專利名稱：適合治療劑全身性遞送的中央氣道給藥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于透過上皮提供治療的方法和產(chǎn)品。具體地說，本發(fā)明涉及通過給藥到肺臟中央氣道用于與新生兒的Fc受體(FcRn)結(jié)合配體綴合的治療劑的全身性遞送的方法和組合物。這些方法和組合物對于治療本身在受試者的疾病、病變或其它癥狀的治療或預(yù)防方面有用的任何適應(yīng)癥都是有用的。
本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)大分子越過上皮屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)可以借助受體非特異性的或受體特異性的機(jī)制發(fā)生。受體非特異性機(jī)制是用效率與被轉(zhuǎn)運(yùn)分子的分子量成反比關(guān)系的薄壁組織細(xì)胞篩分事件表現(xiàn)的。諸如免疫球蛋白G(IgG)之類的大分子經(jīng)由這種薄壁組織細(xì)胞路徑的轉(zhuǎn)運(yùn)由于IgG的大的分子質(zhì)量(ca.150kDa)效率非常低。受體非特異性轉(zhuǎn)運(yùn)可以包括流體相中的胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)。這與受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)相比效率低得多，因?yàn)樵诹黧w相中大多數(shù)大分子被分類到適合降解的溶酶體。反之，可以提供非常有效的分子轉(zhuǎn)運(yùn)的受體特異性機(jī)制以別的方式被薄壁組織細(xì)胞篩分有效地排除。這種受體引導(dǎo)機(jī)制依照目的論可以被理解為對于諸如白蛋白、鐵傳遞蛋白和免疫球蛋白之類的合成代謝費(fèi)用高的大分子有效的清道夫機(jī)制。這些和其它的大分子將以別的方式通過它們從身體里面到外面向下游擴(kuò)散無窮的濃度梯度在上皮屏障遺失。適合大分子越過上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的受體特異性機(jī)制僅僅對于為數(shù)不多的大分子存在。
限定身體內(nèi)部和外部世界之間的邊界的表面是由叫做上皮的專用組織提供的。按其最簡單的形式，上皮是形成覆蓋外表面或“內(nèi)”表面的一層單一類型的細(xì)胞。上皮組織起因于內(nèi)胚層和外胚層，并因此包括皮膚、角膜(眼)的上皮以及胃腸道、泌尿生殖道和呼吸系統(tǒng)的“內(nèi)部的”襯里表面。這些“內(nèi)部的”襯里表面與外側(cè)世界溝通，因此，它們形成在身體內(nèi)部和外側(cè)世界之間的邊界。盡管這些各不相同的上皮細(xì)胞有特定的結(jié)構(gòu)特征或區(qū)分它們的附屬物，但是它們也分享許多共有的東西。
在各種不同的上皮細(xì)胞之中共有的兩個特征是在總水平上的大表面積和在細(xì)胞水平上有緊密接合的近距離并置的組合。這兩個特征對于上皮用作全身性非侵入提供治療的部位分別呈現(xiàn)潛在的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。例如，成年人的肺臟上皮的表面積被認(rèn)為是140m2。因此，這個巨大的表面可能呈現(xiàn)適合全身性提供治療制劑的非常有吸引力的給藥部位，當(dāng)然，這將以治療制劑能提供給上皮并且能越過上皮轉(zhuǎn)運(yùn)為前提條件。
另外，對于本發(fā)明特別重要的代表各種不同的上皮細(xì)胞的第三個特征是由FcRn(新生兒的Fc受體)提供的適合越過上皮屏障轉(zhuǎn)運(yùn)的受體特異性機(jī)制。這種受體是在新生兒的大白鼠和小鼠的腸上皮細(xì)胞中首先識別的并且被表示成母鼠的IgG從乳汁到還在吃奶的大白鼠或小鼠的血流的轉(zhuǎn)運(yùn)媒介?？窟@種機(jī)制轉(zhuǎn)運(yùn)給新生兒的IgG對于嬰兒的免疫防御是至關(guān)緊要的。為了停止跟隨新生兒周期，報(bào)告在大白鼠和小鼠的腸上皮細(xì)胞中的FcRn的表達(dá)。在人類中，體液免疫不取決于新生兒的腸IgG轉(zhuǎn)運(yùn)。然而，人們相信胎盤組織的受體負(fù)責(zé)IgG轉(zhuǎn)運(yùn)。負(fù)責(zé)這種轉(zhuǎn)運(yùn)的受體已被尋找許多年。一些粘合IgG的蛋白質(zhì)已從胎盤中分離出來。FcγRII是在胎盤內(nèi)皮中發(fā)現(xiàn)的，而FcγRIII是在合體細(xì)胞滋養(yǎng)層中發(fā)現(xiàn)的。然而，這兩種受體對于單節(jié)顯性的IgG都表現(xiàn)出比較低的親和力。在1994年，Simister及其同事報(bào)告了從人類胎盤分離給IgG的大白鼠和小鼠Fc受體的人類同系物編碼的cDNA。Story CM等人(1994)J Exp.Met 1802377-81。完整的核苷和演繹的氨基酸序列是分別作為基因庫新增編號U12255和AAA58958報(bào)告的并且都是可用的。
不同于嚙齒動物的腸FcRn，人類的FcRn出乎意料地被發(fā)現(xiàn)是在成人上皮組織中表達(dá)的。見美國專利第6,030,613和6,086,875號。明確地說，業(yè)已發(fā)現(xiàn)，人類的FcRn被表達(dá)在肺的上皮組織和腸的上皮組織上(Israel EJ等人，(1997)Immunology9269-74)、腎的近端管狀上皮細(xì)胞上(Kobayashi N等人，(2002)Am J Physiol Renal Physiol 282F358-65)和包括鼻的上皮細(xì)胞、陰道表面和膽管樹表面在內(nèi)的其它的粘膜上皮表面上。
美國專利第6,030,613號揭示了適合對腸的上皮、粘膜上皮和肺臟的上皮提供治療的與FcRn結(jié)合配體綴合的方法和組合物。
美國專利第6,086,875號揭示通過將與FcRn結(jié)合配體綴合的抗原遞送到包括肺臟上皮在內(nèi)的FcRn表達(dá)上皮來刺激對抗原的免疫反應(yīng)的方法和組合物。
人們普遍地相信適合全身性提供治療的對肺臟上皮的治療劑給藥需要遞送到深層肺臟，即遞送到肺臟周邊，因?yàn)檫@可以到達(dá)最大的可用表面積。見Yu J等人，(1997)Crit Rev TherapeuticDrug Carrier Systems 14395-453。此外，作為肺臟最深區(qū)域(肺泡)襯里的上皮是極薄的單層細(xì)胞。反之，肺臟比較接近中央的氣道的上皮是相當(dāng)厚的，而且它們備有纖毛以利于清除否則可能在較遠(yuǎn)離中央的氣道和肺泡中聚積并借此干擾氣體交換的物質(zhì)。所以，氣溶膠遞送系統(tǒng)和方法已經(jīng)以使藥物最大限度地遞送到深層肺臟為目標(biāo)逐步發(fā)展。這通常需要與氣溶膠發(fā)生器[例如，劑量經(jīng)過計(jì)量的吸入器(MDI)裝置]和使用氣溶膠發(fā)生器時受試者使用的專用吸入技術(shù)兩者有關(guān)的諸因素的組合。例如，典型的MDI可能是為產(chǎn)生可能最小的霧滴或顆粒而設(shè)計(jì)的，而且為了俘獲和除去來自氣溶膠的較大的速度較低的顆粒與隔板裝置或附件一起使用可能是合適的。使用者通?？赡懿坏貌挥梦鼩獾拈_始、吸氣的速率和深度、控制呼吸等協(xié)調(diào)MDI的排放，全部是為了增加活性制劑有效的遞送到肺臟的最深區(qū)域的可能性。不用說，患者的順從和治療效果往往是靠這些技術(shù)要求折衷的。
本發(fā)明的概述本發(fā)明部份地涉及發(fā)明家令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，即FcRn在肺上皮上的表達(dá)在中央氣道比在周邊氣道更廣泛。這種FcRn在肺上皮上的密度分布當(dāng)治療制劑作為治療制劑和FcRn結(jié)合配體的共軛物給藥的時候?qū)嶋H上支持治療制劑對中央氣道而不是對深層肺臟的氣溶膠給藥。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，依照本發(fā)明，成煙霧狀散開的FcRn結(jié)合配體共軛物對中央氣道的優(yōu)先給藥允許共軛物越過呼吸上皮細(xì)胞非常有效的FcRn介導(dǎo)胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)和治療制劑的全身性遞送。不同于其它用于經(jīng)肺部給藥的全身性遞送的方法和組合物，本發(fā)明有利地實(shí)現(xiàn)了最佳的全身性遞送，而不需要專門的呼吸技術(shù)。因深層肺臟遞送的需要所呈現(xiàn)的技術(shù)障礙借此得以避免，而且本發(fā)明通過將治療制劑作為與FcRn結(jié)合配體的共軛物對肺臟中央氣道的氣溶膠給藥提供對于非侵入性地將治療制劑全身性遞送給受試者有用的有效策略。
本發(fā)明在為了治療或預(yù)防可用治療制劑治療的受試者的癥狀需要對受試者完成特定的治療制劑的給藥的所有場合都是有用的。本發(fā)明在需要完成治療制劑的重復(fù)的或長期的給藥、順從專用的呼吸技術(shù)難以實(shí)現(xiàn)的所有場合以及每逢優(yōu)選避免侵入性給藥的時候都特別有用。
依照本發(fā)明的一個方面，提供用于治療制劑的全身性遞送的方法。該方法包括有效量的治療制劑和FcRn結(jié)合配體的共軛物氣溶膠對肺臟這樣給藥，以致中央肺臟區(qū)域/外圍肺臟區(qū)域沉積比(C/P比)是至少0.7。如同下面進(jìn)一步解釋的那樣，C/P比是這樣選擇的，以致共軛物被優(yōu)先遞送到中央氣道。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，C/P比依照本發(fā)明的這個方面至少是1.0。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，C/P比至少是1.5。在大多數(shù)優(yōu)選的實(shí)施方案中，C/P比至少是2.0。
依照本發(fā)明的另一方面，提供用于全身性遞送治療制劑的方法。該方法包括有效量的治療制劑和FcRn結(jié)合配體的共軛物的氣溶膠對肺臟的給藥，其中氣溶膠的顆粒有至少3微米(μm)的質(zhì)量中值氣動力學(xué)直徑(MMAD)。
依照本發(fā)明的第三方面，提供治療制劑和FcRn結(jié)合配體的共軛物的氣溶膠，其中氣溶膠的顆粒有至少3μm的MMAD。
依照本發(fā)明的第四方面，提供氣溶膠遞送系統(tǒng)。依照這個方面的氣溶膠遞送系統(tǒng)包括容器、與容器連接的氣溶膠發(fā)生器以及放容器里面的治療制劑和FcRn結(jié)合配體的共軛物，其中氣溶膠發(fā)生器是為了形成有MMAD至少為3μm的顆粒的共軛物氣溶膠而構(gòu)造和安排的。
在一個實(shí)施方案中，這個方面提供制造氣溶膠遞送系統(tǒng)的方法。該方法包括提供容器、提供與容器連接的氣溶膠發(fā)生器和把有效量的共軛物放進(jìn)容器的步驟。
在一些依照本發(fā)明的這個方面的實(shí)施方案中，氣溶膠發(fā)生器包括與包含共軛物的溶液流體連接的振動元件。
在一些實(shí)施方案中，振動元件包括一個構(gòu)件，該構(gòu)件有(a)前表面、(b)與溶液流體連接的后表面和(c)眾多穿越構(gòu)件的孔。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在前表面的孔有至少3μm的直徑。優(yōu)選的是，孔是錐形的，以致它們從后表面到前表面逐漸變窄。
在一些依照本發(fā)明這個方面的實(shí)施方案中，氣溶膠發(fā)生器是霧化器。在一些實(shí)施方案中，霧化器是噴氣式霧化器。
在一些依照本發(fā)明這個方面的實(shí)施方案中，氣溶膠發(fā)生器是機(jī)械泵。
在一些依照本發(fā)明這個方面的實(shí)施方案中，容器是增壓容器。
依照本發(fā)明的第四方面，提供氣溶膠遞送系統(tǒng)。依照這個方面的氣溶膠遞送系統(tǒng)包括容器、與容器連接的氣溶膠發(fā)生器和放在容器里面的治療制劑和FcRn結(jié)合配體的共軛物，其中氣溶膠發(fā)生器包括產(chǎn)生有MMAD至少為3μm的顆粒的共軛物的氣溶膠的裝置。
在一個實(shí)施方案中，這個方面提供制造氣溶膠遞送系統(tǒng)的方法。該方法包括提供容器、提供與容器連接的氣溶膠發(fā)生器和將有效量的共軛物放進(jìn)容器的步驟。
在一些依照本發(fā)明這個方面的實(shí)施方案中，氣溶膠發(fā)生器包括與包含共軛物的溶液流體連接的振動元件。
在一些實(shí)施方案中，振動元件包含一個構(gòu)件，該構(gòu)件有(a)前表面、(b)與溶液流體連接的后表面和(c)眾多穿越構(gòu)件的孔。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在前表面的孔有至少3μm的直徑。優(yōu)選的是，孔是錐形的，以致它們從后表面到前表面逐漸變窄。
在一些依照本發(fā)明這個方面的實(shí)施方案中，氣溶膠發(fā)生器是霧化器。在一些實(shí)施方案中，霧化器是噴氣式霧化器。
在一些依照本發(fā)明這個方面的實(shí)施方案中，氣溶膠發(fā)生器是機(jī)械泵。
在一些依照本發(fā)明這個方面的實(shí)施方案中，容器是增壓容器。
在本發(fā)明上述的每個方面中，在一些實(shí)施方案中，顆粒的MMAD介于3μm和大約8μm之間。在一些實(shí)施方案中，顆粒的MMAD大于4μm。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，大多數(shù)顆粒是不適于呼吸的，即，它們有至少4.8μm的MMAD。不適于呼吸的顆粒被認(rèn)為不進(jìn)入深層肺臟中的肺泡空間。
在本發(fā)明上述的每個方面中，在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)cRn結(jié)合配體包含F(xiàn)cRn的配體，它的模仿與FcRn結(jié)合的IgG的Fc域部分(即，F(xiàn)c、Fc域、Fc片段、Fc片段同系物)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，F(xiàn)cRn結(jié)合配體的是非特異性IgG或IgG的FcRn粘合片段。最典型的是FcRn結(jié)合配體對應(yīng)于IgG的Fc片段。
在本發(fā)明上述的每個方面中，在一些實(shí)施方案中，治療制劑和FcRn結(jié)合配體是通過共價鍵偶聯(lián)的。
在本發(fā)明上述的每個方面中，，治療制劑和FcRn結(jié)合配體在一些實(shí)施方案中是通過連接體偶聯(lián)的。優(yōu)選的是連接體是肽連接體。在一些實(shí)施方案中，連接體至少包括特異性剪切酶的底物的一部分。
在本發(fā)明上述的每個方面中，治療制劑在一些實(shí)施方案中是多肽。在這樣的實(shí)施方案中，共軛物優(yōu)選是離體融合蛋白。在某些這樣的實(shí)施方案中，共軛物的多肽治療制劑可能是用連接體與FcRn結(jié)合配體相連的，只要多肽治療制劑和FcRn結(jié)合配體每個都至少保有它的一些生物活性即可。
在本發(fā)明上述的每個方面中，治療制劑在一些實(shí)施方案中是細(xì)胞因子。在一些實(shí)施方案中，治療制劑是細(xì)胞因子受體或它的細(xì)胞因子粘合片段。
在本發(fā)明上述的每個方面中，治療制劑在一些實(shí)施方案中是抗原?？乖赡苁遣≡w特有的、自身免疫疾病特有的、過敏原特有的或腫瘤特有的。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，抗原是腫瘤抗原。
在本發(fā)明上述的每個方面中，治療制劑在一些實(shí)施方案中是低聚核苷酸。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，低聚核苷酸是抗過敏的低聚核苷酸。
在本發(fā)明上述的每個方面中，治療制劑在一些實(shí)施方案中是紅細(xì)胞生成素(EPO)、生長激素、干擾素α(IFN-α)、干擾素β(IFN-β)、或促卵泡激素(FSH)。在本發(fā)明上述的每個方面中，治療制劑在一些實(shí)施方案中是因子VIIa、因子VIII、因子IX、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、TNF-α受體[例如，etanercept，ENBREL；參閱美國專利第5,605,690號、PCT/US93/08666(WO94/06476)和PCT/US90/04001(WO91/03553)]、淋巴細(xì)胞功能抗原-3(LFA-3)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，治療制劑是EPO。在其它的優(yōu)選實(shí)施方案中，治療制劑是生長激素。在其它的優(yōu)選實(shí)施方案中，治療制劑是IFN-α。在另一些其它的優(yōu)選實(shí)施方案中，治療制劑是IFN-β。在另一些其它的優(yōu)選實(shí)施方案中，治療制劑是FSH。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，治療制劑是因子VIII。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，治療制劑是因子IX。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，治療制劑是TNF-α。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，治療制劑是TNF受體。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，治療制劑是LFA-3。在進(jìn)一步的優(yōu)選實(shí)施方案中，治療制劑是CNTF。在每一個這樣的和類似的優(yōu)選實(shí)施方案中，治療制劑是有生物活性的多肽，無論是全部還是其一部分。例如，是TNF受體(TNFR)的治療制劑包括整個的TNFR和TNF粘合TNF受體的多肽，例如，TNFR的細(xì)胞外域。
在本發(fā)明上述的每個方面中，共軛物在某些優(yōu)選實(shí)施方案中實(shí)質(zhì)上呈現(xiàn)它天賦的未變性的形式。在一些實(shí)施方案中，至少60％的共軛物呈現(xiàn)它天賦的未變性的形式。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少70％的共軛物呈現(xiàn)它天賦的未變性的形式。在更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少80％的共軛物呈現(xiàn)它天賦的未變性的形式。在非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少90％的共軛物呈現(xiàn)它天賦的未變性的形式。在更加非常優(yōu)選實(shí)施方案中，至少95％的共軛物呈現(xiàn)它天賦的未變性的形式。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少98％的共軛物呈現(xiàn)它天賦的未變性的形式。
本發(fā)明的這些和其它方面將在下面予以更詳細(xì)的描述。
附圖簡要說明

圖1給出包括鉸合部、CH2和CH3域的人類IgG1 Fc片段的核苷酸(SEQ ID NO1)和氨基酸(SEQ ID NO2)序列。在氨基酸序列下面的數(shù)字對應(yīng)于使用EU編號慣例的氨基酸標(biāo)號。
圖2給出野生型人類EPO的cDNA可讀框核苷酸(Panel A；SEQ ID NO3)和演繹的氨基酸(Panel B；SEQ ID NO4)序列。SEQID NO4中的信號肽加下劃線。
圖3給出用于表達(dá)質(zhì)粒pED.dC.XFc(Panel A)和Kb信號肽/Fcγl插入片段(Panel B)的核苷酸(SEQ ID NO5)和氨基酸(SEQ IDNO6)序列的質(zhì)粒圖。Kb信號肽和Fcγl區(qū)域是通過在序列上面加波紋符號(～)指出的。EcoRI、PstI和XbaI限制酶部位加下劃線。
圖4給出用于表達(dá)質(zhì)粒pED.dC.Epofc(Panel A)和Kb信號肽/EPO/Fcγl插入片段(Panel B)的核苷酸(SEQ ID NO7)和氨基酸(SEQ ID NO8)序列的質(zhì)粒圖。Kb信號肽、成熟EPO和Fcγl區(qū)域是通過在序列上面加波紋符號(～)指出的。EcoRI、SbfI和XbaI限制酶部位加下劃線。
圖5給出用于表達(dá)質(zhì)粒pED.dC.natEpofc(Panel A)和天賦EPO/Fcγl插入片段(Panel B)的核苷酸(SEQ ID NO9)和氨基酸(SEQ ID NO10)序列的質(zhì)粒圖。成熟EPO(包括天賦EPO信號肽)和Fcγl區(qū)域是通過在序列上面加波紋符號(～)指出的。EcoRI、SbfI和XbaI限制酶部位加下劃線。
圖6是描繪在活體內(nèi)對作為氣溶膠對獼猴類猴子的中央氣道給藥的EPO-Fc的響應(yīng)的兩張曲線圖。Panel A展示九個動物中每個動物的最大的網(wǎng)狀細(xì)胞響應(yīng)。成煙霧狀散開的EPO-Fc是使用霧化器對自然呼吸的動物給藥的。Panel B展示在通過淺的或深的呼吸吸入之后EPO-Fc(天賦的Fc片段)和突變型EPO-Fc(有三個對于FcRn粘合至關(guān)緊要的氨基酸突變的Fc片段)的最大血清濃度。
