專利名稱：改善動(dòng)物的生長(zhǎng)性能的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明廣義上涉及一種改善動(dòng)物的生長(zhǎng)性能的方法。具體而言，本發(fā)明涉及一種改善動(dòng)物的生長(zhǎng)性能的方法，包括給需要的動(dòng)物施用生長(zhǎng)促進(jìn)量的一或多種抗炎劑的步驟。
背景技術(shù)：
在許多國家的農(nóng)業(yè)中，工業(yè)化家畜飼養(yǎng)系統(tǒng)已變得普遍。工業(yè)化動(dòng)物飼養(yǎng)業(yè)技術(shù)已用于飼養(yǎng)家禽、豬和牛，并導(dǎo)致由這些動(dòng)物產(chǎn)生的食品的產(chǎn)量大大增加。
家畜的工業(yè)化飼養(yǎng)要求生長(zhǎng)速率和飼料轉(zhuǎn)化效率的最大化，以降低單元生產(chǎn)成本。這個(gè)要求導(dǎo)致所謂的“飼料添加劑”的發(fā)展和廣泛使用。
飼料添加劑有兩個(gè)一般目的。一個(gè)目的是在健康和營(yíng)養(yǎng)不成問題的動(dòng)物中在增加生長(zhǎng)速率和/或增加飼料轉(zhuǎn)化效率方面提高動(dòng)物的性能。另一目的是在目前密集飼養(yǎng)的實(shí)踐中不可避免發(fā)生的外傷或“應(yīng)激(stresss)”期間保持動(dòng)物的健康，從而使動(dòng)物不患病。
在20世紀(jì)50年代早期，研究者意外地發(fā)現(xiàn)雞飼料中的抗生素成分是一種“生長(zhǎng)因子”。該發(fā)現(xiàn)大大改變了牲畜和家畜產(chǎn)業(yè)，并在經(jīng)濟(jì)上惠及制藥公司。食用動(dòng)物(feed animal)目前在高度控制條件下飼養(yǎng)并接受含有多種生長(zhǎng)促進(jìn)添加劑的特制飼料。
對(duì)動(dòng)物進(jìn)行常規(guī)抗生素給藥幾乎是普遍的，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)往動(dòng)物飼料中加入少量抗生素如青霉素、四環(huán)素和磺胺二甲嘧啶(sulfamethasine)增加豬和牛的生長(zhǎng)。1979年，在美國飼養(yǎng)的約70％的肉牛和小牛，90％的豬，和基本上100％的小雞食用抗生素作為其每日飼料的一部分。這種使用，數(shù)量為約美國所售抗生素的40％，估計(jì)使消費(fèi)者每年在食品成本上節(jié)省35億美元。
在經(jīng)過優(yōu)化能促進(jìn)生長(zhǎng)的現(xiàn)代條件下飼養(yǎng)的動(dòng)物接受含有高比例蛋白質(zhì)和高百分率的谷物的食物，所述蛋白質(zhì)通常為大豆或棉籽食物形式(肉和骨或血食物在澳大利亞廣泛使用)；所述谷物如玉米或買羅高粱(milo)，這是高粱的一種類型(澳大利亞的小麥和大麥)。已被使用的食物添加劑包括激素如二乙基-己烯雌酚和鎮(zhèn)定劑(未廣泛用于豬)，前者還增大體重增加的速率；后者防止由于封閉條件引起的應(yīng)激效應(yīng)造成疾病或重量損失。
牛通常需要5千克飼料來產(chǎn)生1千克的體重增加。如果在最佳生長(zhǎng)促進(jìn)條件下并采用強(qiáng)化飼料，僅用3千克的飼料使它們?cè)黾?千克。
雖然激素和抗生素大大增加食物動(dòng)物的生長(zhǎng)速率，使用這些添加劑并非沒有問題。一種用作生長(zhǎng)興奮劑的激素，二乙基-己烯雌酚或DES已表明是一種致癌物質(zhì)，在大部分國家已被禁止進(jìn)一步應(yīng)用。
當(dāng)在動(dòng)物飼料中混合抗生素時(shí)，化合物擴(kuò)散到整個(gè)環(huán)境，使微生物與該抗生素接觸。微生物持續(xù)暴露于抗生素對(duì)微生物造成生物壓力，使之對(duì)抗生素形成耐受性。這可能導(dǎo)致產(chǎn)生耐受抗生素的微生物，并使其特別嚴(yán)重和難以治療感染。
抗生素耐受微生物是潛在的嚴(yán)重病原體，因?yàn)樗y以控制。如果有機(jī)體導(dǎo)致動(dòng)物或人感染，則該感染可能不被常規(guī)抗生素控制。如果感染嚴(yán)重，則可能沒有時(shí)間確定哪種抗生素可有效對(duì)抗感染性細(xì)菌。該問題在肉中抗生素耐受性生物被那些自身也服用抗生素來治療疾病的人食用時(shí)特別嚴(yán)重?？股匾种坪粑篮臀改c道中許多正常的微生物。這使耐受性微生物快速增殖，并產(chǎn)生更為嚴(yán)重的疾病。食物中的抗生素耐受性生物體和對(duì)人的無效抗生素治療共同造成過去幾年中在美國報(bào)道的大部分由沙門氏菌食物中毒導(dǎo)致的死亡。
飼料堆中抗生素耐受性細(xì)菌的增加和由抗生素耐受性細(xì)菌導(dǎo)致的許多嚴(yán)重的傳染病的結(jié)果是，關(guān)于禁止在動(dòng)物飼料中使用抗生素的管理壓力在增加。實(shí)際上，世界衛(wèi)生組織和澳大利亞政府具體指出需要使用環(huán)保的備選方法來控制感染。從現(xiàn)在開始在家畜飼料和水中禁用或撤出多種抗生素可能(i)增加動(dòng)物的感染發(fā)生率，從而降低生長(zhǎng)性能，(ii)進(jìn)一步降低動(dòng)物的健康、生育力和繁殖性能。因此，對(duì)于新的、安全和有效的食用動(dòng)物的生長(zhǎng)刺激劑以及通過增加健康來降低疾病的需求是迫切的且越來越多。
不用抗生素而促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的多種嘗試已被人采用，其中許多利用了復(fù)雜和間接的方法。這些包括皮下植入激素或由復(fù)合物制備的具有陽離子的絡(luò)合鹽(例如參見美國專利6,197,815；美國專利3,991,750；美國專利4,067,994)。這些嘗試無一被證明是簡(jiǎn)單或有效的。因此，仍需要一種不依賴使用抗生素或復(fù)雜工藝的改善動(dòng)物的生長(zhǎng)性能的方法。
現(xiàn)在申請(qǐng)人驚奇地發(fā)現(xiàn)，施用抗炎劑，特別是細(xì)胞因子受體拮抗劑如白介素(IL)-1ra，可增加動(dòng)物的生長(zhǎng)性能，同時(shí)減少抗生素的用量。申請(qǐng)人還證明類似的生長(zhǎng)性能效果可以通過施用可溶性細(xì)胞因子受體如TNFα受體、IL-6受體、IL-4受體和IL-8受體，或者細(xì)胞因子阻斷因子如TNF阻斷因子(Bargetzki等，Cancer Research 534010-13(1993)；Engelmann等，Journalof Biological Chemistry 26411974-80(1989))或TNF-α抑制劑(Engelmann等，Journal of Biological Chemistry 2651531-6(1990)；Seckinger等，EuropeanJournal of Immunology 201167-74(1990))來實(shí)現(xiàn)。
無意受任何具體理論或假設(shè)的限制，申請(qǐng)人認(rèn)為在已施用抗炎劑的動(dòng)物中觀察到生長(zhǎng)性能的增加是由四種關(guān)鍵效果的互相作用導(dǎo)致的，它們是1).自身的抗炎效果；2).免疫增強(qiáng)效果；3).抗寄生蟲和抗微生物效果；和4).應(yīng)激降低。
這些效果中的每一種，單獨(dú)或一起，深深地影響動(dòng)物的健康和安寧(welfare)，進(jìn)而影響動(dòng)物的生長(zhǎng)性能，從而影響肉質(zhì)量。例如1).抗炎慢性炎癥通常見于家畜，并與由持續(xù)感染和環(huán)境刺激引起的免疫活化有關(guān)。炎癥在針對(duì)感染的免疫反應(yīng)的啟動(dòng)中起重要作用，但慢性免疫活化，特別是持續(xù)感染或微生物負(fù)載(load)，可對(duì)生長(zhǎng)和發(fā)育具有有害效果，并可減小接種疫苗的效力。過度的免疫活化的結(jié)果包括產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子、發(fā)燒、食欲不振、從肌肉中再吸收氨基酸和從肉類生產(chǎn)中移走營(yíng)養(yǎng)物?？寡讋┛梢詼p少慢性免疫活化的病變，例如通過降低炎性細(xì)胞因子如IL-1、IL-6、TGF-α、IL-11、IL-18、IL-12、IL-17、LIF、IFN-α、IL-8、TNF-α和GM-CSF的效果來實(shí)現(xiàn)?；蛘?，通過施用這些炎性細(xì)胞因子的可溶性細(xì)胞因子受體，即IL-1受體、IL-8受體、TNF-α受體、IL-6受體等，可以減少過量的循環(huán)炎性細(xì)胞因子。細(xì)胞因子受體拮抗劑如IL-1ra、IL-6ra或TNF-αra可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制這些促炎細(xì)胞因子與它們各自的膜表達(dá)型受體結(jié)合，可以用于改善這些細(xì)胞因子的作用。
2).免疫增強(qiáng)效果a).TH1/TH2免疫反應(yīng)炎性反應(yīng)不可避免地與身體的免疫系統(tǒng)有關(guān)。免疫細(xì)胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)和身體的其它調(diào)節(jié)系統(tǒng)之間存在互相作用。對(duì)感染或抗原的免疫反應(yīng)可敏銳地偏向(bias)其中一方。免疫反應(yīng)可以概括為T細(xì)胞反應(yīng)類型生。T輔助細(xì)胞1(TH1)類型反應(yīng)主要涉及細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，而TH2類型反應(yīng)一般涉及體液免疫。TH1和TH2類型細(xì)胞亞群參與調(diào)節(jié)許多由細(xì)胞因子類型限定的免疫反應(yīng)。TH2細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子白介素(IL)-4、IL-5、IL-10和IL-13。IL-3表達(dá)對(duì)TH1和TH2T細(xì)胞而言是共有的。然而，TH1細(xì)胞表達(dá)IL-2、IFNγ和TNFβ。這些TH2細(xì)胞因子影響B(tài)細(xì)胞發(fā)育并促進(jìn)體液反應(yīng)如抗體分泌。兩種類型的TH細(xì)胞通過它們分泌的細(xì)胞因子來彼此影響。例如，TH2細(xì)胞因子如IL-10可以抑制TH1功能。其它細(xì)胞因子還可以影響TH1或TH2發(fā)育，例如TNFβ已知可以下調(diào)TH1反應(yīng)。
已知當(dāng)不存在侵襲性抗原時(shí)，Th1細(xì)胞的作用對(duì)身體有害?？寡讋┮种芓h1細(xì)胞中IFN-γ的產(chǎn)生?？寡讋┻€抑制Th1細(xì)胞的過度產(chǎn)生，因此提高Th2(抗體分泌)細(xì)胞的產(chǎn)生，因?yàn)檫@些細(xì)胞彼此交叉調(diào)節(jié)。這意味著通過施用具體抗炎劑可以抑制促炎細(xì)胞因子的量?；蛘?，通過施用細(xì)胞因子的可溶性細(xì)胞因子受體(如IL-1、IL-4、IL-8、GM-CSF、IL-6或TNF-α)、細(xì)胞因子受體拮抗劑或細(xì)胞因子抑制因子，可減少TH1細(xì)胞過度產(chǎn)生細(xì)胞因子。
b).抗體同種型轉(zhuǎn)換抗體是除去感染或提供針對(duì)性保護(hù)所必需的。成熟B細(xì)胞在抗原刺激之后經(jīng)歷抗體種類轉(zhuǎn)換的過程。TH細(xì)胞在物理接觸和稱為轉(zhuǎn)換因子的細(xì)胞因子作用下，調(diào)節(jié)同種型轉(zhuǎn)換。已知單獨(dú)或組合參與同種型轉(zhuǎn)換的一些細(xì)胞因子是IL-4、IL-5、TNFβ、IL-1、IL-2、IL-6和IL-13。IL-4和IL-5協(xié)同增加IgG1反應(yīng)。例如，最佳的IgG1反應(yīng)還需要IL-2。IL-1可以提高在IL-5存在下的IgA的產(chǎn)量。TNFβ誘導(dǎo)IgA產(chǎn)生。
c).免疫功能障礙大部分生產(chǎn)特性的遺傳潛能是由出生預(yù)先決定的。許多因素(應(yīng)激、疾病、營(yíng)養(yǎng)、免疫等)決定是否獲得這種潛能。抗原暴露的水平和時(shí)間影響和確立免疫系統(tǒng)的“偏向”。大部分免疫反應(yīng)偏向促進(jìn)對(duì)細(xì)菌和病毒的免疫的類型或者促進(jìn)對(duì)許多寄生蟲的免疫的類型。雖然動(dòng)物的基因型可影響這種偏向，但新生兒對(duì)抗原和感染的早期經(jīng)歷可以使免疫反應(yīng)性偏向一種或另一種類型。這種偏向依據(jù)隨后的抗原暴露而改變。基于對(duì)生產(chǎn)特征的選擇而進(jìn)行的飼養(yǎng)程序似乎消耗病損害免疫競(jìng)爭(zhēng)力或反應(yīng)性。這種改變還由于持續(xù)地向水和飼料中添加抗生素而進(jìn)一步加劇，從而預(yù)期導(dǎo)致獲得有效免疫反應(yīng)的遺傳潛能發(fā)生改變。
d).粘膜免疫家畜感染的最易發(fā)區(qū)是粘膜部位，主要是胃腸道和肺。因此，粘膜免疫系統(tǒng)是抵抗病原體和疾病的第一衛(wèi)隊(duì)。細(xì)胞因子，特別是IL-5、IL-4、IL-6和IL-10，在粘膜免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)和效力中起明顯作用。
IL-5和IL-6作用于粘膜免疫系統(tǒng)中淋巴細(xì)胞的B-1和B-2亞種群。IL-5或IL-6或其受體生產(chǎn)的缺陷導(dǎo)致負(fù)責(zé)粘膜中保護(hù)性反應(yīng)的抗體同種型IgA的產(chǎn)生明顯受損。類似地，IL-5、IL-6和趨化因子MIP-1α具有增加IgA對(duì)粘膜疫苗的反應(yīng)的能力。IL-4對(duì)粘膜組織有免疫調(diào)節(jié)作用，主要通過增強(qiáng)TH2反應(yīng)，從而增加抗體的生產(chǎn)。IL-4被認(rèn)為是通過涉及TH2途徑的肺粘膜免疫反應(yīng)的形成所必需的。IL-4和IL-5都在肺內(nèi)協(xié)力工作，其中IL-4使初始(naive)T細(xì)胞發(fā)生TH2表型，其通過隨后的活化而分泌IL-5，導(dǎo)致嗜酸性粒細(xì)胞蓄積。而且，IL-4和IL-10在粘膜耐受性中起作用，因而幫助調(diào)節(jié)和減弱腸內(nèi)過敏性反應(yīng)，并使動(dòng)物對(duì)腸的慢性炎癥的敏感性降低。
3).抗寄生蟲和抗微生物效果a).抗寄生蟲效果對(duì)病原體的獲得性免疫反應(yīng)一般屬于細(xì)胞介導(dǎo)(TH1)或抗體介導(dǎo)(TH2)類型中的一種，且它受細(xì)胞因子調(diào)控。TH2反應(yīng)中涉及的細(xì)胞因子是吸引人的治療靶體，因?yàn)樗鼈兛梢詫?duì)抗外寄生物和胃腸蠕蟲(worm)提供保護(hù)，并抑制由TH1細(xì)胞因子誘導(dǎo)的炎癥。TH2細(xì)胞因子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞增多、IgE合成和粘液產(chǎn)生，從而增強(qiáng)對(duì)抗蠕蟲和其它腸寄生蟲的保護(hù)作用。
b).抗微生物效果雖然在營(yíng)養(yǎng)、疫苗、化學(xué)物質(zhì)和抗生素方面有所發(fā)展，但微生物感染仍是世界范圍內(nèi)影響經(jīng)濟(jì)和健康的問題。針對(duì)微生物病原體的免疫反應(yīng)包括二種識(shí)別系統(tǒng)。第一衛(wèi)隊(duì)是先天性免疫，如果需要的話，隨后發(fā)生適應(yīng)性反應(yīng)(細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)和抗體反應(yīng))。通過用包括保泰松、氟尼辛葡甲胺(meglumine)和酮洛芬或靜脈內(nèi)DMSO在內(nèi)的抗炎劑減少炎癥，流向受染組織的血流得到改善，進(jìn)而促進(jìn)先天性免疫幫助克服感染。此過程可以通過使用血管舒張藥如乙?；骸⒈窖跗S胺、異克舒令(esoxsuprine)、己酮可可堿(pentoxifylline)、阿斯匹林和肝素來得到促進(jìn)。備選方法是施用已知炎性細(xì)胞因子如IL-1、TNF-α、IL-6和IL-8的可溶性細(xì)胞因子受體。
4).應(yīng)激降低工業(yè)化環(huán)境中的許多條件有助于減少飼料攝入、降低生長(zhǎng)速率并使屠宰后畜體(carcasss)質(zhì)量下降。盡管傾注廣泛的研究努力要評(píng)價(jià)應(yīng)激物影響許多物種性能的機(jī)理，但家畜產(chǎn)業(yè)中的長(zhǎng)期問題未解決。應(yīng)激，特別是早期和持續(xù)的應(yīng)激，導(dǎo)致免疫功能障礙、下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(HPA)活性和腦中化學(xué)物質(zhì)失衡。神經(jīng)和免疫系統(tǒng)是整體性的，形成獨(dú)立的神經(jīng)免疫網(wǎng)絡(luò)。抑郁、生理或情緒應(yīng)激可激活那些改變免疫功能的內(nèi)分泌系統(tǒng)，進(jìn)而引起腦內(nèi)生理和化學(xué)改變。同樣，感染形式的免疫應(yīng)激通過細(xì)胞因子和其它可溶性介質(zhì)激活神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)以誘導(dǎo)應(yīng)激，進(jìn)而損害生殖力(productivity)。細(xì)胞因子介導(dǎo)免疫、內(nèi)分泌和中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間的相互作用。以前認(rèn)為是免疫抑制，但現(xiàn)在有確切證據(jù)表明應(yīng)激誘導(dǎo)TH1/TH2免疫反應(yīng)偏移，造成免疫調(diào)節(jié)異常而不是免疫抑制。細(xì)胞因子影響體內(nèi)平衡途徑的潛能導(dǎo)致產(chǎn)生評(píng)價(jià)免疫系統(tǒng)活性的需要。
發(fā)明概述在最廣義方面，本發(fā)明提供一種改善動(dòng)物生長(zhǎng)性能的方法，所述方法包括給需要的動(dòng)物施用生長(zhǎng)促進(jìn)量的一或多種抗炎劑的步驟。
該抗炎劑優(yōu)選增強(qiáng)或補(bǔ)充動(dòng)物自身的抗炎系統(tǒng)。
本發(fā)明還提供一種改善動(dòng)物的生長(zhǎng)性能的方法，所述方法包括給需要的動(dòng)物施用增加或補(bǔ)充內(nèi)源性抗炎劑水平的化合物或組合物的步驟，其中相對(duì)于未施用該化合物或組合物的動(dòng)物的生長(zhǎng)性能而言，提高了生長(zhǎng)性能。
優(yōu)選，該化合物或組合物在施用生長(zhǎng)促進(jìn)量的一或多種抗炎劑之前、一起或之后施用的。
更優(yōu)選該化合物或組合物包含促炎細(xì)胞因子受體拮抗劑。還更優(yōu)選，該化合物或組合物包含TNF-α受體、GM-CSF受體、IL-6受體、IL-1受體、IL-4受體或IL-8受體的拮抗劑。最優(yōu)選該化合物或組合物包含IL-10、1，8-萘磺內(nèi)酰胺(1，8-napthosultam)取代的化合物或喹喔啉(quinoxaline)化合物。
或者，該化合物或組合物通過減少促炎細(xì)胞因子量來增加內(nèi)源性抗炎劑水平。因此，該化合物或組合物包含能增加促炎細(xì)胞因子的循環(huán)、可溶性細(xì)胞因子受體的量的試劑。
本發(fā)明還提供一種改善動(dòng)物的生長(zhǎng)性能的方法，所述方法包括給需要的動(dòng)物施用組合物，其包含與抗生素協(xié)同的抗炎劑，并且其任選與可藥用載體、助劑或賦形劑組合，其中該組合物實(shí)現(xiàn)協(xié)同生長(zhǎng)促進(jìn)效果。
優(yōu)選，該抗炎劑是具有抗炎效果的的任何可溶性細(xì)胞因子受體、細(xì)胞因子受體拮抗劑、細(xì)胞因子抑制因子或其生物活性片段或者選自雙氯酚酸(diclofenac)、二氟尼柳(diflunisal)、依托度酸(etodolac)、氟尼辛(flunix)、非諾洛芬(fenoprofen)、夫洛非寧(floctafenine)、氟比洛芬(flurbiprofen)、布洛芬(ibuprofen)、吲哚美辛(indomethacin)、酮洛芬(ketoprofen)、甲氯芬那酸(meclofenamate)、甲芬那酸(mefenamic acid)、美洛昔康(meloxicam)、萘丁美酮(nabumetone)、萘普生(naproxen)、奧沙普嗪(oxaprozin)、保泰松(phenylbutazone)、吡羅昔康(piroxicam)、舒林酸(sulindac)、替諾昔康(tenoxicam)、噻洛芬酸(tiaprofenic)和托美汀(tolmetin)的抗炎劑。優(yōu)選該可溶性細(xì)胞因子受體或其生物活性片段選自能改善動(dòng)物的生長(zhǎng)性能的TNFα受體、IL-6受體、IL-1受體、IL-4受體和IL-8受體或其組合。更優(yōu)選，可溶性細(xì)胞因子受體或其生物活性片段為IL-1受體。
