專(zhuān)利名稱(chēng)：抗細(xì)胞膜糖蛋白kd－43的單克隆抗體gdk－1及其的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及單克隆抗體(簡(jiǎn)稱(chēng)單抗)領(lǐng)域，尤其是關(guān)于抗細(xì)胞膜糖蛋白KD-43的單克隆抗體GDK-1，及其131-碘化單克隆抗體DGDK-1和其在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
放射治療對(duì)某些局限性的腫瘤病灶非常有效，但并非對(duì)所有的惡性腫瘤均敏感，此外，對(duì)轉(zhuǎn)移病灶，一般說(shuō)來(lái)放射治療是無(wú)效的。而今天的化學(xué)藥物治療至多還只是一種或可緩解病情的輔助手段。即使放射治療和化學(xué)藥物治療今后在療效上會(huì)有進(jìn)步，也很難說(shuō)它們是一類(lèi)理想的治療方法，因?yàn)檫@類(lèi)方法無(wú)選擇地作用于惡性腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞，所導(dǎo)致的副作用往往為患者所不能忍受。
德國(guó)人Paul Ehrlich在20世紀(jì)初最先提出抗腫瘤導(dǎo)向藥物的設(shè)想，所謂腫瘤的導(dǎo)向治療(Targeted Therapy)，乃是一種能選擇性殺死惡性腫瘤細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒害的治療腫瘤的新概念。由于沒(méi)有理想的導(dǎo)向載體，長(zhǎng)時(shí)間以來(lái)，導(dǎo)向藥物的研究一直進(jìn)展得十分緩慢。
1975年，Koehler和Milstein用雜交瘤技術(shù)制備了世界上第一個(gè)鼠源單克隆抗體，為生物技術(shù)打開(kāi)了一個(gè)全新的領(lǐng)域，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，單克隆抗體技術(shù)也有了很大的發(fā)展，各種整分子的、小分子的、雞尾酒的、雙功能的以至抗獨(dú)特性的單克隆抗體均陸續(xù)問(wèn)世；單克隆抗體技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展激勵(lì)了不少人再去探索導(dǎo)向治療的可行性，重新去尋找上世紀(jì)初的舊夢(mèng)。經(jīng)過(guò)十多年的探索和努力，作為生物反應(yīng)調(diào)節(jié)治療(Biological ResponseModulizer)的一種重要的內(nèi)容，以單克隆抗體為載體的導(dǎo)向抗腫瘤藥物已成為一百多年來(lái)腫瘤免疫治療領(lǐng)域中最引人注目的進(jìn)展之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種抗細(xì)胞膜糖蛋白KD-43的單克隆抗體GDK-1，其特征在于編碼其可變區(qū)蛋白的核苷酸序列為序列表中的<210>1和<210>2。
其為鼠源的或人鼠嵌合的。
其為整分子IgG或IgG的Fab片段。
還提供了一種抗細(xì)胞膜糖蛋白KD-43的131-磺化單克隆抗體DGDK-1，編碼其可變區(qū)蛋白的核苷酸序列為序列表中的<210>1和<210>2。
其為鼠源的或人鼠嵌合的。
其為整分子IgG或IgG的Fab片段。
本發(fā)明還提供了該131-碘化單克隆抗體DGDK-1在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。
該肝癌為巨塊型肝癌或彌漫型肝癌。
其放射劑量范圍在20-100mCi之間。
該131-碘化單克隆抗體DGDK-1為液體，使用方法為與生理鹽水配制后兩周內(nèi)1-5次注射。
本發(fā)明產(chǎn)品能用于降低肝癌患者的甲胎蛋白水平，其有效率高達(dá)75％左右；能用于追蹤治療肝癌轉(zhuǎn)移病灶，因而可以用于治療晚期有轉(zhuǎn)移的肝癌患者；除巨塊型外，還可用于治療彌漫型肝癌；能有效地降低原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌手術(shù)后的復(fù)發(fā)率，延長(zhǎng)他們的生存期，對(duì)臨床II期肝癌患者，二步切除后的10年生存率可達(dá)35％以上；能有效地改善患者的食欲、提高患者的體力，有效率達(dá)85％以上。


圖1DGDK-1能在人體內(nèi)直接殺死癌細(xì)胞的組織化學(xué)顯色照片。
圖1A注射DGDK-1前，組織化學(xué)顯色表明癌細(xì)胞依然存活。
圖1B注射DGDK-120天后，組織化學(xué)顯色表明癌細(xì)胞發(fā)生玻璃狀凝集，說(shuō)明癌細(xì)胞已經(jīng)被殺死。
圖2縱隔轉(zhuǎn)移灶SPECT影象。受試者(No.20)為一例肝癌切除后縱隔轉(zhuǎn)移患者，注射DGDK-1后第6天縱隔轉(zhuǎn)移灶放射性濃集。表明DGDK-1在人體內(nèi)能追蹤轉(zhuǎn)移灶。
圖2A縱隔轉(zhuǎn)移灶矢狀面的SPECT影象。
圖2B縱隔轉(zhuǎn)移灶冠狀面的SPECT影象。
圖2C縱隔轉(zhuǎn)移灶橫斷面的SPECT影象。
圖3縱隔病灶組織化學(xué)顯色照片。受試者(No.20)，肝癌切除后縱隔轉(zhuǎn)移，注射DGDK-1一個(gè)月后切除，組織化學(xué)顯色表明單克隆抗體依然結(jié)合在病灶組織上，提示注射后至少30天內(nèi)，在體內(nèi)的單克隆抗體還能保持其免疫活性。
圖3A縱隔病灶放大20倍的組織化學(xué)顯色照片。
圖3B縱隔病灶放大40倍的組織化學(xué)顯色照片。
圖4DGDK-1全身顯象(受試者No.8)。注射后24小時(shí)及48小時(shí)的ECT全身影象，DGDK-1在肝腫瘤上濃集(箭頭所示)。
圖5注射DGDK-1后的連續(xù)動(dòng)態(tài)顯象圖5A連續(xù)觀察12天，病灶仍顯影。(受試者)圖5B連續(xù)觀察9天，病灶仍顯影。(受試者)圖5C連續(xù)觀察13天，病灶仍顯影。(受試者)圖6DGDK-1的臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究中，受試者(No.8)各臟器的時(shí)間-放射性曲線。
圖6-1膀胱時(shí)間-放射性曲線。
圖6-2腦時(shí)間-放射性曲線。
圖6-3受試者(No.8)腎臟時(shí)間-放射性曲線。
圖6-4受試者(No.8)肝臟時(shí)間-放射性曲線。
圖6-5受試者(No.8)肺時(shí)間-放射性曲線。
圖6-6受試者(No.8)脾臟時(shí)間-放射性曲線。
圖6-7受試者(No.8)甲狀腺時(shí)間-放射性曲線。
圖7靜脈注射DGDK-1后的血液廓清曲線。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、抗細(xì)胞膜糖蛋白KD-43的單克隆抗體(GDK-1)的制備方法1).抗原和免疫細(xì)胞膜糖蛋白KD-43是一種分布在人癌細(xì)胞膜表面、特別是在人肝癌細(xì)胞膜表面的一種糖蛋白，其分子量為43kD，其特定的變異的決定簇，可能為人癌細(xì)胞，特別是人肝癌細(xì)胞所特有。
我們以含有細(xì)胞膜糖蛋白KD-43的癌細(xì)胞膜為抗原，免疫BALB/C小鼠，共免疫3-5次，臨用前3-5天加強(qiáng)1次，3-5天后取脾作融合。
2).細(xì)胞融合將從小鼠體內(nèi)摘除的脾臟切碎，離心分離脾細(xì)胞，懸浮在RPMI1640培養(yǎng)基中并洗凈。以同樣方法在含有10％胎牛血清的RPMI1640中培養(yǎng)小鼠骨髓瘤細(xì)胞株NS-1，在密度達(dá)106/ml時(shí)將細(xì)胞用上述RPMI1640培養(yǎng)基洗凈。然后將骨髓瘤細(xì)胞和上述脾細(xì)胞以1∶5-10的比例放入離心管中并混合，以在聚乙二醇4000作用下按常規(guī)方法(Clin.Exp.Immunol.，42，458-462，1980)進(jìn)行細(xì)胞融合。
然后，將所得到的融合細(xì)胞分散于含HAT的RPMI1640培養(yǎng)基的96孔平板中，并在37℃和5％CO2條件下在保溫箱中培養(yǎng)之。以HAT培養(yǎng)液換液若干次，繼以HT培養(yǎng)液換液，直至克隆形成，詳見(jiàn)Clin.Exp.Immunol.，42，458-462，1980。
3).篩選以含有細(xì)胞膜糖蛋白KD-43的癌細(xì)胞膜為靶標(biāo)，篩選出目的克隆。其方法為a.離心并回收靶細(xì)胞膜，將細(xì)胞膜沉淀物懸浮在100μl雜交瘤培養(yǎng)上清中并在37℃下反應(yīng)1小時(shí)。
b.用PBS清洗1次后，加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體并保溫1小時(shí)。
c.用PBS清洗1次后，用熒光顯微鏡觀察分析之。
d.然后使用有限稀釋法，按常規(guī)程序反復(fù)克隆(至少6次)，每次的克隆效率應(yīng)低于35％，所得到的穩(wěn)定分泌單克隆抗體的融合細(xì)胞即為目的克隆。
e.將目的克隆細(xì)胞培養(yǎng)于生物反應(yīng)器中，收集反應(yīng)器中的培養(yǎng)上清液，50％飽和硫酸銨沉淀保存。
f.或?qū)⒛康目寺〖?xì)胞培養(yǎng)于Balb/c小鼠的腹腔中，收集小鼠的腹水，50％飽和硫酸銨沉淀保存。
4).分離和純化a.按常規(guī)高壓液相色譜法(如陽(yáng)離子交換柱)，將所獲得的目的克隆的50％飽和硫酸銨沉淀物純化；b.或按常規(guī)低壓柱層析法(如Protein G柱)，將所獲得的目的克隆的50％飽和硫酸銨沉淀物純化。
5).專(zhuān)一性分析間接免疫熒光法組織名稱(chēng)N1N2P1P2GDK-1大腦- - + + -小腦- - + + -坐骨神經(jīng)- - + + -肺 - - + + -肝 - - + + -腎 - - + + -膀胱- - + + -脾 - - + + -胃 - - + + -腸 - - + + -胰腺- - + + -甲狀腺 - - + + -腎上腺 - - + + -心 - - + + -橫紋肌 - - + + -睪丸- - + + -皮膚- - + + -肝癌- - + + +N1，N2分別為第一和第二陰性對(duì)照。
