專利名稱：丙型肝炎病毒高變區(qū)1合成肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學領(lǐng)域。尤其涉及一種含有丙型肝炎病毒高變區(qū)1合成肽的多肽或其藥物可接受的鹽，該多肽作為制備治療和/或預(yù)防丙型肝炎的藥劑的應(yīng)用，以及含有該多肽的藥物組合物、疫苗、編碼該多肽的多核苷酸。
丙型肝炎易慢性化的主要原因是由于丙型肝炎病毒極高的變異率，在免疫選擇作用下，形成丙型肝炎病毒高變區(qū)1(HVR1區(qū))基因的高度變異，以逃避免疫監(jiān)視。報道表明，HVR1也是主要的中和抗原區(qū)段，含有重要的中和性抗原表位，能誘導宿主產(chǎn)生中和性抗體。因此闡明HVR1的中和抗原表位及這些抗原表位的變異規(guī)律，有助于保護性多肽及基因疫苗研制，是疫苗研究的關(guān)鍵。本發(fā)明人經(jīng)過大量的研究，發(fā)現(xiàn)中國人HCV的變異并非完全隨機，具有一定的保守性，各位點某種氨基酸的出現(xiàn)有特定的概率，且氨基酸的突變多是在具有相似理化性質(zhì)的氨基酸之間，由此可見HCV的生存具有一定的生物學限制，既然高變區(qū)的變異具有一定的規(guī)律性的，本發(fā)明人提出了中國人II/III型HCV～HVR1區(qū)的保守位點是構(gòu)成抗原的基本框架。另外有研究表明對不同HVR1序列誘生的抗HCV～HVR1的多肽之間有很強的交叉反應(yīng)，也提示本區(qū)內(nèi)有保守的抗原表位。
目前，對于丙型肝炎病毒致病機制尚不清楚，還沒有確實有效的治療方法和疫苗以防止其進一步傳播，現(xiàn)在臨床上常使用的干擾素的長期有效率僅為20％，研究和發(fā)展降低HCV感染率，減輕病毒復(fù)制量的HCV疫苗是迫切需要完成的工作。對于HCV患者來說，研制針對丙型肝炎病毒的治療藥物更為有意義。
本發(fā)明還提供本發(fā)明的多肽在制備治療丙型肝炎的藥劑的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供本發(fā)明的多肽在制備預(yù)防丙型肝炎的藥劑的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供一種用于治療丙型肝炎的藥物組合物，其含有治療有效量的本發(fā)明的多肽和必要時藥學上可接受的載體或賦形劑。
本發(fā)明還提供一種疫苗組合物，其含有有效量的本發(fā)明所述的多肽和有效量的弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑。
本發(fā)明還提供一種編碼含有本發(fā)明多肽的多核苷酸。
本發(fā)明人在研究中國人群丙型肝炎病毒II/III型高變區(qū)1序列變異規(guī)律的基礎(chǔ)上，通過計算機模建分析設(shè)計并合成了本發(fā)明的多肽，并對這些多肽進行了與HCV患者血清的反應(yīng)性的研究，體外刺激HCV感染PBMC細胞因子分泌的研究，以及免疫小鼠體內(nèi)免疫原性及血清中細胞因子研究。
本發(fā)明提供一種多肽或其藥物可接受的鹽，其含有一個或多個如SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列的合成肽GQTYTSG(肽1)，其具有誘導細胞因子γ-IFN、IL-4、IL-10和抗體產(chǎn)生的功能。
如本發(fā)明的實施例2和4所示，肽1表現(xiàn)出廣泛的交叉反應(yīng)性和強的誘導抗體產(chǎn)生的能力。這說明其中包含完整的抗原表位，結(jié)合它包括7個氨基酸(383-389)位氨基酸位點，而這個長度正好相當于一個抗原表位的長度，故可以推測383-389位氨基酸就是一個高變區(qū)抗原位點。從本發(fā)明的實驗數(shù)據(jù)也可以看出，肽1結(jié)構(gòu)簡單，生物活性好，是一個很好的活性肽分子。
