專利名稱：嵌合傳染性dna克隆,嵌合豬環(huán)狀病毒及其用途的制作方法
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背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及可用作疫苗的傳染性豬環(huán)狀病毒1型(PCV1)和2型(PCV2)DNA克隆，衍生自所述嵌合DNA克隆的嵌合PCV1-2傳染性DNA克隆和活的嵌合病毒。
相關(guān)領(lǐng)域的說明在本說明書中所引用的所有專利和文獻(xiàn)都被以它們的全文形式收作本文參考。
豬環(huán)狀病毒(PCV)最初是以豬腎細(xì)胞系PK-15的細(xì)胞培養(yǎng)物的污染物形式分離的(I.Tischer等，“具有環(huán)狀單鏈DNA的非常小的豬病毒”Nature 29564-66(1982)；I.Tischer等，“永久性豬腎細(xì)胞系中乳多空病毒和小RNA病毒-樣顆粒的鑒定”，Zentralbl.Bakteriol.Hyg.Otg.A.226(2)153-167(1974))。PCV是小型二十面體無外被病毒，它含有大約1.76kb的單鏈環(huán)狀DNA基因組。PCV屬于環(huán)狀病毒科，該科包括三種其他的動物環(huán)狀病毒(雞貧血病毒(CAV)，鸚鵡喙和羽毛病病毒(PBFDV)，和最近從鴿子體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的鴿子環(huán)狀病毒(CoCV))，以及三種植物環(huán)狀病毒(香蕉蔟頂病病毒，椰子葉腐病病毒和地三葉草矮化病毒(M.R.Bassami等，“鸚鵡喙和羽毛病病毒核苷酸序列分析及其與豬環(huán)狀病毒，植物環(huán)狀病毒和雞貧血病毒的關(guān)系”，Virology 249453-459(1998)；J.Mankertz等，“豬環(huán)狀病毒(PCV)的轉(zhuǎn)錄分析”，Virus Genes 16267-276(1998)；A.Mankertz等，“鴿子環(huán)狀病毒(CoCV)-來自鴿子的新的環(huán)狀病毒的克隆和測序”，Arch.Virol.1452469-2479(2000)；B.M.Meehan等，“豬環(huán)狀病毒DNA的序列與植物環(huán)狀病毒的親和力”，J.Gen.Virol.78221-227(1997)；B.M.Meehan等，“與豬衰竭性綜合征相關(guān)的新型環(huán)狀病毒DNAs的鑒定”，J.Gen.Virol.792171-2179(1998)；D.Todd等，“三種動物病毒與環(huán)狀單鏈DNA基因組的比較”，Arch.Virol.117129-135(1991))。以上三種以前鑒定的動物環(huán)狀病毒(PCV，CAV和PBFDV)的成員，彼此之間不擁有核苷酸序列同源性或抗原決定簇(M.R.Bassami等，1998，同上；D.Todd等1991，同上)。新鑒定的CoCV的基因組與PCV的基因組擁有大約40％的核苷酸序列同一性(A.Mankertz等，“鴿子環(huán)狀病毒(CoCV)——來自鴿子的新的環(huán)狀病毒的克隆和測序”，Arch.Virol.1452469-2479(2000))。最近，從與輸血后肝炎相關(guān)的個(gè)體體內(nèi)鑒定了一種被命名為輸血傳播的病毒或TT病毒(TTV)的具有環(huán)狀基因組的新型人類環(huán)狀病毒(H.Miyata等，“新的富含GC的113個(gè)核苷酸區(qū)的鑒定，以便完善第一種人類環(huán)狀病毒TT病毒的環(huán)狀單鏈DNA基因組”，J.Virol.733582-3586(1999)；T.Nishizawa等，“與未知病因?qū)W的輸血后肝炎的較高的轉(zhuǎn)氨酶水平相關(guān)的新型DNA病毒(TTV)”，Biochem.Biophys.Res.Commun.24192-97(1997))。另外，從正常血液供體體內(nèi)鑒定了人類TTV-樣小病毒(TLMV)(P.Biagini等，“TT病毒-樣小病毒人類分離物的完整基因組和亞基因組序列的遺傳學(xué)分析”，J.Gen.Virol.82379-383(2001)；K.Takahashi等，“直接與TT病毒和雞貧血病毒相關(guān)的新的人DNA病毒(TTV-樣小病毒，TLMV)的鑒定”，Arch.Virol.145979-93(2000))，并且還從患有輸血后肝炎的人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了被稱為SEN病毒(SENV)的第三種新型人類環(huán)狀病毒(T.Umemura等，“SEN病毒感染及其與輸血相關(guān)的肝炎的關(guān)系”，Hepathology 331303-1311(2001))。兩種人類TTV和TLMV的基因組組構(gòu)與CAV的基因組組構(gòu)類似(P.Biagini等，2001，同上；H.Miyata等，1999，同上；K.Takahashi等，2000，同上)。盡管PCV的抗體是在包括人類，小鼠，牛和豬的各種動物物種中發(fā)現(xiàn)的(G.M.Allan等，“豬環(huán)狀病毒的單克隆抗體的生產(chǎn)，初步鑒定和應(yīng)用”，Vet.Immunol.Immunopathol.43357-371(1994)；G.C.Dulac和A.Afshar，“PK-15細(xì)胞系(ATCC CCL-33)中的豬環(huán)狀病毒抗原和加拿大豬體內(nèi)的環(huán)狀病毒抗體的證據(jù)”，″Can.J.Vet.Res.53431-433(1989)；S.Edwards和J.J.Sands，“英國豬體內(nèi)環(huán)狀病毒感染的證據(jù)”，Vet.Rec.134680-1(1994)；J.C.Harding和E.G.Clark，“了解和診斷斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)”，Swine Health andProduction 5201-203(1997)；R.K.Hines和P.D.Lukert，“豬環(huán)狀病毒在美國對豬的血清學(xué)監(jiān)督”，Swine Health and Production371-73(1995)；G.P.Nayar等，“患有呼吸病和流產(chǎn)的牛胎兒的環(huán)狀病毒證據(jù)”，Can.Vet.J.40277-278(1999)；I.Tischer等，“在不同的育種場的豬群體中豬環(huán)狀病毒抗體的分布”，Arch.Virol.140737-743(1995)；1.Tischer等，“在人，小鼠和牛血清中與豬環(huán)狀病毒抗體反應(yīng)的存在”，Arch.Virol.1401427-1439(1995))，對所述動物物種PCV的致病作用的了解很少。具有PK-15細(xì)胞衍生的PCV的豬的實(shí)驗(yàn)感染不能產(chǎn)生臨床疾病，因此，這種病毒不被認(rèn)為是對豬有致病性的(G.M.Allan等，“豬環(huán)狀病毒的病理學(xué)缺少初乳的小豬崽的實(shí)驗(yàn)感染以及豬胎材料的檢查”，Vet.Microbiol.4449-64(1995)；I.Tischer等，“對豬環(huán)狀病毒的流行病學(xué)和致病性的研究”，Arch.Virol.91271-276(1986))。將來自污染的PK-15細(xì)胞系的非致病性PCV命名為1型豬環(huán)狀病毒或PCV1。
最早在1991年披露的斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)(J.C.Harding和E.G.Clark，1997，同上)是斷奶豬崽的復(fù)雜疾病，這種病正越來越廣泛地傳播。由于對養(yǎng)豬行業(yè)造成了潛在的嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)學(xué)影響的威脅，已經(jīng)迫切需要開發(fā)針對PMWS的主要致病劑PCV2的疫苗。PMWS主要影響5-18周齡的豬。PMWS的臨床體征包括進(jìn)展性體重減輕，呼吸困難，呼吸急促，貧血，腹瀉，和黃疸。死亡率可以在1％-2％之間波動，并且，在英國的某些復(fù)雜病例中，死亡率可以高達(dá)40％(M.Muirhead，“有關(guān)PMWS/PDNS的信息來源”，Vet.Rec.150456(2002))。PMWS的微觀病變特征包括肉芽腫性間質(zhì)性肺炎，淋巴腺病，肝炎，和腎炎(G.M.Allan和J.A.Ellis，“豬環(huán)狀病毒概述”，J.Vet.Diagn.Invest.123-14(2000)；J.C.Harding和E.G.Clark，1997，同上)。PMWS現(xiàn)在業(yè)已在加拿大、美國的豬體內(nèi)發(fā)現(xiàn)(G.M.Allan等，“來自患有衰竭性疾病綜合征的豬體內(nèi)的新型豬環(huán)狀病毒”，Vet.Rec.142467-468(1998)；G.M.Allan等，“從美國和歐洲的患有衰竭性疾病的鴿子體內(nèi)分離豬環(huán)狀病毒-樣病毒”，J.Vet.Diagn.Invest.103-10(1998)；G.M.Allan and J.A.Ellis，2000，同上；J.Ellis等，“從患有斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征的豬的損傷中分離環(huán)狀病毒”，Can.Vet.J.3944-51(1998)；A.L.Hamel等，“與豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征相關(guān)的豬環(huán)狀病毒的核苷酸序列”，J.Virol.72526 2-5267(1998)；M.Kiupel等，“與印度的斷奶的豬的疾病相關(guān)的環(huán)狀病毒-樣病毒”，Vet.Pathol.35303-307(1998)；R.Larochelle等，“通過PCR確定的在魁北克常規(guī)養(yǎng)豬場中豬環(huán)狀病毒發(fā)病率的鑒定”，Vet.Rec.145140-142(1999)；B.M.Meehan等，1998，同上；I.Morozov等，“在患有斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征的豬體內(nèi)檢測豬環(huán)狀病毒的新菌株”，J.Clin.Microbiol.362535-2541(1998))，在大部分歐洲國家(G.M.Allan等，“從美國和歐洲的患有衰竭性疾病的豬體內(nèi)分離豬環(huán)狀病毒樣病毒”，J.Vet.Diagn.Invest.103-10(1998)；G.M.Allan和J.A.Ellis，2000，同上；S.Edwards和J.J.Sands，1994，同上；S.Kennedy等，“北愛爾蘭的豬環(huán)狀病毒感染”，Vet.Rec.142495-496(1998)；A.Mankertz等，“來自西班牙，德國和法國的PCV-2分離物的鑒定”，Virus Res.6665-77(2000)；C.Rosell等，“在患有豬皮炎的腎病綜合征的豬的組織中鑒定豬環(huán)狀病毒”，Vet.Rec.14640-43(2000)；P.Spillane等，“愛爾蘭共和國的豬環(huán)狀病毒感染”，Vet.Rec.143511-512(1998)；G.J.Wellenberg等，“從荷蘭的具有斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征的豬體內(nèi)分離并且鑒定2型豬環(huán)狀病毒”，Vet.Quar t.22167-72(2000))以及在亞洲的某些國家(C.Choi等，“韓國豬的豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征通過免疫組織化學(xué)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測豬豬環(huán)狀病毒感染”，J.Vet.Diagn.Invest.12151-153(2000)；A.Onuki等，“從日本的患有衰竭疾病的豬的損傷中檢測豬環(huán)狀病毒”，J.Vet.Med.Sci.611119-1123(1999))都識別到了PMWS。PMWS可能對世界范圍內(nèi)的養(yǎng)豬行業(yè)產(chǎn)生重大的經(jīng)濟(jì)影響。
PMWS的主要致病劑是被命名為2型豬環(huán)狀病毒或PCV的PCV2致病菌株(G.M.Allan等，“來自患有衰竭性疾病綜合征的新型豬環(huán)狀病毒”，Vet.Rec.142467-468(1998)；G.M.Allan等，“從美國和歐洲的患有衰竭性疾病的豬體內(nèi)分離豬環(huán)狀病毒樣病毒”，J.Vet.Diagn.Invest.103-10(1998)；G.M.Allan等，“從西班牙，丹麥和北愛爾蘭的患有消瘦綜合征的豬體內(nèi)分離并且鑒定環(huán)狀病毒”，Vet.Microbiol.66115-23(1999)；G.M.Allan和J.A.Ellis，2000，同上；J.Ellis等，1998，同上；A.L.Hamel等，1998，同上；B.M.Meehan等，1998，同上；I.Morozov等，1998，同上)。業(yè)已確定了與PMWS相關(guān)的PCV2的完整的基因組序列(M.Fenaux等，“來自北美洲不同地區(qū)的患有斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征的豬的2型豬環(huán)狀病毒(PCV-2)的遺傳學(xué)鑒定，并且開發(fā)了示差PCV限制片段長度多形性分析，以便檢測并且區(qū)分PCV-1和PCV-2”，J.Clin.Microbiol.382494-503(2000)；A.L.Hamel等，1998，同上；J.Mankertz等，1998，同上；B.M.Meehan等，1997，同上；B.M.Meehan等，1998，同上；I.Morozov等，1998，同上)。
PCV1在豬體內(nèi)是普遍存在的，但是，對豬來說不是致病性的。相反，在遺傳學(xué)上相關(guān)的PCV2是致病性的，并且會導(dǎo)致豬出現(xiàn)PMWS。序列分析發(fā)現(xiàn)，與PMWS-相關(guān)的PCV2，和非致病性PCV1僅具有大約75％的核苷酸序列同一性。非致病性PCV1和致病性PCV2的ORF2基因編碼主要免疫原性病毒衣殼蛋白(P.Nawagitgul等，“用于檢測PCV抗體的修飾過的間接豬環(huán)狀病毒(PCV)2型和重組衣殼蛋白(ORF2)型ELISA)，Immunol.Clin.Diagn.Lab Immunol.133-40(2002)；P.Nawagitgul等，”編碼主要衣殼蛋白的2型豬環(huán)狀病毒的開放讀框2“，J.Gen.Virol.812281-2287(2000))。
通過接種PCV2，在常規(guī)豬體內(nèi)再現(xiàn)臨床PMWS的最初的嘗試是成功的(M.Balasch等，“用來自患有斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征的豬體內(nèi)的組織勻漿實(shí)驗(yàn)接種常規(guī)豬”，J.Comp.Pathol.121139-148(1999)；M.Fenaux等，“克隆的2型豬環(huán)狀病毒(PCV-2)的基因組DNA在直接注射到SPF豬的肝臟和淋巴結(jié)中之后是傳染性的臨床疾病，病毒分布和病理學(xué)損傷的鑒定”，J.Virol.76541-551(2002))。用來自患有天然存在的PMWS的組織勻漿和用細(xì)胞培養(yǎng)增殖的PCV2在限菌豬和常規(guī)豬體內(nèi)進(jìn)行的臨床PMWS的實(shí)驗(yàn)性再現(xiàn)產(chǎn)生了混合的結(jié)果。在用PCV2和豬細(xì)小病毒(PPV)共同感染的限菌(SPF)豬和缺少初乳和剖腹產(chǎn)的豬體內(nèi)再現(xiàn)了臨床PMWS(G.M.Allan等，“通過用豬環(huán)狀病毒和豬細(xì)小病毒共同感染豬實(shí)驗(yàn)性再現(xiàn)嚴(yán)重的衰竭性疾病”，J.Comp.Pathol.1211-11(1999)；S.Krakowka等，“豬的病毒性衰竭綜合征通過用2型豬環(huán)狀病毒和豬細(xì)小病毒共同感染在限菌豬體內(nèi)實(shí)驗(yàn)性再現(xiàn)斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征”，Vet.Pathol.37254-263(2000))，并且在用PCV2接種的限菌豬體內(nèi)當(dāng)通過用溶解在不完全弗氏佐劑中的匙孔嘁血藍(lán)蛋白激活它們的免疫系統(tǒng)時(shí)，也再現(xiàn)了臨床PMWS(S.Krakowka等，“免疫系統(tǒng)的激活是在受豬環(huán)狀病毒-2(PCV-2)感染的豬體內(nèi)產(chǎn)生衰竭性疾病的關(guān)鍵事件”，″Vet.Pathol.3831-42(2001))。
在僅接種PCV2的剖腹產(chǎn)/缺少初乳的豬(CD/CD)體內(nèi)(P.A.Harms等，“在同時(shí)用2型豬環(huán)狀病毒和豬生殖性和呼吸道綜合征病毒感染的CD/CD豬體內(nèi)實(shí)驗(yàn)性再現(xiàn)嚴(yán)重疾病”。″Vet.Pathol.38528-539(2001))以及在用PCV2和豬細(xì)小病毒(PPV)或豬生殖性和呼吸綜合征病毒(PRRSV)共同感染的常規(guī)豬體內(nèi)(A.Rivora等，“用豬生殖和呼吸綜合征病毒和豬環(huán)狀病毒2實(shí)驗(yàn)性接種常規(guī)豬”，J.Virol.763232-3239(2002))也能再現(xiàn)PMWS。在PRRSV/PCV2共同感染的情況下，PMWS特有的病理學(xué)體征，如淋巴樣衰竭，肉芽腫性炎癥和壞死性肝炎是由PCV2誘導(dǎo)的，而不是由PRRSV誘導(dǎo)的(P.A.Harms等，2001，同上)。不過，在僅用PCV2感染的限菌豬體內(nèi)不能再現(xiàn)臨床PMWS(G.M.Allan等，“用豬環(huán)狀病毒2(PCV2)和豬生殖和呼吸綜合征病毒(PRRSV)實(shí)驗(yàn)性感染缺少初乳的豬崽能加強(qiáng)PCV2復(fù)制”，Arch.Virol.1452421-2429(2000)；G.M.Allan等，“用豬環(huán)狀病毒和豬細(xì)小病毒實(shí)驗(yàn)性感染豬的系列研究低溫冷凍切片的免疫染色和病毒分離”，J.Vet.Med.4781-94(2000)；G.M.Allan等，“通過用豬環(huán)狀病毒和豬細(xì)小病毒共同感染豬實(shí)驗(yàn)性再現(xiàn)嚴(yán)重衰竭疾病”，J.Comp.Pathol.1211-11(1999)；M.Balasch等，1999，同上；J.Ellis等，“在限菌生物豬崽體內(nèi)再現(xiàn)斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征的損傷”，J.Vet.Diagn.Invest.113-14(1999)；S.Kennedy等，“通過僅用豬環(huán)狀病毒2或與豬細(xì)小病毒組合感染常規(guī)豬再現(xiàn)斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征的損傷”，J.Comp.Pathol.1229-24(2000)；S.Krakowka等，2001，同上；S.Krakowka等，2000，同上；R.M.Pogranichnyy等，“小豬對2型豬環(huán)狀病毒感染的免疫應(yīng)答的鑒定”，Viral.Immunol.13143-153(2000))。在這些研究中所使用的病毒接種物是來自患有天然存在的PMWS的豬的組織勻漿，或是在PK-15細(xì)胞培養(yǎng)物中增殖的病毒(G.M.Allan等，“用豬環(huán)狀病毒2(PCV2)和豬生殖和呼吸綜合征病毒(PRRSV)實(shí)驗(yàn)性感染缺少初乳的豬崽能加強(qiáng)PCV2復(fù)制”，Arch.Virol.1452421-2429(2000)；G.M.Allan等，“用豬環(huán)狀病毒和豬細(xì)小病毒實(shí)驗(yàn)性感染的系列研究低溫切片的免疫染色和病毒分離”，J.Vet.Med.4781-94(2000)；G.M.Allan等，“通過用豬環(huán)狀病毒和豬細(xì)小病毒共同感染豬實(shí)驗(yàn)性再現(xiàn)嚴(yán)重衰竭疾病”，J.Comp.Pathol.1211-11(1999)；M.Balasch等，1999，同上；J.Ellis等，1999，同上；S.Kennedy等，2000，同上；S.Krakowka等，2001，同上；S.Krakowka等，2000，同上；R.M.Pogranichnyy等，2000，同上)。由于組織勻漿可能含有其他常見的豬的致病劑，如PPV和豬生殖和呼吸綜合征病毒(PRRSV)(G.M.Allan等，“用豬環(huán)狀病毒2(PCV2)和豬生殖和呼吸綜合征病毒(PRRSV)實(shí)驗(yàn)性感染缺少初乳的豬崽能加強(qiáng)PCV2復(fù)制”，Arch.Virol.1452421-2429(2000)；G.M.Allan等，“通過用豬環(huán)狀病毒和豬細(xì)小病毒共同感染豬實(shí)驗(yàn)性再現(xiàn)嚴(yán)重衰竭疾病”，J.Comp.Pathol.1211-11(1999)；G.M.Allan和J.A.Ellis，2000，同上；J.A.Ellis等，″在患有自然獲得的斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征的豬中通過豬環(huán)狀病毒和豬細(xì)小病毒進(jìn)行共感染″J.Vet.Diagn.Invest.1221-27(2000)；C.Rosell等，2000，同上)，并且由于采用PCV1持續(xù)感染用于PCV2增殖的ATCC PK-15細(xì)胞系(G.C.Dulac和A.Afshar，1989，同上)，這些研究所再現(xiàn)的臨床疾病和病理學(xué)病變可能不完全是由于PCV2感染(G.M.Allan等，“用豬環(huán)狀病毒2(PCV2)和豬生殖和呼吸綜合征病毒(PRRSV)實(shí)驗(yàn)性感染缺少初乳的豬崽，加強(qiáng)了PCV2復(fù)制”Arch.Virol.1452421-2429(2000)；G.M.Allan等，“用豬環(huán)狀病毒和豬細(xì)小病毒實(shí)驗(yàn)性感染豬的系列研究冷凍切片和病毒分離物的免疫染色”J.Vet.Med.4781-94(2000)；G.M.Allan等，“用豬環(huán)狀病毒和豬細(xì)小病毒共同感染豬而實(shí)驗(yàn)性再現(xiàn)嚴(yán)重衰竭疾病”J.Comp.Pathol.1211-11(1999)；G.M.Allan和J.A.Ellis，2000，同上；J.A.Ellis等，2000，同上)。