N1相同濃度的人IgG作為第一抗體，以排除因非特異性吸附所致的假陽(yáng)性。
N2緩沖液代替第一抗體，以排除溶媒成分所致的假陽(yáng)性。
P1，P2分別為第一和第二陽(yáng)性對(duì)照P1小鼠抗人細(xì)胞膜糖蛋白KD-43的全血清(1∶5稀釋)作為第一抗體，以檢查抗原的活性。
P2以含有細(xì)胞膜糖蛋白KD-43的癌細(xì)胞膜作為抗原，以檢查待檢抗體的活性。
6).其它生物學(xué)特性[性狀]無(wú)色澄明液體。
pH值6.5-7.5(中國(guó)藥典1995年版二部附錄 VI H)。
本品按生物制品規(guī)程(1995年版一部)進(jìn)行檢驗(yàn)。
本品以細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)檢查熱原。通過(guò)供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素干擾試驗(yàn)表明，本品稀釋10倍后，對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)不干擾，因而可用細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)檢查本品的熱原。以單克隆抗體一次最大用量10ml計(jì)，再考慮到標(biāo)記過(guò)程中其它試劑也會(huì)攜帶細(xì)菌內(nèi)毒素，因此本品的細(xì)菌內(nèi)毒素為每毫升小于5Eu。
任何生物制品均不允許支原體污染。鑒于人型支原體、肺炎支原體及溶脲脲原體為最有代表性的三種支原體，本標(biāo)準(zhǔn)選定此三種支原體的存在與否為本品是否有支原體污染的判別標(biāo)準(zhǔn)。支原體可以在特定的雙相培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，形成集落；并使培養(yǎng)基變色。肺炎支原體由于能分解葡萄糖產(chǎn)酸，從而使培養(yǎng)基由粉紅變黃；人型支原體由于能分解精氨酸并釋放氨氣，從而使培養(yǎng)基由黃綠變綠；溶脲脲原體由于能分解尿素及釋放氨及二氧化碳，從而使培養(yǎng)基由紫變藍(lán)，因此，我們可以通過(guò)在特定的雙相培養(yǎng)基上直接培養(yǎng)支原體以檢測(cè)支原體的污染。本品的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。
鑒于簡(jiǎn)捷、可靠、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，本標(biāo)準(zhǔn)選定SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳作為單克隆抗體純度的測(cè)定方法，本品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳繼以考馬斯藍(lán)R-250(Coomassie Blue R-250)染色后，還原條件下為兩條明確的顯色帶(分別位于分子量為55KD及25KD的位置)，非還原條件下為一條或兩條明確的顯色帶，位于分子量為160KD或160KD及320KD的位置。經(jīng)電泳膠掃描積分計(jì)算，本品的單克隆抗體(單體及二聚體)純度不低于95％。
IgG1[單克隆抗體含量]采用Bradford法測(cè)定單克隆抗體的含量。該方法的基本原理系因Coomassie Blue G 250染料能夠同蛋白質(zhì)分子的精氨酸的殘基形成穩(wěn)定結(jié)合物，染料在酸性試劑中主要以陽(yáng)離子形式存在，其最大光吸收(λmax)為470nm，而染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合物在酸性試劑中主要以陰離子形式存在，其最大光吸收(λmax)為595nm，據(jù)此，可用標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在相同條件下測(cè)定供試品595nm的光吸收，從而求出單克隆抗體的含量。
采用間接免疫熒光法，以含有細(xì)胞膜糖蛋白KD-43的癌細(xì)胞膜為抗原，本品的免疫活性不高于1微克/毫升。
實(shí)施例2、嵌合型抗細(xì)胞膜糖蛋白KD-43的單克隆抗體(GDK-1)的制備方法1).抗體人源化基于與鼠的序列相似性，人框架組織亞群的kappa鏈(VK)可變區(qū)亞群I和重鏈可變區(qū)(VH)亞群II被選用于抗體人源化。不保留kappa鏈低危位點(diǎn)42、83和106，但保留對(duì)應(yīng)鼠源單抗的與結(jié)合有關(guān)位置的框架組織殘基并人源化。6個(gè)GDK-1 CDRs被嫁接到rGDK-1-A可變區(qū)，根據(jù)抗體基因表達(dá)中最常用的密碼子，rGDK-1可變區(qū)的完整的氨基酸序列轉(zhuǎn)變成DNA序列。NheI位點(diǎn)位于VH的3’末端(GCTAGC)，另一個(gè)限制性位點(diǎn)，hindIII，則被引入5’末端，以便于克隆至哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體。此外，通過(guò)改變密碼子的用法，一些內(nèi)部的限制性位點(diǎn)，如KpnI(GGTACC)和XbaI(TCTAGA)也被引入人源化的框架DNA序列中。
2).表達(dá)載體的構(gòu)建人源kappa鏈和重鏈的不同區(qū)域的DNA片斷的合成使用六段長(zhǎng)的重疊合成DNA寡聚核苷酸，通過(guò)重疊PCR方法即可。六段重疊的寡聚核苷酸分兩步組建而成。第一步，六段寡聚核苷酸(5pmole)的每一段都在50μl的反應(yīng)混合液中退火和延伸。第二步，設(shè)計(jì)每一段的寡聚核苷酸引物(50pmole)在不同片斷的5’和3’端進(jìn)行雜交。人類(lèi)恒變區(qū)域的cDNA片斷可使用變性的引物通過(guò)PCR法克隆制得重鏈恒變區(qū)。重鏈載體(pHeavy)的構(gòu)建首先用hindIII/NheI和NheI/XhoI分別消化人的可變區(qū)DNA片斷和人重鏈不變區(qū)cDNA片斷，然后連接成一個(gè)hindIII/XhoI消化的載體，pSectag2B/Hygro(Invitrogen)；kappa鏈載體(pKappa)的構(gòu)建用hindIII酶消化人源化的可變區(qū)DNA片斷，人不變區(qū)cDNA片斷先5’磷酸化和用XhoI酶消化，然后連接成一個(gè)hindIII/XhoI消化的載體，pSectag2B(Invitrogen)。純化的質(zhì)粒DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染和測(cè)序，可變區(qū)的測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)的hGDK-1 DNA序列比較，共轉(zhuǎn)染至哺乳動(dòng)物細(xì)胞之前，不同的克隆之間通過(guò)交換DNA限制片斷糾正點(diǎn)突變和缺失。
3).抗體在CHO-K1細(xì)胞系中表達(dá)兩種表達(dá)載體(0.75μg pHeavy和0.75μg pKappa)和雜交瘤-SFM(Gibco)中5μl lipofectamine轉(zhuǎn)染至中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢CHO-K1細(xì)胞(ATCC)中，為了選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后添加含有250μg/ml潮霉素B的選擇培養(yǎng)液，選擇致密集落并通過(guò)夾心ELISA法篩選分泌hGDK-1的抗性克隆的上清，選擇分泌抗體達(dá)最高水平的抗性克隆，用無(wú)血清CHO-S-SFM培養(yǎng)液(Gibco)制備抗體，培養(yǎng)3天后收集上清，用旦白A親和層析法純化hGDK-1。離心過(guò)濾大約500ml混合的細(xì)胞上清，用1MTris-HCL(pH8.0)平衡，處理過(guò)的上清上樣，用旦白A柱純化，純化的抗體在PBS溶液中保存在-20℃，或加1％牛血清白旦白和0.02％NaN3(Sigma)保存在4℃。以已知濃度的人抗體IgG1kappa(Sigma)為標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)ELISA試驗(yàn)，用兩倍系列稀釋的純化的抗體測(cè)定濃度，用標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)作圖，校準(zhǔn)回歸線的斜率和Y-截距用相關(guān)系數(shù)不少于0.99來(lái)計(jì)算，hGDK-1樣品的數(shù)據(jù)點(diǎn)在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，用于計(jì)算抗體濃度，抗體樣品的純度和亞單位(重鏈和kappa鏈)的大小，分別在還原和非還原條件下，用SDS-PAGE分析。
4).rGDK-1的鑒定用免疫熒光染色試驗(yàn)證實(shí)rGDK-1與含有細(xì)胞膜糖蛋白KD-43的癌細(xì)胞膜的特異性結(jié)合，含有細(xì)胞膜糖蛋白KD-43的癌細(xì)胞膜先與抗體rGDK-1和GDK-1反應(yīng)，隨后與FITC偶合的二抗反應(yīng)，在熒光顯微鏡下觀察染色切片。通過(guò)間接ELISA法測(cè)定rGDK-1的結(jié)合活性，在96孔ELISA板(Coring)中用含有細(xì)胞膜糖蛋白KD-43的癌細(xì)胞膜包被在ELISA板上，1％BSA封閉后，加各種濃度(0-20μg/ml)的rGDK-1和非特異的人IgG kappa抗體(Sigma)，用HRP標(biāo)記的鼠抗人IgG單克隆抗體(Pharmingen)檢測(cè)結(jié)合的抗體，人組織樣品的成功包被是用鼠抗人的心肌鈣旦白I單克隆抗體(HyTest)針對(duì)心組織樣品。對(duì)含有細(xì)胞膜糖蛋白KD-43的癌細(xì)胞膜，有rGD-1-A，非特異的人IgG1 kappa抗體(Sigma)和非標(biāo)記的GD-A抗體三種抗體與生物素標(biāo)記的GD-A(biotin-GD-A)競(jìng)爭(zhēng)，加各種濃度(0-20μg/ml)的競(jìng)爭(zhēng)抗體樣品，隨后加5μg/ml的生物素-GDK-1，用抗生旦白鏈菌素-HRP(Pharmingen)檢測(cè)生物素-GDK-1與含有細(xì)胞膜糖蛋白KD-43的癌細(xì)胞膜的結(jié)合。
