專利名稱：肺炎鏈球菌疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種改進(jìn)的肺炎鏈球菌(streptococcus pneumonia)疫苗。
背景技術(shù)：
不到2歲的兒童對大多數(shù)多糖疫苗不產(chǎn)生免疫應(yīng)答，所以必須通過與蛋白載體進(jìn)行化學(xué)綴合產(chǎn)生免疫原性的多糖。將多糖(一種不依賴T的抗原)偶合到蛋白(一種依賴T的抗原)，能賦予多糖胸腺依賴的性質(zhì)，包括同種型轉(zhuǎn)換、親和力成熟和記憶誘導(dǎo)。
然而，重復(fù)應(yīng)用多糖-蛋白綴合物或?qū)⒍嗵?蛋白綴合物聯(lián)合成多價疫苗可能有問題。例如，已有報(bào)道對一定劑量范圍內(nèi)以破傷風(fēng)類毒素作為蛋白載體的b型流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)多糖(PRP)疫苗進(jìn)行試驗(yàn)，該疫苗與(游離的)TT和肺炎鏈球菌多糖-TT綴合物疫苗按標(biāo)準(zhǔn)嬰兒計(jì)劃同時免疫。當(dāng)肺炎鏈球菌疫苗的劑量增加時，對Hib綴合物疫苗中的PRP多糖部分的免疫應(yīng)答降低，這表明很可能是使用相同的載體蛋白而引起的對多糖的免疫干擾(Dagan等，Infect Immun.(1998)；662093-2098)。
已證實(shí)載體-蛋白的劑量對蛋白自身的體液免疫應(yīng)答上的影響是多方面的。據(jù)報(bào)道在人嬰兒體內(nèi)增加四價破傷風(fēng)類毒素綴合物的劑量會導(dǎo)致對破傷風(fēng)載體的應(yīng)答下降(Dagan等，見上文)。對聯(lián)合疫苗效應(yīng)進(jìn)行傳統(tǒng)分析認(rèn)為是載體誘導(dǎo)了表位抑制，這一點(diǎn)還沒有完全弄清楚，但認(rèn)為是由于載體蛋白過量引起的(Fattom，Vaccine 17126(1999))。這似乎導(dǎo)致對載體蛋白產(chǎn)生應(yīng)答的B-細(xì)胞和對多糖產(chǎn)生應(yīng)答的B-細(xì)胞產(chǎn)生對Th細(xì)胞的競爭。假如對載體蛋白產(chǎn)生應(yīng)答的B-細(xì)胞占優(yōu)勢，將得不到足夠的Th細(xì)胞為對多糖特異性的B-細(xì)胞提供幫助。然而，觀察到的免疫效果是不一致的，載體蛋白的總量在一些例子中增加免疫應(yīng)答，在另一些例子中降低免疫應(yīng)答降低。
因此，將多種多糖綴合物聯(lián)合制成單一的、有效的疫苗制劑還存在技術(shù)上的困難。本發(fā)明的目的就是開發(fā)一種改進(jìn)的多種血清型肺炎鏈球菌多糖綴合物疫苗的制劑。
發(fā)明概述一方面，本發(fā)明涉及一種改進(jìn)的肺炎鏈球菌疫苗，它包括與2種或更多的載體蛋白綴合的11種或更多的不同肺炎鏈球菌血清型多糖，其中，血清型6B、19F和23F的多糖綴合到第一載體蛋白上，其余的血清型綴合到1或2種第二載體蛋白上，并且第二載體蛋白不同于第一載體蛋白。優(yōu)選地，將血清型6B和2 3F綴合到第一載體蛋白上，更優(yōu)選，只有血清型6B綴合到第一載體蛋白上。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，一種第二載體蛋白為流感嗜血桿菌蛋白D。本發(fā)明可進(jìn)一步包括肺炎鏈球菌表面蛋白，優(yōu)選來自PhtX家族、CbpX家族、CbpX截?cái)囿w家族和Ply。
在一個相關(guān)方面，本發(fā)明涉及一種通過應(yīng)用本發(fā)明的多糖綴合物疫苗誘導(dǎo)嬰兒產(chǎn)生抗肺炎鏈球菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答的改進(jìn)的方法。
在另一個相關(guān)方面，本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答的改進(jìn)的方法，該方法為通過應(yīng)用本發(fā)明多糖綴合的疫苗和肺炎鏈球菌表面蛋白預(yù)防或改善老年人感染肺炎鏈球菌(pneumococcal)(例如，肺炎)和/或兒童感染肺炎鏈球菌(例如，中耳炎)的方法。
附圖簡要說明

圖1為通過多糖免疫后的幾何平均倍增測定的12種不同肺炎鏈球菌多糖引起的免疫應(yīng)答的圖示。
圖2顯示了單獨(dú)用1.0μgPS-PD或與四價、五價、七價或十價疫苗聯(lián)合對成年大鼠免疫后第14天(Post II)的IgG幾何平均濃度[GMC](μg/ml)和調(diào)理素滴度。
圖3顯示了11種血清型和PD(蛋白D)的GMC對一維上6B和23F的劑量和第二維上9種其它血清型劑量的變化。對于所有的血清型和PD，趨勢總是相同的。增加6B和23F的劑量，對其余的綴合物的免疫應(yīng)答有顯著降低的效應(yīng)，即使那些綴合物的劑量不變。
圖4顯示了11種血清型免疫后幼大鼠IgG的GMC對PD總量(即總計(jì)各劑量時每種成分的所有PD的和)的曲線圖?？傏厔菔钱?dāng)載體蛋白的劑量增加時，對所有多糖和PD本身的IgG應(yīng)答將降低。該總趨勢為載體誘導(dǎo)的表位抑制的強(qiáng)有力的證據(jù)。然而，曲線并不是單調(diào)性的，這一事實(shí)表明了存在另外的似乎依賴血清型6B的因素。
發(fā)明詳述本發(fā)明通過對多種與不同的或交替的載體蛋白綴合的多糖進(jìn)行正確地選擇提供一種多血清型肺炎鏈球菌多糖綴合物疫苗的最佳制劑。本發(fā)明是建立在以下事實(shí)的基礎(chǔ)之上的一種血清型的多糖綴合物可能影響或調(diào)節(jié)其它(血清型)多糖綴合物的免疫應(yīng)答。因此，通過將具有不同免疫調(diào)節(jié)性能的不同的肺炎鏈球菌多糖置于可選擇的載體蛋白上可制備一種最佳的多價多糖綴合物疫苗。
本發(fā)明是建立在以下幾種因素相結(jié)合的基礎(chǔ)之上的(i)多糖的劑量-反應(yīng)曲線通常呈鐘形(高斯型曲線)，對于每種多糖(即血清型或結(jié)構(gòu))在某一特定的劑量處有最大反應(yīng)；(ii)在人和動物模型中某些多糖的免疫原性隨年齡進(jìn)行調(diào)節(jié)；(iii)將肺炎鏈球菌多糖綴合物聯(lián)合制成多價制劑通常會引起疫苗中一種或多種成分的免疫原性降低；(iv)然而，某些多糖綴合物聯(lián)合時免疫應(yīng)答會增強(qiáng)；(v)當(dāng)與共同的的載體蛋白綴合時，血清型6B和23F和較低程度的19F多糖能調(diào)節(jié)其它多糖(即其它血清型)的免疫應(yīng)答。
因此，本發(fā)明是建立在所有上述復(fù)雜關(guān)系的基礎(chǔ)上的，與先前的研究相反，本發(fā)明得出這樣的結(jié)論多糖-蛋白綴合物的鐘形劑量-反應(yīng)曲線(即該曲線指示最大的免疫原性)受其它多糖的數(shù)量和特性的影響很大。這種免疫效應(yīng)稱為調(diào)節(jié)。而且還發(fā)現(xiàn)多糖綴合物的調(diào)節(jié)是通過共同的載體蛋白進(jìn)行的。也就是，少數(shù)多糖綴合物可調(diào)節(jié)不同的多糖綴合物引起的免疫應(yīng)答，只要它們有共同的載體蛋白。因此如上所述，本發(fā)明是建立在通過對多糖的正確選擇來確定哪些多糖將被綴合到相同或不同的載體蛋白上。
下面進(jìn)行更具體的說明(a)某些肺炎鏈球菌多糖(PS)綴合時隨年齡有很大調(diào)節(jié)，尤其是血清型6B、14、19F和23F。血清型8、12和18C隨年齡有較小的調(diào)節(jié)。血清型1、2、3、4、5、7F和9V不隨年齡進(jìn)行調(diào)節(jié)(參見圖1)。
