專利名稱：厭氧短小棒狀桿菌藥用成分的分離方法、藥用用途及藥物制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種厭氧短小棒狀桿菌藥用成分的分離方法，并提供了其藥用用途及藥物制劑，屬于生物工程技術(shù)分離純化工藝技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有的厭氧短小棒狀桿菌(以下簡(jiǎn)稱CP)制劑為全菌體制劑，商品名“長(zhǎng)生利康”，是一種免疫治療制劑，該項(xiàng)制劑在生產(chǎn)過程中異種蛋白含量過高，致使產(chǎn)品在使用中副作用大，包括發(fā)熱，注射局部疼痛，使患者難以接受，限制了其推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種厭氧短小棒狀桿菌(CP)藥用成分的分離方法。
本發(fā)明還提供了該桿菌的藥用用途及藥物制劑。
本發(fā)明的技術(shù)解決方法包括以下步驟取CP菌株用1-2ml生理鹽水稀釋，接種于4-5g碎肉培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)4-5天，傳至抗氧化劑培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)，再傳至肝透析液培養(yǎng)集中，厭氧培養(yǎng)3-7天，收集菌體，用生理鹽水稀釋成250億-500億/ml，加入2-3倍的脫水劑(冷-20～-60℃丙酮)，置4℃冰箱過夜，收集菌體，用冷丙酮洗2-3次，將沉淀物至37℃干燥成菌粉，研磨后備用。
取1-3克菌粉加入50-100ml生理鹽水制成懸液，用蛋白酶消化(胰糜蛋白酶0.1-0.6mg/ml，胰蛋白酶0.1-0.6mg/ml，37℃-55℃消化3-6小時(shí))，然后升高溫度80-120℃終止消化，用PBS洗滌，收集沉淀，該消化重復(fù)兩次以上為佳；離心收集沉淀，加入RNAse 70-200μg/ml，DNAse 50-150μg/ml，蛋白酶0.1-0.6mg/ml在0.2M Tris液中20-37℃消化12-36小時(shí)，高速離心，洗滌，取沉淀物重復(fù)消化過程一次，離心，生理鹽水洗滌2次，然后進(jìn)行脫脂殺菌處理用乙醚/乙醇0.5-1.5/1-2(V/V)脫脂24-72小時(shí)，2-4次，收集沉淀用氯仿脫脂24-72小時(shí)2-4次，收集沉淀，用氯仿/甲醇3-1/0.5-2(V/V)24-72小時(shí)，2-4次然后生理鹽水洗滌，冷凍干燥制成厭氧短小棒狀桿菌的藥用成分純化物。
抗氧化劑包括硫乙醇酸鈉。
脫水劑包括丙酮。
消化蛋白酶胰糜蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶。
經(jīng)過藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)篩選，上述提取物具有以下特征1、促進(jìn)脾單核細(xì)胞酸性磷酸酶的活性。
2、促使單和吞噬細(xì)胞功能增強(qiáng)。
3、激活骨髓多能干細(xì)胞。
4、對(duì)免疫細(xì)胞有明顯的激活作用。
通過對(duì)其機(jī)理的研究，上述提取物具有抗腫瘤、抑制轉(zhuǎn)移的藥理活性。
上述提取物還具有對(duì)銀屑病的治療作用。
具有對(duì)婦女外陰白斑的治療作用。
本發(fā)明的藥物組合物含有治療有效量的上述提取物為活性成分，以及含有一種或多種藥學(xué)上可以接受的載體。
本發(fā)明的提取物和組合物可用于制備治療癌癥的藥物。
同時(shí)還可制備具有治療銀屑病、婦女外陰白斑疾病的藥物。
上文的載體是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，包括稀釋劑、賦形劑，填充劑，粘合劑，濕潤(rùn)劑，崩解劑，吸收促進(jìn)劑，表面活性劑，吸附載體。
本發(fā)明可以組合物的形式通過口服、直腸、靜脈、肌肉注射或胃腸外給藥方式施用于這種治療的患者。按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)生產(chǎn)方法制備各種劑型如片劑、顆粒劑、沖劑、膠囊、栓劑、噴霧劑、緩釋劑和注射劑。也可使其活性成分與一種或多種載體或藥物混合，制成所需劑型。
本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選重量比為0.1％～99.5％活性成分，優(yōu)選含有10-90％，更優(yōu)選20-80％，最好為70％的本發(fā)明提取物。
本發(fā)明的施藥量可根據(jù)用藥途徑、患者年齡、體重、疾病類型和嚴(yán)重程度等變化，日劑量為0.01～10mg/kg。