如實施例2、3和4所示，本發(fā)明的多肽或其藥物可接受的鹽具有誘導細胞因子γ-IFN、IL-4、IL-10和抗體產(chǎn)生的作用。由于γ-IFN主要是Th1分泌的細胞因子，是人體免疫系統(tǒng)抵抗病毒感染的主要細胞因子之一，而針對HCV的細胞免疫反應(yīng)對于HCV的清除具有相當重要的意義。因此，本發(fā)明同時提供了一種具有預(yù)防和/或治療丙型肝炎的作用的多肽。
在本發(fā)明的實施方案中，本發(fā)明的多肽可以含有一個或多個如SEQ IDNO.1所示氨基酸序列。在相鄰的序列之間任選有適當?shù)慕宇^或沒有接頭。換句話說，本發(fā)明的多肽分子中如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列可以任選通過適當?shù)慕宇^相互連接，形成多聚體。本發(fā)明的多肽還可以與本發(fā)明人同一申請日提交的另一申請所公開的含有合成肽GQTYTSGX的多肽連接，其中X為A或G，形成異聚多聚體。另外，本發(fā)明多肽還可以與其它的蛋白形成融合蛋白，如可以與牛血清白蛋白形成融合蛋白，以增強其免疫原性。
本發(fā)明的多肽可以單獨使用，也可以以藥物可接受的鹽形式使用。
“藥物可接受的鹽”指適于與人或動物的組織接觸，而無過多的毒性、刺激、變態(tài)反應(yīng)等的鹽。藥物可接受的鹽是本領(lǐng)域熟知的。這種鹽可以在本發(fā)明多肽的最終分離和純化的過程中制備，也可以將多肽與適當?shù)挠袡C或無機酸或堿反應(yīng)單獨制備。代表性酸加成鹽包括但不限于乙酸鹽、二己酸鹽、藻酸鹽、檸檬酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、富馬酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、煙酸鹽、2-萘磺酸鹽、草酸鹽、3-苯基丙酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、磷酸鹽、谷氨酸鹽、碳酸氫鹽、對甲苯磺酸鹽和十一烷酸鹽。能用于形成藥物可接受鹽的優(yōu)選的酸是鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、草酸、馬來酸、琥珀酸和檸檬酸。藥物可接受的堿加成鹽中的陽離子包括但不限于堿金屬或堿土金屬離子如鋰、鈉、鉀、鈣、鎂和鋁等，以及非毒性季銨陽離子如銨、四甲基銨、四乙基銨、甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、三乙基胺、二乙基胺、乙基胺、二乙胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪等。優(yōu)選的堿加成鹽包括磷酸鹽、tris和乙酸鹽。
本發(fā)明的多肽可以按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)固相合成方法合成。例如本發(fā)明多肽可以按Steward and Young(Steward，J.M.and Young，J.D.，Solid Phase Peptide Synthesis，2ndEd.，Pierce Chemical Company，Rockford，I11.，(1984))描述的方法用Applied Biosystem合成儀或PioneerTM肽合成儀按固相化學技術(shù)合成。也可以先合成多個片段，然后連在一起形成更大的片段。對于固相肽合成，在Steward，J.M.and Young，J.D.，Solid Phase Peptide Synthesis，W.H.Freeman Co.(San Francisco)，1963和J.Meienhofer，Hormonal Proteins and Peptides，vol.2，p.46，Academic Press(New York)，1973中可以找到許多技術(shù)的介紹。一般，這些方法包括向成長的肽鏈上依次添加一個或多個氨基酸或適當保護的氨基酸。一般，第一個氨基酸的氨基或羧基用適當?shù)谋Ｗo基保護，然后將保護的氨基酸連在惰性固相載體上，隨后在適于形成酰胺鍵的條件下加入相應(yīng)氨基或羧基被適當保護的序列中的下一個氨基酸。然后從新加入的氨基酸殘基上除去保護基，再加入必要時適當保護的下一個氨基酸，如此重復(fù)操作。當所有氨基酸以正確的順序連接后，相繼或同時除去任何剩余的保護基和固相支持物，得到最終的多肽。通過簡單修改此一般程序，可能一次向成長鏈添加一個以上的氨基酸。