對(duì)于HAMA血清反應(yīng)試驗(yàn)，三種液相抗體樣品(GDK-1，rGDK-1和人IgG kappa)和固相GDK-1競(jìng)爭(zhēng)與人抗鼠抗體的結(jié)合，在ELISA板上先包被5μg/ml的GDK-1然后加含有HAMA血清(Type 2SQ，Boehringer，Mannheim)和各種濃度的抗體樣品(0-0.5μg/ml)的血清/抗體混合液，隨后加2.5μg/ml生物素交聯(lián)的鼠抗人IgG1單克隆抗體和抗生旦白鏈菌素-HRP，檢測(cè)HAMA血清中的人抗鼠IgG抗體和固相GDK-1的結(jié)合。上述提及的三種試驗(yàn)，都用0.1M碳酸鹽緩沖液(pH9.2)包被旦白，結(jié)合和檢測(cè)的溫育步驟都是每孔50μl，室溫1小時(shí)，用封閉液(PBS中1％牛血清白旦白)稀釋所有的血清和抗體樣品，每步之間用PBS洗板六次，檢測(cè)之后，加OPO底物溶液(Sigma)顯色，吸收光線在450nm。
實(shí)施例3、抗細(xì)胞膜糖蛋白KD-43的單克隆抗體的131-碘標(biāo)記(DGDK-1)(以Iodogen法為例)[范楨，湯釗猷，鐘高仁等，Iodogen和氯胺T標(biāo)記放射碘人肝癌鐵蛋白抗體的評(píng)價(jià).上海醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)1992 1912]1).將Iodogen溶于二氯甲烷，濃度為80％(w/v)。
2).取1.0ml上述溶液加入無(wú)熱源玻璃試管中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)掉二氯甲烷，使Iodogen在管內(nèi)形成一均勻薄層。
3).在涂管中按一定比例加入Na131I和抗體溶液，冰浴反應(yīng)30分鐘。
4).將Sephadex G-25用生理鹽水煮沸半小時(shí)，冷卻后裝柱，柱高20-40cm，直徑0.25-1.5cm。
5).用人血清白蛋白少許飽和。
6).將第3步中的反應(yīng)混合液上柱，分步收集流出液。
7).檢測(cè)各管收集液的放射強(qiáng)度。
8).檢測(cè)收集液中各放射峰的蛋白質(zhì)濃度。
9).保留同時(shí)含有放射活性和蛋白的收集液。
10).以0.22微米孔徑的醋酸纖維薄膜無(wú)菌條件下過(guò)濾。
實(shí)施例4、131-碘化單克隆抗體DGDK-1的放射生物學(xué)特性本品系131-碘化單克隆抗體DGDK-1無(wú)菌無(wú)病毒無(wú)熱源溶液。按其標(biāo)簽上記載的時(shí)間，含碘[131I]的放射性活度為標(biāo)示量的90.0-110.0％。
本品含5％人血清白蛋白作為穩(wěn)定劑。
本品為淡黃色的澄明液體。
1).取本品適量，照γ譜儀法(中國(guó)藥典1995年版二部附錄X III)測(cè)定，其主光子能量為0.364Mev?；蛉”酒愤m量，照半衰期測(cè)定法(中國(guó)藥典1995年版二部附錄XIII)測(cè)定，符合規(guī)定。
2).照放射化學(xué)純度測(cè)定法測(cè)定，在Rf值約為0處有放射性主峰。
pH值為6.5-7.5(中國(guó)藥典1995年版二部附 VI H)。
取本品適量，以細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋30倍后，依法檢查(中國(guó)藥典1995年版二部附XI E)。每1毫升原液中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量小于15Eu。
符合注射劑項(xiàng)下有關(guān)的各項(xiàng)規(guī)定(中國(guó)藥典1995年版二部附錄IB)。取本品適量，以丙酮-0.9％氯化鈉溶液(1∶1)為展開(kāi)劑，照放射化學(xué)純度測(cè)定法(中國(guó)藥典1995年版二部附錄XIII一法)測(cè)定，本品的放射化學(xué)純度不低于95％。
取本品適量，以直接放射免疫沉淀法測(cè)定本品的免疫活性。
取本品，照放射性濃度測(cè)量法(中國(guó)藥典1995年版二部附錄XIII)測(cè)量，含碘[131I]的放射性濃度不低于185MBq/ml。
放射性治療用藥。用于治療原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌。
靜脈注射 一次約925-850MBq，最大注入量不得超過(guò)10mL。
應(yīng)用實(shí)施例1 DGDK-1的臨床前動(dòng)物藥效學(xué)研究觀察指標(biāo)1).腫瘤體積按腫瘤長(zhǎng)徑×短徑2計(jì)算，以游標(biāo)卡尺計(jì)量徑長(zhǎng)。
2).生存期觀察時(shí)間2-3個(gè)月。
比放射性限定在3-7uCi/ug范圍內(nèi)。
劑量組的設(shè)置藥品分為0uCi，25uCi，50uCi，75uCi，100uCi，125uCi等劑量點(diǎn)。以0uCi劑量點(diǎn)為對(duì)照。每劑量點(diǎn)由6個(gè)載瘤裸小鼠組成。
試驗(yàn)結(jié)果表1劑量和有效小鼠數(shù)目間的關(guān)系有效鼠數(shù)0uCi 25uCi 50uCi 75uCi 100uCi 125uCi第1天 0 0 0 0 0 0第3天 0 0 0 0 0 2第5天 0 0 0 1 2 3第7天 0 0 1 3 5 6第9天 0 1 2 5 6 6第11天 0 2 3 6 6 6第13天 0 2 3 6 6 6ED50值(第11天及第13天)確定為50uCi/鼠。
表2.藥物注射后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腫瘤平均體積的變化(50uCi/鼠)注射后 對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)組天數(shù) (n＝12)(n＝12)0 2.25 2.883 227.50 88.334 271.09 95.505 505.63 231.456 524.77 290.667 498.68 339.548 675.45 397.459 837.62 521.33101106.79549.75111302.95623.33121249.83564.37131246.58738.58141382.00824.37151400.33831.25161662.54914.95171761.661009.54192136.271050.45212684.291123.54273152.541646.83303363.581577.29343353.292248.75
P值為0.0408＜0.05表3.藥物注射后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腫瘤平均生存期的觀察(50uCi/鼠)注射后 對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)組天數(shù)(n＝12) (n＝12)34 12 1235 11 1250 10 1252 91256 91158 71159 71060 51062 5964 2866 0880 08平均生存天數(shù)57.0873.08試驗(yàn)結(jié)論載瘤動(dòng)物藥效實(shí)驗(yàn)表明在劑量為25-125uCi范圍內(nèi)，注射DGDK-1后，腫塊體積明顯縮小，載瘤動(dòng)物生存期延長(zhǎng)。
應(yīng)用實(shí)施例2 DGDK-1的臨床前動(dòng)物安全性研究1).一般毒理研究試驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)論抗細(xì)胞膜糖蛋白KD-43的131-碘化單克隆抗體DGDK-1注射液的一般毒理研究表明，注射給予大劑量的DGDK-1對(duì)動(dòng)物(昆明種小鼠，家貓)的精神神經(jīng)系統(tǒng)，呼吸系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)無(wú)明顯影響。
2).動(dòng)物急性毒性試驗(yàn)方法參照衛(wèi)生部藥審辦頒布的“人用鼠源性單克隆抗體制備及質(zhì)量控制要點(diǎn)”中急性毒性試驗(yàn)要求進(jìn)行本試驗(yàn)。
試驗(yàn)結(jié)果小鼠一次尾靜脈注射抗細(xì)胞膜糖蛋白KD-43的131-碘化單克隆抗體DGDK-1注射液20mg/kg(相當(dāng)于臨床推薦劑量的200倍)后，一般狀態(tài)良好，與對(duì)照組小鼠無(wú)明顯差異。iv后24小時(shí)剖檢2♂2♀小鼠，肉眼未觀察到病變。試驗(yàn)組小鼠僅于給藥后2-5天出現(xiàn)一過(guò)性攝食減少，體重下降，此后體重逐步恢復(fù)正常增長(zhǎng)。在14天的觀察期內(nèi)，試驗(yàn)組小鼠各時(shí)間段的體重雖明顯低于對(duì)照組鼠(P＜0.001)，但試驗(yàn)組鼠全部存活，一般狀態(tài)正常，體重增長(zhǎng)，未見(jiàn)明顯毒副反應(yīng)。
3).動(dòng)物長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)試驗(yàn)方法參照衛(wèi)生部新藥審評(píng)中心編印的“人用鼠源性單克隆抗體制備及質(zhì)量控制要點(diǎn)”中慢性毒性試驗(yàn)的要求“連續(xù)給藥(隔天或每天)10次(按體重計(jì)算，總劑量相當(dāng)于人相對(duì)劑量的100倍)，觀察3個(gè)月，應(yīng)有80％動(dòng)物存活。然后處死，解剖，檢查有無(wú)肉眼可見(jiàn)病變，如有病變則應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行病理切片檢查。設(shè)有相應(yīng)的對(duì)照組，進(jìn)行本試驗(yàn)。
