專利名稱：將多能干細(xì)胞從組織中流通到外周血的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將有能力分化為多種存在于成體組織中的細(xì)胞，例如紅細(xì)胞，白細(xì)胞，血小板，纖維母細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，骨骼肌細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞，心肌細(xì)胞，神經(jīng)元，神經(jīng)膠質(zhì)，少突膠質(zhì)細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞，皮膚表皮細(xì)胞，皮膚真皮細(xì)胞，毛囊細(xì)胞，骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞，破骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，氣管上皮細(xì)胞，肺泡細(xì)胞，胃腸道上皮細(xì)胞，口腔上皮細(xì)胞，成釉質(zhì)細(xì)胞，成牙本質(zhì)細(xì)胞，肝細(xì)胞，肝星形細(xì)胞，膽囊上皮細(xì)胞，胰臟內(nèi)分泌細(xì)胞，胰臟外分泌細(xì)胞，腎管狀細(xì)胞，腎血管小球細(xì)胞，輸尿管上皮細(xì)胞，泌尿道上皮細(xì)胞，垂體內(nèi)分泌細(xì)胞，甲狀腺細(xì)胞，腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞，腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞，前列腺細(xì)胞，乳腺細(xì)胞，視細(xì)胞，色素上皮細(xì)胞，角膜細(xì)胞，淚腺細(xì)胞和鼓室細(xì)胞的多能干細(xì)胞流通到外周血的試劑；通過含有試劑的組織再生而進(jìn)行治療的試劑；使用試劑回收多能干細(xì)胞的方法；將通過以上方法制備的多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為體細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
目前，從腦死亡的供體進(jìn)行器官移植作為心功能不全，肝功能不全，腎功能不全，神經(jīng)變性疾病(例如帕金森氏病，阿爾茨海默氏病)，心血管疾病，腦血管疾病，脊柱損傷，關(guān)節(jié)炎，骨質(zhì)疏松，糖尿病等等的一種激進(jìn)療法。然而，由于缺少供體，所以即使在移植治療發(fā)達(dá)的美國，希望器官移植的患者中只有大約5％可以獲得器官[J.Am.Med.Assoc.，267，239-246(1992)]。
另外，器官移植伴有免疫排斥，所以，一生都要施用免疫抑制劑，并且有遭受源于供體的感染性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。
為了解決供體缺乏，異種移植技術(shù)正在發(fā)展。
然而，免疫排斥的問題還沒有解決，并且與同種異體移植術(shù)相比，排斥的程度更為嚴(yán)重。豬被認(rèn)為是異種移植的有效材料，通過移植還有感染來自于豬的病毒等等的風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)際上，在馬來西亞近1,000,000頭豬感染了Hendra病毒，結(jié)果，導(dǎo)致多于70人死于感染[Nature，398，549(1999)]。
為了克服以上提及的關(guān)于同種異體移植和異種移植的問題，從干細(xì)胞分化和誘導(dǎo)人組織和細(xì)胞的技術(shù)已經(jīng)在研究。
干細(xì)胞是有著自我復(fù)制能力和分化為多種組織的多能能力的細(xì)胞。根據(jù)它們的收集部位，干細(xì)胞可以粗略地分為五種，它們是胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)，胎兒干細(xì)胞，成體干細(xì)胞，臍帶血干細(xì)胞和胎盤干細(xì)胞。ES細(xì)胞(胚胎干細(xì)胞)分離于囊胚期稱為胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的位置處，EG細(xì)胞(胚胎生殖細(xì)胞)收集于具有全能性，可以分化為成體的所有細(xì)胞的胚胎生殖系，所以，它們作為組織重建的材料引起廣泛注意[Konnnichi no Ishoku，14，542-548(2001)]。另外，從胎兒組織中分離培養(yǎng)組織特異的干細(xì)胞，例如中性干細(xì)胞[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，14720-14725(2000)]。然而，因?yàn)橹苽溥@樣的衍生于胚胎和胎兒的干細(xì)胞，需要破壞胚胎和胎兒，所以有一個(gè)倫理問題。而且，干細(xì)胞不是患者自身的細(xì)胞，在從腦死亡的供體進(jìn)行器官移植的情況下不易避免免疫排斥。而且，因?yàn)榕咛サ母杉?xì)胞和胎兒的干細(xì)胞的功能是個(gè)體的產(chǎn)生，它們的特性與成體干細(xì)胞不同，它們對(duì)成體組織的親和性也不同。實(shí)際上，當(dāng)ES細(xì)胞移植到成體組織時(shí)，會(huì)形成腫瘤。以上表明移植源于胚胎和胎兒的細(xì)胞到成體中的治療方法不容易檢驗(yàn)和證明其長期的安全性。
在干細(xì)胞是源于成體組織的情況下，使用患者自身的細(xì)胞進(jìn)行治療是可行的。
干細(xì)胞有自我復(fù)制的能力，它們可以大量的產(chǎn)生。相應(yīng)的，可以通過證明體外培養(yǎng)和產(chǎn)生的干細(xì)胞與組織中的干細(xì)胞相同，保證移植的安全性。用于皮膚和軟骨復(fù)制的商業(yè)產(chǎn)品已經(jīng)有售[TanpakushitsuKakusan Koso，45，2342-2347(2000)]。
然而，存在于成體組織中的組織特異性干細(xì)胞分裂能力有限，所以有一個(gè)不利之處即難以獲得足量的細(xì)胞。另外，只要是使用組織特異性的干細(xì)胞，它們只能用于治療這種組織，并且不能重復(fù)使用。
然而最近表明有能力分化為成體中幾乎所有種類細(xì)胞的多能干細(xì)胞存在于成體組織中(WO 01/11011，WO 01/21767，WO 01/48149)。
因?yàn)橛凶晕覐?fù)制能力的這樣的細(xì)胞表現(xiàn)為無限生長，所以也可以大量地產(chǎn)生細(xì)胞。進(jìn)一步地，與源于胚胎和的ES細(xì)胞不同，那些細(xì)胞即使移植到成體細(xì)胞，也不形成腫瘤。已經(jīng)表明出生后這樣的多能干細(xì)胞可以在從人的皮膚，骨骼肌和骨髓中制備。
另一方面，為了治療多種疾病已經(jīng)嘗試通過移植造血干細(xì)胞進(jìn)行造血系統(tǒng)重建。造血干細(xì)胞從骨髓收集，從骨髓中收集干細(xì)胞對(duì)患者而言是一個(gè)負(fù)擔(dān)。所以，考慮到使收集容易或使移植時(shí)間縮短，已經(jīng)嘗試將造血干細(xì)胞流通到外周血中，從外周血中收集造血干細(xì)胞而不是從骨髓中收集造血干細(xì)胞。
作為將造血干細(xì)胞流通到外周血的方法，此方法已知使用造血系統(tǒng)生長因子，趨化因子，細(xì)胞毒素劑，等等。
G-CSF(粒細(xì)胞集落-刺激因子)，GM-CSF(粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落-刺激因子)，IL-7，IL-12，flt-3配體，干細(xì)胞因子(SCF)，血小板生成素，等等已知作為造血系統(tǒng)的生長因子。IL-8，MIP-2(巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-2)，BB-10010(MIP-1α)等等已知作為趨化因子。環(huán)磷酰胺等已知作為細(xì)胞毒素劑[Blood，10，3025-3031(2000)]。
哥倫比亞大學(xué)的研究組發(fā)現(xiàn)通過G-CSF流通到人外周血的細(xì)胞中分離出CD34-陽性細(xì)胞，并且移植到心臟梗塞模型中時(shí)，血管生成發(fā)生，心功能提高[Nature Medicine，7，430-436(2001)，WO 2001/94420]。
紐約州立大學(xué)的研究組發(fā)現(xiàn)小鼠骨髓的Lin-陰性和c-kit-陽性造血干細(xì)胞移植到患有心臟梗塞的小鼠時(shí)，心肌和血管再生[Nature，410，701-705(2001)]。同一研究組也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)心臟梗塞開始前給小鼠施用G-CSF和SCF，在梗塞位置發(fā)生心肌和血管再生，研究組認(rèn)為通過G-CSF造血干細(xì)胞流向外周血，因此梗塞的心肌再生[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98，10344-10349(2001)]。