圖7是描繪在20％生活力(20％VC，淺呼吸)和75％生活力(75％VC，深呼吸)下氣溶膠給藥之后在獼猴類猴子中EPO-Fc的最大血清濃度的曲線圖。
圖8是描繪在20％生活力下以30μg/kg(圓)和10μg/kg(三角形)的劑量氣溶膠給藥之后在獼猴類猴子中EPO-Fc的血清濃度隨時間變化的曲線圖。每條曲線表示來自單一動物的數(shù)據(jù)。
圖9是描繪在以20μg/kg的劑量使用淺呼吸完成IFN-α-Fc或INTRONA的氣溶膠給藥之后在獼猴類猴子中IFN-α-Fc或單獨(dú)的IFN-α的血清濃度隨時間變化的曲線圖。每條曲線表示來自單一動物的數(shù)據(jù)。
圖10是描繪在以2μg/kg的劑量使用淺呼吸完成IFN-α-Fc的氣溶膠給藥之后在獼猴類猴子中IFN-α-Fc的血清濃度隨時間變化的曲線圖。每條曲線表示來自單一動物的數(shù)據(jù)。
圖11是描繪在以20μg/kg的劑量使用淺呼吸完成IFN-α-Fc的氣溶膠給藥之后IFN-α生物活性的兩種公測度——寡腺苷酸合成酶(OAS)活性(Panel A)和新蝶呤濃度(Panel B)——的兩張曲線圖。每條曲線表示來自單一動物的數(shù)據(jù)。
圖12是描繪在以0.3-0.5毫克/公斤的估計(jì)沉積劑量使用淺呼吸完成IFN-α-Fc的氣溶膠給藥之后在獼猴類猴子中ENBRELS(人類的TNFR-Fc)的血清濃度隨時間變化的曲線圖。
本發(fā)明的詳細(xì)描述每逢需要越過肺臟上皮遞送治療制劑來實(shí)現(xiàn)治療制劑的全身性遞送的時候，本發(fā)明是有用的。這是通過將治療制劑和FcRn結(jié)合配體的共軛物給藥到中央氣道完成的，其中中央氣道就其本性而言特別適合FcRn結(jié)合配體的FcRn受體介導(dǎo)的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。有利的是，本發(fā)明可能被用在全身性提供幾乎任何大小的治療，包括有非常大的分子量的那些。因此，本發(fā)明可以用于適合全身性遞送的大分子、肽、低聚核苷酸、小分子、藥物和診斷劑的肺部給藥。
一方面，本發(fā)明提供遞送治療制劑的方法，該方法包括將有效量的治療制劑和FcRn結(jié)合配體的共軛物的氣溶膠給藥到肺臟，以致C/P比至少是0.7。
“治療制劑”如同在本文中使用的那樣指的是對治療或預(yù)防受試者的疾病、失調(diào)或癥狀有用的化合物。如同在本文中使用的那樣，術(shù)語“治療”意味著改善受試者的疾病、失調(diào)或癥狀的預(yù)兆或征兆，或停止受試者的疾病、失調(diào)或癥狀的進(jìn)展。受試者的某種特定的疾病、失調(diào)或癥狀的預(yù)兆、征兆和進(jìn)展能使用普通技術(shù)人員認(rèn)可的任何可適用于臨床的或?qū)嶒?yàn)室的測度進(jìn)行評估，例如，如同在Fauci AS等人編輯的“Harrison′s Principles of InternalMedicine(內(nèi)科學(xué)的Harrison原則)”，第14版，McGraw-Hill，New York，1998中描述的那樣。如同在本文中使用的那樣，術(shù)語“受試者”意味著哺乳動物，優(yōu)選人類。為了治療或預(yù)防特定的疾病、失調(diào)或癥狀，普通技術(shù)人員將認(rèn)可適合那個目的的治療制劑。
本發(fā)明的FcRn結(jié)合配體共軛物可以用來全身性遞送各式各樣的治療制劑，包括但不限于，抗原，包括腫瘤抗原；適合治療癌癥的化療制劑；細(xì)胞因子；生長因子；核酸分子和低聚核苷酸，包括DNA和RNA；激素；致育藥；降鈣素、鈣三醇和其它有生物活性的類固醇；抗生藥，包括抗菌劑、抗病毒制劑、抗霉菌制劑和抗寄生蟲制劑；刺激細(xì)胞增殖的制劑；脂類；蛋白質(zhì)和多肽；糖蛋白；碳水化合物；和它們的任何組合。治療制劑的特殊實(shí)例是在本文中其它地方給出的。本發(fā)明的FcRn結(jié)合配體可以被進(jìn)一步用于諸如微粒和脂質(zhì)體之類遞送載體的定向遞送。
“氣溶膠”如同在本文中使用的那樣指的是以細(xì)小顆粒的形式分散在氣體中的液體或固體的懸浮物。如同在本文中使用的那樣，術(shù)語“顆粒”指的是液體(例如，霧滴)和固體(例如，粉末)。用于將本發(fā)明的共軛物遞送到肺臟的藥物氣溶膠優(yōu)選用嘴而不是用鼻子吸入。作為替代，用于將本發(fā)明的共軛物遞送到肺臟的藥物氣溶膠優(yōu)選通過直接遞送引進(jìn)中央氣道，例如經(jīng)由氣管內(nèi)的插管或氣管切開術(shù)。
如同下面更詳細(xì)地描述的那樣，“共軛物”如同在本文中使用的那樣指的是用任何物理化學(xué)方法彼此結(jié)合起來的兩個或多個實(shí)體，其中包括但不限于共價鍵相互作用、疏水基相互作用、氫鍵相互作用或離子鍵相互作用。重要的是注意FcRn結(jié)合配體和治療制劑之間的結(jié)合必須有這樣的天性和位置，以致它不破壞FcRn結(jié)合配體對FcRn的粘合能力。這樣的結(jié)合對于原本普通技術(shù)人員是眾所周知的，其實(shí)例將在下面更詳細(xì)地描述。共軛物可以進(jìn)一步作為融合蛋白形成，也在下面予以更詳細(xì)的討論。
共軛物可能包括在治療制劑和FcRn結(jié)合配體之間的中間體或連接體實(shí)體，以致治療制劑和FcRn結(jié)合配體相互間接地結(jié)合在一起。在一些實(shí)施方案中，連接體經(jīng)受自發(fā)的開裂。在一些實(shí)施方案中，連接體經(jīng)歷諸如酶或化學(xué)制劑之類協(xié)助的開裂。例如，蛋白酶可劈開的肽連接體在技術(shù)上是眾所周知的，而且不受限制地包括胰蛋白酶敏感的序列；纖蛋白溶酶敏感的序列；FLAG肽；牛κ-酪蛋白A的凝乳酶敏感序列(Walsh MK等人，(1996)JBiotechnol 45235-41)；組織蛋白酶B能劈開的連接體(Walker MA等人，(2002)Bioorg Med Chem Lett 12217-9)；嗜熱菌蛋白酶敏感的聚(乙二醇)(PEG)-L-丙氨?；?L-纈胺酸(Ala-Val)(Suzawa T等人，(2000)J Control Release 6927-41)；腸激酶能剪切開的連接體(McKee C等人，(1998)Nat Biotechnol 16647-51)。蛋白酶能劈開的肽連接體可能是為使用而設(shè)計(jì)的并且是與其它主要類別的蛋白酶[例如，基質(zhì)金屬蛋白酶和促胰液肽酶(sheddases)]聯(lián)合使用的。Birkedal-Hansen H等人，(1993)Crit Rev Oral Biol Med4197-250；Hooper NM等人，(1997)Biochem J 321(Pt2)265-79。在其它的實(shí)施方案中，連接體可能是耐自發(fā)剪切、蛋白水解剪切或化學(xué)剪切的。這種類型的連接體的例子是無精氨酸-賴氨酸的連接體(耐胰蛋白酶的)。另外連接體實(shí)例不受限制地包括聚甘氨酸，(Gly)n；聚丙氨酸，(Ala)n；poly(Gly-Ala)，(Glym-翼)n；聚(Gly-Ser)，(例如，Glym-Ser)n，和它們的組合，其中m和n每個都獨(dú)立地是介于1和6之間的整數(shù)。也見Robinson CR等人，(1998)Proc Natl Acad Sci USA 955929-34。
“FcRn結(jié)合配體”如同在本文中使用的那樣指的是能在隨后發(fā)生的經(jīng)FcRn結(jié)合配體的FcRn的主動轉(zhuǎn)運(yùn)中被FcRn結(jié)合的任何實(shí)體。因此，本發(fā)明的FcRn結(jié)合配體包括，例如，整個的IgG、IgG的Fc片段、IgG的包括用于FcRn的完全的粘合區(qū)域的其它片段、和模仿Fc的FcRn粘合部分并且與FcRn結(jié)合的其它分子。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)cRn結(jié)合配體將FcRn特異性的整個抗體排除在外，后者通過抗原特異性的抗原-抗體相互作用專門與FcRn結(jié)合。人們將理解在這個思路中抗原特異性的抗原-抗體相互作用意味著用抗體變異度高的區(qū)域內(nèi)的至少一個互補(bǔ)的決定性區(qū)域(CDR)，例如Fab、F(ab′)、F(ab′)2和Fv片段內(nèi)的CDR，規(guī)定的抗原粘合。同樣地，在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)cRn結(jié)合配體將整個抗體的通過抗原特異性的抗原-抗體相互作用與FcRn結(jié)合的FcRn特異性片段和FcRn特異性片段的相似物排除在外。因此，一些這樣的實(shí)施方案將FcRn特異性的Fv片段、單一的Fv(scFv)鏈段等排除在外。其它這樣的實(shí)施方案將FcRn特異性的Fab片段、F(ab′)片段、F(ab′)2片段等排除在外。
“C/P比”是與對肺臟外圍的沉積相比較成煙霧狀散開的顆粒對肺臟中央氣道的沉積的相對分布的測度。“中央氣道”指的是對于在氣體交換中極少或不起作用的喉在遠(yuǎn)端的引導(dǎo)和過渡氣道。人類的中央氣道包括氣管、主支氣管、肺葉支氣管、肺段支氣管、小支氣管、細(xì)支氣管、末端細(xì)支氣管和呼吸性細(xì)支氣管。因此，中央氣道在肺臟中占?xì)獾婪种ё畛?6-19代，氣管是零代(0)，而肺泡囊是23代。Wiebel ER(1963)Morphometry of theHuman Lung，BerlinSpering-Verlag，pp.1-151。術(shù)語“肺臟外圍”和等價的“深層肺臟”指的是對于中央氣道在遠(yuǎn)端的肺臟氣道。中央氣道與主要負(fù)責(zé)在空氣和血液之間的氣體交換的肺臟外圍相反負(fù)責(zé)空氣的整體運(yùn)動?？傊?，中央氣道僅僅占肺臟的整個呼吸上皮表面積的大約百分之十。見Qiu Y等人，(1997)，InhalationDelivery of Therapeutic Peptides and Proteins，Adjei AL and GuptaPK，eds.，Lung Biology in Health and Disease，Vol.107，MarcelDekkerNew York，pp.89-131。
值得注意的是，上皮細(xì)胞的類型在肺臟的中央?yún)^(qū)域和周邊區(qū)域之間變化。中央氣道是用有纖毛的柱狀上皮細(xì)胞和立方體形上皮細(xì)胞襯里的，然而呼吸區(qū)域是用立方體形上皮細(xì)胞和更靠近末梢的肺泡上皮細(xì)胞襯里的。然而，橫跨肺泡上皮的距離非常小，即，0.1-0.2μm，橫跨圓柱狀和立方體形上皮細(xì)胞的距離要大許多倍，例如，就柱狀上皮而言是30-40μm。
普通技術(shù)人員通常稱P/C比或等價的滲透指數(shù)為制劑對深層肺臟有效給藥的測度。如同術(shù)語建議的那樣，P/C比是與對肺臟中央氣道的沉積相比較成煙霧狀散開的顆粒對肺臟外圍的沉積的相對分布的測度；因此，它是C/P比的倒數(shù)。P/C比直接隨著為了實(shí)現(xiàn)吸入性制劑的全身性遞送(即，優(yōu)先對深層肺臟給藥)迄今已找到的結(jié)果改變。就傳統(tǒng)的應(yīng)用而言已找到的典型的P/C比是在大約1.35到2.2以上的范圍內(nèi)。
不同于這些要求對肺臟外圍給藥達(dá)到最大值并因此要求高的P/C比的比較典型的應(yīng)用，在本發(fā)明中，集中對肺臟中央氣道給藥是符合要求的。因此，在本發(fā)明中，依照對中央氣道給藥優(yōu)于對肺臟外圍給藥這一驚人的發(fā)現(xiàn)，實(shí)現(xiàn)比較低的P/C比，即，高的C/P比是符合要求的。因此，C/P比直接隨著本發(fā)明所找到的結(jié)果(即，優(yōu)先對肺臟中央氣道給藥)改變。因此，優(yōu)選實(shí)施方案包括C/P比至少是0.7-0.9的那些。這些實(shí)施方案明確地包括C/P比至少是0.7、0.8和0.9的那些。更優(yōu)選的實(shí)施方案包括C/P比至少是1.0-1.4的那些。這些實(shí)施方案明確地包括C/P比至少是1.0、1.1、1.2、1.3和1.4的那些。更優(yōu)選的實(shí)施方案包括C/P比至少是1.5-1.9的那些。這些實(shí)施方案明確地包括C/P比至少是1.5、1.6、1.7、1.8和1.9的那些。大多數(shù)的優(yōu)選實(shí)施方案包括C/P比至少是2.0-3.0的那些。這些實(shí)施方案明確地包括C/P比至少是2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9和3.0的那些。不存在C/P比的理論上限。因此，最優(yōu)選的實(shí)施方案包括C/P超過3.0的那些。
C/P比的確定能用任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄍ瓿?，但是通常這樣的確定涉及平面成像灰階閃爍掃描、三維單一光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描(SPECT)或正電子發(fā)射斷層掃描(PET)。Newman SP等人，(1998)Respiratory Drug Delivery 69-15；Fleming JS等人，(2000)JAerosol Med 13187-98。在典型的P/C比確定中，適當(dāng)?shù)馁ゑR射線發(fā)出的放射性核(例如，99mTc、113mIn、131I或81mKr)被加到藥物配方中。在對受試者完成氣溶膠給藥之后，數(shù)據(jù)是用γ照相機(jī)獲得的并且而且分析通過把由此產(chǎn)生的肺臟圖像分成兩個(中央和周邊)或三個(中央、中間和周邊)成像區(qū)域。Newman SP等人，上述的；Agnew JE等人，(1986)Thorax 41524-30。依據(jù)選定的成像方法，中央成像區(qū)域或中央和中間成像區(qū)域一起代表中央氣道。周邊的成像區(qū)域代表肺臟的外圍?？紤]到衰減和衰退，來自周邊成像區(qū)域的計(jì)數(shù)除以來自中央成像區(qū)域的計(jì)數(shù)(或在適當(dāng)?shù)膱龊?，除以來自中央和中間成像區(qū)域的組合計(jì)數(shù))。C/P比的確定遵循剛剛概述的方法，但是該比值是在來自中央成像區(qū)域的計(jì)數(shù)(或在適當(dāng)?shù)膱龊希瑏碜灾醒牒椭虚g成像區(qū)域的組合計(jì)數(shù))除以來自周邊區(qū)域的計(jì)數(shù)時計(jì)算的。
許多因素對顆粒在肺臟內(nèi)的沉積部位有貢獻(xiàn)，包括呼吸技巧。通常，吸入行為越快、越淺、持續(xù)時間越短，對于中央氣道的沉積就越有利。相反，吸入行為越慢、越深、持續(xù)時間越長，對于肺臟外圍的沉積就越有利。因此，例如，正常的(即，潮汐式)呼吸支持中央氣道沉積，反之，深深的超常的吸入行為和屏氣有利于深層肺臟中的沉積。換一種方式，低流量、低壓力的呼吸支持中央氣道沉積，反之高流量、高壓力的呼吸支持深層肺臟沉積。因此，在機(jī)械式呼吸機(jī)上設(shè)定呼吸作用時，受機(jī)械式呼吸機(jī)控制的流量和壓力參數(shù)可以被這樣設(shè)定，以便要么支持在肺臟中央沉積，要么在肺臟周邊沉積。這樣的用機(jī)械控制或幫助呼吸的參數(shù)是根據(jù)技術(shù)上眾所周知的許多臨床因素選定的，其中包括體重、潛在的肺病或其它疾病、吸入氧氣的分?jǐn)?shù)(FiO2)、流體體積狀態(tài)、肺臟順應(yīng)性等，以及例如用血液pH、血液中的氧分壓和血液中的二氧化碳分壓反映的有效的氣體交換。
所以，實(shí)現(xiàn)至少0.7的C/P比得到使用正常的或潮汐式呼吸方式作為優(yōu)選的給藥方法的一部份的支持。這可能是這樣完成的，例如，通過在潮汐式呼吸期間在若干次呼吸的過程中吸入氣溶膠。所以，在機(jī)械式呼吸機(jī)上的呼吸設(shè)定中，至少0.7的C/P比是用作為優(yōu)選的給藥方法的一部份的低流量、低壓力的輔助供氧支持的。
影響顆粒在氣道里面的沉積部位和程度的另一個因素涉及顆粒的物理化學(xué)特性。顆粒的重要物理化學(xué)特性包括它們的氣體力學(xué)直徑、質(zhì)量密度、速度和電荷。一些因素是在本發(fā)明的下一個方面考慮的。
依照本發(fā)明的另一方面，提供用于全身性遞送治療制劑的方法。依照這個方面的方法包括有效量的治療制劑和和FcRn結(jié)合配體的共軛物的氣溶膠對肺臟的給藥，其中氣溶膠中的顆粒有至少3μm的質(zhì)量中值氣動力學(xué)直徑(MMAD)。依照另外一個方面，本發(fā)明提供治療制劑和FcRn結(jié)合配體的共軛物氣溶膠，其中氣溶膠中的顆粒有至少3μm的MMAD。顆粒大小和分布被認(rèn)為是影響氣溶膠沉積的重要參數(shù)。氣溶膠顆粒通常按形狀與大小歸類。氣溶膠的個別顆粒大小可以用顯微鏡描述其特征，然后，可以估算原始的平均粒度值，后者描述整個尺寸分布的中心趨向。用等價的球形尺寸表示形狀不規(guī)則的顆粒的粒度是方便的。氣體力學(xué)直徑(Dae)定義為沉降速度(通常在空氣中)與正在研究的顆粒一樣的單位密度球的直徑。這個尺寸包括顆粒的形狀、密度和物理尺寸。顆粒的群體可以根據(jù)在每個粒度范圍中攜帶的質(zhì)量來定義。這個分布可以在質(zhì)量中值氣動力學(xué)直徑(MMAD)處被平分為兩個相等的部分。圍繞著MMAD的分布可以按照幾何標(biāo)準(zhǔn)偏差(GSD)來表達(dá)。如果假定氣溶膠粒度分布是對數(shù)正態(tài)分布，則可以使用這些參數(shù)。
因?yàn)轭w粒大小不可能是均勻的，所以在各種不同的實(shí)施方案中，Dae至少3μm的顆?？梢詷?gòu)成氣溶膠中的顆粒的至少50％、至少60％、至少70％、優(yōu)選至少75％、更優(yōu)選至少80％、更加優(yōu)選至少85％、更加優(yōu)選至少90％、最優(yōu)選至少95％。
氣溶膠顆粒在氣道里面的沉積機(jī)制包括慣性撞擊、攔截、沉降和擴(kuò)散。慣性撞擊發(fā)生在大的(高遷移率)顆?；蜢F滴按它們的初始方向行進(jìn)而且在空氣運(yùn)動方向繞過障礙物之時不遵從速度流線的時候。這些大顆粒行進(jìn)到障礙物處沉積下來。慣性撞擊遍及氣管支氣管樹到處發(fā)生，但是在最大的氣道中尤其容易發(fā)生，在那里流速和顆粒尺寸都大得多。攔截與鼻中的沉積和小的氣道有關(guān)。顆粒在它們進(jìn)入按流動方向運(yùn)動的氣流離氣道壁小于顆粒直徑的位置的時候?qū)⒈粩r截。沉降在重力的作用下發(fā)生并且影響位于肺泡區(qū)域的較小的氣道中比較大的顆粒。擴(kuò)散負(fù)責(zé)小的、亞微米級的顆粒的沉積。顆粒在氣體分子沖擊的影響下隨機(jī)地移動，直到它們行進(jìn)到氣道壁。
已知專用的氣溶膠發(fā)生器能夠形成“單分散”的氣溶膠，即，有GSD小于1.2μm的顆粒的氣溶膠。Fuchs NA等人，(1966)在Davies CN，Ed.，Aerosol Science，LondonAcademic Press，pp.1-30。振動孔口式單分散氣溶膠發(fā)生器(VOAG)是一種類型的單分散氣溶膠發(fā)生器的例子，而且它時常被用來準(zhǔn)備校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)。Berglund RN等人，(1973)Environ Sci Technol 7147。這種發(fā)生器當(dāng)濃縮物通過孔口直徑尺寸介于5和50μm之間的孔板進(jìn)料的時候能實(shí)現(xiàn)接近1.05的GSD。其它類型的單分散氣溶膠發(fā)生器包括旋盤式和旋轉(zhuǎn)陀螺式氣溶膠發(fā)生器。這些也時常被用來準(zhǔn)備校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)。
粒度(即，MMAD和GSD)能使用任何適當(dāng)?shù)募夹g(shù)進(jìn)行測量。廣泛使用的技術(shù)包括單級的和多級的慣性撞擊、有效撞擊、激光粒度測定、光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡。就綜述而言，見Lalor CB等人，(1997)Inhalation Delivery of Therapeutic Peptideand proteins，Adjei AL and Gupta PK Eds.，New York，MarcelDekker，pp.235-276。
在2μm到10μm范圍中的粒度被普遍地看作對于將治療制劑遞送到氣管支氣管和肺臟區(qū)域是最佳的。Heyder J等人，(1986)J Aerosol Sci 17811-25。業(yè)已表明，最大的肺泡沉積發(fā)生在顆粒有介于1.5μm和2.5μm之間和2.5μm和4μm之間的直徑時候，分別在采用和不采用屏氣技術(shù)的情況下。Byron PR(1986)J.Pharm.Sci.75433-38。隨著粒度逐漸增加到超過大約3μm，沉積在肺泡中逐漸減少而在中央氣道中逐漸增加。超過大約10μm，沉積絕大部分發(fā)生在喉部和上呼吸道。