優(yōu)選，該細(xì)胞因子受體拮抗劑或其生物活性片段選自IL-1ra、IL-6ra、IL-8ra和TNF-αra。更優(yōu)選，該細(xì)胞因子受體拮抗劑或其生物活性片段是IL-1ra。
優(yōu)選，該細(xì)胞因子抑制因子或其生物活性片段選自TNF阻斷因子和TNF-α抑制劑。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，通過將一或多種抗炎劑與一或多種可藥用載體、助劑或賦形劑組合而將本發(fā)明的抗炎劑配制成促進(jìn)生長(zhǎng)的組合物。更優(yōu)選，通過將一或多種可溶性細(xì)胞因子受體、細(xì)胞因子受體拮抗劑、細(xì)胞因子抑制因子或其生物活性片段或者一或多種其它抗炎劑或可藥用載體、助劑或賦形劑組合而配制成促進(jìn)生長(zhǎng)的組合物?？梢允褂萌魏我阎目伤幱幂d體、助劑或賦形劑，只要它不會(huì)對(duì)抗炎劑的生長(zhǎng)促進(jìn)效果有不利影響。
因此，在第二方面本發(fā)明提供一種促進(jìn)生長(zhǎng)的組合物，其包含一或多種抗炎劑及一或多種可藥用載體、助劑或賦形劑。優(yōu)選，該組合物包含選自下組的抗炎劑可溶性細(xì)胞因子受體、細(xì)胞因子受體拮抗劑、細(xì)胞因子抑制因子或其生物活性片段、雙氯酚酸、二氟尼柳、依托度酸、氟尼辛、非諾洛芬、夫洛非寧、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、甲氯芬那酸、甲芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮、萘普生、奧沙普嗪、保泰松、吡羅昔康、舒林酸、替諾昔康、噻洛芬酸和托美汀。
更優(yōu)選，該組合物包含一或多種可溶性細(xì)胞因子受體、細(xì)胞因子受體拮抗劑、細(xì)胞因子抑制因子或其生物活性片段和一或多種不同的可溶性細(xì)胞因子受體、細(xì)胞因子受體拮抗劑、細(xì)胞因子抑制因子或其生物活性片段或一或多種抗炎劑。最優(yōu)選，該組合物包含一種可溶性細(xì)胞因子受體、細(xì)胞因子受體拮抗劑、細(xì)胞因子抑制因子或其生物活性片段和一種不同的抗炎劑或者可藥用載體、助劑或賦形劑。
包含抗生素的組合物有助于限制動(dòng)物的微生物載量，從而幫助抗抗炎劑改善動(dòng)物的生長(zhǎng)性能。特別優(yōu)選的抗生素是已經(jīng)用于常規(guī)動(dòng)物生產(chǎn)環(huán)境的抗生素。但具體地，優(yōu)選抗生素選自阿莫西林(amoxycylin)、氨芐西林(ampicillin)、安普霉素(apramycin)、阿伏帕星(avoparcin)、桿菌肽(bacitracin)、苯乙芐胺(benethamine)、芐星青霉素(benzathine)、頭孢噻呋(ceftiofur)、頭孢呋辛(cefuroxime)、頭孢洛寧(cephalonium)、金霉素(chlortetracyclin)、氯唑西林(cloxacilline)、二甲硝咪唑(dimetridazole)、紅霉素(erythromycin)、吉他霉素(ketasamycin)、拉沙洛西(lasalocid)、林可霉素(lincomycin)、莫能霉素(monensin)、甲基鹽霉素(narasin)、新霉素(neomycin)、竹桃霉素(oleandomycin)、土霉素(oxytetracycline)、奧拉喹多(olaquindox)、青霉素、青霉素G、普魯卡因(procaine)、壯觀霉素(spectinomycin)、鏈霉素、四環(huán)素、替米考星(tilmicosin)、甲氧芐啶(trimethoprim)、泰洛星(tylosin)、沙利霉素(salinomycin)、磺胺(包括和二氨藜蘆啶(diaveridine))和維吉霉素(virginiamycin)或其組合。最優(yōu)選抗生素為阿莫西林、林可霉素或壯觀霉素。
根據(jù)抗炎劑的活性、給藥方式、動(dòng)物的年齡和體重，可以使用不同劑量的抗炎劑。但在一些環(huán)境下，更高或更低的劑量可能是合適的。給藥可以通過單次施用單個(gè)劑量單元或者多個(gè)較小劑量單元的形式來完成，還可以通過在具體時(shí)間間隔多次施用細(xì)分的劑量來完成。
但是，可以理解，任何具體動(dòng)物的特定劑量水平取決于多種因素，包括所用的特定抗炎劑的活性、年齡、體重、總體健康水平、性別、飲食、給藥時(shí)間和給藥途徑、排泄速率和抗炎劑或抗生素組合。但是，通常優(yōu)選的給藥途徑選自口服、局部給藥和腸胃外給藥。
腸胃外給藥包括皮下注射、氣溶膠、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、鞘內(nèi)注射、輸液技術(shù)或被囊化細(xì)胞。
本發(fā)明抗炎劑或組合物還可作為動(dòng)物用水和/或飼料的添加劑施用。
動(dòng)物的生長(zhǎng)性能可以由任何已知的方法確定，包括生長(zhǎng)速率增加、飼料利用率增加、最終增重、清理后(dressed)增重和脂肪含量降低。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到，動(dòng)物生長(zhǎng)性能的改善可以是免疫增強(qiáng)、抗寄生蟲或抗微生物效果、抗炎效果或應(yīng)激降低導(dǎo)致的。更優(yōu)選，免疫增強(qiáng)可以由TH1/TH2免疫反應(yīng)、抗體同種型轉(zhuǎn)換、血細(xì)胞生成、免疫功能改善、粘膜免疫、對(duì)體內(nèi)平衡過程如食欲、內(nèi)分泌或神經(jīng)-內(nèi)分泌過程的有益效果導(dǎo)致。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到，這里公開的方法和組合物可以用于任何期望改善生長(zhǎng)性能的動(dòng)物。但是，本發(fā)明特別用于食用動(dòng)物，即通常在農(nóng)場(chǎng)飼養(yǎng)以進(jìn)行肉類生產(chǎn)的動(dòng)物。優(yōu)選，動(dòng)物為高等偶蹄動(dòng)物(Artiodactyl)或鳥類。偶蹄動(dòng)物包括牛、豬、羊、駱駝、山羊和馬。鳥類包括小雞、火雞、鵝和鴨。更優(yōu)選，本發(fā)明涉及選自牛、豬、羊、駱駝、山羊、馬和小雞的動(dòng)物。最優(yōu)選動(dòng)物為牛、豬或羊。
在第三方面，抗炎劑作為編碼該抗炎劑的核酸分子施用，因而該核酸分子在動(dòng)物中表達(dá)時(shí)產(chǎn)生生長(zhǎng)促進(jìn)量的抗炎劑。因此，本發(fā)明提供一種改善動(dòng)物的生長(zhǎng)性能的方法，所述方法包括給需要的動(dòng)物施用編碼一或多種抗炎劑的核酸分子的步驟，其中該核酸分子的表達(dá)產(chǎn)生有效的生長(zhǎng)促進(jìn)量的一或多種抗炎劑。
該核酸分子可以是DNA、cDNA、RNA或它們的雜合分子?？梢郧宄乩斫?，術(shù)語核酸分子包括全長(zhǎng)分子或其生物活性片段。
優(yōu)選該核酸分子為編碼可溶性細(xì)胞因子受體、細(xì)胞因子受體拮抗劑、細(xì)胞因子抑制因子或其生物活性片段的DNA分子。最優(yōu)選，該DNA編碼選自TNFα受體、IL-6受體、IL-1受體、IL-4受體和IL-8受體或其組合的細(xì)胞因子受體或者選自IL-1ra、IL-6ra和TNF-αra的細(xì)胞因子受體拮抗劑。
該核酸分子可整合至動(dòng)物基因組，或可作為染色體外元件存在。
該核酸分子可以通過已知的方法施用；但是，優(yōu)選皮下、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射或者作為氣溶膠施用。
核酸的施用量取決于給藥途徑和部位以及由該核酸分子編碼的具體細(xì)胞因子受體、細(xì)胞因子受體拮抗劑、細(xì)胞因子抑制因子或其生物活性片段。如這里所述，引入200μg的編碼細(xì)胞因子受體、細(xì)胞因子受體拮抗劑、細(xì)胞因子抑制因子或其生物活性片段的核酸分子足以改善動(dòng)物的生長(zhǎng)性能。因此，優(yōu)選將約200μg-1,000μg的編碼細(xì)胞因子受體、細(xì)胞因子受體拮抗劑、細(xì)胞因子抑制因子或其生物活性片段的核酸分子引入動(dòng)物。
該核酸分子還可以在載體，例如豬腺病毒載體中遞送。還可以作為裸DNA遞送。
因此，在第四方面，本發(fā)明提供一種用于體內(nèi)遞送有效量的細(xì)胞因子受體、細(xì)胞因子受體拮抗劑、細(xì)胞因子抑制因子或其生物活性片段的構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含a)一種編碼細(xì)胞因子受體、細(xì)胞因子受體拮抗劑、細(xì)胞因子抑制因子或其生物活性片段的核苷酸序列；b)一種包含調(diào)控序列的載體，其中該調(diào)控序列能調(diào)控a)的核苷酸序列的表達(dá)，從而產(chǎn)生細(xì)胞因子受體、細(xì)胞因子受體拮抗劑、細(xì)胞因子抑制因子或其生物活性片段，進(jìn)而改善動(dòng)物的生長(zhǎng)性能。
修飾和變體形式的構(gòu)建體可以通過化學(xué)或酶處理在體外產(chǎn)生，或者通過重組DNA技術(shù)在體內(nèi)產(chǎn)生。這些構(gòu)建體可以不同于公開的構(gòu)建體，例如區(qū)別在于一或多種核苷酸取代、缺失或插入，但基本上保持本發(fā)明構(gòu)建體或核酸分子的生物活性。
本發(fā)明還提供試劑盒。因此，在第五方面，本發(fā)明提供一種用于改善動(dòng)物的生長(zhǎng)性能的試劑盒，所述試劑盒包含a).一或多種抗炎劑；b).遞送該抗炎劑的裝置；和c).本發(fā)明方法的使用說明。
適宜的緩沖劑和離子鹽也可以包括在試劑盒中。


圖1表示在飼料內(nèi)含或不含抗生素的情況下，用IL-1ra或鹽水處理的豬在斷奶期的最初4周的增重速率(柱表示組平均值+SEM)。
圖2表示在飼料內(nèi)含或不含抗生素的情況下，用IL-1ra或鹽水處理的豬在斷奶期第5或6周的增重速率(柱表示組平均值+SEM)。
圖3表示在飼料內(nèi)含或不含抗生素的情況下，用IL-1ra或鹽水處理的豬在斷奶期(D7-D42)和生長(zhǎng)期(D79和D93)的增重速率(柱表示組平均值+SEM)。
圖4表示在飼料內(nèi)含或不含抗生素的情況下，用IL-1ra或鹽水處理的豬在結(jié)束期(finisher phase)的增重速率。
圖5表示在斷奶期在存在或不存在飼料內(nèi)藥物的情況下，用鹽水或IL-1ra處理的豬屠宰時(shí)的平均重量。
圖6表示在斷奶期在存在或不存在飼料內(nèi)藥物的情況下，用IL-1ra或鹽水處理的豬的平均清理后重量(溫尸體重量)。
圖7表示在斷奶期在存在或不存在飼料內(nèi)藥物的情況下，用鹽水或IL-1ra處理的豬的飼料轉(zhuǎn)化率。計(jì)算的是結(jié)束期(第93天-第133天)的飼料轉(zhuǎn)化率。
圖8表示用IL-1ra或鹽水處理并被供給0、低水平和正常水平的抗生素藥物的豬在斷奶期結(jié)束時(shí)的平均重量。
圖9表示用IL-1ra或鹽水處理并被供給0、低水平和正常水平的抗生素藥物的豬在斷奶期間有關(guān)體重?fù)p失發(fā)生率和死亡率的產(chǎn)量損失。
圖10表示用IL-1ra或鹽水處理并被供給0、低水平和正常水平的抗生素藥物的豬在斷奶期結(jié)束時(shí)的總組重。
圖11表示用IL-1ra或鹽水處理并被供給0、低水平和正常水平的抗生素藥物的豬在生長(zhǎng)期結(jié)束時(shí)的平均重量。
圖12表示用IL-1ra或鹽水處理并被供給0、低水平和正常水平的抗生素藥物的豬在結(jié)束期結(jié)束時(shí)的平均重量。
圖13表示用IL-1ra或鹽水處理并被供給0、低水平和正常水平的抗生素藥物的豬在屠宰時(shí)的平均P2背膘(backfat)測(cè)量。
圖14表示在最初用大腸桿菌攻擊后從用鹽水、IL-1ra或安普霉素(Apralan)處理5天的豬收集的糞便中培養(yǎng)的大腸桿菌。數(shù)據(jù)點(diǎn)表示組平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖15表示用IL-1ra或安普霉素處理的豬與鹽水對(duì)照組相比，在大腸桿菌攻擊后5天的總糞便培養(yǎng)物得分減小的百分率。
圖16表示被大腸桿菌攻擊并經(jīng)IL-1ra、鹽水或安普霉素處理的豬在5天中的腹瀉和濕糞便記錄。柱表示各組的總記錄；任何組的最大記錄為40。
圖17表示與鹽水對(duì)照組相比，用IL-1ra或安普霉素處理的豬中大腸桿菌感染的臨床癥狀(糞便狀況)的降低百分率。
圖18表示用IL-1ra、鹽水或安普霉素處理的豬在死后沿胃腸道不同區(qū)域所得樣品的大腸桿菌培養(yǎng)物得分。SI指小腸。柱表示組平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖19表示與鹽水處理的對(duì)照組相比，用IL-1ra或安普霉素處理的豬在死后的大腸桿菌培養(yǎng)物得分的減小百分率。
圖20表示用IL-1ra、鹽水或安普霉素處理的豬在死后胃腸道的所有區(qū)域的總大腸桿菌培養(yǎng)物得分。柱表示組平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖21表示與鹽水處理的對(duì)照組相比，用IL-1ra或安普霉素處理的豬在死后腸中存在的總大腸桿菌水平的減小百分率。
圖22表示用IL-1ra、鹽水或安普霉素處理的豬在死后前腸和后腸中的大腸桿菌培養(yǎng)物得分。柱表示組平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖23表示與鹽水對(duì)照組相比，用IL-1ra或安普霉素處理的豬在死后前腸和后腸區(qū)域中得到的大腸桿菌培養(yǎng)物得分的減小百分率。
圖24表示用IL-1ra或鹽水處理的豬在死后沿胃腸道不同區(qū)域所取樣品的螺旋體(spirochaete)培養(yǎng)得分。柱表示組平均值。
圖25表示與鹽水對(duì)照組相比用IL-1ra處理的豬在死后的螺旋菌培養(yǎng)物得分的減小百分率。
圖26表示用鹽水或IL-1ra處理并受豬痢疾攻擊的豬在死后的糞便狀況。
圖27表示用IL-1ra或鹽水處理并受豬痢疾攻擊的豬的外周血液中促炎細(xì)胞因子TNFα的mRNA的表達(dá)。
圖28表示用IL-1ra或鹽水處理并受豬痢疾攻擊的豬的外周血液中促炎細(xì)胞因子IL-8的mRNA的表達(dá)。
圖29表示用IL-1ra或鹽水處理并受豬痢疾攻擊的豬的外周血液中促炎細(xì)胞因子IL-1的mRNA的表達(dá)。
圖30表示用重組IL-1ra、質(zhì)粒IL-1ra、NSAID氟尼辛、質(zhì)粒對(duì)照或鹽水對(duì)照處理，然后用App攻擊的豬在2周中的平均重量增量。柱表示組平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖31表示用鹽水、氟尼辛、重組IL-1ra、質(zhì)粒對(duì)照或質(zhì)粒IL-1ra處理的豬在用App攻擊的14天期間增加的總重。柱表示組平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖32表示用鹽水、氟尼辛、重組IL-1ra、質(zhì)粒對(duì)照或質(zhì)粒IL-1ra處理的豬在用App攻擊的14天期間的日增加速率。柱表示組平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖33表示與鹽水對(duì)照組相比，用氟尼辛或IL-1ra處理后用App攻擊14天的豬的增重變化百分率。
圖34表示與鹽水對(duì)照組和質(zhì)粒對(duì)照組相比，用IL-1ra質(zhì)粒處理后用App攻擊14天的豬的增重變化百分率。
圖35表示用鹽水、氟尼辛、重組IL-1ra、質(zhì)粒IL-1ra或質(zhì)粒對(duì)照處理后用App攻擊的豬的血清中TNFα蛋白的水平。柱表示組平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖36表示用鹽水、氟尼辛、重組IL-1ra、質(zhì)粒對(duì)照或質(zhì)粒IL-1ra處理并用App攻擊的豬的外周血液中促炎細(xì)胞因子IL-6的mRNA的表達(dá)。NS指該時(shí)間點(diǎn)無樣品。柱表示組平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖37表示用鹽水、氟尼辛、重組IL-1ra、質(zhì)粒對(duì)照或質(zhì)粒IL-1ra處理并用App攻擊的豬在攻擊的第一周的30次觀察中，App疾病的臨床癥狀得分。柱表示組平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。最大可能得分是240。
圖38表示與相關(guān)的對(duì)照組相比，用氟尼辛、重組IL-1ra或質(zhì)粒IL-1ra處理并用App攻擊的豬的疾病臨床癥狀的降低百分率。
圖39表示用鹽水、氟尼辛、重組IL-1ra、質(zhì)粒對(duì)照或質(zhì)粒IL-1ra處理并用App攻擊的豬在驗(yàn)尸時(shí)以胸膜炎得分(0-5)表示的胸膜炎程度。柱表示組平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖40表示與相關(guān)的對(duì)照組相比，用氟尼辛、重組IL-1ra或質(zhì)粒IL-1ra處理并用App攻擊的豬的胸膜炎減少百分率。
圖41表示用鹽水、氟尼辛、重組IL-1ra、質(zhì)粒對(duì)照或質(zhì)粒IL-1ra處理并用App攻擊的豬在驗(yàn)尸時(shí)以受染肺的重量百分率表示的胸膜肺炎程度。柱表示組平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖42表示與相關(guān)的對(duì)照組相比，用氟尼辛、重組IL-1ra或質(zhì)粒IL-1ra處理并用App攻擊的豬的受影響的肺質(zhì)量的減小百分率。
圖43表示用鹽水、低或高劑量的IL-1ra或IL-1ra+IL-4(syn)處理的豬在App攻擊的最初10天期間的日增重速率。柱表示組平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖44表示用鹽水、低或高劑量的IL-1ra或IL-1ra+IL-4(syn)處理的豬在App攻擊的第二個(gè)10天期間的日增重速率。柱表示組平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖45表示用鹽水、低或高劑量的IL-1ra或IL-1ra+IL-4(syn)處理的豬在App攻擊的總共21天期間總共增加的重量。柱表示組平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖46表示與鹽水處理的對(duì)照組相比，用低和高劑量的IL-1ra或IL-1ra+IL-4(syn)預(yù)防性處理的豬在App攻擊21天期間增重的改善百分率。
