AdLMP-1感染相對未處理對照P值＜0.01的數(shù)據(jù)點。
圖9顯示對應于HLMP-1表達的sGAG生成增加的時程。對于圖9中的數(shù)據(jù)，大鼠環(huán)細胞用Ad-hLMP-1以MOI 25感染。培養(yǎng)基在感染后每3天改變并用DMMB測定分析sGAG。此數(shù)據(jù)顯示sGAG生成在第6天達到平臺且在第9天大致維持。
圖10是一個圖表，顯示頭蛋白(BMP拮抗物)對LMP-1調節(jié)的sGAG生成增加的效果。如圖10可見，用Ad-LMP-1以MOI 25感染大鼠環(huán)細胞導致第3和第6天間的sGAG生成增加3倍。此增加通過加入3200ng/ml和800ng/ml濃度的頭蛋白(BMP拮抗物)阻礙。然而如圖10所示，頭蛋白不顯著改變未感染細胞中的sGAG生成。也如圖10可見，加入BMP-2后，用100ng/ml rhBMP-2刺激導致第3和第6天間的sGAG生成增加3倍。800ng/ml濃度的頭蛋白也阻礙此增加。
圖11是一個圖表，顯示單層培養(yǎng)6天后LMP-1對培養(yǎng)基中sGAG的效果。數(shù)據(jù)點代表相對未處理細胞的增加倍數(shù)。如圖11所示，當有CMV啟動子的LMP-1通過AAV載體傳遞時，也有效刺激單層大鼠盤細胞的粘多糖合成。
表2用于SYBR Green的RT-PCR&實時PCR的引物序列
表2中的GAPDH表示磷酸甘油醛脫氫酶。
表3用于TaqMan的實時PCR的引物和探針序列
TaqMan核糖體RNA對照試劑(Part號4308329，Applied Biosystems，F(xiàn)osterCity，CA，U.S.A.)用于18S核糖體RNA(rRNA)基因的正向引物、反向引物和探針。
所有引用的出版物和專利全部納入本文供參考。
上述說明書教授了本發(fā)明的原理，提供例子用于闡述目的，本領域技術人員通過讀此說明書理解可對形式和細節(jié)作出多種改變而不離開發(fā)明的真實范圍。
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<141>
<150>US 60/331,321<151>2001-11-14<160>42<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>457<212>PRT<213>大鼠(Rattus norvegicus)<400>1Met Asp Ser Phe Lys Val Val Leu Glu Gly Pro Ala Pro Trp Gly Phe1 5 10 15Arg Leu Gln Gly Gly Lys Asp Phe Asn Val Pro Leu Ser Ile Ser Arg20 25 30Leu Thr Pro Gly Gly Lys Ala Ala Gln Ala Gly Val Ala Val Gly Asp35 40 45Trp Val Leu Ser Ile Asp Gly Glu Asn Ala Gly Ser Leu Thr His Ile50 55 60Glu Ala Gln Asn Lys Ile Arg Ala Cys Gly Glu Arg Leu Ser Leu Gly65 70 75 80Leu Ser Arg Ala Gln Pro Ala Gln Ser Lys Pro Gln Lys Ala Leu Thr85 90 95Pro Pro Ala Asp Pro Pro Arg Tyr Thr Phe Ala Pro Ser Ala Ser Leu100 105 110Asn Lys Thr Ala Arg Pro Phe Gly Ala Pro Pro Pro Thr Asp Ser Ala115 120 125Leu Ser Gln Asn Gly Gln Leu Leu Arg Gln Leu Val Pro Asp Ala Ser130 135 140Lys Gln Arg Leu Met Glu Asn Thr Glu Asp Trp Arg Pro Arg Pro Gly145 150 155 160Thr Gly Gln Ser Arg Ser Phe Arg Ile Leu Ala His Leu Thr Gly Thr165 170 175Glu Phe Met Gln Asp Pro Asp Glu Glu Phe Met Lys Lys Ser Ser Gln
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cgtctgcaag ggggcaagga cttcaacgtg cccctctcca tctctcggct cactcctgga 180ggcaaggccg cacaggccgg tgtggccgtg ggagactggg tactgagtat cgacggtgag 240aacgccggaa gcctcacaca cattgaagcc cagaacaaga tccgtgcctg tggggagcgc 300ctcagcctgg gtcttagcag agcccagcct gctcagagca aaccacagaa ggccctgacc 360cctcccgccg accccccgag gtacactttt gcaccaagcg cctccctcaa caagacggcc 420cggcccttcg gggcaccccc acctactgac agcgccctgt cgcagaatgg acagctgctc 480agacagctgg tccctgatgc cagcaagcag cggctgatgg agaatactga agactggcgc 540ccgcggccag ggacaggcca gtcccgttcc ttccgcatcc ttgctcacct cacgggcaca 600gagttcatgc aagacccgga tgaggaattc atgaagaagt caagccaggt gcccaggaca 660gaagccccag ccccagcctc aaccataccc caggaatcct ggcctggccc caccaccccc 720agccccacca