此外(b)，與單價的多糖綴合物相比，將多糖1、3、6B、9V和23F聯(lián)合成11價的多價制劑用時所引起的免疫應(yīng)答增強(qiáng)。與此相反，血清型14在多價制劑中引起的免疫應(yīng)答顯示出明顯的降低(參見圖2)。
而且(c)，如果與共同的載體蛋白綴合，血清型6B和23F，和較低程度的19F的多糖能調(diào)節(jié)其它多糖(即其它血清型)引起的免疫應(yīng)答(參見圖3和4)。
因此，在一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括的多糖6B、19F和23F與一種(第一)載體蛋白綴合，其余的多糖與另外的(或第二)載體蛋白綴合，條件是第一載體蛋白與第二載體蛋白不同。優(yōu)選地，多糖6B和23F與相同的載體蛋白綴合，其余的多糖與第二載體蛋白綴合。更優(yōu)選地，只有多糖6B與初級(第一)載體蛋白綴合，其余的多糖與第二載體蛋白綴合。
第一載體蛋白不必限于具體的實(shí)施方案中的蛋白，但可包括DT(白喉類毒素)、TT(破傷風(fēng)類毒素)、DTcrm197(DT突變體)、其它DT點(diǎn)突變體(例如在Glu-148位置的突變，參見US4,709,017，WO93/25210，WO95/33481)、FragC(TT的片段)、Ply(肺炎鏈球菌溶血素及其突變體)、PhtA、PhtB、PhtD、PhtE(下文對PhtA-E進(jìn)行更詳細(xì)的描述)、OmpC(源自腦膜炎奈氏球菌(N.meningitidis))、PorB(源自腦膜炎奈氏球菌)等蛋白或它們的片段。優(yōu)選為DT、TT或crm197。更優(yōu)選為DT。
第二載體蛋白也選自PD(流感嗜血桿菌蛋白D-例如參見EP 0594 610 B)、DT、TT、DTcrm197、FragC、Ply、PhtA、PhtB、PhtD、PhtE、OmpC、PorB等。可以考慮在本發(fā)明中可使用兩種不同的第二載體蛋白，但優(yōu)選只使用一種第二載體蛋白。
肺炎鏈球菌多糖數(shù)可為11種不同的血清型(或“V”，價)至23種不同的血清型(23V)。優(yōu)選為11、13或16種不同的血清型。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，疫苗可包括綴合的肺炎鏈球菌多糖和未綴合的肺炎鏈球菌多糖。優(yōu)選多糖血清型的總數(shù)小于或等于23。例如，本發(fā)明包括11種綴合的血清型和12種未綴合的多糖。類似地，該疫苗可包括13或16種綴合的多糖和分別10或7種未綴合的多糖。
本發(fā)明的多價肺炎鏈球菌疫苗優(yōu)選選自血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F，盡管可以理解一種或兩種其它的血清型能被取代，這依賴于疫苗接受者的年齡和疫苗應(yīng)用的地理位置。例如，11價疫苗可包括選自血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的多糖。13價用于兒科(嬰兒)的疫苗也可包括血清型6A和19A，而13價用于老年人的疫苗可包括血清型8和12F。
優(yōu)選地，將本發(fā)明的鏈球菌多糖解聚(篩分)為100-500kD的最終范圍。因而，本發(fā)明的另一特征是載體蛋白與多糖的比例。就綴合的多糖而言，至少七種血清型中載體蛋白與多糖的比值(P/PS)大于0.5(即＞0.5直至1.7)(w/w)。優(yōu)選其比值為□0.70-1.5(例如至少血清型6B、19F、23F)。該范圍更優(yōu)選為0.8-1.5((例如至少血清型6B、19F、23F)。對于本發(fā)明的一種或多種血清型(例如血清型4)，最優(yōu)選P/PS的比值至少接近1(例如0.9-1.1)。
本發(fā)明的一個相關(guān)的特征是對于每種血清型而言，未綴合的(游離的)載體蛋白的水平小于載體蛋白總量的10％，未綴合的多糖的水平小于多糖總量的10％。
多糖可用任何已知的方法連接到載體蛋白上(例如，Likhite申請的美國專利4,372,945，Armor等申請的美國專利4,474,757和Jennings等申請的美國專利4,356,170)。優(yōu)選進(jìn)行CDAP綴合化學(xué)反應(yīng)(參見WO95/08348)。
在CDAP反應(yīng)中，優(yōu)選使用氰化試劑1-氰基-二甲基氨基吡啶鎓四氟硼酸鹽(CDAP)來合成多糖-蛋白綴合物。氰化反應(yīng)在相對溫和的條件下完成，這樣能避免堿性敏感的多糖水解。這種合成能直接與載體蛋白偶合。
多糖溶解在水或鹽水溶液中。將CDAP溶解于乙腈并立即加入到多糖溶液中。CDAP與多糖的羥基反應(yīng)形成氰酸酯?；罨蠹尤胼d體蛋白。賴氨酸的氨基與活化的多糖反應(yīng)形成異脲共價鍵。偶合反應(yīng)發(fā)生后，加入大量過量的甘氨酸猝滅剩余的活化官能團(tuán)。然后，讓產(chǎn)物通過凝膠滲透柱以除去未反應(yīng)的載體蛋白和剩余的試劑。
在另一實(shí)施方案中肺炎鏈球菌綴合物可與其它的多糖聯(lián)合使用，例如，A、C、W、Y型腦膜炎奈氏球菌，B型流感嗜血桿菌，金黃色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、B族鏈球菌、A族鏈球菌等。優(yōu)選為腦膜炎奈氏球菌(A型和/或C型為最優(yōu)選)和/或B型流感嗜血桿菌。另外，本發(fā)明的肺炎鏈球菌綴合物可與病毒抗原例如滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒(poliovirus)(IPV)、流感病毒(滅活的、裂解的亞單位(例如F，G抗原))等聯(lián)合使用。在另一可選方案中，肺炎鏈球菌綴合物可伴隨DTPa(白喉、破傷風(fēng)、非細(xì)胞性百日咳)疫苗和DTPa聯(lián)合疫苗(DTPa+/-乙型肝炎病毒(Hepatitis B)+/-IPV+/-B型流感嗜血桿菌)應(yīng)用。優(yōu)選的DTPa疫苗含25Lf或更低的白喉類毒素。這類額外的抗原可以液體的形式或凍干的形式存在。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種通過應(yīng)用安全和有效量的本發(fā)明的疫苗在嬰兒(0-2歲)體內(nèi)產(chǎn)生(保護(hù)性的)免疫應(yīng)答的改進(jìn)方法。本發(fā)明其它實(shí)施方案包括提供用于藥物的本發(fā)明的抗原性肺炎鏈球菌綴合物組合物和本發(fā)明的肺炎鏈球菌綴合物在制備預(yù)防(或治療)肺炎鏈球菌疾病的藥物中的用途。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種預(yù)防或改善嬰兒肺炎鏈球菌感染(例如中耳炎)的改進(jìn)的疫苗，其中該疫苗是通過向本發(fā)明的肺炎鏈球菌綴合物組合物中加入肺炎鏈球菌蛋白制得的。該肺炎鏈球菌蛋白優(yōu)選來自PhtX家族(見下文)，可向其中再加入其它蛋白。這類額外的肺炎鏈球菌蛋白可包括CbpX、CbpX截?cái)囿w(truncates)和Ply(見下文)，條件是所選擇的肺炎鏈球菌表面蛋白不同于第一和第二載體蛋白。聯(lián)合疫苗中還能包括一種或多種粘膜炎莫拉氏菌(Moraxellacatarrhalis)蛋白抗原。因此，本發(fā)明涉及一種在嬰兒體內(nèi)產(chǎn)生抗中耳炎的(保護(hù)性的)免疫應(yīng)答的改進(jìn)的方法。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及一種在老年人群(在本發(fā)明的上下文中，如果患者是年齡為50歲或更老就認(rèn)為是老年人，通常為55歲以上，更通常的是60歲以上)中產(chǎn)生(保護(hù)性的)免疫應(yīng)答的改進(jìn)的方法，該方法是通過應(yīng)用安全和有效量的本發(fā)明的疫苗來實(shí)現(xiàn)的，優(yōu)選結(jié)合一種、兩種或可能三種肺炎鏈球菌表面蛋白，條件是所選的肺炎鏈球菌表面蛋白不同于第一和第二載體蛋白。該肺炎鏈球菌蛋白優(yōu)選來自PhtX家族(見下文)，其中PhtX族可加入了Ply和任選的CbpX或CbpX截?cái)囿w(見下文)。
