專利名稱：一種以微生物克隆載體生產(chǎn)治療血管疾病基因藥物血管內(nèi)皮生長因子-2裸dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組DNA及其構(gòu)建，并以微生物生產(chǎn)該重組DNA，將其作為DNA藥物的方法。具體地說，本發(fā)明涉及一種包含有人源性VEGF啟動子(hVEGF promoter)，能夠在哺乳動物細胞中表達鼠源性VEGF-2 cDNA(mVEGF-2)的真核表達載體的構(gòu)建，并以微生物生產(chǎn)該血管內(nèi)皮生長因子-2(VEGF-2)DNA藥物的方法。
2.背景技術(shù)血管疾病是嚴重威脅人類健康的常見病、多發(fā)病，其中腦血栓、冠心病患者最多，具有“發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高、致死率高、致殘率高、并發(fā)癥多”的特點，是威脅人類健康的“第一殺手”，占總死亡人數(shù)的40.72％(吳忠祥.選擇健康食品，宜參考專家意見.http//www.cnki.net)。據(jù)世界衛(wèi)生組織保守估計，全球心腦血管疾病患者至少有4500萬人，單是美國就有一千多萬人患冠狀動脈疾病，每年有500萬人發(fā)生心絞痛，有150萬人發(fā)生心臟??；在法國，每年死于心肌梗死的就有10萬人之多(基因療法治療冠心病.http//www.cnki.net)。近年來，我國心腦血管疾病等“現(xiàn)代文明病”發(fā)病率正逐年上升，據(jù)國家衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)統(tǒng)計結(jié)果表明，心腦血管疾病在我國病人死亡原因中也占首位，每年達200萬人。危重肢體缺血病是另一種動脈疾病，并且在吸煙者、糖尿病患者和高血壓病人中也非常普遍(蔡小惠.臺灣首例血管疾病基因治療開始進入人體實驗.http//www.cnki.netelial)，據(jù)估計美國50歲以上的老人中有15％的人患有肢體動脈病。因此，開發(fā)治療血管疾病的特效藥物，對維護人類健康具有重大意義。
動脈血管狹窄和梗塞引起血流不暢，致使局部組織缺血、缺氧而出現(xiàn)疼痛，嚴重時產(chǎn)生壞死性病灶，易于導(dǎo)致死亡和致殘是血管疾病的共同特征(Harada K，et al，Am J Physiol，1996，270(5 Pt 2)H1791-802)。治療動脈血管狹窄和梗塞，一般采用藥物和外科手術(shù)，如采用血管擴展藥物和降脂藥物、外科冠狀動脈搭橋術(shù)和皮下植入冠狀動脈成型術(shù)等。在美國，每年接受外科冠狀動脈搭橋術(shù)的病人達45萬多，皮下植入冠狀動脈成型術(shù)的病人有35萬多(Vascular endothelial growth factor-2 (VEGF-2).http//www.hgsi.com/products/vegf.html)。盡管血管外科手術(shù)發(fā)展很快，但存在血管修復(fù)處狹窄及拆“東墻”補“西墻”和血液循環(huán)不能完美重建的問題(肖軍，楊庭樹，張兆山等.，2001，12(3)S41-S42)。對患有慢性急性下肢缺血的病人，常因血管阻塞的程度與解剖位置侵犯過長，無法接受外科手術(shù)與動脈氣球擴張式血管再生治療，因而這些患者病情惡化甚快，迫切需要更有效的治療方法。目前，臨床上使用的一些治療血管疾病藥物總體效果均不理想，且毒、副作用較大。近年來，人們開始利用某些生長因子，將其導(dǎo)入局部缺血組織，促進新血管生成，以改善組織缺血缺氧狀態(tài)，這對慢性閉塞性血管疾病治療具有積極的意義。因此，尋找促進血管主動重建的藥物成了目前醫(yī)學(xué)研究的熱點之一。
血管生成發(fā)生著一系列相關(guān)事件，包括內(nèi)皮細胞的分化、管狀形成及血管成熟，其發(fā)生過程受體內(nèi)外一系列因子的調(diào)控(Risau W，F(xiàn)lamme I，Annu RevCell Dev Biol，1995，1173-91；Risau W，Nature，1997，386(6626)671-674)。目前已知的具有血管生長作用的因子有酸性和堿性成纖維細胞生長因子、血管表皮生長因子、α和β轉(zhuǎn)化生長因子、血小板源性生長因子、胰島素樣生長因子以及新近發(fā)現(xiàn)的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等(Neufeld G，Cohen T，Gengrinovitch S，et al，F(xiàn)ASEB J，1999，13(1)9-12)。根據(jù)目前對這幾種促血管生成因子的研究，除VEGF外其它均缺乏細胞特異性。VEGF能特異性地作用于血管內(nèi)皮細胞，強烈促進其增殖，促進血管形成，并具升高血管通透性的作用(Leung DW，Cachianes G，Sanzo WJ，etal，Science，1989，246(4935)1306-1309)。人們對此重要的生物學(xué)特異功能產(chǎn)生了極大興趣，試圖將VEGF導(dǎo)入局部缺血部位，以提高血管通透性，誘導(dǎo)新生血管發(fā)生，改善病灶區(qū)域血液循環(huán)和氧氣供應(yīng)狀況。這是一種治療血管疾病的全新方案，為治療腦動脈梗塞、心肌和肢體缺血疾病開辟了一條新途徑。但VEGF的體外生產(chǎn)是其作為一種藥物應(yīng)用于臨床的先決條件，必須先行解決。