gccgcccacc ctgggccgta gatcctgcat ttgctgagcg ctatgcccca 780gacaaaacca gcacagtgct gacccgacac agccagccag ccacacctac gcctctgcag 840aaccgcacct ccatagttca ggctgcagct ggagggggca caggaggagg cagcaacaat 900ggcaagacgc ctgtatgcca ccagtgccac aagatcatcc gcggccgata cctggtagca 960ctgggccacg cgtaccatcc tgaggaattt gtgtgcagcc agtgtgggaa ggtcctggaa 1020gagggtggct tcttcgagga gaagggagct atcttttgcc cctcctgcta tgatgtgcgc 1080tatgcaccca gctgtgccaa atgcaagaag aagatcactg gagagatcat gcatgcgctg 1140aagatgacct ggcatgttcc ctgcttcacc tgtgcagcct gcaaaacccc tatccgcaac 1200agggctttct acatggagga gggggctccc tactgcgagc gagattacga gaagatgttt 1260ggcacaaagt gtcgcggctg tgacttcaag atcgatgccg gggaccgttt cctggaagcc 1320ctgggtttca gctggcatga tacgtgtttt gtttgcgcaa tatgtcaaat caacttggaa 1380ggaaagacct tctactccaa gaaggacaag cccctgtgca agagccatgc cttttcccac 1440gtatgagcac ctcctcacac tactgccacc ctactctgcc agaagggtga taaaatgaga 1500gagctctctc tccctcgacc tttctgggtg gggctggcag ccattgtcct agccttggct 1560cctggccaga tcctggggct ccctcctcac agtccccttt cccacacttc ctccaccacc 1620accaccgtca ctcacaggtg ctagcctcct agccccagtt cactctggtg tcacaataaa 1680cctgtatgta gctgtg 1696<210>3<211>260<212>DNA<213>大鼠(Rattus norvegicus)<400>3ttctacatgg aggagggggc tccctactgc gagcgagatt acgagaagat gtttggcaca 60aagtgtcgcg gctgtgactt caagatcgat gccggggacc gtttcctgga agccctgggt 120ttcagctggc atgatacgtg ttttgtttgc gcaatatgtc aaatcaactt ggaaggaaag 180accttctact ccaagaagga caagcccctg tgcaagagcc atgccttttc ccacgtatga 240gcacctcctc acactactgc 260<210>4<211>16<212>DNA<213>MMLV<400>4aagctttttt tttttg 16<210>5<211>13<212>DNA<213>MMLV<400>5aagcttggct atg13<210>6<211>223
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<210>9<211>1644<212>DNA<213>智人(Homo sapies)<400>9atggattcct tcaaggtagt gctggagggg ccagcacctt ggggcttccg gctgcaaggg 60ggcaaggact tcaatgtgcc cctctccatt tcccggctca ctcctggggg caaagcggcg 120caggccggag tggccgtggg tgactgggtg ctgagcatcg atggcgagaa tgcgggtagc 180ctcacacaca tcgaagctca gaacaagatc cgggcctgcg gggagcgcct cagcctgggc 240ctcagcaggg cccagccggt tcagagcaaa ccgcagaagg cctccgcccc cgccgcggac 300cctccgcggt acacctttgc acccagcgtc tccctcaaca agacggcccg gccctttggg 360gcgcccccgc ccgctgacag cgccccgcaa cagaatggac agccgctccg accgctggtc 420ccagatgcca gcaagcagcg gctgatggag aacacagagg actggcggcc gcggccgggg 480acaggccagt cgcgttcctt ccgcatcctt gcccacctca caggcaccga gttcatgcaa 540gacccggatg aggagcacct gaagaaatca agccaggtgc ccaggacaga agccccagcc 600ccagcctcat ctacacccca ggagccctgg cctggcccta ccgcccccag ccctaccagc 660cgcccgccct gggctgtgga ccctgcgttt gccgagcgcc atgccccgga caaaacgagc 720acagtgctga cccggcacag ccagccggcc acgcccacgc cgctgcagag ccgcacctcc 780attgtgcagg cagctgccgg aggggtgcca ggagggggca gcaacaacgg caagactccc 840gtgtgtcacc