本發(fā)明的肺炎鏈球菌蛋白是表面暴露的，至少在肺炎鏈球菌的部分生活周期內(nèi)是表面暴露的，或者是肺炎鏈球菌分泌或釋放的蛋白。優(yōu)選地，本發(fā)明的蛋白選自下列種類，如具有II型信號序列基序LXXC(其中X為任何氨基酸，例如聚組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX))的蛋白、膽堿結(jié)合蛋白(CbpX)、具有I型信號序列基序的蛋白(例如Sp101)、具有LPXTG基序的蛋白(其中X為任何氨基酸，如Sp128、Sp130)和毒素(例如Ply)。在這些種類(或基序)中優(yōu)選的例子是下列蛋白或其免疫功能的等同體。
優(yōu)選地，本發(fā)明的免疫原性組合物包括一種或多種蛋白，所述蛋白選自聚組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX)、膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)、CbpX截?cái)囿w、LytX家族、LytX截?cái)囿w、CbpX截?cái)囿w-LytX截?cái)囿w嵌合蛋白(或融合物)、肺炎鏈球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Sp128、Sp101、Sp130、Sp125和Sp133。然而，如果CbpX為PspC，則第二蛋白不能是PspA或PsaA。更優(yōu)選地，該免疫原性組合物包括2種或多種選自聚組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX)、膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)、CbpX截?cái)囿w、LytX家族、LytX截?cái)囿w、CbpX截?cái)囿w-LytX截?cái)囿w嵌合蛋白(或融合物)、肺炎鏈球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA和Sp128的蛋白。更優(yōu)選地，該免疫原性組合物包括2種或多種選自聚組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX)、膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)、CbpX截?cái)囿w和肺炎鏈球菌溶血素(Ply)的蛋白。
Pht(聚組氨酸三聯(lián)體)家族包括蛋白PhtA、PhtB、PhtD和PhtE。該家族的特征是脂化序列、被脯氨酸富集區(qū)分開的兩個功能區(qū)和若干組氨酸三聯(lián)體(可能參與金屬或核苷的結(jié)合或酶的活性)、(3-5)卷曲螺旋區(qū)、保守的N端和異源的C端。它存在于所有受試的肺炎鏈球菌菌株中。在其它的鏈球菌和萘瑟氏菌屬也發(fā)現(xiàn)了同源蛋白。該家族優(yōu)選的成員包括PhtA、PhtB和PhtD。更優(yōu)選地包括PhtA或PhtD。最優(yōu)選地包括PhtD。然而，應(yīng)當(dāng)理解術(shù)語PhtA、B、D和E是指具有下面的引文中公開的序列的蛋白和其天然存在的(和人為的)變體，該變體與引用的蛋白至少具有90％的序列相同性。優(yōu)選至少有95％的相同性，最優(yōu)選有97％的相同性。
關(guān)于PhtX蛋白，在WO98/18930中公開了PhtA，也稱為Sp36。如上所述，它是一種屬于聚組氨酸三聯(lián)體家族的蛋白并具有II型信號基序LXXC。在WO00/37105公開了PhtD，也稱為Sp036D。如上所述，它也是一種屬于聚組氨酸三聯(lián)體家族的蛋白并具有II型信號基序LXXC。在WO00/37105中公開了PhtB，也稱為Sp036B。PhtB家族的另一成員是C3-降解的多肽，它在WO00/17370中被公開。該蛋白也屬于聚組氨酸三聯(lián)體家族的蛋白并具有II型信號基序LXXC。優(yōu)選的免疫功能等同體是WO98/18930中公開的Sp42蛋白。PhtB截?cái)囿w(約79kD)在WO99/15675中公開，也被認(rèn)為是PhtX家族的成員。PhtE也稱為BVH-3，在WO00/30299中公開。
關(guān)于膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)，該家族的成員最初被鑒定為肺炎鏈球菌蛋白，它能經(jīng)膽堿親和層析純化。所有的膽堿結(jié)合蛋白都是與細(xì)胞壁的磷壁酸和與膜相關(guān)的脂磷壁酸的磷酰膽堿部分非共價結(jié)合。在結(jié)構(gòu)上，整個家族具有若干共同的區(qū)域，雖然這類蛋白的精細(xì)特性(氨基酸序列、長度等)可能有差異。一般，膽堿結(jié)合蛋白包括N端區(qū)(N)、保守的重復(fù)區(qū)(R1和/或R2)、脯氨酸富集區(qū)(P)和保守的膽堿結(jié)合區(qū)(C)(由多個重復(fù)單元構(gòu)成，約構(gòu)成該蛋白的一半)。本申請中所用到的術(shù)語“膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)”選自WO97/41151中定義的膽堿結(jié)合蛋白、PbcA、SpsA、PspC、CbpA、CbpD和CbpG。CbpA在WO97/41151中公開。CbpD和CbpG在WO00/29434中公開。PspC在WO97/09994中公開。PbcA在WO98/21337中公開。SpsA為WO98/39450中公開的膽堿結(jié)合蛋白。膽堿結(jié)合蛋白優(yōu)選選自CbpA、PbcA、SpsA和PspC。
另一優(yōu)選的實(shí)施方案為CbpX截?cái)囿w，其中“CbpX”在上面定義，“截?cái)囿w”是指缺少50％或更多的膽堿結(jié)合區(qū)(C)的CbpX蛋白。這類蛋白優(yōu)選地缺少整個膽堿結(jié)合區(qū)。更優(yōu)選地，這類蛋白截?cái)囿w缺少(i)膽堿結(jié)合區(qū)和(ii)保留脯氨酸富集區(qū)和至少一個重復(fù)區(qū)(R1或R2)。更優(yōu)選地，截?cái)囿w具有2個重復(fù)區(qū)(R1和R2)。這類優(yōu)選的實(shí)施方案的例子有WO99/51266或WO99/51188中列舉的NR1xR2、NR1xR2P、R1xR2P和R1xR2，不過，其它缺少類似膽堿結(jié)合區(qū)的膽堿結(jié)合蛋白也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
LytX家族是與細(xì)胞溶解有關(guān)的膜相關(guān)蛋白。N末端結(jié)構(gòu)域包括膽堿結(jié)合結(jié)構(gòu)域，然而LytX家族沒有上述CbpA家族中所發(fā)現(xiàn)的所有特征，因而對本發(fā)明而言，LytX族與CbpX族被認(rèn)為是截然不同的。與CbpX家族相反，LytX蛋白族的C-端結(jié)構(gòu)域含有催化的結(jié)構(gòu)域。該家族包括LytA、B和C。關(guān)于LytX家族，Ronda等在Eur J Biochem，164621-624(1987)公開了LytA。LytB也稱為Sp46，在WO98/18930中公開。LytC也稱為Sp91，也在WO98/18930中公開。該家族中優(yōu)選的成員為LytC。