發(fā)明公開多能干細(xì)胞可以再生多種組織。從患者的皮膚，骨骼肌和骨髓中收集多能干細(xì)胞涉及例如對(duì)患者自身造成劇痛，組織破壞等等問題。所以，為了容易地從患者的外周血中進(jìn)行收集，需要將多能干細(xì)胞流通到外周血的試劑。也要求找出沒有細(xì)胞移植時(shí)，使組織破壞和變性的因素，所述因素可以簡化從患者中收集細(xì)胞，細(xì)胞體外培養(yǎng)和細(xì)胞移植到患者的使用細(xì)胞的再生醫(yī)藥治療步驟。
為了解決以上提及的問題，已經(jīng)加強(qiáng)研究以找出多種因素，結(jié)果，據(jù)信在活化免疫系統(tǒng)中起作用的細(xì)胞因子已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有把參與多種組織修復(fù)的多能干細(xì)胞流通到外周血中的作用，因此本發(fā)明已經(jīng)達(dá)到。
本發(fā)明是關(guān)于以下的(1)到(40)。
(1)將多能干細(xì)胞從組織中流通到外周血的試劑，其含有作為活性成分的細(xì)胞因子，所述細(xì)胞因子選自活化單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子，活化的單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，和G-CSF受體表達(dá)的造血細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。
(2)以上(1)中提及的試劑，其中細(xì)胞因子是選自G-CSF，M-CSF，GM-CSF和IL-8的細(xì)胞因子。
(3)以上(1)中提及的試劑，其中活化單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子選自M-CSF和GM-CSF。
(4)以上(1)中提及的試劑，其中表達(dá)G-CSF受體的造血細(xì)胞是粒細(xì)胞或中性粒細(xì)胞。
(5)以上(4)中提及的試劑，其中中性粒細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子是IL-8。
(6)以上的(1)到(5)中任意一項(xiàng)提及的試劑，其中細(xì)胞因子是化學(xué)修飾過的細(xì)胞因子。
(7)以上(6)中提及的試劑，其中細(xì)胞因子用聚亞烷基二醇化學(xué)修飾的細(xì)胞因子。
(8)以上的(1)到(7)中任意一項(xiàng)提及的試劑，其中構(gòu)成細(xì)胞因子的氨基酸序列中的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸被去除，取代，插入或增加，并且細(xì)胞因子實(shí)質(zhì)上有相同的活性。
(9)以上(1)中提及的試劑，其中組織是骨髓。
(10)以上(1)中提及的試劑，其中多功能干細(xì)胞選自CD45-陰性細(xì)胞，血型糖蛋白A-陰性細(xì)胞和oct3/4-陽性細(xì)胞。
(11)以上(1)中提及的試劑，其中多功能干細(xì)胞選自CD45-陰性和血型糖蛋白A-陰性細(xì)胞，oct3/4-陽性和CD45-陰性細(xì)胞，oct3/4-陽性和血型糖蛋白A-陰性細(xì)胞，CD45-陰性，血型糖蛋白A-陰性和oct3/4-陽性細(xì)胞和CD45-陰性和CD34-陰性細(xì)胞。
(12)以上(1)中提及的試劑，其中多功能干細(xì)胞選自CD34-陽性，CD117-陽性和CD140-陽性細(xì)胞，CD10-陽性和CD66e-陽性細(xì)胞，CD13-陽性和CD49b-陽性細(xì)胞和CD45-陰性和CD34-陽性細(xì)胞。
(13)一種回收流通為外周血干細(xì)胞的多能干細(xì)胞的方法，其中使用以上(1)到(12)中任意一項(xiàng)提及的試劑。
(14)一種再生組織的方法，其中使用以上(13)中提及的方法獲得多能干細(xì)胞。
(15)使用以上(1)到(12)中任意一項(xiàng)提及的試劑誘導(dǎo)流通為外周血干細(xì)胞的多能干細(xì)胞分化為體細(xì)胞的方法。
(16)以上(15)提及的方法，其中體細(xì)胞是選自紅細(xì)胞，白細(xì)胞，血小板，纖維母細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，骨骼肌細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞，心肌細(xì)胞，神經(jīng)元，神經(jīng)膠質(zhì)，少突膠質(zhì)細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞，皮膚表皮細(xì)胞，皮膚真皮細(xì)胞，毛囊細(xì)胞，骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞，破骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，氣管上皮細(xì)胞，肺泡細(xì)胞，胃腸道上皮細(xì)胞，口腔上皮細(xì)胞，成釉質(zhì)細(xì)胞，成牙本質(zhì)細(xì)胞，肝細(xì)胞，肝星形細(xì)胞，膽囊上皮細(xì)胞，胰臟內(nèi)分泌細(xì)胞，胰臟外分泌細(xì)胞，腎管狀細(xì)胞，腎血管小球細(xì)胞，輸尿管上皮細(xì)胞，泌尿道上皮細(xì)胞，垂體內(nèi)分泌細(xì)胞，甲狀腺細(xì)胞，腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞，腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞，前列腺細(xì)胞，乳腺細(xì)胞，視細(xì)胞，色素上皮細(xì)胞，角膜細(xì)胞，淚腺細(xì)胞和鼓室細(xì)胞的細(xì)胞。
(17)一種組織再生治療試劑，其含有作為活性成分的細(xì)胞因子，所述細(xì)胞因子選自活化單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子，活化的單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，和G-CSF受體表達(dá)的造血細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。
(18)以上(17)中提及的治療試劑，其中細(xì)胞因子選自G-CSF，M-CSF，GM-CSF和IL-8。
(19)以上(17)中提及的治療試劑，其中活化單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子選自M-CSF和GM-CSF。
(20)以上(17)中提及的治療試劑，其中表達(dá)G-CSF受體的造血細(xì)胞是粒細(xì)胞或中性粒細(xì)胞。
(21))以上(20)中提及的治療試劑，其中中性粒細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子是IL-8。
(22)以上(17)到(21)中任意一項(xiàng)提及的治療試劑，其中細(xì)胞因子是化學(xué)修飾的細(xì)胞因子。
(23)以上(22)中提及的治療試劑，其中細(xì)胞因子是聚亞烷基二醇化學(xué)修飾的細(xì)胞因子。
(24)以上(17)到(23)中任意一項(xiàng)提及的治療試劑，其中構(gòu)成細(xì)胞因子的氨基酸序列中的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸被去除，取代，插入或增加，并且細(xì)胞因子大體上有相同的活性。
(25)以上(17)到(24)中任意一項(xiàng)提及的治療試劑，其中組織選自神經(jīng)組織，皮膚組織，心血管組織，呼吸組織，骨骼組織，結(jié)締組織，血液，免疫組織，腸組織，口腔組織，肝組織，胰腺組織，泌尿組織，內(nèi)分泌腺和感覺組織。
(26)以上(25)中提及的治療試劑，其中神經(jīng)組織選自中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)。
(27)以上(25)中提及的治療試劑，其中皮膚組織選自皮膚表皮，皮膚真皮和皮下組織。
(28)以上(25)中提及的治療試劑，其中心血管組織選自心臟，動(dòng)脈血管，靜脈血管，毛細(xì)血管和淋巴管。
(29)以上(25)中提及的治療試劑，其中呼吸組織選自鼻粘膜，氣管和氣囊。
(30)以上(25)中提及的治療試劑，其中骨骼組織選自骨，軟骨，關(guān)節(jié)，韌帶和跟腱。
(31)以上(25)中提及的治療試劑，其中結(jié)締組織選自脂肪組織和纖維組織。
(32)以上(25)中提及的治療試劑，其中血液組織選自紅細(xì)胞，白細(xì)胞和血小板。
(33)以上(25)中提及的治療試劑，其中免疫組織選自淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞，粒細(xì)胞，胸腺，淋巴結(jié)和脾。
(34)以上(25)中提及的治療試劑，其中腸組織選自唾液腺，胃，十二指腸，小腸，大腸，直腸和肛門。
(35)以上(25)中提及的治療試劑，其中口腔組織選自口腔粘膜，牙和舌。
(36)以上(25)中提及的治療試劑，其中肝組織選自肝和膽囊。
(37)以上(25)中提及的治療試劑，其中胰腺組織選自胰腺的外分泌腺和胰腺的內(nèi)分泌腺。
(38)以上(25)中提及的治療試劑，其中泌尿組織選自腎單位，腎泌尿小管，腎髓質(zhì)，輸尿管，膀胱和泌尿道。
(39)以上(25)中提及的治療試劑，其中內(nèi)分泌腺選自垂體，甲狀腺，周圍神經(jīng)。