如同先前提到的那樣，MMAD至少為4.8μm的顆粒是不適于呼吸的，即，它們被認(rèn)為將不進(jìn)入深層肺臟中的肺泡空間。這就解釋了為什么迄今還優(yōu)選用以顆粒的MMAD小于5μm為特征的氣溶膠給藥。反之，在本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案中，大多數(shù)顆粒是不適于呼吸的。
在第三方面中，本發(fā)明提供氣溶膠遞送系統(tǒng)。依照這個方面的氣溶膠遞送系統(tǒng)包括容器、與容器相連接的氣溶膠發(fā)生器和放在容器里面的治療制劑和FcRn結(jié)合配體的共軛物，氣溶膠發(fā)生器是為了產(chǎn)生顆粒的MMAD至少為3μm的共軛物氣溶膠而構(gòu)造和安排的。
在特別優(yōu)選實(shí)施方案中，氣溶膠遞送系統(tǒng)包括為了振動有眾多限定幾何形狀的小孔的孔板而構(gòu)造和安排的振動元素，其中孔板的一個側(cè)面或表面與共軛物的溶液或懸浮液流體連接。例如，見美國專利第5,758,637號、美國專利第5,938,117號、美國專利第6,014,970號、美國專利第6,085,740號和美國專利第6,205,999號，在此通過引證將它們的整個內(nèi)容全部并入。振動元素振動孔板的激活作用使溶液或懸浮液中包含共軛物的液體被抽吸通過眾多小孔，形成霧滴(即，顆粒)尺寸范圍定義明確的低速的氣溶膠。
這個類型的氣溶膠發(fā)生器的例子是從Aerogen Inc.，Sunnyvale，California購買的。
在另一個實(shí)施方案中，氣溶膠遞送系統(tǒng)包括裝共軛物的溶液或懸浮液的增壓容器。增壓容器通常有與計(jì)量閥連接的執(zhí)行機(jī)構(gòu)，以致執(zhí)行機(jī)構(gòu)的激活作用使在容器內(nèi)的溶液或懸浮液中的預(yù)定數(shù)量的共軛物以氣溶膠的形式從容器中分發(fā)出去。這個類型的增壓容器在技術(shù)上被稱為壓縮氣體驅(qū)動的計(jì)量劑量的吸入器(pMDI或簡稱MDI)。MDI通常包括執(zhí)行機(jī)構(gòu)、計(jì)量閥和增壓容器，后者保存微粉化的藥物懸浮液或溶液、液化的壓縮氣體和表面活性劑(例如，油酸、山梨聚糖三油酸酯、卵磷脂)。在歷史上這些MDI通常使用含氯氟烴(CFCs)作為壓縮氣體，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷和二氯四氟甲烷。當(dāng)單獨(dú)的壓縮氣體是比較差的溶劑時候，諸如乙醇之類的助溶劑可以存在。較新的壓縮氣體可以包括1，1，1，2-四氟乙烷和1，1，1，2，3，3，3-八氟丙烷。MDI的激活作用通常引起劑量為50微克-5毫克的活性制劑在20-100μL體積中以高速度(30m/sec)在100-200msec內(nèi)被遞送。
在其它的實(shí)施方案中，氣溶膠遞送系統(tǒng)包括與裝有共軛物溶液或懸浮液的儲罐流體連接的空氣噴射式霧化器或超聲波霧化器。霧化器(空氣噴射式或超聲波)主要是用于無法走動的患者、嬰兒和孩子的急性病治療。用于霧化的空氣噴射式霧化器因?yàn)樾⌒蛪嚎s空氣泵的可用性被認(rèn)為是便攜的，但是它們是比較大的不便的系統(tǒng)。超聲波霧化器因?yàn)樗鼈兺ǔ２恍枰獕嚎s空氣的來源所以有更容易攜帶的優(yōu)勢。霧化器提供非常小的霧滴和高質(zhì)量輸出。通過霧化給藥的劑量比MDI中的劑量大得多而且液體儲罐在尺寸方面受到限制，從而導(dǎo)致短暫的單一持續(xù)時間的治療。
為了產(chǎn)生來自空氣噴射式霧化器的氣溶膠，壓縮空氣被迫通過毛細(xì)管開口端上的小孔，從而形成低壓區(qū)域。液體配方通過管子被抽吸出來，與空氣射流混合，形成霧滴。在霧化器里面的擋板除去較大的霧滴。氣流中的霧滴大小受壓縮空氣壓力的影響。質(zhì)量中徑通常在空氣壓力介于20到30psig的時候在2到5μm范圍內(nèi)變動。各種市售的空氣噴射式霧化器不同樣地運(yùn)行。這將影響成霧狀的氣溶膠的臨床效能，取決于霧滴大小、霧化器的總輸出和患者決定因素。
超聲波霧化器使用在液體室中用在受激勵時機(jī)械振動的陶瓷壓電晶體聚焦的高頻超聲波(即，100仟赫以上)產(chǎn)生氣溶膠。Dannis JH等人，(1992)J Med Eng Tech 1663-68；O′Doherty MJ等人，(1992)Am Rev Respir Dis 146383-88。在一些例證中，葉輪把顆粒吹出霧化器或氣溶膠被患者直接吸入。超聲波霧化器能夠有大于空氣噴射式霧化器的輸出，并因此時常被用于氣溶膠藥物治療。使用超聲波霧化器形成取決于頻率的霧滴是比用空氣噴射式霧化器遞送的那些粗大(即，較高的MMAD)。引進(jìn)液體的能量能導(dǎo)致溫度上升，從而導(dǎo)致蒸發(fā)和隨著時間流逝濃度變化。這種隨著時間流逝濃度變化在噴氣式霧化器中也曾遇到，但是那是通過蒸發(fā)失去水造成的。
在霧化器中的溶液或懸浮液配方之間選擇類似于用于MDI的那種選擇。選中的配方將影響總質(zhì)量輸出和粒度。霧化器配方通常包含含有助溶劑(乙醇、丙三醇、丙二醇)的水和為改善溶解度和穩(wěn)定性而添加的表面活性劑。為了防止來自低滲或高滲溶液的支氣管狹窄，通常還添加滲透劑。見Witeck TJ等人，(1984)Chest86592-94；Desager KN等人，(1990)Agents Actions225-28。
在另外一些實(shí)施方案中，氣溶膠遞送系統(tǒng)包括與裝有呈粉末狀的共軛物的儲罐流體連接的干粉吸入器。干粉吸入器裝置可能為了適應(yīng)國際性組織控制這些新近的產(chǎn)品中的含氯氟烴的一些指示最后取代MDI。值得注意的是，這種裝置在適于呼吸的粒度范圍內(nèi)只能遞送一小部分它的負(fù)荷。粉末吸入器通常將僅僅把大約10到20％的內(nèi)部藥物分散成適于呼吸的顆粒。典型的干粉吸入器裝置有兩個部件把單位劑量的粉末配方分散到吸入氣流中的吸入器具和分配這些劑量的粉末配方儲罐。儲罐通?？赡苡袃煞N不同的類型。散裝儲罐允許在個別劑量遞送之時把精確數(shù)量的粉體分配成多達(dá)大約200個劑量。單位劑量儲罐提供在需要時吸入的個別劑量(例如，以泡罩包裝或明膠膠囊形式提供的)。手持型裝置是為操縱砸開膠囊/泡罩包裝或在為患者吸入分散之后裝載散裝粉體而設(shè)計(jì)的。氣流將使粉體不再聚集成團(tuán)和成煙霧狀散開。在大多數(shù)情況下，患者吸入的氣流使裝置激活，提供使干粉分散和不再聚集成團(tuán)的能量，以及決定將到達(dá)肺臟的藥劑數(shù)量。
干粉發(fā)生器因?yàn)榉垠w的物理和化學(xué)性質(zhì)受變異性支配。這些吸入器是為計(jì)量在200微克到20毫克范圍內(nèi)變動的劑量設(shè)計(jì)的。在這些裝置中藥物粉體的準(zhǔn)備非常重要。這些吸入器中的粉體需要有效地減小尺寸，這對于在MDI中的懸浮液也是需要的。微粉化的顆粒流動并且比粗大的顆粒分散得更均勻。所以，微粉化的藥物粉體可以與惰性載體混合。這種載體通常是α-乳糖一水合物，因?yàn)槿樘怯懈鞣N各樣的粒度范圍而且被很好地描述特征。Byron PR等人，(1990)Pharm Res 7(suppl)S81。載體顆粒具有大于治療制劑的粒度，以阻止賦形劑進(jìn)入呼吸道。兩個顆粒的分離將發(fā)生在患者通過口罩吸入時形成湍流的時候。這種吸入行為引起的湍流將提供一定數(shù)量的能量克服顆粒間的內(nèi)聚力和顆粒表面的粘著力使微粉化的顆粒變成空氣傳播的。在空氣中藥物顆粒的高濃度容易使用干粉產(chǎn)生過程獲得，但是輸出的穩(wěn)定性和成團(tuán)的和帶電的顆粒的存在是普遍的問題。采用非常小的顆粒，因?yàn)殪o電力、范德瓦爾力、毛細(xì)管作用和機(jī)械力增加它們的締合能量，分散變得很困難。
適合與本發(fā)明一起使用的干粉吸入器氣溶膠發(fā)生器的例子是適當(dāng)?shù)氖琴徸訤isons Corp.，Bedford，Massachusetts的Spinhaler粉體吸入器。
FcRn分子現(xiàn)在被很好地表征。如同前面提到的那樣，適合包括人類在內(nèi)的一些哺乳動物物種的FcRn已被分離。FcRn是作為包括FcRnα鏈(等價地，F(xiàn)cRn重鏈)和β2微球蛋白的異源二聚體出現(xiàn)的。人類FcRn、大白鼠FcRn和小鼠FcRn的α鏈的序列可以在通過引證在此被全部并入的文獻(xiàn)Story，CM等人，(1994)JExp Med 1802377-81中找到。如同普通技術(shù)人員將認(rèn)可的那樣，F(xiàn)cRn能通過克隆或通過使用，例如，非特異性抗體、多克隆抗體或單株抗體的親和力純化來分離。然后，這樣分離的FcRn能用來識別和分離FcRn結(jié)合配體，如同下面描述的那樣。
IgG中與FcRn結(jié)合的Fc部分的區(qū)域已基于X-射線晶體學(xué)予以描述(例如，見通過引證被全部并入的Burmeister WP等人，(1994)Nature 372379-83和Martin WL等人，(2001)Mol Cell7867-77)。Fc與FcRn主要的接觸區(qū)在CH2域和CH3域的交界附近。潛在的IgG觸點(diǎn)是CH2中的殘基248、250-257、272、285、288、290-291、307、308-311和314和CH3中的殘基385-387、428和433-436。這些部位截然不同于借助亞綱比較或定位誘變被識別為對于Fc粘合到白細(xì)胞FcγRI和FcγRII上重要的那些。早期研究已涉及鼠科的IgG殘基253、272、285、310、311和433-436作為與FcRn的潛在接觸。Sields RL等人，(2001)J BiolChem 2766591-6604。在人類IgG1中，早期研究已涉及到殘基253-256、288、307、311、312、380、382和433-436作為與FcRn的潛在接觸。Sields RL等人，(2001)J Biol Chem 2766591-6604。上述的Fc-FcRn接觸全部在單一的Ig重鏈之內(nèi)。人們先前已注意到兩個FcRn能粘合單一的Fc同源二聚體。晶體學(xué)數(shù)據(jù)意味著，在這樣的復(fù)合體中，每個FcRn分子都有與Fc同源二聚體的一個多肽的主要接觸。Martin WL等人，(1999)Biochemistry399698-708。
人類的FcRn與人類IgG的全部亞綱結(jié)合，但是與小鼠和大白鼠IgG的大多數(shù)亞綱的結(jié)合則不那么好。見West AP等人，(2000)Biochemistry 399698-9708；Ober RJ等人，(2001)IntImmunol 131551-59。因此，就特定的物種而言，將會有可以衍生出FcRn結(jié)合配體的優(yōu)選的IgG物種。在每個物種之內(nèi)結(jié)合親和力的次序是IgG1＝IgG2＞IgG3＞IgG4(人類)；IgG1＞IgG2b＞IgG2a＞IgG3(小鼠)；和IgG2a＞IgG1＞IgG2b＝IgG2c(大白鼠)。Burmeister WP等人，(1994)Nature372379-83。所以，人們相信，屬于任何亞綱的人類IgG(及其包含F(xiàn)cRn接觸的片段)作為人類的FcRn結(jié)合配體是有用的。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，F(xiàn)cRn結(jié)合配體而不是整個的IgG可以用來越過肺的上皮屏障轉(zhuǎn)運(yùn)治療劑。在這樣的實(shí)施方案中，選擇與親和力高于完整的IgG的FcRn結(jié)合的FcRn結(jié)合配體是優(yōu)選的。這樣的FcRn結(jié)合配體在利用FcRn實(shí)現(xiàn)越過上皮的屏障主動轉(zhuǎn)運(yùn)綴合治療劑方面和在減少內(nèi)源性IgG為轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制競爭方面有效用。這些親和力較高的FcRn結(jié)合配體的FcRn結(jié)合活性可以采用普通技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)的化驗(yàn)法測量，包括(a)使用自然表達(dá)FcRn的或已為表達(dá)FcRn或FcRn的α鏈做過基因改造的極化細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)化驗(yàn)；(b)使用可溶的FcRn或其片段或固定FcRn的FcRn配體蛋白質(zhì)粘合化驗(yàn)；(c)利用自然表達(dá)FcRn的或已為表達(dá)FcRn或FcRn的α鏈做過基因改造的極化的或非極化的細(xì)胞的粘合化驗(yàn)。
FcRn結(jié)合配體可以借助重組體遺傳工程技術(shù)生產(chǎn)。給人類FcRn結(jié)合配體編碼的核苷酸序列在本發(fā)明的范圍內(nèi)。FcRn結(jié)合配體包括整個IgG、IgG的Fc片段和其它包括用于FcRn的完整粘合區(qū)域的IgG片段。主要接觸部位包括CH2域氨基酸殘基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311和314和CH3域氨基酸殘基385-387、428和433-436。所以，給跨越這些氨基酸殘基的IgG Fc片段區(qū)域編碼的核苷酸序列在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案之中。
IgG的Fc區(qū)域能依照諸如定位誘變之類已被公認(rèn)的程序進(jìn)行修飾，以便產(chǎn)生將受FcRn束縛的經(jīng)修飾的IgG或經(jīng)修飾的Fc片段或其某些部分。這樣的修飾包括遠(yuǎn)離FcRn接觸部位的修飾以及在接觸部位內(nèi)保護(hù)或甚至增強(qiáng)對FcRn的粘合的修飾。例如，人類IgG1 Fc(Fcγl)的下列單一氨基酸殘基能在就FcRn而言Fc的粘合親和力沒有重大損失的情況下替換P238A、S239A、K246A、K248A、D249A、M252A、T256A、E258A、T260A、D265A、S267A、H268A、E269A、D270A、E272A、L274A、N276A、Y278A、D280A、V282A、E283A、H285A、N286A、T289A、K290A、R292A、E293A、E294A、Q295A、Y296F、N297A、S298A、Y300F、R301A、V303A、V305A、T307A、L309A、Q311A、D312A、N315A、K317A、E318A、K320A、K322A、S324A、K326A、A327Q、P329A、A330Q、P331A、E333A、K334A、T335A、S337A、K338A、K340A、Q342A、R344A、E345A、Q347A、R355A、E356A、M358A、T359A、K360A、K360A、N361A、Q362A、Y373A、S375A、D376A、A378Q、E380A、E382A、S383A、N384A、Q386A、E388A、N389A、N390A、Y391F、K392A、L398A、S400A、D401A、D413A、K414A、R416A、Q418A、Q419A、N421A、V422A、S424A、E430A、N434A、T437A、Q438A、K439A、S440A、S444A和K447A，其中例如P238A表示在位置238被丙氨酸替換的野生型脯胺酸。Shield RL等人，(2001)J Biol Chem2766591-6604。上面列出的群叢變型中有許多但并非全部是丙氨酸群叢變型，即，野生型殘基被丙氨酸取代。然而，除了丙氨酸之外，其它的氨基酸可以在前面指定的位置替換野生型氨基酸。這些突變可能被逐一地引進(jìn)Fc，從而產(chǎn)生一百種以上在結(jié)構(gòu)上截然不同于土著人的Fcγl的FcRn結(jié)合配體。此外，這些個別突變中的兩個、三個或更多個的組合可能被一起引進(jìn)，從而產(chǎn)生另外一些FcRn結(jié)合配體。
某些上述的突變可能在FcRn結(jié)合配體上賦予新的官能度。例如，優(yōu)選實(shí)施方案將N297A合并，從而除去高度保守的N-糖基化作用部位。這種突變的效果是減少免疫原性，借此提高FcRn結(jié)合配體的循環(huán)半衰期，和提供本質(zhì)上不兼顧它對FcRn的親和力就沒有能力粘合到FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIIA上的FcRn結(jié)合配體。Routledge EG等人，(1995)Transplantation60847-53；Friend PJ等人，(1999)Transplantation 681632-37；Shield RL等人，(2001)J Biol Chem 2766591-6604。作為起因于上述的突變的新官能度的進(jìn)一步的例子，對FcRn的親和力在一些例證中可以增加到超過野生型的。這種增加的親和力可以反映增加的“ON”率、減少的“OFF”率、或增加的“ON”率和減少的“OFF”率兩者。確信可能賦予FcRn增加的親和力的突變包括在特定的T256A、T307A、E380A和N434A中。Shield RL等人，(2001)J Biol Chem 2766591-6604。確信可能賦予FcRn增加的親和力的群叢變型的組合包括特定的E380A/N434A、T307A/E380A/N434A和K288A/N434A中。見Shield RL等人，(2001)J Biol Chem 2766591-6604。
除了前面揭示的FcRn結(jié)合配體之外，在一個實(shí)施方案中，F(xiàn)cRn結(jié)合配體是包括序列PKNSSMISNTP(SEQ ID NO11)而且非必選地進(jìn)一步包括選自HQSLGTQ(SEQ ID NO12)、HQNLSDGK(SEQ ID NO13)、HQNISDGK(SEQ ID NO14)或VISSHLGQ(SEQ ID NO15)的序列的多肽。授權(quán)給Presta等人的美國專利第5,739,277號。序列PKNSSMISNTP(SEQ ID NO11)將與對應(yīng)于Fc的CH2域中的氨基酸247-257(SEQ ID NO2)的序列PKDTLMISRTP(SEQ ID NO16)相比較。后一個序列包括為了相信是與FcRn的主要接觸部位先前注意到的九個氨基酸。
本發(fā)明不傾向于受選擇任何特定的FcRn結(jié)合配體的限制。因此，除了剛剛描述的FcRn結(jié)合配體以外，其它的結(jié)合配體也能被識別和分離。對于FcRn特異的并且一旦被結(jié)合就能夠被FcRn轉(zhuǎn)運(yùn)的抗體或其某些部分能使用已建好的技術(shù)予以識別和分離。同樣，隨機(jī)產(chǎn)生的形形色色的分子文庫能被篩選，而且被FcRn粘合和轉(zhuǎn)運(yùn)的分子能使用傳統(tǒng)的技術(shù)予以分離。在區(qū)分氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的取代時，F(xiàn)cRn結(jié)合配體對多肽(即，聚酰胺)主鏈的合并修飾也是本發(fā)明關(guān)注的。例如，Bartlett等人報(bào)告了胃蛋白酶和青霉天冬酰蛋白酶的包含膦酸酯、亞膦酸酯和膦酸酰胺的假肽抑制劑。見Bartlett等人，(1990)J Org Chem 556268-74。也見美國專利第5,563,121號。那些抑制劑是包括代替在正常情況下將被那些酶劈開的易切斷的酰胺鍵的包含磷的鍵的假肽。
用來識別和表征FcRn結(jié)合配體的體外篩選法可能以普通技術(shù)人員熟悉的技術(shù)為基礎(chǔ)。這些可能包括酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)，其中被分離的FcRn被直接或間接地粘合到作為“俘獲抗原”的酶作用物上，隨后被暴露在包含試驗(yàn)FcRn結(jié)合配體的試樣之中；然后，試驗(yàn)FcRn結(jié)合配體對到固定FcRn的粘合被直接地或間接地化驗(yàn)。在相關(guān)的方法中，競爭ELISA或直接的放射免疫測定法(RIA)可能用來確定相對于標(biāo)記FcRn結(jié)合配體對FcRn的親和力的非標(biāo)記試驗(yàn)FcRn結(jié)合配體對FcRn的親和力。這些技術(shù)是容易升級的，所以適合候選FcRn結(jié)合配體的大規(guī)模的高生產(chǎn)能力的篩選。
其它適合識別和表征FcRn結(jié)合配體的體外的方法可能以細(xì)胞為基礎(chǔ)。這些方法測量試驗(yàn)FcRn結(jié)合配體的細(xì)胞粘合、細(xì)胞攝取或細(xì)胞胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)。這樣的方法可以通過用抗體(例如，F(xiàn)LAG肽)識別的例如同位素(131I、35S、32P、13C、等等)、生色團(tuán)、熒光團(tuán)、生物素或表位給FcRn結(jié)合配體加標(biāo)記變得容易。在這些化驗(yàn)中使用的細(xì)胞可以自然地或作為將給FcRn編碼的在操作上與適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列連接的孤立的核酸分子引進(jìn)細(xì)胞的結(jié)果表達(dá)FcRn。給FcRn編碼的在操作上與適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列連接的核酸通常是用來轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的質(zhì)粒。用于穩(wěn)定的瞬時轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染的方法是技術(shù)上眾所周知的，而且它們包括物理的、化學(xué)的和病毒的技術(shù)，例如磷酸鈣沉積、電穿孔、biolistic注射和其它。