另一優(yōu)選的實(shí)施方案為LytX截?cái)囿w，其中“LytX”按上述定義且“截?cái)囿w”是指缺少50％或更多的膽堿結(jié)合區(qū)的LytX蛋白。這類蛋白優(yōu)選地缺少整個膽堿結(jié)合區(qū)。本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方案為CbpX截?cái)囿w-LytX截?cái)囿w的嵌合蛋白(或融合物)。優(yōu)選地，它包括CbpX的NR1×R2(或R1xR2)和LytX的C-端部分(Cterm，即缺少膽堿結(jié)合結(jié)構(gòu)域)(例如LytCCterm或Sp91 Cterm)。更優(yōu)選地，CbpX選自CbpA、PbcA、SpsA和PspC。更優(yōu)選地為CbpA。更優(yōu)選地，LytX為LytC(也稱為Sp91)。本發(fā)明的另一優(yōu)選的實(shí)施方案為缺少膽堿結(jié)合結(jié)構(gòu)域(C)的PspA或PsaA截?cái)囿w，該截?cái)囿w與LytX表達(dá)為融合蛋白。優(yōu)選地，LytX為LytC。
肺炎鏈球菌溶血素為具有截然不同的細(xì)胞溶解(溶血的)和補(bǔ)體激活活性的多功能毒素(Rubins等Am.Respi.Cit Care Med，1531339-1346(1996))。該毒素不由肺炎鏈球菌分泌，但由肺炎鏈球菌受自溶素的影響而溶解后釋放。例如，它的作用包括刺激人單核細(xì)胞產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子、抑制人呼吸道上皮纖毛的搏動和降低嗜中性粒細(xì)胞殺細(xì)菌的活性和遷移。肺炎鏈球菌溶血素最明顯的作用是溶解紅細(xì)胞，它包括與膽固醇結(jié)合。因?yàn)樗嵌舅兀栽隗w內(nèi)應(yīng)用之前必須是解毒的(即當(dāng)給予適于保護(hù)的劑量時對人是無毒的)。野生型或天然的肺炎鏈球菌溶血素的表達(dá)和克隆屬于本領(lǐng)域的已知的技術(shù)。例如，參見Walker等(Infect Immun，551184-1189(1987))，Mitchell等(Biochim Biophys Acta，100767-72(1989))和Mitchell等(NAR，184010(1990))。Ply的解毒可用化學(xué)方法進(jìn)行，例如，經(jīng)過GMBS處理、或福爾馬林或戊二醛處理或二者結(jié)合處理。這些方法為本領(lǐng)域用于許多毒素的已知方法。另外，ply能用遺傳學(xué)方法解毒。因此，本發(fā)明包括肺炎鏈球菌蛋白的衍生物，例如可以是突變的蛋白。術(shù)語“突變的”在本文中是指用已知用于定點(diǎn)誘變的技術(shù)或任何其它常規(guī)方法發(fā)生缺失、添加或替代了一個或多個氨基酸的分子。例如，如上所述，ply蛋白的突變體可能發(fā)生變化以致于它失去了生物活性但還保留了其免疫原性的表位，例如，參見WO90/06951、Berry等(Infect Immun，67981-985(1999))和WO99/03884。應(yīng)當(dāng)理解本文中所用的術(shù)語“Ply”是指適合于藥用的(即無毒的)突變的或解毒的肺炎鏈球菌溶血素。
至于PsaA和PspA，兩者均為本領(lǐng)域所已知。例如，Berry&Paton在Infect Immun 1996.12月；64(12)5255-62中已描述了PsaA和其跨膜缺失變異體。PspA及其跨膜缺失變異體也在如US5804193，WO92/14488和WO99/53940中作了描述。
WO00/76540公開了Sp128和Sp130。Sp125為具有LPXTG(其中X為任何氨基酸)的細(xì)胞壁錨著基序的肺炎鏈球菌表面蛋白的一個例子。已發(fā)現(xiàn)屬于具有該基序的這類肺炎鏈球菌表面蛋白的任何蛋白均可用于本發(fā)明，因此也是本發(fā)明的蛋白。Sp125本身在WO98/18930中公開，也稱為ZmpB-一種鋅金屬蛋白酶。Sp101在WO98/06734中公開(其中它具有訪問號#y85993)。其具有I型信號序列的特征。Sp133在WO98/06734中公開(其中它具有訪問號#y85992)。它也具有I型信號序列的特征。
可包括于聯(lián)合疫苗(尤其是預(yù)防中耳炎的疫苗)中的優(yōu)選的粘膜炎莫拉氏菌蛋白抗原的例子為OMP106[WO 97/41731(Antex)和WO96/34960(PMC)]；OMP21；LbpA和/或LbpB[WO98/55606(PMC)]；TbpA和/或TbpB[WO97/13785和WO97/32980(PMC)]；CopB[Helminen ME等(1993)Infect.Immun.612003-2010]；UspA1和/或UspA2[WO93/03761(University of Texas)]；OmpCD；HasR(PCT/EP99/03824)；PilQ(PCT/EP99/03823)；OMP85(PCT/EP00/01468)；lipo06(GB9917977.2)；lipo10(GB9918208.1)；lipo11(GB9918302.2)；lipo18(GB9918038.2)；P6(PCT/EP99/03038)；D15(PCT/EP99/03822)；OmplA1(PCT/EP99/06781)；Hly3(PCT/EP99/03257)；和OmpE?？砂ㄓ诼?lián)合疫苗(尤其是預(yù)防中耳炎的疫苗中的)不能分型的流感嗜血桿菌抗原的例子包括絲束蛋白[(US5766608-Ohio State Research Foundation)]及其含肽的融合體[例如LB1(f)肽融合體；US5843464(OSU)或WO99/64067]；OMP26[WO97/01638(Cortecs)]；P6[EP281673(State University ofNew York)]；TbpA和/或TbpB；Hia；Hsf；Hin47；Hif；Hmw1；Hmw2；Hmw3；Hmw4；Hap；D15(WO94/12641)；P2和P5(WO94/26304)。
前面已經(jīng)提到，本發(fā)明的蛋白也可有益地聯(lián)合。優(yōu)選的聯(lián)合包括但不限于PhtD+NR1xR2，PhtD+NR1xR2P，PhtD+NR1xR2-Sp91Cterm嵌合或融合蛋白，PhtD+Ply，PhtD+Sp128，PhtD+PsaA，PhtD+PspA，PhtA+NR1xR2，PhtA+NR1xR2P，PhtA+NR1xR2-Sp91Cterm嵌合或融合蛋白，PhtA+Ply，PhtA+Sp128，PhtA+PsaA，PhtA+PspA，NR1xR2+LytC，NR1xR2P+PspA，NR1xR2+PspA，NR1xR2P+PsaA，NR1xR2+PsaA，NR1xR2+Sp128，R1xR2+LytC，R1xR2+PspA，R1xR2+PsaA，R1xR2+Sp128，R1xR2+PhtD，R1xR2+PhtA。優(yōu)選地，NR1xR2+/-P(或R1xR2+/-P)源自CbpA或PspC。更優(yōu)選地它源自CbpA。其它的聯(lián)合包括3種蛋白的聯(lián)合，如PhtD+NR1xR2P+Ply，PhtD+NR1xR2+Ply，PhtA+NR1xR2+Ply和PhtA+NR1xR2P+Ply。
本發(fā)明的疫苗優(yōu)選添加佐劑。合適的佐劑包括鋁鹽如氫氧化鋁凝膠(明礬)或磷酸鋁，但也可為鈣鹽、鎂鹽、鐵鹽或鋅鹽，或者可以是?；睦野彼帷⒒蝓；奶?、陽離子或陰離子衍生化的多糖、或聚磷腈的不溶性懸浮液。當(dāng)用鋁鹽作佐劑時，鋁鹽與多糖的比例小于10∶1(w/w)。優(yōu)選地小于8∶1且大于2∶1。
優(yōu)選所選的佐劑是對TH1型應(yīng)答優(yōu)選的誘導(dǎo)劑。這種高水平的Th1-型細(xì)胞因子傾向于誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的對特定抗原的免疫應(yīng)答，而高水平的Th2-型細(xì)胞因子傾向于誘導(dǎo)對抗原的體液免疫應(yīng)答。