圖47表示用鹽水、低或高劑量的IL-1ra或IL-1ra+IL-4(syn)處理的豬在App攻擊的總共21天期間以總肺重百分率表示的受App損害影響的肺的數(shù)量。柱表示組平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖48表示用鹽水、低或高劑量的IL-1ra或IL-1ra+IL-4(syn)處理的豬在App攻擊的總共21天期間的肺的胸膜炎得分。柱表示組平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖49表示用鹽水、低或高劑量的IL-1ra或IL-1ra+IL-4(syn)處理的豬在App攻擊的總共21天期間在死亡后所取的肺組織中促炎細(xì)胞因子，IL-8的mRNA的表達(dá)。柱表示組平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖50表示用鹽水、低或高劑量的IL-1ra或IL-1ra+IL-4(syn)處理的豬在App攻擊的總共21天期間在死亡后所取的肺組織中促炎細(xì)胞因子TNFα的mRNA的表達(dá)。柱表示組平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖51表示用App攻擊后，用高或低劑量的IL-1ra、用鹽水或用速解靈(excenel)處理的豬在攻擊后第2周的增重。柱表示組平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖52表示用App攻擊后，用高或低劑量的IL-1ra、用鹽水或用速解靈處理的豬的飼料攝入。柱表示組平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖53表示用App攻擊后，用高或低劑量的IL-1ra、用鹽水或用速解靈處理的豬的飼料轉(zhuǎn)化率。柱表示組平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖54表示用App攻擊后，用高或低劑量的IL-1ra、用鹽水或用速解靈處理的豬對(duì)被殺死的App的刺激發(fā)生的反應(yīng)中淋巴細(xì)胞的增殖能力。柱表示組平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖55表示用App攻擊后，用高或低劑量的IL-1ra、用鹽水或用速解靈處理的豬在死后在肺中發(fā)現(xiàn)的促炎細(xì)胞因子IL-8的mRNA水平。柱表示組平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
發(fā)明詳述除非另外指出，本發(fā)明的實(shí)施利用本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)的分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。這些技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的，并在文獻(xiàn)中作了充分說明。例如參見Sambrook和Russell“Molecular CloningA Laboratory Manual”(2001)(Green Publishing，New York)；CloningAPractical Approach，″Volumes I and II(D.N.Glover，ed.，1985)(GreenPublishing，New York)；″Oligonucleotide Synthesis″(M.J.Gait，ed.，1984)；″Nucleic Acid Hybridisation″(B.D.Hames & S.J.Higgins，eds.，1985)；“AntibodiesA Laboratory Manual”(Harlow & Lane，eds.，1988)；″Transcriptionand Translation″(B.D.Hames & S.J.Higgins，eds.，1984)；″Animal CellCulture″(R.I.Freshney，ed.，1986)；″Immobilised Cell and Enzymes″(IRL Press，1986)；B.Perbal，″A Practical Guide to Molecular Cloning″(1984)，andSambrook等，″Molecular Cloninga Laboratory Manual″(1989).Ausubel，F(xiàn)等，1989-1999，“Current Protocols in Molecular Biology”(Green Publishing，New York)。
在描述本發(fā)明的方法和組合物之前，應(yīng)理解本發(fā)明不限于所述的特定材料和方法，因?yàn)檫@些是可以變化的。還應(yīng)理解，這里所用的技術(shù)僅用于描述具體實(shí)施方案，而不意在限定本發(fā)明的范圍，該范圍僅由所附的權(quán)利要求限定。必須注意到這里和所附的權(quán)利要求中所用的單數(shù)形式“一種”和“該”包括復(fù)數(shù)含義，除非上下文清楚地表明其它情況。因此，例如“可溶性細(xì)胞因子受體”包括多種這類細(xì)胞因子受體，而“抗生素”指一或多種抗生素和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等同物等等。除非另外定義，這里所用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員常規(guī)理解的含義相同的含義。雖然與這里所述的材料和方法類似或等同的任何材料和方法可以用于實(shí)施和試驗(yàn)本發(fā)明，但現(xiàn)在描述優(yōu)選的材料和方法。
這里提及的所有出版物被引用以描述和公開該出版物中報(bào)道的并可以用于本發(fā)明的方案、試劑和載體。不應(yīng)該將此理解為由于先前的發(fā)明而認(rèn)為本發(fā)明不被賦予先于這些內(nèi)容的權(quán)利。
應(yīng)該理解，本發(fā)明的方法和組合物用于改善動(dòng)物的“生長(zhǎng)性能”。術(shù)語“生長(zhǎng)性能”在本領(lǐng)域已知指動(dòng)物的生長(zhǎng)速率和飼料利用率的標(biāo)準(zhǔn)，還指動(dòng)物的最終重量，和動(dòng)物的清理后重量與尸體的脂肪含量。動(dòng)物的“生長(zhǎng)速率”是動(dòng)物活體的單位增重速率，而“飼料利用率”是動(dòng)物活體每單位增重所需的飼料量。動(dòng)物的“最終重量”是在指定年齡屠宰的動(dòng)物的重量，而“清理后重量”是已除去內(nèi)臟、腳、豬腳或蹄的尸體的重量?！爸竞俊笔钦砗笫w的脂肪量。生長(zhǎng)速率、飼料利用率、最終重量和清理后重量以及尸體脂肪含量的標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定方法是本領(lǐng)域已知的。例如參見Manipulating Pig ProductionVI，VII & VIII.1997，1999 & 2001，Ed.P.D.Cranwell，Australian Pig ScienceAssociation，Werribee，Victoria，Australia。隨時(shí)間連續(xù)測(cè)定活體重量得到生長(zhǎng)速率。隨時(shí)間連續(xù)測(cè)定飼料消失和活體重量得到飼料利用率。尸體脂肪含量一般通過測(cè)定在P2位置的以毫米為單位的背膘厚度來推定。因此，在本發(fā)明中術(shù)語“生長(zhǎng)性能”意指動(dòng)物的生長(zhǎng)速率、飼料利用率、最終或清理后重量和尸體的脂肪含量中的一或多種標(biāo)準(zhǔn)的改善。
這里所用的術(shù)語“動(dòng)物”意指任何需要增強(qiáng)生長(zhǎng)性能的動(dòng)物。例如，哺乳動(dòng)物偶蹄目或鳥類鳥綱所包括的動(dòng)物。
偶蹄動(dòng)物包括約150種活物種，分成9個(gè)科豬(Suidae)、美洲野豬(Tayassuidae)、河馬(hippopotamidae)、駱駝(Camelidae)、鼷鹿(Tragulidae)、長(zhǎng)頸鹿和霍加皮(Giraffidae)、鹿(Cervidae)、叉角羚(Antilocapridae)和牛、羊、山羊與羚羊(Bovidae)。許多這些動(dòng)物在許多國家用作食用動(dòng)物。更重要的是，關(guān)于本發(fā)明，許多經(jīng)濟(jì)上重要的動(dòng)物如山羊、羊、牛和豬具有非常類似的生物學(xué)，并共享高度基因組同源性。更重要的是，已知一些動(dòng)物如山羊和羊與馬和驢可以進(jìn)行種間交配。
這里所用的術(shù)語“鳥”和“鳥類”意指包括所有的鳥類，包括但不限于小雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉和雉雞，它們可以工業(yè)化飼養(yǎng)用于產(chǎn)蛋或肉。此術(shù)語還包括雄性和雌性的任何鳥類物種。因此，術(shù)語“鳥”和“鳥類”具體包括小雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉和雉雞的母雞、公雞和公鴨(drake)。優(yōu)選小雞和火雞。
所有偶蹄動(dòng)物具有類似的包括細(xì)胞因子系統(tǒng)的炎性系統(tǒng)，因?yàn)樗鼈兙哂欣绨捉樗?，GM-CSF、干擾素α、β和γ以及它們各自的受體。在大部分的物種中，編碼這些細(xì)胞因子的基團(tuán)定位在一些染色體的特定區(qū)域。例如，在人當(dāng)中，白介素5基因定位在染色體5q23-31的與編碼GM-CSF、M-CSF、IL-3和IL-4的基因相同的區(qū)域。更重要的是，許多細(xì)胞因子和它們的受體在不同的物種之間具有高度氨基酸序列同源性。例如，本領(lǐng)域已知豬與牛、綿羊(ovine)和馬等動(dòng)物的白介素5共享多達(dá)90％的氨基酸(例如見Sylvin等(2000)，Immunogenetics，5159-64)。實(shí)際上，即使象小鼠和人這樣有明顯區(qū)別的物種也共享多達(dá)70％的氨基酸序列同一性(例如參見Dictionary ofCytokines(1995)，Horst Ibelgaufts，VCH Publishers，Weinheim)。且已知人IL-10與牛、鼠和綿羊IL-10具有明顯程度的序列同源性(Dutia等，(1994)Gene；149393-4)。
本領(lǐng)域還已知許多細(xì)胞因子具有物種交叉反應(yīng)性。例如，IL-4具有一定的交叉物種反應(yīng)性，而IL-5具有高水平的交叉物種反應(yīng)性，Dictionary ofCytokines(1995)，Horst Ibelgaufts，VCH Publishers，Weinheim。但是，應(yīng)該指出現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)中所述的交叉反應(yīng)性涉及體外試驗(yàn)和一些體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，但不涉及生長(zhǎng)性能。
還已知細(xì)胞因子以刺激或抑制方式調(diào)節(jié)細(xì)胞因子受體的表達(dá)，借此通過其它細(xì)胞因子來調(diào)控細(xì)胞因子的生物活性。一些細(xì)胞因子共享共同的可能具有調(diào)控效果的受體亞基。例如，GM-CSF受體表現(xiàn)出與其它造血生長(zhǎng)因子的受體(包括IL-2-β、IL-3、IL-6、IL-7、Epo和催乳素受體)的顯著同源性(例如見Cytokines Online Pathfinder Encyclopaedia-www.copewithCytokines.de)。還已知IL-3能上調(diào)小鼠巨噬細(xì)胞的GM-CSF受體表達(dá)，IL-3也上調(diào)節(jié)人和小鼠骨髓細(xì)胞的IL-1受體表達(dá)，IL-4上調(diào)IL-11型受體表達(dá)并下調(diào)IL-2受體表達(dá)。IL-7上調(diào)IL-4受體表達(dá)，而TNFα上調(diào)IL-3和GM-CSF受體表達(dá)(Dictionary of Cytokines(1995)，Horst Ibelgaufts，VCH Publishers，Weinheim)。
與偶蹄動(dòng)物類似，鳥類也具有共同的細(xì)胞因子系統(tǒng)，包括白介素。因此，這里所用的術(shù)語“鳥類細(xì)胞因子受體”或“鳥細(xì)胞因子受體”意指與鳥類物種產(chǎn)生的細(xì)胞因子相對(duì)應(yīng)的任何細(xì)胞因子受體。
由于許多食用動(dòng)物具有共同的祖先和生物學(xué)水平，許多物種如牛、羊、山羊和豬的細(xì)胞因子的高度氨基酸序列同源性和其它炎性過程，以及細(xì)胞因子的交叉物種反應(yīng)水平，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到這里公開的組合物和方法可用于所有食用動(dòng)物和所有細(xì)胞因子受體。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到這里公開的組合物和方法可以直接外推至包括本發(fā)明的其它方面。例如，提供特定細(xì)胞因子受體拮抗劑的數(shù)據(jù)；但是不應(yīng)將這些理解為限定本發(fā)明。實(shí)際上，所公開的細(xì)胞因子受體拮抗劑是特別選出以例示本發(fā)明范圍的。例如，許多細(xì)胞因子共享受體或受體亞基。例如，IL-3、IL-5和GM-CSF共享受體亞基(Dictionary ofCytokines(1995)，Horst Ibelgaufts，VCH Publishers，Weinheim)。IL-4共享IL-2和IL-7的共同亞基(Dictionary of Cytokines(1995)，Horst Ibelgaufts，VCHPublishers，Weinheim)。一些細(xì)胞因子具有類似的基因結(jié)構(gòu)，并群集至一個(gè)染色體上，例如人和小鼠的IL-3、IL-4、IL-5、GM-CSF和IL-13(Dictionaryof Cytokines(1995)，Horst Ibelgaufts，VCH Publishers，Weinheim)。
以上描述只為舉例說明本發(fā)明在所涉動(dòng)物類型方面的范圍。但是，還容易地看到術(shù)語“細(xì)胞因子受體”或“細(xì)胞因子受體拮抗劑”還應(yīng)被廣義理解，且不限于所公開的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。例如，術(shù)語“細(xì)胞因子受體”包括一或多種IL-1受體、IL-6受體、TGF-β受體、IL-11受體、IL-18受體、IL-12受體、IL-17受體、LIF受體、IFN-γ受體、IL-8受體、TNF-α受體和GM-CSF受體，為可溶形式。術(shù)語“受體拮抗劑”包括IL-1ra、IL-4ra、IL-8ra、GM-CSFra、IL-6ra或TNF-αra。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法的最初步驟包括給動(dòng)物施用生長(zhǎng)促進(jìn)量的一或多種抗炎劑。
這里所用的術(shù)語“抗炎劑”指能降低炎癥的任何化合物或組合物。例如，可以使用具有抗炎效果的可溶性細(xì)胞因子受體、細(xì)胞因子受體拮抗劑、細(xì)胞因子抑制因子或其生物活性片段?；蛘?，可以使用抗炎劑如雙氯酚酸、二氟尼柳、依托度酸、氟尼辛、非諾洛芬、夫洛非寧、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、甲氯芬那酸、甲芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮、萘普生、奧沙普嗪、保泰松、吡羅昔康、舒林酸、替諾昔康、噻洛芬酸或托美汀。還已知皮質(zhì)類固醇藥物是強(qiáng)抗炎劑，它們廣泛用于抑制免疫反應(yīng)的有害效果。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中可以使用皮質(zhì)類固醇藥物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語“抗炎劑”包括增加促炎細(xì)胞因子的可溶性受體量的任何化合物或組合物。
如上述，生長(zhǎng)性能是可以測(cè)定的；但是，生長(zhǎng)性能增加的原因是略復(fù)雜的問題。無意受任何具體理論或假設(shè)限制，本申請(qǐng)人認(rèn)為施用抗炎劑以多種補(bǔ)充方式起作用，從而導(dǎo)致改善生長(zhǎng)性能。例如，本申請(qǐng)人已發(fā)現(xiàn)通過增強(qiáng)食用動(dòng)物的免疫力，避免了原料損失(stock loss)并改善隨后的生長(zhǎng)性能。因此，本發(fā)明提供降低動(dòng)物對(duì)感染的易感性的方法。所述方法用于降低對(duì)由細(xì)菌、病毒或寄生蟲導(dǎo)致的感染的易感性。
本申請(qǐng)人還已發(fā)現(xiàn)，將一或多種抗炎劑和一或多種抗生素一起施用也可改善動(dòng)物的生長(zhǎng)性能，并減少抗生素的總用量。據(jù)信抗生素將動(dòng)物的微生物載量限制在閾值水平，從而使施用的抗炎劑能發(fā)揮對(duì)生長(zhǎng)性能的效果。
因此，本申請(qǐng)人認(rèn)為抗炎劑并非自身用作生長(zhǎng)促進(jìn)劑(雖然這是可能的)，可以理解施用抗炎劑可以通過激活能被抗炎劑激活的免疫反應(yīng)的體液和細(xì)胞武器而導(dǎo)致改善生長(zhǎng)性能。
這里所用的術(shù)語“生長(zhǎng)促進(jìn)量”意指有效導(dǎo)致上述的生長(zhǎng)性能增加的本發(fā)明抗炎劑的量。例如，增加生長(zhǎng)速率、飼料利用率、增加最終體重、增加尸體清理后重量或降低脂肪含量。
這里所用術(shù)語“給藥”指本發(fā)明組合物的遞送方式。該術(shù)語還指組合物的劑量。根據(jù)抗炎劑的活性和動(dòng)物的年齡與體重、可以改變抗炎劑的給藥方式和劑量?？梢岳斫?，任何特定動(dòng)物的特定劑量水平取決于多種因素，包括所用的特定抗炎劑的活性、年齡、體重、總體健康水平、性別、飲食、給藥時(shí)間、給藥途徑、排泄速率和抗炎劑或抗生素組合。但是，通常優(yōu)選的給藥途徑選自口服、局部給藥和腸胃外給藥。
腸胃外給藥包括皮下注射、氣溶膠、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、鞘內(nèi)注射或輸液技術(shù)和被囊化細(xì)胞。
這里所用的術(shù)語“上調(diào)”指引起蛋白或肽的生產(chǎn)、分泌或利用率增加(因此增加濃度)。因此動(dòng)物或鳥類的內(nèi)源性抗炎劑的上調(diào)方法指與未處理的動(dòng)物或鳥類相比，使動(dòng)物或鳥類的抗炎劑的產(chǎn)量、分泌或利用率增加的方法。
術(shù)語“內(nèi)源性”意指在被研究的受試者、細(xì)胞或系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)生。因此，增加抗炎劑的內(nèi)源性水平意指給動(dòng)物施用一或多種化合物以使動(dòng)物中抗炎劑的總量高于正常存在量。增加抗炎劑的內(nèi)源性水平意指給動(dòng)物施用一或多種化合物，其中該化合物增加動(dòng)物細(xì)胞或組織的抗炎劑生產(chǎn)，從而有效地增加動(dòng)物的抗炎劑總量。抗炎劑的內(nèi)源性水平還可以通過降低抗炎劑的轉(zhuǎn)化率來得以有效地增加。例如，本發(fā)明的一或多種化合物在施用于動(dòng)物時(shí)可以通過抑制蛋白水解酶的效果來降低內(nèi)源性抗炎劑的蛋白水解率。
許多物質(zhì)能刺激內(nèi)源性抗炎劑(例如細(xì)胞因子受體、IL-4和IL-16或細(xì)胞因子受體拮抗劑)的上調(diào)。例如，WO93/18783中提示IL-10上調(diào)IL-1受體拮抗劑的表達(dá)。而且，化合物如1，8-萘磺內(nèi)酰胺取代的化合物或喹喔啉化合物已知上調(diào)細(xì)胞因子受體拮抗劑如IL-8。例如參見國際專利申請(qǐng)WO99/36070和WO99/42461，它們?cè)诖吮灰米鳛閰⒖肌?br> 降低或改善促炎細(xì)胞因子如IL-1的效果的備選方法是從循環(huán)中除去這些物質(zhì)。例如，已知存在能與配體結(jié)合從而防止它們與其受體結(jié)合的因子。例如已知上文討論的TNF阻斷因子和TNF-α抑制劑與TNF結(jié)合。
術(shù)語“生物活性片段”指抗炎劑的片段，其對(duì)動(dòng)物的生物或生理效果基本上類似于衍生它的完整抗炎劑。例如，IL-1受體拮抗劑的生物活性片段可以是IL-1受體拮抗劑的具有約5個(gè)以上氨基酸殘基的任何部分，它包含生物活性部位或者保留IL-1受體拮抗劑活性。例如，當(dāng)IL-1受體拮抗劑部分保留與上述IL-1受體結(jié)合的能力時(shí)，此部分是IL-1受體拮抗劑的“生物活性片段”。通常，這種IL-1受體拮抗劑的片段是能競(jìng)爭(zhēng)性抑制IL-1與IL-1受體結(jié)合的片段。
由此可見，可以在該方法中施用足以提供一些或全部IL-1ra功能的IL-1ra的片段，或者足以提供一些或全部IL-1ra功能的任何其它分子，而不是施用IL-1ra。例如，這種片段或分子能提供一些或全部IL-1ra功能，包括阻斷IL-6和IL-8生產(chǎn)。典型地，這種片段或分子能競(jìng)爭(zhēng)性抑制IL-1ra和/或IL-1與IL-1受體結(jié)合。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括施用足以提供一些或全部IL-1ra功能的IL-1ra片段，或者足以提供一些或全部IL-1ra功能的分子。