VEGF是多基因家族，包括VEGF-A(Neafeld G，et al，Ccancer Metastasis Rev，1996，15(2)153-158)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D(Joukov V，Kaipainen A，JeltschM，et al，J Cell Physiol，1997，173206-210)、VEGF-E(Ogawa S，Oku A，Sawano A，et al，J Biol Chem，1998，27331273-31282)和胎盤生長因子(PLGF)(MaglioneD，Guerriero V，Viglietto G，et al，Proc Natl Sci USA，1991，889267-9271)等，它們均是一種糖基化分泌性多肽因子，以二硫鍵連接成同源二聚體，分子質(zhì)量約34～46kD。從人體中分離到的VEGF-A有5種變異體(isoform)，分別含有121、145、165、189和206個氨基酸殘基(注所指的氨基酸殘基數(shù)目不包括N-端26個氨基酸殘基構(gòu)成的疏水信號序列，因為這26個氨基酸殘基在各變異體均相同，后面VEGF-1/2/3也如此)，由mRNA的不同剪接而形成(NeafeldG，et al，Ccancer Metastasis Rev，1996，15(2)153-158)。大多數(shù)表達VEGF的細胞能同時產(chǎn)生多種VEGF變異體，但以VEGF121、VEGF165最為常見，其次是VEGF189，而VEGF145僅在生殖器官的細胞中表達。各變異體與肝素及硫酸肝素結(jié)合力不同，其中四種與肝素及硫酸肝素結(jié)合力大小順序為VEGF189/206＞VEGF165＞VEGF145(Hyder S，Cancer Res，1998，58(2)392-395)，而VEGF121不能連接肝素或硫酸肝素。所以，VEGF121/145/165較易到達靶細胞，VEGF189/206只能保留于細胞外基質(zhì)。
從小鼠胚胎組織中也分離到VEGF-1、VEGF-2和VEGF-3變異體，分別含有164、120和188個氨基酸殘基。與VEGF-3相比，較短的兩種變異體(VEGF-2和VEGF-1)缺失的氨基酸位于肽鏈羧基端(Breier G，et al，Development，1992，114(2))。
由于人VEGF145只在生殖器官細胞特異表達，VEGF189/206則幾乎都結(jié)合在質(zhì)膜或基底膜上而保留在細胞外難以到達靶細胞，體內(nèi)活性不如VEGF121、VEGF165強(Neafeld G，et al，Ccancer Metastasis Rev，1996，15(2)153-158)，只有VEGF121/165為最常見且較易到達靶細胞，故在治療局部性缺血研究中大多采用的是VEGF121和VEGF165(Yamagishi Si，et al，J Biol Chem，1997，272(13)8723-8730)。來自鼠胚胎的三種VEGF中，用于治療局部性缺血研究的只有VEGF-2，其余兩種未見報道。研究表明，用VEGF治療外周梗塞性血管病、腦動脈梗塞癥及心肌缺血研究均獲成功，但究竟那種VEGF的療效更好尚無定論。目前人VEGF121、VEGF165仍處于臨床前試驗，只有鼠VEGF-2已進行到臨床試驗II期(Yeung PK，Curr Opin Investig Drugs，2001，2(6)796-800)。據(jù)此推測，VEGF-2在治療動脈血管疾病上的效果可能更佳。
應(yīng)用VEGF治療血管疾病所面臨的首要問題是其有效性，這取決于局部VEGF含量、VEGF受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)密度及兩者在受體中持續(xù)時間。組織缺血后，局部VEGF及其受體密度上調(diào)，但VEGF量下降太快，缺血組織依賴自身VEGF無法有效刺激形成側(cè)支血管(Bauters C，et al，J Vasc Surg，1995，21(2)314-325)。將外源VEGF導(dǎo)入局部缺血組織，對缺血具有較好治療效果，但VEGF蛋白價格昂貴，且在體內(nèi)不穩(wěn)定，極易被降解，需反復(fù)給藥，因而不具備臨床應(yīng)用的可行性。將VEGF基因整合到真核表達質(zhì)粒或復(fù)制缺陷型腺病毒DNA上，提取純化重組質(zhì)粒DNA或復(fù)制缺陷型腺病毒DNA，將裸DNA直接注射入缺血組織，表達的VEGF蛋白可分泌到胞外與其特異性受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，即使表達少量VEGF蛋白也能取得理想的生物學(xué)效應(yīng)，這可克服直接注射VEGF蛋白的局限性。研究證明，直接基因轉(zhuǎn)染可在24h后開始表達，有效促進血管形成。其做法是用質(zhì)粒作為VEGF cDNA載體或復(fù)制缺陷型重組腺病毒基因注入人為創(chuàng)造的模擬性缺血肢體、大腦或心臟局部，結(jié)果在缺血性肢體、心肌和大腦中內(nèi)皮細胞重現(xiàn)和同側(cè)血管生成，改善了缺血組織的血流供應(yīng)，局部導(dǎo)入具有良好的治療效果(Ono T，F(xiàn)ujino Y，Tsuchiya T，et al，Neurosci Lett，1990，117259-263)。還有人將VEGF DNA和脂質(zhì)體混合后直接注射入小鼠腦皮質(zhì)中也獲得了基因表達(Mustonen T，Alitalo K，J Cell Biol，1995，129895-898)。就三種形式的VEGF裸DNA導(dǎo)入方式來看，復(fù)制缺陷型重組腺病毒表達載體和真核表達質(zhì)粒載體的裸DNA加脂質(zhì)體混合導(dǎo)入的方法，不可避免地存在制備過程復(fù)雜、病毒擴散可能性、免疫原及潛在的毒副作用等缺點，因此更多的人主張用真核表達質(zhì)粒載體的裸DNA直接注射的方法。
影響VEGF有效性的第二個方面是受體的量及持續(xù)時間，因為VEGF的生物學(xué)活性是通過受體介導(dǎo)而發(fā)揮作用的。VEGF通過兩個結(jié)構(gòu)相關(guān)的高親和力的酪氨酸激酶受體介導(dǎo)(Petrova TV，et al，Exp Cell Res，1999，253(1)117-130)，它們分別是180kD的VEGFR-1(fms-like tyrosine kinase，F(xiàn)lt-1)及200kD的VEGFR-2(kinase insert domain containing receptor/fetal liverkinase，KDR/Flk-1)(Petrova TV，et al，Exp Cell Res，1999，253(1)117-130)。