試驗(yàn)結(jié)果大鼠連續(xù)靜注抗細(xì)胞膜糖蛋白KD-43的131-碘化單克隆抗體DGDK-1注射液10天，未見(jiàn)明顯免疫反應(yīng)及抗抗體產(chǎn)生。觀察期間，給藥組有93.3％大鼠依然存活，但大鼠的活動(dòng)明顯減少，精神差，擠在一起，被毛無(wú)光澤、蓬松，攝食量和飲水量明顯減少；給藥組大鼠第1-2周體重增長(zhǎng)，3-6周至13周給藥鼠體重均非常明顯低于對(duì)照鼠，給藥組大鼠的輕度毒性反應(yīng)，可能是由碘[131I]放射損傷作用所致。
常規(guī)血液學(xué)檢查結(jié)果表明連續(xù)10天給予抗細(xì)胞膜糖蛋白KD-43的131-碘化單克隆抗體DGDK-1注射液的大鼠的紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白含量低于對(duì)照組，給藥組雌鼠的凝血時(shí)間長(zhǎng)于對(duì)照組。靜注抗細(xì)胞膜糖蛋白KD-43的131-碘化單克隆抗體DGDK-1注射液大鼠的血清堿性磷酸酶(ALP)、血糖(GLU)、尿素氮(BUN)，肌酐(Crea)，總膽固醇(T-CHO)測(cè)定值均明顯高于對(duì)照組(P＜0.05，P＜0.001)。其他生化指標(biāo)，均在正常值范圍內(nèi)。這些生化學(xué)改變可能是由碘[131I]內(nèi)照射損傷作用引起。
尸解發(fā)現(xiàn)心、肝、肺、脾、腎、腎上腺、甲狀腺、腦、睪丸、前列腺、腎上腺和甲狀腺臟器系數(shù)均明顯低于對(duì)照組。病理組織學(xué)檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給藥組大鼠腎臟發(fā)生程度不同的局灶性腎小球血管球增大，充滿球囊，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞增生，腎皮質(zhì)部曲管稍混亂，其中三只大鼠可見(jiàn)腎近曲小管空泡樣變性。對(duì)照組大鼠腎臟未見(jiàn)組織病理學(xué)改變。結(jié)果表明抗細(xì)胞膜糖蛋白KD-43的131-碘化單克隆抗體DGDK-1注射液對(duì)大鼠腎臟有一定損害作用。
4).醫(yī)學(xué)內(nèi)照射吸收劑量的研究方法采用ICRP和MIRD的方法。
內(nèi)照射吸收劑量表4單次注射后各器官的吸收劑量(mGY/MBq)心12.43肝17.97腎11.15肺41.37脾34.07卵巢 7.86腦12.56膀胱 94.97小腸 7.57上部大腸壁36.50下部大腸壁55.16
結(jié)論單次注射抗細(xì)胞膜糖蛋白KD-43的131-碘化單克隆抗體DGDK-1注射液后，心腦肝腎等主要臟器所受的輻射劑量比較小，膀胱，腸壁，尤其是下部大腸壁所受的劑量較高，但也在容許范圍內(nèi)。
應(yīng)用實(shí)施例3 DGDK-1的臨床前動(dòng)物藥代動(dòng)力學(xué)研究試驗(yàn)內(nèi)容和試驗(yàn)方法參照衛(wèi)生部藥政局頒布的《新藥臨床前研究指導(dǎo)原則匯編》中“臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究指導(dǎo)原則”進(jìn)行本試驗(yàn)。
結(jié)論大鼠靜注抗細(xì)胞膜糖蛋白KD-43的131-碘化單克隆抗體DGDK-1注射液后，0.15、0.30和0.45mg/kg三個(gè)劑量組的血藥濃度—時(shí)間曲線，符合二室數(shù)學(xué)模型，其藥物動(dòng)力學(xué)t/2α、t/2β，K12，K10，Vd，AUC和CL，分別為10.64±6.35min，328.32±22.17min，0.0486±0.03444min-1、0.03435±0.01575min-1、0.005065±0.001909min-1、349.92±16.82ml/kg、203775±21497μg·min·L-1和0.7424±0.0791ml·kg-1·min-1；7.5678±1.4485min、308.5±7.313min、0.5393±0.1382min-1、0.03705±0.00605min-1、0.005699±0.00034min-1、342.52±19.73ml/kg、39125±30715μg·min·L-1和0.7541±0.0548ml·kg-1·min-1；20.67±1.34min、317.5±9.33min、0.01597±0.00097min-1、0.0149±0.00098min-1、0.004897±0.000103min-1、401.0±25.21ml/kg、515175±24515μg·min·L-1和0.8749±0.0411ml·kg-1·min-1。靜注后，72和120hr抗細(xì)胞膜糖蛋白KD-43的131-碘化單克隆抗體DGDK-1注射液在荷人肝癌裸小鼠的組織分布基本相似，其放射性計(jì)數(shù)值以血液最高，肺腎次之，肝癌組織第4，肝、腦、骨骼肌、體脂、睪丸、胃腸、心、脾等組織分布較少，且這些組織的T/NT值均大于1，表明抗體與肝癌組織有特異結(jié)合。同時(shí)，子宮卵巢組織分布明顯高于睪丸組織。大鼠靜注單抗后，單抗絕大部分自尿排出，糞排出較少；靜注后第一天從尿、糞中排泄速度快，數(shù)量多，第二天次之，此后有一個(gè)長(zhǎng)時(shí)間的緩慢排泄過(guò)程，每天排泄量逐漸減少，直到第20天仍有微量抗體排出。20天內(nèi)總排泄量占注入量的50％左右。
應(yīng)用實(shí)施例4 DGDK-1注射液在荷人肝癌裸小鼠體內(nèi)的組織分布表5瘤/組織比器官2小時(shí)后72小時(shí)后120小時(shí)后心 2.74 2.402.38肺 2.19 1.581.61肝 3.15 2.472.11脾 3.00 2.452.49胃 3.42 4.284.37腸 4.91 3.292.37骨 2.61 5.183.79肌 6.29 5.876.54體脂6.10 4.093.93腦 18.46 14.91 13.69腎 2.57 2.252.55生殖腺 1.56 1.511.32血液0.61 0.490.66應(yīng)用實(shí)施例5 DGDK-1注射液的臨床安全性研究劑量分組
根據(jù)動(dòng)物毒理學(xué)的試驗(yàn)資料，小鼠單次靜脈注射的安全劑量可達(dá)3700MBq(100mCi)；又參照動(dòng)物藥效學(xué)試驗(yàn)的結(jié)果，小鼠顯效放射劑量范圍為0.925～4.625MBq(25-125uCi)。以國(guó)人的標(biāo)準(zhǔn)體重50kg計(jì)，相應(yīng)的人體劑量在3212.5～11562.5MBq(62.5-312.5mCi)之間，均應(yīng)屬安全劑量范圍。為謹(jǐn)慎起見(jiàn)，該項(xiàng)研究選用相應(yīng)的人體顯效劑量的1/3，即750MBq(20mCi)作為起始劑量。受試者共分5組，第1組為起始劑量組，劑量逐組遞增，組間間隔劑量為740MBq(20mCi)，最高劑量組為3700～MBq(100～mCi)。在上一劑量組連續(xù)觀察不短于14天、未發(fā)現(xiàn)毒副作用后再繼續(xù)下一劑量組。
740MBq～(20mCi～)組6例1480MBq～(40mCi～)組4例2220MBq～(60mCi～)組11例2960MBq～(80mCi～)組8例3700MBq～(100mCi～)組3例用藥方法將新鮮制備的DGDK-1與10ml生理鹽水混勻，在5分鐘內(nèi)緩慢經(jīng)靜脈注射入人體，再用同一注射器靜脈注入10ml生理鹽水，也可經(jīng)靜脈點(diǎn)滴、動(dòng)脈介入，可在2周內(nèi)多次注射。
毒副反應(yīng)觀察1.一般毒副反應(yīng)1)24小時(shí)內(nèi)(注射當(dāng)日)的急性毒副反應(yīng)觀察對(duì)32例受試者進(jìn)行注射后24小時(shí)內(nèi)的急性毒副反應(yīng)觀察顯示，劑量在740-3700MBq(20～100mCi)范圍內(nèi)，所有受試者在注射當(dāng)日均無(wú)休克、紫紺、呼吸困難、昏迷等危象發(fā)生，生命指征正常，亦無(wú)其它不良癥候出現(xiàn)；僅3例有發(fā)熱，均系注射前已發(fā)熱者，高于37.5℃，最高為38.6℃，(見(jiàn)表6)。
表6 耐受性試驗(yàn)臨床不良反應(yīng)觀察(注射當(dāng)日)序列 劑量體溫血壓脈搏 呼吸系統(tǒng)循環(huán)系統(tǒng)消化系統(tǒng)其它反應(yīng)號(hào) (MBq) (℃)1. 802.9 37.5 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化2. 806.6 37.0 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化3. 869.5 36.7 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化4. 743.7 37.5 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化5. 817.7 37.3 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化6. 784.4 37.0 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化7. 1505.9 37.1 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化8. 1520.7 38.6 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化9. 