制備本發(fā)明的較短的多肽，例如肽1優(yōu)選的方法是固相肽合成，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，使用413A自動合成儀(PE公司的產(chǎn)品)制備本發(fā)明的多肽。其中使用α氨基被酸或堿敏感性基團保護的氨基酸。這種保護基應(yīng)該在肽鍵形成條件下穩(wěn)定，又容易除去而不破壞成長的肽鏈、不會引起其中的任何手性中心外消旋。適當?shù)谋Ｗo基有9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧羰基(Boc)、芐氧羰基(Cbz)、2-氰基叔丁氧羰基等。9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)是合成本發(fā)明肽特別優(yōu)選的。制備本發(fā)明的較長的多肽為本領(lǐng)域已知的，可以使用戊二醛交聯(lián)的方法，也可以使用基因表達的方式獲得。
本發(fā)明還提供本發(fā)明的多肽作為制備治療丙型肝炎的藥劑的應(yīng)用。在本發(fā)明的實施例3和4中，可以看出在人PBMC培養(yǎng)上清和免疫小鼠血清中γ-IFN、白介素-4、白介素-10都有不同程度的提高，尤其是γ-IFN水平的升高是一個非常令人感興趣的現(xiàn)象，因為γ-IFN主要是Th1分泌的細胞因子，是人體免疫系統(tǒng)抵抗病毒感染的主要細胞因子之一，它通過誘導2-5A合成酶，進而活化RNaseL，降解病毒RNA，從而抑制病毒蛋白的合成。根據(jù)本發(fā)明的實驗結(jié)果，本發(fā)明的多肽具有激活一定強度的細胞免疫反應(yīng)的能力，而針對HCV的細胞免疫反應(yīng)對于HCV的清除具有相當重要的意義。
本發(fā)明提供一種藥物組合物，其含有治療有效量的本發(fā)明多肽和必要時藥學上可接受的載體或賦形劑。藥學上可接受的載體或賦形劑指無毒固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)填充劑、稀釋劑、包裹材料或其他制劑輔料?？梢愿鶕?jù)治療目的、給藥途徑的需要將藥物組合物制成各種劑型，例如溶液劑、脂質(zhì)體包裹劑、微膠囊劑及其他緩釋制劑。載體或賦形劑的例子包括生理鹽水、等滲葡萄糖溶液、緩沖鹽水、甘油、乙醇及上述溶液的組合?？筛鶕?jù)需要在組合物中添加輔助成份，例如與本發(fā)明多肽有協(xié)同作用的化合物；人血清白蛋白、低分子量肽、氨基酸和金屬陽離子等蛋白保護劑；等等。例如，本發(fā)明提供一種上述藥物組合物，其含有本發(fā)明所述的多肽和Al(OH)3，其中每毫升生理鹽水或中性磷酸鹽緩沖液(PBS)中含有如SEQ IDNO.1所示合成肽約1.0-15mg(即以肽1為基準)，含有Al(OH)3約0.5-2mg。所述中性磷酸鹽緩沖液為本領(lǐng)域熟知的，優(yōu)選pH約7.2-7.4。上述試劑經(jīng)滅菌過濾后，2ml/安培瓶，使用時采用肌肉注射方式。上述藥物組合物更優(yōu)選含有本發(fā)明的多肽和Al(OH)3，其中每毫升生理鹽水或中性磷酸鹽緩沖液(PBS)中含有如SEQ ID NO.1所示合成肽約1.0-12mg，Al(OH)3約1mg。當然，藥物組合物也可以直接由有效量的本發(fā)明的多肽和生理鹽水構(gòu)成，使用時采用靜脈滴注方式。