重要的是記住Th1和Th2-型免疫應(yīng)答的區(qū)分并不是絕對的。事實(shí)上，個體將支持一種描述為主要為Th1型或主要為Th2型的免疫應(yīng)答。然而，通常根據(jù)Mosmann和Coffman對鼠CD4+ve T細(xì)胞克隆的描述(Mosmann，T.R.Coffman，R.L.(1989)TH1和TH2細(xì)胞不同方式的淋巴因子分泌導(dǎo)致不同的功能性質(zhì)different patterns oflymphokine secret ion lead to different functionalpropertes)。Annual Review of Immunology，7，第145-173頁)來考慮細(xì)胞因子家族是比較方便的。傳統(tǒng)上認(rèn)為，Th1型應(yīng)答與T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生INF-γ和IL-2細(xì)胞因子相關(guān)。其它常與Th1型免疫應(yīng)答誘導(dǎo)直接相關(guān)的細(xì)胞因子不由T細(xì)胞產(chǎn)生，如TL-12。與此相反，Th2型應(yīng)答與IL-4、IL-5、IL-6、IL-10的分泌有關(guān)。促進(jìn)以Th1型應(yīng)答為主的合適佐劑系統(tǒng)包括單磷酰類脂A或其衍生物，尤其是3-脫氧-?；?單磷酰類脂A(3D-MPL)(關(guān)于其制備參見GB2220211A)；和單磷酰類脂A(優(yōu)選3-脫氧-?；?單磷酰類脂A)與鋁鹽(例如磷酸鋁或氫氧化鋁)或水包油乳劑結(jié)合物。在這樣的結(jié)合中，在同一特定的結(jié)構(gòu)中包含抗原和3D-MPL，這樣使得抗原性的和免疫刺激的信號更有效地傳遞。研究表明3D-MPL能進(jìn)一步增強(qiáng)明礬吸附的抗原的免疫原性[Thoelen等Vaccine(1998)16708-14；EP689454-B1]。
增強(qiáng)系統(tǒng)包括單磷酰類脂A與皂苷衍生物的聯(lián)合，尤其是WO94/00153中公開的QS21與3D-MPL的聯(lián)合，或WO96/33739中公開的較少反應(yīng)原性的聯(lián)合，其中QS21被膽固醇猝滅。WO95/17210中描述了一種的特別有效的佐劑制劑，該制劑在水包油乳劑中包含QS21、3D-MPL和生育酚，是優(yōu)選的制劑。優(yōu)選地，該疫苗額外地包含皂苷，更優(yōu)選地包括QS21。該制劑也可包括水包油乳劑和生育酚(WO95/17210)。本發(fā)明也提供生產(chǎn)疫苗制劑的方法，該方法包括將本發(fā)明的蛋白與藥學(xué)上可接受的賦形劑如3D-MPL混合。含寡核苷酸的未甲基化的CpG(WO96/02555)也是TH1型應(yīng)答優(yōu)選的誘導(dǎo)劑且適合用于本發(fā)明。
本發(fā)明的疫苗制劑可通過將所述疫苗經(jīng)全身或粘膜途徑應(yīng)用來用于保護(hù)或治療對感染敏感的哺乳動物。這些應(yīng)用可包括經(jīng)肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)或皮下注射；或經(jīng)粘膜應(yīng)用到口腔/飲食、呼吸道、泌尿生殖道中。優(yōu)選鼻內(nèi)應(yīng)用疫苗用來治療肺炎或中耳炎(因?yàn)樗芨行У刈柚狗窝祖溓蚓?jīng)鼻咽輸入，因而能在最初始階段減少感染)。雖然本發(fā)明的疫苗可以單一的劑量應(yīng)用，但也可將其成分在同一時間或在不同的時間共同應(yīng)用(例如，為了使免疫應(yīng)答相互達(dá)到最佳的協(xié)同作用，肺炎鏈球菌多糖可與疫苗的細(xì)菌蛋白成分在同一時間分開應(yīng)用或在疫苗的細(xì)菌蛋白成分應(yīng)用1-2周后應(yīng)用)。關(guān)于共同應(yīng)用，任選的Th1佐劑可存在于任何或所有不同應(yīng)用形式，然而優(yōu)選存在于與疫苗的細(xì)菌蛋白成分的聯(lián)合中。除單一的應(yīng)用途徑外，還可使用2種不同的應(yīng)用途徑。例如，多糖可經(jīng)IM(或ID)應(yīng)用，細(xì)菌蛋白可經(jīng)IN(或ID)應(yīng)用。此外，本發(fā)明的疫苗引發(fā)劑量可經(jīng)IM應(yīng)用，加強(qiáng)劑量可經(jīng)IM或IN(不含鋁)應(yīng)用。
各疫苗劑量中綴合物抗原的量應(yīng)選擇為在通常的疫苗中能誘導(dǎo)免疫保護(hù)性應(yīng)答而又不引起明顯的有害副作用的量。此量將隨使用的具體免疫原和使用的方式而變化。通常，要求每個劑量包括0.1-100μg多糖，對于多糖綴合物為0.1-50μg多糖，優(yōu)選1-10μg(其中1-5μg為優(yōu)選的范圍和2-5μg為更優(yōu)選的范圍)。然而，對于血清型6B，優(yōu)選的劑量包括3-10μg多糖，更優(yōu)選5-10μg多糖綴合物。
疫苗中蛋白抗原的含量通常為1-100μg，優(yōu)選的范圍為5-50μg，最常用的范圍為5-25μg。在初始接種疫苗后，受治療者可接受間隔足夠的一次或幾次加強(qiáng)免疫。
Vaccine Design(“the subunit and adjuvant approach”(edsPowell M.F.&Newman M.J.)(1995)Plenum Press New York)對疫苗制劑作了總的論述。Fullerton申請的美國專利4,235,877中描述了脂質(zhì)體中的被囊化。
本發(fā)明的疫苗可以貯存在溶液溶液中或凍干。當(dāng)為液體時，本發(fā)明的疫苗通常以0.5ml/劑量的形式貯存。疫苗優(yōu)選地吸附在鋁鹽上。假如該溶液被凍干，優(yōu)選含有糖如蔗糖、乳糖或海藻糖。更優(yōu)選的是將疫苗凍干并在使用前臨時重建。鏈球菌多糖的凍干可能產(chǎn)生更穩(wěn)定的組合物(疫苗)且在存在3D-MPL和缺少以鋁為基礎(chǔ)的佐劑時可能產(chǎn)生更高的抗體滴度。
雖然本發(fā)明的疫苗可經(jīng)任何途徑應(yīng)用，但本發(fā)明的一個實(shí)施方式是將所述疫苗應(yīng)用到皮膚中(ID)。人的皮膚包括外層的“角質(zhì)”外皮，稱為角質(zhì)層，它覆蓋在表皮上。在表皮下是所謂的真皮層，它依次覆蓋皮下的組織。研究者已顯示將疫苗注射到皮膚內(nèi)尤其是真皮內(nèi)，能刺激免疫應(yīng)答，這也可能與許多額外的好處有關(guān)。本發(fā)明優(yōu)選形式是將本文中所述的疫苗皮內(nèi)接種。
皮內(nèi)注射的常規(guī)技術(shù)“Mantoux氏程序”包括下列步驟清潔皮膚，然后用一只手使其伸展，使細(xì)規(guī)格針(26-31規(guī)格)的斜面朝上，以10-15°角將針插入。一旦針的斜面插入，降低針管并前推，同時輕壓使其在皮膚下抬高。然后將液體緩慢注入，這樣便形成一個大皰或腫塊，接著將針緩慢撤下。
最近，已描述了為液體試劑應(yīng)用到皮膚內(nèi)或穿透皮膚而專門設(shè)計(jì)的裝置，例如WO99/34850和EP1092444中描述的裝置，還有例如WO01/13977；US5,480,381，US5,599,302，US5,334,144，US5,993,412，US5,649,912，US5,569,189，US5,704,911，US5,383,851，US5,893,397，US5,466,220，US5,339,163，US5,312,335，US5,503,627，US5,064,413，US5,520,639，US4,596,556，US4,790,824，US4,941,880，US4,940,460，WO97/37705和WO97/13537中描述的快速注射裝置。另外，皮內(nèi)應(yīng)用疫苗制劑的方法可包括使用傳統(tǒng)的注射器和針或?yàn)闆_擊輸送固體疫苗而設(shè)計(jì)的裝置(WO99/27961)，或經(jīng)皮貼劑(WO97/48440；WO98/28037)；或應(yīng)用于皮膚的表面(經(jīng)皮或經(jīng)皮輸送WO98/20734；WO98/28037)。