(40)以上(25)中提及的治療試劑，其中感覺組織選自味蕾，嗅上皮，視網(wǎng)膜，角膜，晶狀體，內(nèi)耳和周圍神經(jīng)系統(tǒng)。
本發(fā)明以下將詳細(xì)描述。
1.將多能干細(xì)胞從組織中流通到外周血的試劑本發(fā)明涉及將多能干細(xì)胞從組織中流通到外周血的試劑，所述試劑含有作為活性成分的細(xì)胞因子，例如活化粒細(xì)胞，單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子，活化的單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，和G-CSF受體表達(dá)的造血細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。
有以上提及的特性的任何細(xì)胞因子都可以作為本發(fā)明的試劑。
例如，M-CSF，GM-CSF，等等，可以作為活化粒細(xì)胞，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子的例子；G-CSF，GM-CSF等等可以作為活化的巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的例子；IL-8等等可以作為中性粒細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的例子。
雖然金屬蛋白酶明膠酶B(以后縮寫為MMP-9)并不是細(xì)胞因子，但是它可以作為一種與本發(fā)明中以上提及的細(xì)胞因子相同的物質(zhì)，因?yàn)樗c中性粒細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子有相同的活性。
以上提及的被化學(xué)修飾的細(xì)胞因子也可以作為本發(fā)明的藥物使用?；瘜W(xué)修飾方法的例子是聚亞烷基二醇修飾(WO98/55500)，白蛋白，纖維素衍生物，明膠，膠原，纖維蛋白，多糖，透明質(zhì)酸，聚乳酸，乳酸與乙醇酸的共聚物，聚乙烯吡咯烷酮，葡聚糖和聚氨基酸修飾(Bioconjugate Chemistry，3，349-362，1992)，脂例如卵磷脂修飾(J.Pharm.Exp.Therap.，271，1672-1677，1994)，苯乙烯與順丁烯二酸共聚物(SMA)，乙烯醚與順丁烯二酸酐共聚物(DIVEMA)和聚乙烯醇(PVA)修飾(Bioconjugate Chemistry6，332-351，1995)等等，優(yōu)選的是聚亞烷基二醇修飾。
聚亞烷基二醇修飾細(xì)胞因子的具體例子是聚亞烷基二醇修飾的G-CSF和G-CSF衍生的ND28[J.Biochem.，115814-819，(1994)]。
作為本發(fā)明的試劑，也可以使用如以上的大體上相同活性的細(xì)胞因子，在此，組成以上提及的細(xì)胞因子的氨基酸序列中，一個(gè)或幾個(gè)氨基酸被去除，取代，插入或增加?！叭コ〈?，插入或增加”的表達(dá)意味著，在相同序列的任何位置，有一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的去除，取代，插入或增加。去除，取代，插入或增加可以同時(shí)發(fā)生，被去除，取代，插入或增加的氨基酸殘基可以是天然類型也可以是非天然類型。天然的氨基酸殘基的例子是L-丙氨酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，L-谷氨酰胺，L-谷氨酸，甘氨酸，L-組氨酸，L-異亮氨酸，L-亮氨酸，L-賴氨酸，L-精氨酸，L-甲硫氨酸，L-苯丙氨酸，L-脯氨酸，L-絲氨酸，L-蘇氨酸，L-色氨酸，L-酪氨酸，L-纈氨酸和L-半胱氨酸。
可以相互取代的氨基酸殘基的例子顯示如下。同組的氨基酸殘基可以相互取代。組A亮氨酸，異亮氨酸，正亮氨酸，纈氨酸，戊氨酸，丙氨酸，2-氨基丁酸，甲硫氨酸，O-甲絲氨酸，叔丁基甘氨酸，叔丁基丙氨酸，環(huán)己基丙氨酸；組B天冬氨酸，谷氨酸，異天冬氨酸，異谷氨酰胺，2-氨基己二酸，2-氨基辛二酸；組C天冬酰胺，谷氨酰胺；組D賴氨酸，精氨酸，鳥氨酸，2，4-二氨基丁酸，2，3-二氨基丙酸；組E脯氨酸，3-羥脯氨酸，3-羥脯氨酸；組F絲氨酸，蘇氨酸，高絲氨酸；組G苯丙氨酸，酪氨酸。具體的，ND 28(Biochemical and Biophysical Research Communication，159103-111，1989)是G-CSF的變體的例子。ND 28是野生型G-CSF的第一個(gè)Thr，第三個(gè)Leu，第四個(gè)Gly，第五個(gè)Pro，第17個(gè)Cys分別被Ala，Thr，Tyr，Arg和Ser取代的物質(zhì)。
表達(dá)G-CSF受體的造血干細(xì)胞的例子是髓樣類型前體，淋巴細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，等等，優(yōu)選的是巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。
在本發(fā)明的試劑中使用的細(xì)胞因子可以是單獨(dú)使用也可以是聯(lián)合使用。
在以上提及的組織中，骨髓是典型的組織。
以上多能干細(xì)胞的例子是CD 45-陰性細(xì)胞，血型糖蛋白A-陰性細(xì)胞，和oct 3/4-陽性細(xì)胞，等等，優(yōu)選的多能干細(xì)胞是CD 45-陰性和血型糖蛋白A-陰性細(xì)胞，oct 3/4-陽性和CD 45-陰性細(xì)胞，oct3/4-陽性和血型糖蛋白A-陰性細(xì)胞，CD 10-陽性和CD 66e-陽性細(xì)胞，CD 13-陽性和CD 49b-陽性細(xì)胞等等，更優(yōu)選的多能干細(xì)胞是CD 45-陰性，血型糖蛋白A-陰性和oct 3/4-陽性細(xì)胞，CD 34-陽性，CD 117-陽性和CD 140-陽性細(xì)胞，CD 45-陰性和CD-34陰性細(xì)胞，CD 45-陰性和CD-34陽性細(xì)胞等等。
具體例子是對(duì)CD 10，CD 13，CD 49b，CD 49e，CDw 90，F(xiàn)lk1，EGF-R，TGF-R1，TGF-R2，BMP-R1A，PDGF-R1a和PDGF-R1b為陽性，對(duì)CD 31，CD 34，CD 36，CD 38，CD45，CD 50，CD 62E，CD 62P，HLA-DR，Muc 18，STRO-1，c-kit，Tie/Tek，CD 44，HLA-I型和2-微球蛋白為陰性的多能干細(xì)胞；對(duì)CD 10和CD 66e為陽性，對(duì)CD 1a，CD 2，CD 3，CD 4，CD 5，CD 7，CD 8，CD 9，CD 11b，CD 11c，CD 13，CD 14，CD 15，CD 16，CD 18，CD19，CD 20，CD 22，CD 23，CD 24，CD 25，CD 31，CD 33，CD 34，CD 36，CD 38，CD 41，CD 42b，CD 44，CD 45，CD 49d，CD 55，CD 56，CD 57，CD 59，CD 61，CD 62E，CD 65，CD 68，CD 69，CD 71，CD 79，CD 83，CD 90，CD 95，CD 105，CA 117，CD 123，CD 166，血型糖蛋白-A，DRJI，Class-1，F(xiàn)LT 3，F(xiàn)MC-7，annexin和LIN為陰性的多能干細(xì)胞；對(duì)CD 10，CD 13，CD 34，CD 56，CD 90和MHC-I型為陽性的多能干細(xì)胞；對(duì)CD 10，CD 13，CD 34，CD 56，CD 90和MHC-I型為陽性，對(duì)CD 1a，CD 2，CD 3，CD 4，CD 5，CD 7，CD 8，CD 9，CD 11b，CD 11c，CD 14，CD 15，CD 16，CD 18，CA 19，CD 20，CD 22，CD 23，CD 24，CD 25，CD 31，CD 33，CD36，CD 38，CD 41，CD 42b，CD 44，CD 45，CD 49d，CD 55，CD 57，CD 59，CD 61，CD 62E，CD 65，CD 66e，CD 68，CD 69，CD 71，CD 79，CD 83，CD 95，CD 105，CD 117，CD 123，CD 166，血型糖蛋白-A，DR-II，F(xiàn)LT 3，F(xiàn)MC-7，annexin和LIN為陰性的多能干細(xì)胞；以及對(duì)CD 34，CD 117，CD 144，CD 140，CD 29和CD 44為陽性，對(duì)CD 14，CD 45，F(xiàn)lk-1，CD 31，CD 105，CD 49b，CD 49d，CD 54，CD 102和CD 106為陰性的多能干細(xì)胞。
本發(fā)明的試劑沒有特殊的限制，只要其含有至少一種選自活化粒細(xì)胞，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的因子，活化的單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞分泌的因子，或表達(dá)G-CSF受體，M-CSF，G-CSF，GM-CSF，IL-8和MMP-9的造血細(xì)胞分泌的因子中的因子，然而優(yōu)選的是提供一種通過制藥技術(shù)領(lǐng)域中已知的任何方法與一種或多種藥學(xué)可接受載體混合而生產(chǎn)的試劑。