在用豬肺炎支原體接種時(shí)，在PCV2接種過的CD/CD豬體內(nèi)也能再現(xiàn)臨床PMWS(G.M.Allan等，“免疫刺激，PCV-2和PMWS”，Vet.Rec.147171-172(2000))。最近進(jìn)行的兩項(xiàng)野外研究(G.M.Allan等，“豬肺炎支原體的新生接種和斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征野外實(shí)驗(yàn)”，Pig J.4834-41(2001)，和.C.Kyriakis等，“免疫調(diào)節(jié)對斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征的臨床和病理學(xué)表達(dá)的影響”，J.Comp.Pathol.12638-46(2002))檢測了通過豬肺炎支原體疫苗對地方性獸群PMWS發(fā)展的免疫調(diào)節(jié)作用，并且與接種過的動物相比，在未接種過的小鼠中出現(xiàn)了PMWS病例的顯著減少。不過，使用常規(guī)SPF小豬崽在受控制的實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行的另一項(xiàng)最新研究，不能再現(xiàn)所述作用，這表明了用豬肺炎支原體免疫有可能影響臨床PMWS的發(fā)展，但是，對于PCV2感染來說，它顯然是一種次要因素?；谏鲜龊推渌芯?，PCV2盡管被認(rèn)為是PMWS的主要致病劑，但不是唯一的致病劑。
生物學(xué)純形式的PCV2的傳染性病毒原種的缺乏，業(yè)已妨礙了對PMWS中PCV2發(fā)病機(jī)理和PCV2的流行病學(xué)作用的了解。對PPV以及可能的PRRSV的免疫，沒有一致性地表現(xiàn)出能抑制PCV2感染過的豬的PMWS的發(fā)作。因此，發(fā)現(xiàn)能特異性針對PMWS的安全的但仍然有效的疫苗一直是困難的。在獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域確實(shí)認(rèn)識到了需要生產(chǎn)能抗PCV2感染和PMWS的有效的、安全的疫苗。
美國專利號6,287,856(Poet等)和WO 99/45956涉及來自鸚鵡喙和羽毛病毒(BFDV)的核酸，它是一種能感染禽類的環(huán)狀病毒，和來自豬環(huán)狀病毒(PCV)的核酸。以上專利提供了包括裸露的DNA或mRNA的疫苗組合物，并且披露了用于在真核細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)PCV的核酸載體，這種載體包括源于人巨細(xì)胞病毒立即或早期基因增強(qiáng)子的順式作用轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)控序列或與序列的核酸功能性連接的啟動子。不過，由于PCV DNA僅僅是源于PK-15細(xì)胞系，它有可能包括在將近30年以前由I.Tischer等(1974，同上)發(fā)現(xiàn)的非致病性PCV1，因此，它不大可能有效地誘導(dǎo)針對PCV2或由PCV2誘導(dǎo)的感染的免疫應(yīng)答。在所述專利中還提示了用包括開放讀框的載體制備的重組蛋白的亞單位疫苗，不過，來自PCV的開放讀框，彼此之間不能很好地表征或區(qū)分。由于PCV DNA的來源是PK-15細(xì)胞，用包括PCV1的開放讀框的載體制備的蛋白，不具備針對PCV2的可靠的免疫原性特性(如果有的話)。
美國專利號6,217,883(Allan等)和法國專利號2,781,159B涉及從加拿大，加利弗尼亞和法國(Brittany)的感染了PMWS的豬體內(nèi)采集的肺或神經(jīng)結(jié)樣品中分離五種PCV菌株，以及將它們與至少一種豬細(xì)小病毒抗原組合用于免疫原性組合物中的用途。由包括ORF1-ORF13的PCV2開放讀框(ORF)編碼的蛋白在專利文獻(xiàn)中有廣泛的披露，不過，沒有任何一種具有免疫原性特性的特定蛋白的例子。所述專利還披露了包括DNA質(zhì)粒，線性DNA分子，和重組病毒的載體，這些載體包括，并且能夠在體內(nèi)表達(dá)編碼PCV抗原的核酸分子。若干其他的參考文獻(xiàn)，例如，美國專利號6,391,314B1；美國專利號6,368,601B1；法國專利號2,769,321；法國專利號2,769,322；WO 01/96377 A2；WO 00/01409；WO 99/18214；WO 00/77216 A2；WO 01/16330A2；WO 99/29871等，也披露了施用PCV1或PCV多肽或編碼各種菌株的多肽的核酸。
不過，非致病性PCV1不能用于抗PCV2感染，而現(xiàn)有技術(shù)中所披露的致病性PCV2菌株即使是減毒的，也可能只具有有限的價(jià)值，因?yàn)榛畹牟《就ǔ＞哂谢謴?fù)它的有毒力狀態(tài)的傾向。因此，本領(lǐng)域長期以來一直需要用于給豬接種的活的，傳染性的，非致病性抗原，以便預(yù)防由PCV2導(dǎo)致的嚴(yán)重感染或PMWS，這種抗原是有效的，并且用在獸醫(yī)疫苗中仍然是安全的。通過構(gòu)建本文所披露的新型活的嵌合豬環(huán)狀病毒實(shí)現(xiàn)了上述目的，這種病毒是以由I.Tischer等在大約30年前分離的非致病性PCV1的基因組主鏈為基礎(chǔ)的。本發(fā)明的新型嵌合豬環(huán)狀病毒能夠滿足所述長期的需要，包括獨(dú)特并且有利于保留PCV1的非致病性表型，而又能誘導(dǎo)針對致病型PCV2的特異性免疫應(yīng)答。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及可用作疫苗的豬環(huán)狀病毒(PCV)的傳染性嵌合DNA克隆和源于DNA克隆的活的嵌合病毒。所述新的、活的嵌合的、遺傳學(xué)上無毒的病毒，是用非致病性PCV1基因組結(jié)構(gòu)制備的，其中，用致病性PCV2菌株的免疫原性基因取代了PCV1的基因，通常是在相同的相應(yīng)位置上取代。本發(fā)明包括含有本文所披露的新的重組核酸分子的具有生物學(xué)功能的質(zhì)粒，病毒載體等，用包括所述DNA的載體轉(zhuǎn)染過的合適的宿主細(xì)胞以及免疫原性多肽表達(dá)產(chǎn)物。在本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括保護(hù)豬免受由PCV2導(dǎo)致的病毒感染或斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的新方法，該方法包括給需要所述保護(hù)的豬施用免疫有效量的疫苗，例如，所述疫苗包括質(zhì)粒上的克隆的嵌合DNA，源于所述嵌合DNA的嵌合病毒，由本文所述DNA表達(dá)的多肽產(chǎn)物等。本發(fā)明還提供了新的傳染性PCV2分子DNA，和PCV的交互(reciprocal)嵌合DNA克隆，可將它用作獲得或鑒定新型減毒病毒疫苗的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br> 附圖簡述下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的背景及其與現(xiàn)有技術(shù)的差別作進(jìn)一步說明，其中

圖1表示傳染性PCV2分子DNA克隆的構(gòu)建。用于擴(kuò)增完整的PCV2基因組的引物對的相對位置用箭頭標(biāo)出(反向引物PCVSAC2，正向引物PCVSAC2)。用SacII限制酶消化通過PCR擴(kuò)增的PCV2基因組DNA，并且純化，連接純化的和SaCII消化過的基因組DNA，以便構(gòu)成多聯(lián)體。通過凝膠電泳分離連接的多聯(lián)體，純化SaCII的串聯(lián)基因組二聚體，并且克隆到預(yù)先用SaCII酶消化過的pSK載體上，以便產(chǎn)生分子PCV2 DNA克隆。
圖2A和2B表示克隆的PCV2質(zhì)粒DNA在體外感染PK-15細(xì)胞時(shí)是傳染性的。圖2A表示通過免疫熒光測定(IFA)，在用克隆的PCV2質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染過的PK-15細(xì)胞中檢測PCV2抗原。在轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞核中觀察到了PCV2抗原的強(qiáng)的免疫標(biāo)記，而在細(xì)胞質(zhì)中觀察到了較弱的免疫標(biāo)記。圖2B表示模擬轉(zhuǎn)染的PK-15細(xì)胞。
圖3A表示來自第21 DPI的通過淋巴內(nèi)途徑用PCV2 DNA接種過的豬的肺。所述肺是橡膠狀的，不能收縮，并且呈斑點(diǎn)狀棕紅色。氣管支氣管淋巴結(jié)明顯擴(kuò)大，并且是棕色的(箭頭)。圖3B表示來自對照豬的正常肺的顯微鏡切片(25X)。圖3C表示來自圖3A中的豬的肺的顯微鏡切片。注意支氣管周淋巴組織細(xì)胞炎癥和中度壞死性支氣管炎(25X)。圖3D表示圖3A中肺的免疫組織化學(xué)染色。注意巨噬細(xì)胞中的PCV2抗原(箭頭)和呼吸道周圍的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞(箭頭的頭部)(64X)。
圖4A表示來自對照豬的正常淋巴結(jié)。注意界限明確的淋巴樣濾泡(箭頭)(25X)。圖4B表示圖3A的21天前通過淋巴內(nèi)途徑用克隆的PCV2基因組DNA接種過的豬的氣管支氣管淋巴結(jié)的顯微鏡切片。淋巴樣濾泡形成較差，存在輕度至中度淋巴衰竭，和輕度多病灶肉芽腫樣炎癥(25X)。圖4C表示圖4B中的淋巴結(jié)的顯微切片的更大的放大倍數(shù)，聚焦在一個(gè)濾泡。注意用巨噬細(xì)胞和巨大細(xì)胞(箭頭)代替濾泡淋巴細(xì)胞所產(chǎn)生的分界較差的濾泡(64X)。圖4D表示與圖4B相同的淋巴結(jié)中，在巨噬細(xì)胞(箭頭)和巨大細(xì)胞(小箭頭)，和濾泡中樹突樣細(xì)胞(大箭頭)中，PCV2抗原的免疫組織化學(xué)檢測(64X)。
圖5表示用攜帶致病性PCV2的免疫原性O(shè)RF2衣殼基因的非致病性PCV1基因組構(gòu)建嵌合PCV1-2(PCV1/PCV2)DNA克隆。用二聚化的DNA克隆體外轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，以便產(chǎn)生能表達(dá)PCV2的ORF2蛋白的活的嵌合病毒，并且通過體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)它的活性。
圖6表示傳染性PCV1，PCV2，嵌合PCV1-2和交互的嵌合PCV2-1分子DNA克隆的構(gòu)建和組構(gòu)。PCV2 DNA克隆是通過以前所披露的通用方法，將兩個(gè)完整長度的線性PCV2基因組串聯(lián)連接在pBluescript SK載體(pSK)上而構(gòu)建的(M.Fenaux等，2002，同上)。PCV1 DNA克隆是通過將兩個(gè)完整長度的PCV1基因組串聯(lián)連接在pSK載體上而構(gòu)建的。嵌合PCV1-2 DNA克隆是通過用PCV2的ORF2衣殼基因取代pSK載體的非致病性PCV1基因組主鏈上的PCV1 ORF2衣殼基因而構(gòu)建的。交互的嵌合PCV2-1 DNA克隆是通過用非致病性PCV1的ORF2衣殼基因取代pSK載體的致病性PCV2基因組上的致病性PCV2的ORF2衣殼基因而構(gòu)建的。在pSK載體上，兩種嵌合克隆都是二聚體。箭頭表示PCR引物的相對位置，用于檢測接種動物的PCV1，PCV2，PCV1-2和PCV2-1的病毒血癥。
圖7A-7J表示PCV1，PCV2，嵌合PCV1-2和交互的嵌合PCV2-1 DNA克隆是傳染性的，并且在體外轉(zhuǎn)染到PK-15細(xì)胞時(shí)能表達(dá)相應(yīng)的病毒抗原。左側(cè)的照片(7A，7C，7E，7G和7I)是用抗PCV1 ORF2的單克隆抗體染色的。右側(cè)的照片(7B，7D，7F，7H和7J)是用抗PCV2的抗體染色的。照片7A和7B是模擬轉(zhuǎn)染的PK-15細(xì)胞。照片7C和7D是用PCV1 DNA克隆轉(zhuǎn)染過的PK-15細(xì)胞。照片7E和7F是用PCV2 DNA克隆轉(zhuǎn)染過的PK-15細(xì)胞。照片7G和7H是用嵌合PCV1-2 DNA克隆轉(zhuǎn)染過的PK-15細(xì)胞。照片7I和7J是用交互PCV2-1 DNA克隆轉(zhuǎn)染過的PK-15細(xì)胞。
圖8表示克隆的PCV2分子DNA的完整長度DNA序列(它相當(dāng)于SEQID NO1)。
圖9表示克隆的PCV1-2 DNA的完整長度DNA序列(它相當(dāng)于SEQ IDNO2)。
圖10表示克隆的PCV1-2 DNA的免疫原性O(shè)RF2衣殼基因的DNA序列(它相當(dāng)于SEQ ID NO3)。
圖11表示嵌合的PCV1-2 DNA的免疫原性O(shè)RF2衣殼基因的推測的氨基酸翻譯(它相當(dāng)于SEQ ID NO4)。
發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明，提供了豬環(huán)狀病毒(PCV)的傳染性分子和嵌合核酸分子，由所述嵌合核酸分子生產(chǎn)的活的嵌合病毒，以及用于保護(hù)豬免受病毒感染或由PCV2引起的斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的影響的獸醫(yī)疫苗。本發(fā)明還提供了可用作疫苗的免疫原性多肽表達(dá)產(chǎn)物。
PCV的新的、無毒的、傳染性嵌合DNA分子(PCV1-2)，包括編碼傳染性，非致病性PCV1的核酸分子，它包括取代了PCV1基因組中的ORF基因的致病性PCV2的免疫原性開放讀框(ORF)基因。這種傳染性嵌合PCV1-2 DNA克隆優(yōu)選包括克隆在傳染性，非致病性PCV1 DNA克隆的基因組主鏈上的PCV2 DNA的免疫原性衣殼基因(ORF2)。一般來說，PCV2 DNA的衣殼基因取代了非致病性PCV1基因組結(jié)構(gòu)上的PCV1DNA的ORF2基因，但是，可以理解的是，能夠通過遺傳工程構(gòu)建多種位置置換，以獲得其它無毒或減毒的嵌合DNA克隆。PCV1和PCV2之間的交互的嵌合傳感性PCV2-1 DNA克隆作為對照分析本發(fā)明的嵌合PCV1-2克隆，并且是通過用PCV1的衣殼基因取代致病性PCV2傳染性DNA克隆主鏈上的PCV2的衣殼基因而構(gòu)建的。除了作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，所述交互嵌合PCV2-1 DNA克隆可用于制備專門修飾過的疫苗。
本文所披露的克隆的PCV2的基因組DNA，在轉(zhuǎn)染到PK-15細(xì)胞中并且給豬使用時(shí)，表現(xiàn)出體外和體內(nèi)傳染性。傳染性PCV2 DNA克隆在豬體內(nèi)產(chǎn)生了PMWS所特有的病理學(xué)損傷，使得能夠更好地鑒定臨床疾病，并且了解在所述組織細(xì)胞中的病毒分布。這種新的便于復(fù)制的致病劑，導(dǎo)致了它本身可以發(fā)展成用于防止豬出現(xiàn)PMWS的合適的接種過程。
通過體外轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞和給豬體內(nèi)施用，所述新的嵌合PCV1-2DNA克隆同樣是傳染性的。在轉(zhuǎn)染過的PK-15細(xì)胞中，嵌合的PCV1-2 DNA克隆，能表達(dá)PCV2衣殼抗原(PCV2的免疫原性衣殼蛋白)，而所述交互嵌合PCV2-1 DNA克隆能表達(dá)PCV1衣殼抗原。這一結(jié)果是通過用對PCV1或PCV2衣殼抗原特異的抗體通過免疫熒光測定(IFA)證實(shí)的。在用傳染性PCV2克隆以及嵌合PCV1-2克隆接種過的豬體內(nèi)檢測到了PCV2-特異性抗體的血清轉(zhuǎn)變。PCV2-特異性抗體的血清轉(zhuǎn)變的檢測，確定了嵌合PCV1-2 DNA克隆能在受感染的豬體內(nèi)誘導(dǎo)PCV2-特異性抗體，并因此發(fā)揮保護(hù)接種過的豬免受PCV2感染的作用。
下面的實(shí)施例更詳細(xì)地披露了所述嵌合DNA克隆在接種過的豬體內(nèi)免疫原性和致病性的評估。大體上講，向抗PCV2 ORF2抗原的抗體的血清轉(zhuǎn)變，是在用PCV2 DNA克隆(第3組)和嵌合PCV1-2 DNA克隆(第4組)接種過的豬體內(nèi)檢測到的。用PCV1克隆和交互嵌合PCV2-1DNA克隆接種過的所有的豬(分別為第2和第5組)都能血清轉(zhuǎn)變成PCV1抗體。從每一個(gè)組中選擇的豬體內(nèi)回收的病毒進(jìn)行了部分測序，并且證實(shí)是用于所述接種的真實(shí)的相應(yīng)的傳染性DNA克隆。與用PCV1，嵌合PCV1-2和交互嵌合PCV2-1 DNA克隆接種過的豬相比，用PCV2 DNA克隆接種過的動物的各種組織中的肉眼可見和顯微鏡下的病變明顯更嚴(yán)重。
令人吃驚的并且有利的是，具有克隆到非致病性PCV1基因組主鏈上的致病性PCV2的免疫原性衣殼基因(ORF2)的嵌合PCV1-2傳染性DNA克隆，能誘導(dǎo)針對致病性PCV2衣殼抗原的特異性抗體應(yīng)答，同時(shí)，它在豬體內(nèi)獨(dú)特地保留了PCV1的非致病性性質(zhì)。用嵌合PCV1-2傳染性DNA克隆接種過的動物，發(fā)生了類似于PCV1接種動物的輕度感染，同時(shí)，發(fā)生了抗致病性PCV2的ORF2衣殼蛋白的抗體的血清轉(zhuǎn)變。在用PCV1和嵌合PCV1-2接種過的動物體內(nèi)觀察到的病毒血癥的平均長度，分別比致病性PCV2接種過的動物短0.625周和1周，后者的平均長度為大約2.12周。在某些接種過的動物體內(nèi)缺乏可檢測的嵌合PCV1-2病毒血癥，并不影響在PCV1-2接種過的豬(第4組)體內(nèi)向抗PCV2 ORF2衣殼蛋白的抗體的血清轉(zhuǎn)變。以上結(jié)果表明，即使在某些接種過的動物體內(nèi)嵌合PCV1-2病毒血癥時(shí)間短或者是無法檢測，但嵌合PCV1-2病毒仍然能夠誘導(dǎo)針對PCV2 ORF2衣殼蛋白的抗體應(yīng)答。嵌合的PCV1-2傳染性DNA克隆誘導(dǎo)特異于致病性PCV2免疫原性O(shè)RF2衣殼蛋白的免疫應(yīng)答的特殊能力，對豬來說仍然是非致病性的，這使得這種嵌合PCV1-2克隆特別適合用作遺傳學(xué)工程改造過的減毒活疫苗和其他類型的疫苗。
本發(fā)明的新的，純化的，和分離的核酸分子，包括在SEQ ID NO2中和在圖9中示出的克隆的嵌合PCV1-2 DNA的完整長度DNA序列，并且以專利保藏號PTA-3912在美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏；它的互補(bǔ)鏈(即，反向和相對的堿基對)或與所述嵌合核苷酸序列具有至少95％的同源性的核苷酸序列(即完整基因的主要活性部分)。可以用本領(lǐng)域所熟知的常規(guī)方法，制備具有高度同源性的互補(bǔ)鏈或核苷酸序列，例如，通過本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)或高嚴(yán)格性雜交技術(shù)制備。在SEQ IDNO3和圖10中同樣示出了包括克隆的嵌合PCV1-2 DNA的免疫原性衣殼基因的DNA序列的純化的和分離的核酸分子。