本發(fā)明還提供本發(fā)明的多肽作為制備治療丙型肝炎的藥劑的應(yīng)用。雖然丙型肝炎的治療與預(yù)防是兩個不同的方面，在治療中發(fā)揮作用的細胞因子與抗體水平并不緊密相關(guān)。但本發(fā)明的實施例2和4中，同時也證明肽1也具有誘導抗體產(chǎn)生的能力。尤其在本發(fā)明的實施例4中，表明肽1在小鼠體內(nèi)誘導對應(yīng)抗體的產(chǎn)生，三組免疫小鼠血清學結(jié)果同陰性對照組進行T檢驗，P＜0.05。
本發(fā)明還提供一種丙型肝炎疫苗組合物，其含有本發(fā)明所述多肽和有效量的弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑。其中，弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，可通過商購(例如GIBCOBRL公司)獲得，含量也是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易確定的。為了進一步提高本發(fā)明多肽的免疫原性，本發(fā)明多肽可以進一步與其它蛋白形成融合肽。例如，可以與牛血清白蛋白形成的融合肽，以通過結(jié)合大的免疫原性強的分子，來提高目的多肽的免疫原性。
此外，本發(fā)明還涉及一種編碼含有如SEQ ID NO.1所示合成肽的多肽的多核苷酸。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知，可以根據(jù)不同氨基酸對應(yīng)的密碼子，確定編碼含有如SEQ ID NO.1所示合成肽的多肽的多核苷酸，當然，由于密碼子的簡并性，所述的多核苷酸可以有不同的形式，優(yōu)選根據(jù)不同生物密碼子的使用頻率，選擇相應(yīng)的密碼子。本發(fā)明的多肽的多核苷酸序列可以是DNA或RNA，其中DNA包括eDNA、基因組DNA以及合成的DNA，DNA可以是雙鏈或是單鏈形式，單鏈DNA可以是編碼鏈或是非編碼鏈(反義鏈)。本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明肽1的核苷酸序列，如SEQ ID NO.2所示。
合成肽的序列如下HCV包膜區(qū)(E2)383389↑ ↑肽1G Q T Y T S G SEQ ID NO.1合成肽產(chǎn)品經(jīng)高壓液相色譜(HPLC)分析進行純度鑒定，純度均大于95％，符合設(shè)計要求。
實施例2本發(fā)明合成肽同丙型肝炎患者血清的反應(yīng)性研究1.血清來源30份抗HCV抗體陽性血清，隨機從2000-2001年解放軍302醫(yī)院HCV感染住院的患者中選取，PCR檢測血清HCV RNA90％為陽性。對照血清取自解放軍總醫(yī)院輸血科健康獻血人員，化驗檢查各項指標均正常。乙型肝炎(HBV)患者血清選自解放軍302醫(yī)院乙型肝炎住院患者，化驗檢查均呈乙型肝炎病毒表面抗原陽性。
2.方法本發(fā)明合成肽同患者血清反應(yīng)性的檢測采用間接ELISA10ug本發(fā)明肽1，加于堿性包被液中(0.1M NaHCO3，35ul；0.1M Na2CO3，15ul；DDH2O，50ul)包被聚丙乙烯微孔條，4℃過夜。每種樣品作2個復(fù)孔。加120ulFCS-PBS 37℃封閉2小時。依次加入各組患者血清(1∶100稀釋，37℃孵育1小時)和羊抗人IgG(購自華美生物制品公司)(1∶1000，孵育同上)。最后每孔加入A、B液(北京科衛(wèi)試劑廠產(chǎn)品)50ul，置暗處放5分鐘，于450nm波長下檢測光吸收度(A)。采用DG3022型酶聯(lián)免疫檢測儀(PE公司的產(chǎn)品)。
3.結(jié)果3.1本發(fā)明多肽結(jié)合HCV患者血清(30份)的陽性結(jié)果如下表1
其中此組一共同30份患者血清中的13份反應(yīng)為陽性，說明肽1的結(jié)合百分比達到43.3％。而融合肽的結(jié)合百分比達到70％。
此多肽同HBV患者血清及健康人血清結(jié)合試驗結(jié)果均為陰性。
3.2根據(jù)試驗結(jié)果作出表，如下