試劑的具體例子是作為遺傳修飾的G-CSF制劑的Neu-Up(由Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd.生產(chǎn))，作為遺傳修飾的G-CSF制劑的Neutrogin(由Chugai Pharmaceutical Co.，Ltd.生產(chǎn))，作為遺傳修飾的G-CSF制劑的Gran(由Kirin Brewery Co.，Ltd.生產(chǎn))，和M-CSF制劑的Leukoprol(由Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd.生產(chǎn))。
考慮到施用途徑，理想的是使用對(duì)治療最為有效的途徑。優(yōu)選的是口內(nèi)施用和腸胃外施用例如氣管內(nèi)施用，直腸內(nèi)施用，皮下施用，肌肉內(nèi)施用和靜脈內(nèi)施用，最優(yōu)選的是皮下施用和靜脈內(nèi)施用。
噴霧劑，膠囊，片劑，顆粒劑，糖漿，乳劑，栓劑，注射劑，軟膏，粘膏等等是施用形態(tài)的例子。
合適于口服的制劑例子是乳劑，糖漿，膠囊，片劑，粉末和顆粒劑。
液體制劑例如乳劑和糖漿可以用水；例如蔗糖，山梨醇和果糖的糖類；例如聚乙二醇和丙二醇的二醇；例如芝麻油，橄欖油和豆油的油劑；例如對(duì)羥基苯甲酸的防腐劑；例如草莓味和薄荷味的香料；等等作為添加劑制作。
膠囊，片劑，粉末，顆粒劑等等用例如乳糖，葡萄糖，蔗糖和甘露醇的賦形劑；例如淀粉和海藻酸鈉的分裂劑；例如硬脂酸鎂和滑石的滑潤劑；例如聚乙烯醇，羥丙纖維素和明膠的粘合劑；例如脂肪酸酯的表面活性劑；例如甘油的增塑劑；等等作為添加劑制作。
合適于腸胃外施用的制劑例子是注射劑，栓劑和噴霧劑。
注射劑用鹽溶液，葡萄糖溶液，包含兩者的混合物的載劑制備。
栓劑用載劑例如可可脂，氫化的脂或羧酸制備。
噴霧劑使用化合物本身或使用不刺激接受者的口腔和氣管粘膜的載劑或類似材料而制備，把以上提及的要素分散為細(xì)顆粒，使吸收容易。
載劑的具體例子是乳糖和甘油。根據(jù)以上提及的要素和使用載劑的特性，試劑可以制備為氣霧劑，干粉，等等。在那些腸胃外使用的試劑中，也可以加入作為口服試劑添加劑例子的成分。
雖然本藥學(xué)組合物的劑量根據(jù)患者的年齡，癥狀等等變化，但是施用于包括人的哺乳動(dòng)物時(shí)，在施用例如是G-CSF制劑的Neu-Up的情況下，劑量是0.1到1,000微克/千克/天。在施用的是M-CSF制劑的Leukoprol的情況下，劑量是100,000-10,000,000單位/天。施用或者是只施用一天的單次施用或者是天天施用。
因?yàn)槭┯帽景l(fā)明的試劑，現(xiàn)在可以流通多能干細(xì)胞到外周血中。
2.回收流通為外周血干細(xì)胞的多能干細(xì)胞的方法本發(fā)明也涉及使用本發(fā)明的試劑流通為外周血干細(xì)胞的多能干細(xì)胞的回收方法。
使用本發(fā)明的試劑將流通到外周血中的多能干細(xì)胞的回收方法的例子是包括通過白細(xì)胞除去法從外周血中選擇單核細(xì)胞，使用細(xì)胞標(biāo)記識(shí)別的方法回收所要的細(xì)胞的方法。
白細(xì)胞除去法可以使用例如Haemonetics公司的CCS(細(xì)胞收集系統(tǒng))的儀器。
通過使用細(xì)胞標(biāo)記識(shí)別而進(jìn)行所要細(xì)胞回收的方法的例子是利用識(shí)別細(xì)胞標(biāo)記的抗體的方法，使用微珠和磁體的方法。
所要細(xì)胞的例子是有CD 45-陰性和/或血型糖蛋白-A陰性特性的細(xì)胞。
使用識(shí)別細(xì)胞標(biāo)記抗體的方法的例子是一種包括使用識(shí)別CD 45和血型糖蛋白-A的抗體，從通過以上提及方法收集的外周血單核細(xì)胞中除去CD 45-陽性細(xì)胞和血型糖蛋白-A陽性細(xì)胞的方法，等等，所述CD 45是淋巴細(xì)胞的共同抗原，血型糖蛋白A是成紅血細(xì)胞的共同抗原。
使用微珠和磁體的方法的例子是這樣一種方法，所述方法包括把血型糖蛋白A和CD 45的微珠(Miltenyi Biotec)與從外周血中制備的單核細(xì)胞室溫下孵育15分鐘，然后使用Super MACS(Miltenyi Biotec)除去CD 45-陽性細(xì)胞和血型糖蛋白-A陽性細(xì)胞，所述Super MACS是一種磁體。通過本處理獲得的細(xì)胞大約99.5％是CD 45-陰性和血型糖蛋白-A陰性細(xì)胞，并且在所獲得的細(xì)胞中含有多能干細(xì)胞。
3.流通到外周血的多能干細(xì)胞的分離和孵育方法以上2中制備的CD 45-陰性和血型糖蛋白-A陰性細(xì)胞中分離和孵育多能干細(xì)胞的方法有以下兩種。
第一種方法如下。從外周血單核細(xì)胞中制備的CD 45-陰性和血型糖蛋白-A陰性細(xì)胞用包被5納克/毫升纖維連接蛋白的培養(yǎng)皿，在培養(yǎng)基(培養(yǎng)基-A)中培養(yǎng)2到3星期，小的粘連細(xì)胞形成集落，所述培養(yǎng)基使用低糖DMEM，MCDB-201作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，含有10微克/毫升胰島素，5.5微克/毫升轉(zhuǎn)鐵蛋白，5納克/毫升硒，0.5微克/毫升牛血清白蛋白，0.01微摩爾地塞米松，0.1毫摩爾L-抗壞血酸2-磷酸鹽，2％胎牛血清，10納克/毫升PDGF，10納克/毫升EGF，10納克/毫升IGF，1,000國際單位LIF。把細(xì)胞用識(shí)別細(xì)胞表面標(biāo)記的抗體染色后，制備的細(xì)胞的特性可以用熒光活化細(xì)胞分離器(FACS)分析。
以上提及的方法制備的多能干細(xì)胞，其細(xì)胞標(biāo)記可以用FACS分析鑒定。
可以使用CD 10，CD 13，CD 49b，CD 49e，CDw 90，F(xiàn)lk1，EGF-R，TGF-R1，TGF-R2，BMP-R1A，PDGF-R1a，PDGF-R1b，CD 31，CD 34，CD 36，CD 38，CD 45，CD 50，CD 62E，CD 62P，HLA-DR，Muc 18，STRO-1，c-kit，Tie/Tek，CD 44，HLA-I型，2-微球蛋白，等等作為多能干細(xì)胞的細(xì)胞標(biāo)記。
通過以上提及的方法制備的多能干細(xì)胞的例子是對(duì)CD 10，CD13，CD 49b，CD 49e，CDw 90，F(xiàn)lk1，EGF-R，TGF-R1，TGF-R2，BMP-R1A，PDGF-R1a和PDGF-R1b為陽性，對(duì)CD 31，CD 34，CD 36，CD 38，CD 45，CD 50，CD 62E，CD 62P，HLA-DR，Muc 18，STRO-1，c-kit，Tie/Tek，CD 44，HLA-I型和2-微球蛋白為陰性的細(xì)胞。
制備多能干細(xì)胞的第二種方法如下。從外周血單核細(xì)胞中制備的CD 45-陰性和血型糖蛋白-A陰性細(xì)胞用含有10％馬血清的EMEM培養(yǎng)基(培養(yǎng)基-B)培養(yǎng)并生長直到細(xì)胞匯合，然后細(xì)胞用含有0.05％胰蛋白酶和0.0744％EDTA的PBS溶液回收，冷卻，并在含有7.5％DMSO的培養(yǎng)基B中冷凍到-80℃。冷凍細(xì)胞37℃復(fù)蘇，細(xì)胞離心回收，在培養(yǎng)基B中再次培養(yǎng)。因?yàn)橹貜?fù)冷凍和復(fù)蘇，所以多能干細(xì)胞被濃縮。
在這種方法制備的多能干細(xì)胞中，可以使用流式細(xì)胞儀分析鑒定細(xì)胞標(biāo)記。
作為通過以上提及方法制備的多能干細(xì)胞，要提及的是(1)對(duì)CD 10和CD 66e為陽性，對(duì)CD 1a，CD 2，CD 3，CD 4，CD 5，CD 7，CD 8，CD 9，CD 11b，CD 11c，CD 13，CD 14，CD 15，CD 16，CD18，CD 19，CD 20，CD 22，CD 23，CD 24，CD 25，CD 31，CD 33，CD 34，CD 36，CD 38，CD 41，CD 42b，CD 44，CD 45，CD 49d，CD 55，CD 56，CD 57，CD 59，CD 61，CD 62E，CD 65，CD 68，CD 69，CD 71，CD 79，CD 83，CD 90，CD 95，CD 105，CA 117，CD 123，CD 166，血型糖蛋白-A，DRII，Class-I，F(xiàn)LT 3，F(xiàn)MC-7，annexin和LIN為陰性的細(xì)胞；(2)對(duì)CD 10，CD 13，CD 34，CD 56，CD 90和MHC-I型為陽性，對(duì)CD 1a，CD 2，CD3，CD 4，CD 5，CD 7，CD 8，CD 9，CD 11b，CD 11c，CD 14，CD 15，CD 16，CD 18，CA 19，CD 20，CD 22，CD 23，CD 24，CD 25，CD 31，CD 33，CD 36，CD 38，CD 41，CD 42b，CD 44，CD 45，CD 49d，CD 55，CD 57，CD59，CD 61，CD 62E，CD 65，CD 66e，CD 68，CD 69，CD 71，CD 79，CD 83，CD 95，CD 105，CD 117，CD 123，CD 166，血型糖蛋白-A，DR-II，F(xiàn)LT 3，F(xiàn)MC-7，annexin和LIN為陰性的細(xì)胞；(3)對(duì)CD 10，CD 13，CD 49b，CD 49e，CDw 90，F(xiàn)lk1，EGF-R，TGF-R1，TGF-R2，BMP-R1A，PDGF-R1a和PDGF-R1b為陽性，對(duì)CD 31，CD 34，CD 36，CD 38，CD 45，CD 50，CD 62E，CD 62P，HLA-DR，Muc 18，STRO-1，c-kit，Tie/Tek，CD 44，HLA-I型和2-微球蛋白為陰性的細(xì)胞；(4)對(duì)CD 34，CD 117，CD 144，CD 140，CD 29和CD 44為陽性，對(duì)CD 14，CD 45，CD 90，F(xiàn)lk-1，CD 31，CD 105，CD 49b，CD 49d，CD 54，CD 102和CD 106為陰性的細(xì)胞。