含有所述嵌合核酸分子的合適的細(xì)胞，能獨(dú)特地產(chǎn)生活的傳染性嵌合豬環(huán)狀病毒。正如本文所披露的，所述活的，傳染性嵌合病毒是通過體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，由所述嵌合DNA克隆衍生的?？寺〉那逗螾CV1-2 DNA的優(yōu)選例子，是在SEQ ID NO2和圖9中所示出的核苷酸序列。本發(fā)明還預(yù)計(jì)所述嵌合病毒源于所述嵌合核苷酸序列的互補(bǔ)鏈或與所述嵌合核苷酸序列具有至少95％同源性的高同源性的核苷酸序列。
本發(fā)明的范圍還包括含有本文所披露的新的重組核酸分子的具有生物學(xué)功能的質(zhì)粒，和病毒載體等，用包括所述嵌合的和分子DNA克隆的載體轉(zhuǎn)染過的合適的宿主細(xì)胞以及免疫原性多肽表達(dá)產(chǎn)物。特別優(yōu)選的免疫原性蛋白具有在SEQ ID NO4和圖11中所示出的氨基酸序列。本發(fā)明還包括它的生物學(xué)活性變體。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員無需過多的努力，就可以了解如何修飾，取代，缺失來自所述多肽序列的氨基酸，并且生產(chǎn)保留了與親本序列相同或大體上相同的活性的生物學(xué)活性變體等。
為了生產(chǎn)本發(fā)明的免疫原性多肽產(chǎn)物，所述方法可以包括以下步驟以允許表達(dá)多肽產(chǎn)物的方式，在合適的營養(yǎng)條件下生長用本文所披露的新的重組核酸分子轉(zhuǎn)染過的原核或真核宿主細(xì)胞，并且通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法分離由所述核酸分子表達(dá)的需要的多肽產(chǎn)物?？梢岳斫獾氖?，所述免疫原性蛋白可以通過其他技術(shù)制備，例如，通過生物化學(xué)合成等。
嵌合病毒和分子DNA克隆的疫苗以及使用它們的方法同樣包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。接種過的豬能夠免受嚴(yán)重病毒感染和由PCV2導(dǎo)致的PMWS。通過給豬施用免疫有效量的本發(fā)明的疫苗，所述新方法能夠保護(hù)需要保護(hù)的豬免受病毒感染或PMWS，例如，包括免疫原性量的嵌合PCV1-2 DNA的疫苗，克隆的嵌合病毒，含有PCV1-2的嵌合DNA的質(zhì)?；虿《据d體，多肽表達(dá)產(chǎn)物，重組PCV2 DNA等?？梢詫⒅T如PRRSV，PPV，其他傳染性豬致病劑和免疫刺激劑的其他抗原同時(shí)提供給豬，以便提供針對病毒感染的廣譜性保護(hù)。
例如，所述疫苗包括傳染性嵌合PCV1-2 DNA，存在于合適的質(zhì)?；蜉d體上的克隆的PCV嵌合DNA基因組，例如，pSK載體，無毒的、活的嵌合病毒，失活的嵌合病毒等，它們與無毒性的生理學(xué)上可接受的載體組合，并且任選與一種或多種佐劑組合。所述疫苗還可以包括本文所披露的傳染性PCV2分子DNA克隆。傳染性嵌合PCV1-2 DNA，含有傳染性嵌合病毒基因組的質(zhì)粒DNA以及活的嵌合病毒是優(yōu)選的，而活的嵌合病毒是最優(yōu)選的。本發(fā)明的無毒的，活的病毒疫苗與使用減毒的，活的病毒的傳統(tǒng)病毒疫苗相比具有優(yōu)點(diǎn)，后者存在恢復(fù)有毒力狀態(tài)的危險(xiǎn)，或者殺傷細(xì)胞培養(yǎng)物增殖的所有病毒，可能不能誘導(dǎo)用于預(yù)防病毒性疾病的足夠的抗體免疫應(yīng)答。
可以與本發(fā)明的疫苗組合使用的佐劑是能增強(qiáng)所述豬對所述疫苗的免疫應(yīng)答的佐劑。所述佐劑可以在與所述疫苗相同的時(shí)間和相同的部位使用，或者在不同的時(shí)間施用，例如，作為加強(qiáng)劑使用。佐劑還可優(yōu)選以與施用疫苗不同的方式和部位給所述豬施用。合適的佐劑包括，但不局限于氫氧化鋁(明礬)，免疫刺激復(fù)合物(ISCOMS)，非離子嵌段聚合物或共聚物，細(xì)胞因子(如IL-1，IL-2，IL-7，IFN-α，IFN-β，IFN-γ等)，皂苷，單磷酰脂質(zhì)A(MLA)，和胞壁酰二肽(MDP)等。其他合適的佐劑包括，例如，硫酸鋁鉀，從大腸桿菌中分離的熱不穩(wěn)定性或熱穩(wěn)定性腸毒素，霍亂毒素或它的B亞基，白喉毒素，破傷風(fēng)毒素，百日咳毒素，弗氏不完全或完全佐劑等。在使用之前，可以使諸如白喉毒素，破傷風(fēng)毒素和百日咳毒素的基于毒素的佐劑失活，例如，通過用甲醛處理使它失活。
所述疫苗還可以包括其他抗原，以便增強(qiáng)傳染性嵌合PCV DNA克隆的免疫學(xué)活性，所述克隆如豬生殖和呼吸綜合征病毒(PRRSV)，豬細(xì)小病毒(PPV)，其他傳染性豬致病劑和免疫刺激劑。
本發(fā)明的新的疫苗不局限于任何特定類型或制備方法。所述克隆的病毒疫苗包括，但不局限于傳染性DNA疫苗(即利用質(zhì)粒，載體或其他常規(guī)載體將DNA直接注射到豬體內(nèi))，活的疫苗，修飾過的活的疫苗，失活的疫苗，亞單位疫苗，減毒疫苗，遺傳工程疫苗等。所述疫苗是通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法制備的。
所述活的病毒疫苗通常是最需要的疫苗，就是說，能在所述疫苗受體內(nèi)激活所有可能的免疫應(yīng)答，包括系統(tǒng)性，局部，體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。另一方面，滅活的疫苗只能誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。不過，雖然活的病毒疫苗是最理想的，但是它具有若干缺陷，例如，受活的意外病毒劑污染的潛在危險(xiǎn)或所述病毒在野外恢復(fù)毒力的危險(xiǎn)。值得注意的是，本發(fā)明的獨(dú)特的PCV1-2嵌合DNA克服了所述缺陷。僅使用致病性PCV2的免疫原性基因，所述嵌合DNA構(gòu)成了活的，復(fù)制的嵌合病毒，它是非致病性的，但仍然能誘導(dǎo)活的病毒疫苗針對致病性PCV2病毒的全面的，有利的免疫應(yīng)答。基于所述嵌合病毒的活的病毒疫苗，基本上少有恢復(fù)成致病性表型的機(jī)會(如果有)。因此，基于非致病性的PCV1的結(jié)構(gòu)的新的嵌合病毒，與重組PCV2 DNA病毒，任何活的，減毒的PCV2疫苗或任何其他類型的用于誘導(dǎo)針對PCV2感染的免疫的用于PCV2的疫苗相比，具有巨大的優(yōu)點(diǎn)。
盡管活的病毒疫苗是最優(yōu)選的，可用于接種豬的其他類型的疫苗具有本文所披露的新嵌合病毒和其他抗原。為了制備失活的病毒疫苗，例如，來自傳染性DNA克隆的病毒增殖，是通過本領(lǐng)域已知方法或本文所披露的方法進(jìn)行的。然后，通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所普遍公知的方法優(yōu)化系列病毒滅活。
失活的病毒疫苗可以通過用諸如福爾馬林或疏水性溶劑，酸之類的滅活劑處理衍生自克隆的PCV DNA的嵌合病毒，通過用紫外線或X-射線輻射，通過加熱等方法制備。滅活是通過本領(lǐng)域所了解的方法進(jìn)行的。例如，在化學(xué)滅活中，用足夠數(shù)量或濃度的滅活劑，在足夠高(或低，這取決于所述滅活劑)的溫度下或pH下，處理合適的病毒樣品或含有所述病毒的血清樣品足夠的時(shí)間，以便使所述病毒失活。熱滅活是在一定溫度下進(jìn)行足夠長的時(shí)間以滅活病毒。輻射滅活是通過使用一定波長的光或其他能源進(jìn)行足以使所述病毒失活的時(shí)間而進(jìn)行的。如果所述病毒不能夠感染易受感染的細(xì)胞的話，就認(rèn)為所述病毒是失活的。
亞單位疫苗的制備通常不同于修飾過的活疫苗或失活的疫苗的制備。在制備亞單位疫苗之前，必須確定所述疫苗的保護(hù)性或抗原性成分。所述保護(hù)性或抗原性成分包括病毒衣殼蛋白的某些氨基酸區(qū)段或片段，它們能在豬體內(nèi)產(chǎn)生特別強(qiáng)的保護(hù)性或免疫應(yīng)答；單個(gè)或多個(gè)病毒衣殼蛋白本身，它們的寡聚體，以及病毒衣殼蛋白的高級締合物(這種締合物形成了病毒的亞結(jié)構(gòu)或所述亞結(jié)構(gòu)的可識別的部分或單位)；存在于病毒表面上或病毒表面附近，或存在于病毒亞結(jié)構(gòu)中的寡糖苷，糖脂或糖蛋白，如與病毒締合的脂蛋白或脂基等。優(yōu)選將衣殼蛋白，如由ORF2基因編碼的蛋白用作所述亞單位疫苗的抗原性成分。還可以使用由所述傳染性DNA克隆編碼的其他蛋白。這些免疫原性成分可以通過本領(lǐng)域已知的方法方便地鑒定。一旦鑒定所述病毒的保護(hù)性或抗原性部分(即“亞基”)之后，就可以用本領(lǐng)域已知的方法純化和/或克隆。所述亞單位疫苗與基于活病毒的其他疫苗相比具有優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樗鰜喕?，如病毒的高度純化的亞基，與完整的病毒相比具有較弱的毒性。
如果所述亞單位疫苗是通過重組遺傳學(xué)技術(shù)生產(chǎn)的話，舉例來說，通過諸如ORF2(衣殼)基因的克隆的亞單位的表達(dá)，可以通過本領(lǐng)域所公知的方法優(yōu)化(例如，參見Maniatis等，″Molecular CloningA Laboratory Manual，″Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，MA.，1989)。如果所使用的亞單位體現(xiàn)了所述病毒的完整的結(jié)構(gòu)特征，如作為完整的衣殼蛋白的話，從病毒中分離它的方法必須進(jìn)行優(yōu)化。在任何場合下，在對所述失活方法進(jìn)行優(yōu)化之后，在生產(chǎn)之前，可以對亞單位純化方法進(jìn)行優(yōu)化。
為了用致病性克隆制備減毒的疫苗，首先通過本領(lǐng)域已知的方法對適應(yīng)組織培養(yǎng)物的，活的，致病性的PCV2進(jìn)行減毒(使它變成非致病性的或無害的)，通常是通過細(xì)胞培養(yǎng)而連續(xù)傳代。致病性克隆的減毒，還可以通過基因缺失或病毒生產(chǎn)基因的突變而完成。然后，可以將減毒的PCV2用于構(gòu)建其他嵌合的PCV1-2病毒，所述病毒保留了PCV1的非致病表型，不過，在免疫原性性狀的強(qiáng)度方面可以改變，所述性狀是通過重組技術(shù)從PCV2基因組中選擇的。
最優(yōu)選的疫苗利用了活的嵌合病毒DNA克隆，特別是含有克隆在非致病性PCV1主鏈上的PCV2的免疫原性基因的克隆。有利的是，通過遺傳工程構(gòu)建的天然無毒的所述活的嵌合病毒，不需要花費(fèi)時(shí)間的減毒過程。所述病毒能獨(dú)特地用作活的，但是非致病性的復(fù)制型病毒，它能在病毒復(fù)制期間產(chǎn)生針對PCV2的免疫原性蛋白，所述蛋白隨后能誘導(dǎo)針對致病性PCV2的完整范圍的免疫應(yīng)答。
作為另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明的優(yōu)選的活的嵌合病毒提供了遺傳學(xué)穩(wěn)定的疫苗，所述疫苗比其他類型的減毒疫苗更便于制備，保存和送遞?；谇逗喜《镜臒o毒和減毒疫苗，一般被認(rèn)為是與傳統(tǒng)的修飾的活的疫苗同樣安全(如果不是更安全)(J.Arroyo等，“使黃熱病毒/日本腦炎病毒嵌合疫苗(ChimeriVax-JE)的神經(jīng)毒性減弱的分子基礎(chǔ)”，J.Virol.75(2)934-942(2001)；F.Guirakhoo等，“在非人靈長類中重組嵌合黃熱-2型登革熱病毒是免疫原性的和保護(hù)性的”，J.Virol.74(12)5477-5485(2000)；S.Tang等，“針對脊髓灰質(zhì)炎型猴免疫缺陷病毒疫苗遺傳穩(wěn)定性和免疫原性之間的相關(guān)性”，J.Virol.71(10)7841-7850(1997))。例如，針對日本腦炎病毒(JEV)的ChimeriVax-JE疫苗，它是黃熱病毒疫苗YFV17D的遺傳工程衍生物，其中，編碼YFV17D的結(jié)構(gòu)蛋白prM和E的基因被減毒的JEVSA14-14-2株的相應(yīng)的基因所取代，在體外和體內(nèi)長期傳代之后表現(xiàn)出遺傳學(xué)穩(wěn)定性(J.Arroyo等，2001，同上)。針對2型登革熱的另一種嵌合病毒疫苗ChimeriVax-D2(它是減毒的嵌合黃熱病(YF))2型登革熱(登革熱-2) 病毒是遺傳學(xué)穩(wěn)定的；據(jù)報(bào)導(dǎo)，它的序列在Vero細(xì)胞中經(jīng)過18次傳代之后沒有改變(F.Guirakhoo等，2000，同上)。
本發(fā)明的另一種優(yōu)選的疫苗，利用合適的質(zhì)粒將非致病性嵌合DNA克隆送遞到豬體內(nèi)。與使用活的或滅活的細(xì)胞培養(yǎng)物增殖的完整病毒的傳統(tǒng)疫苗相反，本發(fā)明提供了用含有傳染性嵌合病毒基因組的質(zhì)粒DNA直接接種豬的方法。
本發(fā)明另一種需要的遺傳工程疫苗是通過本領(lǐng)域已知技術(shù)生產(chǎn)的。所述技術(shù)包括，但不局限于進(jìn)一步操作重組DNA，修飾或取代重組蛋白的氨基酸序列等。
例如，基于重組DNA技術(shù)的遺傳工程疫苗，是通過鑒定編碼負(fù)責(zé)誘導(dǎo)豬體內(nèi)的較強(qiáng)的免疫或保護(hù)反應(yīng)的蛋白的病毒基因的替代部分制備的(例如，源于ORF3，ORF4等的蛋白)?？梢詫⑺鲨b定的基因或免疫顯性片段克隆到諸如桿狀病毒載體的標(biāo)準(zhǔn)蛋白表達(dá)載體上，并且用于感染合適的宿主細(xì)胞(例如，參見O′Reilly等，“桿狀病毒表達(dá)載體實(shí)驗(yàn)室手冊”，″Freeman & Co.，1992)。培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，以便表達(dá)所需要的疫苗蛋白，可以將所述疫苗蛋白純化到需要的程度，并且配制成合適的疫苗產(chǎn)品。
如果所述克隆保持了任何不希望的導(dǎo)致發(fā)病的天然能力的話，還可以標(biāo)出病毒基因組中決定毒力的核苷酸序列的位置，并且，通過諸如定點(diǎn)誘變的方法，對通過遺傳工程改造使所述病毒無毒。定點(diǎn)誘變能夠添加，缺失或改變一個(gè)或多個(gè)核苷酸(例如，參見Zoller等，DNA3479-488，1984)。合成含有所需突變的寡核苷酸，并且與單鏈病毒DNA的一部分退火。將通過這種方法得到的雜合分子用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌。然后將分離的含有合適突變的雙鏈DNA用于通過與后者的限制片段連接，生產(chǎn)完整長度的DNA，然后將所得到的DNA轉(zhuǎn)染到合適的細(xì)胞培養(yǎng)物中。將所述基因組連接到合適的載體上，以便可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知的任何標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移。將所述載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中，以便生產(chǎn)病毒后代，這一目的可以使用任何常規(guī)方法實(shí)現(xiàn)，如磷酸鈣或DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，電穿孔，原生質(zhì)體融合和其他眾所周知的技術(shù)(例如，Sambrook等，″Molecular CloningALaboratory Manual，″Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。這樣，克隆的病毒具有需要的突變。另外，可以合成包括所述合適的突變的兩種寡核苷酸?？梢宰屢陨蟽煞N寡核苷酸退火，以便形成能夠插入所述病毒DNA的雙鏈DNA，從而生產(chǎn)完整長度的DNA。
例如，可用于疫苗中的遺傳工程蛋白可以在昆蟲細(xì)胞，酵母細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)?？梢酝ㄟ^常規(guī)方法純化或分離的所述遺傳工程蛋白，能夠直接接種到豬體內(nèi)，以便產(chǎn)生對由PCV2導(dǎo)致的病毒感染或斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的預(yù)防作用。
可以用含有從病毒中獲得的或由病毒基因組拷貝的編碼所述病毒的一種或多種免疫顯性蛋白的核酸分子的轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化昆蟲細(xì)胞系(如HI-FIVE)。例如，所述轉(zhuǎn)移載體包括線性化的桿狀病毒DNA和含有所需多核苷酸的質(zhì)粒。可以用線性化的桿狀DNA和質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染所述宿主細(xì)胞系，以便制備所述重組桿狀病毒。
另外，可以將來自患有PMWS豬體內(nèi)的，編碼一種或多種衣殼蛋白的DNA，傳染性PCV2分子DNA克隆或克隆的PCV嵌合DNA基因組，插入諸如痘病毒或腺病毒的活的載體內(nèi)，并用作疫苗。
給需要預(yù)防病毒感染或PMWS的豬施用免疫有效量的本發(fā)明的疫苗。用于接種所述豬的免疫有效量或免疫原性量，可以通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)方便地確定或方便地滴定。有效量是這樣一種量其中，獲得了對所述疫苗的足夠的免疫應(yīng)答，以便保護(hù)接觸能導(dǎo)致PMWS的病毒的豬。優(yōu)選在一定程度上對所述豬提供保護(hù)，其中，所述病毒性疾病的一種至所有的不良生理學(xué)癥狀或作用均被明顯減弱，緩解或完全抑制。
所述疫苗可以用單一劑量施用或用重復(fù)的劑量施用。例如，劑量可以為1-1000微克含有所述傳染性嵌合DNA基因組的質(zhì)粒DNA(取決于所述疫苗的免疫活性成分的濃度)，不過，應(yīng)當(dāng)不包括足以導(dǎo)致病毒感染的不良反應(yīng)或生理學(xué)癥狀的量的基于病毒的抗原。根據(jù)豬的體重，抗原的濃度和其他常見因素確定或滴定活性抗原性制劑的劑量的方法，為本領(lǐng)域所公知。優(yōu)選將所述傳染性嵌合病毒DNA克隆用作疫苗，或在體外制備活的傳染性嵌合病毒，然后將所述活的嵌合病毒用作疫苗。在這種情況下，可以給豬提供100-200微克克隆的嵌合PCVDNA，或活的嵌合病毒的大約10000 50％組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)。
所述疫苗優(yōu)選給尚未接觸PCV病毒的豬施用。含有所述嵌合PCV1-2傳染性DNA克隆或其他抗原性形式的疫苗，可以方便地通過鼻內(nèi)，經(jīng)皮(即涂在皮膚表面上以便系統(tǒng)吸收)，腸胃外等途徑施用。腸胃外施用途徑包括，但不局限于肌內(nèi)，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，真皮內(nèi)(即注射或以其他方式放置在皮膚下面)途徑等。由于肌內(nèi)和真皮內(nèi)接種途徑在使用病毒傳染性DNA克隆的其他研究中業(yè)已獲得成功(E.E.Sparger等，“通過注射貓免疫缺陷病毒分子克隆的DNA感染貓”，Virology 238157-160(1997)；L.Willems等，“將牛白血病原病毒轉(zhuǎn)染到綿羊體內(nèi)”，Virology 189775-777(1992))，除了實(shí)際的鼻內(nèi)施用途徑之外，所述途徑是最優(yōu)選的。盡管不夠方便，但也可以通過淋巴內(nèi)接種途徑將所述疫苗接種到豬體內(nèi)。一種獨(dú)特的，高度優(yōu)選的施用方法，包括將含有PCV1-2嵌合體的質(zhì)粒DNA通過肌內(nèi)，真皮內(nèi)，淋巴內(nèi)途徑等直接注射到豬體內(nèi)。
在以液體形式施用時(shí)，本發(fā)明的疫苗可以水溶液，糖漿，酏劑，和酊劑形式制備。所述制劑為本領(lǐng)域所公知，并且通常是通過將抗原和其他常見的添加劑溶解在合適的載體或溶劑系統(tǒng)中制備的。合適的載體或溶劑包括，但不局限于水，鹽溶液，乙醇，乙二醇，甘油等。例如，典型的添加劑是得到認(rèn)證的染料，芳香劑，甜味劑，和抗微生物防腐劑，如硫柳汞(乙基汞硫代水楊酸鈉)。所述溶液可以是穩(wěn)定化的，例如，通過添加部分水解的明膠，山梨醇或細(xì)胞培養(yǎng)基，并且可以通過常規(guī)方法，用本領(lǐng)域已知的試劑緩沖，如磷酸氫鈉，磷酸二氫鈉，磷酸氫鉀，磷酸二氫鉀，以及它們的混合物等。