下述的藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)了本發(fā)明提取物藥理活性一、純化制劑動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果用體重18-20g的C57小鼠，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各10只，雌雄各半.將樣品稀釋為0.8-2.4mg/ml，給實(shí)驗(yàn)組腹腔注射0.5ml/只，對(duì)照組腹腔注射生理鹽水0.5ml/只，14天處死，稱體重，脾重，計(jì)算脾激活指數(shù)，其值不應(yīng)低于1.5，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次得到類似結(jié)果，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組相比有顯著性差異(p＜0.01)。

表1純化制劑脾指數(shù)測(cè)定結(jié)果

二、通過臨床研究1.對(duì)癌癥治療效果(1)抗腫瘤，抑制轉(zhuǎn)移對(duì)癌癥治療有較好的療效，特別對(duì)癌性胸腹水效果達(dá)95％以上；對(duì)于肺癌手術(shù)患者，隨機(jī)分組，18例作為實(shí)驗(yàn)組，術(shù)前皮下注射CP制劑，18例做為對(duì)照組皮下注射生理鹽水。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組癌細(xì)胞有明顯變性，癌巢周圍有明顯的纖維增生，免疫活性細(xì)胞聚集，隨訪一年半，對(duì)照組4例死亡，6例復(fù)發(fā)，；而治療組均活存并復(fù)發(fā)。
表2 CP對(duì)中早期肺癌術(shù)后抗復(fù)發(fā)作用

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果P＜0.01
(2)能延長(zhǎng)化療放療使用時(shí)間，延長(zhǎng)存活期有明顯效果表3短棒狀制劑與化療合用的療效

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果P＜0.05.
2.婦女外陰白斑治療觀察，對(duì)于來(lái)自白求恩醫(yī)大二院，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬一院，中國(guó)醫(yī)大三院，河北中醫(yī)院共522例患者治療結(jié)果表明，痊愈率15％，總有效率92％，無(wú)效7.2％。
3.銀屑病觀察對(duì)于來(lái)自鞍山市礦泉研究所，白求恩醫(yī)科大學(xué)二院，東北輸油管理局，職工療養(yǎng)院，沈陽(yáng)市第七人民醫(yī)院患者共466例總有效率87.7％，治愈率35％，無(wú)效17％。
本發(fā)明的積極效果在于提供了厭氧短小棒狀桿菌藥用成分的分離方法，為除去熱源物質(zhì)，降低副作用，保留其有效成分，純化制劑，獲得更新?lián)Q代的產(chǎn)品，為患者提供更安全有效的產(chǎn)品。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1取CP菌株用2ml生理鹽水稀釋，接種于4g碎肉培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)5天，傳至硫乙醇酸鈉抗氧化劑培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)，再傳至肝透析液培養(yǎng)集中，厭氧培養(yǎng)5天，收集菌體，用生理鹽水稀釋成300億-450億/ml，加入3倍的脫水劑(-46℃冷丙酮)，置4℃冰箱過夜，收集菌體，用冷丙酮洗2次，將沉淀物至37℃干燥成菌粉，研磨后備用。
取3克菌粉加入100ml生理鹽水制成懸液，用胰糜蛋白酶0.1-0.6mg/ml，胰蛋白酶0.1-0.6mg/ml，37℃-55℃消化3-6小時(shí)，然后升高溫度80-120℃終止消化，用PBS洗滌，收集沉淀，在同上重復(fù)消化一次；離心收集沉淀，加入RNAse 70-200μg/ml，DNAse 50-150μg/ml，蛋白酶0.1-0.6mg/ml在0.2M Tris液中20-37℃消化12-36小時(shí)，高速離心，洗滌，取沉淀物重復(fù)消化過程一次，離心，生理鹽水洗滌2次，然后進(jìn)行脫脂殺菌處理用乙醚/乙醇0.5-1.5/1-2(V/V)脫脂24-72小時(shí)，2-4次，收集沉淀用氯仿脫脂24-72小時(shí)2-4次，收集沉淀，用氯仿/甲醇3-1/0.5-2(V/V)24-72小時(shí)，2-4次然后生理鹽水洗滌，冷凍干燥制成CP藥用成分純化物。
實(shí)施例2取實(shí)施例1制備的CP藥用成分純化物20克，加人賦形劑藥用淀粉20克，混合均勻，造粒整粒壓片，制得片劑，每片含CP的藥用成分純化物200毫克。