另一些適合識別和表征FcRn結(jié)合配體的體外的方法可以包括流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)(FACS)、電遷移率變動分析(EMSA)、表面胞質(zhì)基因共振(生物分子相互作用分析；BIAcore)、基于嵌片的表面相互作用分析和其它。
如果FcRn結(jié)合配體是整體上由基因編碼的氨基酸組成的肽，或其這樣組成的一部分，那么肽或相關(guān)部分也可以使用傳統(tǒng)的重組體遺傳工程技術(shù)合成。就重組體生產(chǎn)而言，給FcRn結(jié)合配體編碼的多核苷酸序列被插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，即包含對于插入的編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯必需的元素的載體，或在RNA病毒載體的情況下，對于復(fù)制和翻譯必需的元素。然后，表達(dá)載體被轉(zhuǎn)染到或以其它方式引進(jìn)將表達(dá)肽的適當(dāng)?shù)陌屑?xì)胞。然后，依據(jù)所用的表達(dá)系統(tǒng)，被表達(dá)的肽被技術(shù)上已確立的程序分離。用于重組蛋白質(zhì)和肽的生產(chǎn)方法是技術(shù)上眾所周知的(例如，見Maniatis等人，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，N.Y.；Ausubel等人，1989，Current Protocals inMolecular Biology，Greene Publishing Associates and WileyInterscience，New York)。
為了提高生產(chǎn)效率，多核苷酸可以是為了給被酶的卵裂部位分開的FcRn結(jié)合配體的多個單元編碼而設(shè)計(jì)的。由此產(chǎn)生的多肽能為了重新獲得肽單元而被劈開(例如，借助用適當(dāng)?shù)拿柑幚?。這能增加被單一啟動子驅(qū)動的肽的得率。當(dāng)用在適當(dāng)?shù)牟《颈磉_(dá)系統(tǒng)中的時候，每個用mRNA編碼的肽的翻譯在轉(zhuǎn)錄物中得到內(nèi)部指導(dǎo)，例如，得到內(nèi)部核糖體進(jìn)入部位的指導(dǎo)。因此，多順反子的構(gòu)造指導(dǎo)單一的大的多順反子mRNA的轉(zhuǎn)錄，后者依次指導(dǎo)多重個別肽的翻譯。這種方法取消多蛋白的生產(chǎn)和酶加工，而且可以大大增加受單一啟動子驅(qū)動的肽的得率。
各式各樣的宿主表達(dá)載體系統(tǒng)可以被用來表達(dá)在此描述的FcRn結(jié)合配體。這些包括但不限于微生物，例如用包含適當(dāng)?shù)木幋a序列的重組噬菌體DNA或質(zhì)粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌；用包含適當(dāng)?shù)木幋a序列的重組酵母或真菌表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母或絲狀真菌；用包含適當(dāng)?shù)木幋a序列的重組病毒表達(dá)載體(例如，桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；用重組病毒表達(dá)載體(例如，花椰菜花葉病毒(CaMV)或煙草花葉病毒(TMV))感染的或用包含適當(dāng)?shù)木幋a序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(例如，Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或動物細(xì)胞系統(tǒng)。各種不同的宿主表達(dá)系統(tǒng)是普通技術(shù)人員眾所周知的，而且宿主細(xì)胞和表達(dá)載體的元素可從商業(yè)來源獲得。
表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)元素在它們的強(qiáng)度和特異性方面改變。依據(jù)所利用的宿主/載體系統(tǒng)，包括組成型和誘導(dǎo)型啟動子在內(nèi)的許多適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯元素中的任何一個都可以被用在表達(dá)載體中。例如，當(dāng)在細(xì)菌系統(tǒng)中克隆的時候，可以使用誘導(dǎo)型啟動子，例如，噬菌體λ、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac混合型啟動子)等等的pL；當(dāng)在昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)中克隆的時候，可以使用諸如桿狀病毒多角體啟動子之類的啟動子；當(dāng)在植物細(xì)胞系統(tǒng)中克隆的時候，可以使用起源于植物細(xì)胞基因組的啟動子(例如，熱激啟動子；用于RUBISCO的小亞基的啟動子；用于葉綠素a/b結(jié)合蛋白的啟動子)或起源于植物病毒的啟動子(例如，CaMV的35S RNA啟動子；TMV的外被蛋白啟動子)；當(dāng)在哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)中克隆的時候，可以使用起源于哺乳動物細(xì)胞基因組的啟動子(例如，金屬硫蛋白啟動子)或起源于哺乳動物病毒的啟動子(例如，腺病毒晚期啟動子；牛痘病毒7.5K啟動子；巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子)；當(dāng)產(chǎn)生包含表達(dá)產(chǎn)品的多重副本的細(xì)胞系的時候，基于SV40、BPV和EBV的載體可以與可適當(dāng)選擇的標(biāo)記一起使用。
在使用植物表達(dá)載體的情況下，本發(fā)明給多肽編碼的序列表達(dá)可以受許多啟動子之中任何一個驅(qū)動。例如，可以使用諸如CaMV的35S RNA和19S RNA啟動子之類的病毒啟動子(KozielMG等人(1984)J Mol Appl Genet 2549-62)，或TMV的外被蛋白啟動子；作為替代，可以使用植物啟動子，例如RUBISCO的小亞基(CoruzziG等人(1984)EMBO J 31671-79；Broglie R等人(1984)Science 224838-43)，或熱激啟動子，例如，大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B(Gurley WB等人(1986)Mol Cell Biol 6559-65)。這些構(gòu)造能使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接的DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電穿孔等以及植物細(xì)胞。就這類技術(shù)的綜述而言，例如，見Weissbach & Weissbach，1988，Methods for PlantMolecular Biology，Acadermic Press，NY，Section VIII，pp.421-463；和Grierson & Corey，1988，Plant Molecular Biology，2d Ed，Blackie，London，Ch.7-9。
在可以用來表達(dá)FcRn結(jié)合配體的昆蟲表達(dá)系統(tǒng)中，苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)被用作表達(dá)外源基因的載體。病毒在草地夜蛾細(xì)胞中生長。編碼序列可以被克隆到病毒的非必需區(qū)(例如，多角體基因)之中并且被置于AcNPV啟動子(例如，多角體啟動子)的控制之下。編碼序列的成功插入將導(dǎo)致多角體基因的失活和非包含體型重組病毒的生產(chǎn)(即，缺乏用多角體基因編碼的蛋白質(zhì)外殼的病毒)。這些重組體病毒然后用來感染插入其中的基因已被表達(dá)的草地夜蛾細(xì)胞(例如，見美國專利第4,745,051號)。這種表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)一步的例子可以在CurrentProtocols in Molecular Biology，Vol.2，Ausubel等人編輯，GreenePublishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.中找到。
在哺乳動物宿主細(xì)胞中，許多基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)可以被利用。在腺病毒被用作表達(dá)載體的情形中，編碼序列可以被接到腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯控制復(fù)合體上，例如，晚期啟動子和三聯(lián)前導(dǎo)序列。然后，這種嵌合基因可以借助體外或體內(nèi)重組插進(jìn)腺病毒基因組。插進(jìn)病毒基因組的非必需區(qū)(例如，區(qū)域E1或E3)將導(dǎo)致能存活而且能夠表達(dá)受感染宿主中的肽的重組體病毒(例如，見Logan J等人(1984)Proc Natl Acad Sci USA 813655-59)。作為替代，牛痘7.5K啟動子可以被使用，(例如，見Mackett M等人(1982)Proc Natl Acad Sci USA 797415-19；Mackett M等人(1984)J Virol49857-64；Panicali S等人(1982)Proc Natl Acad Sci USA 794927-31)。
另外，對于在哺乳動物中使用，宿主細(xì)胞是許多真核表達(dá)質(zhì)粒。這些質(zhì)粒通常包括可操作地與感興趣的插入基因或核酸鏈接的啟動子或啟動子/增強(qiáng)子元件、置于插入基因下游的多腺苷酸化信號、選擇標(biāo)記和復(fù)制起點(diǎn)。這些質(zhì)粒中有一些是為了在指定位置接受核酸插入片段作為PCR產(chǎn)品或限制酶消化產(chǎn)品而設(shè)計(jì)的。真核表達(dá)質(zhì)粒的例子包括pRc/CMV、pcDNA3.1、pcDNA4、pcDNA6。pGene/V5(Invitrogen)和pED.dC(Genetics Institute)。
FcRn結(jié)合配體在與抗原綴合的一些實(shí)施方案中?？乖缤诒疚闹惺褂玫哪菢臃殖伤念?1)以病原體為特征的抗原；(2)以自身免疫疾病為特征的抗原；(3)以過敏原為特征的抗原；和(4)以癌癥或腫瘤為特征的抗原?？乖篌w上包括來自細(xì)胞表面、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、粒線體等等的多糖、糖脂、糖蛋白、肽、蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂類。
以對病原體為特征的抗原包括起源于病毒、細(xì)菌、寄生物或真菌的抗原。重要的病原體的例子包括霍亂弧菌、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌、輪狀病毒、難辨梭菌、志賀氏菌屬物種、傷寒桿菌、副流感病毒、流感病毒、肺炎鏈球菌、布氏疏螺旋體、愛滋病毒、鏈球菌突變體、惡性瘧原蟲、金黃色葡萄球菌、狂犬病病毒和EB病毒。
病毒大體上包括但不限于下列各科中的那些小RNA病毒科、杯狀病毒科、囊膜病毒科、黃病毒科、冠狀病毒科、棒狀病毒科、線狀病毒科、副粘病毒科、正粘病毒科、布尼亞病毒科、沙粒病毒科、呼腸病毒科、逆轉(zhuǎn)錄病毒科、嗜肝DNA病毒科、細(xì)小病毒科、乳多空病毒科、腺病毒科、皰疹病毒科和痘病毒科。
細(xì)菌大體上包括但不限于假單胞菌亞種，包括銅綠假單胞菌和洋蔥假單胞菌；埃希氏菌亞種，包括大腸桿菌，E.faecalis；克雷伯氏菌亞種；沙雷氏菌亞種；不動桿菌亞種；鏈球菌亞種，包括肺炎鏈球菌、釀膿鏈球菌、牛鏈球菌、無乳鏈球菌；葡萄球菌亞種，包括金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌；嗜血菌亞種；奈瑟氏球菌亞種，包括腦膜炎奈瑟氏球菌；類桿菌亞種；檸檬酸桿菌屬亞種；布蘭漢氏球菌亞種；沙門氏菌亞種；志賀氏菌亞種；巴斯德氏菌亞種，包括巴斯德氏菌；梭狀芽胞桿菌亞種；丹毒桿菌亞種；利斯特菌亞種；多殺巴斯德氏菌；鏈桿菌亞種；螺旋菌亞種；梭菌螺旋體亞種；梅毒螺旋體；疏螺旋體亞種；放線菌；枝原體亞種；衣原體亞種；立克次氏體亞種；螺旋體；軍團(tuán)菌亞種；分枝桿菌亞種，包括結(jié)核分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿、瘰疬分枝桿菌；尿枝原體亞種；鏈霉菌亞種；和毛滴蟲亞種。
寄生物包括但不限于惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、三日瘧原蟲；鼠弓形體；Leishmania mexicana，熱帶利什曼原蟲、主要利什曼原蟲、L.aethiopica，杜氏利什曼原蟲；克氏錐蟲、布氏錐蟲、曼氏裂體吸蟲、埃及裂體吸蟲、日本體吸蟲；旋毛線蟲；班氏吳策線蟲；Brugia malayi；溶組織內(nèi)阿米巴；蟯蟲；Taenia solium、無鉤絳蟲；陰道毛滴蟲、人毛滴蟲、口腔毛滴蟲；腸蘭伯氏鞭毛蟲；Cryptosporidium parvum；卡氏肺囊蟲；牛巴貝蟲、B.divergens、B.microti；貝氏等孢子球蟲、人等孢子球蟲；脆雙核阿米巴；旋盤尾絲蟲；人蛔蟲；美洲鉤蟲；十二指腸鉤蟲；糞類圓線蟲；Capillaria philippinensis；Angiostrongyluscantonensis；短膜殼絳蟲；闊節(jié)裂頭絳蟲；細(xì)粒棘球絳蟲、E.multilocularis；肺吸蟲、P.caliensis；Chlonorchis sinensis；貓后睪吸蟲、麝貓后睪吸蟲；肝片吸蟲、疥螨、人虱；Phthirlus pubis；和人皮蠅。
真菌大體上包括但不限于新型隱球菌；皮炎芽生菌；Aiellomyces dermatitidis；莢膜組織胞漿菌；Coccidioidesimmitis；念珠菌屬種，包括白念珠菌、C.tropicalis、C.parapsilosis、高里氏念珠菌和克柔氏念珠菌；曲霉屬種，包括煙曲霉、黃曲霉和黑曲霉；根霉菌屬種；根毛霉種；小克銀漢霉屬種；Apophysomyces species，包括A.saksenaea、A.Mucor和A.absidia；申克氏孢子絲菌；巴西芽生菌；Pseudallescheria boydii；Torulopsis glabrata和皮真菌種。
以自身免疫疾病為特征的抗原通常將起源于哺乳動物組織的細(xì)胞表面、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、粒線體等。例子包括以葡萄膜炎、糖尿病、多發(fā)性硬化、全身性紅斑狼瘡、慢性甲狀腺炎、重癥肌無力、原發(fā)性粘液水腫、甲狀腺毒癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、惡性貧血、阿狄孫氏病、硬皮病、自身免疫萎縮胃炎、早熟的絕經(jīng)期(少數(shù)情形)、男性不育癥(少數(shù)情形)、少年糖尿病、古德帕斯徹氏綜合癥、尋常天皰瘡、類天皰瘡、交感性眼炎、晶狀體葡萄膜炎、自身免疫性溶血貧血、先天性血小板減少性紫斑、先天性白血球減少癥、原發(fā)膽汁性肝硬變(少數(shù)情形)、潰瘍性結(jié)腸炎、斯耶格倫氏綜合癥、韋格納肉芽腫病、多/皮肌炎和盤狀紅斑狼瘡為特征的抗原(例如，S抗原)。人們將理解，以自身免疫疾病為特征的抗原指的是一種抗原，受試者自己的免疫系統(tǒng)制造反對該抗原的抗體或特殊的T細(xì)胞，而且那些抗體或T細(xì)胞是以自身免疫疾病為特征的。自身免疫疾病的抗原特性的特異性識別在許多情況下是不知道的而且就本發(fā)明的目的而言的確不需要知道。
抗原是通常為蛋白質(zhì)或糖蛋白的過敏原，雖然過敏原也可以是包括在與蛋白質(zhì)載體共價結(jié)合之后誘發(fā)過敏反應(yīng)性的低分子量過敏原的半抗原(Remington’s Pharmaceutical science)。過敏原包括起源于花粉、粉塵、真菌、孢子、毛屑、昆蟲和食物的抗原。特定的例子包括諸如毒葉藤、太平洋漆樹和美國毒漆樹之類野葛的兒茶酚(十五烷基兒茶酚或十七烷基兒茶酚)和豚草和相關(guān)植物的倍半類萜內(nèi)酯。
以腫瘤抗原為特征的抗原通常將起源于腫瘤組織細(xì)胞的細(xì)胞表面、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞器等等。例子包括以腫瘤蛋白質(zhì)為特征的抗原，包括用突變的致癌基因編碼的蛋白質(zhì)；與腫瘤相關(guān)聯(lián)的病毒蛋白質(zhì)；和腫瘤粘蛋白和糖脂。腫瘤包括但不限于來自下列癌癥部位和癌癥類型的那些唇、鼻咽、咽和口腔、食道、胃、小腸、大腸、結(jié)腸、直腸、肝、膽囊、膽汁樹、胰、喉、肺臟和支氣管、黑色素瘤、乳房、子宮頸、子宮、卵巢、膀胱、腎臟、腦和神經(jīng)系統(tǒng)其它部分、甲狀腺、前列腺、睪丸、骨、肌肉、霍杰金氏病、非霍杰金氏淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤和白血病。與腫瘤相關(guān)聯(lián)的病毒蛋白質(zhì)將是來自前面注意到的病毒綱的那些。以腫瘤為特征的抗原可能是通常不用腫瘤前身細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)，或可能是雖然在腫瘤前身細(xì)胞中被正常地表達(dá)但是有腫瘤的突變特征的蛋白質(zhì)。腫瘤的抗原特征可能是有修飾活性或亞細(xì)胞分布的正常蛋白質(zhì)的突變型群叢變型。引起腫瘤抗原的基因突變除了前面指定的那些之外可能在基因的編碼區(qū)域、5′或3′非編碼區(qū)域或基因內(nèi)區(qū)中，而且可能是點(diǎn)突變、移碼、反向、缺失、添加、重復(fù)、染色體重排等等的結(jié)果。普通技術(shù)人員熟知各式各樣引起腫瘤抗原的正?；蚪Y(jié)構(gòu)和表達(dá)的變化。
腫瘤抗原的具體例子包括蛋白質(zhì)，例如B細(xì)胞淋巴瘤的Ig-個體基因型；黑色素瘤的突變型依賴細(xì)胞周期蛋白的激酶4；黑色素瘤的Pmel-17(gp100)；黑色素瘤的MART-1(Melan-α)(PCT公開WO94/21126)；黑色素瘤的p15蛋白質(zhì)；黑色素瘤的酪胺酸酶(PCT公開WO94/14459)；黑色素瘤、甲狀腺髓質(zhì)的小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸和/或支氣管鱗狀上皮細(xì)胞癌的MAGE 1、2和3(PCT/US92/04354)；MAGE-Xp(美國專利第5,587,289號)；膀胱、黑色素瘤、乳房和鱗狀上皮細(xì)胞癌科的BAGE(美國專利第5,571,711號和PCT公開WO95/00159)；GAGE(美國專利第5,610,013號和PCT公開WO95/03422)；RAGE家族(美國專利第5,939,526號)；PRAME(從前的DAGE；PCT公開WO96/10577)；MUM-1/LB-33B；(美國專利第5,589,334號)；NAG(美國專利第5,821,122號)；FB5(endosialin)(美國專利第6,217,868號)；PSMA(前列腺特異性膜抗原；美國專利第5,935,818號)；黑色素瘤的gp75；黑色素瘤的胎性癌抗原；諸如乳房、胰和卵巢癌的粘蛋白之類的碳水化合物/脂類；黑色素瘤的GM2和GD2神經(jīng)節(jié)甙脂；諸如癌的突變型p53之類的致癌基因；結(jié)腸癌的突變型ras；乳房癌的HER2/neu原致癌基因；和諸如子宮頸和食道的鱗狀上皮細(xì)胞癌的人類乳突病毒蛋白質(zhì)之類的病毒產(chǎn)品。前面的目錄僅僅傾向于作為代表，而不應(yīng)理解為限制。人們還應(yīng)該注視蛋白質(zhì)腫瘤抗原可以被HLA分子作為起源于整個蛋白質(zhì)的特殊的肽呈現(xiàn)出來。產(chǎn)生抗原性肽的蛋白質(zhì)新陳代謝過程在技術(shù)上是眾所周知的(例如，見在此通過引證被全部并入的授權(quán)給Boon等人的美國專利第5,342,774號)。因此，現(xiàn)在的方法包括抗原型肽和較大的多肽中這樣的肽或引起抗原型肽的整個蛋白質(zhì)的遞送?？乖碗幕虻鞍踪|(zhì)的遞送可以引起體液或細(xì)胞的免疫性。