液體制劑可以包括含有與其他標(biāo)準(zhǔn)共同制備制劑組合的懸浮或乳化劑的懸浮液或乳液。以上類型的液體制劑可以通過常規(guī)方法制備。例如，懸浮液可以用膠體磨制備。例如，乳液可以用勻漿機(jī)制備。
為了注射到體液系統(tǒng)中而設(shè)計(jì)的腸胃外制劑，需要合適的等滲性并且將pH緩沖到與豬體液相當(dāng)?shù)乃?。根?jù)需要，可以用氯化鈉和其他鹽適當(dāng)調(diào)整等滲性?？梢詫⒅T如乙醇或丙二醇的合適溶劑用于提高所述成分在制劑中的溶解度和所述液體制劑的穩(wěn)定性?？捎糜诒景l(fā)明疫苗中的其他添加劑包括，但不局限于葡萄糖，常規(guī)抗氧化劑和常規(guī)螯合劑，如乙二胺四乙酸(EDTA)。在使用之前，還必須對腸胃外劑型進(jìn)行消毒。
本發(fā)明的另一種實(shí)施方案包括制備PCV1-2的傳染性，非致病性嵌合核酸分子的新方法，該方法包括除去編碼傳染性非致病性PCV1的核酸分子的開放讀框(ORF)基因，用編碼傳染性致病性PCV2的核酸分子的免疫原性O(shè)RF基因取代所述相同的位點(diǎn)，并且回收所述嵌合核酸分子。所述核酸分子通常是DNA。優(yōu)選的方法是用本文所披露的PCV2的傳染性致病性分子DNA的免疫原性O(shè)RF2衣殼基因取代非致病性PCV1 DNA的ORF2基因?？梢岳斫獾氖牵渌鸒RF位點(diǎn)或它的免疫原性片段，可以在PCV1和PCV2 DNA之間交換，以便按照本文所披露的方法構(gòu)建減毒的傳染性嵌合DNA克隆。
然后將所述重組核酸分子用于構(gòu)建本發(fā)明的活的，傳染性的，復(fù)制型嵌合病毒，所述病毒有利地保留了PCV1的非致病性性質(zhì)，并仍然能表達(dá)致病性PCV2的免疫原性O(shè)RF2蛋白，并且誘導(dǎo)針對致病性PCV2的完整的免疫應(yīng)答。所述PCV1-2 DNA克隆優(yōu)選起著遺傳工程改造的無毒的，活的疫苗的作用，可以在豬體內(nèi)抗PCV2感染和PMWS。
按本文所述方法，構(gòu)建了PCV2的傳染性DNA克隆，以便可以制備生物學(xué)純的和均勻的傳染性病毒原種，用于病理學(xué)研究和開發(fā)非致病性嵌合疫苗。與以往觀察到的結(jié)果相比，通過使用這種分子DNA克隆和源于所述分子DNA克隆的生物學(xué)純的和均勻的傳染性PCV2病毒原種，可以更明顯地表征與PCV2感染相關(guān)的臨床疾病進(jìn)程、病毒分布和病理學(xué)病變，這使得它本身可用于開發(fā)本發(fā)明需要的疫苗制品。
PCV2分子克隆是通過將兩個(gè)拷貝的完整PCV2基因組串聯(lián)在pSK載體上而制備的。與現(xiàn)有技術(shù)中所披露的單一拷貝基因組形成鮮明對照的是，通過本文所披露的方法制備的傳染性DNA PCV2克隆包括以串聯(lián)重復(fù)形式連接在一起的兩個(gè)完整拷貝的PCV2基因組。將兩個(gè)拷貝的基因組串聯(lián)在一起，提供了模擬PCV2的常見環(huán)狀基因組的類似的環(huán)狀基因組。在傳染性DNA PCV2克隆中具有兩個(gè)串聯(lián)的基因組拷貝的優(yōu)點(diǎn)是，當(dāng)所述傳染性DNA克隆在體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)染時(shí)，能夠增強(qiáng)復(fù)制。因此，本發(fā)明的克隆能夠比現(xiàn)有的單拷貝基因組更有效并且更經(jīng)濟(jì)地工作。
為了研究病毒復(fù)制的遺傳決定因素和在宿主體內(nèi)的毒力，用所述分子病毒克隆感染動物是極為有效的。業(yè)已將2型豬環(huán)狀病毒(PCV2)認(rèn)定為斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的致病劑。PMWS是豬的一種復(fù)雜的疾病綜合征，并且在PMWS的臨床表現(xiàn)方面涉及到多種因素。不過，由于其他常見的豬致病劑在患病豬的組織勻漿中的存在而導(dǎo)致的生產(chǎn)生物學(xué)純形式的PCV2的難度，業(yè)已妨礙了僅僅由于PCV2感染所造成的臨床疾病和病理學(xué)病變的明確表征。這是第一次構(gòu)建了PCV2的傳染性分子DNA克隆，并用于表征通過用所述分子克隆直接體內(nèi)轉(zhuǎn)染豬而導(dǎo)致的與PCV2感染相關(guān)的疾病和病理學(xué)損傷。
在轉(zhuǎn)染到PK-15細(xì)胞中時(shí)，證實(shí)了源于所述分子克隆的均勻的PCV2活的病毒原種是傳染性的。所述克隆的PCV2基因組DNA在直接注射到無特定病原體(SPF)豬的肝臟和表淺回腸淋巴結(jié)中時(shí)，也是傳染性的。用所述克隆的PCV2質(zhì)粒DNA注射過的動物，出現(xiàn)了類似于通過鼻內(nèi)接種均勻的，傳染性PCV2活的病毒原種所誘導(dǎo)的感染和疾病。在接種后第35天(DPI)，來自接種過的組的大部分豬體內(nèi)檢測到向PCV2-特異性抗體的血清轉(zhuǎn)變。
在用嵌合PCV1-2 DNA克隆接種過的豬體內(nèi)的病毒血癥的發(fā)作和持續(xù)，類似于用非致病性PCV1 DNA克隆接種過的豬，而在用PCV2克隆接種過的豬病毒血癥比后者出現(xiàn)的更早并且持續(xù)更長時(shí)間。在大部分PCV2接種的動物體內(nèi)檢測到病毒血癥始于第14DPI，并且持續(xù)大約2-4周。類似地，在35DPI進(jìn)行尸體剖檢的大部分接種過的豬，都發(fā)生了向PCV2-抗體的血清轉(zhuǎn)變。在接種過的豬的各種組織和器官中都檢測到PCV2抗原。肉眼可見的病變局限于肺和淋巴結(jié)，并且以全身增大的棕色淋巴結(jié)，不能收縮的肺和輕度多病灶棕色實(shí)變灶為特征。影響非致病性PCV1和嵌合PCV1-2接種的豬體內(nèi)的淋巴結(jié)的肉眼可見的病變是輕度的，并且僅局限于少數(shù)動物，而致病性PCV2接種過的豬都具有淋巴組織的中度至重度腫脹和脫色(參見下面的表9)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，嵌合PCV1-2接種的動物體內(nèi)的淋巴結(jié)的肉眼可見的病變的評分，類似于非致病性PCV1接種的豬的肉眼可見的病變的評分。在21DPI，PCV2接種過的豬的肉眼可見的病變在統(tǒng)計(jì)學(xué)上比PCV1和嵌合的PCV1-2接種的豬更嚴(yán)重。在接種過的(感染過的)豬的多種組織和包括大腦，肺，心臟，腎臟，扁桃腺，淋巴結(jié)，脾臟，回腸和肝臟的器官中檢測到了組織病理學(xué)病變和PCV2-特異性抗原。用PCV2分子DNA克隆以及由所述分子DNA克隆體外制備的傳染性病毒，在多種組織和器官中再現(xiàn)了類似于PMWS的組織病理學(xué)病變。在微觀水平上，在21和49DPIs，嵌合PCV1-2接種過的動物，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上比PCV2接種過的動物具有更小的顯微鏡下病變。在嵌合PCV1-2接種的豬的淋巴結(jié)中的顯微鏡下病變評分，類似于非致病性PCV1，交互的PCV2-1和未接種過的對照動物的評分。在致病性PCV2接種的動物的包括肺，肝臟，淋巴，脾臟，大腦，心臟，腎臟和扁桃腺組織的多種組織中，發(fā)現(xiàn)了中度至重度顯微鏡下病變。不過，在嵌合PCV1-2接種的動物體內(nèi)，輕度至中度顯微鏡下病變僅局限于肝臟，淋巴結(jié)和腎臟組織(參見下面的表10)。
在對照或任何接種過的豬體內(nèi)沒有顯著的PMWS臨床體征。盡管用克隆的PCV2質(zhì)粒DNA(傳染性PCV2 DNA克隆)或用生物學(xué)純的PCV2傳染性病毒原種沒有觀察到PMWS的特有臨床癥狀，PCV2明顯負(fù)責(zé)在以下說明性實(shí)施例中再現(xiàn)的PMWS樣組織病理學(xué)病變。得到普遍認(rèn)可的是，PCV2是決定臨床PMWS發(fā)作的主要的，但不是唯一的致病劑。
本發(fā)明更明確地表征了僅僅由PCV2感染造成的臨床進(jìn)程和病理學(xué)病變。在下面的說明性實(shí)施例中所提供的數(shù)據(jù)表明，便于復(fù)制的克隆的PCV2基因組DNA，可用于取代傳染性病毒，以便進(jìn)行PCV2病理學(xué)和免疫研究。盡管證實(shí)了PCV2是PMWS發(fā)展所必需的，諸如PRRSV，PPV等的其他因素或致病劑，可能是誘導(dǎo)與先前出現(xiàn)的PMWS病例相關(guān)的全部臨床體征和病變所需要的。不過，由于了解到PCV2是關(guān)鍵因素，本發(fā)明的新的傳染性，復(fù)制性病毒克隆，可以通過免疫學(xué)和分子遺傳學(xué)領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知的方法進(jìn)行進(jìn)一步修飾或進(jìn)行遺傳工程改造，以便獲得所需要的最佳免疫原性效果。
本文所披露的PCV2傳染性DNA克隆的可利用性，使得它適合開發(fā)遺傳工程減毒的疫苗，用于預(yù)防豬感染PCV2和PMWS。已知在天然感染期間，PCV2能在淋巴結(jié)，肺和肝臟中復(fù)制，并且主要病理學(xué)作用之一是通過降解淋巴樣結(jié)構(gòu)損傷免疫系統(tǒng)(S.Krakowka等，2001，同上；G.M.Allan和J.A.Ellis，2000，同上；S.Kennedy等，2000，同上；G.J.Wellenberg等，2000，同上；G.M.Allan等，“通過用豬環(huán)狀病毒和豬細(xì)小病毒共同感染豬實(shí)驗(yàn)性再現(xiàn)嚴(yán)重衰竭性疾病”，J.Comp.Pathol.1211-11(1999)；J.Ellis等，“在限菌小豬崽體內(nèi)再現(xiàn)斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征的損傷”，J.Vet.Diagn.Invest.113-14(1999)；J.C.Harding和E.G.Clark，1997，同上)。通過使用這種新的傳染性PCV2分子DNA克隆，能夠更明確地表征僅僅由PCV2導(dǎo)致的臨床疾病，病理學(xué)病變和病毒分布。
由于本文所披露的PCV2，PCV1，嵌合PCV1-2，和交互嵌合PCV2-1傳染性DNA克隆的可利用性，能夠更好地理解PCV基因的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系。Will等，“克隆的HBV DNA能在黑猩猩體內(nèi)導(dǎo)致肝炎”，Nature299740-742(1982)首次證實(shí)了利用克隆的乙型肝炎病毒DNA通過直接體內(nèi)注射感染黑猩猩的可行性。這種方法一直被用于研究若干種其他病毒的病毒復(fù)制和病理學(xué)(T.W.Dubensky等，“將病毒和質(zhì)粒DNA直接轉(zhuǎn)染到小鼠的肝臟或脾臟中”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 817529-7533(1984)；R.Girones等，“能感染天然宿主的土撥鼠肝炎病毒的分子克隆的完整核苷酸序列”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 861846-1849(1989)；N.L.Letvin等，“操作HIV的風(fēng)險(xiǎn)”，Nature 349573(1991)；C.Seeger等，“地松鼠肝炎病毒的克隆基因組在動物體內(nèi)是傳染性的”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.815849-5852(1984)；E.E.Sparger等，“通過注射貓免疫缺陷病毒分子克隆的DNA感染貓”，Virology 238157-160(1997)；R.Sprengel等，“在體內(nèi)DNA轉(zhuǎn)染之后嗜肝DNA病毒基因組之間的同源重組用于研究病毒傳染性”，Virology 159454-456(1987)；H.t Will等，1982，同上；L.Willems等，“將牛白血病原病毒活體轉(zhuǎn)染到綿羊體內(nèi)”，Virology 189775-777(1992))。
在本發(fā)明中，傳染性PCV2分子DNA克隆的構(gòu)建，以及將克隆的PCV2質(zhì)粒DNA直接注射到豬的肝臟和淋巴結(jié)內(nèi)所導(dǎo)致的感染的證實(shí)，有利于PCV2研究。這種體內(nèi)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)將會增強(qiáng)對PCV2基因的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的研究，利用在體外構(gòu)建的重組質(zhì)粒檢測PCV2的不同區(qū)域或基因在宿主細(xì)胞中病毒復(fù)制和致病作用方面的作用。PCV2的復(fù)制和致病作用可以在體內(nèi)研究，而沒有必要通過在細(xì)胞培養(yǎng)物中增殖PCV2生產(chǎn)傳染性病毒原種。這一點(diǎn)是有利的，因?yàn)橄盗屑?xì)胞培養(yǎng)物傳代，可能會選擇病毒變體。使用克隆的PCV2基因組DNA取代活的病毒進(jìn)行動物研究的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，比較容易對接種的劑量進(jìn)行定量。通過分光光度計(jì)，可以方便地測定用于動物接種的克隆PCV2 DNA的量，而活的PCV2病毒的劑量需要在細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行傳染力滴定，并且通過IFA證實(shí)感染。用克隆的PCV2質(zhì)粒DNA直接注射動物，消除了與在動物研究中存在于組織勻漿接種物中的其他固有的豬致病劑相關(guān)的問題。
在本發(fā)明中，免疫原性O(shè)RF2衣殼基因在致病性PCV2和非致病性PCV1之間變換，以便產(chǎn)生嵌合的PCV1-2傳染性DNA克隆的獨(dú)特結(jié)構(gòu)。令人吃驚并且有利的是，嵌合的PCV1-2傳染性克隆能在體外和體內(nèi)復(fù)制，表達(dá)所述免疫原性O(shè)RF2衣殼抗原，并且誘導(dǎo)針對PCV2 ORF2的特異性抗體應(yīng)答，但是保留了PCV1的非致病性質(zhì)。嵌合的PCV1-2傳染性DNA克隆具有誘導(dǎo)針對PCV2的強(qiáng)免疫應(yīng)答的能力，同時(shí)僅誘導(dǎo)具有輕度病理學(xué)病變的有限感染，這種感染類似于非致病性PCV1的感染。對于疫苗開發(fā)來說，克隆DNA的比較便于保存和穩(wěn)定性，以及重組PCV2質(zhì)粒DNA和嵌合PCV1-2 DNA克隆大規(guī)模生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性，提供了將活的，傳染性病毒DNA疫苗或遺傳工程生產(chǎn)，減毒的病毒疫苗送遞到豬體內(nèi)的吸引人的手段，因此，在本發(fā)明中所披露的嵌合PCV1-2傳染性DNA克隆，是抗PCV2感染和PMWS的有用的疫苗候選物。
應(yīng)當(dāng)理解的是，本文所使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所普遍了解的相同含義。對于本發(fā)明來說，術(shù)語“傳染性的”表示病毒能在豬體內(nèi)復(fù)制，而無論所述病毒是否會導(dǎo)致任何疾病。“SFP”表示無特異性病原體的豬?！跋蘧必i表示無菌豬。術(shù)語“PCV2質(zhì)粒DNA”，“PCV2基因組DNA”和“PCV2分子DNA”可以相互交換使用，用來表示相同的克隆核苷酸序列。
傳染性PCV1/PCV2嵌合DNA克隆(菌株名稱“PCV1-2嵌合體”)，傳染性PCV2分子DNA克隆(菌株名稱“PCV2克隆”)和從患有嚴(yán)重PMWS的豬體內(nèi)分離的并且確定為分離編號40895(菌株名稱PCV2#40895”)的源于PCV2的Iowa樣品的生物學(xué)純的和均勻的PCV2原種，是按照布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，遵照37 C.F.R.§1.808規(guī)定的條件，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209，U.S.A.保藏的。本文所披露的DNA序列包含在克隆到pBluescript SK(+)載體(pSK)(StratageneInc.，La Jolla，CA)上的6,490bp的質(zhì)粒內(nèi)，并且轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。所述含有傳染性嵌合PCV1-2 DNA克隆(被確定為“嵌合豬環(huán)狀病毒1型(PCV1)和2型(PCV2)傳染性DNA克隆”)和傳染性PCV2分子DNA克隆(確定為“2型豬環(huán)狀病毒傳染性DNA克隆(PCV2)”)的質(zhì)粒業(yè)已于2001年12月7日交由ATCC保藏，并且分別授予了ATCC專利保藏號PTA-3912和PTA-3913。應(yīng)當(dāng)理解的是，可以利用定點(diǎn)誘變和本文所披露的技術(shù)方便地構(gòu)建的其他質(zhì)粒也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。分離物編號為40895的生物學(xué)純的和均勻的PCV2樣品(被確定為“2型豬環(huán)狀病毒(PCV2)”)，也于2001年12月7日交由ATCC保藏，并且確定的ATCC專利保藏號為PTA-3914。PCV2分離物編號40895的基因組(核苷酸)序列業(yè)已交由Genbank數(shù)據(jù)庫保存，并且從2000年7月23日開始可以公開獲得，編號為AF264042。
下面的實(shí)施例說明了本發(fā)明的某些方面。不過，應(yīng)當(dāng)理解的是，這些實(shí)施例只是用于說明目的，而不是要全面限定本發(fā)明的條件和范圍。應(yīng)當(dāng)理解的是，在提供典型的反應(yīng)條件(例如溫度，反應(yīng)時(shí)間等)時(shí)，可以使用規(guī)定范圍以上和以下的條件，只不過一般來說，使用起來不夠方便而已。這些實(shí)施例是在室溫(大約23℃-大約28℃)和大氣壓下進(jìn)行的。本文所提到的所有份數(shù)和百分比，都是以重量為基礎(chǔ)的，并且所有溫度都是以℃形式表示的，除非另有規(guī)定。
通過下面的非限定性實(shí)施例可以獲得對本發(fā)明的進(jìn)一步理解。
實(shí)施例1制備無PCV1污染的PK-15細(xì)胞系PCV2分離物的來源，是來自患有天然存在的PMWS的豬的脾組織樣品(PCV2系列鑒定號40895，被稱為“分離物40895”)(M.Fenaux等，2000，同上)。用PCV2-特異性抗體進(jìn)行的免疫組織化學(xué)染色(IHC)，證實(shí)了PCV2抗原在所述組織中的存在。將所述脾組織放在-80℃下保存待用。
從美國典型培養(yǎng)物保藏中心購買的PK-15細(xì)胞系(ATCC保藏號CCL-33)，用PCV1進(jìn)行持續(xù)感染(G.C.Dulac和A.Afshar，1989，同上)。由于只有PK-15細(xì)胞的一個(gè)亞群是持續(xù)感染的(id.)，通過終點(diǎn)稀釋制備了無PCV1污染的PK-15細(xì)胞系。方案是按以下方式進(jìn)行的在補(bǔ)充了10％胎牛血清(FBS)和1×抗生素(Life Technologies，Inc.)的含有Earle′s鹽和L-谷氨酰胺(Life Technologies，Inc.，Grand Island，NY)的MEM中生長PK-15細(xì)胞。將鋪滿的細(xì)胞單層胰蛋白酶化，然后對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并且進(jìn)行系列稀釋，使終點(diǎn)濃度為每0.2ml一個(gè)細(xì)胞。將所述終點(diǎn)稀釋液鋪平板到96孔平板上，并且讓它從一個(gè)單細(xì)胞開始生長成單層。利用能檢測和分辨PCV1和PCV2的PCR-RFLP測定方法，檢測來自每一個(gè)孔的細(xì)胞中PCV1 DNA的存在(M.Fenaux等，2000，同上)。隨后將通過PCR-RFLP測定檢測成陰性的來自所述孔的PK-15細(xì)胞用于擴(kuò)增。將無PCV1的PK-15的細(xì)胞系再繼代培養(yǎng)5代，并且在每一個(gè)世代，通過PCR發(fā)現(xiàn)PCV1 DNA是陰性的。