agtgccacaa ggtcatccgg ggccgctacc tggtggcgtt gggccacgcg 900taccacccgg aggagtttgt gtgtagccag tgtgggaagg tcctggaaga gggtggcttc 960tttgaggaga agggcgccat cttctgccca ccatgctatg acgtgcgcta tgcacccagc 1020tgtgccaagt gcaagaagaa gattacaggc gagatcatgc acgccctgaa gatgacctgg 1080cacgtgcact gctttacctg tgctgcctgc aagacgccca tccggaacag ggccttctac 1140atggaggagg gcgtgcccta ttgcgagcga gactatgaga agatgtttgg cacgaaatgc 1200catggctgtg acttcaagat cgacgctggg gaccgcttcc tggaggccct gggcttcagc 1260tggcatgaca cctgcttcgt ctgtgcgata tgtcagatca acctggaagg aaagaccttc 1320tactccaaga aggacaggcc tctctgcaag agccatgcct tctctcatgt gtgagcccct 1380tctgcccaca gctgccgcgg tggcccctag cctgaggggc ctggagtcgt ggccctgcat 1440ttctgggtag ggctggcaat ggttgcctta accctggctc ctggcccgag cctgggctcc 1500cgggcccctg cccacccacc ttatcctccc accccactcc ctccaccacc acagcacacc 1560ggtgctggcc acaccagccc cctttcacct ccagtgccac aataaacctg tacccagctg 1620aattccaaaa aatccaaaaa aaaa1644<210>10<211>457<212>PRT<213>智人(Homo sapies)<400>10Met Asp Ser Phe Lys Val Val Leu Glu Gly Pro Ala Pro Trp Gly Phe1 5 10 15Arg Leu Gln Gly Gly Lys Asp Phe Asn Val Pro Leu Ser Ile Ser Arg20 25 30Leu Thr Pro Gly Gly Lys Ala Ala Gln Ala Gly Val Ala Val Gly Asp35 40 45Trp Val Leu Ser Ile Asp Gly Glu Asn Ala Gly Ser Leu Thr His Ile50 55 60Glu Ala Gln Asn Lys Ile Arg Ala Cys Gly Glu Arg Leu Ser Leu Gly65 70 75 80Leu Ser Arg Ala Gln Pro Val Gln Ser Lys Pro Gln Lys Ala Ser Ala85 90 95Pro Ala Ala Asp Pro Pro Arg Tyr Thr Phe Ala Pro Ser Val Ser Leu100 105 110
Asn Lys Thr Ala Arg Pro Phe Gly Ala Pro Pro Pro Ala Asp Ser Ala115 120 125Pro Gln Gln Asn Gly Gln Pro Leu Arg Pro Leu Val Pro Asp Ala Ser130 135 140Lys Gln Arg Leu Met Glu Asn Thr Glu Asp Trp Arg Pro Arg Pro Gly145 150 155 160Thr Gly Gln Ser Arg Ser Phe Arg Ile Leu Ala His Leu Thr Gly Thr165 170 175Glu Phe Met Gln Asp Pro Asp Glu Glu His Leu Lys Lys Ser Ser Gln180 185 190Val Pro Arg Thr Glu Ala Pro Ala Pro Ala Ser Ser Thr Pro Gln Glu195 200 205Pro Trp Pro Gly Pro Thr Ala Pro Ser Pro Thr Ser Arg Pro Pro Trp210 215 220Ala Val Asp Pro Ala Phe Ala Glu Arg Tyr Ala Pro Asp Lys Thr Ser225 230 235 240Thr Val Leu Thr Arg His Ser Gln Pro Ala Thr Pro Thr Pro Leu Gln245 250 255Ser Arg Thr Ser Ile Val Gln Ala Ala Ala Gly Gly Val Pro Gly Gly260 265 270Gly Ser Asn Asn Gly Lys Thr Pro Val Cys His Gln Cys His Lys Val275 280 285Ile Arg Gly Arg Tyr Leu Val Ala Leu Gly His Ala Tyr His Pro Glu290 295 300Glu Phe Val Cys Ser Gln Cys Gly Lys Val Leu Glu Glu Gly Gly Phe305 310 315 320Phe Glu Glu Lys Gly Ala Ile Phe Cys Pro Pro Cys Tyr Asp Val Arg325 330 335Tyr Ala Pro Ser Cys Ala Lys Cys Lys Lys Lys Ile Thr Gly Glu Ile340 345 350Met His Ala Leu Lys Met Thr Trp His Val His Cys Phe Thr Cys Ala355 360 365Ala Cys Lys Thr Pro Ile Arg Asn Arg Ala Phe Tyr Met Glu Glu Gly370 375 380Val Pro Tyr Cys Glu Arg Asp Tyr Glu Lys Met Phe Gly Thr Lys Cys385 390 395 400His Gly Cys Asp Phe Lys Ile Asp Ala Gly Asp Arg Phe Leu Glu Ala405 410 415Leu Gly Phe Ser Trp His Asp Thr Cys Phe Val Cys Ala Ile Cys Gln420 425 430Ile Asn Leu Glu Gly Lys Thr Phe Tyr Ser Lys Lys Asp Arg Pro Leu435 440 445