當(dāng)將本發(fā)明的疫苗應(yīng)用到皮膚，更準(zhǔn)確地說是應(yīng)用到真皮內(nèi)時，疫苗為小體積的液體形式，尤其為約0.05ml-0.2ml之間的體積。
本發(fā)明皮膚內(nèi)或皮內(nèi)應(yīng)用的疫苗中抗原的含量可以與肌內(nèi)的疫苗中常用的劑量相似(見上面)。然而，經(jīng)皮膚或皮內(nèi)應(yīng)用的疫苗的特點(diǎn)是制劑可為“低劑量”。因此，在“低劑量”的疫苗中蛋白抗原優(yōu)選為少至0.1-10μg，優(yōu)選每劑量0.1-5μg；且多糖(優(yōu)選為綴合的)抗原的量為0.01-1μg，優(yōu)選為每劑量在0.01-0.5μg多糖之間。
本文中所使用的術(shù)語“皮內(nèi)輸送”是指疫苗輸送到皮膚的真皮部位。然而，疫苗不一定只局限于真皮內(nèi)。真皮是指位于人皮膚表面下約1.0-約2.0mm的皮膚層，但不同的個體之間及身體的不同部位有一定量的差異。一般認(rèn)為往皮膚的表面向下進(jìn)入1.5mm就到達(dá)真皮層。真皮位于角質(zhì)層及表面的表皮和下面的皮下層之間。跟輸送方式有關(guān)，疫苗可能最終只位于或主要位于真皮內(nèi)，或者它最終可能分布于表皮和真皮內(nèi)。
為了更好地理解本發(fā)明，列舉了下面的實(shí)施例。這些實(shí)施例只是用來作為示范說明本發(fā)明，而決不能認(rèn)為是限制本發(fā)明的范圍的。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例實(shí)施例1免疫應(yīng)答隨年齡進(jìn)行調(diào)節(jié)的多糖的測定內(nèi)部收集或經(jīng)外部來源收集對免疫前和免疫后(2周-3月)多糖(未綴合的)人抗體滴度數(shù)據(jù)。圖1顯示了每種血清型多糖的免疫原性與研究對象的平均年齡之間的關(guān)系，其中多糖的免疫原性是由用多糖免疫后的抗體滴度的幾何平均倍增(GFI)來測量的。幾何平均倍增的對數(shù)與年齡之間的線性關(guān)系能顯示免疫應(yīng)答是否隨年齡進(jìn)行調(diào)節(jié)。如圖1所示，血清型6、14、19和23與年齡之間呈明顯的相關(guān)(p＜0.001)，而血清型8、12和18與年齡之間的相關(guān)不明顯(0.05＜p＜0.2)。最后，血清型1、2、3、4、5、7和9與年齡之間沒有明顯的相關(guān)(p＞或＝0.20)。
實(shí)施例2測定多種哺乳動物的抗體應(yīng)答的一般方法用ELISA方法測試血清中的抗肺炎鏈球菌多糖的IgG抗體，該測試方法是建立在1994-1996的聯(lián)合的CDC/WHO專題學(xué)術(shù)討論會建議的達(dá)成共識的人血清測試的基礎(chǔ)之上(WHO 1996，Plikatis等J.Clin.Mierobiol 382043(2000))。簡而言之，購自ATCC(Rockyille，Md，20852)的純化的英膜多糖，以磷酰緩沖鹽水(PBS)中的25μg/ml在高結(jié)合的微量滴定板(Nunc Maxisorp)上4℃包被過夜。用胎牛血清(FCS)封閉微量滴定板，37℃1小時。用20μg/ml細(xì)胞壁多糖(Statens Serum Institute，Copenhagen)和10％FCS在室溫下預(yù)溫育血清樣品30分鐘以中和抗該抗原的抗體。用同樣的方法處理對照用的血清89SF(由Dr.C Frasch惠贈，USFDA)，包括在每個盤上。然后將樣品用PBS中的10％FCS在微量培養(yǎng)板上稀釋兩倍，并在室溫下攪拌1小時至平衡。洗滌后，用過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgGFc單克隆抗體(HP6043-HRP，Stratech Scientific Ltd)在室溫下攪拌1小時平衡微量培養(yǎng)板，其中抗人IgG Fc單克隆抗體以PBS中的10％FCS按1∶4000的比例稀釋。以ELISA方法使用JacksonImmuno Labortories Inc.生產(chǎn)的過氧化物酶綴合的親和純(AffiniPure)山羊抗大鼠IgG(H+L)(編碼112-035-003)在1∶5000時測量大鼠IgG。對于每種血清型，滴定曲線用SoftMax Pro進(jìn)行邏輯對數(shù)而以標(biāo)準(zhǔn)血清為對照。除了6B和23F使用的濃度為20μg/ml外，用來包被ELISA板的多糖的濃度都固定在10μg/ml。此外，當(dāng)測試6B血清型的抗血清時，使用100％的胎牛血清作為稀釋液，因?yàn)樵撗逍蛢A向于非特異性的ELISA反應(yīng)。對于獼猴血清的血清型3血清學(xué)使用mHSA共混(comix)以包被抗原。用4mg OPD(Sigma)/10mlpH4.5的0.1M檸檬酸緩沖液和14μl H2O2在暗處室溫下15分鐘顯色。用50μl的HCl終止反應(yīng)，在490nm處讀取相對于650nm處的光密度值。參考標(biāo)定曲線的滴定點(diǎn)確定IgG濃度，其中標(biāo)準(zhǔn)曲線是應(yīng)用SoftMax Pro軟件計(jì)算的4-參數(shù)的邏輯對數(shù)方程作出的。
為獲得抗體的絕對濃度(μg/ml)，用兩種獨(dú)立的方法標(biāo)定混合的對照用的抗血清。對于大鼠抗血清，使用Zollinger和Boslego的方法(1981)來測定11種血清型，將4種血清型該方法的測定值與免疫沉淀獲得的測定值比較。發(fā)現(xiàn)兩種方法的測定結(jié)果非常一致。對于鼠血清，使用純化的單克隆抗體IgG1，通過corollary應(yīng)答來確定其活性濃度PVW1999。在這種情況下發(fā)現(xiàn)有較好的一致。對于獼猴血清，測試表明所用的抗IgG試劑與人和獼猴的IgG發(fā)生同等的反應(yīng)；因而應(yīng)用標(biāo)定的人對照血清89SF(購自US FDA)作為ELISA中的對照。
測定鼠和大鼠抗肺炎鏈球菌多糖的IgG的ELISA方法除了下面的區(qū)別外相似。使用本實(shí)驗(yàn)室制的多糖包被ELISA板，對于6B和23F血清型為PBS中的20μg/ml，對于14和19F血清型為PBS中的10μg/ml。用Jackson Immuno Labortories Inc.生產(chǎn)的過氧化物酶綴合的親和純(AffiniPure)山羊抗小鼠IgG(H+L)和親和純(AffiniPure)山羊抗大鼠IgG(H+L)來測定結(jié)合的IgG.HP6043-HRP與人和獼猴純化的IgG發(fā)生同等的反應(yīng)，所以該試劑可用作獼猴抗血清，且用89SF作為對照血清。
用于人和獼猴血清學(xué)的對照血清為89SF，由Dr.Carl Frasch惠贈。已公開了普遍接受的抗10種肺炎鏈球菌血清型的IgG、IgA和IgM的人對照血清89SF基于重量的濃度標(biāo)定值，該值用2種不同的方法標(biāo)定的。
蛋白的ELISA與多糖的ELISA方法相似，但有下面的改變。蛋白在PBS中的2.0μg/ml時包被過夜。血清樣品用含10％的胎牛血清和0.1％的聚乙烯醇的PBS稀釋。用Sigma過氧化物酶綴合的山羊親和純化的抗人IgG Fc抗體(對照品A-2290)測定結(jié)合的人抗體。為標(biāo)定人和獼猴血清學(xué)的蛋白反應(yīng)，用Sandoglobulin批號069(被發(fā)現(xiàn)含顯著的抗蛋白D抗體)作為對照，并給定其100個ELISA個單位中一任意值。對于鼠和大鼠血清學(xué)，可由直接的抗原包被或抗體捕獲通過corollary應(yīng)答來確定抗體的濃度。