表2本發(fā)明多肽同實驗組HCV感染病人血清及陰性對照組正常人血清反應(yīng)結(jié)果比較
經(jīng)STATA軟件分別對兩組間進行統(tǒng)計學分析，卡方檢驗P＝0.011，＜0.05，兩組的陽性率差異有顯著性意義。也就是說，此組合成肽可以引起HCV感染病人血清反應(yīng)，與陰性對照組正常人血清無反應(yīng)。
表3本發(fā)明多肽同實驗組HCV感染病人血清及HBV感染病人血清反應(yīng)比較
分別對兩組間進行統(tǒng)計學分析，卡方檢驗P＝0.011，＜0.01，兩組的陽性率差異有顯著性意義。也就是說，此組合成肽可以引起HCV感染病人血清反應(yīng)，與HBV感染病人血清無反應(yīng)。
實施例3本發(fā)明多肽體外刺激HCV感染PBMC細胞因子分泌的研究1.外周血細胞來源23份HCV感染陽性血標本取自302醫(yī)院HCV感染住院的患者，PCR檢測血清HCV RNA90％為陽性。血清HCV抗體陽性。
2.方法2.1標本PBMC的提取取新鮮靜脈肝素抗凝血3ml，加等量Hank’s液稀釋，混勻，輕鋪到與血體積等量的淋巴細胞分離液液面上，1500-2000rpm/min，離心30分鐘，吸出云霧狀的淋巴細胞層，用Hank’s液洗兩次，可獲得大量的淋巴細胞。
2.2細胞培養(yǎng)將獲得的淋巴細胞在顯微鏡下計數(shù)，按每份的細胞數(shù)大約為1*105/100ul將細胞平均分配，加到96孔細胞培養(yǎng)板上，加入一定量(10ug/孔)的抗原合成肽，另設(shè)不加肽的陰性對照孔及PHA刺激的陽性對照孔，(每種樣品設(shè)三復(fù)孔)，震蕩混勻，置入37C，5％CO2孵箱中培養(yǎng)，觀察。培養(yǎng)過程中連續(xù)顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，記錄。
2.3培養(yǎng)上清的收集用多頭細胞收集器仔細將細胞收獲于試管中，1000-rpm/min，離心10分鐘沉淀細胞，收集培養(yǎng)上清。
2.4細胞因子的檢測采用ELASA法(試劑來源見上)(1)除空白孔外，分別將標本或不同濃度的標準品(100微升/孔)加入相應(yīng)孔中，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫(20-25℃)孵育120分鐘。
(2)洗板4次。
(3)除空白孔外，加入檢測劑工作液(100微升/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫(20-25℃)孵育60分鐘。
(4)洗板4次。
(5)加入底物A、B(各50微升/孔)，閉光室溫10-30分鐘。
2.5標本熒光標記(1)收集培養(yǎng)細胞。
(2)2％FCS清洗兩遍。
(3)加入熒光抗體1微升/105細胞。避光室溫靜置20分鐘。
(4)2％FCS清洗一遍。
(5)加入1％多聚甲醛2毫升，4℃保存。
2.6淋巴細胞分類檢測對培養(yǎng)后集落出現(xiàn)好的樣本進行培養(yǎng)，并利用流式細胞儀(BD公司FACS CALIBUR型)檢測熒光CD4和CD8抗體標記細胞。
2.7統(tǒng)計學方法Stata統(tǒng)計軟件計算。
肽1組測定結(jié)果與陰性組結(jié)果進行t檢驗。由于測定IL-4、IL-10和γ-IFN的結(jié)果同陰性組方差不齊，統(tǒng)計學方法采用秩和檢驗。
3.結(jié)果3.1光鏡觀察HCV感染病人的PBMC加入合成肽后第二天，鏡下觀察可見細胞生活良好，體大，個圓，透光性好，陽性對照孔可見滿視野多個小細胞增殖團，實驗孔可見散在的小細胞增殖團，培養(yǎng)4天左右，可見散在的小細胞團較前增大，形成明顯的集落團。陰性對照孔未見明顯的集落團出現(xiàn)。HBV病人的PBL加入合成肽后未見集落團。
3.2體外培養(yǎng)HCV患者增殖PBMC FACS淋巴細胞分類結(jié)果如