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<400>17catggattcc ttcaaggtag tgc 23<210>18<211>20<212>DNA<213>智人(Homo sapies)<400>18gttttgtctg gggcagagcg 20<210>19<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述Marathon RACE反應的銜接子<400>19ctaatacgac tcactatagg gctcgagcgg ccgcccgggc aggt 44<210>20<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述Marathon RACE銜接子特異的PCR引物<400>20ccatcctaat acgactcact atagggc 27<210>21<211>765<212>DNA<213>智人(Homo sapies)<400>21ccgttgtttg taaaacgacg cagagcagcg ccctggccgg gccaagcagg agccggcatc 60atggattcct tcaaggtagt gctggagggg ccagcacctt ggggcttccg gctgcaaggg 120ggcaaggact tcaatgtgcc ctcctccatt tcccggctca cctctggggg caaggccgtg 180caggccggag tggccgtaag tgactgggtg ctgagcatcg atggcgagaa tgcgggtagc 240ctcacacaca tcgaagctca gaacaagatc cgggcctgcg gggagcgcct cagcctgggc 300ctcaacaggg cccagccggt tcagaacaaa ccgcaaaagg cctccgcccc cgccgcggac 360cctccgcggt acacctttgc accaagcgtc tccctcaaca agacggcccg gcccttgggg 420gcgcccccgc ccgctgacag cgccccgcag cagaatggac agccgctccg accgctggtc 480ccagatgcca gcaagcagcg gctgatggag aacacagagg actggcggcc gcggccgggg 540acaggccagt gccgttcctt tcgcatcctt gctcacctta caggcaccga gttcatgcaa 600gacccggatg aggagcacct gaagaaatca agccaggtgc ccaggacaga agccccagcc 660ccagcctcat ctacacccca ggagccctgg cctggcccta ccgcccccag ccctaccagc 720cgcccgccct gggctgtgga ccctgcgttt gccgagcgct atgcc 765<210>22<211>1689
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1.一種在哺乳動物非骨細胞中表達LIM礦化蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括用分離的核酸轉染細胞，所述核酸包含可操作連接于啟動子的編碼LIM礦化蛋白的核苷酸序列。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述細胞能產(chǎn)生蛋白聚糖和/或膠原，且其中LIM礦化蛋白的表達刺激細胞中蛋白聚糖和/或膠原的合成。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述分離的核酸在標準條件下和與全長SEQ.ID NO25互補的核酸分子雜交；和/或在高度嚴格條件下和與全長SEQ.ID NO26互補的核酸分子雜交。
4.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述細胞是干細胞、椎間盤細胞、髓核細胞或纖維環(huán)細胞。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述細胞體外轉染。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述細胞體內轉染。
7.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述細胞通過直接注射核酸到哺乳動物椎間盤進行體內轉染。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸在載體中。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述載體是表達載體。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述表達載體是質粒。
11.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述載體是病毒。