通過對來自ATCC的持續(xù)感染的PK-15細(xì)胞進(jìn)行終點(diǎn)稀釋，生產(chǎn)PCV1污染為陰性的四種細(xì)胞系。在經(jīng)過5次額外傳代之后，通過PCR證實(shí)所述細(xì)胞系保持PCV1陰性。隨后對所述細(xì)胞系之一進(jìn)行擴(kuò)增，并且證實(shí)在用PCV2分子DNA克隆轉(zhuǎn)染(圖2)和用PCV2病毒感染所述細(xì)胞時(shí)，能夠支持PCV2復(fù)制。將所述克隆細(xì)胞進(jìn)一步用于PCV2分子DNA克隆的體外轉(zhuǎn)染，以便制備生物學(xué)純的PCV2傳染性病毒原種，用于動物接種實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例2PCV2傳染性DNA克隆的構(gòu)建為了構(gòu)建PCV2分子DNA克隆，根據(jù)PCV2分離物40895的公開序列設(shè)計(jì)了一對PCR引物(M.Fenaux等，2000，同上)正向引物F-PCVSAC2(5′-GAACCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGT-3′)，如SEQ ID NO5所示；和反向引物R-PCVSAC2(5′-GCACCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA-3′)，如SEQ ID NO6所示。該引物對能擴(kuò)增PCV2的完整基因組，它具有一個(gè)包括獨(dú)特的SacII限制酶位點(diǎn)的重疊區(qū)(圖1)。用QIAamp DNA微量制備試劑盒(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)，從患有天然存在的PMWS的豬的脾組織樣品(分離物40895)中提取DNA(M.Fenaux等，2000，同上)。用Ampli TaqGold聚合酶(Perkin-Elmer，Norwalk，CT)，通過PCR擴(kuò)增提取的DNA。所述PCR反應(yīng)包括在95℃下進(jìn)行了9分鐘的最初的酶激活步驟，隨后進(jìn)行35輪在94℃下變性1分鐘，在48℃下退火1分鐘，在72℃下延伸3分鐘，并且在72℃下最終延伸7分鐘。通過凝膠電泳分離具有預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物，并且用Geneclean試劑盒(Bio 101，Inc.，LaJolla，CA)通過glassmilk方法純化。
為了構(gòu)建含有PCV2基因組的串聯(lián)二聚體的分子DNA克隆，首先，將包括完整PCV2基因組的PCR產(chǎn)物連接到advanTAge質(zhì)粒載體上(Clontech，Palo Alto，CA)。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。通過限制酶消化證實(shí)重組質(zhì)粒。通過用SacII限制酶消化，將完整長度的PCV2基因組DNA從advanTAge載體上切除。在37℃下用T4 DNA連接酶連接消化過的PCV2基因組DNA僅僅10分鐘，這有利于串聯(lián)二聚體的產(chǎn)生。隨后將所述串聯(lián)二聚體克隆到pBluescript SK(+)載體(pSK)上(Stratagene Inc.，La Jolla，CA)(圖1)。通過PCR，限制酶消化，和DNA測序，證實(shí)包括PCV2基因組的串聯(lián)二聚體(本文稱之為PCV2分子DNA克隆)的重組質(zhì)粒。通過分光光度法測定重組質(zhì)粒的DNA濃度。
具體地講，通過PCR擴(kuò)增PCV2(分離物40895)的完整基因組，以便構(gòu)建傳染性PCV2分子DNA克隆。將兩個(gè)拷貝的完整PCV2基因組以串聯(lián)形式連接到pSK載體上，以便產(chǎn)生PCV2分子DNA克隆(圖1)。通過PK-15細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)染，確定PCV2分子DNA克隆的傳染力。用PCV2-特異性抗體進(jìn)行的IFA證實(shí)了所述分子DNA克隆在體外是具有傳染性的，并且，大約10-15％的PK-15細(xì)胞被轉(zhuǎn)染過。通過IFA在轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞的細(xì)胞核中觀察到了PCV2-特異性抗原，并且，在較低程度上在細(xì)胞質(zhì)中觀察到了所述抗原(圖2)。用空的pSK載體模擬轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，保持PCV2抗原陰性。
實(shí)施例3用PCV2分子DNA克隆進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染，并且制備生物學(xué)純的和均勻PCV2轉(zhuǎn)染性病毒原種為了測試所述分子DNA克隆的體外傳染性，讓沒有PCV1污染的PK-15細(xì)胞在8孔LabTek腔室載玻片上生長。當(dāng)PK-15細(xì)胞達(dá)到大約85％的鋪滿度時(shí)，使用脂轉(zhuǎn)染胺Plus試劑，按照生長商提供的方法(LifeTechnologies，Inc)，用所述分子DNA克隆轉(zhuǎn)染細(xì)胞。用空的pSK載體模擬轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對照。轉(zhuǎn)染后3天，用含有80％丙酮和20％甲醇的溶液在4℃下固定細(xì)胞20分鐘，進(jìn)行使用PCV2-特異性兔多克隆抗血清的免疫熒光測定，以確定分子DNA克隆的體外感染力(見下文)。
為了制備用于動物接種實(shí)驗(yàn)的生物學(xué)純的和均勻的PCV2傳染性病毒原種，在T-25培養(yǎng)燒瓶中培養(yǎng)無PCV1污染的PK-15細(xì)胞，并且用PCV2分子DNA克隆轉(zhuǎn)染。在T-25燒瓶中，讓PK-15細(xì)胞生長到大約85％的鋪滿度。在轉(zhuǎn)染之前，用無菌PBS緩沖液洗滌所述細(xì)胞1次。對于在T-25燒瓶中進(jìn)行的每一次轉(zhuǎn)染反應(yīng)來說，將12微克的PCV2質(zhì)粒DNA與16微升的Plus試劑在0.35ml的MEM培養(yǎng)基中混合。將用空的pSK載體模擬轉(zhuǎn)染細(xì)胞的燒瓶用作陰性對照。在室溫下培養(yǎng)15分鐘之后，將稀釋在0.35ml MEM培養(yǎng)基中的50微升的脂轉(zhuǎn)染胺試劑添加到該混合物中，并且在室溫下再培養(yǎng)15分鐘。然后將該轉(zhuǎn)染混合物添加到含有2.5毫升新的MEM的PK-15細(xì)胞的T-25燒瓶中。在37℃下培養(yǎng)3小時(shí)之后，用含有2％FBS和1×抗生素的新的MEM培養(yǎng)基更換所述培養(yǎng)基。在轉(zhuǎn)染3天之后收獲轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞，并且在-80℃下保存待用。通過IFA測定所述病毒原種的傳染效價(jià)(參見下文)。
一般來說，通過用PCV2分子DNA克隆轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞制備生物學(xué)純的和均勻的PCV2傳染性病毒原種。通過體外轉(zhuǎn)染生產(chǎn)的PCV2毒粒是傳染性的，因?yàn)檗D(zhuǎn)染過的細(xì)胞裂解液能成功地用于感染PK-15細(xì)胞。因此，PCV2分子DNA克隆在用于體外轉(zhuǎn)染時(shí)能夠生產(chǎn)傳染性PCV2毒粒。測定用轉(zhuǎn)染細(xì)胞制備的均勻的PCV2病毒原種的傳染效價(jià)為1×104.5TCID50/ml。將該病毒原種用于接種第二組豬。用空的pSK載體模擬轉(zhuǎn)染的細(xì)胞裂解液不能感染PK-15細(xì)胞。
實(shí)施例4通過免疫熒光分析(IFA)進(jìn)行的病毒滴定為了測定均勻PCV2病毒原種的傳染效價(jià)，將PK-15細(xì)胞放在8孔LabTek腔室載玻片上培養(yǎng)。用MEM將所述病毒原種系列稀釋10倍，并且將每一種稀釋液接種到生長在LabTek腔室載玻片上的PK-15細(xì)胞單層的10個(gè)孔上。將未接種過的細(xì)胞的孔作對照。在接種之后第3天，用含有80％丙酮和20％甲醇的溶液，在4℃下將感染過的細(xì)胞固定20分鐘。在用PBS緩沖液洗滌所述細(xì)胞之后，用以1∶1000倍稀釋的PCV2-特異性兔單克隆抗體在37℃下培養(yǎng)感染過的細(xì)胞1小時(shí)(S.D.Sorden等，“用于檢測福爾馬林固定的，石蠟包埋的組織中2型豬環(huán)狀病毒的多克隆抗體型免疫組織化學(xué)方法的開發(fā)”，J.Vet.Diagn.Invest.11528-530(1999))。然后用PBS緩沖液洗滌所述細(xì)胞3次，并且用二級FITC-標(biāo)記的山羊抗兔IgG在37℃下培養(yǎng)5分鐘(Kirkegaard & Perry Laboratories Inc，Gaithersburg，MD)。在用PBS緩沖液洗滌所述載玻片3次之后，用fluoromount-G封固所述載玻片，加蓋蓋玻片，并且在熒光顯微鏡下檢查。計(jì)算每毫升50％組織培養(yǎng)物感染劑量(TCID50/ml)。首先，用包括單拷貝PCV2基因組的質(zhì)粒構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，不過，來自單基因組構(gòu)建體的傳染性PCV2效價(jià)要比含有串聯(lián)基因組的構(gòu)建體的傳染效價(jià)低的多。因此，將含有二聚體形式的PCV2基因組的質(zhì)粒構(gòu)建體用于體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例5用PCV2分子DNA克隆體外轉(zhuǎn)染豬，以及用均勻的PCV2傳染性病毒原種實(shí)驗(yàn)性接種豬。
將4周齡的40頭無特定病原體(SPF)豬隨機(jī)安排到4個(gè)房間，每個(gè)房間10只。在接種之前，檢測SPF豬的PCV，PRRSV，PPV的抗體，以及豬戊型肝炎病毒。第一組的豬不進(jìn)行接種，并且被用作陰性對照。第二組的豬分別通過鼻內(nèi)接種大約1.9×105TCID50的衍生自PCV2分子DNA克隆的PCV2傳染性病毒源種。第三組的豬在肝臟內(nèi)直接注射PCV2分子克隆的重組質(zhì)粒DNA。每一頭豬一共注射200微克的重組質(zhì)粒DNA(克隆的PCV2質(zhì)粒DNA)。通過超聲波導(dǎo)向技術(shù)，注射到肝臟的6個(gè)不同部位，第四組的豬分別用總共200微克重組PCV2質(zhì)粒DNA直接注射到表淺回腸淋巴結(jié)中，并且每一個(gè)淋巴結(jié)接受2次獨(dú)立的注射。每天監(jiān)測所述動物的疾病的臨床體征。在注射后(DPI)第0，7，14，21，28，35天，從每一只動物體內(nèi)采集血清樣品。在21 DPI，從每一組中隨機(jī)挑選5頭豬，并且進(jìn)行尸體剖檢。每個(gè)小組的其余5只動物在35 DPI進(jìn)行尸體剖檢。在尸體剖檢期間收集各種組織和器官，并且處理以便進(jìn)行組織學(xué)檢查和免疫組織化學(xué)染色(參見下文)。
結(jié)果如下面的表1所示。在第0 DPI，來自第2，3和4組的所有接種過的豬都是PCV2抗體陰性的。在第0 DPI，來自未接種過的對照第1組的兩頭豬具有可檢測的PCV2母體抗體。這兩頭小豬崽體內(nèi)的母體抗體到第7 DPI消失。在10頭未接種過的對照豬的任何一頭體內(nèi)都沒有檢測到向PCV2抗體的血清轉(zhuǎn)變。在通過鼻內(nèi)接種PCV2傳染性病毒的第2組豬中，有一頭小豬崽在第21 DPI發(fā)生了向PCV2抗體的血清轉(zhuǎn)變。到第35 DPI，第2組豬中其余5頭豬中的4頭發(fā)生了血清轉(zhuǎn)變。來自第3和第4組的轉(zhuǎn)染動物的血清轉(zhuǎn)變最早出現(xiàn)在第28DPI。到第35 DPI，來自第3組的其余5頭豬中的5頭，以及來自第4組的其余5頭豬中3頭發(fā)生了向PCV2抗體的血清轉(zhuǎn)變。
在第3和21 DPI檢測到了所有豬的PPV抗體，并且在35 DPI檢測了其余豬的PPV抗體。在SPF小豬崽體內(nèi)檢測到針對普遍存在的豬致病劑PPV的母體抗體。在除了一頭豬崽的所有豬崽體內(nèi)的PPV HI抗體效價(jià)，從第3 DPI(平均效價(jià)為1∶2，665)-21 DPI(平均效價(jià)為1∶246)期間顯著減弱，這表明了在這些豬崽體內(nèi)檢測到的抗體是被動衍生的。一頭小豬崽的PPV HI效價(jià)從第3 DPI的1∶32略微提高到第21 DPI的1∶64，這可能是由于測試的變異造成的。用公開的PCR分析方法，對在第0，21和35 DPI從所有豬體內(nèi)采集的血清樣品的PPV DNA作進(jìn)一步的測定(J.M.Soucie等，“在患有血友病接受Hyate人群中進(jìn)行的豬細(xì)小病毒研究C豬因子VIII濃縮物”，Transfusion 40708-711(2000))。在任何DPI，從任何豬體內(nèi)都沒有檢測到PPV病毒血癥，這進(jìn)一步表明了所述豬不受PPV的感染。
表1.在接種了PCV2活的病毒或直接注射克隆的PCV2質(zhì)粒DNA的豬體內(nèi)向PCV2特異性抗體的血清轉(zhuǎn)變接種接種后天數(shù)組別接種物 途徑07 14 21 28 351 無 2/10a0/100/100/100/50/52 PCV2活毒b鼻內(nèi) 0/10 0/100/101/101/54/53 PCV2 DNAc肝內(nèi) 0/10 0/100/100/101/55/54 PCV2 DNAc淋巴內(nèi)0/10 0/100/100/101/53/5aPCV2抗體是通過ELISA測定的，陽性數(shù)量/測試數(shù)量。
b通過用PCV2分子DNA克隆轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞制備的生物學(xué)純的和均勻的PCV2病毒原種。
c克隆在pSK質(zhì)粒上的PCV2基因組DNA。
實(shí)施例6PCR-RFLP分析為了測定用PCV2分子DNA克隆轉(zhuǎn)染的豬和用PCV2傳染性病毒原種感染的豬體內(nèi)的PCV2病毒血癥，通過以前披露的PCR-RFLP分析的一般方法，檢測了在不同的DPIs采集的血清樣品中PCV2 DNA的存在(M.Fenaux等，2000，同上)。使用DNAzo1試劑，按照生產(chǎn)商提供的方法(Molecular Research Center，Cincinnati，OH)從每一種血清樣品的50微升樣品中提取病毒DNA。將提取的DNA重新懸浮在不含DNase-，RNase-，和蛋白酶的水中，并且通過RCD-RFLP檢測PCV2DNA(id.)。對來自選定動物的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，以便確定感染豬的病毒的起源。
在第0，7，14，21，28，和35 DPIs，從所有對照和接種過的動物體內(nèi)采集血清樣品，并且通過檢測PCV2 DNA分析PCV2病毒血癥(id.)。結(jié)果如下面的表2所示。在任何DPI，在第1組未接種過的對照豬體內(nèi)都沒有檢測到PCV2 DNA。在第14 DPI從來自第2組的10頭豬的7頭中檢測到了病毒血癥，并且在第35 DPI，從10頭豬的8頭中檢測到了病毒血癥。病毒血癥只持續(xù)了幾周時(shí)間，因?yàn)樵诘?8 DPI和35 DPI，在來自第2組的所有其余5頭豬中都沒有檢測到PCV2 DNA。在肝內(nèi)注射PCV2分子DNA克隆的第3組豬中，在第14 DPI，10頭豬中有8頭是具有病毒血癥的，而到第35 DPI，10頭豬中有9頭具有可檢測的病毒血癥。第4組的豬用PCV2分子DNA克隆注射到淋巴結(jié)中。在第14 DPI，在第4組中的10頭豬中有2頭，以及在第21 DPI，10頭豬中有8頭是具有病毒血癥的。以上結(jié)果表明，當(dāng)PCV2分子DNA克隆被直接注射到SPF豬的肝臟和表淺回腸淋巴結(jié)中之后，是有傳染性的。對來自選定動物的擴(kuò)增PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。來自選定動物的擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的序列與所述PCV2分子DNA克隆的相應(yīng)部位相同。
表2.通過PCR檢測接種過的和對照豬的血清的病毒血癥(PCV2DNA)接種接種后天數(shù)組別接種物 途徑07 14 21 28 35 總計(jì)1 無 0/10a0/100/100/100/50/50/102 PCV2活毒b鼻0/10 0/107/105/100/50/58/103 PCV2 DNAc肝內(nèi) 0/10 0/108/106/103/53/59/104 PCV2 DNAc淋巴內(nèi)0/10 0/102/108/102/50/58/10a每組10頭豬，陽性數(shù)量/測試數(shù)量。
b通過用PCV2分子DNA克隆轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞制備的生物學(xué)純的和均勻的PCV2病毒原種。
c克隆在pSK質(zhì)粒上的PCV2基因組DNA。
實(shí)施例7臨床評估在第0 DPI和在尸體剖檢時(shí)對豬進(jìn)行稱重。從第0到第35 DPI，每隔1天記錄直腸溫度和從0到6的臨床呼吸疾病評分(0＝正常，6＝嚴(yán)重)(P.G.Halbur等，“兩種美國豬生殖和呼吸綜合征病毒分離物與Lelystad病毒的致病性的比較，Vet.Pathol.32648-660(1995))。臨床觀察包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，肝臟肝臟疾病(黃疸)，肌肉骨骼疾病的表現(xiàn)，并且還要每天記錄身體狀態(tài)的變化。
為了評估總體病理學(xué)和組織病理學(xué)，在21和35 DPI從每一組中隨機(jī)挑選5頭豬進(jìn)行尸體剖檢。在進(jìn)行尸體剖檢時(shí)，尸體剖檢小組不了解這些豬的感染狀態(tài)。對所有的豬進(jìn)行全面尸體剖檢。根據(jù)前面所披露的評分系統(tǒng)(id.)，記錄每一頭豬的具有肉眼可見的肺炎的肺的估計(jì)百分比。該評分系統(tǒng)是以每一個(gè)肺葉占整個(gè)肺的大致體積為基礎(chǔ)的右前葉，右中葉，左前葉的前部，和左前葉的尾部各自占總肺體積的10％，附屬葉占5％，而右側(cè)和左側(cè)尾葉各自占27.5％。諸如淋巴結(jié)腫大的其他病變是分別觀察的。用于進(jìn)行組織病理學(xué)檢查的缺陷是從鼻甲，肺(七個(gè)切片)(id.)，心臟，腦，淋巴結(jié)(氣管支氣管，回腸，腸系膜，舌下)，扁桃腺，胸腺，肝臟，膽囊，脾臟，關(guān)節(jié)，小腸，結(jié)腸，乳腺和腎臟中采集的。所述組織以盲法形式檢查的，并且為肺，淋巴結(jié)和肝臟病變的嚴(yán)重程度提供主觀評分。肺的得分為0(正常)到3(嚴(yán)重淋巴組織細(xì)胞間質(zhì)性肺炎)之間。肝臟得分為0(正常)到3(嚴(yán)重淋巴組織細(xì)胞性肝炎)之間。淋巴結(jié)得分是用于評估濾泡的淋巴衰竭量的，它為0(正常或無淋巴衰竭)為3(嚴(yán)重淋巴衰竭和濾泡的組織細(xì)胞置換)。
血清學(xué)方法包括在達(dá)到11-12周齡時(shí)采集血液，以及在第0，7，14，21，28，和35 DPIs，從所有的豬體內(nèi)采集血液。用Herd Check PRRSVELISA分析PRSSV的血清抗體(IDEXX Laboratories，Westbrook，MA)。通過血凝抑制(HI)分析檢測PPV的血清抗體(H.S.Joo等，“用于豬細(xì)小病毒抗體的標(biāo)準(zhǔn)化血凝抑制測試”，Aust.Vet.J.52422-424(1976))。通過以PCV2的重組ORF2蛋白為基礎(chǔ)的改進(jìn)的間接ELISA，檢測PCV2的血清抗體(P.Nawagitgul等，“用于檢測PCV抗體的基于改進(jìn)的間接2型豬環(huán)狀病毒(PCV)和基于重組衣殼蛋白(ORF2)的ELISA”，Immunol.Cl in.Diagn.Lab Immunol.133-40(2002))。由含有PCV2的主要衣殼ORF2蛋白的重組桿狀病毒感染過的Hi Five細(xì)胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)制備部分純化的PCV2抗原(P.Nawagitgul等，“編碼主要衣殼蛋白的2型豬環(huán)狀病毒的開放讀框2”，J.Gen.Virol.812281-2287(2000))。用類似方法制備用野生型桿狀病毒感染過的Hi Five細(xì)胞的細(xì)胞裂解物，并且用作陰性對照抗原。在4℃下，用最佳濃度的陽性抗原和陰性抗原對Immulon 2 HB聚苯乙烯微量滴定板(Dynex Technologies Inc，Chantilly，VA)進(jìn)行包被36小時(shí)。將在5％乳稀釋劑(Kirkegaard &Perry Laboratories，Inc.)中以1∶100的比例稀釋的100微升每一種血清樣品添加到每一個(gè)孔中。重復(fù)檢測4次所述血清樣品兩個(gè)孔用于陰性對照抗原，兩個(gè)平行的孔用于PCV2抗原。在每一個(gè)平板上包括陽性對照和陰性對照血清。在37℃下培養(yǎng)所述血清30分鐘，然后用含有0.1％Tween-20的0.1M的PBS緩沖液洗滌5次。在37℃下，培養(yǎng)用過氧化物酶標(biāo)記過的二級抗豬IgG(Sigma Co，St.Louis，MO)30分鐘。再次洗滌所述平板，并且在37℃下與2，2′-連氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(Kirkegaard & Perry LaboratoriesInc)一起溫育15分鐘，進(jìn)行顯色。在405mm的波長下讀出光密度(OD)。通過從含有PCV2抗原的平行的孔的讀數(shù)中扣除含有陰性抗原的孔的平均OD值，計(jì)算每一種測試和對照血清中的校正過的OD。通過用陽性對照血清的OD值(P)除測試血清樣品的校正過的OD值(S)，將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，并且以S/P的比例形式報(bào)導(dǎo)。S/P比例≤0.12，0.12-0.2，和＞0.2的樣品，分別被認(rèn)為是陰性的，不確定的和陽性的。