Flt-1廣泛表達于胚胎及成人血管內(nèi)皮細胞，運用基因敲除法(gene knock out)剔除Flt-1基因的小鼠因沒有血管生成，而導(dǎo)致小鼠死亡，但有趣的是表達一缺乏酪氨酸激酶的截短Flt-1基因的小鼠能夠生成正常血管，這說明Flt-1基因或許是一“誘餌受體”(decoyreceptor)，而并非是一個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子(Kim KJ，et al，Nature，1993，362(6423)841-888)。KDR主要表達于胚胎發(fā)育期的血管內(nèi)皮細胞，在成人血管內(nèi)皮細胞則表達下降，雖然它也廣泛表達于胚胎發(fā)育期的血管內(nèi)皮細胞，但在成人組織中僅限表達于淋巴管內(nèi)皮細胞。最近又發(fā)現(xiàn)了一個新的VEGF受體neuropilin-1，它是一細胞表面的糖蛋白，為VEGF165特異性的受體。它不僅表達于內(nèi)皮細胞，而且表達于其他類型細胞中。盡管VEGFR對血管形成是必需的，但加入外源VEGFR卻降低了VEGF刺激內(nèi)皮細胞增殖的作用(馬驪，王小寧等，中國生物制品學(xué)雜志，2000，13(4)196-200)，其原因被認為是外源VEGFR與血管內(nèi)皮細胞表面的受體競爭結(jié)合VEGF，從而阻斷了VEGF的生物學(xué)活性，這對抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移、視網(wǎng)膜和關(guān)節(jié)滑膜新血管形成，治療腫瘤、糖尿病性視網(wǎng)膜病和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病有潛在的臨床藥用開發(fā)價值，但對血管病治療上似無益處。
VEGF表達水平還受其他因素的影響，如缺氧/缺血，某些病理狀態(tài)如皮膚燙傷、牛皮癬、遲發(fā)性過敏反應(yīng)和一氧化氮(NO)等均可促進VEGF合成。缺氧/缺血是胚胎組織、一些病變組織和腫瘤中血管發(fā)生的共性，在治療操作上無法人為控制。NO是血管系統(tǒng)中重要的信號分子(Michell BJ，et al，Curr Biol 1999，9(15)845-848)，當(dāng)它在動脈血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生時，迅速穿過細胞膜擴散至下層肌肉細胞，可使VEGF及其受體mRNA水平升高，從而解除肌肉細胞的收縮，使動脈舒展，控制血壓及血流的分配，防止血栓形成。在缺氧情況下，對大鼠肺進行離體灌流時發(fā)現(xiàn)，在灌流液中加入SNP(一種NO供體)，VEGF及其受體mRNA水平升高，當(dāng)加入L-NAME(一種NO合成酶抑制劑)后，VEGF及其受體mRNA水平下降(Tsurumi Y，et al，Nat Med，1997，3(8)879-886)。但NO是如何促進VEGF及其受體mRNA水平增加的不得而知，我們推測它們可能受NO誘導(dǎo)的啟動子控制之下。NO有如此強的誘導(dǎo)效果，而它又是人為可補給的調(diào)節(jié)因子，所以分離NO信號驅(qū)動的誘導(dǎo)性啟動子，構(gòu)建誘導(dǎo)型VEGF基因表達載體，在注入VEGF DNA的同時，加上產(chǎn)生NO的化學(xué)藥物，可能對提高VEGF治療血管病效果有重要作用。
從目前世界各國對VEGF治療動脈血管疾病的研究進展來看，美國處于領(lǐng)先地位，臺灣緊隨其后，其他地區(qū)仍處于臨床前試驗階段。美國人類基因組科學(xué)公司(HGS)利用VEGF-2治療冠狀動脈病的研究證明(Vascularendothelial growth factor-2(VEGF-2).http//www.hgsi.com/products/vegf.html)，當(dāng)注射VEGF-2基因到缺血組織中時，可使鄰近細胞產(chǎn)生VEGF-2蛋白質(zhì)，促進新生血管和淋巴管生長。該公司于1997年10月將VEGF-2基因轉(zhuǎn)讓給了血管遺傳學(xué)股份公司。血管遺傳學(xué)公司正在冠狀動脈病患者身上進行臨床I/II期試驗，對患各種危重肢體部分缺血癥患者的兩次試驗已完成，對冠狀動脈病的四次試驗中有3次已完成，第4次臨床試驗正在由食品醫(yī)藥品局(FDA)進行。據(jù)稱，給危重冠心病患者注射VEGF基因，使患者的心臟血流量增加，從而使患者的日常生活質(zhì)量得以改善。在此之前，他們曾接受各種療法，但都無濟于事。在接受這種療法的16位患者中，9位患者受損的冠心區(qū)冠狀動脈嚴重程度部分或全部地恢復(fù)了活力。六個月后，任何人都沒有再發(fā)作過心臟病，也沒有出現(xiàn)過較嚴重的并發(fā)癥，每周心絞痛的平均次數(shù)由治療前的48次降至目前的2次。據(jù)此，他們認定利用血管生長因子治療心血管疾病的基因療法是有效和安全的。目前臺灣也已完成了VEGF臨床前試驗，正在進行臨床I期試驗。從VEGF-2基因藥物應(yīng)用范圍來看，它可用于有嚴重心絞痛、現(xiàn)有治療法不能治療的病人，以及冠狀動脈疾病嚴重程度較輕的病人。用VEGF-2基因療法可取代各種心臟外科手術(shù)，或改善已接受外科手術(shù)的病人的療效及減輕充血性心臟障礙的病人的發(fā)病。用于治療肢體動脈疾患時，可以使病人免除某些切除手術(shù)，或者減少切除的范圍。它也可用以提高由局部缺血引起的皮膚潰瘍的治愈率，減輕病人痛苦。此外，還可用于治療由體育鍛煉而引起的小腿肚疼痛和腫脹。因此，VEGF-2基因藥物的應(yīng)用前景非常廣闊，具有實際開發(fā)價值。
3.發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是構(gòu)建含人源性VEGF啟動子(人體VEGF-A各變異體共同的啟動子，它可驅(qū)動VEGF-A各基因的轉(zhuǎn)錄)表達鼠源性VEGF-2基因的表達載體，其啟動子具有NO和缺氧可誘導(dǎo)調(diào)控元件，它既可在微生物中以多拷貝復(fù)制生產(chǎn)VEGF基因，又能夠在哺乳動物細胞中高效表達，在給予局部缺血性組織VEGF基因裸DNA的同時，輔以NO供體化學(xué)物質(zhì)，便可提高VEGF促進新生血管生成能力，更有力地改善缺血組織的供血狀況，達到更有效地治療血管疾病的目的。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種包含NO和缺氧誘導(dǎo)特異表達啟動子和VEGF-2基因的微生物克隆。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種將微生物生產(chǎn)的裸DNA注射到局部缺血哺乳動物模型中，對其促進血管生成、改善供血狀況的能力以及毒副作用進行鑒定的方法。