1698.3 37.2 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化10.1576.2 36.8 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化11.2264.4 36.9 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化12.2238.5 36.4 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化13.2253.3 37.0 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化14.2264.4 37.2 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化15.2249.6 36.6 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化17.2249.6 37.0 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化18.2223.7 37.2 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化19.2231.1 36.7 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化20.2486.4 37.0 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化21.2623.3 36.7 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化22.2652.9 37.0 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化24.2967.4 38.7 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化25.2971.1 37.3 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化26.3293.0 37.3 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化27.3133.9 36.8 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化28.2634.4 36.9 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化29.3015.5 37.0 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化30.2960.0 37.2 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化31.2878.6 36.5 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化32.3707.4 37.0 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化34.3877.6 36.7 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化35.3814.7 38.3 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化備注1、本表所記錄的體溫系指注射后24小時(shí)內(nèi)的最高體溫。有3例(No.8、No.24和No.35)體溫高于37.5℃；均系注射前已發(fā)熱者；注射后24小時(shí)內(nèi)的最高體溫分別為38.6℃、38.2℃和38.3℃，同注射前的體溫相比，無(wú)明顯增高。
2、血壓無(wú)異常變化系指注射后24小時(shí)內(nèi)未出現(xiàn)注射藥品所引起的血壓異常變化。
3、脈搏無(wú)異常變化系指注射后24小時(shí)內(nèi)未出現(xiàn)注射藥品所引起的脈搏異常變化。
4、呼吸系統(tǒng)無(wú)異常變化系指注射后24小時(shí)內(nèi)原有呼吸系統(tǒng)的癥狀或體征在注射后無(wú)明顯惡化。注射前咳嗽、咳血者2例，呼吸困難者1例，注射后并未觀察到原有癥狀有明顯惡化。
5、循環(huán)系統(tǒng)無(wú)異常變化系指注射后24小時(shí)內(nèi)原有循環(huán)系統(tǒng)的癥狀或體征在注射后無(wú)明顯惡化。
6、消化系統(tǒng)無(wú)異常變化系指注射后24小時(shí)內(nèi)原有消化道癥狀或體征在注射后無(wú)明顯惡化。注射前食欲不振者24例，腹脹者23例，腹痛者16例，乏力者16例，肝大并疼痛者22例，黃疸者3例，伴胸腹水者2例，注射后并未觀察到原有癥狀有明顯惡化。
7、其它無(wú)異常變化系指注射后24小時(shí)內(nèi)未出現(xiàn)皮疹、皮膚瘙癢、煩躁不安等。1例受試者原有皮膚瘙癢，注射后未觀察到明顯加重。
2)45天內(nèi)的毒副反應(yīng)觀察對(duì)32例受試者注射后45天內(nèi)的毒副反應(yīng)觀察發(fā)現(xiàn)，劑量為740-3700MBq(20～100mCi)時(shí)，除注射前原有的癥狀和體征外，所有受試者均未出現(xiàn)可疑的與該藥品有關(guān)的不良反應(yīng)，亦未觀察到原有的癥狀和體征因該藥品的使用而進(jìn)一步惡化(見(jiàn)表7)。
表7 耐受性試驗(yàn)臨床不良反應(yīng)觀察(注射后45天內(nèi))序列 劑量體溫 呼吸系統(tǒng) 循環(huán)系統(tǒng) 消化系統(tǒng)其它反應(yīng)號(hào) (MBq) (℃)1.802.9 38.2無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化2.806.6 37.0無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化3.869.5 38.2無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化4.743.7 37.0無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化5.817.7 37.0無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化6.784.4 37.3無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化7.1505.9 37.0無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化8.1520.7 39.4無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化9.1698.3 37.2無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化10. 1576.2 37.0無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化11. 2264.4 36.8無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化12. 2238.5 36.8無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化13. 2253.3 37.1無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化14. 2264.4 37.2無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化15. 2249.6 36.7無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化17. 2249.6 36.5無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化18. 2223.7 37.0無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化19. 2231.1 36.6無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化20. 2486.4 37.1無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化21. 2623.3 37.0無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化22. 2652.9 37.1無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化24. 2967.4 38.0無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化25. 2971.1 37.3無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化26. 3293.0 37.5無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化27. 3133.9 37.1無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化28. 2634.4 36.7無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化29. 3015.5 36.7無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化30. 2960.0 36.7無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化31. 2878.6 36.8無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化32. 3707.4 37.0無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化34. 3877.6 37.0無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化35. 3814.7 38.6無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化 無(wú)異常變化備注1、本表所記錄的體溫系指注射后45天內(nèi)記錄到的最高體溫。5例(No.1、No.3、No.8、No.24和No.35)有發(fā)熱，大多表現(xiàn)為一過(guò)性或波浪性，最高者39.4℃，可能系癌性發(fā)熱。在觀察期間體溫均曾回復(fù)至正常。