根據(jù)以上臨床評估的結(jié)果，對照和接種過的豬無一表現(xiàn)出類似于臨床PMWS的明顯的疾病體征。四個(gè)小組中任意兩個(gè)之間，都不存在體重增加或平均直腸溫度的差別。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，第一組的對照豬一直保持正常。從第8到第14 DPI，在PCV2 DNA-轉(zhuǎn)染過的和PCV2病毒-感染過的組中的大部分豬中，都觀察到了輕度短時(shí)間的呼吸疾病。這種疾病以各個(gè)豬的持續(xù)1到2天輕度呼吸困難(臨床呼吸評分為1-2)，和一組豬的持續(xù)5-6天的輕度呼吸困難為特征。
在尸體剖檢時(shí)，在對照豬體內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)肉眼可見的病變。三個(gè)接種過的組中的豬具有局限于肺和淋巴結(jié)的肉眼可見的病變(參見下面的表3)。所述病變在PCV2質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染過的豬和PCV2病毒感染過的組中的豬之間是類似的。在第21 DPI，占肺體積的0-2％(圖3)，在第35 DPI，占肺體積的0-13％的肺不能回縮，并且具有隨機(jī)的，多病灶的，棕色到紫色固化的中度界限明顯的實(shí)變。在第21和35 DPI，在來自所有三個(gè)PCV2接種組的大部分豬的淋巴結(jié)比正常體積系統(tǒng)性擴(kuò)大了2-5倍，堅(jiān)硬，并且呈棕色(圖3)。
顯微鏡檢查在除了肝臟以外的對照豬的所有組織中，都沒有發(fā)現(xiàn)病變。10頭對照豬中有8頭具有非常輕的多病灶淋巴漿細(xì)胞炎癥，主要位于肝臟的門脈周圍區(qū)域，與在正常豬中常見的情況一樣，并且被認(rèn)為是正常的背景(P.G.Halbur等，2001，同上)。
來自兩個(gè)PCV2質(zhì)粒DNA-轉(zhuǎn)染組(肝內(nèi)和淋巴內(nèi))，以及PCV2病毒-感染組(鼻內(nèi))的豬，在腦，肺，心臟，腎臟，淋巴組織(扁桃腺，淋巴結(jié)，脾臟)，回腸和肝臟中具有類似的病變(參見下面的表4)。在來自三個(gè)接種組的30頭豬中的23頭中觀察到了腦病變，并且以具有血管外周成套和神經(jīng)膠質(zhì)增多癥的輕度至中度多病灶淋巴漿細(xì)胞腦膜腦炎為特征。在30頭PCV2接種過的豬中，有28頭出現(xiàn)了肺病變，并且以輕度至中度支氣管外周淋巴漿細(xì)胞和組織細(xì)胞支氣管間質(zhì)性肺炎為特征(圖3C)。在第21 DPI，對來自第2組的PCV2病毒感染的1頭豬進(jìn)行尸體剖檢，并且在第35 DPI，對分別來自兩個(gè)PCV2質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染組的1頭豬進(jìn)行尸體剖檢，在支氣管的固有層和支氣管外周區(qū)具有潰瘍性和增殖性支氣管炎，伴有纖維增生和肉芽腫樣炎癥。在30頭PCV2-接種過的豬中，有18頭還出現(xiàn)了輕度多病灶淋巴漿細(xì)胞心肌炎。在30頭PCV2接種過的豬中，有14頭出現(xiàn)了輕度至中度多病灶淋巴漿細(xì)胞間質(zhì)性腎炎。沒有在胸腺中發(fā)現(xiàn)病變。在PCV2接種過的豬中，在扁桃腺中出現(xiàn)輕度至中度淋巴衰竭(圖4B)和濾泡的組織細(xì)胞置換的比例為8/30，在脾臟中的比例為1/30，在淋巴結(jié)中的比例為26/30。在第21 DPI，通過鼻內(nèi)途徑接種PCV2病毒的3頭豬體內(nèi)觀察到了具有巨大細(xì)胞的中度肉芽腫樣淋巴腺炎(圖4C)，并且在第35 DPI，在每一個(gè)PCV2質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染組中有1頭豬出現(xiàn)了以上癥狀。在第35 DPI，輕度淋巴漿細(xì)胞和組織細(xì)胞小腸結(jié)腸炎在PCV2病毒感染組中的出現(xiàn)比例為3/5，在PCV2質(zhì)粒DNA肝內(nèi)轉(zhuǎn)染組中的出現(xiàn)比例為3/5，而在PCV2質(zhì)粒DNA淋巴轉(zhuǎn)染組的出現(xiàn)比例為1/5。在每一個(gè)PCV2質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染組中，有1頭豬伴隨組織細(xì)胞置換的輕度淋巴衰竭，和在Peyer′s斑中的少量巨大細(xì)胞。在3個(gè)PCV2接種豬組的30頭豬中的29頭中觀察到了輕度至中度淋巴漿細(xì)胞肝炎。在第21 DPI，在每一個(gè)PCV2質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的組中的1頭豬體內(nèi)，出現(xiàn)了由淋巴組織細(xì)胞炎癥包圍的少量廣泛分布的獨(dú)立的壞死肝細(xì)胞。在其他組織中的病變不明顯。
按照公開的評分系統(tǒng)，給肺，肝臟和淋巴結(jié)的顯微鏡下病變評分(參見下面的表4)(P.G.Halbur等，2001，同上；P.G.Halbur等，1995，同上)。沒有用于其他組織和器官的可接受的評分系統(tǒng)。3個(gè)PCV2接種組的豬的肺和淋巴結(jié)的病變的平均得分，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不同于第一組對照豬的得分。3個(gè)PCV2接種組的肝臟病變的平均得分在統(tǒng)計(jì)學(xué)上與對照豬沒有差別。
表3.對照和PCV2接種豬體內(nèi)的肺和淋巴結(jié)的肉眼可見病變接種21 DPI35 DPI組別接種物 途徑淋巴節(jié) 肺 淋巴節(jié) 肺1 無0/5a0/50/5 0/52 PCV2活毒b鼻內(nèi) 5/5 1/5(0-1)c5/5 4/5(0-5)3 PCV2 DNAd肝內(nèi) 2/5 2/5(0-2) 5/5 2/5(0-13)4 PCV2 DNAd淋巴內(nèi)4/5 5/5(0-1) 3/5 1/5(0-9)a在第21 DPI，對來自每一個(gè)組的5頭豬進(jìn)行尸體剖檢，并且在35 DPI對其余5頭豬進(jìn)行尸體剖檢。陽性數(shù)量/檢測數(shù)量。
b通過用PCV2分子DNA克隆轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞制備的生物學(xué)純的和均勻的PCV2病毒原種。
c具有病變的數(shù)量/檢測數(shù)量(受肉眼可見的肺炎病變影響的肺的估算百分比范圍，0-100％)d克隆在pSK質(zhì)粒上的PCV2基因組DNA。
表4.組織病理學(xué)病變在對照和PCV2接種豬體內(nèi)的分布接種組別接種物 途徑 DPIa肺b肝cLNd脾 胸腺 回腸 腦 心臟 腎 扁桃腺1 無 21 0/5(0.0)4/5(0.8) 0/5(0.0) 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/50/535 0/5(0.0)4/5(0.8) 0/5(0.0) 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/50/52 PCV2病毒 鼻內(nèi) 21 5/5(1.6)5/5(1.2) 3/5(1.2) 1/5 0/5 0/5 4/5 3/5 1/50/535 3/5(0.6)4/5(1.0) 4/5(0.8) 3/5 0/5 3/5 4/5 0/5 1/53/53 PCV2 DNA 肝內(nèi) 21 5/5(1.0)5/5(1.0) 5/5(1.0) 1/5 0/5 0/5 5/5 4/5 1/50/535 5/5(1.2)5/5(1.0) 4/5(1.0) 2/5 0/5 3/5 3/5 4/5 5/53/54 PCV2 DNA 淋巴內(nèi) 21 5/5(1.2)5/5(1.0) 5/5(0.8) 0/5 0/5 0/5 4/5 4/5 3/50/535 5/5(1.0)5/5(1.2) 5/5(1.4) 0/5 0/5 1/5 3/5 3/5 3/52/5
a接種后的天數(shù)(DPI)在第21 DPI，對來自每一個(gè)組的5個(gè)動物進(jìn)行尸體剖檢，并且在35 DPI，對來自每個(gè)組的其余5個(gè)動物進(jìn)行尸體剖檢。
b陽性數(shù)量/檢測數(shù)量(平均組織學(xué)肺得分0＝正常，1＝輕度間質(zhì)性肺炎，2＝中度，3＝嚴(yán)重)c陽性數(shù)量/檢測數(shù)量(平均組織學(xué)肝臟得分0＝正常，1＝輕度肝炎，2＝中度，3＝嚴(yán)重)d陽性數(shù)量/檢測數(shù)量(平均組織學(xué)淋巴(LN)衰竭得分0＝正常，1＝輕度，2＝中度，3＝嚴(yán)重)實(shí)施例8免疫組織化學(xué)對在第21和35DPIs進(jìn)行的尸體剖檢期間采集的所有組織進(jìn)行PCV2-特異性抗原的免疫組織化學(xué)(IHC)檢測。將兔多克隆PCV2-特異性抗血清用于IHC，并且，總體方法以前業(yè)已公開(S.D.Soden等，1999，同上)。
為了檢測PCV2抗原的組織分布，對在第21和35 DPI進(jìn)行尸體剖檢的所有豬的腦，肺，鼻甲，心臟，腎臟，前列腺，淋巴結(jié)，脾臟，胸腺，回腸，肝臟，膽囊和胰腺進(jìn)行PCV2抗原的IHC染色。來自對照組的所有組織，都是PCV2抗原陰性的。PCV2抗原在三個(gè)PCV2接種組中的組織分布是類似的(參見下面的表5)。在腦中，發(fā)現(xiàn)PCV2抗原主要出現(xiàn)在腦膜和脈絡(luò)叢的單核細(xì)胞，成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中，并且在大腦和小腦的內(nèi)皮細(xì)胞和血管外周單核細(xì)胞中較為少見。在肺中，PCV2抗原是在呼吸道的固有層中的肺泡和隔膜巨噬細(xì)胞以及成纖維樣細(xì)胞中檢測到的(圖3D)。在心臟中，PCV2抗原是在廣泛分布的巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中檢測到的。在腎臟中，PCV2抗原是在氣管上皮細(xì)胞和間質(zhì)中的單核細(xì)胞中檢測到的。在淋巴樣組織(淋巴結(jié)，脾，前列腺和Peyer′s斑)中，PCV2抗原主要是在巨噬細(xì)胞和樹突樣細(xì)胞以及濾泡中的巨大細(xì)胞中檢測到的(圖4D)。還在小腸的固有層的巨噬細(xì)胞內(nèi)檢測到了PCV2抗原。在肝臟中，PCV2抗原是在單核細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞中檢測到的。在鼻甲，胸腺或膽囊中沒有檢測到PCV2抗原。
表5.通過免疫組織化學(xué)在對照和PCV2接種過的豬中檢測PCV2-特異性抗原的分布接種組別接種物 途徑 DPIa肺 肝 LN 脾 胸腺回腸腦 心臟腎 扁桃腺1 無 21 0/5b0/50/50/50/5 0/5 0/50/5 0/5 0/535 0/5 0/50/50/50/5 0/5 0/50/5 0/5 0/52 PCV2病毒 鼻內(nèi) 21 4/5 5/55/53/50/5 3/5 3/51/5 1/5 2/535 1/5 2/53/52/50/5 0/5 2/50/5 0/5 0/53 PCV2 DNA 肝內(nèi) 21 5/5 5/55/55/50/5 0/5 5/51/5 0/5 2/535 4/5 4/53/54/50/5 3/5 4/52/5 2/5 3/54 PCV2 DNA 淋巴內(nèi)21 4/5 4/55/54/50/5 3/5 3/50/5 0/5 3/535 3/5 4/55/54/50/5 2/5 3/51/5 0/5 4/5
a接種后的天數(shù)(DPI)在第21 DPI，對來自每一個(gè)組的5個(gè)動物進(jìn)行尸體剖檢，并且在35 DPI，對來自每個(gè)組的其余5個(gè)動物進(jìn)行尸體剖檢。
b陽性數(shù)量/檢測數(shù)量。
實(shí)施例9非致病性PCV1傳染性DNA克隆的構(gòu)建用于構(gòu)建PCV1傳染性DNA克隆的方法，基本上與本文所披露的用于構(gòu)建PCV2的方法相同。根據(jù)公開的PCR1序列，設(shè)計(jì)一對PCR引物如SEQ ID NO7所示的KPNPCV1.U和SEQ ID NO8所示的KPNPCV1.L(參見下面的表6)。該引物對能擴(kuò)增具有包括獨(dú)特的KpnI限制酶位點(diǎn)的重疊區(qū)的PCV1的完整基因組。PCV1病毒的DNA，是從污染過的ATCCPK-15細(xì)胞系中提取的，該細(xì)胞系是從美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得的(ATCC保藏號CCL-33)。使用QIAmp DNA微量制備試劑盒(Qiagen，Inc.，Valencia，CA.)，從用PCV1持續(xù)感染的ATCC PK-15細(xì)胞中提取PCV1 DNA。用AmpliTaq Gold聚合酶(Perkin-Elmer，Norwalk，CT)，通過PCR擴(kuò)增提取的DNA。所述PCR循環(huán)包括95℃，10分鐘的起始步驟，隨后進(jìn)行35輪循環(huán)在94℃下變性1分鐘，在48℃下退火1分鐘，在72℃下延伸2分鐘，并且在72℃下最終延伸7分鐘。通過凝膠電泳分離具有預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物，并且用Geneclean試劑盒通過glassmilk方法純化(Bio101，Inc.，La Jolla，CA)。首先，將包括完整PCV1基因組的純化的PCR產(chǎn)物連接到advanTAge質(zhì)粒載體上(Clontech，Palo Alto，CA)。將大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞用于轉(zhuǎn)化。通過限制酶消化證實(shí)重組質(zhì)粒。通過用KpnI限制酶消化，將完整長度的PCV1基因組DNA從advanTAge載體上切除。在37℃下，用T4 DNA連接酶將完整長度的PCV1基因組DNA連接到pBluescript SK(+)(pSK)載體上(Stratagene，La Jolla，CA)，過夜。用Qiagen質(zhì)粒微量制備試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)分離包括完整長度PCV1基因組的重組質(zhì)粒，并且通過限制酶消化和DNA測序驗(yàn)證。通過KpnI消化，將完整長度的PCV1基因組DNA從pSK載體上切除，并且二聚化，以便按照在實(shí)施例2中制備PCV2傳染性克隆的方法制備PCV1傳染性DNA克隆。制備這樣的串聯(lián)二聚體，是因?yàn)槎刍拇?lián)DNA克隆被證實(shí)有利于更有效地轉(zhuǎn)染細(xì)胞和生產(chǎn)傳染性毒粒。為了制備PCV1DNA的串聯(lián)二聚體，在37℃下，用T4 DNA連接酶連接消化過的PCV1基因組DNA僅10分鐘時(shí)間，這有利于串聯(lián)二聚體的產(chǎn)生。然后，將所述串聯(lián)二聚體克隆到pBluescript SK(+)(pSK)載體上(Stratagene，La Jolla，CA)。通過PCR，限制酶消化，和DNA測序，證實(shí)含有PCV1基因組的串聯(lián)二聚體(本文稱之為“PCV1 DNA克隆”)的重組質(zhì)粒。通過分光光度法測定重組質(zhì)粒的DNA濃度。
表6.用于本發(fā)明的寡核苷酸引物引物 方向 引物序列 應(yīng)用構(gòu)建引物KPNPCV1.U.＞a5’-TTTGGTACCCGAAGGCCGATT-‘3( 相當(dāng)于SEQ ID NO7)PCV1 DNA 克隆構(gòu)建KPNPCV1.L.＜ 5’-ATTGGTACCTCCGTGGATTGTTCT-‘3( 相當(dāng)于SEQ ID NO8) PCV1 DNA 克隆構(gòu)建Hpa I-2 ＜ 5’-GAAGTTAACCCTAAATGAATAAAAATAAAAACCATTACG-‘3 PCV1-2 DNA 克隆構(gòu)建( 相當(dāng)于SEQ ID NO9)Nar I-3 ＞ 5’-GGTGGCGCCTCCTTGGATACGTCATCCTATAAAAGTG-‘3PCV1-2 DNA 克隆構(gòu)建( 相當(dāng)于SEQ ID NO10)Psi I-5 ＞ 5’-AGGTTATAAGTGGGGGGTCTTTAAGATTAA-‘3 PCV1-2 DNA 克隆構(gòu)建( 相當(dāng)于SEQ ID NO11)Acl I-6 ＜ 5’-GGAAACGTTACCGCAGAAGAAGACACC-‘3 PCV1-2 DNA 克隆構(gòu)建( 相當(dāng)于SEQ ID NO12)Bgl-II-ORF2 ＞ 5’-ACTATAGATCTTTATTCATTTAGAGGGTCTTTCAG-‘3 PCV2-1 DNA 克隆構(gòu)建( 相當(dāng)于SEQ ID NO13)SpH-I-ORF2＜ 5’-TACGGGCATGCATGACGTGGCCAAGGAGG-‘3PCV2-1 DNA 克隆構(gòu)建( 相當(dāng)于SEQ ID NO14)Bgl-II-PCV2 ＜ 5’-AGACGAGATCTATGAATAATAAAAACCATTACGAAG-‘3 PCV2-1 DNA 克隆構(gòu)建( 相當(dāng)于SEQ ID NO15)SpH-I-PCV2＞ 5’-CGTAAGCATGCAGCTGAAAACGAAAGAAGTG-‘3 PCV2-1 DNA 克隆構(gòu)建( 相當(dāng)于SEQ ID NO16)檢測引物MCV1 ＞ 5’-GCTGAACTTTTGA從GTGAGCGGG-‘3( 相當(dāng)于SEQ ID NO17) PCV1和PCV2檢測MCV2 ＜ 5’-TCACACAGTCTCAGTAGATCATCCCA-‘3( 相當(dāng)于SEQ ID NO18)PCV1和PCV2檢測Orf.PCV1 ＜ 5’-CCAACTTTGTAACCCCCTCCA-‘3( 相當(dāng)于SEQ ID NO19) PCV1和PCV2-1 檢測Gen.PCV1 ＞ 5’-GTGGACCCACCCTGTGCC-‘3( 相當(dāng)于SEQ ID NO20)PCV1和PCV1-2 檢測嵌套 Orf.PCV1＜ 5’-CCAGCTGTGGCTCCATTTAA-‘3( 相當(dāng)于SEQ ID NO21) PCV1和PCV2-1 檢測嵌套 Gen.PCV1＞ 5’-TTCCCATATAAAATAAATTACTGAGTCTT-‘3PCV1和PCV1-2 檢測( 相當(dāng)于SEQ ID NO22)Orf.PCV2 ＜ 5’-CAGTCAGAACGCCCTCCTG-‘3( 相當(dāng)于SEQ ID NO23) PCV2和PCV1-2 檢測Gen.PCV2 ＞ 5’-CCTAGAAACAAGTGGTGGGATG-‘3( 相當(dāng)于SEQ ID NO24)PCV2和PCV2-1 檢測嵌套 Orf.PCV2＜ 5’-TTGTAACAAAGGCCACAGC-‘3( 相當(dāng)于SEQ ID NO25) PCV2和PCV1-2 檢測嵌套 Gen.PCV2＞ 5’-GTGTGATCGATATCCATTGACTG-‘3( 相當(dāng)于SEQ ID NO26) PCV2和PCV2-1 檢測a引物方向?qū)嵤├?0在轉(zhuǎn)染到?jīng)]有病毒污染的PK-15細(xì)胞中之后評估PCV1 DNA克隆的傳染力通過體外轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，測定PCV1分子DNA克隆的傳染力。用PCV1特異性單克隆抗體(由Gordon Allan博士饋贈，Belfast，U.K.)進(jìn)行的IFA，證實(shí)了PCV1分子DNA克隆在PK-15細(xì)胞細(xì)胞中是傳染性的。通過IFA在轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞的細(xì)胞核中觀察到了PCV1-特異性抗原，并且在較低程度上在細(xì)胞質(zhì)中觀察到了所述抗原。用空的pSK載體模擬轉(zhuǎn)染的細(xì)胞保持PCV1抗原陰性。