本發(fā)明首先從受孕小鼠胚胎克隆了鼠源性VEGF-2(mVEGF-2)基因(SEQID NO 1)，然后從新生兒胎盤克隆人源性VEGF啟動子(hVEGF promoter)(SEQ ID NO 3)，并使mVEGF-2被hVEGF promoter所驅(qū)動，然后插入哺乳動物表達載體pEGSH中，構(gòu)建出能夠在原核細胞中以高拷貝數(shù)產(chǎn)生大量DNA、并在原核和哺乳動物細胞中均能表達的載體pEGVPV。用這種載體轉(zhuǎn)化E.coli DH5α后，獲得DNA拷貝數(shù)有2000個/細胞之多，從細胞培養(yǎng)物中分離的DNA產(chǎn)量能夠達到1.5mg/L。缺血型動物模型實驗表明，向局部缺血組織顯微注射該裸DNA可促進新生血管形成，增強側(cè)枝循環(huán)的建立，有效地改善了缺血組織的血液供應(yīng)。本方法可能提供一種治療血管疾病的新方案，使血管內(nèi)皮生長因子能特異性地作用于血管內(nèi)皮細胞，強烈促進其增殖和血管形成，并有升高血管通透性的作用。
對影響VEGF作用的因素，特別是NO和缺血對VEGF作用發(fā)揮的刺激作用人們均有一定的認識，但目前國內(nèi)外用VEGF基因的裸DNA治療缺血性血管疾病研究中，都沒有考慮如何利用NO這個調(diào)控因子來增強VEGF基因治療的效果，而且構(gòu)建的載體中大多采用的是一些在哺乳動物細胞中能夠啟動基因表達的病毒啟動子，所啟動的是組成型表達，而事實上新生血管生成又是腫瘤細胞生長的一個條件，這樣一種無控的表達載體導(dǎo)入人體是否會有誘發(fā)腫瘤的潛在危險，仍無法預(yù)料。本發(fā)明利用具有NO可調(diào)控的人源性VEGF啟動子和鼠源性VEGF基因，導(dǎo)入缺血組織的同時配合使用釋放NO的化學(xué)藥品，有效地提高了VEGF的治療效果；同時采用的是具有人源性的啟動子，排除了病毒啟動子潛在地危險性，對人體會更加安全可靠。這樣的VEGF表達載體國內(nèi)外尚未有報道。
4.


圖1 小鼠胚胎RNA RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳結(jié)果Lane 1DGL2000 DNA MarkersLanes 2～4不同模扳(cDNA第一鏈)用量的PCR擴增產(chǎn)物，其中加入的模板量為2#1ul；3#1.5ul；4#2ul圖2 Bam HI和Eco RI對兩種質(zhì)粒酶切結(jié)果Lane 1DL2000 DNA MarkersLane 2pUC-V450Lane 3pET-28c(+)Lane 4λDNA/EcoR I+Hind III Markers圖3 人胎盤DNA作模板PCR擴增產(chǎn)物L(fēng)ane1PCR擴增產(chǎn)物L(fēng)ane2λDNA/EcoR I+Hind III Markers圖4 轉(zhuǎn)染Hela cells中熒光素酶活性熒光顯微觀察A.phrGFPVP轉(zhuǎn)染，NO刺激誘導(dǎo)；B.phrGFPVP轉(zhuǎn)染，缺氧刺激；C.phrGFPVP轉(zhuǎn)染，NO+缺氧刺激；D.phrGFPVP轉(zhuǎn)染，正常氧含量；E.空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，缺氧刺激；F.空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，正常氧供應(yīng)圖5 四種處理的大鼠缺血腦組織中心血管的形成比較圖6 具有hVEGF啟動子的mVEGF-2哺乳動物表達載體構(gòu)建示意圖
5.具體實施方式
實施例1.鼠源性VEGF-2基因及其在微生物表達系統(tǒng)中的蛋白鑒定根據(jù)已知mVEGF-2核苷酸序列(GenBankS38100，gi249860)設(shè)計一對特異引物，在這一對引物的5’端分別引入了BamH I和EcoR I位點。
Bam HIVP-15’-GCC TCCGGA TCCATG AAC TTT CTG-3’VP-25’-GAA TTCACC GCC TCG GCT TGT C-3’Eco RI從處死受孕2周的小鼠體內(nèi)取出胚胎，用總RNA提取試劑盒(GIBCO公司產(chǎn)品-TRIZOLReagent，Cat.No.15596)提取總RNA。以胚胎總RNA為模板，Oligo(dT)15作引物，在AMV Reverase(AMV-RT)作用下合成cDNA第一鏈。然后，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋50倍作模板，加入合成的引物(VP-1和VP-2)、dNTP和Taq DNA polymerase，混勻后進行PCR擴增。PCR擴增反應(yīng)參數(shù)為 擴增得到分子量約450bp、580bp和650bp的三個片段(圖1)。
由于小鼠胚胎的VEGF有三種變異體(VEGF-1、VEGF-2和VEGF-3)，分別含有164、120和188個氨基酸殘基(不包括N端26個氨基酸組成的信號肽)。與VEGF-3相比，較短的兩種變異體(VEGF-2和VEGF-1)缺失的氨基酸位于肽鏈羧基端，在cDNA堿基序列上的差別是近3’端的不同缺失所造成的，它們?nèi)咴?’和3’端序列相同，因此，用相同的一對引物擴增出了3條特異帶。