本發(fā)明還涉及可溶性細(xì)胞因子受體、細(xì)胞因子受體拮抗劑、細(xì)胞因子抑制因子或其生物活性片段的氨基酸序列變體。例如，可將一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基加到上述可溶性細(xì)胞因子受體、細(xì)胞因子受體拮抗劑、細(xì)胞因子抑制因子或其生物活性的片段序列或其片段的N-或C末端或者內(nèi)部。上述可溶性細(xì)胞因子受體、細(xì)胞因子受體拮抗劑、細(xì)胞因子抑制因子序列或它們的片段的氨基酸序列變體，其中該序列或其片段的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基缺失，并任選被一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基取代；和以上可溶性細(xì)胞因子受體、細(xì)胞因子受體拮抗劑、細(xì)胞因子抑制因子或其生物活性片段的衍生物，其中氨基酸殘基已被共價(jià)修飾，因而所得的產(chǎn)物為非天然存在的氨基酸。而且術(shù)語“生物活性片段”包括可溶性細(xì)胞因子受體、細(xì)胞因子受體拮抗劑、細(xì)胞因子抑制因子或其生物活性片段的所有這些變體，只要該變體保留衍生它的完整可溶性細(xì)胞因子受體、細(xì)胞因子受體拮抗劑、細(xì)胞因子抑制因子或其生物活性片段的生物活性。
本文中“可藥用載體、助劑或賦形劑”是用于將抗炎劑和/或抗生素遞送至動(dòng)物的可藥用溶劑、懸浮劑或賦形劑。載體可以是液體或固體，并根據(jù)計(jì)劃的給藥方式進(jìn)行選擇。
術(shù)語“基本上同源”可以核酸和/或氨基酸序列，它意指具體受試序列，例如突變體序列，由參照序列經(jīng)一或多種取代、缺失或加入而演變，其最終效果不導(dǎo)致參照和受試序列之間的不利的功能差異。為本發(fā)明的目的，認(rèn)為具有等同生物活性和等同表達(dá)特征的序列基本上是同源的。認(rèn)為具有較小程度的同一性、相當(dāng)?shù)纳锘钚院偷韧磉_(dá)特征的序列是等同的。
“微生物的”指由細(xì)菌、真菌(例如酵母)、病毒(例如桿狀病毒)或植物表達(dá)系統(tǒng)制備的重組蛋白。作為一種產(chǎn)物，“重組微生物的”定義一種基本上不含天然內(nèi)源性物質(zhì)且不伴有相關(guān)的天然糖基化作用的動(dòng)物蛋白。大部細(xì)菌培養(yǎng)物，例如大腸桿菌中表達(dá)的蛋白沒有發(fā)生糖基化修飾；在酵母和昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的蛋白具有不同于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的糖基化模式。
“核酸分子”或“多核酸分子”指所有形式的脫氧核糖核酸和核糖核酸，即單鏈和雙鏈DNA、cDNA、mRNA等。
“雙鏈DNA分子”指在其正常、雙鏈螺旋中的聚合形式的脫氧核苷酸(腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)，該術(shù)語僅指該分子的一級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)，并不限制它的任何三級(jí)結(jié)構(gòu)。因此此術(shù)語包括可見于線性DNA分子(例如限制性片段)、病毒、質(zhì)粒和染色體中的雙鏈DNA。在討論具體雙鏈DNA分子的結(jié)構(gòu)時(shí)，本文對(duì)序列的描述可以按一般規(guī)律，僅提供沿非轉(zhuǎn)錄DNA鏈(即與mRNA具有序列同源性結(jié)構(gòu)的鏈)的5′-3′方向的序列。
如果一種DNA序列根據(jù)遺傳密碼進(jìn)行翻譯產(chǎn)生一種氨基酸序列(即該DNA序列“編碼”該氨基酸序列)，則該DNA序列“對(duì)應(yīng)”于該氨基酸序列。
如果二種DNA序列編碼相同的氨基酸序列，則一種DNA序列“對(duì)應(yīng)”于另一種DNA序列。
當(dāng)至少約85％，優(yōu)選至少約90％，最優(yōu)選至少約95％的核苷酸與確定長(zhǎng)度的DNA序列匹配時(shí)，兩種DNA序列“基本上相似”。基本上類似的序列可以用Southern雜交實(shí)驗(yàn)，在例如與具體系統(tǒng)有關(guān)的嚴(yán)謹(jǐn)條件下來鑒定。適宜雜交條件的確定在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。例如參見Sambrook等，DNACloning，vols.I，II and III.Nucleic Acid Hybridization。但是，通常核酸分子的雜交或退火的“嚴(yán)謹(jǐn)條件”是這樣的條件(1)利用低離子強(qiáng)度和高溫進(jìn)行洗滌，例如0.015M NaCl/0.0015M檸檬酸鈉/0.1％十二烷基硫酸鈉(SDS)，在50℃進(jìn)行洗滌，或者(2)在雜交期間使用變性試劑如甲酰胺(例如50％(vol/vol)甲酰胺)以及0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液，pH6.5，750mM NaCl，75mM檸檬酸鈉，42℃的條件。
另一個(gè)實(shí)例是使用50％甲酰胺、5X SSC(0.75M NaCl，0.075M檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH 6.8)、0.1％焦磷酸鈉、5 XDenhardt溶液、超聲處理的鮭精DNA(50μg/mL)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，42℃的條件，并在42℃用0.2X SSC和0.1％SDS洗滌。
DNA構(gòu)建體的“異源”區(qū)或結(jié)構(gòu)域是較大分子中在其天然狀態(tài)下不與其結(jié)合的可鑒定的DNA片段。因此，當(dāng)異源區(qū)編碼哺乳動(dòng)物基團(tuán)時(shí)，該基因側(cè)翼一般具有在來源生物基因組中并非位于所述哺乳動(dòng)物基因組DNA側(cè)翼的DNA。異源區(qū)的另一實(shí)例是一種構(gòu)建體，其中編碼序列本身不在自然中發(fā)現(xiàn)(例如一種cDNA，其中基因組編碼序列包含具有不同于天然基因的密碼子的內(nèi)含子或合成序列)。等位基因變異或天然存在的突變事件不產(chǎn)生這里定義的DNA的異源區(qū)。
“編碼序列”是符合讀框(in-frame)的密碼子序列，它對(duì)應(yīng)于或編碼蛋白或肽序列。兩種編碼序列或它們的互補(bǔ)序列編碼相同的氨基酸序列時(shí)，這兩種編碼序列彼此對(duì)應(yīng)。與適宜的調(diào)控序列結(jié)合的編碼序列可以在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯成多肽。多腺苷酸化信號(hào)和轉(zhuǎn)錄終止序列一般位于編碼序列的3′端。
“啟動(dòng)子序列”是一種能與細(xì)胞中的RNA聚合酶結(jié)合并引起下游(3′向)編碼序列轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)控區(qū)。當(dāng)結(jié)合啟動(dòng)子序列的RNA聚合酶將編碼序列轉(zhuǎn)錄成mRNA，而mRNA進(jìn)而轉(zhuǎn)錄成由該編碼序列編碼的蛋白時(shí)，編碼序列“受控于”細(xì)胞內(nèi)的啟動(dòng)子序列。
為本發(fā)明的目的，啟動(dòng)子序列3′末端被編碼序列的翻譯起始密碼子結(jié)合，并向上游延伸，以便包括引起超過背景的可檢測(cè)水平的轉(zhuǎn)錄所需的最少量堿基或元件。在啟動(dòng)子序列內(nèi)可以發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(可方便地用核酸酶S1作圖來限定)以及負(fù)責(zé)結(jié)合RNA聚合酶的蛋白結(jié)合域(共有序列)。真核生物啟動(dòng)子一般，但不總是包含“TATA”盒和“CAT”盒；原核生物啟動(dòng)子除了-10和-35共有序列之外還包含Shine-Delgarno序列。
當(dāng)將外源DNA引入細(xì)胞壁內(nèi)側(cè)時(shí)，稱細(xì)胞被這些外源DNA“轉(zhuǎn)化”。外源DNA可以整合或不整合(共價(jià)連接)至組成細(xì)胞基因組的染色體DNA。例如在原核生物和酵母中，外源DNA可以保留在附加元件如質(zhì)粒上。關(guān)于真核細(xì)胞，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是通過染色體復(fù)制而將異源DNA遺傳給子細(xì)胞的那些細(xì)胞。這種穩(wěn)定性通過真核細(xì)胞建立由包含異源DNA的子細(xì)胞群組成的細(xì)胞系或克隆的能力來證明。
DNA的“整合”可以利用微量注射法、基因槍法(boilistics)、電穿孔法或脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法將DNA傳至細(xì)胞，然后利用非同源重組來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明還包括備選方法如異源重組，和/或限制酶介導(dǎo)的整合(REMI)或轉(zhuǎn)座子，并可以認(rèn)為它們是改進(jìn)的整合方法。
“克隆”是通過有絲分裂由單一細(xì)胞或共同祖先衍生的細(xì)胞群。
因此“細(xì)胞”、“宿主細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換使用，且所有這些術(shù)語應(yīng)被理解為包括子代。“細(xì)胞系”是能在體外穩(wěn)定生長(zhǎng)許多代的原代細(xì)胞的克隆。因此，術(shù)語“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”包括原代受試細(xì)胞和由其衍生的培養(yǎng)物，而與該培養(yǎng)物傳代的次數(shù)無關(guān)。還應(yīng)該理解，由于有意或無意的突變，所有子代的DNA含量可能不完全相同。
載體用于將外源物質(zhì)，例如DNA、RNA或蛋白引入生物體。典型的載體包括重組病毒(用于DNA)和脂質(zhì)體(用于蛋白)。“DNA克隆載體”是自主復(fù)制的DNA分子，例如質(zhì)粒、噬菌體或粘粒。通常，DNA克隆載體包含一個(gè)或少數(shù)限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，在這些位點(diǎn)可以以可測(cè)定的方式切割這種DNA序列而不損失載體的基本生物功能，并可以將DNA片段剪接到所述位點(diǎn)以使其復(fù)制和克隆。克隆載體還可以包含適于在鑒定該克隆載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞時(shí)用到的標(biāo)記。
“表達(dá)載體”類似于DNA克隆載體，但包含能指導(dǎo)適宜宿主細(xì)胞進(jìn)行蛋白合成的調(diào)控序列。這一般是指與RNA聚合酶結(jié)合，并引起mRNA轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，以及指導(dǎo)mRNA翻譯成多肽的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和起始信號(hào)。將DNA序列摻入表達(dá)載體的適宜位點(diǎn)和正確讀框中，然后用該載體轉(zhuǎn)化適宜宿主細(xì)胞，能產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于該DNA序列的mRNA，并通常產(chǎn)生由該DNA序列編碼的蛋白。
為本發(fā)明的目的，啟動(dòng)子序列3′末端被編碼序列的翻譯起始密碼子結(jié)合，并向上游延伸，以便包括引起超過背景的可檢測(cè)水平的轉(zhuǎn)錄所需的最少量堿基或元件。在啟動(dòng)子序列內(nèi)可以發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(可方便地用核酸酶S1作圖來限定)以及負(fù)責(zé)結(jié)合RNA聚合酶的蛋白結(jié)合域(共有序列)。
“異源”元件是相對(duì)宿主細(xì)胞而言外來的元件，或者與宿主細(xì)胞同源但在宿主細(xì)胞中處于并非該元件通常可見的位置的元件。
DNA的“消化”是指利用僅作用于DNA的一些部位的酶催化裂解DNA。這些酶稱為限制酶或限制核酸內(nèi)切酶，而這種酶裂解的DNA內(nèi)的位點(diǎn)稱為限制位點(diǎn)。如果DNA內(nèi)存在多個(gè)限制位點(diǎn)，則消化將產(chǎn)生兩個(gè)或更多個(gè)線性DNA片段(限制性片段)。這里所用的多種限制酶是可商購的，并使用由酶制造商確定的它們的反應(yīng)條件、輔助因子和其它要求。限制酶一般由縮寫來指定，它包括一個(gè)大寫字母，其后是代表獲得每種限制酶的原始微生物的其它字母，然后是指示具體酶的數(shù)字。一般地，約1μg的DNA用在約20μl緩沖液中的約1-2單位的酶消化。關(guān)于具體限制酶的適宜緩沖液和底物量由制造商特別指明，和/或在本領(lǐng)域已知。
指定DNA片段經(jīng)限制性消化后的“回收”或“分離”通過以下方法來完成在聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳來分離稱為“限制性片段”的消化產(chǎn)物，根據(jù)相對(duì)于已知分子量的標(biāo)記DNA片段的遷移來鑒定目標(biāo)片段，切割包含目標(biāo)片段的凝膠部分，并從凝膠中分離DNA，例如電洗脫分離。
“連接”指在雙鏈DNA片段之間形成磷酸二酯鍵的過程。除非另外特別說明，連接使用已知的緩沖液和條件，采用10單位T4 DNA連接酶每0.5μg約等摩爾量的待連接DNA片段來完成。
“寡核苷酸”是通過已知方法(包括例如三酯、亞磷酰胺或膦酸酯化學(xué))，例如Engels等，Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.28716-734(1989)所述方法合成的短長(zhǎng)度、單鏈或雙鏈聚脫氧核苷酸。然后通過，例如聚丙烯酰胺凝膠電泳純化。
本文中“聚合酶鏈反應(yīng)”或“PCR”一般指目標(biāo)核苷酸序列的體外擴(kuò)增方法，可參見美國專利4,683,195。一般地，PCR法包括使用兩種能優(yōu)先與模板核酸雜交的寡核苷酸引物進(jìn)行引物延伸合成的反復(fù)循環(huán)。通常用于PCR法的引物與模板內(nèi)待擴(kuò)增核苷酸序列的末端或側(cè)翼的核苷酸序列互補(bǔ)，也可以使用與待擴(kuò)增的核苷酸序列互補(bǔ)的引物。Wang等，PCR Protocols，pp.70-75(Academic Press，1990)；Ochman等，PCR Protocols，pp.219-227；Triglia等，Nucl.Acids Res.168186(1988)。
“PCR克隆”指采用PCR法擴(kuò)增相應(yīng)細(xì)胞或組織的核酸中的具體目標(biāo)核苷酸序列，包括總基因組DNA和由細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)錄的cDNA。Frohman等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 858998-9002(1988)；Saiki等，Science 239487-492(1988)；Mullis等，Meth.Enzymol.155335-350(1987)。
“載體”或“構(gòu)建體”指質(zhì)粒或病毒或基因組整合體，其包含具有以下成分的轉(zhuǎn)錄單元(1)在基因表達(dá)中具有調(diào)控作用的一或多種遺傳元件，例如啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，(2)轉(zhuǎn)錄成mRNA并翻譯成蛋白的結(jié)構(gòu)或編碼序列，和(3)適宜的轉(zhuǎn)錄起始和終止序列。欲用于酵母或真核表達(dá)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)單元包括前導(dǎo)序列，其使宿主細(xì)胞將翻譯的蛋白分泌到細(xì)胞外?；蛘?，當(dāng)重組蛋白在無前導(dǎo)序列或轉(zhuǎn)運(yùn)序列的情況下表達(dá)時(shí)，它可以包括N-末端蛋氨酸殘基。該殘基隨后從表達(dá)的重組蛋白切出或不切出而得到最終產(chǎn)物。一般地，重組表達(dá)載體包括允許轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的復(fù)制起點(diǎn)和可選擇的標(biāo)記和來自高表達(dá)基團(tuán)的啟動(dòng)子以引起下游結(jié)構(gòu)序列的轉(zhuǎn)錄。異源結(jié)構(gòu)序列在適宜的時(shí)期與下列物質(zhì)組裝翻譯起始和終止序列，優(yōu)選能指導(dǎo)翻譯蛋白分泌至胞質(zhì)空間或細(xì)胞外介質(zhì)的前導(dǎo)序列?？蛇x地，異源序列可以編碼融合蛋白，該融合蛋白包括賦予目標(biāo)特征(例如穩(wěn)定或更簡(jiǎn)易純化所表達(dá)的重組產(chǎn)物)的N-末端識(shí)別肽。本發(fā)明優(yōu)選的重組表達(dá)載體是病毒載體(例如豬腺病毒載體)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如豬細(xì)胞)、植物細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞。
術(shù)語″免疫反應(yīng)″意指脊椎動(dòng)物受試者的免疫系統(tǒng)對(duì)抗原或抗原決定簇的任何反應(yīng)。例舉性的免疫反應(yīng)包括體液免疫反應(yīng)(例如抗原特異性抗體的產(chǎn)生)和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)(例如淋巴細(xì)胞增殖)，見下文。
術(shù)語“系統(tǒng)性免疫反應(yīng)”意指與淋巴結(jié)節(jié)、脾或腸相關(guān)的淋巴樣組織中的免疫反應(yīng)，其中產(chǎn)生免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，例如B淋巴細(xì)胞。例如，系統(tǒng)性免疫反應(yīng)可以包括產(chǎn)生血清IgG。而且，系統(tǒng)性免疫反應(yīng)指在血流中循環(huán)的抗原特異性抗體和在系統(tǒng)性隔室如脾和淋巴結(jié)的淋巴樣組織中的抗原特異性細(xì)胞。作為對(duì)照，與腸相關(guān)的淋巴樣組織(GALT)是粘膜免疫系統(tǒng)的一個(gè)組分，因?yàn)閷?duì)腸抗原/病原體作出反應(yīng)的抗原特異性細(xì)胞可在GALT中誘導(dǎo)并檢測(cè)。
由于細(xì)胞因子受體和細(xì)胞因子受體拮抗劑在所有食用動(dòng)物物種中內(nèi)源性表達(dá)，且其中的許多具有高度交叉反應(yīng)性，由此可見來自一個(gè)物種的細(xì)胞因子受體和細(xì)胞因子受體拮抗劑可以施用于不同物種的動(dòng)物，反之亦然。例如當(dāng)動(dòng)物為豬時(shí)，可以將人細(xì)胞因子受體如IL-1受體用于所公開的方法。并不要求具體細(xì)胞因子受體或細(xì)胞因子受體拮抗劑與在動(dòng)物中內(nèi)源性表達(dá)的細(xì)胞因子受體或細(xì)胞因子受體拮抗劑完全相同。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括(1)在施用一或多種抗生素之前、同時(shí)或之后施用一或多種抗炎劑；或(2)施用包含一或多種抗炎劑和一或多種抗生素的組合物。
(3)施用不含任何抗生素的一或多種抗炎劑。
本發(fā)明的抗炎劑或組合物可以通過口服、局部或腸胃外途徑，以包含無毒的常規(guī)可藥用載體、助劑和賦形劑的單位劑量配制劑來給藥。本文術(shù)語腸胃外包括皮下注射、氣溶膠、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、鞘內(nèi)、顱內(nèi)注射或輸液技術(shù)。