2、呼吸系統(tǒng)無(wú)異常變化系指注射后45天內(nèi)原有呼吸系統(tǒng)的癥狀或體征在注射后無(wú)明顯惡化。注射前咳嗽、咳血者2例，呼吸困難者1例，注射45天內(nèi)未觀察到原有癥狀有明顯惡化。
3、循環(huán)系統(tǒng)無(wú)異常變化系指注射后45天內(nèi)原有循環(huán)系統(tǒng)的癥狀或體征在注射后無(wú)明顯惡化。
4、消化系統(tǒng)無(wú)異常變化系指注射后45天內(nèi)原有消化道癥狀或體征在注射后無(wú)明顯惡化。注射前食欲不振者24例，腹脹者23例，腹痛者16例，乏力者16例，肝大并疼痛者22例，黃疸者3例，伴胸腹水者2例，注射后并未觀察到原有癥狀有明顯惡化。
5、其它無(wú)異常變化系指注射后45天內(nèi)未出現(xiàn)皮疹、皮膚瘙癢、煩躁不安等。1例原有皮膚瘙癢，注射后未觀察到明顯加重。
2.血液學(xué)毒性32例受試者注射后45天內(nèi)血液學(xué)毒性觀察，劑量在740-3700MBq(20～100mCi)范圍內(nèi)，經(jīng)多次檢驗(yàn)，32例受試病人的血紅蛋白、白細(xì)胞、血小板均在正常范圍內(nèi)；白細(xì)胞水平最低者曾達(dá)1.8×109/L(No.21，注射后第13天從2.9降至1.8，17天后恢復(fù)至2.7)；血小板水平最低者達(dá)35×109/L(No.26，注射后第6天從59降至35，4天后恢復(fù)至40)；表明注射該藥品后45天內(nèi)絕大多數(shù)受試者均未觀察到臨床上嚴(yán)重的血象異常反應(yīng)(見(jiàn)表8)。
表8.受試者受試前后的血象Hb(g/L) WBC(109/L) PLT(109/L)序列號(hào) 受試前 注射后 受試前 注射后 受試前 注射后1.120 110 3.65.1 123 802.141 131 5.84.1 154 573.98 70 5.95.8 210 1154.149 122 13.0 10.3 201 1735.103 90 7.35.5 137 1486.119 122 26.6 10.5 254 1307.123 110 5.34.2 192 1268.143 89 4.43.8 83 809.144 130 4.13.7 56 3910. 163 130 7.25.1 205 12011. 106 71 5.55.2 110 14612. 137 108 3.84.0 96 8613. 121 118 2.73.9 63 7414. 120 111 9.53.9 266 16415. 102 103 4.13.9 86 6617115 119 4.23.5 83 6518. 135 121 5.45.0 100 10819. 128 111 8.95.8 236 18020. 142 138 6.45.2 216 11421. 133 118 2.91.8 69 4022. 113 109 4.54.6 151 13424. 110 95 4.43.2 84 3925. 112 121 5.45.3 142 12726. 122 121 9.44.8 59 3527. 92 83 5.64.2 62 5128. 131 115 4.44.7 109 11029. 116 94 16.5 12.0 201 8330. 155 147 4.94.7 87 10431. 126 98 6.35.9 243 14832. 126 100 5.23.1 156 10634. 166 146 5.14.5 104 11535. 106 101 7.25.8 126 82備注表中所例的注射后的數(shù)據(jù)系指注射后45天內(nèi)多次化驗(yàn)報(bào)告中的最低值。
3.肝臟毒性對(duì)受試者進(jìn)行注射后45天內(nèi)的肝功能觀察，以了解該藥品對(duì)肝臟的毒性作用。在劑量740-3700MBq(20～100mCi)范圍內(nèi)，32例受試者經(jīng)多次檢驗(yàn)，8例(25.00％)白/球比值(A/G)注射后從1.0以上降至1.0以下，最甚者(No.5)降至0.91，但均能很快恢復(fù)，如No.5，白/球比值在下降后15天即恢復(fù)至1.11。23例受試者的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)值注射前已大于40單位，占受試者總數(shù)71.88％；注射后，這些受試者ALT值仍在40單位以上范圍內(nèi)呈小幅波動(dòng)。2例ALT值從注射前的陰性轉(zhuǎn)呈陽(yáng)性(No.5從38升至59，No.19從31升至56)，均為III期患者(見(jiàn)表9)。
表9.受試前后的肝功能A/G γ-GT(u/L) ALT(u/L)序列號(hào)受試前 注射后受試前 注射后 受試前 注射后1. 33.3/47.3 29.2/43.7108156 65 1870.7 0.672. 47.1/36.4 35.5/31.955 141 47 721.291.113. 36.3/33.7 31.2/30.5750400 31 351.081.024. 42.8/23.8 29.0/27.0112470 12 371.801.075. 42.4/23.8 31.2/34.392 206 38 591.780.916. 33.9/37.1 33.9/43.6320475 47 480.910.787. 38.0/32.5 33.9/33.6218203 46 1041.171.008. 37.1/36.0 27.3/27.474 274 1004901.030.999. 37.1/43.0 33.1/38.0130158 58 670.860.8710. 47.3/31.9 43.6/28.264 90 21 291.481.5511. 47.3/27.7 35.2/23.777 107 44 571.701.4912. 37.0/37.0 35.0/33.291 129 42 711 1.0513. 35.2/26.9 37.0/46.039 53 19 371.310.8014. 45.1/38.9 35.2/40.4223438 66 1881.160.8715. 37.4/51.0 35.3/38.330 95 29 230.730.9217. 38.0/29.7 32.0/33.740 44 21 331.270.9518. 42.1/38.2 37/42.1 49 105 58 1571.100.8819. 30.0/38.0 40.0/38.499 245 31 560.791.0420. 44.3/39.1 34.1/35.141 73 53 1661.130.9721. 32.0/41.6 32.0/41.660 93 66 610.770.7722. 41.8/31.2 37.0/37.557 157 44 701.330.9924. 30.6/38.3 29.2/48.6192243 51 3040.790.6025. 39.5/43 35.2/37.9447453 1892050.920.9326. 31.1/41.8 32.0/39.8165275 53 770.740.8027. 28.9/41.3 27.5/38.549 171 65 1180.690.7128. 42/26.1 40/31190185 65 701.611.2929. 31.0/42.4 24.0/37.0178178 24 280.730.6530. 42.2/32.1 32.5/28.2142215 68 791.311.1531. 38.1/34.6 32.0/40.1250402 52 511.100.8032. 27.0/32.0 24.5/32 165300 54 870.840.7734. 37.6/34.5 41.6/40.1335379 81 741.171.0435. 28.7/41.5 25.9/40.3191275 51 810.690.64備注
表中所列A/G值，系指45天內(nèi)多次化驗(yàn)報(bào)告中的最低值；γ-GT、ALT值，系指45天內(nèi)多次化驗(yàn)報(bào)告中的最高值。
4.腎臟毒性對(duì)受試者進(jìn)行注射后45天內(nèi)的腎功能觀察，以了解該藥品對(duì)腎臟的毒性作用。在劑量740～3700MBq(20～100mCi)范圍內(nèi)，32例受試者經(jīng)多次檢驗(yàn)，僅1例(No.20，腎轉(zhuǎn)移患者)尿酸(BUN)和肌酐(Cr)值高于正常，其腎功能注射前已不正常，注射后的BUN值波動(dòng)于7.0～9.2之間，Cr值波動(dòng)于135～140之間，追蹤數(shù)據(jù)較為穩(wěn)定(見(jiàn)表10)。
表10.受試前后的腎功能BUN(mmol/L)Cr(μmol/L)序列號(hào) 受試前 注射后 受試前 注射后1. 4.1 5.0 84 922. 5.436.5 83 803. 2.316.1 36 1004. 6.5 6.0 72 885. 4.0 5.0 57 906. 4.026.0 62 827. 5.3 5.71 60 708. 7.5 7.5 96 9595.2 5.6 93 8210. 6.7 6.5 68 7511. 5.6 6.9 79 8012. 7.5 5.4 78 7813. 6.0 7.6 63 8314. 3.8 4.5 89 7615. 3.5 4.9 73 7117. 5.3 6.3 59 6618. 4.9 6.1 89 8519. 2.6 4.1 44 6320. 7.0 9.2 140 13921. 5.0 5.0 78 7822. 4.056.7 76 8424. 3.6 3.8 79 7725. 6 7.2 97 11426. 4.3 4.7 78 9027. 3.7 3.9 46 4728. 4.446.0 54 6229. 5.0 5.6 73 7930. 5.055.97 53 5031. 6.7 5.9 61 9132. 3.1 6.5 59 8734. 5.065.3 70 7135. 5.564.21 51 48備注
表中所列注射后的數(shù)據(jù)，系指注射后45天內(nèi)多次化驗(yàn)報(bào)告中BUN和Cr的最高值。