用PCR Fragment Recovery Kit回收PCR產(chǎn)物中分子量約為450bp的特異條帶(因為編碼VEGF-2變異體的cDNA長度為450bp)。在T4 DNA連接酶的作用下，將回收片段與pUCm-T Vector連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5α。挑選白色單菌斑搖菌，采用堿裂解法微量提取質(zhì)粒。通過滯后質(zhì)粒篩選、酶切和PCR鑒定，初步確定為重組子，提交上海聯(lián)合基因科技有限公司進行測序。由于pUCm-T Vector是用于PCR產(chǎn)物插入和克隆的載體(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品，Cat.No.D0211)，用M13通用引物和T7啟動子引物即可對PCR產(chǎn)物進行測序，我們要求上海聯(lián)眾基因公司進行測序時采用M13通用引物。測序結(jié)果為SEQ ID NO 1，其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO2，與GenBank中的VEGF-2序列(S38100，gi249860)進行同源性比較，相同率達到98.5％，確證得到VEGF-2基因，將此重組子命名為pUC-V450。
分別培養(yǎng)pUC-V450/E.coli DH5α和pET-28C/E.coli BL21，提取質(zhì)粒。根據(jù)pUC-V450和pET-28c(+)的酶切位點，選用Bam HI和Eco RI分別對這兩種質(zhì)粒酶切(圖2)；從pUC-V450質(zhì)粒酶切液中回收約470bp(包括酶切位點)片段，pET-28c(+)質(zhì)粒酶切液中回收5363bp片段；在T4 DNA連接酶作用下，將上述兩個回收片段連接，構(gòu)建成原核表達載體，將此重組質(zhì)粒命名為pET-V450。然后將pET-V450轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21，涂布到加卡那霉素(50mg/L)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜。次日從轉(zhuǎn)化菌涂布平皿上挑取隔離良好的單菌落8個，少量搖菌后提取質(zhì)粒，PCR鑒定均為陽性。
按照pET-28c(+)Kit試劑盒說明書的方法，用IPTG對克隆菌進行誘導(dǎo)表達，結(jié)果預(yù)期的20kD蛋白分子得以高水平表達。實施例2.人源性VEGF啟動子的克隆和綠色熒光蛋白(GFP)基因瞬時表達載體構(gòu)建及其功能鑒定人源性VEGF基因(hVEGF)上游序列已有報道(GenBankAF095785，gi4154290)，為3401bp，這樣大的片段克隆難度較大。按照真核啟動子的一般特點，啟動子的主要元件通常在轉(zhuǎn)錄起始位點上游1kb左右。根據(jù)Hideo等(Hideo K，et al.Blood，2000，95189-197)的研究，我們進一步分析認為，-1041～-1(從轉(zhuǎn)錄起始位點排序)的片段包括了啟動子的基本元件。但在Hideo等(Hideo K，et al.Blood，2000，95189-197)的研究中并未考慮5’端非翻譯區(qū)(5’-UTR)(指轉(zhuǎn)錄起始位點開始后的+1～+1038片段)，現(xiàn)在人們越來越認識到5’-UTR對基因表達調(diào)控起著非常重要的作用。因此，我們將5’-UTR片段也一并克隆，并對其表達調(diào)控能力進行了鑒定。
1.hVEGF啟動子的克隆根據(jù)Brogan等(Brogan IJ，et al，Hum.Immunol.1999，60(12)1245-1249)報道的人源性VEGF基因及啟動子序列(GenBankAF095785，gi4154290)，綜合分析后設(shè)計并合成如下兩個引物Not I引物VPP-15’-GCG CGG CCG CCT GTC TGC CCA GCT GCC TCC CCC-3’Bam HI引物VPP-25’-CGCGGA TCCGGT TTC GGA GGC CCG ACC GGG-3’在這一對引物的5’端分別引入了Not I位點和Bam HI位點。
以人胎盤總DNA為模板，通過PCR擴增(94℃，3min；94℃ 40sec，65℃ 40sec，72℃ 2min，循環(huán)30次；72℃ 10min補平)得到約2.06kb的產(chǎn)物(圖3)，回收純化后與pUCm-TVector連接，用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆并提取重組質(zhì)粒，進行酶切鑒定和PCR擴增鑒定，初步確定hVEGF啟動子片段已插入到T-Vector，提交基因公司進行測序，其測序方法和使用引物如同前述。測序結(jié)果如SEQ ID NO 3所示，與GenBank中的人源性VEGF基因(hVEGF)上游序列(AF095785，gi4154290)進行了同源性比較，結(jié)果相同率達到98.2％，由此確證該質(zhì)粒含有hVEGF啟動子序列，將此重組質(zhì)粒命名為pUCVP。
2.hVEGF啟動子功能及特性鑒定選用phrGFP Vector(美國STRATAGENE公司產(chǎn)品，德國MERCK公司代理，Cat.No.#240063)作為哺乳動物表達載體，用以鑒定hVEGF啟動子功能及特性。此載體具有人性化的綠色熒光蛋白(hrGFP)報告基因，對轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞只是低毒，不影響細胞的活性和便于表達水平檢測；在hrGFP基因上游具有多克隆位點，便于將啟動子或增強子插入，對其功能進行鑒定。用Bam HI和Not I，分別對phrGFPVector和pUCVP酶切，回收3670bp(phrGFP Vector經(jīng)BamH I和Not I酶切后的大片段)和2078bp片段(包括hVEGF啟動子2064bp片段及加入的Not I和BamH I酶切位點的14bp)，混合，在T4 DNA連接酶作用下連接，導(dǎo)入E.coli DH5α，涂布到含有Amp的LB固體培養(yǎng)基的平皿上培養(yǎng)14h。挑選單菌落搖菌，提取質(zhì)粒，進行PCR鑒定，陽性重組子即為具有hVEG啟動子的哺乳動物表達載體，命名為phrGFPVP。
3.瞬時表達的鑒定在Φ10cm組織培養(yǎng)皿中，加入20μl脂質(zhì)轉(zhuǎn)染物(Life Technologies，Rockville，MD)和濃縮20％-30％的赫拉細胞株(Hela cells)的細胞，用載體質(zhì)粒(5μg phrGFPVP)進行轉(zhuǎn)染，同時用空載體phrGFP Vector作對照。在37℃下，轉(zhuǎn)染孵育培養(yǎng)15h。轉(zhuǎn)染培養(yǎng)到預(yù)訂時間后，用正常培養(yǎng)基替換含DNA的培養(yǎng)基，給予有氧(21％O2)、缺氧(1％O2)、NO供體化學(xué)試劑S-亞硝基-N-乙酰基-D，L-青霉胺(SNAP)等處理，在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)12h。