本發(fā)明還提供適用于本發(fā)明改善生長(zhǎng)性能的新方法的局部、口服和腸胃外用藥物配制劑。本發(fā)明的組合物可以作為片劑、水性或油性懸浮液、錠劑、糖錠、散劑、顆粒劑、乳劑、膠囊、糖漿或酏劑口服給藥?？诜M合物可以包含一或多種選自甜味劑、調(diào)味劑、著色劑和防腐劑的試劑，以產(chǎn)生藥學(xué)上優(yōu)質(zhì)可口的制劑。片劑包含與適于配制片劑的無毒可藥用載體、助劑或賦形劑混合的活性成分。
這些載體、助劑或賦形劑可以是，例如(1)惰性稀釋劑，例如碳酸鈣、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；(2)造粒和崩解劑，例如玉米淀粉或海藻酸；(3)粘合劑，例如淀粉、明膠或阿拉伯膠；和(4)潤(rùn)滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。這些片劑可以無包衣或者由已知技術(shù)包衣以延遲在胃腸道中崩解和吸收，借此提供較長(zhǎng)時(shí)間的持續(xù)作用。例如可以使用延時(shí)材料如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。還可以使用美國專利4,256,108、4,160,452和4,265,874所述的技術(shù)進(jìn)行包衣，以形成滲透性治療片劑來進(jìn)行控釋。
用于本發(fā)明的方法的抗炎劑和抗生素可以通過在體內(nèi)應(yīng)用、腸胃外注射或緩慢輸液一段時(shí)間而單獨(dú)或共同給藥。給藥可以是靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腔內(nèi)或透皮給藥。
用于腸胃外給藥的制劑包括無菌水溶液或非水性溶液、懸浮液和乳液。非水性溶劑的實(shí)例為丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油和可注射的有機(jī)酯如油酸乙酯。水性載體包括水、醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。腸胃外賦形劑包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉，乳酸化林格氏靜脈內(nèi)賦形劑包括液體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑、電解質(zhì)補(bǔ)充劑(例如基于林格氏右旋糖的補(bǔ)充劑)等。還可以存在防腐劑和其它添加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、生長(zhǎng)因子和惰性氣體等。
本發(fā)明包括用于改善生長(zhǎng)性能的多種組合物。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的組合物通過用載體、助劑、賦形劑或添加劑將一或多種抗炎劑(含有或不含有一或多種抗生素)配制成適于對(duì)動(dòng)物給藥的劑型來制備。
適用于本發(fā)明的這個(gè)方面的抗生素是通常在動(dòng)物飼養(yǎng)業(yè)中用作動(dòng)物用水和/或飼料的添加劑并用于限制動(dòng)物的微生物載量的那些抗生素。這些抗生素的實(shí)例包括林可霉素、壯觀霉素和阿莫西林。在澳大利亞，將抗生素用于食用動(dòng)物的用途詳見“The use of antibiotics in food-producing動(dòng)物santibiotic-resistant bacteria in Animals and humans”。關(guān)于抗生素耐受性的聯(lián)合專家咨詢委員會(huì)的報(bào)告(JETACAR)，澳大利亞共和國，1999。
抗生素可以施用于動(dòng)物，其用量與常規(guī)施用于動(dòng)物以減少動(dòng)物的微生物載量的量相同。抗生素的所述量是本領(lǐng)域已知的，可參見上述JETACAR。
常用的載體、助劑或賦形劑包括碳酸鎂、二氧化鈦、乳糖、甘露糖醇和其它糖、滑石、乳蛋白、明膠、淀粉、維生素、纖維素及其衍生物、動(dòng)物和植物油、聚乙二醇和溶劑，如無菌水、醇、甘油和多羥基醇。靜脈內(nèi)賦形劑包括液體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑。防腐劑包括抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體。其它可藥用載體包括水溶液、無毒賦形劑，包括鹽、防腐劑、緩沖劑等，例如見Remington′s Pharmaceutical Sciences，15th ed.EastonMack Publishing Co.，1405-1412，1461-1487(1975)和The National FormularyXIV.，14th ed.WashingtonAmerican Pharmaceutical Association(1975)，該文獻(xiàn)內(nèi)容在此被引用作為參考。該藥物組合物的多個(gè)組分的pH和精確濃度可以根據(jù)本領(lǐng)域常識(shí)調(diào)節(jié)。參見Goodman and Gilman′s，The Pharmacological Basisfor Therapeutics(7th ed.)。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以以生長(zhǎng)促進(jìn)量進(jìn)行局部或系統(tǒng)給藥。這種應(yīng)用的有效量當(dāng)然取決于抗炎劑和動(dòng)物的重量與一般狀況。一般地，體外使用的劑量可以為所述組合物原位給藥的量提供有用的指導(dǎo)。許多考慮在例如Langer，Science，2491527，(1990)中作了描述?？诜渲苿┛梢允怯裁髂z膠囊的形式，其中將活性成分與惰性固體稀釋劑(例如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土)混合。它們還可以是軟明膠膠囊的形式，其中活性成分與水或油介質(zhì)(如花生油、液體石蠟或橄欖油)混合。
水懸浮液通常包含與適于制備水懸浮液的賦形劑混合的活性成分。這類賦形劑可以是(1)助懸劑，例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃芪膠和阿拉伯膠；(2)分散或潤(rùn)濕劑，它可以是(a)天然存在的磷脂，例如卵磷脂；(b)烯化氧與脂肪酸的縮合產(chǎn)物，例如聚環(huán)氧乙烷硬脂酸酯；(c)環(huán)氧乙烷與長(zhǎng)鏈脂肪醇的縮合產(chǎn)物，例如十七碳乙烯氧基鯨蠟醇；(d)氧化乙烯與由脂肪酸與己糖醇衍生的部分酯的縮合產(chǎn)物，例如聚環(huán)氧乙烷山梨醇一油酸酯或(e)環(huán)氧乙烷與由脂肪酸和己糖醇酐衍生的部分酯的縮合產(chǎn)物，例如聚氧化乙烯脫水山梨醇一油酸酯。
組合物可以是無菌注射用水性或油性懸液形式。這種懸液可以根據(jù)已知方法，使用上述適宜的分散劑或潤(rùn)濕劑和助懸劑來制備。無菌注射制劑還可以是在腸胃外可接受的無毒稀釋劑或溶劑中的無菌注射液，例如在1，3-丁二醇中的溶液?？梢允褂玫目山邮艿馁x形劑和溶劑為水、林格氏溶液和等滲氯化鈉溶液。此外，無菌、固化的油常用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為此目的，可以使用任何溫和的固化油，包括合成的甘油一酸酯或甘油二酸酯。此外，脂肪酸，例如油酸可用于制備注射劑。
本發(fā)明的抗炎劑和組合物還可以脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)的形式(例如小單層囊泡、大單層囊泡和多層囊泡)給藥。脂質(zhì)體可以由不同的磷脂，例如膽固醇、硬脂胺或磷脂酰膽堿形成。
本發(fā)明的抗炎劑或組合物的劑量水平等級(jí)為約1微克至約50微克每千克體重，優(yōu)選的劑量范圍為約5微克至約20微克每千克體重每次服藥(可以一次或多次服藥)(約100微克至約500微克每只動(dòng)物每次服藥)?？梢耘c載體物質(zhì)組合以制備單一劑量(single dose)的抗炎劑量將隨動(dòng)物和具體給藥模式而變。例如，欲用于對(duì)豬進(jìn)行靜脈內(nèi)給藥的制劑可以包含約20μg至1g的抗炎劑和可以為全部組合物的約5-95％的適宜且方便量的載體物質(zhì)。單位劑量形式通常包含約5μg-500mg的抗炎劑。
但是可以理解，任何具體動(dòng)物的具體劑量水平取決于多個(gè)因素，包括所用的具體抗炎劑的活性、年齡、體重、總體健康水平、飲食、給藥時(shí)間、給藥途徑、排泄率和藥物組合。
在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，一或多種抗炎劑在體內(nèi)表達(dá)而不是外源施用。例如，通過插入編碼抗炎劑的結(jié)構(gòu)DNA序列和適當(dāng)?shù)姆g起始與終止信號(hào)，使其與功能性啟動(dòng)子處在可操作性閱讀狀態(tài)，可以產(chǎn)生能在體內(nèi)表達(dá)抗炎劑的表達(dá)載體。該載體包含一個(gè)或多個(gè)表型可選擇的標(biāo)記和復(fù)制起點(diǎn)，以確保在宿主內(nèi)擴(kuò)增。適于轉(zhuǎn)化的原核宿主包括大腸桿菌(E.coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)和假單胞菌屬、鏈單胞菌屬(Streptomonas)和葡萄球菌屬的多個(gè)物種，也可以選擇其它物種。在將適宜的宿主菌株轉(zhuǎn)化和表達(dá)之后，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。細(xì)胞通常通過離心來收集，用物理或化學(xué)方法破裂，并保留所得的粗提取物以作進(jìn)一步純化。多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物系統(tǒng)還可以用于表達(dá)重組蛋白。哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)例包括Gluzman，Cell23175(1981)所述的猴腎成纖維細(xì)胞的COS-7系和其它能表達(dá)相容載體的細(xì)胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK細(xì)胞系，當(dāng)然還有豬細(xì)胞。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體將包含復(fù)制起點(diǎn)、適宜的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，還包含任何需要的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、多腺苷酸化位點(diǎn)、剪接供體和受體位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止序列和5′-側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列。由SV40病毒基因組衍生的DNA序列，例如，SV40起點(diǎn)、早期啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、剪接位點(diǎn)和多腺苷酸化位點(diǎn)可以用來提供所需的非轉(zhuǎn)錄性遺傳元件。在細(xì)菌培養(yǎng)物中產(chǎn)生的重組蛋白一般通過以下方法分離首先從細(xì)胞碎片進(jìn)行提取，然后進(jìn)行一次或多次鹽析、水溶液離子交換或大小排阻層析處理步驟。必要時(shí)，用蛋白再折疊步驟實(shí)現(xiàn)成熟蛋白構(gòu)型。最后，可以將高效液相色譜法(HPLC)用于最終的純化步驟。用于蛋白表達(dá)的微生物細(xì)胞可以用任何適宜的方法破裂，包括冷凍-融化循環(huán)、超聲處理、機(jī)械破裂或利用細(xì)胞溶解試劑。表達(dá)純化所用標(biāo)簽序列的表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用將簡(jiǎn)化純化。本文所述重組表達(dá)系統(tǒng)在誘導(dǎo)與DNA片段或待表達(dá)的合成基團(tuán)連接的調(diào)控元件時(shí)表達(dá)異源蛋白。不含細(xì)胞的翻譯系統(tǒng)也可以用于利用由本發(fā)明的DNA構(gòu)建體衍生的RNA生產(chǎn)豬細(xì)胞因子。適用于原核生物和真核生物宿主的克隆和表達(dá)載體見Maniatis，MolecularCloningA Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor，N.Y.，1985)，該文獻(xiàn)的內(nèi)容在此被引用作為參考。
編碼具體抗炎劑的核酸優(yōu)選為質(zhì)粒DNA或病毒載體形式(它是由腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、痘病毒，特別是痘苗病毒或MVA病毒、皰疹病毒、腺伴隨病毒等衍生的載體)的形式。編碼具體抗炎劑的核酸通過感染性病毒顆?；蛘咭院铣奢d體(陽離子脂類、脂質(zhì)體，陽離子聚合物等)，或經(jīng)改造的細(xì)胞(用該核酸轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞)或未經(jīng)改造的細(xì)胞(它天然包含該核酸)的形式轉(zhuǎn)運(yùn)。
根據(jù)另一優(yōu)選的變體，目標(biāo)核酸由有復(fù)制缺陷的腺病毒載體(不能在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制)攜帶。腺病毒的技術(shù)在現(xiàn)有技術(shù)中有描述(例如參見Graham and Prevec in Methods in Molecular Biology，1991，vol 7，pp.109-128，ed E.J.Murey，The Human Press Inc)。有利地，本發(fā)明范圍內(nèi)所用的腺病毒載體由腺病毒的基因組衍生，它包含至少ITR(反向末端重復(fù))和殼體化序列，并缺乏所有或部分E1腺病毒區(qū)。此外，它可以缺乏所有或部分E3腺病毒區(qū)。但是，根據(jù)一個(gè)有利的實(shí)施方案，優(yōu)先保留編碼多肽，特別是糖蛋白gp19 k的部分E3區(qū)(Gooding等，Critical Review of Immunology，1990，1053-71)，從而使其能逃避宿主的免疫系統(tǒng)。而且，該載體可以包括附加的缺失和突變，它們尤其影響所有或部分的選自E2、E4、L1、L2、L3、L4和L5區(qū)的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域(例如參見WO 94/28152)。為了例示這一點(diǎn)，可以提及影響E2A區(qū)的DBP(代表DNA結(jié)合蛋白)基因的溫度敏感性突變(Ensinger等，J.Virol.，1972，10328-339)。另一變體或吸引人的組合是缺失E4區(qū)，但編碼開放讀框(ORFs)6和7的序列除外(這些限制性缺陷不要求E4功能互補(bǔ)；Ketner等，Nucleic Acids Res.，1989，173037-3048)。優(yōu)選將目標(biāo)基因插入載體代替缺失的腺病毒區(qū)，特別是E1區(qū)。使用許多目標(biāo)基因時(shí)，它們可以插在病毒基因組的相同位點(diǎn)或不同位點(diǎn)，并可以處在相同的調(diào)控元件或獨(dú)立元件的控制之下，且如果合適的話，它們中的一些可以與其它的取向相反，以便在其表達(dá)水平下的干擾現(xiàn)象最小化。重組腺病毒載體的基因組可以通過分子生物學(xué)技術(shù)或通過同源重組(參見WO 96/17070)來制備。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)使用的腺病毒載體在能反式提供缺陷功能的補(bǔ)充細(xì)胞系中繁殖以產(chǎn)生形成感染性病毒顆粒所需的肽。例如，利用細(xì)胞系293來補(bǔ)充E1功能(Graham等，J.Gen.Virol.，1977，3659-72)或利用國際申請(qǐng)WO 97/04119所述的細(xì)胞系來進(jìn)行雙互補(bǔ)。還可以使用適宜的細(xì)胞系和輔助病毒以補(bǔ)充所有缺陷功能。從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收產(chǎn)生的病毒顆粒，如果需要的話，用本領(lǐng)域中的技術(shù)純化(氯化銫梯度，色譜步驟等)。
本發(fā)明范圍內(nèi)所用的腺病毒載體可以由源自人、犬、鳥類、牛、鼠、綿羊、豬或猴子的腺病毒的基因組衍生，或者由包含不同來源的腺病毒基因組片段的雜合體衍生。更具體而言，可以提及來源于犬的CAV-1或CAV-2腺病毒、來源于鳥類的DAV，或者來源于牛的III型Bad(Zakharchuk等，Arch.Virol.，1993，128171-176；Spibey and Cavanagh，J.Gen.Virol.，1989，70165-172；Jouvenne等，Gene，1987，6021-28；Mittal等，J.Gen.Virol.，1995，7693-102)。但是，優(yōu)選研究對(duì)具體動(dòng)物物種有特異性的腺病毒載體。
本發(fā)明的方法可以具體化為試劑盒的形式。
該試劑盒包括含有一或多種抗炎劑的第一容器，用于遞送試劑的裝置和使用說明。
在適用于密集的動(dòng)物生產(chǎn)的實(shí)施方案中，該試劑盒還可以包括含有一或多種抗生素的第二容器。備選試劑盒包括含有一或多種編碼抗炎劑的核酸分子的第一容器(如果將它施用于動(dòng)物，則在動(dòng)物上表達(dá)該核酸分子時(shí)產(chǎn)生生長(zhǎng)促進(jìn)量的抗炎劑)，用于遞送試劑的裝置和使用說明。
使用說明使農(nóng)場(chǎng)主或其它動(dòng)物飼養(yǎng)實(shí)踐者能施用抗炎劑或核酸分子，以提高該動(dòng)物相對(duì)于未施用這種試劑或核酸分子的動(dòng)物的生長(zhǎng)促進(jìn)作用。
在整個(gè)說明書中，詞“包括(comprise)”和該詞的變型，例如“包括(comprising)”和“包括(comprises)”意指“包括但不限于”，并且不意在排除其它添加劑、組分、整數(shù)或步驟。
僅通過參照以下非限制性實(shí)施例的方式進(jìn)一步描述本發(fā)明。但應(yīng)該理解，以下的實(shí)施例僅是例示性的，不應(yīng)以任何方式被認(rèn)為是對(duì)上述本發(fā)明的一般性的限制。例如，雖然主要的實(shí)施例與豬有關(guān)，但應(yīng)理解本發(fā)明還可以用于這里公開的其它動(dòng)物，包括例如羊、牛和小雞。
實(shí)施例1重組IL-1RA作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑以代替飼料內(nèi)的抗生素進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)以確定IL-1ra是否能夠在工業(yè)化環(huán)境中改善斷奶豬的生長(zhǎng)性能和健康。我們還希望研究IL-1ra作為飼料中的抗生素藥物的替代物的潛能。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)重組豬IL-1ra在大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)，并用polyHis標(biāo)記系統(tǒng)進(jìn)行純化。在開始實(shí)驗(yàn)前在生物分析中測(cè)定IL-1ra的生物活性。
將雄性斷奶豬(28天大)以每組20只分配到表1所述的處理組。各處理組的平均重量相同，具有相同的方差。將豬以每組畜欄(group pen)20圈養(yǎng)，其中2個(gè)監(jiān)禁組提供含藥物的水并按照目前的工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，而另2個(gè)畜欄給予不含藥物的水并飼養(yǎng)。如表2所述，每周兩次將體積為1ml的重組IL-1ra或鹽水(對(duì)照)注入豬，持續(xù)斷奶期(42天)。
在斷奶期開始(0天)和斷奶期結(jié)束(第42天)時(shí)，豬通過靜脈穿刺放血以進(jìn)行免疫分析。在整個(gè)斷奶期(第0-42天)每周對(duì)豬稱重，然后在第79天、第93天和試驗(yàn)最后一天即第113天試驗(yàn)分別對(duì)豬稱重，然后屠宰動(dòng)物并測(cè)定尸體特征。
表1

表2第0天對(duì)28天大的斷奶豬進(jìn)行稱重和分組。