實(shí)施例11嵌合PCV1-2病毒DNA克隆的構(gòu)建通過使用PCV1和PCV2的傳染性DNA，構(gòu)建了非致病性PCV1和與PMWS相關(guān)的PCV2之間的嵌合病毒。為了構(gòu)建嵌合PCV1-2 DNA克隆，將非致病性PCV1的ORF2衣殼基因從PCV1傳染性DNA克隆中除去，并且，將致病性PCV2的免疫原性O(shè)RF2衣殼基因置換到PCV1的基因組主鏈上(參見圖5和6)。設(shè)計(jì)了兩對PCR引物。第一對引物是用于PCV2 ORF2的，將SEQ ID NO11所示的PsiI-5和SHQ ID NO12所示的AclI-6設(shè)計(jì)成在所述引物的5’末端具有點(diǎn)突變，以便產(chǎn)生限制酶位點(diǎn)Aclt和PsiI，以便擴(kuò)增PCV2的ORF2基因，并且通過點(diǎn)突變導(dǎo)入旁側(cè)PsiI和AclI限制酶位點(diǎn)。用于PCV2 ORF2擴(kuò)增的PCR反應(yīng)，包括在95℃下進(jìn)行9分鐘的起始步驟，隨后進(jìn)行38輪在95℃下進(jìn)行1分鐘的變性，在48℃下退火1分鐘，在72℃下延伸1分鐘，并且在72℃下最終延伸7分鐘。
設(shè)計(jì)了用于擴(kuò)增pSK+載體及其PCV1基因組插入片段的第二對PCR引物SEQ ID NO9所示的Hpa I-2和SEQ ID NO10所示的Nar I-3。在所述PCR引物的5’末端導(dǎo)入點(diǎn)突變，以便產(chǎn)生旁側(cè)限制酶位點(diǎn)NarI和HpaI。該引物對通過使用PCV1傳染性DNA克隆作為PCR模板，擴(kuò)增了pSK+載體以及它的缺少ORF2衣殼基因的插入PCV1的基因組DNA，即缺少PCV1 ORF2的PCV1基因組(pSK-PCV1ΔORF2)。所述PCR反應(yīng)包括在95℃下進(jìn)行9分鐘的起始步驟，然后進(jìn)行38輪在95℃下變性1分鐘，在50℃下退火1分鐘，在72℃下延伸3.5分鐘，和在72℃下最終延伸7分鐘。用AclI和PsiI消化PCV2 ORF2 PCR產(chǎn)物，以便消除所導(dǎo)入的點(diǎn)突變。用NarI和HpaI消化pSK-PCV1ΔORF2產(chǎn)物(缺少PCV1的ORF2基因的pSK載體-PCV1基因組PCR產(chǎn)物)，以便除去PCR導(dǎo)入的點(diǎn)突變。后一種消化產(chǎn)生了互補(bǔ)于通過AclI和PsiI限制酶消化產(chǎn)生的PCV2 ORF2 PCR產(chǎn)物的粘端和平端。用T4 DNA連接酶連接消化過的PCV2 ORF2產(chǎn)物和ORF2-缺失的pSK-PCV1產(chǎn)物，以便形成嵌合PCV1-2基因組DNA克隆，其中，PCV1的ORF2基因被PCV2的ORF2基因所取代。一旦消化并且重新連接了這兩種PCR產(chǎn)物，在所得到的嵌合克隆中除去了所有通過PCR導(dǎo)入的用于促進(jìn)克隆的點(diǎn)突變。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。分離含有嵌合DNA克隆的重組質(zhì)粒，并且通過PCR，限制酶消化和部分DNA測序加以證實(shí)。通過KpnI消化將完整長度的嵌合PCV1-2基因組從pSK+載體(重組載體)上切除。然后，通過用T4 DNA連接酶進(jìn)行10分鐘短時(shí)間的連接反應(yīng)，將嵌合DNA基因組二聚化，這有利于線性二聚體的形成，以便生產(chǎn)PCV1-2嵌合傳染性DNA克隆(圖6)。通過PCR，限制酶消化和DNA測序，證實(shí)含有兩個(gè)拷貝的所述嵌合病毒基因組的重組質(zhì)粒。
實(shí)施例12PCV1-2嵌合DNA克隆的體外傳染性的評估在PK-15細(xì)胞中檢測嵌合PCV DNA克隆(具有PCV2的免疫原性衣殼基因的非致病性PCV1)的存活力。在用嵌合病毒DNA克隆轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞時(shí)，在轉(zhuǎn)染之后大約2天，通過IFA檢測到PCV2 ORF2衣殼特異的病毒抗原。所述PCV1衣殼抗原在轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞中檢測不到。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在體外具有傳染性的所述嵌合DNA克隆能在PK-15細(xì)胞中復(fù)制，并且產(chǎn)生PCV2的免疫原性衣殼蛋白。
實(shí)施例13交互嵌合PCV2-1 DNA克隆的構(gòu)建為了構(gòu)建交互嵌合PCV2-1 DNA克隆，致病性PCV2的基因組主鏈上的PCV2的ORF2衣殼基因被非致病性PCV1所取代(圖6)。設(shè)計(jì)了兩個(gè)PCR引物對SEQ ID NO13所示的Bgl-II-ORF2和SEQ ID NO14所示的SpH-I-ORF2能擴(kuò)增PCV1 ORF2基因，并且通過點(diǎn)突變導(dǎo)入旁側(cè)BglII和SpHI限制酶位點(diǎn)。第二個(gè)PCR引物對，SEQ ID NO15所示的Bgl-II-PCV2和SEQ ID NO16所示的SpH-I-PCV2能擴(kuò)增pSK載體，和去掉了ORF2基因的PCV2基因組(pSK-PCV2ΔORF2)，用PCV2傳染性DNA克隆作為PCR的模板，并且通過點(diǎn)突變導(dǎo)入旁側(cè)限制酶位點(diǎn)BglII和SpHI。用BglII和SPAHI限制酶消化pSK-PCV2ΔORF2產(chǎn)物和PCV1 ORF2 PCR產(chǎn)物，以便產(chǎn)生連接在一起的互補(bǔ)的粘端和平端。在轉(zhuǎn)化到大腸桿菌細(xì)胞中之后，通過酶消化和部分DNA測序，分離并且證實(shí)真實(shí)的重組質(zhì)粒。通過SacII消化將完整長度的交互嵌合PCV2-1基因組從重組質(zhì)粒上切除，并且按本文所述方法二聚化，以便生產(chǎn)交互嵌合PCV2-1傳染性克隆。
實(shí)施例14用PCV1，PCV2，PCV1-2和PCV2-1 DNA克隆對PK-15細(xì)胞進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染業(yè)已在上面的實(shí)施例3-5中證實(shí)了PCV2克隆的體外和體內(nèi)傳染性。為了檢測PCV1和兩種嵌合克隆的體外傳染力，讓通過實(shí)施例1所述方法制備的沒有PCV1污染的PK-15細(xì)胞在8孔LabTek腔室載玻片(Nalge Nunc Int.，Denmark)上生長。當(dāng)PK-15細(xì)胞達(dá)到大約80％的鋪滿度時(shí)，分別用PCV1.PCV2，PCV1-2和PCV2-1 DNA克隆轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞，按照生產(chǎn)商所提供的方法，使用脂轉(zhuǎn)染胺Plus試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染(Life Technologies，Inc.)。將用空的pSK載體模擬轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用作對照。轉(zhuǎn)染3天之后，在4℃下，用含有80％丙酮和20％甲醇的溶液固定所述細(xì)胞20分鐘。通過間接免疫熒光測定(IFA)，使用由G.M.Allan博士饋贈的抗PCV1 ORF2衣殼基因的單克隆抗體，證實(shí)用PCV1和PCV2-1 DNA克隆轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞中傳染力和病毒復(fù)制的證據(jù)(G.M.Allan等，“豬環(huán)狀病毒單克隆抗體的生產(chǎn)，初步表征和應(yīng)用”，Vet.Immunol.Immunopathol.43357-371(1994))。用磷酸緩沖的鹽溶液(PBS)洗滌固定的細(xì)胞，并且在37℃下與1∶20稀釋的PCV1單克隆抗體培養(yǎng)1小時(shí)。然后用PBS緩沖液洗滌所述細(xì)胞3次，并且在37℃下與熒光素異硫氰酸酯(FITC)標(biāo)記過的山羊抗小鼠免疫球蛋白G(Kirkegaard & PerryLaboratories，Inc.，Gaithersburg，Md.)一起溫育45分鐘。用PBS緩沖液洗滌3次，然后用fluoromount-G封固所述載玻片，并且在熒光顯微鏡下檢查。按在前面的實(shí)施例4中所述方法，使用對PCV2特異的抗體，通過IFA證實(shí)用PCV2和嵌合PCV1-2 DNA克隆轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞的傳染力。
PCV1，嵌合PCV1-2 DNA和交互嵌合PCV2-1 DNA克隆的傳染力，是通過體外轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞證實(shí)的。將兩個(gè)相同拷貝的完整PCV1基因組以串聯(lián)形式連接到pSK載體上，以便產(chǎn)生PCV1 DNA克隆(圖6)。嵌合PCV1-2 DNA克隆中非致病性PCV1基因組主鏈上的PCV1的ORF2衣殼基因被致病性PCV2的ORF2衣殼基因所取代。交互嵌合PCV1-2 DNA克隆中致病性PCV2基因組主鏈上的PCV2的ORF2衣殼基因被非致病性PCV1的ORF2衣殼基因所取代。如果在體外具有傳染性，所述嵌合PCV2-1 DNA克隆將能產(chǎn)生PCV2的ORF2衣殼抗原，而交互嵌合PCV1-2 DNA克隆，能在轉(zhuǎn)染過的PK-15細(xì)胞中表達(dá)PCV1 ORF2衣殼抗原。以上結(jié)果表明，PCV1，嵌合PCV1-2 DNA和交互嵌合PCV2-1 DNA克隆在轉(zhuǎn)染到PK-15細(xì)胞中之后，都令人吃驚地表現(xiàn)出是傳染性的，并且表達(dá)了相應(yīng)的病毒衣殼抗原蛋白，這一結(jié)果是通過使用對PCV1或PCV2特異的抗體進(jìn)行IFA證實(shí)的。使用抗PCV1 ORF2的單克隆抗體和抗PCV2抗體進(jìn)行的IFA，證實(shí)了PCV1 DNA和PCV1-2 DNA克隆是傳染性的。用PCV1 ORF2-特異性單克隆抗體進(jìn)行的IFA，證實(shí)了PCV1-2嵌合DNA克隆也是傳染性的。大約10-20％的轉(zhuǎn)染過的PK-15細(xì)胞對于PCV1衣殼抗原和PCV2抗原來說是陽性的，并且在轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)了PCV1 ORF2抗原(圖7)。
實(shí)施例15用PCV1、PCV2、嵌合PCV1-2和交互嵌合PCV2-1 DNA克隆實(shí)驗(yàn)性接種豬為了評估所述嵌合DNA克隆的免疫原性和致病性，將40頭4-6周齡的無特異性抗原(SPF)的豬隨機(jī)安排到5個(gè)房間中，每個(gè)房間8頭豬。在接種之前，檢測動物的PCV，PRRSV，PPV，和豬戊型肝炎病毒抗體。另外，通過PCR檢測接種前血清樣品的PCV1和PCV2核酸，以便證實(shí)所述豬沒有受到上述任意一種病毒的天然感染。PCV1，PCV2，PCV1-2和PCV2-1 DNA克隆，都是通過將克隆的質(zhì)粒DNA直接注射到豬的表淺回腸淋巴結(jié)中接種的。第一組的豬接受磷酸緩沖的鹽溶液(PBS緩沖液)，并且用作陰性對照。第二組豬分別用200微克傳染性PCV1 DNA克隆注射到表淺回腸淋巴結(jié)中。第三組豬分別注射200微克傳染性PCV2 DNA克隆。第四組豬分別注射200微克傳染性嵌合PCV1-2 DNA克隆。第五組豬分別接受200微克傳染性交互嵌合PCV2-1DNA克隆。每天監(jiān)測所有動物的疾病的臨床體征。在接種之后第-2，7，14，21，28，35，42和49天(DPI)，從每一只動物體內(nèi)采集血清樣品。在第21 DPI，對從每一小組中隨機(jī)挑選的4只動物進(jìn)行尸體剖檢。在第49 DPI，對每個(gè)小組的其余4只動物進(jìn)行尸體剖檢。按照在前面的實(shí)施例7中所披露的方法，在尸體剖檢期間采集各種組織和器官，并且進(jìn)行處理，以便進(jìn)行組織學(xué)檢查。
檢查所述豬體內(nèi)的PCV1，PCV2和嵌合傳染性DNA克隆的免疫原性。通過PCR檢測克隆特異性DNA序列，分析在第-2(0)，7，14，21，28，35，42和49 DPIs從所有對照和接種過的動物體內(nèi)采集的血清樣品的PCV1，PCV2，PCV1-2和PCV2-1病毒血癥，對于抗PCV1抗體來說，通過抗IFA進(jìn)行分析，而對于抗-PCV2 ORF2抗體來說，通過ELISA進(jìn)行分析。在-2 DPI的接種之前，通過PCR檢測發(fā)現(xiàn)，來自所有5個(gè)組的動物都是PCV1和PCV2 DNA陰性的。
在本研究中，陰性對照動物的PCV1和PCV2病毒血癥都是陰性的(參見下面的表7)。在第-2 DPI，未接種過的對照組中的5頭豬具有可檢測的PCV3母體抗體，并且在第7 DPI，有兩頭豬具有可檢測的PCV1母體抗體(參見下面的表8)。在這些小豬崽體內(nèi)，PCV1和PCV2的母體抗體在第21 DPI消失了。在本研究中，8頭未接種過的對照豬中的任意一頭，都沒有檢測向PCV1或PCV2的血清轉(zhuǎn)變。
在PCV1接種過的組中，病毒血癥最初是在第7 DPI在接種過的豬體內(nèi)檢測到的(參見下面的表7)，并且持續(xù)到第35 DPI都能檢測到。用PCV1傳染性DNA克隆接種過的8只動物，有5只是PCV1病毒血癥陽性的。PCV1病毒血癥的平均持續(xù)時(shí)間為0.625周。到第21 DPI，PCV1接種組的所有動物都發(fā)生了向PCV1的血清轉(zhuǎn)變，并且，直到第49 DPI本研究結(jié)束時(shí)，仍然保持PCV1抗體陽性。
在本文中證實(shí)了PCV2 DNA克隆在豬體內(nèi)是傳染性的。在PCV2 DNA克隆接種組中，最初在第7 DPI檢測到PCV2病毒血癥(參見下面的表7)。到第21 DPI，所有PCV2接種的第3組動物都是PCV2病毒血癥陽性的。PCV2病毒血癥的平均長度為2.12周。在第7 DPI，PCV2接種組內(nèi)的兩頭豬具有可檢測水平的母體PCV2抗體(參見下面的表8)，并且這些小豬崽體內(nèi)的母體抗體在第14 DPI消失。通過PCV2-特異性ELISA分析的向PCV2的血清轉(zhuǎn)變，最初是在第35 DPI檢測到的。到第42 DPI，用PCV2傳染性DNA克隆接種過的所有豬都發(fā)生了向PCV2的血清轉(zhuǎn)變。
在用PCV1-2嵌合傳染性DNA克隆接種的第4組豬體內(nèi)，對所述嵌合病毒特異的病毒血癥，最初是在第14 DPI檢測到的(參見下面的表7)。在第14 DPI和42 DPI之間，7頭接種過的動物中有4頭出現(xiàn)病毒血癥。嵌合PCV1-2病毒血癥的平均時(shí)間為1周。1頭豬在第7和14 DPI具有可檢測水平的母體PCV2抗體，不過，所述母體抗體到第21 DPI消失(參見下面的表8)。向PCV2 ORF2-特異性抗體的血清轉(zhuǎn)變最初出現(xiàn)在第28 DPI。到第49 DPI，所有用嵌合PCV1-2 DNA克隆接種過的豬都發(fā)生了向PCV2ORF2-特異性抗體的血清轉(zhuǎn)變。
在用交互嵌合PCV2-1克隆接種過的豬中，在血清樣品中沒有檢測到對PCV2-1嵌合病毒特異的病毒DNA(參見下面的表7)。不過，在第21 DPI，第5組中的所有動物都發(fā)生了向PCV1抗體的血清轉(zhuǎn)變。對從每一組中選擇的豬擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，并且證實(shí)是用于每一組接種的真實(shí)的相應(yīng)的傳染性克隆。
表7-通過嵌套PCR在接種過的和對照豬的血清中檢測病毒血癥組別接種物 DPI總計(jì)-2 7 14 21 28 35 42 491 PBSa0/8b0/80/80/80/40/40/40/40/82 PCV1 DNAc0/8 1/81/82/80/42/40/40/45/83 PCV2 DNAc0/8 3/86/87/81/42/42/40/48/84 PCV1-2 DNAc0/7 0/71/72/72/42/42/40/44/75 PCV2-1 DNAc0/8 0/80/80/80/40/40/40/40/8a用作陰性對照的磷酸緩沖的鹽溶液(PBS)b每一個(gè)組中8頭豬；陽性數(shù)量/檢測數(shù)量c克隆在pSK質(zhì)粒上的基因組PCV或嵌合PCV DNA
表8.在用PCV2或嵌合PCV1-2 DNA克隆接種的豬體內(nèi)向抗PCV2抗體的血清轉(zhuǎn)變以及在用PCV1或PCV2-1 DNA克隆接種的豬體內(nèi)向抗PCV1抗體的血清轉(zhuǎn)變組別接種物a檢測以下抗原的抗體bDPIc-2 7 14 21 28 35 42 491 PBS PCV1 NA 2/82/81/80/40/40/40/4PCV2 5/85/82/80/80/40/40/40/42 PCV1 DNA PCV1 ORF2 NA 3/82/88/84/44/44/44/43 PCV2 DNA PCV2完整病毒 3/82/80/80/80/43/44/44/44 PCV1-2DNA PCV2完整病毒 2/81/81/80/81/41/43/44/45 PCV2-1 DNAPCV1 ORF2 NA 3/83/88/83/43/44/44/4a用作陰性對照的磷酸緩沖的鹽溶液(PBS)。接種物是克隆在pSK質(zhì)粒上的克隆的基因組PCV或PCV嵌合DNAb通過對PCV1抗原特異的間接免疫熒光分析，測定ORF2的PCV1抗體。通過酶聯(lián)免疫吸附分析測定PCV2抗體。
c接種后天數(shù)，陽性數(shù)量/檢測數(shù)量。
實(shí)施例16臨床評估在第0 DPI和在尸體剖檢時(shí)對豬進(jìn)行稱重。從第0到第49DPI，每隔1天記錄直腸溫度和在0到6范圍內(nèi)的臨床呼吸得分(0＝正常；6＝嚴(yán)重)。(P.G.Halbur等，“兩種美國豬生殖和呼吸綜合征病毒分離物與Lelystad病毒的致病性的比較”Vet.Pathol.32648-660(1995))。每天還要記錄臨床觀察結(jié)果，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，肝臟疾病(黃疸)，肌肉骨骼疾病的表現(xiàn)和身體狀況的改變。由包括二個(gè)人的小組進(jìn)行所有的臨床評估。
對照或接種豬中沒有1頭表現(xiàn)出明顯的完整范圍的臨床PMWS體征。在任意組之間都不存在體重增加或平均直腸溫度方面的差別。來自PCV1-2接種的第3組的1頭豬，在接種一天之后死亡。在尸體剖檢和臨床分析之后，沒有檢測到致病劑，并且死亡與接種方法或嵌合PCV1-2病毒無關(guān)。
實(shí)施例17大體病理學(xué)和組織病理學(xué)分別在第21和49 DPI對來自每個(gè)小組的4頭豬進(jìn)行尸體剖檢。在尸體剖檢時(shí)，尸體剖檢小組不了解所述豬的感染狀況。對所有的豬進(jìn)行全面尸體剖檢。根據(jù)以前所披露的評分系統(tǒng)記錄每一頭豬的患有肉眼可見的肺炎的肺的估算百分比(P.G.Halbur等，1995，同上)。單獨(dú)發(fā)現(xiàn)了諸如淋巴結(jié)腫大的其他損傷。用于組織病理學(xué)檢查的切片是從鼻甲，肺(七個(gè)切片)(id.)，心臟，大腦，淋巴結(jié)(氣管支氣管，回腸，腸系膜，舌下)，扁桃腺，胸腺，肝臟，膽囊，脾臟，關(guān)節(jié)，小腸，結(jié)腸，胰腺和脾臟中采集的。以盲法方式檢查所述組織，并且按實(shí)施例7所述方法對肺，淋巴結(jié)和肝臟病變的嚴(yán)重程度進(jìn)行主觀評分。肺的得分為0(正常)至3(嚴(yán)重淋巴組織細(xì)胞間質(zhì)性肺炎)，肝臟得分為0(正常)至3(嚴(yán)重淋巴組織細(xì)胞肝炎)，淋巴結(jié)得分對于估算量的濾泡淋巴衰竭的淋巴結(jié)得分為0(正?；驘o淋巴衰竭)至3(嚴(yán)重淋巴衰竭和濾泡的組織細(xì)胞置換)。