通常，受試者能用下面詳細(xì)說明的一種或多種方法接受有效量的抗原，包括腫瘤抗原，和/或源自那里的肽。起始劑量之后可以遵從技術(shù)上免疫程序標(biāo)準(zhǔn)采用加強(qiáng)劑量。包括腫瘤抗原在內(nèi)的抗原的遞送可以這樣刺激溶解細(xì)胞的T淋巴細(xì)胞的增殖。
在蛋白質(zhì)和肽治療劑的情況下，與FcRn結(jié)合配體連接的共價鍵傾向于包括在單一的多肽鏈中用肽鍵連接。已建立的方法(Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY 1989，在此通過引證將其內(nèi)容全部并入)將用來設(shè)計(jì)給由蛋白質(zhì)或肽治療劑和FcRn結(jié)合配體組成的融合蛋白質(zhì)編碼的DNA。這種DNA將用已建立的方法放進(jìn)表達(dá)載體并且引進(jìn)細(xì)菌的，真核狀態(tài)的或其它適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞。融合蛋白質(zhì)將用已建立的方法從細(xì)胞或培養(yǎng)基純化。純化方案可以方便地使用分離的或重組的蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G來純化來自宿主細(xì)胞產(chǎn)品的包含F(xiàn)cRn結(jié)合配體的融合蛋白質(zhì)。這樣產(chǎn)生的共軛物包括FcRn結(jié)合配體對蛋白質(zhì)、肽或蛋白質(zhì)衍生物(例如，在此列出的那些，包括但不限于抗原、過敏原、病原體)或有潛在治療利益的其它的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)衍生物(例如，生長因子、集落刺激因子、生長抑止因子、信號分子、激素、類固醇、神經(jīng)遞質(zhì)或當(dāng)越過上皮屏障遞送的時候?qū)杏玫男螒B(tài)發(fā)生素)的融合。
作為例子但不是限制，在融合蛋白質(zhì)中用來合成共軛物的蛋白質(zhì)可以包括EPO(美國專利第4,703,008；5,457,089；5,614,184；5,688,679；5,773,569；5,856,298；5,888,774；5,986,047；6,048,971；6,153,407號)、IFN-α(美國專利第4,678,751；4,801,685；4,820,638；4,921,699；4,973,479；4,975,276；5,098,703；5,310,729；5,869,293；6,300,474號)、IFN-β(美國專利第4,820,638；5,460,811號)、FSH(美國專利第4,923,805；5,338,835；5,639,639；5,639,640；5,767,251；5,856,137號)、源自血小板的生長因素(PDGF；美國專利第4,766,073號)、源自血小板的內(nèi)皮細(xì)胞生長因素(PD-ECGF；美國專利第5,227,302號)、人類垂體腺生長激素(hGH；美國專利第3,853,833號)，TGF-β(美國專利第5,168,051號)、TGF-α(美國專利第5,633,147號)、角化細(xì)胞生長因素(KGF；美國專利第5,731,170號)、類胰島素生長因子I(IGF-1；美國專利第4,963,665號)、表皮生長因子(EGF；美國專利第5,096,825號號)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF；美國專利第5,200,327號)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF；美國專利第5,171,675號)、集落刺激因子-1(CSF-1；美國專利第4,847,201號)、青灰因子、降血鈣素、AP-1蛋白質(zhì)(美國專利第5,238,839號)、因子VIIa，因子VIII、因子IX、TNF-α、TNF-α受體、LFA-3、CNTF、CTLA-4、leptin(PCT/95/10479，WO96/05309)和源自腦的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF；美國專利第5,229,500號)。前面引證的全部參考文獻(xiàn)都在此通過引證被全部并入。
作為例子但不作為限制，在融合蛋白質(zhì)中用來合成共軛物的肽可以包括紅細(xì)胞生成素?cái)M態(tài)的肽(EPO受體興奮劑肽；PCT/US01/14310；WO01/83525；Wrighton NC等人(1996)Science273458-64；PCT/US99/05842，WO99/47151)、EPO受體拮抗劑肽(PCT/US99/05842，WO99/47151；Mc Connell SJ等人(1998)BiolChem3791279-86)和T20(PCT/USOO/35724；WO01/37896)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)是這樣構(gòu)造和安排的，以致共軛物的FcRn結(jié)合配體部分出現(xiàn)在治療制劑部分的下游，即，F(xiàn)cRn結(jié)合配體部分相對于治療制劑部分是C-末端的。這種安排以速記方式被表達(dá)為X-Fc，其中“X”代表治療制劑部分，而Fc代表FcRn結(jié)合配體部分。在這種速記符號中，“Fc”可以是但不限于IgG的Fc片段。符號“X-Fc”將被理解為包括其中呈現(xiàn)把X成份參加粘合與FcRn結(jié)合配體成份結(jié)合起來的連接體的融合蛋白質(zhì)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)有這樣的構(gòu)造，其中共軛物由融合到在此列出的多肽治療制劑之一上的人類IgG1的Fc片段組成(在鉸合部的N-末端以氨基酸D-K-T-H為起點(diǎn)(見SEQ ID NO2，圖1)，包括鉸合部和CH2域而且在CH3域中通過S-P-G-K序列繼續(xù))。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，給功能性EPO編碼的核苷酸序列在適當(dāng)?shù)姆g讀框5′中被融合到給人類IgG1的恒定不變的重(CH)鏈的鉸合部、CH2域和CH3域編碼的核苷酸序列上。這個優(yōu)選實(shí)施方案在實(shí)施例3中予以更詳細(xì)的描述。
公開的歐洲專利申請EP 0464533A揭示EPO-Fc融合蛋白質(zhì)。
公開的PCT申請PCT/US00/19336(WO01/03737)揭示人類EPO-Fc融合蛋白質(zhì)。
公開的PCT申請PCT/US98/13930(WO99/02709)揭示EPO-Fc和Fc-EPO的融合蛋白質(zhì)。
公開的PCT申請PCT/EP00/10843(WO01/36489)揭示若干Fc-EPO的融合蛋白質(zhì)。
公開的PCT申請PCT/US00/19336(WO01/03737)揭示人類IFN-α-Fc融合蛋白質(zhì)。
授權(quán)給Chang等人的美國專利第5,723,125號揭示人類的IFN-α-Fc融合蛋白質(zhì)，其中IFN-α域和Fc域通過特定的Gly-Ser連接體(Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser；SEQ ID NO17)連接起來。
公開的PCT申請PCT/USOO/13827(WO00/69913)揭示一種Fc-IFN-α融合蛋白質(zhì)。
公開的PCT申請PCT/US00/19336(WO01/03737)揭示人類IFN-β-Fc融合蛋白質(zhì)。
公開的PCT申請PCT/US99/24200(WO00/23472)揭示人類IFN-β-Fc融合蛋白質(zhì)。
授權(quán)給Chang等人的美國專利第5,908,626號揭示人類的IFN-β-Fc融合蛋白質(zhì)，其中IFN-β域和Fc域通過特定的Gly-Ser連接體(Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser；SEQ ID NO17)連接起來。
授權(quán)給Lo等人的美國專利第5,726,044號和公開的PCT申請PCT/US00/19816(WO01/07081)揭示Fc-PSMA融合構(gòu)造。
FcRn結(jié)合配體可以被綴合到多種用于定向全身性遞送的治療制劑上。本發(fā)明包括生物活性物質(zhì)的定向全身性遞送。
如同在本文中使用的那樣，術(shù)語“生物活性物質(zhì)”指的是真核細(xì)胞和原核細(xì)胞、病毒、載體、蛋白質(zhì)、肽、核酸、多糖和碳水化合物、脂類、糖蛋白以及它們的組合，和當(dāng)對動物給藥的時候施加生物效應(yīng)的自然發(fā)生的、合成的和半合成的有機(jī)和無機(jī)藥物。為了易于參考，該術(shù)語也用來包括可檢測的化合物，例如，包括鋇的不透射線化合物，以及磁性化合物。生物活性物質(zhì)在水中可以是可溶的或不溶的。生物活性物質(zhì)的例子包括抗血管生成因子、抗體、生長因子、激素、酶和諸如類固醇、抗癌藥和抗生素之類的藥物。
在診斷實(shí)施方案中，F(xiàn)cRn結(jié)合配體也可以被綴合到藥學(xué)上可接受的發(fā)射γ射線的部分上，包括但不限于銦和锝、磁性顆粒、諸如鋇之類不透射線物質(zhì)和螢光化合物。
作為例子但不作為，下述類別的藥物可以為了越過肺的上皮屏障全身性遞送被綴合到FcRn結(jié)合配體上抗腫瘤化合物硝基脲，例如，氯化亞硝脲、環(huán)己亞硝脲、甲環(huán)亞硝脲、鏈脲霉素；甲芐肼，例如，甲基芐肼、卡巴咪唑；類固醇激素，例如，糖皮質(zhì)激素、雌激素、孕激素、雄激素、tetrahydrodesoxycaricosterone、細(xì)胞因子和生長因素；天冬酰胺酶。
免疫活性化合物免疫抑制劑，例如，乙胺嘧啶、三甲氧蝶呤、青霉胺、環(huán)胞菌素、硫唑嘌呤；免疫刺激劑，例如，左旋咪唑、二乙基二硫氨基甲酸酯、腦啡肽、內(nèi)啡肽。
抗微生物化合物抗生素，例如，青霉素、頭孢菌素、碳青霉烯和單環(huán)內(nèi)酰胺，β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，氨基糖苷、大環(huán)內(nèi)酯、四環(huán)素、壯觀霉素；抗瘧藥；殺阿米巴藥；抗原生動物制劑；抗霉制劑，例如，兩性霉素B；抗病毒制劑，例如，無環(huán)鳥苷、碘苷、病毒唑、三氟脲苷、阿糖腺苷、9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤。胃腸藥物組胺H2受體拮抗劑、質(zhì)子泵抑制劑、promotility制劑。
血液學(xué)化合物免疫球蛋白；凝血蛋白；例如，抗血友病因子、因子IX復(fù)合體；抗凝劑，例如，雙香豆素、肝素Na；費(fèi)布羅利辛(fibrolysin)抑制劑、凝血酸。
心血管藥物周邊抗腎上腺素功能的藥物、中心起作用的抗高血壓藥物，例如，甲基多巴、鹽酸甲基多巴；抗高血壓的直接血管擴(kuò)張劑，例如，氯甲苯噻嗪、鹽酸肼苯噠嗪；影響腎素-血管緊縮素系統(tǒng)的藥物；周邊血管舒張劑、酚妥胺；抗心絞痛藥物；強(qiáng)心甙；inodilators；例如，氨吡酮、甲氰吡酮、依諾西酮、甲硫咪唑酮、imazodan、sulmazole；抗節(jié)律紊亂藥；鈣進(jìn)入阻滯劑；影響血脂的藥物。
神經(jīng)肌肉阻斷劑去極化，例如，阿曲庫銨苯磺酸鹽、溴化己芴胺、碘甲筒箭毒、氯化琥珀膽、氯化筒箭毒堿、維庫溴銨；中心起作用的肌肉弛緩藥，例如，氯苯氨丁酸。
神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)遞質(zhì)劑乙酰氯、阿糖腺苷、三磷酸腺苷鈉、氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)，例如，刺激性氨基酸、GABA、甘氨酸；生物胺神經(jīng)遞質(zhì)，例如，多巴胺、腎上腺素、組織胺、去甲腎上腺素、對羥苯-β-羥乙胺、5-羥色胺、酪胺；神經(jīng)肽、一氧化氮、K+通道毒素。
抗帕金森藥物鹽酸金剛胺、甲磺酸芐托品、例如，卡比多巴。
利尿劑雙氯磺酰胺、甲醋唑胺、芐氟噻嗪、多噻嗪。
抗偏頭痛藥舒馬曲坦。
激素垂體激素，例如，絨膜促性腺激素、二十四肽促皮質(zhì)素、絕經(jīng)促性素、生長激素、iorticotropin、促甲狀腺激素釋放激素、促甲狀腺激素、抗利尿激素、賴氨酸加壓素；腎上腺素激素，例如，倍氯美松雙丙酸酯、倍他米松、地塞米松、去炎松；胰腺的激素，例如，胰高血糖素、胰島素；甲狀旁腺激素，例如，dihydrochysterol；甲狀腺激素，例如，降鈣素羥乙二磷酸二鈉、甲狀腺素鈉、碘甲腺氨酸鈉、liotrix，甲狀腺球蛋白，teriparatideacetate；抗甲狀腺的藥物；雌激素；孕激素和拮抗藥、荷爾蒙避孕藥、睪丸激素；胃腸激素膽囊收縮素、腸多糖、galanin，腸抑胃肽、表皮生長因子-尿抑胃素、腸抑胃肽、胃泌素釋放肽，胃泌素，五肽胃泌素、四肽胃泌素、促胃動素、肽YY、促胰液素、血管活性腸肽、sincalide；勒帕茄堿。
酶透明質(zhì)酸酶、鏈激酶、組織纖溶酶原活化劑、尿激酶、PGE-腺嘌呤核苷脫氨酶。
靜脈注射的麻醉藥氟哌利多、甲芐咪唑、檸檬酸芬太尼/氟哌利多、環(huán)己烯巴比妥、氯胺酮HCl、甲己炔巴比妥鈉、硫戊巴比妥鈉、戊硫巴比妥鈉。
抗癲癇藥酰胺咪嗪、氯硝西泮、雙丙戊酸鈉、乙琥胺、甲基妥因、乙甲雙酮、苯妥英、去氧苯巴比妥。
肽和蛋白質(zhì)FcRn結(jié)合配體可以綴合到肽或多肽上，例如，錨蛋白、視紫紅質(zhì)抑制蛋白、細(xì)菌膜蛋白、網(wǎng)格蛋白、[間隙連接]連接蛋白、肌營養(yǎng)不良蛋白、內(nèi)皮縮血管肽受體、血影蛋白、選擇蛋白、細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子、胰島素、紅細(xì)胞生成素(EPO)、腫瘤壞死因子(TNF)、CNTF、神經(jīng)肽、神經(jīng)肽Y、神經(jīng)降壓肽、TGF-α、TGF-β、干擾素(IFN)、激素、生長抑制劑，例如，染料木黃酮、類固醇等；糖蛋白，例如，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、血小板糖蛋白、GPIb-IX復(fù)合體，GPIIb-IIIa復(fù)合體、因子VIIa、因子VIII、因子IX、玻連蛋白、凝血調(diào)節(jié)蛋白、CD4、CD55、CD58、CD59、CD44、CD152(CTLA-4)、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原(LFA)、胞間粘著分子(ICAM)、血管細(xì)胞粘著分子(VCAM)、Thy-1、antiporters、CA-15-3抗原、纖連蛋白、層粘連蛋白、髓鞘相關(guān)糖蛋白、GAP、GAP-43和上述物質(zhì)的粘合受體和反受體的結(jié)合部分。在本發(fā)明的這個實(shí)施方案中，多肽治療劑可以被共價地綴合到FcRn結(jié)合配體上，或FcRn結(jié)合配體和治療劑可以使用標(biāo)準(zhǔn)的基因重組技術(shù)被表示成融合蛋白質(zhì)。
細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體依照本發(fā)明可以經(jīng)由FcRn結(jié)合配體遞送的或綴合到FcRn結(jié)合配體上的細(xì)胞因子及其受體的例子包括但不限于白細(xì)胞介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-1受體、IL-2受體、IL-3受體、IL-4受體、IL-5受體、IL-6受體、IL-7受體、IL-8受體、IL-9受體、IL-10受體、IL-11受體、IL-12受體、IL-13受體、IL-14受體、IL-15受體、IL-16受體、IL-17受體、IL-18受體、淋巴因子的抑制因子(LIF)、M-CSF、PDGF、干細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-βs)、TNF、TNFR、淋巴毒素、Fas、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、GM-CSF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ。
生長因子和蛋白質(zhì)激素依照本發(fā)明可以經(jīng)由FcRn結(jié)合配體遞送的或綴合到FcRn結(jié)合配體上的生長因子及其受體和蛋白質(zhì)激素及其受體的例子包括但不限于EPO、血管生成素、肝細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、角化細(xì)胞生長因子、神經(jīng)生長因子、腫瘤生長因子α、血小板生成素(TPO)、甲狀腺刺激因子、甲狀腺釋放的激素、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白、表皮生長因子、VEGF、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、LDL、生長調(diào)節(jié)素、胰島素生長因子、胰島素樣生長因子I和II。
趨化因子依照本發(fā)明可以經(jīng)由FcRn結(jié)合配體遞送的或綴合到FcRn結(jié)合配體上的趨化因子及其受體的例子包括但不限于ENA-78、ELC、GRO-α、GRO-β、GRO-γ、HRG、LIF、IP-10、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MIP-1α、M1P-1β、MIG、MDC、NT-3、NT-4、SCF、LIF、勒帕茄堿、RANTES、lymphotactin、eotaxin-1、eotaxin-2、TARC、TECK、WAP-1、WAP-2、GCP-1、GCP-2、α-趨化因子受體CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7、β-趨化因子的受體CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7。
化療制劑FcRn結(jié)合配體可以被綴合到對包括白血病、淋巴瘤、癌、肉瘤、骨髓瘤等等在內(nèi)的各種不同類型的人類及其它癌癥有效的諸如阿霉素、絲裂霉素、順二氯二氨鉑、柔紅霉素、博萊霉素、放線菌素D、新制癌素、長春堿、長春新堿、太平洋紫杉素之類的化療劑或抗腫瘤藥上。
抗病毒藥FcRn結(jié)合配體可以被綴合到諸如逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和核苷類似物(例如，ddI、ddC、3TC、ddA、AZT)；蛋白酶抑制劑(例如、Invirase、ABT-538)；在RNA加工中的抑制劑(例如，三氮唑核苷)；和細(xì)胞融合抑制劑(例如，T-20)之類的抗病毒藥上，(Kilby JM等人，(1998)Nat Med.41302-7)。
核酸FcRn結(jié)合配體可以被綴合到諸如抗過敏低聚核苷酸和基因置換核酸之類的核苷酸分子上。在涉及核酸共軛物的實(shí)施方案中，人們相信優(yōu)選的是把可劈開的連接體包括在核酸和FcRn結(jié)合配體之間以致核酸能成為細(xì)胞內(nèi)可得的。例如，抗過敏的低聚核苷酸包括但不限于anti-PKC-α、anti-ICAM-1、anti-H-ras、anti-Raf、anti-TNF-α、anti-VLA-4、anti-clusterin(全來自IsisPharmaceuticals，Inc.)和anti-Bcl-2(GENASENSETM；Genta，Inc.)。
已知可以經(jīng)由FcRn結(jié)合配體遞送的治療劑的具體的例子包括但不限于(a)卡托普利、福森普利、帕伐他丁、Avapro、Plavix、頭孢齊爾、頭孢羥氨芐/羥氨芐頭孢菌素、氨曲南Azactam、Videx、Zerit、頭孢吡肟、足葉乙苷、卡鉑、順鉑、太平洋紫杉素、喃氟啶尿嘧啶、丁螺環(huán)酮、Serzone、StadolNS、Estrace、二甲雙胍(Bristol-Myers Squibb)；(b)頭孢克羅、氯拉卡比、地紅霉素、氟西汀、達(dá)而豐、培高利特、Zyprexa、Humalog、尼扎替丁、Gemzar、Evista(EliLilly)；(c)依那普利/恩那普利、洛伐他丁、塞伐他丁、賴諾普利/Prinizide、非洛地平、Cozaar/Hyzaar、法莫替丁、Prilosec、普立馬辛、諾氟沙星、RecombivaxHB、娃力瓦克、噻嗎洛爾/XE、Trusopt、芬甾酮、阿侖特羅、Sinemet、Crixivan、Propecia、Vioxx、Singulair、Maxalt、異阿凡曼菌素(Merck & Co)；(d)氟康唑、舒巴克坦鈉-氨芐西林、Sulperazon、阿齊紅霉素、Trovan、硝苯地平XL、多沙唑嗪、氨氯地平、Dofetilide、炎痛喜康、舍曲林、Zeldox、GlucotrolXL、西替立嗪、Eletriptan、Viagra、Droloxifene、Aricept、Lipitor(Pfizer)；(e)頭孢多肟吡呋酯、Rescriptor、Vistide、基因重組人生長激素、格列本脲/Glyn./Glyb.、替地肝素、Total Medrol、阿普唑侖/甲基三唑安定、麥角溴煙酯、三唑侖/甲基三唑氯安定、Freedox、Dostinex、Edronax、Mirapex、表阿霉素、阿霉素、Camptosar、Remisar、甲羥孕酮、Caverject、Detrusitol、Estring、Healon、Xalatan、Rogaine(Pharmacia & Upjohn)；(f)吉非洛齊、Accrupil、大他丁、他克林、加巴噴丁、醋炔諾酮、Dilzem、Fempatch、Estrostep、Rezulin、Lipitor、Omnicef、FemHRT、Suramin、克林沙星(Warner Lambert)。