放血。對(duì)各組進(jìn)行注射。
第1天對(duì)各組進(jìn)行注射。
第6天稱重對(duì)各組進(jìn)行注射。
第7天(第1周) 對(duì)各組進(jìn)行注射。
第9天 稱重第13天對(duì)各組進(jìn)行注射。
對(duì)各組進(jìn)行注射。
第14天(第2周) 稱重第16天對(duì)各組進(jìn)行注射。
第20天對(duì)各組進(jìn)行注射。
稱重。
第21天(第3周) 對(duì)各組進(jìn)行注射。
第23天對(duì)各組進(jìn)行注射。
第27天稱重對(duì)各組進(jìn)行注射。
第28天(第4周) 對(duì)各組進(jìn)行注射。稱重。最后一次放血。
第30天移至生長(zhǎng)畜圈。
第34天生長(zhǎng)期。所有的豬給予標(biāo)準(zhǔn)飼料，并保持在先前的組中。
第35天(第5周) 在生長(zhǎng)期期間(D73)和結(jié)束時(shí)(D93)稱重。
第37天第41天結(jié)束期。將豬移至單一畜圈，并測(cè)定攝入飼料的FCR(食物轉(zhuǎn)化率)。所有的豬給予標(biāo)準(zhǔn)完工飼料。
第42天(第6周) 在結(jié)束期期間(實(shí)驗(yàn)天(D)114)和結(jié)束期結(jié)束時(shí)(第42-93天) (屠宰D133)稱重。測(cè)定最終重量，P2背膘，(第93-133天) 尸體重量，％清理后(dressing)重量。
結(jié)果關(guān)于最初4周的處理，用IL-1ra處理的豬在增重率方面與鹽水對(duì)照組表現(xiàn)一樣好(圖1)。但是，當(dāng)實(shí)驗(yàn)和處理進(jìn)行至斷奶期的后幾周，即第5和第6周時(shí)，用IL-1ra處理的豬在加藥物和不加藥物的飼養(yǎng)方案中，其表現(xiàn)均勝過鹽水處理的豬(圖2)。而且，用IL-1ra處理并喂飼不含抗生素的食物的豬的表現(xiàn)與喂飼含藥物食物的鹽水處理豬的表現(xiàn)一樣好(圖2，IL-1ra對(duì)鹽水+)。用IL-1ra處理并喂飼含藥物的食物的豬在斷奶的最后2周中有最大的增加率。
這些結(jié)果表明，對(duì)于促進(jìn)工業(yè)化條件下豬的生長(zhǎng)，IL-1ra處理與飼料內(nèi)抗生素應(yīng)用同樣有效。IL-1ra處理的豬在IL-1ra施用4周后的表現(xiàn)改善還意味著IL-1ra的作用被延遲，或者需要數(shù)次處理以產(chǎn)生與飼料內(nèi)的抗生素類似的效果。
IL-1ra處理的豬的較高增重率的趨勢(shì)在整個(gè)生長(zhǎng)和結(jié)束期(分別為第43-92天，和第93-134天)持續(xù)。在第6周停止注射后，用IL-1ra處理并不提供飼料內(nèi)藥物的豬繼續(xù)生長(zhǎng)的速度與用鹽水處理并提供飼料內(nèi)藥物的豬一樣快(圖3)。而且，此結(jié)果意味著IL-1ra處理對(duì)于促進(jìn)豬增長(zhǎng)而言與抗生素一樣有效，這如在斷奶期最后2周(圖2)和生長(zhǎng)期(圖3、D79和D93)所示。IL-1ra的效果似乎在第6周細(xì)胞因子處理結(jié)束后長(zhǎng)久存在。
用IL-1ra處理并提供含藥物食物的豬在生長(zhǎng)期表現(xiàn)最高的增重率(圖3、D79和D93)，而用鹽水處理并喂飼非藥物食物的豬在所有處理組中具有最低的增重率。
在結(jié)束期，在斷奶期用IL-1ra處理且食物中不加藥物的豬在所有的組中表現(xiàn)最高的增加率(圖4)。此結(jié)果進(jìn)一步表明對(duì)施用至第6周的IL-1ra的反應(yīng)的延遲性，且IL-1ra與目前工業(yè)中所用的飼料內(nèi)的抗生素一樣是豬生長(zhǎng)的有效促進(jìn)劑。
IL-1ra作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑的積極效果也由屠宰的豬的平均重量(圖5)及其屠宰之后的溫尸體重量(圖6)表示。在斷奶期在不存在飼料內(nèi)的抗生素的情況下用IL-1ra處理的豬在屠宰時(shí)比用鹽水處理并提供飼料內(nèi)的抗生素的豬平均重0.7kg。IL-1ra處理導(dǎo)致的這種重量增長(zhǎng)是在這兩種處理之間在飼料轉(zhuǎn)化率方面不存在任何差異的情況下發(fā)生的(圖7)。在斷奶期提供飼料內(nèi)抗生素的豬在結(jié)束期間的飼料轉(zhuǎn)化率為2.5，而且在不存在飼料內(nèi)抗生素的存在下，用IL-1ra處理的豬在結(jié)束期間的飼料轉(zhuǎn)化率為2.49。在存在抗生素的情況下，用IL-1ra處理的豬的溫尸體重量大于鹽水處理對(duì)照組的重量(圖6)。而且，在不存在抗生素的情況下，用IL-1ra處理的豬的溫尸體重量等于喂飼抗生素并用鹽水處理的豬的溫尸體重量。這些結(jié)果表明，IL-1ra處理的豬比抗生素處理的豬增加更多的重量，這種增加與目前給豬喂養(yǎng)抗生素的工業(yè)化實(shí)踐一樣有效。
結(jié)論1).IL-1ra在不存在飼料內(nèi)抗生素的情況下改善豬的生長(zhǎng)。
2).由IL-1ra處理產(chǎn)生的生長(zhǎng)改善等效于通過加入飼料內(nèi)抗生素所見的生長(zhǎng)改善。
3).與鹽水處理的對(duì)照組和鹽水處理并喂飼抗生素補(bǔ)充食物的豬相比，IL-1ra在不存在飼料內(nèi)抗生素的情況下改善斷奶期最后2周的生長(zhǎng)。
4).在斷奶期施用IL-1ra對(duì)生長(zhǎng)的作用被延遲并長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)，所述作用在整個(gè)生長(zhǎng)和結(jié)束期中持續(xù)。
5).在生長(zhǎng)期，IL-1ra處理的豬與喂飼抗生素的豬生長(zhǎng)同樣好。
6).在結(jié)束期，IL-1ra處理的豬比喂飼抗生素的豬更快生長(zhǎng)。
7).與用鹽水處理并喂飼抗生素補(bǔ)充食物的豬相比，在斷奶期施用IL-1ra導(dǎo)致屠宰增重。
8).在結(jié)束期期間，在斷奶期用IL-1ra處理的豬與在斷奶期喂飼抗生素補(bǔ)充食物的豬具有相同的飼料效率。
9).這些結(jié)果表明，與目前抗生素補(bǔ)充的豬飼料的工業(yè)實(shí)踐相比，IL-1ra產(chǎn)生更大的豬，并且不影響飼料轉(zhuǎn)化效率。
實(shí)施例2重組IL-1RA作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑用于降低飼料內(nèi)的抗生素水平本實(shí)驗(yàn)通過比較斷奶期、生長(zhǎng)期和結(jié)束期至屠宰時(shí)，雄性和雌性斷奶豬的生長(zhǎng)速率和健康而反復(fù)對(duì)IL-1ra改善豬的性能和/或免疫力進(jìn)行評(píng)價(jià)。此試驗(yàn)設(shè)計(jì)用于研究給藥數(shù)個(gè)水平的IL-1ra的效果，即從目前用于豬生產(chǎn)的抗生素給藥正常水平至減少抗生素給藥和不給藥抗生素藥物。此實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)在正常工業(yè)化豬飼養(yǎng)條件下，IL-1ra代替抗生素的能力，并確定在整個(gè)動(dòng)物生命中持續(xù)施用IL-1ra的效果。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)重組豬IL-1ra在大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)，并用polyHis標(biāo)記系統(tǒng)純化。在開始實(shí)驗(yàn)前，在生物實(shí)驗(yàn)中測(cè)定IL-1ra的生物活性。
該實(shí)驗(yàn)在工業(yè)化環(huán)境中進(jìn)行，其中豬在28天大時(shí)斷奶。所有的注射為1ml。每種處理對(duì)16頭豬進(jìn)行，即每種處理8頭雄性和8頭雌性豬。處理組的平均重量與實(shí)驗(yàn)開始時(shí)類似。
處理方案組 處理 藥物治療1鹽水 02鹽水 減少
3 鹽水 正常4 IL-1ra 05 IL-1ra 減少6 IL-1ra 正常所用的符號(hào)-表示在整個(gè)試驗(yàn)中在飼料或水中沒有補(bǔ)充抗生素。
-0.5表示用于整個(gè)試驗(yàn)的單一抗生素。
+表示用于整個(gè)試驗(yàn)的正常工業(yè)化抗生素方案。
處理鹽水注射，1ml IM頸肌。
100μg IL-1ra注射，1ml IM頸肌。
在斷奶期每周兩次施用注射劑，并在整個(gè)生長(zhǎng)期和結(jié)束期每周一次施用注射劑。
在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)(D0，W0)將豬斷奶并稱重。在以下時(shí)期記錄體重整個(gè)斷奶期(W0-W6)、生長(zhǎng)期期間(W9)、生長(zhǎng)期末期(W13)、結(jié)束期期間(W16)和結(jié)束期末屠宰前即W19。在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)和在斷奶期、生長(zhǎng)期及結(jié)束期的末期收集血樣。進(jìn)行血液學(xué)和免疫學(xué)分析。在屠宰時(shí)，記錄尸體特征，包括P2背膘測(cè)定值和清理后尸體重量。
結(jié)果在斷奶期末期，在所有3種藥物水平下，用IL-1ra處理的豬比它們的鹽水對(duì)照更重(圖8)。顯然，用IL-1ra處理但不給藥抗生素藥物的斷奶豬的重量大于用鹽水處理并提供正常水平抗生素的斷奶豬的重量(Irap-vs鹽水+，圖8)。如預(yù)期地，抗生素藥物增強(qiáng)鹽水處理豬的生長(zhǎng)并改善用IL-1ra處理豬的生長(zhǎng)。
抗生素藥物的存在對(duì)斷奶期的豬的健康具有很大影響，這通過出現(xiàn)重量損失或死亡的豬的數(shù)量來測(cè)定(圖9)。在鹽水處理的豬中，抗生素水平的提高降低出現(xiàn)重量損失或死亡的豬的數(shù)量。但是，不管抗生素的水平如何，用IL-1ra處理的豬表現(xiàn)最少的重量損失或死亡記錄。在不存在抗生素的情況下，用鹽水處理的16只豬有一半以上在斷奶期表現(xiàn)健康和產(chǎn)量降低。但是，IL-1ra處理將這種數(shù)量降至16頭豬中的2頭(圖9)。斷奶期這種健康的改善和死亡率的降低以及體重增加改善一起導(dǎo)致斷奶期末總組重量的明顯差異(圖10)。不進(jìn)行藥物治療、減少藥物治療和完全藥物治療的鹽水處理組分別重292kg、324kg和406kg。IL-1ra處理的豬在斷奶期末期的對(duì)應(yīng)總組重量為369kg、390kg和451kg。IL-1ra處理的這種組重量的增加在零、降低的和正常的抗生素給藥水平下分別反映為生產(chǎn)率增加26.4％、20.4％和11.1％。
在斷奶期，IL-1ra處理的導(dǎo)致的生產(chǎn)率的改善在整個(gè)生長(zhǎng)和結(jié)束期繼續(xù)(圖11和12)。在生長(zhǎng)期末期，不管藥物水平如何，用IL-1ra處理的豬比所有鹽水處理的豬都重(圖11)。重要的是，與目前藥物治療的工業(yè)給藥水平相比，不存在抗生素的情況下，IL-1ra的遞送導(dǎo)致生長(zhǎng)期末期的重量更高。鹽水處理的豬的最終重量以依賴于劑量的方式受藥物治療影響(圖12)，其中增加藥物治療水平導(dǎo)致屠宰時(shí)增重。但是，這種模式不能在IL-1ra處理的豬中重復(fù)。在不存在抗生素藥物治療的情況下，用IL-1ra處理的豬比鹽水處理的豬重16.7％。實(shí)際上，不進(jìn)行藥物治療時(shí)，IL-1ra的施用在促進(jìn)完工豬的生長(zhǎng)方面的表面超過目前工業(yè)水平的抗生素治療(圖12)。這些結(jié)果表明，在整個(gè)生產(chǎn)期促進(jìn)豬的生長(zhǎng)方面IL-1ra比抗生素治療更有效。雖然IL-1ra處理導(dǎo)致屠宰時(shí)豬較大，這種重量的增加并不伴隨P2背膘增加(圖13)。在不存在抗生素的情況下用IL-1ra處理的豬的P2背膘水平與用鹽水處理并提供完全抗生素藥物治療的豬相當(dāng)(圖13)。這兩個(gè)結(jié)果表明施用IL-1ra導(dǎo)致的活體重量提高可持續(xù)至終產(chǎn)物，產(chǎn)生較瘦的尸體。
結(jié)論1).在飼料內(nèi)不存在抗生素和具有降低的抗生素水平的情況下，IL-1ra改善豬的生長(zhǎng)。
2).通過IL-1ra處理產(chǎn)生的生長(zhǎng)改善超過目前工業(yè)水平的抗生素藥物治療所致的生長(zhǎng)改善。
3).IL-1ra改善從斷奶期至完工期的整個(gè)生產(chǎn)期(production phase)的生長(zhǎng)，導(dǎo)致屠宰時(shí)增重。
4).IL-1ra改善斷奶豬的健康，這可以由與鹽水處理組比較死亡率降低和體重?fù)p失發(fā)生率減小看出。
5).施用IL-1ra所致的健康參數(shù)的改善大于由抗生素藥物治療導(dǎo)致的健康參數(shù)的改善。
6).連續(xù)施用IL-1ra對(duì)豬無任何有害效果。
7).IL-1ra改善重量并且不損及尸體質(zhì)量，這由屠宰時(shí)P2背膘值沒有改變看出。
實(shí)施例3遞送重組IL-1RA以改善出血性大腸桿菌(E.coli)感染的斷奶豬的健康本研究確定IL-1ra是否能夠改善暴露于例如出血性大腸桿菌感染的豬的健康。進(jìn)一步的目的在于確定IL-1ra是否能夠改善在斷奶期被大腸桿菌感染的豬的生長(zhǎng)。它還設(shè)計(jì)為表明IL-1ra是否能夠降低感染率并改善大腸桿菌感染的豬的健康。最后希望該實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛟u(píng)價(jià)與目前抗生素處理相比IL-1ra對(duì)斷奶豬大腸桿菌感染的預(yù)防或治療潛力。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將平均重量為5.4kg的雄性斷奶豬分配至包含8只動(dòng)物的各個(gè)組，各組間平均重量相等。將豬在包含來自每個(gè)處理組的復(fù)制品的組畜圈中飼養(yǎng)。給豬無限制地提供丸狀飼料和水。
用重組鹽水、IL-1ra或抗生素安普霉素處理豬，并根據(jù)表3所列的方案用大腸桿菌攻擊。以1ml劑量肌內(nèi)遞送鹽水或200μg IL-1ra。安普霉素根據(jù)制造商的指示以12mg/kg的劑量口服遞送。大腸桿菌攻擊物以含有108cfu/ml的8ml劑量口服遞送。如表3所示，首次用大腸桿菌攻擊第-2天、第0天和第+6天通過靜脈穿刺從豬中取血樣。分析血液的免疫學(xué)參數(shù)，包括白細(xì)胞數(shù)、分化細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)、IgG水平和細(xì)胞因子產(chǎn)量。在第-2天和第6天試驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)豬稱重。
從攻擊后的第2天至第6天的5天內(nèi)，每天從每頭豬取糞便樣品；將這些樣品在羊血瓊脂中培養(yǎng)以對(duì)大腸桿菌進(jìn)行定量。綿羊血瓊脂上的生長(zhǎng)記分為0-5(其中0為無生長(zhǎng)，1表示原代接種體生長(zhǎng)，2表示第一劃線生長(zhǎng)，3表示第二劃線生長(zhǎng)，4表示第三劃線生長(zhǎng)，而5表示在最后的劃線中大腸桿菌生長(zhǎng))。糞便的狀況記為正常、濕或腹瀉，作為臨床癥狀的指示。
在第7天實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，使豬安樂死，并從胃腸道的不同區(qū)域取拭子，所述區(qū)域包括小腸(沿小腸長(zhǎng)度25％、50％和75％處)、盲腸和結(jié)腸，并取樣原位糞便。將這些死后所取的拭子在綿羊血瓊脂中培養(yǎng)以對(duì)上述的大腸桿菌負(fù)荷進(jìn)行定量。
表3用于檢測(cè)IL-1RA作為豬大腸桿菌感染預(yù)防藥的效力的實(shí)驗(yàn)方案


結(jié)果與用鹽水處理的對(duì)照豬相比，用IL-1ra或安普霉素處理的豬表現(xiàn)出糞便中大腸桿菌排泄減少(圖14)。用安普霉素處理的豬在攻擊后的第2天至第5天細(xì)菌排泄減少，而IL-1ra處理的豬在第2天至第4天細(xì)菌排泄減少。在攻擊后第6天，所有組的細(xì)菌排泄相同。對(duì)于安普霉素和IL-1ra處理，在遞送最后處理藥劑后3天，糞便中大腸桿菌排泄恢復(fù)至鹽水對(duì)照水平?？傊?，安普霉素處理的組在所有處理中表現(xiàn)出最少的細(xì)菌排泄。
與鹽水處理的對(duì)照豬相比，安普霉素處理的豬在整個(gè)攻擊期每組的糞便得分表現(xiàn)為糞便排泄減少80.9％，而IL-1ra處理的豬與鹽水處理的對(duì)照豬相比表現(xiàn)為細(xì)菌排泄減少37％(圖15)。
在工業(yè)化情況下，感染豬的細(xì)菌排泄減少將進(jìn)一步降低畜群或畜圈中其它成員的交叉感染，從而改善斷奶者的健康，并因此改善生長(zhǎng)。提高斷奶豬的健康和生長(zhǎng)將導(dǎo)致后期產(chǎn)率的改善，因?yàn)樵跀嗄唐诘哪┢诋a(chǎn)率的主要預(yù)測(cè)物是重量。
臨床癥狀記錄為糞便狀況的改變，例如濕糞便或腹瀉的存在，這在用IL-1ra或安普霉素處理的豬減少(圖16)。與鹽水對(duì)照或安普霉素處理的豬相比，用IL-1ra處理的豬具有較少濕糞便和腹瀉病例的記錄。用安普霉素處理的豬與鹽水對(duì)照相比具有較少濕糞便的記錄，但還顯示為在攻擊后的時(shí)間內(nèi)腹瀉流行少量增加。
如果將這些臨床癥狀描述為與鹽水對(duì)照相比的癥狀減少百分率，則IL-1ra處理減少64％的臨床癥狀，而安普霉素導(dǎo)致臨床癥狀減少27％(圖17)。
臨床癥狀的結(jié)果表明IL-1ra和安普霉素都能減少大腸桿菌(E.coli)感染的外表癥狀。在這個(gè)關(guān)于健康的測(cè)定中，IL-1ra的表現(xiàn)超過安普霉素這種目前大腸桿菌感染的抗生素處理。
與鹽水處理的對(duì)照相比，安普霉素和IL-1ra處理都導(dǎo)致胃腸道(GIT)所有區(qū)域細(xì)菌負(fù)荷減少(圖18)。用IL-1ra處理的豬顯示其小腸和結(jié)腸的所有取樣區(qū)域的培養(yǎng)物得分最低。IL-1ra和安普霉素處理的豬中，取自盲腸和糞便的樣品的糞便培養(yǎng)物得分同樣低。與鹽水處理的對(duì)照相比，IL-1ra處理導(dǎo)致小腸前部分中的大腸桿菌減少71％，中段小腸中大腸桿菌減少51％，后段小腸中大腸桿菌減少47％，盲腸中大腸桿菌減少39％，結(jié)腸中大腸桿菌減少44％，而原位糞便中大腸桿菌減少23％(圖19)。
如果記錄每頭豬的所有培養(yǎng)物得分，并將其用于計(jì)算組平均總得分(圖20)，用IL-1ra處理的豬得分可能小于10/30，而鹽水處理的豬的得分為17/30，安普霉素處理的豬的得分為12/30。如果將此數(shù)據(jù)表示為相對(duì)于鹽水對(duì)照大腸桿菌培養(yǎng)物得分的減小百分率(圖21)，則IL-1ra的預(yù)防應(yīng)用導(dǎo)致胃腸道中大腸桿菌量減少45％。安普霉素的處理僅能將腸中大腸桿菌集群減少33％。
這些結(jié)果表明用IL-1ra處理的豬的細(xì)菌負(fù)荷最低，這進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)這種制劑對(duì)控制幼豬的出血性大腸桿菌的價(jià)值。
如果根據(jù)腸的位置分離大腸桿菌培養(yǎng)物的死后結(jié)果，則可以看到IL-1ra和安普霉素的作用差異(圖22)。小腸(前腸)的大腸桿菌細(xì)菌負(fù)荷與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)，因?yàn)樾∧c是表現(xiàn)分泌性腹瀉的部位。與鹽水對(duì)照相比IL-1ra處理將小腸細(xì)菌負(fù)荷降低55％，而安普霉素導(dǎo)致小腸細(xì)菌負(fù)荷降低32％(圖23)。與鹽水對(duì)照相比，在后腸區(qū)(盲腸和結(jié)腸)記錄的安普霉素和IL-1α處理的細(xì)菌負(fù)荷類似，分別導(dǎo)致大腸桿菌減少37％和42％(圖23)。
IL-1ra優(yōu)選降低前腸細(xì)菌負(fù)荷的能力表明這種處理可以降低與出血性大腸桿菌感染有關(guān)的疾病的嚴(yán)重性。實(shí)際上，這些結(jié)果支持那些關(guān)于疾病臨床癥狀的記錄，其中與其它處理相比用IL-1ra處理的豬的腹瀉發(fā)生率降低(圖16)。因此，IL-1ra可能是目前在養(yǎng)豬業(yè)中施用的抗生素的潛在替代物或佐劑，以控制這種疾病對(duì)豬生產(chǎn)的有害作用。