刮下細胞，溶于200μl 0.25mol/L Tris-Cl(pH7.5)，在4℃ 270g離心10min收集細胞。用緩沖液重懸沉淀，冰上放置10min，然后用注射器反復(fù)抽吸5-8次以便勻質(zhì)化。用10×的緩沖液(40mmol/L Tris-Cl[pH7.9]，10mmol/LEDTA[pH8.0]，150mmol/L NaCl)收集的細胞，重懸在整體細胞提取緩沖液(10mmol/L N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙烷磺酸[pH 7.9]；400mmol/L NaCl；0.1mmol/L EDTA；5％[vol/vol]甘油；1mmol/L DTT；and 1mmol/L苯甲基磺酰氟化物)。然后在4℃條件下，16,000g離心30min。上清液貯藏在-70℃?zhèn)溆谩?br> 將100μl細胞提取物和225μl熒光素試劑混合，用以鑒定熒光素酶活性。37℃孵化0.5-1h后，加入50μl 1mol/L Na2CO3終止反應(yīng)。在熒光顯微鏡像觀察并照像，同時測定A420的吸光度。以β-半乳糖苷酶活性作為熒光素酶活性的標準來測定相對熒光素酶活性(平均值±標準誤)，以刺激的細胞相對熒光素酶活性對非刺激對照的比率作為測定折算的誘導(dǎo)活性。
根據(jù)觀測結(jié)果，不同處理的轉(zhuǎn)染細胞中的熒光素酶活性差別非常明顯，用空載體轉(zhuǎn)染的細胞中幾無熒光素酶表達(圖4-E，F(xiàn))，而在具有hVEGF啟動子phrGFPVP轉(zhuǎn)染的細胞中均有熒光素酶表達(圖4-A，B，C，D)，缺氧和NO刺激可顯著的提高熒光素酶的表達(圖4-A，B，C)，說明克隆的hVEGF啟動子具有誘導(dǎo)調(diào)控的特性。熒光素酶活性的吸光度測定(結(jié)果略)也得到同樣的結(jié)果。
實施例3.hVEGF啟動子和VEGF-2哺乳動物表達載體構(gòu)建和缺血性模型動物實驗1.hVEGF啟動子和mVEGF-2哺乳動物表達載體的構(gòu)建選用pEGSH(美國STRATAGENE公司產(chǎn)品，德國MERCK公司代理，Cat.No.#217461)為插入hVEGF啟動子和mVEGF-2的表達載體。之所以選擇此載體，主要是出于三個方面的考慮①該質(zhì)粒具有ColE1復(fù)制原點和Amp選擇標記，為松弛型質(zhì)粒，可在微生物中以多拷貝形式存在，有利于利用微生物來高效生產(chǎn)hVEGF啟動子和mVEGF-2裸DNA；選擇標記的存在可防止重組質(zhì)粒在宿主菌中丟失，有利于維持工程菌穩(wěn)定性；②具有多克隆位點(MCS)，便于外源基因的插入；③此質(zhì)粒無病毒啟動子，在MCS下游具有猿猴空泡病毒40(SV40)的多聚腺苷化作用區(qū)段，可使外源功能基因轉(zhuǎn)錄后加上poly(A)，這對維持外源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物穩(wěn)定性和提高翻譯水平是極為重要的，據(jù)產(chǎn)品使用說明書介紹該質(zhì)?？墒雇庠椿虮磉_水平提高1200～1700倍。
用Not I和BamH I分別將pUCVP質(zhì)粒和pEGSH酶切消化，回收2078bp片段(包括hVEGF啟動子2064bp片段、并包括加入的Not I和BamH I酶切位點的14bp)和4812bp(pEGSH酶切后的大片段)片段，在T4 DNA連接酶作用下連接，導(dǎo)入感受態(tài)E.coli DH5α，涂布在含有Amp的固體培養(yǎng)基進行篩選，挑取隔離良好的單菌落搖菌，提取質(zhì)粒，進行滯后質(zhì)粒篩選和PCR鑒定，陽性重組子即是含有hVEGF啟動子的質(zhì)粒，命名為pEGVP。
接著用BamH I和Eco RI分別酶切pEGVP和pUC-V450，回收6890bp(pEGVP經(jīng)BamH I和Eco RI酶切后的大片段)和474bp(VEGF-2 cDNA及BamH I和Eco RI位點)片段，按上述方法進行連接、轉(zhuǎn)化和鑒定，陽性克隆命名為pEGVPV(圖6)。
2.缺血性模型動物實驗的結(jié)果(1)動物模型制作和分組選用大鼠為實驗動物。供試大鼠大腦缺血模型制作按Longa等的線栓法(Longa EZ et al.Stroke，1989，2084-91)進行；缺血動物模型分為四組一組注射裸pEGVPV質(zhì)粒DNA(含hVEGF啟動子和5’UTR及mVEGF-2cDNA)，另一組注射注射裸pEGVPV質(zhì)粒DNA(含hVEGF啟動子和5’UTR及mVEGF-2cDNA)+NO供體化學(xué)試劑S-亞硝基-N-乙酰基-D，L-青霉胺(SNAP)，第三組注射裸pEGSH(空載)質(zhì)粒DNA+S-亞硝基-N-乙酰基-D，L-青霉胺(SNAP)，第四組注射生理鹽水(對照，CK)。各組動物均要達到4～6只。
(2)基因轉(zhuǎn)染按照以上四組設(shè)計，在制作模型的同時，用微量注射器立即向局部缺血區(qū)注射相應(yīng)的裸質(zhì)粒DNA(或生理鹽水及SNAP)。對大腦缺血動物模型組中，應(yīng)先用手捻鉆在前顱開一小孔，然后注射裸質(zhì)粒DNA、空載質(zhì)?；騍NAP，縫合傷口。
(3)VEGF-2基因表達水平檢測基因?qū)?天后，從局部缺血組織提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄后用VEGF-2的一組擴增引物進行PCR擴增，然后進行電泳分析。
(4)VEGF-2基因蛋白表達檢測基因?qū)?天后，取動物模型組缺血區(qū)組織，固定、包埋、速凍后，在冷凍切片機上切片，用多克隆抗體及免疫組織化檢測試劑盒進行免疫化學(xué)染色，鏡檢。