5.甲狀腺毒性對(duì)32例受試者進(jìn)行注射后45天內(nèi)的甲狀腺功能觀察，以了解該藥品對(duì)甲狀腺的毒性作用。注射前甲狀腺功能低于正常標(biāo)準(zhǔn)者12例(占受試者總數(shù)的37.5％)，其中，T3和T4均低于正常標(biāo)準(zhǔn)者5例(占受試者總數(shù)的15.6％)，T3值低于正常標(biāo)準(zhǔn)者7例(占受試者總數(shù)的21.9％)，T4值低于正常標(biāo)準(zhǔn)者10例(占受試者總數(shù)的31.25％)；上述T3和T4值低于正常標(biāo)準(zhǔn)者，注射后[在劑量740～3700 MBq(20～100mCi)范圍內(nèi)]，其T3和T4值仍在正常標(biāo)準(zhǔn)以下呈小幅度波動(dòng)。受試前甲狀腺功能正常的20例患者中僅1例(No.35)，注射后T3值從正常的2.9降至2.2，下降幅度不大(見(jiàn)表11)。未觀察到該藥品在短期內(nèi)對(duì)甲狀腺的明顯毒性。
表11.受試者受試前后的甲狀腺激素水平序列 T3(pmol/L)T4(pmol/L)號(hào) 受試前注射后受試前注射后1. 3.9 2.7 22.1 18.52. 5.9 4.1 16.7 213. 5.1 4.2 18.8 264. 3.9 3.7 19.1 205. 4.1 2.65 20.39 19.26. 5.0 5.6 20.9 19.57. 5.5 3.8 15.9 24.18. 2.3 2.1 1.21 2.39. 3.1 3.2 10.5 10.910. 2.3 3.0 9.1 17.111. 1.3 1.4 11.1 12.112. 3.6 3.5 14.1 2413. 2.4 7.14 9.2 6.8914. 3.6 2.6 15.3 15.015. 6.4 5.5 12.9 13.717. 3.9 3.6 13.5 18.718. 2.5 6.25 8.7 11.8919. 5.1 6.0 24.6 22.420. 2.5 0.92 1.7 8.921. 2.8 2.75 6.0 6.022. 5.0 5.1 21.2 12.924. 3.5 3.7 8.7 9.125. 3.0 3.2 9.8 10.126. 3.7 3.8 15.0 15.227. 2.6 2.5 10.2 10.228. 4.5 4.6 13.7 17.929. 6.7 2.4 15.1 23.730. 6.1 4.2 15.4 24.031. 1.8 2.1 16.8 13.432. 3.5 3.6 11.1 19.534. 3.9 4.3 15.1 17.235. 2.9 2.2 11.9 10.3
備注表中所列注射后的數(shù)據(jù)系指注射后45天內(nèi)多次化驗(yàn)報(bào)告中T3和T4的最低值。
應(yīng)用實(shí)施例6 DGDK-1在原發(fā)性肝癌患者體內(nèi)的分布對(duì)32例受試者用ECT進(jìn)行DGDK-1的體內(nèi)分布研究。肝癌陽(yáng)性顯象率為76.47％(26/34)，提示DGDK-1在人體內(nèi)對(duì)肝癌組織具有相當(dāng)識(shí)別能力(表12，圖4)。注射后第4天顯象者7例，占20.59％，注射后第6天顯象者8例，占23.53％，注射后第14天顯象者4例，占11.76％，提示DGDK-1在人體內(nèi)明顯濃集在肝癌組織上，并能存留較長(zhǎng)時(shí)間(表12)。
表12. DGDK-1的ECT顯像結(jié)果總結(jié)序列號(hào) ECT顯像所見(jiàn) 顯象時(shí)間 顯象結(jié)果(注射后天數(shù))1.右葉可見(jiàn)較為明顯之放射性濃集 14 +2.右葉內(nèi)段左葉下段可見(jiàn)放射性濃集14 +3.右葉可見(jiàn)放射性濃集4 +4.右葉及方葉區(qū)域可見(jiàn)放射性濃集 4 +5.右葉可見(jiàn)異常放射性濃集區(qū) 4 +6.右葉可見(jiàn)異常放射性濃集區(qū) 10 +7.右葉內(nèi)顯較明顯放射性濃集 3 +8.巨塊型肝癌組織高強(qiáng)度積聚 2 +9.肝臟腫瘤高強(qiáng)度濃聚9 +10.肝左葉可見(jiàn)不均勻性放射性濃集， 3 +右葉占位區(qū)稍有濃集11.肝右葉及左葉可見(jiàn)放射性濃集區(qū) 6 +12.右葉占位區(qū)放射性高于其它肝組織 6 +13.右葉占位區(qū)放射性略高于其它肝組織 6 +14.肝右葉占位區(qū)放射性呈逐漸濃集趨勢(shì) 4 +15.右葉顯一放射性濃集區(qū) 8 +17.右葉可見(jiàn)明顯的放射性濃集區(qū)， 6 +分布不均勻18.肝右葉可見(jiàn)放射性濃集于腫瘤組織 1 +19.右葉可見(jiàn)明顯放射性濃集 4 +20.縱隔轉(zhuǎn)移性肝癌高強(qiáng)度放射性濃集 14 +21.肝右葉可見(jiàn)放射性濃集區(qū) 6 +22.肝右葉可見(jiàn)一大范圍放射性缺損區(qū) 4 -24.右后葉腫瘤未見(jiàn)放射性積聚 6 -25.肝右葉腫瘤高強(qiáng)度放射性濃集 2 +26.肝內(nèi)小腫瘤放射性積聚不明顯 4 -27.肝腫瘤未見(jiàn)明顯積聚 7 -28.肝右葉腫瘤區(qū)內(nèi)放射性明顯濃集 8 +29.右葉內(nèi)可見(jiàn)放射性異常濃集區(qū) 7 +30.右葉可見(jiàn)兩處放射性過(guò)度濃集區(qū) 6 +31.肝內(nèi)可見(jiàn)放射性濃集 6 -右葉外側(cè)部放射性稀疏32.顯現(xiàn)多個(gè)放射性濃集區(qū) 14 +33.腫瘤內(nèi)未見(jiàn)放射性積聚 4 -34.周邊部有少量放射性濃集 13 -35.肝右葉腫瘤濃集 6 +37.腫瘤內(nèi)未見(jiàn)放射性濃集 3 -顯象陽(yáng)性率 76.47％
應(yīng)用實(shí)施例7 注射DGDK-1后肝癌和肝、肺的放射性比值觀察了數(shù)例受試者各時(shí)相腫瘤和肝、肺的放射性比值，均大于1，瘤/肝比值最高者達(dá)39∶1(注射后120小時(shí))，在注射后360小時(shí)仍達(dá)34∶1(表13)。
表13.各時(shí)相腫瘤和肝、肺的放射性比值(受試者No.8)Time(h) T/Liver T/Lung2 177824 164548 166372 215696 2689120 39100144 27102168 26.2 103192 30120240 2789360 34147連續(xù)觀察部分病例的放射性分布動(dòng)態(tài)變化，示于圖5-1、5-2、5-3。觀察到單克隆抗體在病灶上的濃集需要一段時(shí)間過(guò)程，濃集的高峰時(shí)間因人而異。
應(yīng)用實(shí)施例8 DGDK-1的臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究對(duì)6例受試者進(jìn)行了藥代動(dòng)力學(xué)研究。6例受試者的受試序列號(hào)為8、9、18、28、33、37。注藥后，分別于1min、2min、5min、10min、15min、20min、3hr、4hr、6hr、24hr、48hr、72hr、120hr、144hr、168hr、192hr、240hr抽取2ml靜脈血樣，用肝素抗凝，然后取各時(shí)間點(diǎn)血清200ul，用γ計(jì)數(shù)器測(cè)量放射性。據(jù)此，描繪血液和有關(guān)臟器(肝、甲狀腺、腎等)的廓清曲線以及時(shí)間-放射性曲線；獲得DGDK-1的血液動(dòng)力學(xué)效應(yīng)值及有關(guān)排泄常數(shù)。測(cè)定2例受試者的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(見(jiàn)表14)，DGDK-1在肝、血液和肺的半數(shù)廓清時(shí)間均為24小時(shí)以?xún)?nèi)，腎臟的半數(shù)廓清時(shí)間約為48-72小時(shí)之間，甲狀腺的半數(shù)廓清時(shí)間為24小時(shí)，臟器的時(shí)間-放射性曲線見(jiàn)圖6-1、6-2、6-3、6-4、6-6、6-7。血液廓清時(shí)間-放射性曲線見(jiàn)圖7。
表14.若干臟器的藥代動(dòng)力學(xué)排泄常數(shù)序列號(hào) No.8 No.9肝 A(t)＝259.95e-0.108t+84.26e-0.0059t-904.68e-0.82tA(t)＝738.40e-0.00513t-682.96e-0.005t+160.3e-0.043t腎 A(t)＝25.28e-0.01215t+4.895e-1.395t甲狀腺 A(t)＝44.34e-1.07t+14.36e-0.0106tA(t)＝715.52e-0.0023t-706.0e-0.0023t+24.87e-0.029t肺 A(t)＝57.63e-0.01132t+66.99e-0.01132t脾 A(t)＝10.01e-0.00012t+111.23e-0.89tA(t)＝696.71e-0.0069t-725.1e-0.007t+61.16e-0.01t心 A(t)＝24.43e-0.009t+34.22e-0.605tA(t)＝716.44e-0.00179t-705.0e-0.0018t+23.68e-0.02t顱腔 A(t)＝14.44e-0.0124t+15.78e-0.72tA(t)＝716.44e-0.0179t-705.1e-0.018t+23.68e-0.02t血液 A(t)＝-40075.04e-22.38t+7683.61e-0.0189t+22120.19e-0.29t腫瘤 A(t)＝34.35e-0.0499t+88.90e-0.00634tA(t)＝717.68e-0.0023t-704.5e-0.0024t+52.59e-0.04t應(yīng)用實(shí)施例9 DGDK-1的內(nèi)照射輻射吸收劑量計(jì)算對(duì)6例受試者以Mirdose3軟件進(jìn)行DGDK-1的吸收劑量計(jì)算，其主要臟器內(nèi)的滯留時(shí)間研究作為計(jì)算臟器吸收劑量的基礎(chǔ)。DGDK-1在臟器內(nèi)滯留時(shí)間以顱腔最長(zhǎng)(32.14hr)，以后依次為肝臟(15.65hr)、肺(10.63hr)、甲狀腺(9.10hr)等(見(jiàn)表15)。