IL-1ra和安普霉素對(duì)細(xì)菌排泄、臨床癥狀和死后細(xì)菌負(fù)荷的效果的比較性總結(jié)包括在表4中。
表4IRAP(IL-1RA)和安普霉素控制斷奶幼豬的出血性大腸桿菌感染的治療效果的比較總結(jié)


結(jié)論1).IL-1ra改善豬的健康，即它減少存在出血性大腸桿菌感染時(shí)的出血性腹瀉相關(guān)性糞便改變方面的臨床病癥。
2).由IL-1ra處理產(chǎn)生的健康改善等于，并在一些情況下強(qiáng)于抗生素安普霉素處理的效果，后者是目前處理豬的出血性大腸桿菌的方法。
3).與鹽水處理的對(duì)照組相比，IL-1ra處理導(dǎo)致感染期間糞便中細(xì)菌排泄減少。用IL-1ra處理的豬在攻擊后的3/5天的細(xì)菌排泄比鹽水處理的對(duì)照組明顯更少。這些結(jié)果表明在工業(yè)化條件下，減少環(huán)境中的細(xì)菌負(fù)荷可以降低感染率。
4).與鹽水處理的對(duì)照組相比，施用IL-1ra的效果導(dǎo)致GIT所有區(qū)域的細(xì)菌數(shù)減少。
5).明顯地，IL-1ra導(dǎo)致在大腸桿菌感染期間小腸(前腸)的細(xì)菌負(fù)荷降低55％，其中小腸為分泌性腹瀉通常所在的部位。由于小腸細(xì)菌負(fù)荷與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)，因此IL-1ra可能對(duì)疾病的進(jìn)展和病理有顯著的治療效果。
6).IL-1ra處理在減少臨床病癥、死后腸中存在的大腸桿菌水平以及小腸重要部位存在的大腸桿菌方面優(yōu)于目前工業(yè)用抗生素即安普霉素的處理。
實(shí)施例4遞送重組IL-1RA以改善致豬痢疾性腸炎性病原體，即豬痢疾短螺旋體(Serpulina)感染的斷奶豬的健康和生產(chǎn)力本實(shí)施例的目的在于確定IL-1ra能否改善導(dǎo)致被豬痢疾的腸炎性病原體，豬痢疾短螺旋體(Brachyspira(Serpulina)hyodysenteriae)感染的豬的健康。另一目的在于確定IL-4是否能夠在豬痢疾攻擊的條件下改善豬的生長(zhǎng)速率。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將平均初始重量為6.5kg的雄豬分配到由8只豬組成的各處理組。將豬在組畜圈中飼養(yǎng)，每個(gè)畜圈包含來自各處理組的一個(gè)復(fù)制品。將一組8只豬在單獨(dú)的室內(nèi)圈養(yǎng)并不被感染，以用作未處理的對(duì)照。給豬無限制地提供丸狀飼料和水。
在豬痢疾攻擊之前，通過肌內(nèi)注射200μg重組IL-1ra或1ml鹽水處理豬。根據(jù)制造商的說明將鹽酸林可霉素作為2ml肌內(nèi)注射劑遞送。在表5所列的實(shí)驗(yàn)方案所述的時(shí)間間隔給藥細(xì)胞因子、抗生素并進(jìn)行攻擊。在第0天、第1天和第2天用豬痢疾短螺旋體感染豬，所述豬痢疾短螺旋體作為120ml對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期螺旋體培養(yǎng)物的口服丸給予，其包含108個(gè)細(xì)胞。
在表5所述的時(shí)間間隔從每只豬取得糞便拭子和血樣。培養(yǎng)糞便拭子中存在的螺旋體。如以上實(shí)施例3所述分析血樣的免疫學(xué)參數(shù)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中每周一次對(duì)豬稱重，通過在最初攻擊后的第19和20天對(duì)所述豬進(jìn)行安樂死來終止其生命。在死后，培養(yǎng)來自后腸各區(qū)域的拭子中存在的螺旋菌，并記錄胃腸組織的大體病理?xiàng)l件。
表5用于評(píng)價(jià)IL-1RA作為豬痢疾感染預(yù)防性處理的效力的實(shí)驗(yàn)過程方案

豬死亡后從后腸取得的螺旋菌培養(yǎng)物表明與鹽水對(duì)照組相比，用IL-1ra處理豬減少了殘留在腸中的螺旋菌的數(shù)量(圖24)。與鹽水處理的對(duì)照組相比，IL-1ra能夠降低前結(jié)腸、后結(jié)腸和糞便中螺旋菌培養(yǎng)物得分。如所預(yù)期的，未受豬痢疾攻擊的豬死后其后腸或糞便中沒有螺旋菌(數(shù)據(jù)未顯示)。
與鹽水處理的豬相比，IL-1ra處理導(dǎo)致前結(jié)腸中螺旋菌減少15.8％，后結(jié)腸中螺旋菌減少47.1％，糞便中螺旋菌減少42.1％(圖25)。IL-1ra處理的凈效果是整個(gè)GIT中螺旋菌減少27％。
除了腸中螺旋菌數(shù)量減少之外，IL-1ra處理還減少由糞便狀況指示的與感染有關(guān)的臨床癥狀。圖26表明與鹽水處理的對(duì)照組相比，IL-1ra處理的豬表現(xiàn)較少的痢疾影響的糞便征(濕粘液樣并帶血)。
與鹽水處理的對(duì)照組相比，IL-1ra處理能夠降低促炎細(xì)胞因子TNF、IL-8和IL-1的產(chǎn)生(圖27、28和29)。重要的是，促炎細(xì)胞因子與動(dòng)物的疾病表現(xiàn)有關(guān)，并與在密集飼養(yǎng)的家畜中所見的生產(chǎn)力降低有關(guān)。IL-1ra的抗炎能力可以表現(xiàn)為長(zhǎng)期生長(zhǎng)改善。實(shí)際上，這些結(jié)果在以上實(shí)施例1、2和3所述。
而且，豬痢疾的臨床癥狀是推測(cè)由炎性介質(zhì)例如促炎細(xì)胞因子加劇的慢性炎性病理狀態(tài)。IL-1ra降低這些炎性介質(zhì)產(chǎn)生的能力可在減少與豬痢疾感染有關(guān)的病理中起一定作用。
這些結(jié)果證明，IL-1ra能夠減少豬痢疾感染對(duì)豬健康的有害效果。已知IL-1ra對(duì)免疫系統(tǒng)具有抗炎效果，因此與痢疾有關(guān)的腸炎性病理變化的減少可有助于細(xì)胞因子的抗炎性能和螺旋菌負(fù)荷的降低(如圖24可見)。
結(jié)論1).與鹽水處理相比，用IL-1ra處理豬減少死后后腸和糞便中存在的螺旋菌的數(shù)量。
2).與鹽水對(duì)照組相比，IL-1ra使通過糞便狀況檢測(cè)到的豬痢疾感染的臨床癥狀減少。
3).用IL-1ra處理豬導(dǎo)致與生長(zhǎng)和生產(chǎn)力受損有關(guān)的促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)量降低。
4).IL-1ra在以下二種腸感染模型中改善豬的健康溶血大腸桿菌(E.coli)和豬痢疾短螺旋體(Serpulina)(豬痢疾)。二種模型中健康的改善均可由感染期間臨床癥狀減少來描述。在大腸桿菌模型中，健康的改善伴隨與死后感染有關(guān)的病理的減少。在豬痢疾模型中，還注意到促炎細(xì)胞因子水平降低。IL-1ra進(jìn)行預(yù)防性處理以改善暴露于大腸桿菌的豬的健康的能力與目前工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)抗生素效果相當(dāng)。因此，IL-1ra具有作為抗生素處理的可替代的選擇或補(bǔ)充，或者預(yù)防豬大腸桿菌和豬痢疾的潛能。IL-1ra作為健康促進(jìn)劑的潛能可以進(jìn)一步通過同時(shí)應(yīng)用抗生素治療劑來得到增強(qiáng)。
實(shí)施例5遞送質(zhì)粒S和重組IL-1RA以改善胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)感染的豬的生長(zhǎng)和健康此實(shí)施例的目的在于確定IL-1ra是否可以改善炎性肺病原體，胸膜肺炎放線桿菌(App)感染的豬的健康。而且，另一目的在于確定IL-1ra是否可以改善App攻擊條件下的豬的生長(zhǎng)速率。此外，此實(shí)施例的目的是確定IL-1ra的質(zhì)粒DNA還是重組遞送更為有效。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將平均初始重量為52kg的雄性豬分配至表6所列的5個(gè)處理組。在組畜圈中飼養(yǎng)豬，各畜圈包含來自各處理組的復(fù)制品。各處理組和各畜圈的初始重量在開始試驗(yàn)前相等。給豬無限制地提供丸狀飼料和水。
將重組IL-1ra和鹽水以1ml劑量施用，在耳后皮下給予。質(zhì)粒以1ml劑量施用，在后腿經(jīng)肌肉內(nèi)給予。例如，氟尼辛以2ml劑量根據(jù)制造商的說明施用，并在頸部肌肉內(nèi)遞送。施用的時(shí)間表如下表6所列。
表6細(xì)胞因子實(shí)驗(yàn)中所應(yīng)用的處理和劑量，所述實(shí)驗(yàn)用于評(píng)價(jià)IL-1RA作為胸膜肺炎放線桿菌感染的預(yù)防性處理的效力

在攻擊前，如表7所述用重組細(xì)胞因子、氟尼辛或質(zhì)粒處理豬。麻醉豬，并在第0天用7.5×105pfu App進(jìn)行氣管內(nèi)感染。
在攻擊后第0、24小時(shí)和第4天通過靜脈穿刺從豬取血樣。如前述分析血液的免疫參數(shù)。從質(zhì)粒遞送起以及攻擊后兩周內(nèi)每周對(duì)豬稱重一次。
表7評(píng)價(jià)IL-4作為胸膜肺類放線桿菌感染預(yù)防性處理的效力的實(shí)驗(yàn)方案

結(jié)果在攻擊的一周期間，與鹽水處理的對(duì)照組相比，IL-1ra改善豬的生長(zhǎng)(圖30)。用鹽水、氟尼辛(非甾族抗炎藥，NSAID)或?qū)φ召|(zhì)粒處理的豬表現(xiàn)重量損失，而用IL-1ra或質(zhì)粒IL-1ra處理的豬在攻擊的一周期間表現(xiàn)出正生長(zhǎng)。在攻擊后的一周中，所有組的豬增重，但同樣重組IL-1ra處理的豬平均起來比處理組的豬增加更多的重量。用鹽水處理的豬在攻擊后第二周明顯恢復(fù)，而用IL-1ra處理的豬繼續(xù)增加重量。在所有組中，用質(zhì)?；蚍嵝撂幚淼呢i在攻擊第二周生長(zhǎng)最為不良。
用App攻擊之后的2周期間的增重表明，與鹽水處理的對(duì)照組相比，重組IL-1ra處理提高了增重，雖然這種結(jié)果在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是不顯著的。與鹽水處理的對(duì)照組相比，氟尼辛和質(zhì)粒對(duì)照在生長(zhǎng)方面表現(xiàn)最差。在攻擊后2周期間IL-1ra質(zhì)粒在生長(zhǎng)方面表現(xiàn)好于質(zhì)粒對(duì)照組(圖31)。注意到日增重率具有類似的表現(xiàn)方式，其中與用鹽水處理的對(duì)照豬每天增加433g相比，用重組IL-1ra處理的豬平均每天增加667g。
用重組IL-1ra處理導(dǎo)致相對(duì)于鹽水對(duì)照增重改善53.8％，而NSAID氟尼辛處理導(dǎo)致增重減少84.6％(圖33)。質(zhì)粒處理與鹽水對(duì)照相比一般具有較小的增重，但是與質(zhì)粒對(duì)照相比，IL-1ra質(zhì)粒使增重改善100％(圖34)。
App攻擊后，數(shù)組中的促炎細(xì)胞因子TNFα和IL-6升高。
有趣的是，NSAID氟尼辛不能抑制TNFα的產(chǎn)生(圖35)，這可能有助于解釋這組所見的不良生長(zhǎng)。與攻擊前水平相比，攻擊后第13天重組IL-1ra、質(zhì)粒對(duì)照和IL-1ra質(zhì)粒都具有降低的TNFα水平。與鹽水處理和氟尼辛處理豬相比，這3種處理在攻擊后第13天還具有明顯較低的TNFα產(chǎn)生水平(p＜0.05)。
與鹽水處理的對(duì)照組相比，所有的處理都降低攻擊后24小時(shí)的IL-6的產(chǎn)生(圖36)，且這種趨勢(shì)持續(xù)至攻擊后第13天。不幸的是，由于取樣錯(cuò)誤，App攻擊后的13天中，鹽水處理組的IL-6數(shù)據(jù)無法補(bǔ)救。，攻擊13天后，與氟尼辛處理的豬相比，用作為質(zhì)粒或重組體的IL1-ra處理的豬的促炎細(xì)胞因子IL-6的水平降低。
雖然抗炎細(xì)胞因子處理可導(dǎo)致循環(huán)中促炎細(xì)胞因子水平降低，且在一些情況下改善生長(zhǎng)，但促炎細(xì)胞因子與生長(zhǎng)受損之間的關(guān)系仍不清楚。通常，其中豬的促炎細(xì)胞因子水平降低的組是在攻擊后第一周還具有最小生長(zhǎng)抑制作用的組。需要進(jìn)一步的工作來闡明在這種攻擊模型下豬的重量損失的機(jī)理。
除了改善豬的生長(zhǎng)之外，我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子處理可以改善暴露于App攻擊的豬的健康。圖37的數(shù)據(jù)表明在攻擊第一周期間進(jìn)行的30次觀察的平均臨床得分。各頭豬表現(xiàn)的癥狀嚴(yán)重程度，例如嗜睡、咳嗽和呼吸參數(shù)得分為0-8，而死亡或安樂死的豬在后來各次觀察中的得分規(guī)定為8。與鹽水處理的對(duì)照組相比，用重組IL-1ra處理的豬的臨床病癥顯著減少(p＜0.05，圖37)。與鹽水和質(zhì)粒對(duì)照組相比，作為質(zhì)粒遞送的IL-1ra還導(dǎo)致臨床癥狀減少。在所有處理組中，用鹽水或氟尼辛處理的豬表現(xiàn)出最多的App臨床病癥。
與用鹽水處理的豬相比，作為重組體遞送的IL-1ra導(dǎo)致臨床癥狀的存在減少72％(圖38)。與鹽水處理的對(duì)照組相比，以質(zhì)粒形式遞送的IL-1ra導(dǎo)致減少52％，且與質(zhì)料處理的對(duì)照組相比減少31％(圖38)。作為質(zhì)?；蛑亟M體遞送的IL-1ra比氟尼辛更有效地減少App感染的臨床癥狀。
在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，使豬安樂死，并取出肺以進(jìn)行死后檢查。對(duì)肺的胸膜炎評(píng)分為0-5(圖39和40)，且胸膜肺炎程度的確定通過對(duì)受影響的肺進(jìn)行稱重，并表示為總肺重的百分率(圖41和42)。用氟尼辛和IL-1ra處理的豬比鹽水對(duì)照組具有較輕的胸膜炎(圖39)。雖然用作為質(zhì)粒遞送的IL-1ra處理的豬的胸膜炎比質(zhì)粒處理的對(duì)照組輕，它們的胸膜炎水平相當(dāng)于鹽水處理的對(duì)照組(圖39)。與鹽水處理的對(duì)照組相比，重組IL-1ra將胸膜炎水平降低22％，而氟尼辛處理將胸膜炎減輕55.6％(圖40)。作為質(zhì)粒遞送的IL-1ra與鹽水處理的對(duì)照組相比將胸膜炎減輕5.6％，與質(zhì)粒對(duì)照組相比減輕39.3％(圖40)。
與鹽水處理的對(duì)照組相比，用氟尼辛或重組IL-1ra處理的豬中，App損傷影響的肺的百分率大大降低(圖41)。鹽水對(duì)照組和質(zhì)粒對(duì)照組具有類似水平的損傷影響的肺。與鹽水和質(zhì)粒對(duì)照組相比，IL-1ra質(zhì)粒減少App損傷影響的肺的百分率，但質(zhì)粒IL-1ra損害App疾病病理的能力不如作為重組體遞送的IL-1ra或氟尼辛明顯(圖41)。這些結(jié)果反映，與鹽水處理的對(duì)照組相比，IL-1ra使受影響的肺質(zhì)量減小73.9％，氟尼辛使之64.1％，質(zhì)粒IL-1ra使之36.7％(圖42)。
結(jié)論
1).與鹽水處理的對(duì)照組相比，在App攻擊的第一周期間重組IL-1ra能夠大大增加豬的生長(zhǎng)。攻擊2周后，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)用IL-1ra處理的豬因此比鹽水處理的對(duì)照重4kg，這代表生長(zhǎng)改善69％。用氟尼辛處理的豬在2周的攻擊期間具有最低的生長(zhǎng)。
2).重組IL-1ra、質(zhì)粒對(duì)照和質(zhì)粒IL-1ra能夠降低與不良生長(zhǎng)性能有關(guān)的促炎細(xì)胞因子TNFα和IL-6的產(chǎn)生。氟尼辛僅能降低IL-6的產(chǎn)生。
3).IL-1ra大大降低攻擊期間臨床病癥的嚴(yán)重程度，作為質(zhì)粒遞送的IL-1ra也如此。與鹽水處理相比，重組IL-1ra將臨床癥狀減少72％，而質(zhì)粒IL-1ra將臨床癥狀減少52％。
4).氟尼辛能夠降低死后所見的胸膜炎水平。與鹽水處理相比，IL-1ra將胸膜炎減少22％。
5).氟尼辛、IL-1ra和質(zhì)粒IL-1ra都降低App損傷影響的肺的百分率。用重組或質(zhì)粒IL-1ra的處理分別導(dǎo)致App影響的肺的質(zhì)量減小74％和37％。
6).用IL-1ra處理的豬改善暴露于App攻擊的豬的健康和生產(chǎn)力。
7).重組IL-1ra的遞送比質(zhì)粒IL-1ra的遞送更為有效。
實(shí)施例6以低和高劑量并與IL-4聯(lián)用來預(yù)防性遞送重組IL-1RA的，用于改善被胸膜肺炎放線桿菌感染的豬的健康和生長(zhǎng)此實(shí)施例的目的是確定在炎性肺病原體，胸膜肺炎放線桿菌(App)感染的豬體內(nèi)增加IL-1ra的劑量是否能夠?qū)Ω纳粕L(zhǎng)和減輕病理產(chǎn)生更大的影響。而且，另一目的是確定IL-1ra是否能夠與另一種抗炎細(xì)胞因子IL-4協(xié)同作用，以增強(qiáng)細(xì)胞因子處理對(duì)App感染的豬的生長(zhǎng)和病理的有益效果。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將平均初始重量為56kg的雄性豬分配到表8所述的5個(gè)處理組中。在組畜圈中飼養(yǎng)豬，且每個(gè)畜圈包含來自每個(gè)處理組的動(dòng)物；無限制地提供丸狀飼料和水。各處理組和畜圈的初始重量在開始試驗(yàn)前相同。
在耳后經(jīng)皮下注射以2ml劑量施用重組IL-1ra、IL-4和鹽水。因此，協(xié)同組的豬接受1劑量的IL-1ra和1劑量的IL-4。在用App攻擊前24小時(shí)、攻擊時(shí)和攻擊后24小時(shí)用IL-1ra、IL-1ra+IL-4或鹽水處理豬。在第0天麻醉豬并用7.5×105pfu進(jìn)行氣管內(nèi)感染。
在自攻擊-24小時(shí)、+0小時(shí)、+24小時(shí)和+3周通過靜脈穿刺從豬中取血樣。如前述分析血液的免疫學(xué)參數(shù)。在第-1天、第10天和第3周將豬稱重。
表8細(xì)胞因子實(shí)驗(yàn)(N＝8)中所應(yīng)用的處理和劑量所述實(shí)驗(yàn)用于評(píng)價(jià)不同劑量的IL-1RA和IL-1RA+IL-4作為胸膜肺炎放線桿菌感染的預(yù)防性處理的效力

結(jié)果與實(shí)施例5不同的是，用鹽水處理的動(dòng)物在用App攻擊的早期沒有經(jīng)歷重量損失(比較圖30和圖43)。盡管出現(xiàn)這種結(jié)果，在用高劑量IL-1ra處理的豬中看到生長(zhǎng)改善(圖43)，相當(dāng)于增重率增加到超過100g/天。共同應(yīng)用IL-1ra和IL-4以研究協(xié)同作用，這導(dǎo)致與鹽水處理的豬相比在App攻擊的前10天期間生長(zhǎng)反應(yīng)受到抑制。組內(nèi)差異是高的，因此在這種情況下誤差范圍(bar)較大并缺少統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。但是，在實(shí)施例5中所見的IL-1ra改善體重增加的趨勢(shì)在此實(shí)驗(yàn)中可重復(fù)。
在攻擊的最后10天，用低劑量的IL-1ra或或低劑量的IL 1ra+IL-4處理的豬分別表現(xiàn)出最大的增重率(圖44)，即分別為1250g/天和1306g/天，耳鹽水處理的對(duì)照組為1079g/天。用高劑量IL-1ra處理的豬增加1170g/天，高于鹽水處理組的增重率。該高協(xié)同劑量導(dǎo)致App攻擊后期的增重較低。
用低或高劑量的IL-1ra和低劑量的IL-1ra+IL-4處理的豬顯示比鹽水處理的對(duì)照組更高的增重(圖45)。在攻擊期的21天中，用低和高劑量的IL-1ra處理的豬或低劑量的協(xié)同處理的豬分別增加17.9kg和17kg，而鹽水處理的對(duì)照組僅增加15.75kg(圖45)。因此，與鹽水處理的對(duì)照組相比，用IL-1ra或低劑量的IL-1ra+IL-4進(jìn)行的處理使生長(zhǎng)分別改善13.5％和7.9％(圖46)。
如實(shí)施例5看出，用重組IL-1ra處理豬導(dǎo)致疾病嚴(yán)重程度降低，如在死后病理結(jié)果中記錄的那樣(圖39、40、41和42)。在目前的實(shí)施例中，應(yīng)用高劑量的IL-1ra降低受App損害影響的肺的量(圖47)。類似地，與鹽水處理相比，遞送低劑量IL-1ra和IL-4組合物降低受影響的肺的重量。高劑量的IL-1ra和高劑量的協(xié)同處理降低死后所見的胸膜炎的程度(圖48)。