為了確定PCVI，PCV2，嵌合PCV1-2和交互嵌合PCV2-1傳染性DNA克隆在豬體內(nèi)的致病性，首先檢查肉眼可見病變。結(jié)果如下面的表9所示。在第21和第49 DPIs，來自未接種的第1個(gè)對照組的動物的淋巴結(jié)是正常的。第4個(gè)接種組的豬具有局限于淋巴結(jié)的可變程度的肉眼可見病變。在PCV1接種過的第2組豬中，在第21 DPI，淋巴結(jié)大體上是正常的，不過，在第49 IDPI，檢測到了淋巴結(jié)的輕度至中度腫脹和脫色。第3組的所有PCV2接種的豬都具有比正常體積大2-5倍的淋巴結(jié)，到第21和第49 DPIs，所述淋巴結(jié)是堅(jiān)硬的和棕色的。在第21和第49 DPIs，7頭來自嵌合PCV1-2接種的動物中的5只的淋巴結(jié)是輕度至中度腫脹的，并且是脫色的。在用PCV2-1克隆接種的第5組豬中，8只動物中有1只在第21 DPI具有淋巴結(jié)的輕度腫脹和脫色。在第21和第49 DPIs，用嵌合PCV1-2克隆接種的豬的淋巴結(jié)的肉眼可見病變的平均得分，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上與第1、2和5組的豬沒有差別，不過，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上與用致病性PCV2接種的第3組的豬有差別。在第49 DPI，來自PCV1，PCV2，和PCV1-2接種動物的平均淋巴肉眼可見病變得分彼此之間在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有差別，不過，與第1和第5組的平均肉眼可見病變得分都存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差別。
然后，檢查了顯微鏡下病變。結(jié)果如下面的表10所示。在任何DPI，在未接種過的第1組對照豬或PCV1接種的第2組豬中，都沒有檢測到顯微鏡下病變。在8頭PCV2接種的豬中的1頭觀察到了以輕度氣管外周淋巴漿細(xì)胞和組織細(xì)胞支氣管間質(zhì)性肺炎為特征的微觀肺損傷。在PCV1-2和PCV2-1接種的動物中，沒有在肺中觀察到顯微鏡下病變。在任何接種豬的胸腺中都沒有觀察到損傷。在PCV2接種過的組中，在8頭豬中有2頭出現(xiàn)了輕度多病灶淋巴漿細(xì)胞心肌炎。來自PCV1-2和PCV2-1接種動物的心臟組織沒有顯微鏡下病變。在PCV2接種小組的8頭豬中有4頭，在PCV1-2接種的7頭豬中有2頭，以及在PCV2-1接種過的8頭豬中有1頭出現(xiàn)了輕度多病灶淋巴漿細(xì)胞間質(zhì)性腎炎。在PCV2接種組中，出現(xiàn)輕度至中度淋巴衰竭和濾泡的組織細(xì)胞置換的比例，在扁桃腺中為5/8頭豬，在脾臟中為3/8頭豬，在淋巴結(jié)中為8/8頭豬。在嵌合7PCV1-2接種過的動物中，在7頭豬中，有2頭的淋巴結(jié)出現(xiàn)了輕度淋巴衰竭和濾泡的組織細(xì)胞置換，不過，在脾臟或扁桃腺中都沒有檢測到。在交互嵌合PCV2-1接種的動物的淋巴結(jié)，脾臟或扁桃腺中都沒有出現(xiàn)淋巴衰竭或?yàn)V泡的組織細(xì)胞置換。在PCV2接種的8頭豬中，有7頭出現(xiàn)了輕度至中度淋巴漿細(xì)胞肝炎。在嵌合PCV1-2接種的7頭豬中，有2頭出現(xiàn)了輕度淋巴漿細(xì)胞肝炎。在交互嵌合PCV2-1接種的豬中，沒有出現(xiàn)淋巴漿細(xì)胞肝炎。在其他組織中的損傷不明顯。
按照公開的評估系統(tǒng)對肺、肝臟和淋巴結(jié)的顯微鏡下病變進(jìn)行評分(P.G.Halbur等，1995，同上)。結(jié)果如下面的表10所示。在第21和49 DPIs，來自第4組用嵌合PCV1-2接種的豬的淋巴結(jié)中病變的平均得分，與來自第1，2和5組的豬的類似，不過，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上與來自用致病性PCV2接種的第3組豬的得分不同。在第21 DPI，來自嵌合PCV1-2接種組的平均微觀肝臟病變得分，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上與來自PCV2接種的第3組動物的得分不同，不過，在第21 DPI，與來自第1，2和5組的豬的得分類似。在第49 DPI，來自第4組嵌合PCV1-2接種的豬的平均微觀肝臟得分，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上與來自1，2，3和5組的豬的得分沒有差別。沒有用于其他組織或器官的可以接受的評分系統(tǒng)。
表9.對照和接種豬的淋巴結(jié)的肉眼可見病變DPIb組別接種物a21491 PBS 0/4(0.0) 0/4(0.0)2 PCV1 DNA 0/4(0.0) 4/4(1.5)3 PCV2 DNA 4/4(2.5) 4/4(2.25)4 PCV1-2 DNA2/3(0.66)3/4(1.25)5 PCV2-1 DNA1/4(0.25)0/4(0.0)a用作陰性對照的磷酸緩沖的鹽溶液(PBS)。接種物是克隆在pSK質(zhì)粒上的基因組PCV或PCV嵌合DNAb在第21 DPI對來自每一個(gè)小組的4頭豬進(jìn)行尸體剖檢，并且，在第49 DPI，對其余的豬進(jìn)行尸體剖檢；陽性數(shù)量/檢測數(shù)量。具有損傷的數(shù)量/檢測數(shù)量(估計(jì)的嚴(yán)重淋巴結(jié)腫大的范圍)
表10.組織病理學(xué)病變在來自對照和接種豬的不同組織/器官中的分布組別接種物aDPIb肺c肝d淋巴節(jié)e脾胸腺 回腸 腦心臟 腎扁桃腺1 PBS 21 0/4(0.0) 0/4(0.0) 0/4(0.0) 0/40/40/4 0/40/4 0/4 0/449 0/4(0.0) 0/4(0.0) 0/4(0.0) 0/40/40/4 0/40/4 0/4 0/42 PCV1 DNA 21 0/4(0.0) 0/4(0.0) 0/4(0.0) 0/40/40/4 0/40/4 0/4 0/449 0/4(0.0) 0/4(0.0) 0/4(0.0) 0/40/40/4 0/40/4 0/4 0/43 PCV2 DNA 21 0/4(0.0) 4/4(1.5) 4/4(1.75)3/40/40/4 1/41/4 2/4 3/449 1/4(0.25)3/4(0.75)4/4(1.0) 0/40/40/4 0/41/4 2/4 2/44 PCV1-2 DNA21 0/3(0.0) 1/3(0.33)1/3(0.33)0/40/40/4 0/40/4 0/4 0/449 0/4(0.0) 1/4(0.25)1/4(0.25)0/40/40/4 0/40/4 2/4 0/45 PCV2-1 DNA21 0/4(0.0) 0/4(0.0) 0/4(0.0) 0/40/40/4 0/40/4 0/4 0/449 0/4(0.0) 0/4(0.0) 1/4(0.25)0/40/40/4 0/40/4 0/4 0/4a用作陰性對照的磷酸緩沖的鹽溶液(PBS)。接種物是克隆在pSK質(zhì)粒上的基因組PCV或PCV嵌合DNA。
b在第21 DPI對來自每一個(gè)小組的4頭豬進(jìn)行尸體剖檢，并且在第49 DPI對其余的豬進(jìn)行尸體剖檢；c陽性數(shù)量/檢測數(shù)量(平均組織學(xué)肺得分0，正常；1，輕度間質(zhì)性肺炎；2，中度；3，嚴(yán)重)。
d陽性數(shù)量/檢測數(shù)量(平均組織學(xué)肝臟得分0，正常；1，輕度肝炎；2，中度；3，嚴(yán)重)。
e陽性數(shù)量/檢測數(shù)量(平均組織學(xué)淋巴(淋巴結(jié))衰竭得分0，正常；1，輕度；2，中度；3，嚴(yán)重)。
實(shí)施例18血清學(xué)在第-2，7，14，21，28，35，42和49DIPs，從所有豬體內(nèi)采集血液。使用Herd Check PRRSV ELISA(IDEXX Laboratories，Westbrook，MA)分析PRRSV的血清抗體。通過血凝抑制(HI)分析檢測PPV的血清抗體(H.S.Joo等，“用于檢測豬細(xì)小病毒抗體的標(biāo)準(zhǔn)化血凝抑制”，Aust.Vet.J.52422-424(1976))，通過基于上文所述PCV2的重組ORF2衣殼蛋白的改進(jìn)的間接ELISA，檢測PCV2的血清抗體(也可參見P.Nawagitgul等，“基于2型豬環(huán)狀病毒(PCV2)改進(jìn)的直接和基于重組衣殼蛋白(ORF2)的ELISA”，Immunol.Clin.Diagn.LabImmunol.133-40(2002))。通過間接免疫熒光分析(IFA)檢測PCV1的血清抗體。讓用PCV1感染過的PK-15細(xì)胞在8孔LabTek腔室載玻片上生長。當(dāng)感染過的PK-15細(xì)胞達(dá)到95-100％鋪滿度時(shí)，用含有80％丙酮和20％甲醇的溶液，在4℃下固定感染過的細(xì)胞20分鐘。用PBS緩沖液洗滌所述固定過的細(xì)胞1次。將以1∶10的比例稀釋在PBS中的100μl豬血清添加到所述腔室中，并且在37℃下培養(yǎng)4小時(shí)。然后用PBS洗滌所述細(xì)胞3次，并且在45℃下下與FITC-標(biāo)記的山羊抗-豬二級抗體一起溫育45分鐘。然后用PBS洗滌所述載玻片3次，用Fluoromout-G封固，加蓋玻片，并且在熒光顯微鏡下檢查。對于陽性對照來說，將PCV1感染過的細(xì)胞，與稀釋過的PCV1特異性單克隆抗體(由G.M.Allan博士饋贈)一起溫育，然后，與FITC-標(biāo)記過的山羊抗小鼠IgG(Kirkegaard&Perry Laboratories，Inc.，Gaithersburg，MD.)一起溫育。對于陰性對照來說，將PCV1感染過的細(xì)胞與以1∶10的比例稀釋的不含PCV1和PCV2抗體的豬血清一起溫育，然后與FITC-標(biāo)記的山羊抗豬IgG(Kirkegaard&PerryLaboratories，Inc.，Gaithersburg，MD.)一起溫育。
實(shí)施例19PCR檢測為了檢測來自接種過的豬的血清中的PCV1，PCV2，嵌合PCV1-2和交互嵌合PCV2-1病毒血癥，通過PCR檢測在不同的DPIs采集的血清樣品。按照生產(chǎn)商的方法，用DNAzol試劑(Molecular ResearchCenter，Cincinnati，OH)從100微升每一種血清樣品中提取病毒DNA。將提取的DNA重新懸浮在不含DNase，RNase和蛋白酶的水中。為了擴(kuò)增PCV1，PCV2，嵌合PCV1-2和嵌合交互PCV2-1的克隆特異性基因組序列，設(shè)計(jì)了兩套嵌套PCR引物對(參見上面的表6)。第一套嵌套引物是根據(jù)公開的PCV1序列設(shè)計(jì)的。如SEQ ID NO20所示的引物Gen.PCV1和如SEQ ID NO19所示的Orf.PCV1，在存在PCV1基因組的情況下擴(kuò)增了400bp的片段。所述嵌套的引物，即如SEQ ID NO22所示的nested.Gen.PCV1和如SEQ ID NO21所示的nested.Orf.PCV1擴(kuò)增了220bp的片段。
為了檢測PCV2病毒血癥，如SEQ ID NO24所示的Gen.PCV2和如SEQ ID NO23所示的Orf.PCV2組成的PCV2引物對，在存在PCV2的條件下，在第一輪PCR中擴(kuò)增了900bp的片段。如SEQ ID NO26所示的引物nested.Gen.PCV2和SEQID NO25所示的nested.Orf.PCV2在嵌套PCR中擴(kuò)增了600bp的片段。
為了檢測嵌合PCV1-2病毒血癥，第一輪PCR反應(yīng)采用了如SEQ IDNO20所示的PCV1-特異性引物Gen.PCV1和如SEQ ID NO23所示的PCV2 ORF2-特異性引物Orf.PCV2，以便擴(kuò)增580bp的嵌合片段。為了進(jìn)行嵌套PCR，將如SEQ ID NO22所示的PCV1-特異性引物nested.Gen.PCV1和如SEQ ID NO25所示的PCV2 ORF2-特異性引物nested.Orf.PCV2用于擴(kuò)增370bp的嵌合片段。
為了檢測交互嵌合PCV2-1病毒血癥，第一輪PCR采用了如SEQ IDNO24所示的PCV2-特異性引物Gen.PCV2和如SEQ ID NO19所示的PCV1 ORF2-特異性引物Orf.PCV1，以便擴(kuò)增700bp的嵌合片段。為了進(jìn)行嵌套PCR，將如SEQ ID NO26所示的PCV2-特異性引物nested.Gen.PCV2和如SEQ ID NO21所示的PCV1 ORF2-特異性引物nested.Orf.PCV1用于擴(kuò)增400bp的嵌合片段。所有PCR參數(shù)基本上相同，包括38輪在94℃下變性1分鐘，在45℃下退火1分鐘，并且在72℃下延伸1.5分鐘。通過PCR-RFLP診斷分析，檢測來自陰性對照豬的血清樣品，正如以前所披露的，該分析方法能檢測并且區(qū)分PCV1和PCV2(M.Fenaux等，“來自北美洲不同地區(qū)的患有斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征的豬的2型豬環(huán)狀病毒(PCV-2)的遺傳學(xué)表征和用于檢測和區(qū)分PCV-1和PCV-2感染的示差PCR-限制片段長度多形性分析”，J.Clin.Microbiol.382494-503(2000))。對來自每一個(gè)組的選擇的動物的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，以便驗(yàn)證所述感染豬的病毒的來源。
實(shí)施例20免疫組織化學(xué)(IHC)對在第21和49 DPIs從所有尸體剖檢的豬體內(nèi)采集的淋巴結(jié)組織進(jìn)行PCV2-特異性抗原的IHC檢測。按照以前所披露的通用方法，將抗PCV2的兔多克隆抗血清用于IHC(S.D.Sorden等，“用于檢測福爾馬林固定的，石蠟包埋的組織中的2型豬環(huán)狀病毒的多克隆抗體型免疫組織化學(xué)方法的開發(fā)”，J.Vet.Diagn.Invest.11528-530(1999))。
根據(jù)PCV2-特異性抗原的IHC染色，來自未接種的對照，PCV1和PCV2-1接種的豬的淋巴組織的PCV2抗原呈陰性。在PCV2接種組的8只動物中，有7只動物的淋巴組織中檢測了PCV2抗原。在來自嵌合PCV1-2接種組的7頭豬中，有1頭豬的淋巴組織中也檢測到了PCV2抗原。
在以上說明中，業(yè)已出于說明目的，而不是限定目的對本發(fā)明的具體實(shí)施方案進(jìn)行了詳細(xì)說明?？梢岳斫獾氖?，在基于本說明書的基礎(chǔ)上本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的所有其他改進(jìn)、分枝和等同方案，都被視為包括在如權(quán)利要求書所確定的本發(fā)明范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.豬環(huán)狀病毒(PCV1-2)的傳染性嵌合核酸分子，其特征在于具有編碼傳染性，非致病性PCV1的核酸分子，它包括取代了所述PCV1核酸分子的ORF基因的致病性PCV2的免疫原性開放讀框(ORF)基因。
2.如權(quán)利要求1的嵌合核酸分子，其特征在于所述免疫原性PCV2 ORF基因取代了所述PCV1核酸分子上的相同的ORF基因位置。
3.如權(quán)利要求2的嵌合核酸分子，其特征在于所述免疫原性O(shè)RF基因是ORF2衣殼基因。
4.如權(quán)利要求3的嵌合核酸分子，其特征在于所述嵌合核酸分子具有如SEQ ID NO2所示的核苷酸序列，它的互補(bǔ)鏈或與SEQ ID NO2的核苷酸序列具有至少95％的同源性的核苷酸序列。
5.一種具有生物學(xué)功能的質(zhì)粒或病毒載體，其特征在于包括如權(quán)利要求4所述的嵌合核酸分子。
6.如權(quán)利要求5的質(zhì)粒，其特征在于具有ATCC專利保藏號PTA-3912。
7.一種用載體轉(zhuǎn)染過的合適的宿主細(xì)胞，其特征在于包括權(quán)利要求4所述的嵌合核酸分子。
8.一種無毒的，傳染性嵌合豬環(huán)狀病毒，其特征在于是由含有如權(quán)利要求4所述的嵌合核酸分子的細(xì)胞生產(chǎn)的。
9.如權(quán)利要求8的傳染性嵌合豬環(huán)狀病毒，其特征在于所述細(xì)胞含有包含在具有ATCC專利保藏號PTA-3912的質(zhì)粒中或衍生自該質(zhì)粒的嵌合核酸分子。
10.一種用于生產(chǎn)免疫原性多肽產(chǎn)物的方法，所述方法的特征在于它包括在合適的營養(yǎng)條件下，以允許表達(dá)所述多肽產(chǎn)物的方式生長用權(quán)利要求4的核酸分子轉(zhuǎn)染過的原核或真核宿主細(xì)胞，并且分離所述核酸分子表達(dá)的所需的多肽產(chǎn)物。
11.如權(quán)利要求10的表達(dá)的免疫原性多肽產(chǎn)物。
12.一種免疫原性多肽，其特征在于具有如SEQ ID NO4所示的氨基酸序列，或它的生物學(xué)活性變體。
13.一種保護(hù)豬免受由PCV2導(dǎo)致的病毒感染或斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的病毒疫苗，其特征在于包括無毒的，生理學(xué)上可接受的載體和免疫原性量的選自下組的成分(a)具有SEQ ID NO2所示核苷酸序列的嵌合核酸分子，它的互補(bǔ)鏈或與SEQ ID NO2的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列；(b)具有生物學(xué)功能的質(zhì)?；虿《据d體，它含有所述嵌合核酸分子，互補(bǔ)鏈或與SEQ ID NO2的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列；(c)無毒的，傳染性嵌合豬環(huán)狀病毒；(d)具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的多肽或它的生物學(xué)活性變體；(e)具有ATCC專利保藏號PTA-3913的傳染性PCV2分子DNA克隆或由它衍生的PCV2 DNA克??；和(f)包括具有ATCC專利保藏號PTA-3913的傳染性PCV2分子DNA克隆或由它衍生的PCV2 DNA克隆的具有生物學(xué)功能的質(zhì)?；虿《据d體。
14.如權(quán)利要求13的病毒疫苗，其特征在于所述疫苗包括活的嵌合豬環(huán)狀病毒。
15.一種保護(hù)豬免受由PCV2導(dǎo)致的病毒感染或斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的方法，其特征在于包括給需要保護(hù)的豬施用免疫有效量的如權(quán)利要求13的疫苗。
16.如權(quán)利要求15的方法，其特征在于包括給所述豬施用所述嵌合核酸分子或活的嵌合豬環(huán)狀病毒。
17.如權(quán)利要求16的方法，其特征在于包括通過腸胃外，鼻內(nèi)，真皮內(nèi)或經(jīng)皮途徑給所述豬施用疫苗。
18.如權(quán)利要求17的方法，其特征在于包括通過淋巴內(nèi)或肌內(nèi)途徑給所述豬施用所述疫苗。
19.一種制備權(quán)利要求1的PCV1-2的傳染性嵌合核酸分子的方法，其特征在于包括除去編碼傳染性，非致病性PCV1的核酸分子的開放讀框(ORF)；用來自致病性PCV2的免疫原性O(shè)RF基因取代PCV1的所述ORF基因位置；以及回收所述嵌合核酸分子。
20.如權(quán)利要求19的方法，其特征在于所述免疫原性PCV2 ORF基因取代了所述PCV1核酸分子上的相同的ORF基因位置。
21.如權(quán)利要求20的方法，其特征在于所述免疫原性O(shè)RF基因是ORF2。
22.如權(quán)利要求21的方法，其特征在于所述PCV2的ORF2基因是從包含在具有ATCC專利保藏編號PTA-3913的表達(dá)載體上的PCV2的分子核酸分子獲得的。
23.一種傳染性PCV2分子DNA克隆，其特征在于具有ATCC專利保藏編號PTA-3913或由它衍生的PCV2 DNA克隆。
24.一種具有生物學(xué)功能的質(zhì)?；虿《据d體，其特征在于包括權(quán)利要求23所述的傳染性PCV2分子DNA克隆。
25.一種PCV2-1的傳染性交互嵌合核酸分子，其特征在于包括編碼傳染性，致病性PCV2的核酸分子，它具有取代了PCV2核酸分子的ORF2基因的來自非致病性PCV1的免疫原性O(shè)RF2基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及傳染性DNA克隆，豬環(huán)狀病毒(PCV)的傳染性嵌合DNA克隆，保護(hù)豬免受PCV2引起的病毒感染或斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的疫苗和方法。所述新型嵌合的傳染性DNA克隆及其衍生的有毒力的嵌合病毒是用非致病性PCV1構(gòu)建的，其中，致病性PCV2的免疫原性O(shè)RF基因取代了非致病性PCV1的基因，優(yōu)選是在相同的位置上取代。所述嵌合病毒優(yōu)選保留了PCV1的非致病性表型，但是，仍然能誘導(dǎo)對致病性PCV2的特異性免疫應(yīng)答。本發(fā)明還包括所述免疫原性多肽表達(dá)產(chǎn)物。
文檔編號A61K48/00GK1620310SQ02828049
公開日2005年5月25日 申請日期2002年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月12日
發(fā)明者孟祥金, M·費(fèi)瑙克斯, P·G·哈爾布爾 申請人:弗吉尼亞科技知識產(chǎn)權(quán)有限公司, 衣阿華州立大學(xué)研究基金公司