(5)血管計數(shù)給藥后10d，每組取一只動物做血管造影。麻醉下4F導(dǎo)管經(jīng)左頸總動脈至腹主動脈上3cm處，注射76％復(fù)方泛影葡胺，速度3ml/s，4s后用X光片拍照記錄。
(6)栓塞體積測定組織經(jīng)固定、包埋、速凍后，進行冷凍切片、染色，在圖象分析系統(tǒng)上測量梗塞面積及總面積，然后折算成體積。
(7)統(tǒng)計資料分析計數(shù)資料用相對數(shù)表示，用兩組獨立樣本X2(卡)檢驗進行統(tǒng)計學(xué)處理；計量資料用x±s表示，用兩組獨立樣本t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)處理。統(tǒng)計軟件采用SAS軟件包。
實驗結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)移空載質(zhì)粒和注射生理鹽水的對照組相比，轉(zhuǎn)移具有hVEGF啟動子驅(qū)動的mVEGF-2基因后5天的大鼠腦組織中有mRNA的表達，且同時注射SNAP的實驗組大鼠腦組織中mRNA的表達量是僅注射含hVEGF啟動子和mVEGF-2基因質(zhì)粒的2～3倍。VEGF-2免疫組化染色可見VEGF-2蛋白表達水平增高，腦血管數(shù)增多(圖5)，梗塞體積縮小(表1)，尤以同時注射具有hVEGF啟動子的mVEGF-2基因質(zhì)粒裸DNA和NO釋放劑(SNAP)的實驗組效果最為明顯。
表1 四種處理組合對降低大鼠腦梗塞體積缺血腦組織 梗塞體積/大腦體積 (％)X±s(％)注射處理 1 2 3 4裸pEGVPV DNA 11.3 10.7 8.69.4 10.0±1.2*裸pEGVPV 8.26.05.35.7 6.3±1.3**DNA+SNAP裸pEGSH16.3 18.4 14.2 18.816.8±2.0DNA+SNAP生理鹽水(CK) 26.1 23.3 21.7 20.522.9±2.4*較對照達到P＜0.05的顯著水平；**較對照達到P＜0.01的顯著水平。SEQ ID NO 1的信息序列特征(A)(長度)457個堿基(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)(拓撲結(jié)構(gòu))線性序列描述SEQ IDNO 1起始密碼↓1 GCCTCCGGAT CCATGAACTT TCTGCTGTCT TGGGTGCACT GGACCCTGGC51TTTACTGCTG TACCTCCACC ATGCCAAGTG GTCCCAGGCT GCACCCACGA101 CAGAAGGAGA GCAGAAGTCC CATGAAGTGA TCAAGTTCAT GGACGTCTAC151 CAGCGAAGCT ACTGCCGTCC AATTGAGACC CTGGTGGACA TCTTCCAGGA201 GTACCCCGAC GAGATAGAGT ACATCTTCAA GCCGTCCTGT GTGCCGCTGA251 TGCGCTGTGC AGGCTGCTGT AACGATGAAG CCCTGGAGTG CGTGCCCACG301 TCAGAGAGCA ACATCACCAT GCAGATCATG CGGATCAAAC CTCACCAAAG351 CCAGCACATA GGAGAGATGA GCTTCCTACA GCACAGCCGA TGTGAATGCA401GACCAAAGAA AGACAGGACA AAGCCAGAAA AATGTGACAA GCCGAGGCGG451TGAATTC↑終止密碼SEQ ID NO 2的信息序列特征(A)(長度)146個氨基酸(B)類型多肽(C)鏈性單鏈(D)(拓撲結(jié)構(gòu))線性序列描述SEQ ID NO 2信號肽1 APTT EGEQKSHEVI KFMDVYQRSY51 CRPIETLVDI FQEYPDEIEY IFKPSCVPLM RCAGCCNDEA LECVPTSESN101ITMQIMRIKP HQSQHIGEMS FLQHSRCECR PKKDRTKPEK CDKPRRSEQ ID NO 3的信息序列特征(A)(長度)2064個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)(拓撲結(jié)構(gòu))線性序列描述SEQ ID NO 3NF-kB-like序列1 CTGTCTGCCC AG HIF-1結(jié)合位點 HIF-1輔助序列AP-1位點51 101151201TGCAGGCC AGATGAGGGC251TCCAGATGGC ACATTGTCAG AGGGACACAC TGTGGCCCCT GTGCCCAGCC301CTGGGCTCTC TGTACATGAA GCAACTCCAG TCCCAAATAT GTAGCTGTTT351GGGAGGTCAG AAATAGGGGG TCCAGGAGCA AACTCCCCCC ACCCCCTTTC401CAAAGCCCAT TCCCTCTTTA GCCAGAGCCG GGGTGTGCAG ACGGCAGTCA451CTAGGGGGCG CTCGGCCACC ACAGGGAAGC TGGGTGAATG GAGCGAGCAG501CGTCTTCGAG AGTGAGGACG TGTGTGTCTG TGTGGGTGAG TGAGTGTGTG551CGTGTGGGGT TGAGGGTGTT GGAGCGGGGA GAAGGCCAGG GGTCACTCCA601GGATTCCAAC AGATCTGTGT GTCCCTCTCC CCACCCGTCC CTGTCCGGCT651CTCCGCCTTC CCCTGCCCCC TTCAATATTC CTAGCAAAGA GGGAACGGCT701CTCAGGCCCT GTCCGCACGT AACCTCACTT TCCTGCTCCC TCCTCGCCAA751TGCCCCGCGG GCGCGTGTCT CTGGACAGAG TTTCCGGGGG CGGATGGGTA801ATTTTCAGGC TGTGAACCTT GGTGGGGGTC GAGCTTCCCC TTCATTGCGG851CGGGCTGCGG GCCAGGCTTC ACTGGGCGTC CGCAGAGCCC GGGCCCGAGC901CGCGTGTGGA GGGGCTGAGG CTCGCCTGTC CCCGCCCCCC GGGGCGGGCC951GGGGGCGGGG