與其它處理相比，高劑量IL-1ra和IL-1ra+IL-4處理大大降低促炎細(xì)胞因子IL-8的產(chǎn)量(圖49)。IL-8將嗜中性粒細(xì)胞募集到肺，而隨后的嗜中性粒細(xì)胞脫粒被懷疑是App感染病理的主要因素。因此，肺組織中IL-8水平降低可能導(dǎo)致暴露于App感染的豬的病理減輕和健康改善。類似地，通過用高劑量的IL-1ra或低劑量的IL-1ra+IL-4處理，可抑制肺組織中的另一種促炎細(xì)胞因子TNFα的產(chǎn)生(圖50)。這些結(jié)果表明，App攻擊條件下，抗炎機(jī)理可能在這些處理對(duì)豬的生長(zhǎng)和健康的有益效果中起作用。
結(jié)論1).高劑量的IL-1ra改善攻擊早期的生長(zhǎng)，而低或高劑量的IL-1ra和低劑量的IL-1ra+IL-4改善攻擊后期的生長(zhǎng)。
2).低或高劑量的IL-1ra以及低劑量的IL-1ra+IL-4導(dǎo)致整個(gè)攻擊期的體重增加提高。
3).高劑量IL-1ra和低劑量IL-1ra+IL-4減少App損害影響的肺的數(shù)量。高劑量的IL-1ra和IL-1ra+IL-4降低胸膜炎得分。
4).高劑量的IL-1ra和IL-1ra+IL-4具有抗炎效果，這由肺組織中促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生減少顯示。
5).高劑量的IL-1ra明顯降低肺中與病理有關(guān)的IL-8的產(chǎn)生。
6).這些結(jié)果支持實(shí)施例5的結(jié)果，起發(fā)現(xiàn)在App感染之前或之時(shí)給予IL-1ra治療改善生長(zhǎng)并減少病理。
實(shí)施例7治療性遞送低和高劑量的重組IL-1RA，以改善胸膜肺炎放線桿菌感染的豬的健康和生長(zhǎng)此實(shí)施例的目的在于確定胸膜肺炎放線桿菌(App)感染建立之后IL-1ra的治療遞送是否能夠消除感染并改善豬的生長(zhǎng)。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將平均初始重量為34.6kg的雄性豬分配至4個(gè)每組有9頭豬的處理組。處理為鹽水、2μg/天的IL-1ra、10μg/天的IL-1ra和速解靈(Excenel)，目前App感染的臨床處理。將3頭豬圈養(yǎng)在一個(gè)個(gè)畜欄中，且各畜圈有3個(gè)復(fù)制品。給豬任意提供丸狀飼料和水。各處理組和各畜圈的初始重量在開始試驗(yàn)前相等。
將豬麻醉，并在第0天用7.5×105pfu進(jìn)行氣管內(nèi)感染。將重組IL-1ra和鹽水以2ml的劑量，在耳后經(jīng)皮下給予。根據(jù)制造商的說明將速解靈施用于豬。在用App攻擊后24小時(shí)、48小時(shí)和1周時(shí)用IL-1ra、鹽水或速解靈處理豬。
在感染后第0小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、1周和2周通過靜脈穿刺從豬中取血樣。如前述分析血液的免疫學(xué)參數(shù)。在攻擊前當(dāng)天以及攻擊后第6天和第13天將豬稱重。
結(jié)果在App攻擊后的第二周平均重量增加，如圖51所示，這表明用低劑量的IL-1ra處理的豬比其它處理組增加更多的重量。用低劑量IL-1ra處理的豬在攻擊的第2周平均增加5.7kg，相比之下鹽水處理的對(duì)照組增重4.4kg，而抗生素處理增加4.9kg(圖51)。
而且，與鹽水處理相比，IL-1ra處理和用抗生素速解靈處理均可降低日飼料攝入(圖52)。用低和高劑量IL-1ra處理的豬分別消耗1.7和1.8kg飼料每天，用速解靈處理的豬消耗2kg，而用鹽水處理的豬消耗2.2kg。
改善增重和降低飼料攝入的聯(lián)合效果導(dǎo)致與鹽水對(duì)照組相比，用低劑量IL-1ra處理的豬其飼料轉(zhuǎn)化率改善(FCR，飼料增重)(圖53)。IL-1ra處理將FCR降低1.6，相比之下鹽水處理的FCR為2.1。
在被殺死的App存在下，用低劑量IL-1ra處理的豬趨于增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)(圖54)。淋巴細(xì)胞擴(kuò)增試驗(yàn)測(cè)定淋巴細(xì)胞對(duì)具體抗原反應(yīng)的能力。在這種情況下，抗原與感染物同源，因此體外高度增殖性反應(yīng)表明體內(nèi)對(duì)App病原體的識(shí)別和抗御該病原體的動(dòng)員(mobilization)增強(qiáng)。淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)所見的趨勢(shì)與FCR一致——對(duì)殺死的App產(chǎn)生最強(qiáng)體外反應(yīng)的豬還具有最大的飼料效率，這由FCR減小可證明。因此，IL-1ra可以通過增強(qiáng)特定的免疫反應(yīng)性來改善飼料效率和增重。
與其它處理相比，對(duì)App感染的豬治療性遞送低劑量的IL-1ra還降低肺組織中促炎細(xì)胞因子IL-8的產(chǎn)生(圖55)。與鹽水處理的對(duì)照組相比，低劑量的IL-1ra和速解靈處理也降低尾縱隔淋巴結(jié)中IL-8的產(chǎn)生，所述淋巴結(jié)引流肺(圖56)。而且，這些結(jié)果表明IL-1ra調(diào)節(jié)保護(hù)性免疫反應(yīng)和有害的炎性反應(yīng)，從而可以有助于改善App感染的豬的增重和飼料轉(zhuǎn)化率。
結(jié)論1).與抗生素或鹽水處理相比，治療性應(yīng)用低劑量的IL-1ra改善App感染的豬的重量增加。
2).與其它處理相比，治療性施用IL-1ra降低飼料攝入。
3).IL-1ra的治療性施用大大改善App感染的豬的飼料效率。
4).治療性遞送IL-1ra到App感染的豬中導(dǎo)致細(xì)胞免疫反應(yīng)增強(qiáng)，同時(shí)減輕炎性反應(yīng)。
權(quán)利要求
1.一種改善動(dòng)物的生長(zhǎng)性能的方法，所述方法包括給需要的動(dòng)物施用生長(zhǎng)促進(jìn)量的一或多種抗炎劑的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該抗炎劑任選與可藥用載體、助劑或賦形劑聯(lián)合施用。
3.一種改善動(dòng)物的生長(zhǎng)性能的方法，所述方法包括給需要的動(dòng)物施用組合物的步驟，所述組合物包含與抗生素協(xié)同的抗炎劑并任選與可藥用載體、助劑或賦形劑組合，其中該組合物實(shí)現(xiàn)協(xié)同生長(zhǎng)促進(jìn)效果。
4.一種改善動(dòng)物的生長(zhǎng)性能的方法，所述方法包括給需要的動(dòng)物施用增加或補(bǔ)充內(nèi)源性抗炎劑水平的化合物或組合物的步驟，其中相對(duì)于未施用該化合物或組合物的動(dòng)物的生長(zhǎng)性能而言，提高了生長(zhǎng)性能。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述化合物或組合物在施用生長(zhǎng)促進(jìn)量的一或多種抗炎劑之前、一起或之后施用。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的方法，其中該化合物或組合物包含促炎細(xì)胞因子受體拮抗劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中該拮抗劑是TNF-α受體、GM-CSF受體、IL-6受體、IL-1受體、IL-4受體或IL-8受體的拮抗劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-6之任一項(xiàng)的方法，其中該化合物或組合物包含IL-10、1，8-萘磺內(nèi)酰胺取代的化合物或喹喔啉化合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求4或5的方法，其中該化合物或組合物通過減少促炎細(xì)胞因子量來增加內(nèi)源性抗炎劑水平。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-3或5之任一項(xiàng)的方法，其中該抗炎劑為具有抗炎效果的可溶性細(xì)胞因子受體、細(xì)胞因子受體拮抗劑、細(xì)胞因子抑制因子或其生物活性片段，或者選自雙氯酚酸、二氟尼柳、依托度酸、氟尼辛、非諾洛芬、夫洛非寧、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、甲氯芬那酸、甲芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮、萘普生、奧沙普嗪、保泰松、吡羅昔康、舒林酸、替諾昔康、噻洛芬酸和托美汀的抗炎劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中該可溶性細(xì)胞因子受體或其生物活性片段選自能改善動(dòng)物生長(zhǎng)性能的TNFα受體、IL-6受體、IL-1受體、IL-4受體，IL-8受體或其組合。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中該可溶性細(xì)胞因子受體或其生物活性片段為IL-1受體、IL-4受體、IL-8受體或其組合。
13.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中該可溶性細(xì)胞因子受體或其生物活性片段為IL-1受體。
14.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中該細(xì)胞因子受體拮抗劑或其生物活性片段選自IL-1ra、IL-6ra、IL-8ra和TNF-αra。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中該細(xì)胞因子受體拮抗劑或其生物活性片段為IL-1ra。
16.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中該細(xì)胞因子抑制因子或其生物活性片段選自TNF阻斷因子和TNF-α抑制劑。
17.根據(jù)權(quán)利要求1、2、4-16之任一項(xiàng)的方法，所述方法還包括施用抗生素的步驟。
18.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中施用抗生素的步驟在施用抗炎劑之前或之后。
19.根據(jù)權(quán)利要求3或權(quán)利要求17的方法，其中該抗生素選自阿莫西林、青霉素、普魯卡因、氨芐西林、氯唑西林、青霉素G、芐星青霉素、苯乙芐胺、頭孢噻呋、頭孢洛寧、頭孢呋辛、紅霉素、泰洛星、替米考星、竹桃霉素、吉他霉素、林可霉素、壯觀霉素、四環(huán)素、土霉素、金霉素、新霉素、安普霉素、鏈霉素、阿伏帕星、二甲硝咪唑、磺胺(包括甲氧芐啶和二氨藜蘆啶)、桿菌肽、維吉霉素、莫能霉素、沙利霉素、拉沙洛西、甲基鹽霉素和奧拉喹多或其組合。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中該抗生素為林可霉素、壯觀霉素或阿莫西林或其組合。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-20之任一項(xiàng)的方法，其中該給藥是口服、局部或腸胃外給藥。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中腸胃外給藥采用皮下注射、氣溶膠、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、鞘內(nèi)、胸骨內(nèi)注射、輸液技術(shù)或被囊化細(xì)胞。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-22之任一項(xiàng)的方法，其中該給藥是單個(gè)劑量單位或多個(gè)劑量單位。
24.根據(jù)權(quán)利要求1-20之任一項(xiàng)的方法，其中該給藥是作為在水和/或飼料中的添加劑口服施用的。
25.根據(jù)權(quán)利要求1-24之任一項(xiàng)的方法，其中該動(dòng)物的生長(zhǎng)性能選自生長(zhǎng)速率增加、飼料利用率增加、最終增重、清理后增重和脂肪含量降低。
26.根據(jù)權(quán)利要求1-24之任一項(xiàng)的方法，其中動(dòng)物生長(zhǎng)性能的改善是由于免疫增強(qiáng)、抗寄生蟲或抗微生物效應(yīng)、抗炎效應(yīng)或應(yīng)激降低引起的。
27.根據(jù)權(quán)利要求1-26之任一項(xiàng)的方法，其中該動(dòng)物是偶蹄動(dòng)物或鳥類。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中該偶蹄動(dòng)物選自牛、豬、羊、駱駝、山羊和馬。
29.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中該鳥類選自小雞、火雞、鵝和鴨。
30.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中該動(dòng)物是牛、豬或羊。
31.一種促進(jìn)生長(zhǎng)的組合物，所述組合物包含一或多種抗炎劑和一或多種可藥用載體、助劑或賦形劑。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的促進(jìn)生長(zhǎng)的組合物，其中該組合物包含選自以下的抗炎劑可溶性細(xì)胞因子受體、細(xì)胞因子受體拮抗劑、細(xì)胞因子抑制因子或其生物活性片段、雙氯酚酸、二氟尼柳、依托度酸、氟尼辛、非諾洛芬、夫洛非寧、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、甲氯芬那酸、甲芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮、萘普生、奧沙普嗪、保泰松、吡羅昔康、舒林酸、替諾昔康、噻洛芬酸和托美汀。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的促進(jìn)生長(zhǎng)的組合物，其中該組合物包含一或多種可溶性細(xì)胞因子受體、細(xì)胞因子受體拮抗劑、細(xì)胞因子抑制因子或其生物活性片段和一或多種不同的可溶性細(xì)胞因子受體、細(xì)胞因子受體拮抗劑、細(xì)胞因子抑制因子或其生物活性片段或一或多種不同的抗炎劑。
34.根據(jù)權(quán)利要求32的促進(jìn)生長(zhǎng)的組合物，其中該組合物包含一種可溶性細(xì)胞因子受體、細(xì)胞因子受體拮抗劑、細(xì)胞因子抑制因子或其生物活性片段和一種不同的抗炎劑或可藥用載體、助劑或賦形劑。
35.根據(jù)權(quán)利要求32的促進(jìn)生長(zhǎng)的組合物，其中該可溶性細(xì)胞因子受體或其生物活性片段選自TNFα受體、IL-6受體、IL-1受體、IL-4受體，IL-8受體或其組合。
36.根據(jù)權(quán)利要求32的促進(jìn)生長(zhǎng)的組合物，其中該可溶性細(xì)胞因子受體或其生物活性片段是IL-1受體、IL-4受體、IL-8受體或其組合。
37.根據(jù)權(quán)利要求32的促進(jìn)生長(zhǎng)的組合物，其中該可溶性細(xì)胞因子受體或其生物活性片段是IL-1受體。
38.根據(jù)權(quán)利要求32的促進(jìn)生長(zhǎng)的組合物，其中該細(xì)胞因子受體拮抗劑或其生物活性片段選自IL-1ra、IL-6ra、IL-8ra和TNF-αra。
39.根據(jù)權(quán)利要求32的促進(jìn)生長(zhǎng)的組合物，其中該細(xì)胞因子受體拮抗劑或其生物活性片段是IL-1ra。
40.根據(jù)權(quán)利要求32的促進(jìn)生長(zhǎng)的組合物，其中該細(xì)胞因子抑制因子或其生物活性片段選自TNF阻斷因子和TNF-α抑制劑。
41.根據(jù)權(quán)利要求31-40之任一項(xiàng)的促進(jìn)生長(zhǎng)的組合物，所述組合物還包含一或多種抗生素。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的促進(jìn)生長(zhǎng)的組合物，其中該抗生素選自阿莫西林、青霉素、普魯卡因、氨芐西林、氯唑西林、青霉素G、芐星青霉素、苯乙芐胺、頭孢噻呋、頭孢洛寧、頭孢呋辛、紅霉素、泰洛星、替米考星、竹桃霉素、吉他霉素、林可霉素、壯觀霉素、四環(huán)素、土霉素、金霉素、新霉素、安普霉素、鏈霉素、阿伏帕星、二甲硝咪唑、磺胺(包括甲氧芐啶和二氨藜蘆啶)、桿菌肽、維吉霉素、莫能霉素、沙利霉素、拉沙洛西、甲基鹽霉素和奧拉喹多或其組合。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的促進(jìn)生長(zhǎng)的組合物，其中該抗生素是林可霉素、壯觀霉素或阿莫西林或其組合。
44.一種改善動(dòng)物的生長(zhǎng)性能的方法，所述方法包括給需要的動(dòng)物施用編碼一或多種抗炎劑的核酸分子，其中該核酸分子的表達(dá)產(chǎn)生有效生長(zhǎng)促進(jìn)量的一或多種抗炎劑。
45.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，其中該核酸分子是DNA、cDNA、RNA或其雜合分子。
46.根據(jù)權(quán)利要求44或權(quán)利要求45的方法，其中該核酸分子是全長(zhǎng)分子或其生物活性片段。
47.根據(jù)權(quán)利要求30-32之任一項(xiàng)的方法，其中該核酸分子是編碼可溶性細(xì)胞因子受體、細(xì)胞因子受體拮抗劑、細(xì)胞因子抑制因子或其生物活性片段的DNA分子。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中該DNA編碼選自TNFα受體、IL-6受體、IL-1受體、IL-4受體和IL-8受體或其組合的細(xì)胞因子受體，或者選自IL-1ra、IL-6ra和TNF-αra的細(xì)胞因子受體拮抗劑。
49.根據(jù)權(quán)利要求44-48之任一項(xiàng)的方法，其中該核酸分子結(jié)合到動(dòng)物基因組或者是染色體外元件。
50.根據(jù)權(quán)利要求44-49之任一項(xiàng)的方法，其中該核酸分子通過皮下、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射施用或者作為氣溶膠施用。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中該核酸分子的施用量為約1μg-2000μg/劑。
52.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中該核酸分子的施用量為約5μg-1000μg/劑。
53.根據(jù)權(quán)利要求52的方法，其中該核酸分子的施用量為約6μg-200μg/劑。
54.根據(jù)權(quán)利要求44-53之任一項(xiàng)的方法，其中該核酸分子在載體中或作為裸DNA施用。
55.根據(jù)權(quán)利要求54的方法，其中該載體為豬腺病毒載體。
56.一種構(gòu)建體，用于體內(nèi)遞送有效量的細(xì)胞因子受體、細(xì)胞因子受體拮抗劑、細(xì)胞因子抑制因子或其生物活性片段，所述構(gòu)建體包含a)編碼細(xì)胞因子受體、細(xì)胞因子受體拮抗劑、細(xì)胞因子抑制因子或其生物活性片段的核苷酸序列；b)包含調(diào)控序列的載體，其中該調(diào)控序列的載體能調(diào)控a)的核苷酸序列的表達(dá)，從而產(chǎn)生細(xì)胞因子受體、細(xì)胞因子受體拮抗劑、細(xì)胞因子抑制因子或其生物活性片段，進(jìn)而改善動(dòng)物的生長(zhǎng)性能。
57.用于改善動(dòng)物的生長(zhǎng)性能的試劑盒，所述試劑盒包含a).一或多種抗炎劑；b).該抗炎劑的遞送裝置；和c).本發(fā)明方法的使用說明。
全文摘要
本發(fā)明廣義上涉及一種改善動(dòng)物的生長(zhǎng)性能的方法。具體而言，本發(fā)明涉及一種包括給需要的動(dòng)物施用生長(zhǎng)促進(jìn)量的一或多種抗炎劑的步驟的改善動(dòng)物的生長(zhǎng)性能的方法。
文檔編號(hào)A61K38/17GK1652695SQ02829362
公開日2005年8月10日 申請(qǐng)日期2002年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月25日
發(fā)明者艾倫·D·G·斯特羅姆, 阿萊塔·G·諾爾斯, 艾倫·赫斯本德 申請(qǐng)人:悉尼大學(xué)