可以借助本發(fā)明的FcRn結(jié)合配體遞送的治療制劑的進(jìn)一步的例子可以在通過引證被全部并入的Goodman和Gilman的“ThePharmaceutical Basis of Therapeutics”(9thed.McGraw-Hill 1996)中找到。
在給藥的時候、本發(fā)明的共軛物是按藥學(xué)上可接受的制劑給藥的。這樣的制劑通?？梢园帉W(xué)可接受濃度的鹽、緩沖劑、防腐劑、兼容的載體、諸如輔藥和細(xì)胞因子之類補(bǔ)充免疫增強(qiáng)劑和非必選的其它治療制劑。因此，包括共軛物和制劑的“雞尾酒”受到關(guān)注。治療制劑本身被綴合到FcRn結(jié)合配體上，以增強(qiáng)治療制劑越過肺的上皮屏障的遞送。
本發(fā)明的共軛物可以以純化的形式或以藥學(xué)可接受的鹽的形式給藥。在藥中使用的時候，鹽應(yīng)該是藥學(xué)上可接受的，而非藥學(xué)上可接受的鹽可以方便地被用來制備藥學(xué)上可接受的鹽而且不被排除在本發(fā)明的范圍之外。這樣的藥學(xué)上可接受的鹽包括但不限于從下列的酸制備的那些氫氯酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、馬來酸、醋酸、水楊酸、對甲苯磺酸、酒石酸、檸檬酸、甲磺酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。另外，藥學(xué)上可接受的鹽可以作為堿金屬或堿土金屬的鹽來制備，例如，羧酸族的鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽。
適當(dāng)?shù)木彌_劑包括醋酸和醋酸鹽(1-2％w/v)；檸檬酸和檸檬酸鹽(1-3％w/v)；硼酸和硼酸鹽(0.5-2.5％w/v)；碳酸氫鈉(0.5-1.0％w/v)；以及磷酸和磷酸鹽(0.8-2％w/v)。適當(dāng)?shù)姆栏瘎┌崰枩?0.003-0.03％w/v)；三氯叔丁醇(0.3-0.9％w/v)；對羥基苯甲酸酯(0.01-0.25％w/v)和硫柳汞(0.004-0.02％w/v)。
在本文中使用的并且在下面將予以更完全的描述的術(shù)語“載體”意味著一種或多種適合對人類或其它哺乳動物給藥的固體或液體的填料、稀釋劑或膠囊物質(zhì)。“載體”可以是與活性成份合并以利于給藥的天然的或合成的有機(jī)的或無機(jī)的成份。
藥學(xué)組合物的成份能夠以這樣的方式與本發(fā)明共軛物彼此混合，以致沒有將會實(shí)質(zhì)上損害預(yù)期的藥學(xué)效能的相互作用。在某些實(shí)施方案中，氣溶膠配方的成份包括已溶解的活性成份，和非必選的適合溶液配方的抗氧化劑、混合溶劑和壓縮氣體；微粉化的和懸浮的活性成份，和非必選的適合懸浮液配方的分散劑和壓縮氣體。
術(shù)語“輔藥”傾向于包括被并入本發(fā)明的共軛物或與本發(fā)明的共軛物同時給藥的而且并非特異性地加強(qiáng)受試者的免疫反應(yīng)的任何物質(zhì)。輔藥包括鋁的化合物，例如，凝膠、氫氧化鋁和磷酸鋁，和Freund的完全的或不完全的輔藥。(其中共軛物被并入已穩(wěn)定的水/石蠟油乳液中的水相)。石蠟油可以用不同類型的油代替，例如，角鯊烯或花生油。有輔藥性質(zhì)的其它材料包括BCG(稀釋的牛分枝桿菌)、磷酸鈣、左旋咪唑、異丙肌苷、聚陰離子(例如，聚A:U)、leutinan、百日咳菌外毒素、霍亂菌外毒素、類脂A、皂素和肽，例如，胞壁酰二肽。稀土金屬(例如，鑭和鈰)的鹽也可以作為輔藥使用。輔藥的數(shù)量取決于受試者和所用的共軛物，而且能由普通技術(shù)人員毫不遲疑地決定無需過分的實(shí)驗(yàn)。
其它補(bǔ)充的免疫增強(qiáng)劑(例如，細(xì)胞因子)可以連同本發(fā)明的共軛物一起遞送。在一個實(shí)施方案中，細(xì)胞因子與本發(fā)明的共軛物分開給藥，以便補(bǔ)充治療。在另一個實(shí)施方案中，細(xì)胞因子是綴合到FcRn結(jié)合配體上給藥的。被注視的細(xì)胞因子是將增強(qiáng)由于依照本發(fā)明的FcRn結(jié)合配體共軛物的給藥產(chǎn)生的有益效果的那些。特別優(yōu)選的細(xì)胞因子是IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-1、IL-2和TNF-α。其它有用的細(xì)胞因子和相關(guān)的分子被認(rèn)為是IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-18、白血病抑制因子、制癌蛋白-M、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、生長激素、催乳激素、CD40配體、CD27配體、CD30配體和TNF-β。其它依照本發(fā)明以有可能有用的方式調(diào)整T細(xì)胞活性的已知的細(xì)胞因子是集落刺激因子和生長因子，包括粒細(xì)胞和/或粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞的集落刺激因子(CSF-1，G-CSF和GM-CSF)和源自血小板的、表皮性的和像胰島素一樣的轉(zhuǎn)化因子和成纖維細(xì)胞生長因子。特定的細(xì)胞因子的選擇將取決于所需要的免疫系統(tǒng)的特殊調(diào)整。細(xì)胞因子關(guān)于特定的細(xì)胞類型的活性是普通技術(shù)人員已知的。
上述的用于本發(fā)明的細(xì)胞因子的精確數(shù)量將取決于多種因素，包括選定的共軛物、選定的劑量數(shù)量和劑量時間安排、給藥的模式和受試者的特征。選定的精確數(shù)量不需要過度的實(shí)驗(yàn)就能確定，尤其因?yàn)榈紫迶?shù)量將是將會增強(qiáng)所需要的免疫反應(yīng)的任何數(shù)量。因此，一般相信納克到毫克數(shù)量的細(xì)胞因子是有用的，取決于遞送模式，但是納克到微克的數(shù)量有可能最有用，因?yàn)榧?xì)胞因子的生理水平是相當(dāng)?shù)偷摹?br> 本發(fā)明的制劑是按有效數(shù)量給藥的?！坝行?shù)量”是共軛物在需要時將單獨(dú)或連同進(jìn)一步的劑量一起刺激治療反應(yīng)的數(shù)量。在本文中使用的“治療有效數(shù)量”是共軛物在需要時將單獨(dú)或連同進(jìn)一步的劑量一起刺激治療反應(yīng)的數(shù)量。在各種不同的實(shí)施方案中，這可以包括受試者的疾病、失調(diào)或癥狀的征兆或癥狀的預(yù)防、減輕或穩(wěn)定。
FcRn結(jié)合配體共軛物在依照本發(fā)明制成的所有藥學(xué)制劑中的優(yōu)選數(shù)量應(yīng)該是它的治療有效數(shù)量，這也是它醫(yī)學(xué)上可接受的數(shù)量。在本發(fā)明的藥學(xué)組合物中FcRn結(jié)合配體共軛物的實(shí)際劑量水平可能是變化的，以便獲得能有效地實(shí)現(xiàn)對特定的患者、FcRn結(jié)合配體共軛物的藥學(xué)組合物和給藥模式預(yù)期的治療反應(yīng)而且對患者沒有毒性的FcRn結(jié)合配體共軛物的數(shù)量。
本發(fā)明的共軛物的選定的劑量水平和給藥頻率將取決于多種因素，包括包含F(xiàn)cRn結(jié)合配體共軛物的治療劑的給藥方法、給藥時間、排泄和新陳代謝的速率、治療的持續(xù)時間、與FcRn結(jié)合配體共軛物結(jié)合使用的其它藥物、化合物和/或材料、正在接受治療的患者的年齡、性別、體重、癥狀、一般健康狀況和以前的病史以及醫(yī)學(xué)的技術(shù)上眾所周知的相似的因素。例如，劑量控制有可能因懷孕女人、保姆和孩子相對于健康成人有所改變。選定的精確數(shù)量不需要過度的實(shí)驗(yàn)就能確定，尤其因?yàn)榈紫迶?shù)量將是將影響預(yù)期的治療反應(yīng)的任何數(shù)量。因此，一般相信納克到毫克數(shù)量是有用的，取決于特定的治療制劑和受試者的癥狀，但是納克到微克數(shù)量有可能是最有用的，因?yàn)橹委熤苿┑纳砗退幚硭蕉枷喈?dāng)?shù)汀?br> 一般地說，相信適合本發(fā)明的共軛物的中央氣道肺部給藥的劑量將會落在10ng/kg到500μg/kg的范圍內(nèi)。例如，0.1-10μg/kg的劑量被認(rèn)為對IFN-α-Fc是有用的，而劑量1-100μg/kg對EPO-Fc是有用的。在一些例證中，超過25毫克的劑量可能是最好按分開的劑量制造的。
本領(lǐng)域技術(shù)人員的醫(yī)師能毫不遲疑地決定和開出必需的治療有效量的藥學(xué)組合物的藥方。例如，醫(yī)師可能從將比實(shí)現(xiàn)預(yù)期的治療效果所需要的水平低的FcRn結(jié)合配體共軛物劑量用在本發(fā)明的藥學(xué)組合物中開始，然后逐漸增加劑量直到實(shí)現(xiàn)預(yù)期的效果為止。
組合物可以方便地以單位劑量形式提供，而且可以用藥房的技術(shù)上眾所周知的任何方法制備。所有的方法都包括使共軛物與組成一種或多種附屬組份的載體結(jié)合的步驟。一般地說，組合物是通過使共軛物與液體載體、磨碎的固體載體或兩者均勻地緊密結(jié)合制備的，然后，如果必要，使產(chǎn)品成形。
遞送系統(tǒng)可以包括定時釋放、延遲釋放或持續(xù)釋放遞送系統(tǒng)。這樣的系統(tǒng)能避免本發(fā)明的共軛物的重復(fù)給藥，從而進(jìn)一步為受試者和醫(yī)師提供方便。許多類型的釋放遞送系統(tǒng)對于普通的技術(shù)人員是可得的和已知的。它們包括基于聚合物的系統(tǒng)，例如，聚乳酸和聚羥基乙酸、聚酐和聚己酸內(nèi)酯、臘涂料等等。
就適合吸入的給藥而言，本發(fā)明的共軛物能以氣溶膠的形式方便地遞送。如同前面注意到的那樣，氣溶膠能從與適當(dāng)?shù)膲嚎s氣體(例如，含氯氟烴、氫化氯氟烴、氫化氟碳化合物和包括二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、1，1，1，2-四氟乙烷、1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷的碳?xì)浠衔锘蚱渌m當(dāng)?shù)膲嚎s氣體)一起使用的增壓包裝或吸入器中產(chǎn)生。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，氣溶膠是通過使包含共軛物的溶液或懸浮液與壓電晶體之類和適當(dāng)?shù)哪茉催B接的振動元件接觸產(chǎn)生的。優(yōu)選的是氣溶膠包含并且實(shí)質(zhì)上以它們自然的未變性的形式遞送共軛物。在增壓的氣溶膠的情況下，劑量單位可以通過提供閥門計(jì)量遞送數(shù)量來確定。例如，在吸入器或吹入器中使用的明膠膠囊和藥筒可以被配制成包含化合物和諸如乳糖或淀粉之類適當(dāng)?shù)姆垠w成份的粉狀混合物。
參照下面的非限制性的實(shí)施例可以進(jìn)一步理解本發(fā)明。
實(shí)施例材料SATA，N-琥珀酰亞胺基S-乙酰基硫代乙酸酯；硫代-LC-SPDP，硫代琥珀酰亞胺基6-[3′-(2-吡啶基二硫)-丙酰胺基]己酸酯；和硫代-SMCC，硫代琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯都是從Pierce(Rockford，IL)購買的。BALB/c小鼠是從Charles River Laboratories(Wilmingto，MA)購買的。
酶和細(xì)胞所有的限制酶和修飾酶都是從New EnglandBiolabs(Beverly，MA)或InVitrogen(GIBCO，Gaithersburg，MD)購買的，而且是依照制造商的流程使用的。Vent聚合酶是從NewEngland Biolabs(Beverly，MA)獲得的，而Expand聚合酶來自RocheMolecular Biochemicals(Indianapolis，IN)，而且兩者都是在它們的制造商提供的緩沖液中與鎂一起使用的。蝦堿性磷酸酶(SAP)是從Roche Molecular Biochemicals(Indianapolis，IN)購買的。所有的低聚核苷酸都是由Integrated DNA Technologies，Inc.(Coralville，IA)合成和純化的。DH5α感受態(tài)細(xì)胞是從InVitrogen(GIBCO，Gaithersburg，MD)購買的，而且是依照制造商的流程使用的。
表達(dá)載體哺乳動物表達(dá)載體pED.dC是從GeneticsInstitute(Cambridge，MA)獲得的。這種起源于Kaufman RJ等人(1991)在Nucleic Acid Res 194485-90中描述的pED4的載體包含被普遍用于適合有效轉(zhuǎn)錄的表達(dá)載體中的腺病毒主要晚期啟動子和提高RNA穩(wěn)定性和輸出的IgG基因內(nèi)區(qū)。該載體還包含腺病毒mRNA前導(dǎo)序列、EMC病毒5′UTR(核糖體進(jìn)入序列)、SV40polyA信號和腺病毒穩(wěn)定性元素，以便提高RNA水平并因此導(dǎo)致靶蛋白更大的表達(dá)。該載體還包含適合在細(xì)菌中生長的復(fù)制的colE1起始點(diǎn)以及適合細(xì)菌中的氨比西林選擇的β-內(nèi)酰胺酶的基因。最后，該載體給雙順反子(dicistronic)信息編碼。第一個順反子將是靶蛋白，而第二個順反子是小鼠的二氫葉酸還原酶(dhfr)基因。dhfr基因考慮到雙順反子信息在dhfr-不足的細(xì)胞系中的選擇和放大。Schimke RT(1984)Cell 37705-13；Urlaub G等人(1986)Somat Cell Mol Genet 12555-566。
DNA模板載體A2E/X是由H.Ploegh(Massachusetts Instituteof Technology，Cambridge，MA)友情提供的，wt EPO-Fc是親切地由Wayne Lencer(Harvard Medical School，Boston，MA)提供的。成年的腎cDNA是從Clontech(Palo Alto，CA)購買的。pGEM-TEasy載體是從Promega(Madison，WI)購買的。
低聚核苷酸引物下列的低聚核苷酸(從左到右展示5′到3′)被用于EPO-Fc表達(dá)載體的組成。每個引物中為給相應(yīng)的cDNA分子或模板退火而設(shè)計(jì)的部分都有下劃線。
PKFaaaactgcagaccaccatggtaccgtgcacg(SEQ ID NO18)KXRcgtctagagccggcgcgggtctgagtcgg(SEQ ID NO19)FCGFaagaattcgccggcgccgctgcggtcgacaaaactc(SEQ ID NO20)FCGRMttcaattgtcatttacccggagacaggg(SEQ ID NO21)EPO-Faatctagagccccaccacgcctcatctgtgac(SEQ ID NO22)EPO-Rttgaattctctgtcccctgtcctgcaggcc(SEQ ID NO23)EPS-Fgtacctgcaggcggagatgggggtgca(SEQ ID NO24)EPS-Rcctggtcatctgtcccctgtcc(SEQ ID NO25)
PCR擴(kuò)增聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是在Idaho TechnologyRapidCycler或MJ Reseach PTC-200 Peltier Thermal Cycler中完成的。
DNA分離和純化PCR產(chǎn)品和所有的限制酶消化都曾經(jīng)歷電泳，而對應(yīng)于正確尺寸的DNA帶是從瓊脂糖凝膠切斷的；這樣切斷的DNA是使用Qiagen DNA純化裝備(Valencia，CA)遵照制造商的流程純化的。來自Life Technologies(Rockville，MD)的1KbDNA梯或1Kb Plus DNA梯被用于確定DNA片段的大小。洗提后DNA的濃度是借助在瓊脂糖凝膠上顯象或測量OD260估計(jì)的。
連接反應(yīng)和轉(zhuǎn)化作用連接反應(yīng)是使用T4DNA連接酶依照已建立的流程(New England Biolabs，Beverly MA)(Sambrook等人(1989)Molecular CloningA Laboratory Mannual，Second Edition，Cold Spring Harbor，New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress)或使用Rapid DNA連接裝備(Roche，Indianapolis，IN)依照制造商的流程完成的。連接反應(yīng)產(chǎn)品被用于依照已建立的流程轉(zhuǎn)化大腸桿菌毒株DH5。Sambrook等人(1989)Molecular CloningALaboratory Mannual，Second Edition，Cold Spring Harbor，NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press。
DNA排序雙鏈質(zhì)粒DNA的序列是用在Dana FarberMolecular Biology Core Facilities(Boston，MA)或Veritas，Inc.分子的生物學(xué)[噬菌體]髓部設(shè)備或真理，公司(Rockville，MD)完成的雙脫氧測序確定的。序列是使用SeqMan(DNAStar，Madison，WI)編譯的，而附加的DNA分析是使用程序(DNAStar，Madison，WI)的LaserGene Suite或Vector NTI(Informax，Gaithersburg，MD)完成的。
表達(dá)表達(dá)結(jié)構(gòu)被轉(zhuǎn)染到Chinese Hamster Ovary(CHO)dhfr-不足的(dhfr-)細(xì)胞系之中。穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系被產(chǎn)生。為了提高EPO-Fc表達(dá)水平，EPO-Fc基因是通過增加生長培養(yǎng)基中的氨甲蝶呤濃度放大的。
實(shí)施例1人類免疫球蛋白G的制備為了制備在與本發(fā)明的化合物(例如，抗原或治療制劑)接合時使用的人類的IgG或人類的IgG片段，下列的方法可以被采用。純化的非特異性的人類IgG可以從廠商(例如，SigmaChemical Co.，Pierce Chemical，HyClone Laboratories，ICNBiomedicals和Organon Teknika-Cappel)處購買。
免疫球蛋白G也可以借助血清的硫酸銨沉積反應(yīng)分離。蛋白質(zhì)沉積物是借助離子交換層析或凝膠過濾層析進(jìn)一步分級分離的，以便分離出實(shí)質(zhì)上純化的非特異性IgG。所謂的非特異性IgG指的是沒有單一抗原特異性在抗體總體或池內(nèi)占優(yōu)勢。
免疫球蛋白G也可以借助對諸如蛋白質(zhì)A一瓊脂糖(Pharmacia)、AvidChrom-A蛋白(Sigma)或蛋白質(zhì)G-瓊脂糖(Sigma)之類附著到固相支持體上的蛋白質(zhì)A的吸附作用被純化。其它的IgG純化方法對于熟悉本技術(shù)的人是眾所周知的而且可以被用于分離非特異性IgG。
為了制備人類IgG的Fc片段，經(jīng)過分離或純化的IgG依照制造商推薦的流程與固定的木瓜蛋白酶(Pierce)一起經(jīng)受消化。其它消化IgG產(chǎn)生能與Fc受體結(jié)合的完好無缺的Fc片段的蛋白酶，例如，纖蛋白溶酶(Sigma)或固定化的無花果蛋白酶(Pierce)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，而且可以用來制備Fc片段。然后，經(jīng)消化的免疫球蛋白與諸如蛋白A-瓊脂糖或蛋白G-瓊脂糖之類親和基質(zhì)一起孵化。IgG的非粘合部分通過逐批或逐柱地徹底洗滌從親和基質(zhì)中被洗提出來。然后，IgG的Fc片段通過添加與Fc-吸附劑束縛不相容的緩沖液被洗提出來。在Fc片段的純化中有效的其它方法也可以被使用。
實(shí)施例2化合物對人類的免疫球蛋白Fc片段的接合作用為了借助FcRn轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制遞送化合物，這樣的化合物能與整個的IgG或Fc片段偶聯(lián)。就這樣的目的而言，交聯(lián)試劑和有效試劑的化學(xué)在技術(shù)上是眾所周知的。用來綴合待遞送的整個的IgG或Fc片段和化合物的交聯(lián)試劑的性質(zhì)不受本發(fā)明的限制。任何交聯(lián)劑都可以使用，只要化合物的活性得以保持而且共軛物的Fc部分的FcRn的粘合不受不利的影響即可。