以上提及的細(xì)胞具有多潛能性，可以分化為成體中存在的除生殖腺之外的所有組織。另外，對(duì)CD 10，CD 13，CD 34，CD 56，CD 90和MHC ClaSS-I為陽性，對(duì)CD 1a，CD 2，CD 3，CD 4，CD 5，CD7，CD 8，CD 9，CD 11b，CD 11c，CD 14，CD 15，CD 16，CD 18，CA 19，CD 20，CD 22，CD 23，CD 24，CD 25，CD 31，CD 33，CD 36，CD 38，CD 41，CD 42b，CD 44，CD 45，CD 49d，CD 55，CD 57，CD59，CD 61，CD 62E，CD 65，CD 66e，CD 68，CD 69，CD 71，CD 79，CD 83，CD 95，CD 105，CD 117，CD 123，CD 166，血型糖蛋白A，DR-II，F(xiàn)LT3，F(xiàn)MC-7，annexin和LIN為陰性的細(xì)胞對(duì)于間質(zhì)系統(tǒng)有多潛能性。
間質(zhì)系統(tǒng)包括衍生于中胚層例如骨骼肌，平滑肌，心肌，骨骼，軟骨，脂肪，成纖維細(xì)胞，血管和血液的細(xì)胞。
在FACS中分類的方法有水滴電荷法，細(xì)胞捕獲法，等等(“FlowCytometer Jiyujizai”14-23頁，Shujunsha，1999)。在任何這些方法中，與細(xì)胞表面表達(dá)的分子結(jié)合的抗體發(fā)出的熒光強(qiáng)度轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，由此抗原的表達(dá)量可以定量。也可以利用表面抗原，通過與使用的熒光類型結(jié)合而分離。熒光的例子是FITC(異硫氰酸熒光素)，PE(藻紅蛋白)，APC(別藻藍(lán)蛋白)，TR(Texas紅)，Cy3，CyChrome，Red 613，Red 670，PerCP，TRI-Color，Quantum Red，等等(“FlowCytometer Jiyujizai”，3-13頁，Sbujunsha，1999)。
4.本發(fā)明的再生和治療組織的試劑以上1中提及的試劑流通多能干細(xì)胞到外周血中，受損組織可以通過流通的多能干細(xì)胞再生。因此，以上1中的試劑可以用于再生和治療組織。
作為使用本發(fā)明的再生和治療組織的試劑治療疾病的方法，提及的是包括對(duì)患者施用該試劑修復(fù)受損部位的方法，包括通過以上1的試劑，通過以上2的方法，回收流通到外周血中的多能干細(xì)胞，把回收的多能干細(xì)胞本身或者體外分化成為所要的細(xì)胞或組織后移植到受損部位的方法，等等。
本發(fā)明的再生和治療組織的試劑可以流通多能干細(xì)胞到外周血中，然后多能干細(xì)胞遷移或分化到受損部位，修復(fù)受損組織。
所以，對(duì)于組織受損迅速發(fā)生的疾病的治療，優(yōu)選的是使用包括直接對(duì)患者施用根據(jù)本發(fā)明的再生和治療組織的試劑的方法。
組織受損迅速發(fā)生的疾病的例子是器官或組織不可逆受損例如心功能不全，肝功能不全，腎功能不全，心血管損傷，腦血管損傷，骨髓損傷，由于癌癥化療或癌癥免疫療法的產(chǎn)生的副作用。
也可以通過施用根據(jù)本發(fā)明的再生和治療組織的試劑，通過以上提及的方法2回收流通到外周血中的多能干細(xì)胞，把回收的多能干細(xì)胞本身或者體外分化后成為所要的細(xì)胞或組織移植到受損部位，而治療疾病。
當(dāng)多能干細(xì)胞或分化的細(xì)胞用于治療時(shí)，用Haemonetics公司的Hemolite 2 Plus或類似物用生理鹽水溶液洗滌細(xì)胞。至于儀器，可以處于完全密閉的系統(tǒng)中，可以濃縮，洗滌，和回收培養(yǎng)細(xì)胞的儀器作為例子，優(yōu)選是的可以幾乎100％的除去用于培養(yǎng)和分化的物質(zhì)例如細(xì)胞因子的儀器。這樣回收的多能干細(xì)胞或分化的細(xì)胞可以通過通常的灌注輸注入靜脈或直接輸注到患病部位而用于治療。
這種方法優(yōu)選用于治療伴有慢性組織損傷或潰變的疾病。
伴有慢性組織損傷或潰變的疾病的例子是神經(jīng)變性疾病，關(guān)節(jié)炎，頑固炎性腸病，骨質(zhì)疏松，動(dòng)脈硬化和糖尿病。
根據(jù)本發(fā)明，不僅僅活化粒細(xì)胞，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的因子，而且粒細(xì)胞，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞也可以直接移植到組織，從而將多能干細(xì)胞流通到受損組織。
粒細(xì)胞，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞可以通過使用一種磁性細(xì)胞分類系統(tǒng)(MACS)，從外周血單核細(xì)胞中收集CD 14-陽性細(xì)胞進(jìn)行制備。它們也可以通過使用Methoculto H4434V(StemCell Tec)，孵育從骨髓或臍帶血液中分離的CD 34-陽性，AC 133-陽性或CD 34-和AC133-雙陽性造血干細(xì)胞而進(jìn)行制備。
執(zhí)行發(fā)明的最佳模式實(shí)施例1通過單獨(dú)施用G-CSF或者聯(lián)合施用G-CSF和M-CSF，改變外周血中細(xì)胞的特性(1)改變流通到外周血的細(xì)胞的數(shù)目研究了通過施用G-CSF或者G-CSF和M-CSF改變流通到外周血的未分化干細(xì)胞的數(shù)目。
如下所示，準(zhǔn)備包含4只小鼠的組A，包含5只小鼠的組B，包含5只小鼠的組C，連續(xù)5天施用三種不同的試劑。具體的，在組A的小鼠中，八周齡的四只雄性Balb/c小鼠(Nippon SLC)每只每天皮下注射10微克的G-CSF(Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd生產(chǎn)，商品名Neu-Up)，連續(xù)5天。在組B的小鼠中，八周齡的五只雄性Balb/c小鼠每只每天皮下注射10微克的G-CSF(Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd生產(chǎn)，商品名Neu-Up)和105單位的M-CSF(Kyowa HakkoKogyo Co.，Ltd生產(chǎn)，商品名Leukoprol)，連續(xù)5天。在組C的小鼠中，八周齡的五只雄性Balb/c小鼠每只每天皮下注射200微升的PBS(磷酸鹽緩沖鹽)(pH7.4)(Life Technologies生產(chǎn))，連續(xù)5天。
最后一次施用試劑的次日，組A，組B和組C每組中的小鼠用乙醚麻醉，從眼動(dòng)脈收集大約1.2毫升外周血，置于事先有100單位肝素鈉(Takeda Chemical industries生產(chǎn))的管中，然后加入與收集血同樣量的用于稀釋的0.9％的NaCl，其鋪在1.4毫升Nyco Prep 1.077 Animal(Daiichi Kagaku Yakuhin生產(chǎn))上，室溫600×g離心30分鐘。收集懸浮于界面的單核細(xì)胞層，用1毫升PBS混合，室溫400×g離心15分鐘。除去上清液，沉淀的單核細(xì)胞懸浮于250微升MACS緩沖液[含0.5％BSA(牛血清白蛋白)的PBS]中，在冰上與70微升小鼠CD 45微珠(Miltenyi Biotec生產(chǎn))和30微升Ter-119微珠(Miltenyi Biotec生產(chǎn))反應(yīng)15分鐘。往反應(yīng)物中加入4毫升MACS緩沖液，混合物300×g離心10分鐘，然后除去上清液。沉淀懸浮于400微升MACS緩沖液中。懸浮的細(xì)胞通過分離柱MS(Miltenyi Biotec生產(chǎn))以除去CD45-陽性和Ter 119-陽性細(xì)胞，然后濃縮在外周血中含有的CD 45-陰性和Ter 119-陰性細(xì)胞。CD 45是白細(xì)胞的標(biāo)記，而Ter 119是小鼠紅細(xì)胞的標(biāo)記。通過除去在外周血中含有的成熟細(xì)胞例如白細(xì)胞和紅細(xì)胞，制備的CD 45-陰性和Ter 119-陰性細(xì)胞的總數(shù)，組A(施用G-CSF)分別是2.88×104，2.32×104，4.72×104和2.08×104，組B(施用G-CSF和M-CSF)分別是2.76×104，7.93×103，3.88×104和4.94×104和3.07×104，組C(施用PBS)分別是5.28×105，5.19×103，2.60×103，2.67×103和2.67×103。與施用PBS的組相比，單獨(dú)施用G-CSF或聯(lián)合施用G-CSF和M-CSF的組的外周血中細(xì)胞數(shù)增加。