實(shí)施例3制備本發(fā)明膠囊制劑取實(shí)施例1制備的厭氧短小棒狀桿菌的藥用成分純化物20克，加人賦形劑藥用淀粉30克，充分混合均勻，裝入膠囊，每粒含厭氧短小棒狀桿菌的藥用成分純化物200毫克。
實(shí)施例4
粉針注射劑將實(shí)施例1所得產(chǎn)物用甲醇重結(jié)晶得本發(fā)明純品。
CP藥用成分純化物 15克氯化納 75克注射用水 1000ml制備過程將CP藥用成分純化物、氯化納溶解與適量的注射用蒸餾水中，用1～5％的氫氧化鈉溶液調(diào)PH8.5，加注射用水至1000ml，通過0.2μm的微孔濾膜過濾所得溶液，在無(wú)菌條件下裝入安瓶，冷凍干燥。
權(quán)利要求
1.一種厭氧短小棒狀桿菌藥用成分的分離方法，其特征包括以下步驟取CP菌株用1-2ml生理鹽水稀釋，接種于4-5g碎肉培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)4-5天，傳至抗氧化劑培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)，再傳至肝透析液培養(yǎng)集中，厭氧培養(yǎng)3-7天，收集菌體，用生理鹽水稀釋成250億-500億/ml，加入2-3倍的脫水劑(冷-20～-60℃丙酮)，置4℃冰箱過夜，收集菌體，用冷丙酮洗2-3次，將沉淀物至37℃干燥成菌粉，研磨后備用。取1-3克菌粉加入50-100ml生理鹽水制成懸液，用蛋白酶消化(胰糜蛋白酶0.1-0.6mg/ml，胰蛋白酶0.1-0.6mg/ml，37℃-55℃消化3-6小時(shí))，然后升高溫度80-120℃終止消化，用PBS洗滌，收集沉淀，該消化重復(fù)兩次以上為佳；離心收集沉淀，加入RNAse 70-200μg/ml，DNAse 50-150μg/ml，蛋白酶0.1-0.6mg/ml在0.2M Tris液中20-37℃消化12-36小時(shí)，高速離心，洗滌，取沉淀物重復(fù)消化過程一次，離心，生理鹽水洗滌2次，然后進(jìn)行脫脂殺菌處理用乙醚/乙醇0.5-1.5/1-2(V/V)脫脂24-72小時(shí)，2-4次，收集沉淀用氯仿脫脂24-72小時(shí)2-4次，收集沉淀，用氯仿/甲醇3-1/0.5-2(V/V)24-72小時(shí)，2-4次然后生理鹽水洗滌，冷凍干燥制成CP的藥用成分純化物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法制得的藥用成分純化物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1藥用成分純化物在制備抗腫瘤、抑制轉(zhuǎn)移作用藥物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1藥用成分純化物在制備治療銀屑病藥物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1藥用成分純化物在制備治療婦女外陰白斑藥物中的應(yīng)用。
6.用于制備抗腫瘤、抑制轉(zhuǎn)移作用的藥物組合物，其中含有治療有效活性成分的權(quán)利要求1藥用成分純化物和藥學(xué)上可接受的載體。
7.用于制備治療銀屑病的藥物組合物，其中含有治療有效活性成分的權(quán)利要求1藥用成分純化物和藥學(xué)上可接受的載體。
8.用于制備治療婦女外陰白斑病的藥物組合物，其中含有治療有效活性成分的權(quán)利要求1藥用成分純化物和藥學(xué)上可接受的載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求6～8所述的藥物組合物，優(yōu)選重量比為0.1％～99.5％活性成分，優(yōu)選含有10-90％，更優(yōu)選20-80％，最好為70％。
10.根據(jù)權(quán)利要求3～8所述的藥物，其特征在于所說的藥劑是任何一種藥劑學(xué)上所說的劑型。
全文摘要
本發(fā)明公開一種厭氧短小棒狀桿菌藥用成分的分離方法，并提供了其藥用用途及藥物制劑，采用本發(fā)明對(duì)厭氧短小棒狀桿菌的藥用成分進(jìn)行分離，可除去熱源物質(zhì)，降低副作用，保留其有效成分，純化制劑，獲得更新?lián)Q代的產(chǎn)品，為患者提供更安全有效的產(chǎn)品。對(duì)癌癥治療有較好的療效，特別對(duì)癌性胸腹水效果達(dá)95％以上；對(duì)婦女外陰白斑治療的痊愈率15％，總有效率92％；對(duì)銀屑病治療觀察治愈率35％，總有效率87.7％。
文檔編號(hào)A61K35/74GK1439381SQ03110879
公開日2003年9月3日 申請(qǐng)日期2003年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月17日
發(fā)明者張靜華, 萬(wàn)金會(huì), 邰桂香 申請(qǐng)人:張靜華