12.如權利要求11所述的方法，其特征在于，所述病毒是腺病毒。
13.如權利要求11所述的方法，其特征在于，所述病毒是逆轉錄病毒。
14.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述腺病毒是AdHLMP-1。
15.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述啟動子是巨細胞病毒啟動子。
16.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白聚糖是硫酸化粘多糖。
17.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述LIM礦化蛋白是RLMP、HLMP-1、HLMP-1s、HLMP-2或HLMP-3。
18.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述LIM礦化蛋白是HLMP-1。
19.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述LIM礦化蛋白的表達增加細胞中一個或多個骨形態(tài)發(fā)生蛋白的表達。
20.一種哺乳動物非骨細胞，其特征在于，所述細胞包括編碼LIM礦化蛋白的分離的核酸序列。
21.如權利要求20所述的哺乳動物非骨細胞，其特征在于，所述細胞是干細胞、纖維環(huán)細胞、髓核細胞或椎間盤細胞。
22.如權利要求20所述的哺乳動物非骨細胞，其特征在于，所述細胞是多能干細胞或間質干細胞。
23.一種治療哺乳動物椎間盤損傷或疾病的方法，其特征在于，所述方法包括將分離的核酸轉染到能產(chǎn)生蛋白聚糖和/或膠原的哺乳動物細胞；其中所述分離的核酸包含可操作連接于啟動子的編碼LIM礦化蛋白的核苷酸序列，其中所述LIM礦化蛋白的表達刺激細胞中蛋白聚糖和/或膠原合成。
24.如權利要求23所述的方法，其特征在于，所述方法反轉、防止或延遲盤變性。
25.如權利要求23所述的方法，其特征在于，所述盤疾病是變性性盤疾病、下腰痛、盤疝形成或椎管狹窄。
26.如權利要求23所述的方法，其特征在于，所述細胞是椎間盤細胞，其中所述細胞通過直接注射分離核酸到哺乳動物椎間盤進行體內轉染。
27.如權利要求23所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物細胞體外轉染，隨后移植到哺乳動物中。
28.如權利要求23所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物細胞是哺乳動物非骨細胞。
29.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物細胞是干細胞、椎間盤細胞、纖維環(huán)細胞或髓核細胞。
30.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物細胞是多能干細胞或間質干細胞。
31.如權利要求23所述的方法，其特征在于，所述分離的核酸在載體中。
32.如權利要求23所述的方法，其特征在于，所述分離的核酸在表達載體中。
33.如權利要求23所述的方法，其特征在于，所述分離的核酸在質粒中。
34.如權利要求23所述的方法，其特征在于，所述分離的核酸在病毒中。
35.如權利要求23所述的方法，其特征在于，所述分離的核酸在腺病毒中。
36.如權利要求23所述的方法，其特征在于，所述分離的核酸在逆轉錄病毒中。
37.如權利要求35所述的方法，其特征在于，所述腺病毒是AdHLMP-1。
38.如權利要求23所述的方法，其特征在于，所述啟動子是巨細胞病毒啟動子。
39.如權利要求23所述的方法，其特征在于，所述LIM礦化蛋白是RLMP、HLMP-1、HLMP-1s、HLMP-2或HLMP-3。
40.如權利要求23所述的方法，其特征在于，所述LIM礦化蛋白是HLMP-1。
41.如權利要求23所述的方法，其特征在于，所述分離的核酸在標準條件下和與全長SEQ.ID NO25互補的核酸分子雜交；和/或在高度嚴格條件下和與全長SEQ.ID NO26互補的核酸分子雜交。
42.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述細胞移植到椎間盤。
43.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述方法還包括使轉染細胞在移植到哺乳動物前與載體結合。
44.如權利要求43所述的方法，其特征在于，所述載體包括多孔基質。
45.如權利要求44所述的方法，其特征在于，所述載體包括合成聚合體或膠原基質。
46.一種椎間盤移植物，其特征在于，所述移植物包括載體物質；哺乳動物細胞集合，其中包含編碼LIM礦化蛋白的分離的核酸序列；其中所述載體物質包括生物適合物質的多孔基質，且其中所述哺乳動物細胞結合到載體中。
47.如權利要求46所述的移植物，其特征在于，所述哺乳動物細胞選自干細胞、纖維環(huán)細胞、髓核細胞、椎間盤細胞和它們的組合。
48.如權利要求46所述的移植物，其特征在于，所述哺乳動物細胞是多能干細胞、間質干細胞或它們的組合。
49.如權利要求46所述的移植物，其特征在于，所述生物適合物質包括合成聚合體或蛋白質。
50.如權利要求46所述的移植物，其特征在于，所述生物適合物質包括膠原。
全文摘要
描述了在哺乳動物非骨細胞中表達LIM礦化蛋白的方法，如干細胞或椎間盤細胞(如纖維環(huán)細胞或髓核細胞)。方法包括用分離的核酸轉染細胞，所述核酸包含可操作連接于啟動子的編碼LIM礦化蛋白的核苷酸序列。轉染可體外或體內完成，通過直接注射病毒或裸露DNA，或通過非病毒載體例如質粒。表達LIM礦化蛋白可刺激能產(chǎn)生蛋白聚糖和/或膠原的細胞中生成蛋白聚糖和/或膠原。也描述了治療盤疾病的方法，疾病與外傷或盤變性相關。
文檔編號A61K35/12GK1665391SQ02827099
公開日2005年9月7日 申請日期2002年11月14日 優(yōu)先權日2001年11月14日
發(fā)明者W·F·麥克凱, S·D·伯登, S·T·永恩 申請人:Sdgi控股股份有限公司