圖1所示，培養(yǎng)后增殖細胞群淋巴細胞分類中CD4+細胞所占比重增加(平均上升3.5％)，而CD8+細胞比重下降(平均下降2.9％)，說明增殖細胞主要為CD4+細胞。
3.3體外細胞因子分泌水平變化研究第5號標本對肽1有較好的增殖反應(yīng)，故對它的細胞因子分泌水平隨時間的變化進行了研究。
結(jié)果表明IL-4、IL-10、γ-IFN水平是隨培養(yǎng)時間的延長而升高的。并且在培養(yǎng)后48-72小時間達到最高水平。
3.4培養(yǎng)72小時的上清中細胞因子水平γ-IFN檢測結(jié)果表明γ-IFN分泌明顯的升高，為32.87(pg/ml)，與陰性對照組相比明顯升高，差異有顯著意義(P＜0.05)。
IL-4檢測結(jié)果表明IL-4分泌明顯的升高，為31.0(pg/ml)，與陰性對照組相比明顯升高，差異有顯著意義(P＜0.05)。
IL-10檢測結(jié)果表明IL-10分泌明顯的升高，為109.2，(pg/ml)，與陰性對照組相比明顯升高，差異有顯著意義(P＜0.05)。表4不同病人PBMC經(jīng)合成肽刺激后細胞因子水平的變化
實施例4本發(fā)明的多肽在小鼠體內(nèi)免疫原性和血清中細胞因子的研究1.實驗動物BALB/c小鼠購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，均為雄性性6周齡。
2.方法2.1免疫小鼠用上述肽1直接免疫小鼠，每組5只小鼠。另設(shè)一組陰性對照組，第一次免疫合成肽用量為50ug，將弗氏完全佐劑(GIBCOBRL公司)與合成肽抗原各50ul等體積混合，用微量攪拌器充分混勻，多點注射小鼠足墊，陰性對照組只注射完全弗氏佐劑。2周后進行第二次免疫，即加強免疫。用同樣的合成肽量，改用弗氏不完全佐劑(例如GIBCOBRL公司)，注射體積和方法同上。免疫進行兩次后進行沖擊免疫，用PBS 200ul溶解100ug的合成肽，經(jīng)肌肉注射，陰性對照組只注射200ul的PBS。第一次及第二次加強免疫后一天對小鼠進行剪尾取血，第二次加強免疫三天后，摘除小鼠眼球放血，收取血清作標本。
2.2小鼠血清抗體檢測，采用ELASA法(1)用肽1作為抗原包被聚丙乙烯微孔條，每種樣品用三復(fù)孔，合成肽用量分別用10ug，加入到100ul堿性包被液中，4℃過夜。
(2)用120ul PBS封閉，37℃孵育2小時。
(3)加入各組小鼠血清，1∶100稀釋，37℃孵育1小時。
(4)每孔加入羊抗鼠IgG100ul(1∶1000)稀釋，37℃孵育1小時。
(5)每孔加入A、B液50ul，置暗處放5分鐘，檢測450nm波長下的光密度(OD)值。
2.3小鼠血清細胞因子檢測，采用ELASA法(1)除空白孔外，分別將標本或不同濃度的標準品(100微升/孔)加入相應(yīng)孔中，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫(20-25℃)孵育120分鐘。
(2)洗板4次。
(3)除空白孔外，加入檢測劑工作液(100微升/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫(20-25℃)孵育60分鐘。
(4)洗板4次。
(5)加入底物A、B(各50微升/孔)，閉光室溫10-30分鐘。
(6)加入終止液(50微升/孔)，混勻后即刻測量450nm波長下OD值。
3.結(jié)果3.1合成肽免疫效果表5450nm波長下檢測抗合成肽抗體對應(yīng)的平均OD值
3.2小鼠血清細胞因子水平結(jié)果如下所示，表6實驗小鼠血清中各細胞因子濃度(pg/ml)
上述實驗結(jié)果表明，小鼠對肽1產(chǎn)生了明顯的免疫反應(yīng)。而且，血清中γ-IFN、IL-4、IL-10，都有不同程度的提高。尤其是γ-IFN水平的升高是一個非常令人感興趣的現(xiàn)象，因為γ-IFN主要是Th1分泌的細胞因子，是人體免疫系統(tǒng)抵抗病毒感染的主要細胞因子之一，它通過誘導2-5A合成酶，進而活化RNaseL，降解病毒RNA，從而抑制病毒蛋白的合成。說明本發(fā)明的多肽具有激活一定強度的細胞免疫反應(yīng)的能力，故此多肽引起的針對HCV的細胞免疫反應(yīng)對于HCV的清除具有相當重要的意義。