TCCCGGCGGG GCGGAGCCAT GCGCCCCCCC CTTTTTTTTT1001 TAAAAGTCGG CTGGTAGCGG GGAGG TCGC GGAGGCTTGG GGCAGCCGGG-1+1(轉(zhuǎn)錄起始位點)1051 TAGCTCGGAG GTCGTGGCGC TGGGGGCTAG CACCAGCGCT CTGTCGGGAG1101 GCGCAGCGGT TAGGTGGACC GGTCAGCGGA CTCACCGGCC AGGGCGCTCG1151 GTGCTGGAAT TTGATATTCA TTGATCCGGG TTTTATCCCT CTTCTTTTTT1201 CTTAAACATT TTTTTTTAAA ACTGTATTGT TTCTCGTTTT AATTTATTTT1251 TGCTTGCCAT TCCCCACTTG AATCGGGCCG ACGGCTTGGG GAGATTGCTC1301 TACTTCCCCA AATCACTGTG GATTTTGGAA ACCAGCAGAA AGAGGAAAGA1351 GGTAGCAAGA GCTCCAGAGA GAAGTCGAGG AAGAGAGAGA CGGGGTCAGA1401 GAGAGCGCGC GGGCGTGCGA GCAGCGAAAG CGACAGGGGC AAAGTGAGTG1451 ACCTGCTTTT GGGGGTGACC GCCGGAGCGC GGCGTGAGCC CTCCCCCTTG1501 GGATCCCGCA GCTGACCAGT CGCGCTGACG GACAGACAGA CAGACACCGC1551 CCCCAGCCCC AGCTACCACC TCCTCCCCGG CCGGCGGCGG ACAGTGGACG1601 CGGCGGCGAG CCGCGGGCAG GGGCCGGAGC CCGCGCCCGG AGGCGGGGTG1651 GAGGGGGTCG GGGCTCGCGG CGTCGCACTG AAACTTTTCG TCCAACTTCT1701 GGGCTGTTCT CGCTTCGGAG GAGCCGTGGT CCGCGCGGGG GAAGCCGAGC1751 CGAGCGGAGC CGCGAGAAGT GCTAGCTCGG GCCGGGAGGA GCCGCAGCCG1801 GAGGAGGGGG AGGAGGAAGA AGAGAAGGAA GAGGAGAGGG GGCCGCAGTG1851 GCGACTCGGC GCTCGGAAGC CGGGCTCATG GACGGGTGAG GCGGCGGTGT1901 GCGCAGACAG TGCTCCAGCC GCGCGCGCTC CCCAGGCCCT GGCCCGGGCC1951 TCGGGCCGGG GAGGAAGAGT AGCTCGCCGA GGCGCCGAGG AGAGCGGGCC2001 GCCCCACAGC CCGAGCCGGA GAGGGAGCGC GAGCCGCGCC GGCCCCGGTC2051 GGGCCTCCGA AACC
權(quán)利要求
1.一種包含有人源性VEGF啟動子(hVEGF promoter)和鼠源性VEGF-2cDNA(mVEGF-2)的載體，其特征在于該載體的hVEGF啟動子和mVEGF-2定向連接在一起，hVEGF啟動子位于mVEGF-2上游，使mVEGF-2基因被hVEGF啟動子所驅(qū)動。
2.一種如權(quán)利要求1所述的載體，其中鼠源性VEGF-2基因核苷酸序列為SEQ ID NO 1。
3.一種如權(quán)利要求1所述的載體，其中人源性VEGF啟動子的核苷酸序列為SEQ ID NO 3。
4.一種構(gòu)建如權(quán)利要求1-3所述任一載體的方法。
5.一種含有如權(quán)利要求1-3所述任一載體的微生物克隆。
6.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1-3所述任一載體的方法，其特征在于，將權(quán)利要求1-3所述的載體轉(zhuǎn)化入受體菌，將受體菌搖菌活化后，從中大量提取純化質(zhì)粒DNA。
7.一種權(quán)利要求1-3所述任一載體的用途，其特征在于該載體作為治療血管疾病的基因藥物。
8.一種權(quán)利要求1-3所述任一載體的用途，其特征在于該載體以裸DNA的方式作為治療血管疾病的基因藥物。
9.一種檢測權(quán)利要求1-3所述任一載體的以裸DNA方式作用效果的方法，其特征在于，將微生物生產(chǎn)的權(quán)利要求1-3所述任一載體的裸DNA注射到局部缺血哺乳動物模型中。
10.權(quán)利要求9所述的方法包括局部缺血模型制作，向缺血組織注射裸DNA的劑量的確定、NO供體化學(xué)試劑及用量的確定。
全文摘要
本方法從受孕小鼠胚胎克隆了鼠源性VEGF－2(mVEGF－2)基因，然后從新生兒胎盤克隆人源性VEGF啟動子(hVEGF promoter)，并使mVEGF－2被hVEGF promoter所驅(qū)動，插入哺乳動物表達載體pEGSH中，構(gòu)建出能夠在原核細胞中以高拷貝數(shù)產(chǎn)生大量DNA、并能在原核和哺乳動物細胞中均能表達的載體pEGVPV。用這載體轉(zhuǎn)化E.coli DH5α后，獲得的DNA拷貝數(shù)有2000個/細胞之多，從細胞培養(yǎng)物中分離的DNA產(chǎn)量能夠達到1.5mg/L。本發(fā)明還提供了一種以微生物生產(chǎn)血管內(nèi)皮生長因子－2(vascular endothelial growth factor2，VEGF－2)DNA藥物的方法。血管內(nèi)皮生長因子能特異性地作用于血管內(nèi)皮細胞，強烈促進其增殖和血管形成，并有升高血管通透性的作用。缺血型動物模型實驗表明，向局部缺血組織顯微注射該裸DNA可促進新生血管形成，增強側(cè)枝循環(huán)的建立，有效地改善了缺血組織的血液供應(yīng)。本方法可提供一種治療血管疾病的新方案。
文檔編號A61K48/00GK1467295SQ03100580
公開日2004年1月14日 申請日期2003年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月20日
發(fā)明者周長生, 張金文, 陳正華 申請人:甘肅亞盛鹽化工業(yè)集團有限責(zé)任公司