(2)流通到外周血中的細(xì)胞的分析使用FACS Calibur(Becton Dickinson生產(chǎn))分析流通到外周血的細(xì)胞中表達(dá)多種細(xì)胞表面抗原的細(xì)胞的數(shù)目。在分析中，使用與在多能干細(xì)胞表面表達(dá)的五種抗原-CD 34，c-kit，CD 10，Sca-1和CD140a中的每一種抗原反應(yīng)的抗體。
首先，通過以上方法濃縮的組A到組C的CD 45-陰性和Ter 119-陰性細(xì)胞全部回收，每一組的細(xì)胞等分3份，用于以下分析(以下稱為“分開的細(xì)胞”)首先，每一組中分開的細(xì)胞400×g室溫離心10分鐘，懸浮于20微升含有10％血清的DMEM培養(yǎng)基(Life Technologies生產(chǎn))，然后加入10微升FITC標(biāo)記的抗-鼠CD 34抗體(BD PharMingen生產(chǎn))和10微升PE標(biāo)記抗-鼠c-kit抗體(BD PharMingen生產(chǎn))，冰上避光反應(yīng)30分鐘。DMEM培養(yǎng)基洗滌后，使用FACS Calibur(BectonDickinson生產(chǎn))檢測FITC和PE的熒光強(qiáng)度，測定表達(dá)抗原的細(xì)胞數(shù)目。結(jié)果，CD 34-陽性細(xì)胞的數(shù)目在小鼠組A平均為46.7，在小鼠組B平均為35.3，在小鼠組C平均為9.3，而c-kit-陽性細(xì)胞的數(shù)目在小鼠組A平均為31.3，小鼠組B平均為13.5，在小鼠組C平均為10.7。
然后，每一組的分開的細(xì)胞與10微升PE標(biāo)記的抗鼠Sca-1抗體(BD Pharmingen生產(chǎn))和10微升兔抗CD 10抗體(Santa CruzBiotechnology生產(chǎn))冰上反應(yīng)30分鐘，DMEM培養(yǎng)基洗滌，與10微升FITC標(biāo)記的抗兔Ig抗體(BD PharMingen生產(chǎn))反應(yīng)，使用FACS分別通過測定FITC和PE強(qiáng)度分析CD 10-陽性細(xì)胞和Sca 1-陽性細(xì)胞的數(shù)目。結(jié)果，CD 10-陽性細(xì)胞的數(shù)目在小鼠組A中平均為18.7，小鼠組B中平均為9.8，小鼠組C中平均為1.7。
Sca-1-陽性細(xì)胞的數(shù)目在小鼠組A中平均為18.7，小鼠組B中平均為11.8，小鼠組C中平均為1.7。
進(jìn)一步的，每一組分開的細(xì)胞與10微升鼠抗-CD 140a抗體(BDPharMingen生產(chǎn))冰上反應(yīng)30分鐘，DMEM培養(yǎng)基洗滌，與10微升FITC標(biāo)記的抗鼠Ig抗體(BD PharMingen生產(chǎn))反應(yīng)，使用FACS通過測定FITC強(qiáng)度分析CD 140a-陽性細(xì)胞的數(shù)目。結(jié)果，CD 140a-陽性細(xì)胞的數(shù)目在小鼠組A中平均為19.3，小鼠組B中平均為6.3，小鼠組C中平均為4.7。
以上結(jié)果表明G-CSF可以流通不僅僅造血干細(xì)胞，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，而且流通多能干細(xì)胞到外周血。
實(shí)施例2.通過施用G-CSF流通到外周血中的CD 45-陰性，Ter119-陰性和CD 13-陽性細(xì)胞數(shù)目改變準(zhǔn)備包含5只小鼠的組D，包含5只小鼠的組E，與實(shí)施例1相似，連續(xù)5天施用兩種不同試劑。具體的，在組D的小鼠中，八周齡的五只雄性Balb/c小鼠(Nippon SLC)每只每天皮下注射10微克的G-CSF(Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd生產(chǎn)，商品名Neu-Up)，連續(xù)5天。在組E的小鼠中，八周齡的五只雄性Balb/c小鼠每只每天皮下注射200微升的PBS(磷酸鹽緩沖鹽)(pH7.4)(Life Technologies生產(chǎn))，連續(xù)5天。
最后一次施用試劑的次日，組D和組E的每一只小鼠用乙醚麻醉，從眼動(dòng)脈收集1.2毫升外周血，置于事先有100單位肝素鈉(TakedaChemical industries生產(chǎn))的管中，然后加入與收集血同樣量的用于稀釋的0.9％的NaCl，其鋪在1.4毫升Nyco Prep 1.077 Animal(DaiichiPure Chemicals Co.，Ltd.生產(chǎn))上，室溫600×g離心30分鐘。收集懸浮于界面的單核細(xì)胞層，用1毫升PBS混合，室溫400×g離心15分鐘。除去上清液，沉淀的單核細(xì)胞懸浮于250微升MACS緩沖液[含0.5％BSA(牛血清白蛋白)的PBS]中，在冰上與70微升小鼠CD 45微珠(Miltenyi Biotec生產(chǎn))和30微升Ter-119微珠(Miltenyi Biotec生產(chǎn))反應(yīng)15分鐘。往反應(yīng)溶液中加入4毫升MACS緩沖液，混合物300×g離心10分鐘，然后除去上清液，沉淀懸浮于400微升MACS緩沖液中。懸浮的細(xì)胞通過分離柱MS(Miltenyi Biotec生產(chǎn))以除去CD 45-陽性和Ter 119-陽性細(xì)胞，然后濃縮在外周血中含有的CD 45-陰性和Ter 119-陰性細(xì)胞。
在濃縮的CD 45-陰性和Ter 119-陰性細(xì)胞中，使用確定了在多能干細(xì)胞表面表達(dá)，作為指示物的CD 13，使用FACS Calibur(BetonDickinson)分析CD-13表達(dá)的細(xì)胞的數(shù)目。首先，通過以上方法濃縮的CD 45-陰性和Ter 119-陰性細(xì)胞400×g室溫離心10分鐘，懸浮于20微升含有10％血清的DMEM培養(yǎng)基(Life Technologies生產(chǎn))中，然后加入10微升PE-標(biāo)記的抗-鼠CD13抗體(BD PharMingen生產(chǎn))和10微升Per CP-標(biāo)記的抗-鼠CD 45抗體(BD PharMingen生產(chǎn))，反應(yīng)在冰上避光進(jìn)行30分鐘。DMEM培養(yǎng)基洗滌后，使用FACSCalibur(Becton Dickinson生產(chǎn))測定熒光強(qiáng)度，分析抗原表達(dá)的細(xì)胞的數(shù)目。結(jié)果，CD 45-陰性，Ter 119-陰性和CD 13-陽性單核細(xì)胞的數(shù)目在小鼠組D中平均為29.5，小鼠組E中平均為11.9。結(jié)果表明G-CSF抗原流通不僅僅造血干細(xì)胞，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，而且還能流通多能干細(xì)胞到外周血。
實(shí)施例3.施用G-CSF流通到外周血的細(xì)胞的特性(1)通過施用G-CSF流通到外周血的細(xì)胞移植到用X射線照射的小鼠中通過把細(xì)胞移植到小鼠中分析施用G-CSF流通到外周血的細(xì)胞的特性。
GFP基因整合于身體所有細(xì)胞并且GFP基因表達(dá)的十周齡的小鼠(C57BL/6，×129株的F4)分為包含3只小鼠的組F，包含1只小鼠的組G，以下試劑施用于每一只小鼠。具體的，對(duì)于組F，每只小鼠每天皮下注射10微克的G-CSF(Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd生產(chǎn)，商品名Neu-Up)，連續(xù)5天。對(duì)于組G，每只小鼠每天皮下注射200微升PBS(pH7.4)(Life Technologies生產(chǎn))，連續(xù)5天。
最后一次施用試劑的次日，組F和組G的每一只小鼠用乙醚麻醉，從眼靜脈收集外周血，置于事先有肝素鈉(Takeda Chemical industries生產(chǎn))的管中，回收的外周血通過一個(gè)100-微升的細(xì)胞濾器(BectonDickinson生產(chǎn))。至于組G，切除股骨，附著股骨的肌肉用剪刀截?cái)?，這樣整個(gè)股骨暴露出來，然后用剪刀剪去兩端。連著Thermo生產(chǎn)的27G針，并且含有PBS的注射針的前端插入股骨膝關(guān)節(jié)側(cè)的截?cái)喽耍ㄟ^把PBS吹入試管收集骨髓，將收集的骨髓細(xì)胞通過一個(gè)100微升的細(xì)胞濾器(Becton Dickinson生產(chǎn))。
如下把收集的外周血或骨髓從尾靜脈注入C57BL/6小鼠而進(jìn)行移植。
首先，準(zhǔn)備八周齡的C57BL/6小鼠(Nippon Claire)，從尾靜脈注射的前一天，使用X-光照射儀(Hitachi Medico生產(chǎn))，用劑量為12Gy的X-光照射小鼠。那些小鼠分為組H，組I，組J和組K。組H的每一只小鼠從其尾靜脈移植300微升取自組F小鼠的外周血；組I的每一只小鼠從其尾靜脈移植300微升取自組G小鼠的外周血；組J的每一只小鼠從其尾靜脈移植3×106個(gè)取自組G小鼠的骨髓細(xì)胞；組K的小鼠不進(jìn)行移植。
結(jié)果，在組I和組K中，所有的小鼠從移植開始7到10天內(nèi)死亡，然而，組H和組J，小鼠移植后八周仍存活。然而，骨髓移植的組J的一些小鼠，記錄到外觀和行為異常，例如，毛發(fā)出現(xiàn)，皮膚長瘡，它們行走時(shí)朝頭部傾斜，行走不自然。移植施用G-CSF的小鼠的外周血的組H，記錄到外觀和行為無異常。
結(jié)果表明，通過施用G-CSF，有能力分化成組織例如皮膚的干細(xì)胞流通到小鼠的外周血中。