通過對體外調(diào)理素細(xì)胞吞噬進(jìn)行檢測來測試血清殺死活肺炎鏈球菌的能力。用已公開的方案(Romero-Steiner等1997)，和CDC(多實(shí)驗(yàn)室研究的一部分)的Sandy Steiner提供的具體方案修改為調(diào)理素細(xì)胞吞噬的檢測。
可運(yùn)用兩種方法。在方法A中，由CDC提供的肺炎鏈球菌菌株被SB生產(chǎn)菌株取代。其次，HL-60細(xì)胞被新鮮純化的人嗜中性粒細(xì)胞(PMN)取代。以50％的細(xì)菌被殺死所需的血清稀釋度表示結(jié)果。
在方法B中，更嚴(yán)格地按CDC(多實(shí)驗(yàn)室研究的一部分)提供的公開的和具體的標(biāo)準(zhǔn)化的方案(Romero-Steiner 1997，Romero-Steiner2000)進(jìn)行。
簡而言之，分化的HL60細(xì)胞在1000rpm(300xg)的轉(zhuǎn)速下離心，移去培養(yǎng)物上清液。用由HBSS-BSA組成的檢測緩沖液將細(xì)胞再懸浮。如果培養(yǎng)基中存在抗生素，就重復(fù)該操作以確保將抗生素完全移去。
血清樣品事先預(yù)稀釋以便在4種檢測中的檢測體積最適宜。試驗(yàn)表明若在4℃保存，用檢測緩沖液以1∶2稀釋的樣品能產(chǎn)生至少5天穩(wěn)定的調(diào)理素滴度。向微量培養(yǎng)板的圓底孔內(nèi)的25μl檢測緩沖液中加入25μl稀釋的血清。用25μl的體積再進(jìn)行兩倍的系列稀釋以使檢測體積最適宜。
幼兔的補(bǔ)體和肺炎鏈球菌培養(yǎng)物在使用前保存在-70℃下。將活化的HL60細(xì)胞、新鮮解凍的肺炎鏈球菌培養(yǎng)基物和新鮮解凍的幼兔補(bǔ)體按4∶2∶1的體積比渦旋混合。將25μl的該混合物迅速分配到含稀釋的血清的微量培養(yǎng)板的孔中，得到的最終體積為50μl。這樣在每個孔最終的混合物中得到1E5 HL60，150CFU的肺炎鏈球菌和7.1％的補(bǔ)體濃度，除了血清型6B有兩點(diǎn)改變外最終的補(bǔ)體濃度為12.5％且在檢測緩沖液中包含5％FCS以使肺炎鏈球菌在溫育期間達(dá)到生長平衡。微量培養(yǎng)板用5％的CO2在37℃下溫育2小時，同時以210rpm的轉(zhuǎn)速振蕩。
溫育后，從孔中取出20μl等分試樣對肺炎鏈球菌進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。用只含檢測緩沖液不含血清的孔作為空白孔以測定加入到每個孔中的肺炎鏈球菌的精確數(shù)量。每個板上8個空白孔的CFU平均數(shù)用于后面的計(jì)算中。
相對于空白孔平均數(shù)計(jì)算殺死細(xì)菌的百分?jǐn)?shù)。以殺死50％以上肺炎鏈球菌的血清稀釋度倒數(shù)的最大值確定血清樣品的滴度。所測值是以非連續(xù)的滴度8，16，32等報(bào)告的。殺死細(xì)菌的百分?jǐn)?shù)小于50％的樣品以滴度＜8報(bào)告。將觀察到前區(qū)效果(prozone effect)的樣品重復(fù)試驗(yàn)，取第2次試驗(yàn)的結(jié)果。若再一次觀察到前區(qū)效果，則認(rèn)為該結(jié)果無效。這種情況在樣品中的發(fā)生率小于5％。滴度大于1024的樣品以1∶64的稀釋度為起始點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)。
實(shí)施例3肺炎鏈球菌PS-PD綴合物的聯(lián)合在成年大鼠體內(nèi)對免疫原性的影響已觀察到疫苗聯(lián)合成多價制劑可能引起疫苗中一種或多種成分的免疫原性降低。尤其在綴合物疫苗中能觀察到這種情況，稱為載體誘導(dǎo)的表位抑制。引起該抑制的機(jī)理還不是很清楚，但在載體蛋白的劑量較高時易于發(fā)生。
11-價肺炎鏈球菌綴合物疫苗為聯(lián)合疫苗的一個例子。因?yàn)楦鞣N血清型綴合物的聯(lián)合將增加用于免疫的蛋白的總量，所以確定各綴合物疫苗聯(lián)合成多價制劑是否會導(dǎo)致綴合物的免疫原性明顯降低將是重要的。
方案用肺炎鏈球菌多糖蛋白D的綴合物疫苗(參見WO00/56360)單獨(dú)地或在多價制劑中聯(lián)合免疫成年大鼠。每組10只大鼠，28天內(nèi)分兩次免疫各組，在第28天和第42天(第二次免疫后14天)取血測試。
按所述方法測定抗體的濃度。調(diào)理素的滴度按A方法測定。
結(jié)果根據(jù)ELISA測定(圖2)，所有的綴合物均誘導(dǎo)特異性的IgG抗體。在所有的血清中對調(diào)理素的活性(以能殺死50％活肺炎鏈球菌的混合血清的稀釋度之倒數(shù)來確定)進(jìn)行了檢測。
圖2也顯示了單價PS-PD綴合物聯(lián)合后對成年大鼠體內(nèi)免疫原性的影響，這可由II次免疫后第14天的IgG濃度和調(diào)理素滴度來測量。
對所有的樣品進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析以確定聯(lián)合后IgG的濃度是否存在顯著性的差異。只有血清型14在聯(lián)合時ELISA滴度顯示出顯著性的降低。其IgG濃度降低到與其它血清型相似的水平。所有其它的差異均不顯著，但血清型7F的差異接近顯著(p＝0.08)。
血清型1、3、6B、9V和23F聯(lián)合后實(shí)際上顯示為增加。
實(shí)施例4血清型6B和23F劑量的獨(dú)立變化將單個的綴合物疫苗聯(lián)合成多價制劑會導(dǎo)致抗體應(yīng)答的增加或降低。該免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)是血清型依賴性的。為描述對聯(lián)合的11價綴合物疫苗的免疫應(yīng)答的特征，將11價疫苗分成兩組聯(lián)合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)6B和23F為一組，其余的9種價的血清型為一組。
方案用11價的PS-PD肺炎鏈球菌綴合物疫苗以雙重劑量(two-tiereddosage)免疫幼大鼠和成年大鼠，即如表1中所顯示的6B&23F的劑量獨(dú)立于其它9種價的血清型而變化。
表111價PS-PD雙向(Two-Way)劑量制劑

幼OFA大鼠隨機(jī)分配給不同的母親且成長7天時接受第一次免疫。每組10只大鼠分別在第0、14和28天接受3次免疫。于第42天(第III次免疫后第14天)和第56天(第III免疫后第28天)取血。
結(jié)果雙重劑量的三維分析(3D analysis)指示出幼大鼠體內(nèi)由6B-PD和23F-PD引起的免疫調(diào)節(jié)。圖3顯示了11種血清型和PD的GMC對6B和23F的劑量在一維上的變化，及其對其它9種血清型的劑量在第二維上的變化。所有的血清型和PD的變化趨勢相同。增加6B和23F的劑量會引起對其余的綴合物的抗體反應(yīng)顯著降低，即使綴合物的劑量不變。在幼大鼠體內(nèi)這種效應(yīng)相當(dāng)明顯，但對于成年大鼠只能觀察到輕微的變化(沒有顯示)。
圖4顯示了抗綴合物疫苗中每種血清型的抗體濃度是總蛋白D含量的函數(shù)。若載體誘導(dǎo)的表位抑制是疫苗劑量增加后免疫應(yīng)答降低的主要或唯一的原因，則可預(yù)料到這些曲線將會單調(diào)性地下降。波動的函數(shù)表明有一些其它因素影響抗體免疫應(yīng)答。如圖3中顯示的，當(dāng)聯(lián)合血清型6B和23F將劑量分次使用時，可得到平滑的三維(3D)面，這表明6B和23F調(diào)節(jié)對其它血清型的免疫應(yīng)答。圖4血清型6B顯示了單調(diào)性下降的免疫應(yīng)答，因此可以推測出血清型6B的劑量是主要因素，因?yàn)樗c它本身的相互作用總是恒定的因而就只顯示出載體誘導(dǎo)的表位抑制作用。