Fc和化合物有效的一步交聯(lián)的實(shí)例是在磷酸鈉緩沖液中用高碘酸鈉在室溫下將Fc氧化30分鐘，然后與待綴合的化合物一起在4℃下通宵孵化。接合作用也可以通過化合物和Fc片段兩者與sulfo-LC-SPDP一起在室溫下衍生18小時得以完成。共軛物也可以通過將待遞送的Fc片段和需要的化合物與隨后將形成共價鍵的不同的交聯(lián)試劑一起衍生來制備。這個反應(yīng)的實(shí)例是Fc片段與sulfo-SMCC一起和待綴合到Fc上的化合物的衍生是用SATA硫醇化的。衍生的諸如成份經(jīng)過純化去掉交聯(lián)劑而且在室溫下結(jié)合一小時以允許交聯(lián)。包括醛、酰亞胺、氰基、鹵素、羧基、活性羧基、酐和馬來酰亞胺官能團(tuán)的其它的交聯(lián)試劑對于普通技術(shù)人員是已知的，而且也可以用于化合物對Fc片段的綴合。當(dāng)然，交聯(lián)試劑的選擇將取決于需要綴合到Fc上的化合物的性質(zhì)。上述的交聯(lián)試劑對于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)接合是有效的。如果要綴合的化合物是碳水化合物或有碳水化合物部分，那么諸如ABH、M2C2H、MPBH和PDPH之類雜二官能團(tuán)的交聯(lián)試劑對于與蛋白質(zhì)類的FcRn粘合分子(Pierce)的接合是有用的。蛋白質(zhì)和碳水化合物的另一種綴合方法是由Brumeanu等人(GeneticEngineering News，October，1，1995，p.16)揭示的。如果待綴合的化合物是脂或有脂類部分便作為用于FcRn粘合分子的綴合部位，那么諸如SPDP、SMPB及其衍生物之類的交聯(lián)劑可以被使用(Pierce)。借助非共價鍵方式綴合任何要遞送的分子也是可能的。一種便于實(shí)現(xiàn)非共價鍵綴合的方法是用技術(shù)上眾所周知的方法產(chǎn)生待遞送的化合物的抗體，例如，單株抗體，以及選擇有正確的Fc區(qū)域和需要的抗原粘合性質(zhì)的單株抗體。然后，要遞送的抗原或治療制劑被預(yù)先鍵合到單株抗體載體上。在上述的全部交聯(lián)反應(yīng)中，重要的是純化衍生的化合物去掉交聯(lián)試劑。另外，純化最后的共軛物徹底去掉未綴合的反應(yīng)物也很重要。純化可以基于共軛物中的任一成份的性質(zhì)借助親和力、凝膠過濾或離子交換層析來完成。特別優(yōu)選的方法是最初的親和力純化步驟使用A蛋白-瓊脂糖來保有Fc和Fc-化合物綴合，接下來基于Fc共軛物的質(zhì)量、大小或電荷進(jìn)行凝膠過濾或離子交換層析。這個純化方案的初始步驟保證共軛物將粘合到作為本發(fā)明的基本要求的FcRn上。
實(shí)施例3一般用途的X-Fc表達(dá)載體的構(gòu)造Kb信號肽考慮到許多不同的可能與Fcγl融合的蛋白質(zhì)的有效生產(chǎn)和分泌。所以，一般用途的X-Fc表達(dá)載體是通過把在Fcγl的鉸合區(qū)域中靠13-氨基酸肽連接體與天冬氨酸221(D221，EU編號)融合的Kb信號肽組成的表達(dá)盒(GSRPGEFAGAAAV；SEQID NO26)插入pED.dC的第一個順反子位置構(gòu)成的。
Kb信號序列是在使用Vent聚合酶的RapidCycler中使用引物PKF和KXR從在95℃下變性15秒，接著28個95℃持續(xù)0秒、55℃持續(xù)0秒和72℃持續(xù)1分20秒的斜率為6.0的周期，再在72℃下擴(kuò)散3分鐘的A2E/X模板獲得的。引物PKF包含PstI部位，而引物KXR包含XbaI部位。兩個限制部位促進(jìn)了擴(kuò)增產(chǎn)品的定向克隆。大約90個堿基對(bp)的PCR產(chǎn)品被凝膠純化、用PstI和XbaI消化，再一次凝膠純化和亞克隆變成經(jīng)PstI/XbaI消化、凝膠純化的pED.dC載體。一種構(gòu)造被選為代表性的無性繁殖系，并且被命名為pED.dC.Kb。
Fcγl序列是在使用Expand聚合酶的RapidCycler中使用引物FCGF和FCGMR從在95℃下變性15秒，接著30個95℃持續(xù)0秒、55℃持續(xù)0秒和72℃持續(xù)1分20秒的斜率為6.0的周期，再在72℃下擴(kuò)散10分鐘的EPO-Fc模板獲得的。大約720bp的產(chǎn)品被凝膠分離和克隆成pGEM-T Easy載體，然后被測序。然后，正確的編碼區(qū)域被EcoRI-MfeI消化切除、凝膠純化和亞克隆成經(jīng)EcoRI消化、凝膠純化的pED.dC.Kb構(gòu)造。按正確的取向有Fcγ編碼區(qū)域的質(zhì)粒通過用SmaI消化被確定下來，而且這種構(gòu)造的序列被確定下來。該構(gòu)造被命名為pED.dC.XFc。pED.dC.XFc的質(zhì)粒圖和部分序列被展示在圖3中。
實(shí)施例4有Kb信號肽的EPO-Fc的表達(dá)載體的構(gòu)造在這個實(shí)施例中，成人的EPO序列被插入盒，從而產(chǎn)生接在Fcγl序列前面的cDNA編碼的Kb信號肽、3-氨基酸連接體(GSR)、成熟的EPO序列和8-氨基酸連接體(EFAGAAAV，SEQ IDNO27)。EPO序列是當(dāng)模板在使用Vent聚合酶的RapidCycler中使用引物EPO-F和EPO-R在95℃下變性15秒，接著28個95℃持續(xù)0秒、55℃持續(xù)0秒和72℃持續(xù)1分20秒的斜率為6.0的周期，再在72℃下擴(kuò)散10分鐘的時候從成年腎臟QUICK-克隆cDNA制劑獲得的。引物EPO-F包含XbaI部位，而引物EPO-R包含EcoRI部位。大約514bp的產(chǎn)品被凝膠純化、用XbaI和EcoRI消化、再一次凝膠純化和定向亞克隆成經(jīng)XhaI/EcoRI消化、凝膠純化的pED.dC.XFc載體。在轉(zhuǎn)化之后，被考核的20個無性繁殖系中的四個擁有正確的插入片段。一個這樣的無性繁殖系被發(fā)現(xiàn)如同用直接測序確定的那樣沒有突變。這種構(gòu)造被命名為pED.dC.EPofc。關(guān)于野生型人類EPO的核酸和氨基酸序列，參照圖2。pED.dC.Epofc的質(zhì)粒圖和部分序列被展示在圖4中。
實(shí)施例5有EPO信號肽的EPO-Fc表達(dá)載體的構(gòu)造為了在使用內(nèi)生的EPO信號肽而不是Kb信號肽的時候評估EPO-Fc的生產(chǎn)和分泌，第二個EPO-Fc的表達(dá)質(zhì)粒被產(chǎn)生。這個質(zhì)粒中的分泌盒給在Fcγl序列前面的包括它與8-氨基酸連接體融合的內(nèi)因性信號肽(EFAGAAAV，SEQ ID NO27)在內(nèi)的人類EPO序列編碼。包含內(nèi)生的信號肽和成熟的序列兩者的天然EPO序列是當(dāng)模板在使用Expand聚合酶的PTC-200中使用引物EPS-F和EPS-R在94℃下變性2分鐘，接著32個94℃持續(xù)30秒、57℃持續(xù)30秒和72℃持續(xù)45秒的周期，再在72℃下擴(kuò)散10分鐘的時候從成年腎臟QUICK-克隆cDNA制劑獲得的。引物EPS-F包含在開始密碼子上游的Sbf1部位而引物EPS-R在EPO序列中使內(nèi)生Sbf7部位的下游退火。大約603bp的產(chǎn)品被凝膠分離和亞克隆成pGEM-T Easy載體。四個獨(dú)立的構(gòu)造被完全測序，兩個無突變的之一被用于進(jìn)一步地亞克隆。正確編碼的序列被SbfI消化切斷、凝膠純化和克隆成經(jīng)PstI消化、SAP處理和凝膠純化的pED.dC.EPofc質(zhì)粒。在正確的方向上有插入片段的質(zhì)粒最初是借助KpnI消化確定的。這種構(gòu)造的XmnI和PvuII消化與pED.dC.Epofc進(jìn)行比較并且確認(rèn)正確的取向。序列被確定下來，而且該構(gòu)造被稱為pED.dC.natEpoFc。pED.dC.natEpoFc的質(zhì)粒圖和部分序列被展示在圖5中。
實(shí)施例6在體內(nèi)EPO-Fc的生物活性的保留為了證明通過FcRn結(jié)合配體和感興趣的蛋白質(zhì)的融合制成的共軛物能夠保有生物活性，上述的示范蛋白質(zhì)以下述方式就紅細(xì)胞生成素的生物活性予以表達(dá)和化驗(yàn)。包含EPO-Fc融合的哺乳動物表達(dá)載體被轉(zhuǎn)染到中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中并且按照技術(shù)上的標(biāo)準(zhǔn)流程表達(dá)。轉(zhuǎn)染的或未轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的上清液被收集起來并且被皮下注射到BALB/c小鼠體內(nèi)。小鼠的網(wǎng)狀細(xì)胞計(jì)數(shù)用在本技術(shù)領(lǐng)域中已知的技術(shù)借助Coulter FACS分析獲得的。結(jié)果證明用轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液注射的小鼠具有比用對照(未轉(zhuǎn)染)上清液注射的小鼠高數(shù)倍的網(wǎng)狀細(xì)胞計(jì)數(shù)。由于EPO已被證明刺激紅血球的生產(chǎn)，所以在此揭示的結(jié)果支持本發(fā)明合成有生物活性的FcRn結(jié)合配體共軛物的能力。
同樣，用Fc片段替換上述載體中的替代FcRn結(jié)合配體域的融合蛋白質(zhì)將被期望保有生物活性。
實(shí)施例7EPO-Fc遞送到中央氣道之后的透過上皮吸收免疫組織化學(xué)研究表明在獼猴類猴子和人類兩個方面FcRn在中央氣道中都以比肺泡上皮中高的水平被表達(dá)。所以，所關(guān)心的是確定粘合到FcRn上的EPO-Fc融合蛋白(MW＝112kDa)能否通過肺臟上皮轉(zhuǎn)運(yùn)以及在肺臟中這種吸收發(fā)生在哪里。由天然的人類EPO在其羧基末端融合到人類IgG1的Fc域的氨基末端上組成的人類EPO-Fc融合蛋白質(zhì)被表達(dá)在CHO細(xì)胞中而且是使用蛋白A親和層析從細(xì)胞培養(yǎng)基提純的。純化的人類EPO-Fc融合蛋白在體外是有生物活性的。EPO-Fc憑借高親和力(對于天然的huEPO，Kd＝0.25nM對0.2nM)鍵合到EPO受體(EpoR)上，而且刺激TF-1人類紅白血病細(xì)胞的增殖(對于天然的huEPO，ED50＝0.07nM對0.03nM)。在Biacore化驗(yàn)中，EPO-Fc還鍵合到純化的可溶的huFcRn上(對于IgG1，Kd＝14nM對8nM)。
EPO-Fc的氣溶膠(在PBS中，pH7.4)是用各種不同的噴氣式霧化器產(chǎn)生的而且是通過氣管內(nèi)的管子對被麻醉的獼猴類猴子給藥的。在一些實(shí)驗(yàn)中，猴子正在自然地呼吸，而在其它的實(shí)驗(yàn)中，呼吸的深度和速率是用Bird Mark呼吸機(jī)或Spangler盒式裝置調(diào)節(jié)的。循環(huán)網(wǎng)狀細(xì)胞方面的增加被用作對EPO-Fc的生物響應(yīng)的指示器。EPO-Fc是在血清中使用特異性ELISA定量的。
在被麻醉的自然呼吸的獼猴類猴子方面的初步研究考察對成煙霧狀散開的EPO-Fc的生物學(xué)響應(yīng)(圖6A)。在這項(xiàng)研究中所有動物在EPO-Fc給藥后5-7天都以循環(huán)網(wǎng)狀細(xì)胞的增加回應(yīng)。后來的研究表明高濃度的EPO-Fc是在以類似的方式單一劑量給藥之后在血清中獲得的(圖6B)。在其FcRn粘合方面減少90％以上的突變的EPO-Fc(在Fc域I253A、H310A和H435A中有三個關(guān)鍵的氨基酸殘基被修飾的Fc)不能被很好地吸收。平均的血清半衰期對于EPO-Fc是大約22小時(與對于EPOGEN(Amgen)的5-6小時相比較)。EPO-Fc和mutEPO-Fc的吸收是用淺的(自然的)呼吸或深的(強(qiáng)制換氣)呼吸進(jìn)行比較的。被迫深呼吸的手法導(dǎo)致比自然的淺呼吸低得多的EPO-Fc吸收，同時在突變的EPO-Fc的吸收方面沒有差異。
這些結(jié)果在使用γ閃爍掃描法(99mTc-DTPA作為放射性示蹤劑共同給藥)的實(shí)驗(yàn)中得到確認(rèn)和增強(qiáng)，以便在強(qiáng)制換氣的情況下以20％或75％的生活力比較EPO-Fc的沉積和吸收(圖7)。閃爍掃描圖像證明放射性示蹤劑的沉積是適于20％生活力的氣管/中央氣道對適于75％生活力的中央氣道/深層肺臟。EPO-Fc的吸收在使用20％生活力給藥之后是更強(qiáng)健的。此外，EPO-Fc的吸收是在不同的沉積劑量水平下考核的(全部按20％生活力手法完成)，以便找到適合臨床應(yīng)用的EPO-Fc劑量范圍。0.01-0.03mg/kg的沉積劑量導(dǎo)致與臨床效用一致的藥物動力學(xué)(圖8)。
實(shí)施例8通過人類的IFN-α-Fc對非人類的靈長類動物的中央氣道的氣溶膠給藥考核IFN-α的全身性遞送人類IFN-α-Fc表達(dá)結(jié)構(gòu)是使用實(shí)施例3的pED.dC.Kb表達(dá)載體和人類IFN-α的編碼區(qū)域產(chǎn)生的。適合人類IFN-α的核苷酸序列可根據(jù)編號J00207從GenBank公開地獲得。人類IFN-α-Fc被表達(dá)在CHO細(xì)胞中并且是以類似于上述的EPO-Fc的方式分離的。就這個實(shí)驗(yàn)而言六只獼猴類猴子被分為三組。組I的猴子通過類似于在實(shí)施例7中就EPO-Fc描述的給藥方法的中央氣道氣溶膠給藥完成20μg/kg IFN-α-Fc給藥。組II的猴子是以同樣的方式完成對中央氣道20μg/kg的INTRON(ScheringCorporation，Kenilworth，NJ)(一種重組人類IFN-α)的給藥的。組III的猴子是通過中央氣道氣溶膠給藥按組I的IFN-α-Fc給藥量的十分之一(即，2μg/kg)給藥的。血樣在14天里被定期抽取而且IFN-α的血清水平是在每個時間點(diǎn)使用適當(dāng)?shù)奶禺愋訣LISA測定的。也用同樣的ELISA確定的處理前的IFN-α水平被從所有后來的IFN-α水平測定中減去。此外，用于IFN-α生物活性的標(biāo)準(zhǔn)化驗(yàn)是使用從組I中的動物獲得的序列試樣完成的，以便估定被給藥的IFN-α-Fc的生物活性。這些化驗(yàn)包括寡腺苷酸合成酶(OAS)活性和新蝶呤濃度的測量。結(jié)果被展示在圖9-11中。
圖9展示組I的猴子(DD030和DD039)實(shí)現(xiàn)在160-185納克/毫升范圍內(nèi)的IFN-α峰值血清濃度，而半衰期(T1/2)為83.7-109小時。相比之下，以同樣的給藥方式接受20μg/kg作為INTRON的IFN-α的組II中的猴子(DD029和DD045)實(shí)現(xiàn)只有大約13.6納克/毫升的IFN-α峰值血清水平，而且半衰期(T1/2)只有4.8-5.9小時。這些結(jié)果表明給藥到中央氣道的成煙霧狀散開的IFN-α-Fc對于IFN-α的全身性遞送是非常有效的。此外，因此作為IFN-α-Fc給藥的IFN-α的延長的半衰期證明與類似地單獨(dú)給藥的IFN-α相比IFN-α能作為FcRn結(jié)合配體共軛物給藥而且在藥物動力學(xué)方面有引人注目的改善。
圖10展示，IFN-α-Fc的給藥量僅僅是組I猴子的十分之一組III的猴子(DD055和DD057)實(shí)現(xiàn)成比例地降低的血清濃度而且有相似的藥物動力學(xué)分布曲線。
圖11展示接受IFN-α-Fc的組I的猴子的IFN-α生物活性化驗(yàn)的結(jié)果。圖11A展示作為時間的函數(shù)與圖9和圖10的藥物動力學(xué)數(shù)據(jù)平行的逐漸增加的和保持不變的OAS活性。圖11B展示也與圖9和圖10中的藥物動力學(xué)數(shù)據(jù)平行的逐漸增加的和保持不變的新蝶呤濃度。這些數(shù)據(jù)表明IFN-α-Fc中的IFN-α在依照本發(fā)明的方法對中央氣道氣溶膠給藥之后保有生物活性。
實(shí)施例9通過人類的TNFR-Fc對非人類的靈長類動物的中央氣道的氣溶膠給藥考核TNFR-Fc的全身性遞送三只獼猴類猴子中的每一只都依照本發(fā)明方法經(jīng)由中央氣道完成成煙霧狀散開的ENBREL(etanercept，ImmunexCorporation，Seattle，WA)(一種重組人類腫瘤壞死因子受體(TNFR)-Fcγl)的給藥。ENBREL是包括在支架中融化到鉸合部(人類IgG1的CH2、CH3域)的人類TNFR的胞外粘合配體部分的二聚融合蛋白質(zhì)。ENBREL被表達(dá)在CHO細(xì)胞中并且有大約150kDa的分子量。在這個實(shí)驗(yàn)中對每只猴子估計(jì)的沉積劑量是0.3-0.5mg/kg。血樣在十天里被定期地抽取，而且TNFR-Fc的血清水平是在每個時間點(diǎn)使用適當(dāng)?shù)奶禺愋訣LISA測定的。就血清ENBREL濃度的測量而言，夾心式ELISA是使用粘合到平板上的TNF-α作為俘獲劑、血清或ENBREL分別作為試樣或標(biāo)準(zhǔn)和抗TNFR的抗體作為報(bào)道劑完成的。結(jié)果被展示在圖12中。
圖12表明三只獼猴類猴子(101、102和103)實(shí)現(xiàn)大約200納克/毫升的TNFR-Fc的類似的峰值血清濃度。TNFR-Fc的半衰期被延長。這個實(shí)驗(yàn)證明人類TNFR-Fc能依照本發(fā)明的方法經(jīng)由氣溶膠給藥被有效地給藥到非人類的靈長類動物的中央氣道。
實(shí)施例10通過人類IFN-β-Fc對非人類的靈長類動物的中央氣道的氣溶膠給藥考核IFN-β的全身性遞送人類IFN-β-Fc表達(dá)結(jié)構(gòu)是使用實(shí)施例3的pED.dC.Kb表達(dá)載體和人類IFN-β的編碼區(qū)域產(chǎn)生的。用于人類IFN-β的核苷酸序列可根據(jù)編號V00535從GenBank公開地獲得。人類IFN-β-Fc被表達(dá)在CHO細(xì)胞中，并且是以類似于前面就EPO-Fc描述的方式分離的。兩只獼猴類猴子和兩只恒河猴類猴子每只都借助類似于在實(shí)施例7中就EPO-Fc給藥描述的方法的中央氣道氣溶膠給藥完成40μg/kg IFN-β-Fc的給藥。血樣在兩天里被定期地抽取，而且IFN-β的血清水平是在每個時間點(diǎn)使用適當(dāng)?shù)奶禺愋訣LISA測定的。也用同樣的ELISA測定的處理前的IFN-β水平被從所有后來的IFN-β水平測定中減去。
結(jié)果表明經(jīng)由中央氣道完成成煙霧狀散開的人類IFN-β-Fc的給藥的獼猴類和恒河猴類的猴子都實(shí)現(xiàn)值得注意的和保持不變的IFN-β血清濃度。在這個實(shí)驗(yàn)中獼猴類猴子實(shí)現(xiàn)比恒河猴類猴子高的峰值水平(獼猴的11.0-24.7納克/毫升對恒河猴的5.4-8.4納克/毫升)。IFN-β-Fc的半衰期在兩組中大體相同，即12.8-14.2小時。這些數(shù)據(jù)證明給藥到兩種非人類的靈長類動物的中央氣道的成煙霧狀散開的IFN-β-Fc對IFN-β的全身性遞送是有效的。
實(shí)施例11通過人類FSH-Fc對非人類的靈長類動物的中央氣道的氣溶膠給藥考核FSH的全身性遞送人類FSH-Fc的表達(dá)結(jié)構(gòu)是使用實(shí)施例3的pED.dC.Kb表達(dá)載體和單鏈人類FSH的編碼區(qū)域產(chǎn)生的。分子的單鏈FSH部分包括異源二聚體激素FSH在適當(dāng)?shù)姆g讀框中用SmaI限制核酸內(nèi)切限制部位(CCCGGG)連接在一起的α鏈和β鏈。因此，F(xiàn)SH-Fc構(gòu)造也被稱為hFSHβα-Fc。用于人類FSH的α亞基和β亞基的核苷酸序列可以分別根據(jù)編號NM_000735和NM_000510公然通過GenBank獲得。人類FSH-Fc被表達(dá)在CHO細(xì)胞中，并且是以類似于前面就EPO-Fc描述的方式分離的。
兩只獼猴類猴子每只都借助與在實(shí)施例7中就EPO-Fc的給藥描述的方法類似的中央氣道氣溶膠給藥完成100μg/kg的FSH-Fc給藥。血樣在兩個星期里被定期地抽取，而FSH的血清水平是在每個時間點(diǎn)使用適當(dāng)?shù)奶禺愋訣LISA測定的。也用同樣的ELISA測定的處理前的FSH水平被從所有后來的FSH水平測定中減去。結(jié)果表明兩只猴子都實(shí)現(xiàn)值得注意的FSH水平，其中峰值血清濃度為21.6和42.8ng/ml，而半衰期為145-153小時。
本發(fā)明在范圍方面不受傾向于作為本發(fā)明個別方面的單一例證的特定的實(shí)施方案的限制，而且功能上等價的方法和成份在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。確實(shí)，除了在此展示和描述的之外，本發(fā)明各種不同的修改方案對于本領(lǐng)域普通的技術(shù)人員從前面的描述和附圖將變得明顯。這樣的修改方案預(yù)計(jì)將落在權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。
在本文中引證的全部參考文獻(xiàn)都在此通過引證被全部并入本文。