(2)解剖細(xì)胞移植的小鼠將(1)中獲得的組H小鼠解剖并且灌注和固定，每個(gè)器官都切除。
具體的，小鼠通過腹膜內(nèi)注射Nembutal(DainipponPharmaceutical Co.，Ltd.生產(chǎn))進(jìn)行麻醉，整個(gè)身體用70％乙醇潤濕，提起股皮膚，從膝到大腿根的皮膚用剪子切開并打開，暴露出股動(dòng)脈和靜脈。用絲制的縫線(Natsume Seisakusho Co.，Ltd生產(chǎn))結(jié)扎股動(dòng)脈和靜脈，從結(jié)扎端切斷大腿。從此處切去脛骨，用剪子除去連著脛骨的肌肉，暴露出整個(gè)脛骨，用剪子剪去兩端。連著Thermo生產(chǎn)的23G針，并且含有PBS的注射針的前端插入脛骨膝關(guān)節(jié)側(cè)的截?cái)喽?，通過把PBS吹入試管收集骨髓。
另一方面，小鼠經(jīng)剖腹和胸廓切開，暴露出心臟，帶翼的Thermo生產(chǎn)的25G靜脈注射針插入左心室，切掉右心耳，流入20毫升PBS，灌注整個(gè)身體。收集從心臟溢出的血液作為外周血裝在裝有100單位肝素鈉(Takeda Chemical industries Inc.生產(chǎn))的管中。
所有PBS流出后，通過同樣操作流入20毫升固定溶液[4％PFA(多聚甲醛)，PBS]進(jìn)行固定。
然后，切除肺和氣管，20毫升的裝有連著由Thermo生產(chǎn)的surflow內(nèi)針(20G)的導(dǎo)管，含有用PBS稀釋2倍的OCT(最適割開溫度)化合物(Miles生產(chǎn))的注射器插入氣管，導(dǎo)管前端和氣管用絲制的縫線(Natsume Seisakusho Co.，Ltd.生產(chǎn))連接，用PBS稀釋兩倍的10毫升OCT溶液通過氣管注入肺。注入后，肺切成幾平方毫米的塊，用OCT化合物包被，將其用干冰冷凍的異戊烷冷凍。
別的器官也從小鼠切除，浸入固定溶液[4％PFA(多聚甲醛)，PBS]中，4℃，2小時(shí)，用PBS漂洗，浸入高蔗糖溶液[20％蔗糖，PBS]中，4℃過夜，第二天切成幾平方毫米的塊，用OCT化合物包被，將其用干冰冷凍的異戊烷冷凍。
使用恒冷切片機(jī)把冷凍的組織切成10微米厚的片，貼附于包被有APS(Matsunami生產(chǎn))的載玻片，干燥以制備冷凍切片。
在以上提及的操作中制備的外周血用相同量的0.9％NaCl稀釋，鋪在1.4毫升Nyco Prep 1.077Animal(Daiichi Pure Chemicals Co.，Ltd生產(chǎn))上，室溫600×g離心30分鐘。收集懸浮于界面的單核細(xì)胞層，用1毫升PBS混合，室溫400×g離心15分鐘。除去上清液，沉淀的單核細(xì)胞懸浮于0.5毫升PBS，使用FACS Calibur(Becton Dickinson生產(chǎn))測定在外周單核細(xì)胞中GFP-陽性細(xì)胞數(shù)目的比率。結(jié)果，GFP-陽性細(xì)胞數(shù)目的比率是90.3％。
至于骨髓細(xì)胞，也用同樣方式，使用FACS Calibur測定GFP-陽性細(xì)胞數(shù)目的比率，GFP-陽性細(xì)胞占87.3％。
切除的每個(gè)器官制備成的冷凍切片在Zeiss生產(chǎn)的熒光顯微鏡Axiophot 2下觀察，證實(shí)在身體幾乎所有的器官，例如肺，心臟，肝，腦，胃，皮膚，小腸，大腸，骨骼肌，胰臟，脾，腎，氣管中都存在GFP-陽性細(xì)胞，特別是在腦中，例如嗅球，脈絡(luò)叢區(qū)域觀察到GFP-陽性細(xì)胞。結(jié)果表明小鼠的通過施用G-CSF動(dòng)員到外周血的干細(xì)胞功能是修復(fù)身體的多種組織。
(3)通過免疫染色鑒定GFP-陽性細(xì)胞的特性如下將(2)中制備的冷凍切片用多種抗體染色，觀察GFP-陽性細(xì)胞的特性首先，多種器官的組織切片用抗細(xì)胞角蛋白抗體免疫染色。細(xì)胞角蛋白是上皮細(xì)胞的標(biāo)記。
皮膚切除制備成的冷凍切片置于載玻片上，載玻片浸于PBS中5分鐘，重復(fù)3次。載玻片洗滌后，浸于用PBS稀釋，終濃度為10毫克/毫升的蛋白酶K(Gibco BRL生產(chǎn))中15分鐘。PBS洗滌一次后，與固定溶液[4％PFA(多聚甲醛)，PBS]室溫反應(yīng)15分鐘。PBS洗滌2次后，浸于封閉溶液[10％豬血清(Dako生產(chǎn))，PBS]中室溫1小時(shí)，與用PBS稀釋50倍，含有1.5％豬血清的一抗溶液[單克隆鼠抗-人細(xì)胞角蛋白，Clones AE1/AE3]室溫反應(yīng)一小時(shí)。PBS洗滌4次后，與用PBS稀釋800倍，含有1.5％豬血清的二抗溶液[Cy3-結(jié)合的Affini純的羊抗-鼠IgG(H+L)](Seikagaku公司生產(chǎn))室溫反應(yīng)1小時(shí)。PBS再洗滌4次后，含有DAPI的Vectashield封固劑(Vector Laboratories生產(chǎn))滴入切片，用蓋玻片封閉，在Zeiss生產(chǎn)的熒光顯微鏡Axiophot2下觀察。因?yàn)橛^察到GFP-陽性和細(xì)胞角蛋白-陽性細(xì)胞，表明用于移植的通過G-CSF流通的外周血細(xì)胞中含有能夠趨向皮膚和分化為上皮細(xì)胞的干細(xì)胞。
大腸的冷凍切片相似地使用抗-細(xì)胞角蛋白抗體染色，在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果觀察到GFP-陽性和細(xì)胞角蛋白-陽性細(xì)胞。結(jié)果表明，用于移植的通過G-CSF動(dòng)員的外周血細(xì)胞中含有趨向大腸和分化為上皮細(xì)胞能力的干細(xì)胞。
小腸的冷凍切片相似地使用抗-細(xì)胞角蛋白抗體和CD 45抗體染色，CD 45是血細(xì)胞的標(biāo)記。在熒光顯微鏡下觀察，觀察到細(xì)胞角蛋白-陽性和CD 45-陰性細(xì)胞。結(jié)果表明，用于移植的通過G-CSF動(dòng)員的外周血細(xì)胞中含有趨向小腸和分化為除血細(xì)胞之外細(xì)胞能力的干細(xì)胞。
然后，使用抗-CD 45抗體，多種器官經(jīng)免疫染色。
肺切除制備的冷凍切片置于載玻片上，浸于PBS中洗滌5分鐘，重復(fù)3次。載玻片浸于Dako Biotin封閉系統(tǒng)(1)溶液(Dako生產(chǎn))中室溫10分鐘，用PBS洗滌2次，浸于Dako Biotin封閉系統(tǒng)(2)溶液(Dako生產(chǎn))中室溫10分鐘，用PBS再洗滌2次。
然后，載玻片浸于封閉溶液[10％豬血清(Dako生產(chǎn))，PBS]中室溫1小時(shí)，與用PBS稀釋100倍，含有1.5％豬血清的一抗溶液[Biotin抗—鼠CD 45(LCA，Ly 5)](BD Pharmingen生產(chǎn))室溫反應(yīng)1小時(shí)。PBS洗滌4次后，與用PBS稀釋到終濃度為5微克/毫升，含有1.5％豬血清的二抗溶液(streptavidin，Alexa Fluor 594 conjugate)(MolecularProbe生產(chǎn))室溫反應(yīng)1小時(shí)。PBS再洗滌4次后，含有DMPI的Vectashield封固劑(Vector Laboratories生產(chǎn))滴入切片，用蓋玻片封閉，在熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果觀察到GFP-陽性和CD 45-陰性細(xì)胞。結(jié)果表明，在用于移植的通過G-CSF動(dòng)員的外周血細(xì)胞中含有趨向肺和分化為除血細(xì)胞之外細(xì)胞能力的干細(xì)胞。
相似地肝的冷凍切片使用抗-CD 45抗體染色，在熒光顯微鏡下觀察，觀察到GFP-陽性和CD 45-陰性細(xì)胞。結(jié)果表明，用于移植的通過G-CSF動(dòng)員的外周血細(xì)胞中含有趨向肝和分化為除血細(xì)胞之外細(xì)胞能力的干細(xì)胞。
心臟，腦，胃，皮膚，小腸，大腸，骨骼肌和胰腺的冷凍切片相似地使用抗-CD 45抗體染色，在熒光顯微鏡下觀察，在每個(gè)組織中都觀察到GFP-陽性和CD 45-陰性細(xì)胞。結(jié)果表明，用于移植的通過G-CSF動(dòng)員的外周血細(xì)胞中含有趨向心臟，腦，胃，皮膚，小腸，大腸，骨骼肌和胰腺和分化為除血細(xì)胞之外細(xì)胞能力的干細(xì)胞。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明涉及流通能夠分化為多種組織的多能干細(xì)胞到外周血的試劑，通過含有該試劑的組織再生進(jìn)行治療的試劑，使用試劑進(jìn)行多能干細(xì)胞回收的方法，和誘導(dǎo)以上方法制備的多能干細(xì)胞分化為體細(xì)胞的方法。
權(quán)利要求
1.一種將多能干細(xì)胞從組織流通到外周血的試劑，其含有作為活性成分的的細(xì)胞因子，所述的細(xì)胞因子選自活化單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子，活化的單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和表達(dá)G-CSF受體的造血細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑，其中細(xì)胞因子是選自G-CSF，M-CSF，GM-CSF和IL-8的細(xì)胞因子。