序列表<110>程云中國人民解放軍傳染病研究所<120>丙型肝炎病毒高變區(qū)1合成肽及其應(yīng)用<130>D0301059F<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>丙型肝炎病毒高變區(qū)1合成肽<400>1Gly Gln Thr Tyr Thr Ser Gly1 5<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(3，9，15，18，21)<22 3>n＝u或c或a或g<220><221>misc_feature<222>(6)<223>r＝a或g<220><221>misc_feature<222>(12)<223>y＝u或c<400>2gancaracnu ayacnucnga n
權(quán)利要求
1.含有一個或多個如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的合成肽GQTYTSG的多肽或其藥物可接受的鹽，其具有誘導細胞因子γ-IFN、IL-4、IL-10和抗體產(chǎn)生的功能。
2.權(quán)利要求1所述的多肽或其藥物可接受的鹽，其特征在于其為如SEQ ID NO.1所示的合成肽或其藥物可接受的鹽。
3.如權(quán)利要求1或2所述的多肽或其藥物可接受的鹽，其具有治療和/或預(yù)防丙型肝炎的作用。
4.權(quán)利要求1-3任一項所述的多肽在制備治療丙型肝炎的藥劑的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1-3任一項所述的多肽在制備預(yù)防丙型肝炎的藥劑的應(yīng)用。
6.一種用于治療丙型肝炎的藥物組合物，其含有治療有效量的權(quán)利要求1-3任一項所述的多肽和必要時藥學上可接受的載體或賦形劑。
7.權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其含有權(quán)利要求1-3任一項所述的多肽和Al(OH)3，其中每毫升生理鹽水或中性磷酸鹽緩沖液中含有如SEQID NO.1所示合成肽1.0-15mg，含有Al(OH)30.5-2mg。
8.權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其由有效量的權(quán)利要求1-3任一項所述的多肽和生理鹽水構(gòu)成。
9.一種丙型肝炎疫苗組合物，其含有有效量的權(quán)利要求1-3任一項所述的多肽和有效量的弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑。
10.一種編碼權(quán)利要求1-3任一項多肽的多核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含有丙型肝炎病毒高變區(qū)1合成肽的多肽或其藥物可接受的鹽，尤其涉及含有一個或多個如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的合成肽GQTYTSG的多肽或其藥物可接受的鹽，其具有誘導細胞因子γ－IFN、IL－4、IL－10和抗體產(chǎn)生的功能。本發(fā)明還涉及上述多肽作為制備治療和/或預(yù)防丙型肝炎的藥劑的應(yīng)用，以及含有上述多肽的用于治療丙型肝炎的藥物組合物、疫苗、編碼該多肽的多核苷酸。
文檔編號A61K38/08GK1438238SQ0310326
公開日2003年8月27日 申請日期2003年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月24日
發(fā)明者程云, 趙軍, 陳昊, 李靖, 舒翠麗, 林芳, 鄭宇 , 蘇秦, 王國志, 張英起 申請人:程云, 中國人民解放軍傳染病研究所