序列表<110>布賴漢姆婦女醫(yī)院<120>適合治療劑全身性遞送的中央氣道給藥<130>S01383/70005WO<150>US 60/364,482<151>2002-03-15<160>27<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>681<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1gacaaaactc acacatgtcc accttgtcca gctccggaac tcctgggggg accgtcagtc 60ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca120tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac180ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac240cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag300tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa360gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag420aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag480tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc540gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg600aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc660
ctctccctgt ctccgggtaa a 681<210>2<211>227<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly1 5 10 15Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met20 25 30Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His35 40 45Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val50 55 60His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr65 70 75 80Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly85 90 95Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile100 105 110Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val115 120 125Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu145 150 155 160Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro165 170 175Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val180 185 190Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met195 200 205His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser210 215 220Pro Gly Lys225<210>3<211>579<212>DNA<213>Homo sapiens<400>3atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctgcag120aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc180agcttgaatg agaatatcac tgtcccagac accaaagtta atttctatgc ctggaagagg240atggaggtcg ggcagcaggc cgtagaagtc tggcagggcc tggccctgct gtcggaagct300gtcctgcggg gccaggccct gttggtcaac tcttcccagc cgtgggagcc cctgcagctg360catgtggata aagccgtcag tggccttcgc agcctcacca ctctgcttcg ggctctggga420
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<400>7ctgcagacca ccatggtacc gtgcacgctg ctcctgctgt tggcggccgc cctggctccg 60actcagaccc gcgccggctc tagagcccca ccacgcctca tctgtgacag ccgagtcctg 120cagaggtacc tcttggaggc caaggaggcc gagaatatca cgacgggctg tgctgaacac 180tgcagcttga atgagaatat cactgtccca gacaccaaag ttaatttcta tgcctggaag 240aggatggagg tcgggcagca ggccgtagaa gtctggcagg gcctggccct gctgtcggaa 300gctgtcctgc ggggccaggc cctgttggtc aactcttccc agccgtggga gcccctgcag 360ctgcatgtgg ataaagccgt cagtggcctt cgcagcctca ccactctgct tcgggctctg 420ggagcccaga aggaagccat ctcccctcca gatgcggcct cagctgctcc actccgaaca 480atcactgctg acactttccg caaactcttc cgagtctact ccaatttcct ccggggaaag 540ctgaagctgt acacagggga ggcctgcagg acaggggaca gagaattcgc cggcgccgct 600gcggtcgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 660tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 720gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 780gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 840acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 900tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 960gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg1020accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc1080gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgttg1140gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag1200caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag1260
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Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp145 150 155 160Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys165 170 175Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg Glu Phe180 185 190Ala Gly Ala Ala Ala Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro195 200 205Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys210 215 220Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val225 230 235 240Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr245 250 255Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu260 265 270Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His275 280 285Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys290 295 300Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln305 310 315 320
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Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu85 90 95Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser100 105 110Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly115 120 125Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu130 135 140Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile145 150 155 160Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu165 170 175
Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp180 185 190Arg Glu Phe Ala Gly Ala Ala Ala Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro195 200 205Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe210 215 220Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val225 230 235 240Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe245 250 255Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro260 265 270Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr275 280 285Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val290 295 300Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala305 310 315 320Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg325 330 335Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly340 345 350
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<400>17Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5 10 15<210>18<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>synthetic oligonucleotide
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<223>synthetic peptide<400>27Glu Phe Ala Gly Ala Ala Ala Val1 權(quán)利要求
1.一種用于全身性遞送治療制劑的方法，該方法中包括給藥有效量的治療制劑和FcRn結(jié)合配體的共軛物的氣溶膠對肺臟，以致肺臟中央?yún)^(qū)域/肺臟外圍區(qū)域的沉積比(C/P比)至少是0.7。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中C/P比至少是1.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中C/P比至少是1.5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中C/P比至少2.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中治療制劑是多肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中治療制劑是抗原。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中抗原是腫瘤抗原。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中治療制劑是低聚核苷酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中低聚核苷酸是抗過敏的低聚核苷酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中治療制劑是紅細(xì)胞生成素(EPO)、生長激素、干擾素α(IFN-α)、干擾素β(IFN-β)或促卵泡生成激素(FSH)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中治療制劑是EPO。
12.一種用于全身性遞送治療制劑的方法，其中包括給藥有效量的治療制劑和FcRn結(jié)合配體的共軛物的氣溶膠對肺臟，其中氣溶膠的顆粒有至少3微米(μm)的質(zhì)量中值氣動力學(xué)直徑(MMAD)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中顆粒的MMAD介于3μm和大約8μm之間。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中顆粒的MMAD大于4μm。
15.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中大多數(shù)顆粒是不適于呼吸的。
16.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中治療制劑是多肽。
17.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中治療制劑是抗原。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中抗原是腫瘤抗原。
19.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中治療制劑是低聚核苷酸。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中低聚核苷酸是抗過敏的低聚核苷酸。
21.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中治療制劑是EPO、生長激素、IFN-α、IFN-β、或FSH。
22.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中治療制劑是EPO。
23.一種治療制劑和FcRn結(jié)合配體的共軛物的氣溶膠，其中氣溶膠中的顆粒具有至少3μm的MMAD。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的氣溶膠，其中顆粒的MMAD介于3μm和大約8μm之間。
25.根據(jù)權(quán)利要求23的氣溶膠，其中顆粒的MMAD大于4μm。
26.根據(jù)權(quán)利要求23的氣溶膠，其中大多數(shù)顆粒是不適于呼吸的。
27.根據(jù)權(quán)利要求23的氣溶膠，其中治療制劑是多肽。
28.根據(jù)權(quán)利要求23的氣溶膠，其中治療制劑是抗原。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的氣溶膠，其中抗原是腫瘤抗原。
30.根據(jù)權(quán)利要求23的氣溶膠，其中治療制劑是低聚核苷酸。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的氣溶膠，其中低聚核苷酸是抗過敏的低聚核苷酸。
32.根據(jù)權(quán)利要求23的氣溶膠，治療制劑是EPO，生長激素，IFN-α、IFN-β、或FSH。
33.根據(jù)權(quán)利要求23的氣溶膠，其中治療制劑是EPO。
34.一種氣溶膠遞送系統(tǒng)，其中包括容器、與容器連接的氣溶膠發(fā)生器和安排在容器之內(nèi)的治療制劑和FcRn結(jié)合配體的共軛物，其中氣溶膠發(fā)生器是為生成含有顆粒的MMAD至少為3μm的共軛物的氣溶膠而構(gòu)成和安排的。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的氣溶膠遞送系統(tǒng)，其中顆粒的MMAD大于4μm。
36.根據(jù)權(quán)利要求34的氣溶膠遞送系統(tǒng)，其中大多數(shù)顆粒是不適于呼吸的。
37.根據(jù)權(quán)利要求34的氣溶膠遞送系統(tǒng)，其中氣溶膠發(fā)生器包括與包含共軛物的溶液流體連接的振動元件。
38.根據(jù)權(quán)利要求34的氣溶膠遞送系統(tǒng)，其中氣溶膠發(fā)生器是霧化器。
39.根據(jù)權(quán)利要求34的氣溶膠遞送系統(tǒng)，其中氣溶膠發(fā)生器是機(jī)械泵。
40.根據(jù)權(quán)利要求34的氣溶膠遞送系統(tǒng)，其中容器是增壓容器。
41.一種制造權(quán)利要求34的氣溶膠遞送系統(tǒng)的方法，其中包括提供容器；提供與容器連接的氣溶膠發(fā)生器；以及將有效量的共軛物放進(jìn)容器。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，其中氣溶膠發(fā)生器包括與包含共軛物的溶液流體連接的振動元件。
43.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，其中氣溶膠發(fā)生器是霧化器。
44.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，其中氣溶膠發(fā)生器是機(jī)械泵。
45.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，其中容器是增壓容器。
全文摘要
本發(fā)明涉及適合透過上皮全身性提供治療的方法和產(chǎn)品。具體地說，本發(fā)明涉及通過包含治療制劑與FcRn結(jié)合配體的共軛物的氣溶膠對肺臟中央氣道上皮的給藥用于治療劑的全身性遞送的方法和組合物。這些方法和產(chǎn)品能適應(yīng)各式各樣的治療制劑，包括蛋白質(zhì)和多肽、核苷酸、藥物和其它。此外，這些方法和產(chǎn)品具有不需要為了實(shí)現(xiàn)全身性遞送而給藥到深層肺臟的優(yōu)勢。
文檔編號A61K48/00GK1671863SQ02828942
公開日2005年9月21日 申請日期2002年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月15日
發(fā)明者理查德·S·布盧姆伯格, 韋恩·I·倫瑟, 尼爾·E·史密斯特爾, 艾倫·J·比通提 申請人:布賴漢姆婦女醫(yī)院