3.如權(quán)利要求1所述的試劑，其中活化單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子選自M-CSF和GM-CSF。
4.如權(quán)利要求1所述的試劑，其中表達(dá)G-CSF受體的造血細(xì)胞是粒細(xì)胞或中性粒細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求4所述的試劑，其中中性粒細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子是IL-8。
6.如權(quán)利要求1到5中任意一項(xiàng)所述的試劑，其中細(xì)胞因子是化學(xué)修飾的細(xì)胞因子。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑，其中細(xì)胞因子由聚亞烷基二醇化學(xué)修飾。
8.如權(quán)利要求1到7中任意一項(xiàng)所述的試劑，其中組成細(xì)胞因子的氨基酸序列中的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸被去除，取代，插入或增加，并且細(xì)胞因子有大體上相同的活性。
9.如權(quán)利要求1所述的試劑，其中組織是骨髓。
10.如權(quán)利要求1所述的試劑，其中多能干細(xì)胞選自CD45-陰性細(xì)胞，血型糖蛋白A-陰性細(xì)胞和oct3/4-陽性細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求1所述的試劑，其中多能干細(xì)胞選自CD45-陰性和血型糖蛋白A-陰性細(xì)胞，oct3/4-陽性和CD45-陰性細(xì)胞，oct3/4-陽性和血型糖蛋白A-陰性細(xì)胞，CD45-陰性和血型糖蛋白A-陰性和oct3/4-陽性細(xì)胞與CD45-陰性和CD34-陰性細(xì)胞。
12.如權(quán)利要求1所述的試劑，其中多能干細(xì)胞選自CD34-陽性，CD117-陽性和CD140-陽性細(xì)胞，CD10-陽性和CD66e-陽性細(xì)胞，CD13-陽性和CD49b-陽性細(xì)胞與CD45-陽性和CD34-陽性細(xì)胞。
13.一種回收流通為外周血干細(xì)胞的多能干細(xì)胞的方法，其中使用如權(quán)利要求1到12中任意一項(xiàng)所述的試劑。
14.一種組織再生的方法，其中使用如權(quán)利要求13中所述的方法獲得的多能干細(xì)胞。
15.使用如權(quán)利要求1到12中任意一項(xiàng)所述的試劑把流通為外周血干細(xì)胞的的多能干細(xì)胞分化為體細(xì)胞的方法。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中體細(xì)胞是選自紅細(xì)胞，白細(xì)胞，血小板，纖維母細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，骨骼肌細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞，心肌細(xì)胞，神經(jīng)元，神經(jīng)膠質(zhì)，少突膠質(zhì)細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞，皮膚表皮細(xì)胞，皮膚真皮細(xì)胞，毛囊細(xì)胞，骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞，破骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，氣管上皮細(xì)胞，肺泡細(xì)胞，胃腸道上皮細(xì)胞，口腔上皮細(xì)胞，成釉質(zhì)細(xì)胞，成牙本質(zhì)細(xì)胞，肝細(xì)胞，肝星形細(xì)胞，膽囊上皮細(xì)胞，胰臟內(nèi)分泌細(xì)胞，胰臟外分泌細(xì)胞，腎管狀細(xì)胞，腎血管小球細(xì)胞，輸尿管上皮細(xì)胞，泌尿道上皮細(xì)胞，垂體內(nèi)分泌細(xì)胞，甲狀腺細(xì)胞，腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞，腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞，前列腺細(xì)胞，乳腺細(xì)胞，視細(xì)胞，色素上皮細(xì)胞，角膜細(xì)胞，淚腺細(xì)胞和鼓室細(xì)胞的細(xì)胞。
17.一種組織再生治療試劑，其含有作為活性成分的的細(xì)胞因子，所述的細(xì)胞因子選自活化單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子，活化的單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和表達(dá)G-CSF受體的造血細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中細(xì)胞因子選自G-CSF，M-CSF，GM-CSF和IL-8。
19.如權(quán)利要求17所述的治療試劑，其中活化單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子選自M-CSF和GM-CSF。
20.如權(quán)利要求17所述的治療試劑，其中表達(dá)G-CSF受體的造血細(xì)胞是粒細(xì)胞或中性粒細(xì)胞。
21.如權(quán)利要求20所述的治療試劑，其中中性粒細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子是IL-8。
22.如權(quán)利要求17到21中任意一項(xiàng)所述的治療試劑，其中細(xì)胞因子是化學(xué)修飾的細(xì)胞因子。
23.如權(quán)利要求22所述的治療試劑，其中細(xì)胞因子由聚亞烷基二醇化學(xué)修飾。
24.如權(quán)利要求17到23中任意一項(xiàng)所述的治療試劑，其中組成細(xì)胞因子的氨基酸序列中的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸被去除，取代，插入或增加，并且細(xì)胞因子有大體上相同的活性。
25.如權(quán)利要求17到24所述的治療試劑，其中組織選自神經(jīng)組織，皮膚組織，心血管組織，呼吸組織，骨骼組織，結(jié)締組織，血液，免疫組織，腸組織，口腔組織，肝組織，胰腺組織，泌尿組織，內(nèi)分泌腺和感覺組織。
26.如權(quán)利要求25所述的治療試劑，其中神經(jīng)組織選自中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)。
27.如權(quán)利要求25所述的治療試劑，其中皮膚組織選自皮膚表皮，皮膚真皮，皮下組織。
28.如權(quán)利要求25所述的治療試劑，其中心血管組織選自心臟，動(dòng)脈血管，靜脈血管，毛細(xì)血管和淋巴管。
29.如權(quán)利要求25所述的治療試劑，其中呼吸組織選自鼻粘膜，氣管和氣囊。
30.如權(quán)利要求25所述的治療試劑，其中骨骼組織選自骨，軟骨，關(guān)節(jié)，韌帶，跟腱。
31.如權(quán)利要求25所述的治療試劑，其中結(jié)締組織選自脂肪組織和纖維組織。
32.如權(quán)利要求25所述的治療試劑，其中血組織選自紅細(xì)胞，白細(xì)胞和血小板。
33.如權(quán)利要求25所述的治療試劑，其中免疫組織選自淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞，粒細(xì)胞，胸腺，淋巴結(jié)和脾。
34.如權(quán)利要求25所述的治療試劑，其中腸組織選自唾液腺，胃，十二指腸，小腸，大腸，直腸和肛門。
35.如權(quán)利要求25所述的治療試劑，其中口腔組織選自口腔粘膜，牙和舌。
36.如權(quán)利要求25所述的治療試劑，其中肝臟組織選自肝和膽囊。
37.如權(quán)利要求25所述的治療試劑，其中胰腺組織選自胰腺的外分泌腺和胰腺的內(nèi)分泌腺。
38.如權(quán)利要求25所述的治療試劑，其中泌尿組織選自腎單位，腎泌尿小管，腎髓質(zhì)，輸尿管，膀胱和泌尿道。
39.如權(quán)利要求25所述的治療試劑，其中內(nèi)分泌腺選自垂體，甲狀腺，周圍神經(jīng)。
40.如權(quán)利要求25所述的治療試劑，其中感覺系統(tǒng)選自味蕾，嗅上皮，視網(wǎng)膜，角膜，晶狀體，內(nèi)耳和周圍神經(jīng)系統(tǒng)。
全文摘要
從組織(骨髓，皮膚，骨骼肌，等等)中流通多能干細(xì)胞到外周血的藥物；使用從組織(骨髓，皮膚，骨骼肌，等等)中流通多能干細(xì)胞到外周血的藥物治療心力衰竭，肝衰竭，腎衰竭，神經(jīng)變性疾病(帕金森氏病，阿爾茨海默氏病)，心血管疾病，腦血管疾病，脊髓損傷，關(guān)節(jié)炎，骨質(zhì)疏松，糖尿病等等的方法。
文檔編號(hào)A61P17/00GK1615149SQ0282726
公開日2005年5月11日 申請日期2002年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月19日
發(fā)明者佐藤秀尚, 山田陽史, 安藤博司, 橫山裕美, 櫻田一洋 申請人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會(huì)社