結(jié)論6B&23F與其余的9種血清型劑量的獨(dú)立變化表明血清型6B&23F對其它的血清型引起的抗體應(yīng)答有影響。每種血清型引起的抗體免疫應(yīng)答隨用于免疫的PD總量的增加而降低，表明存在載體誘導(dǎo)的表位抑制，但由于其關(guān)系曲線不平滑，所以一定存在其它的因素。此外，PD引起的IgG應(yīng)答也隨劑量的增加而降低，這與根據(jù)載體誘導(dǎo)的表位抑制而預(yù)測的結(jié)果相反。綜上所述可得出這樣的結(jié)論綴合物疫苗引起的免疫應(yīng)答存在目前未知的調(diào)節(jié)因素，這一點(diǎn)反映在6B和23F血清型的劑量圖上。
實(shí)施例5血清型6B和23F對免疫的調(diào)節(jié)經(jīng)蛋白載體傳遞的證實(shí)目的顯然綴合物6B和23F的劑量調(diào)節(jié)對多價制劑中其它綴合物引起的抗體應(yīng)答。下面的實(shí)驗(yàn)用來確定幼大鼠體內(nèi)6B&23F-PD(綴合物)相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)是否是由于多糖或多糖蛋白綴合物引起的。
方案綴合物6B&23F-PD或PS(未綴合的)與其它的血清型聯(lián)合成多價制劑，其中6B&23F的劑量為0.01和1.0μg，普通的多糖為1.0μg(非6B&23F綴合物)。
幼OFA大鼠隨機(jī)分配給不同的母親且成長7天時接受第一次免疫。每組10只鼠分別在第0、14和28天接受3次免疫。于第42天(第III次免疫后第14天)取血。
結(jié)果正如前面所觀察到的，增加6B&23F-PD的劑量會降低19F引起的應(yīng)答。當(dāng)PS取代綴合物時，可觀察到19F引起的較高應(yīng)答。
結(jié)論存在1μg的6B和23F綴合物疫苗的劑量足以調(diào)節(jié)多價綴合物疫苗中19F血清型引起的免疫應(yīng)答，然而，普通多糖同樣的劑量沒有影響。由于已經(jīng)確定了人和動物體內(nèi)血清型6B和23F在其引起的免疫應(yīng)答中受調(diào)節(jié)，因此我們可得出這樣的結(jié)論血清型6B和23F的免疫調(diào)節(jié)是由普通的蛋白載體傳遞的。
實(shí)施例6血清型6B的蛋白載體的變化在幼大鼠體內(nèi)劑量為0.1μg時抗6B PS-綴合物的血清轉(zhuǎn)變率低。對能影響綴合物的免疫原性的其它因素進(jìn)行了檢測。這些因素包括材料中碳水化合物與蛋白的比例、所使用的鍵合的具體方法、游離多糖的存在以及所用的具體的載體蛋白。
在幼大鼠或小鼠模型中偶合的化學(xué)方法的改變都不增加6B綴合物的免疫原性。在小鼠模型中使用TT載體似乎會增加免疫原性，但僅在較高劑量時才出現(xiàn)。以初始載體蛋白(蛋白D)/PS為2.5∶1的比例合成綴合物。其它綴合物的合成中初始載體蛋白(蛋白D)/PS的比例為1∶1。
實(shí)施例7臨床評估對本發(fā)明的幾種疫苗制劑正在人體內(nèi)進(jìn)行臨床評估。表2舉例說明了這類疫苗組合物。
表2-肺炎鏈球菌制劑

盡管以上舉例說明了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于本文中公開的明確的教導(dǎo)并保留了下述權(quán)利要求的范圍內(nèi)所有改變的權(quán)利。
權(quán)利要求
1.一種改進(jìn)的肺炎鏈球菌疫苗，包括與2種或更多的載體蛋白綴合的11種或更多的來自不同肺炎鏈球菌血清型的多糖，其中，血清型6B、19F和23F綴合到第一載體蛋白上，其余的血清型綴合到1或2種第二載體蛋白上，并且其中，第二載體蛋白不同于第一載體蛋白。
2.一種改進(jìn)的肺炎鏈球菌疫苗，包括與2種或更多的載體蛋白綴合的11種或更多的來自不同肺炎鏈球菌血清型的多糖，其中，血清型6B和23F綴合到第一載體蛋白上，其余的血清型綴合到1或2種第二載體蛋白上，并且其中，第二載體蛋白不同于第一載體蛋白。
3.一種改進(jìn)的肺炎鏈球菌疫苗包括與2種或更多的載體蛋白綴合的11種或更多的來自不同肺炎鏈球菌血清型的多糖，其中，血清型6B綴合到第一載體蛋白上，其余的血清型綴合到1或2種第二載體蛋白上，并且其中，第二載體蛋白不同于第一載體蛋白。
4.前述任一權(quán)利要求的疫苗，其中第一載體蛋白選自DT、crm197、TT、片段C、Ply、PhtA、PhtB、PhtD、PhtE、OmpC、和PorB。
5.前述任一權(quán)利要求的疫苗，其中第二載體蛋白包括1種或2種選自PD、DT、crm197、TT、片段C、Ply、PhtA、PhtB、PhtD、PhtE、OmpC、和PorB的蛋白。
6.前述任一權(quán)利要求的疫苗，其中存在1種第二載體蛋白。
7.前述任一權(quán)利要求的疫苗，其中每種血清型的多糖存在的量為1-10μg。
8.權(quán)利要求7的疫苗，其中選自1、3、4、5、7F、9V、14和18C的一種或多種血清型存在的量為2-5μg。
9.前述任一權(quán)利要求的疫苗，其中載體蛋白與多糖的比值為0.5至1.7(w/w)。
10.權(quán)利要求9的疫苗，其中，對于選自6B、19F和23F的一種或多種血清型而言，載體蛋白與多糖的比值為0.7至1.5。
11.前述任一權(quán)利要求的疫苗，第二載體蛋白為流感嗜血桿菌蛋白D(PD)。
12.前述任一權(quán)利要求的疫苗，其中多糖血清型6B綴合到選自DT、crm197或TT的第一載體蛋白上。
13.權(quán)利要求12的疫苗，其中第一載體蛋白為DT。
14.前述任一權(quán)利要求的疫苗，其中多糖6B存在的量為5-10μg/劑量。
15.前述任一權(quán)利要求的疫苗，進(jìn)一步包括未綴合的肺炎鏈球菌的多糖，該多糖的血清型不同于已綴合的多糖，以便其中綴合和未綴合多糖數(shù)小于或等于23。
16.一種誘導(dǎo)嬰人產(chǎn)生抗肺炎鏈球菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，包括應(yīng)用前述任一權(quán)利要求所述的疫苗。
17.一種誘導(dǎo)老年人產(chǎn)生抗肺炎鏈球菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，包括應(yīng)用(i)前述任一權(quán)利要求所述的疫苗和(ii)源自PhtX族的肺炎鏈球菌表面蛋白。
18.一種誘導(dǎo)嬰兒產(chǎn)生抗中耳炎的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，包括應(yīng)用(i)前述任一權(quán)利要求所述的疫苗和(ii)源自PhtX族的肺炎鏈球菌表面蛋白。
19.權(quán)利要求17或18的方法，其中PhtX家族蛋白為PhtD或PhtB。
20.權(quán)利要求19的方法，其中PhtX家族蛋白為PhtD。
21.權(quán)利要求17的方法，進(jìn)一步包括CbpX家族蛋白。
22.權(quán)利要求21的方法，其中CbpX家族蛋白為缺少膽堿結(jié)合結(jié)構(gòu)域的截?cái)囿w。
23.權(quán)利要求22的方法，其中CbpX截?cái)囿w為膽堿結(jié)合蛋白A。
24.權(quán)利要求18的方法，進(jìn)一步包括Ply。
全文摘要
本發(fā)明提供一種多血清型肺炎鏈球菌綴合物疫苗的最佳制劑。
文檔編號A61P11/00GK1635904SQ02827993
公開日2005年7月6日 申請日期2002年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月18日
發(fā)明者C·A·J·拉菲里雷, J·普爾曼 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司