表15.抗細(xì)胞膜糖蛋白KD-43的131-碘化單克隆抗體DGDK-1注射液在若干臟器內(nèi)的滯留時(shí)間(hr)序列號(hào) No.8 No.9 No.18 No.28 No.33 No.37平均值注射劑量(MBq) 1520.71698.32223.72634.42031.31853.71993.7源器官顱腔 1.26E+00 2.47E+00 1.51E+00 18.5E+01 1.81E+00 7.60E-01 32.14E+00雙腎 1.21E+00 4.18E+00 1.47E+00 2.16E+01 3.68E+00 2.73E+00 5.81E+00肝臟 2.41E+01 7.79E+00 1.14E+01 2.26E+01 1.37E+01 1.43E+01 15.65E+00肺4.68E+00 1.20E+01 6.81E+00 2.26E+01 9.40E+00 8.28E+00 10.63E+00脾臟 1.21E+00 2.45E+00 2.24E+00 2.11E+01 3.99E+00 1.12E+00 5.35E+00甲狀腺4.70E+00 2.07E+00 1.50E+00 2.66E+01 1.31E+01 6.61E+00 9.10E+00膀胱 3.00E+00 3.29E+00 2.40E+001.90E+00 7.90E-01 2.28E+00依上述參數(shù)用Mirdose軟件計(jì)算6例受試者臟器內(nèi)照射吸收劑量，結(jié)果顯示臟器內(nèi)照射吸收劑量(mGy/MBq)從高到低依次為甲狀腺(225.7E-01)、脾(37.95E-01)、雙腎(35.45E-01)、肝(25.86E-01)、肺(13.31E-01)、心肌(11.16E-01)，以下較低的依次為下段大腸(0.18E-01)、睪丸(0.33E-01)、上段大腸(0.40E-01)、皮膚(0.46E-01)(表16)。除甲狀腺外，體內(nèi)主要臟器所受到的內(nèi)照射輻射劑量均在允許范圍以?xún)?nèi)。
表16中的有效劑量(effective dose)系指各器官所受到的內(nèi)照射輻射劑量乘以權(quán)重因子后的加和值，代表射線引起機(jī)體效應(yīng)(包括隨機(jī)效應(yīng))所需要的劑量，由表16可知，該項(xiàng)研究中的平均有效劑量為28.69E-01mSv/MBq，也在允許范圍以?xún)?nèi)。
表16.抗細(xì)胞膜糖蛋白KD-43的131-碘化單克隆抗體DGDK-1注射液對(duì)各臟器的內(nèi)照射吸收劑量(mGy/MBq)序列號(hào) No.8No.9No.18 No.28 No.33 No.37 平均值注射劑量(MBq) 1520.7 1698.3 2223.7 2634.4 2031.3 1853.7 1993.7源器官腎上腺 1.30E-011.05E-018.71E-025.95E-011.28E-011.08E-011.92E-01顱腔 1.32E-012.60E-011.59E-011.98E+002.08E-018.98E-029.36E-01乳腺 3.14E-023.84E-022.76E-022.62E-014.14E-023.49E-020.73E-01膽囊壁 2.13E-019.54E-021.10E-014.92E-011.43E-011.39E-011.99E-01下段大腸 2.26E-022.39E-021.77E-021.78E-029.72E-030.18E-01小腸 3.92E-022.95E-022.50E-022.73E-013.38E-022.69E-020.71E-01胃 5.46E-025.51E-024.59E-024.62E-017.14E-024.70E-021.23E-01上段大腸 5.40E-023.35E-023.17E-024.24E-023.65E-020.40E-01心肌 7.80E-027.72E-026.05E-026.32E+008.69E-027.50E-0211.16E-01雙腎 5.90E-011.80E+006.71E+009.35E+001.62E+001.20E+0035.45E-01肝 1.85E+006.33E-018.91E+001.92E+001.08E+001.12E+0025.86E-01肺 6.15E-011.47E+008.50E-012.83E+001.18E+001.04E+0013.31E-01肌肉 3.09E-023.20E-022.48E-022.64E-014.66E-023.24E-020.72E-01胰腺 1.19E-011.02E-019.03E-027.11E-011.38E-019.56E-022.09E-01紅骨髓 3.60E-023.89E-022.87E-023.15E-014.94E-023.66E-020.84E-01骨表皮 3.07E-023.41E-022.55E-023.42E-014.80E-023.35E-020.86E-01皮膚 1.57E-021.57E-021.23E-021.93E-012.22E-021.59E-020.46E-01脾臟 8.75E-011.76E+001.59E+001.49E+012.82E+008.24E-0137.95E-01睪丸 1.21E-021.29E-029.53E-031.52E-018.06E-033.77E-030.33E-01胸腺 3.03E-024.46E-023.04E-023.82E-015.88E-024.43E-020.98E-01甲狀腺 2.66E+001.17E+018.46E+001.50E+007.38E+013.73E+01225.70E-01膀胱壁 9.47E-011.04E+007.56E-011.81E-016.01E-012.52E-016.30E-01全身其他部位 9.32E-028.63E-026.99E-025.16E-011.24E-019.14E-021.63E-01有效劑量當(dāng)量 4.39E-018.74E-016.13E-017.00E+002.76E+001.47E+0021.93E-01有效劑量 4.02E-019.43E-016.79E-018.75E+004.22E+002.22E+0028.69E-01有效劑量當(dāng)量和有效劑量單位為mSv/MBq或者rem/mCi
應(yīng)用實(shí)施例10 DGDK-1引起的抗抗體反應(yīng)對(duì)33例受試者進(jìn)行注射該藥品后45天血液HAMA水平檢測(cè)，以了解該藥品所引起的抗抗體反應(yīng)。在用藥劑量740-3700MBq范圍內(nèi)，經(jīng)反復(fù)多次檢驗(yàn)，所有受試者注射后15天以?xún)?nèi)HAMA檢測(cè)均為陰性，但45天后大部分受試者出現(xiàn)HAMA陽(yáng)性反應(yīng)，45天后的HAMA陽(yáng)性率達(dá)81.82％(表17)。
表17. 受試前后的血液HAMA水平(O.D值)序列號(hào) 受試前注射后15天注射后45天1. - - +2. - - +3. - - +4. - - +5. - - +6. - - -7. - - +8. - - +9. - - +10. - - +11. - - -12. - - +13. - - +14. - - +15. - - -17. - - +18. - - +19. - - -20. - - +21. - - +22. - - +24. - - -25. - - +26. - - +27. - - -28. - - +29. - - +30. - - +31. - - +32. - - +34. - - +35. - - +37. - - +
備注高于Cut off值為陽(yáng)性，以+表示；低于Cut off值為陰性，以-表示。陽(yáng)性對(duì)照減去陰性對(duì)照的二分之一值為Cut off值。
應(yīng)用實(shí)施例11 抗細(xì)胞膜糖蛋白KD-43的131-碘化單克隆抗體DGDK-1注射液的臨床療效觀察指標(biāo)包括甲胎蛋白水平以明顯降低或恢復(fù)至20ng/ml以下為有效。
腫塊體積生存期參照文獻(xiàn)(“原發(fā)性肝癌”第2版，p539，湯釗猷、余業(yè)勤主編，1998年)，II期肝癌患者(中位腫瘤直徑為9cm)的自然平均生存期為6個(gè)月；III期肝癌患者(有黃疸、腹水、或轉(zhuǎn)移等)的自然平均生存期為2個(gè)月；考慮到該項(xiàng)臨床試驗(yàn)大部分受試者觀察時(shí)間尚短，故對(duì)II期和III期受試者分別設(shè)定判斷初步療效的指標(biāo)如下II期受試者參照文獻(xiàn)，以自然平均生存期6個(gè)月的1.33倍即存活8個(gè)月，和2.00倍即存活12個(gè)月，作為初步有效或有效的兩項(xiàng)指標(biāo)，分別計(jì)算8個(gè)月和12個(gè)月平均生存率。
III期受試者參照文獻(xiàn)，以自然平均生存期2個(gè)月的2.00倍即存活4個(gè)月，和3.00倍即存活6個(gè)月，作為初步有效或有效的兩項(xiàng)指標(biāo)，分別計(jì)算4個(gè)月和6個(gè)月平均生存率。
4.一般癥狀以食欲改進(jìn)、疲勞恢復(fù)、體力增進(jìn)、痛苦減輕、主觀癥狀好轉(zhuǎn)為有效。
療效1.甲胎蛋白受試前32例中20例血清甲胎蛋白陽(yáng)性(占受試者總數(shù)的62.5％)，最高者＞3500ng/ml(No.13和No.32)，其中30％為彌漫型肝癌患者。注射DGDK-1后45天內(nèi)，4例甲胎蛋白水平恢復(fù)至正常，占甲胎蛋白陽(yáng)性受試者總數(shù)的20％(4/20)，11例甲胎蛋白水平明顯下降，占甲胎蛋白陽(yáng)性受試者總數(shù)的55％(11/20)，甲胎蛋白水平微弱下降或不再升高者4例，占甲胎蛋白陽(yáng)性受試者總數(shù)的20％(4/20)。甲胎蛋白水平反而升高者1例，占甲胎蛋白陽(yáng)性受試者總數(shù)的5％(1/20)。(見(jiàn)表18)。
表18.受試前后甲胎蛋白(ng/ml)水平變化序列號(hào) 受試前受試后1. 198.7 188(治療后45天)2. ＜20 ＜203. ＜20 ＜204. ＜20 ＜205. ＜20 ＜206. ＜20 ＜207. ＜20 ＜208. ＜20 ＜209. 313.39＜20(治療后50天)10. 22.1 ＜20(治療后7天)11. 2616 1960(治療后45天)12. 1746 304(治療后45天)13. ＞35001052(治療后80天)14. 143 123.6(治療后45天)15. ＜20 ＜2017. 82.6 30(治療后60天)18. 2000 ＜20(治療后120天)19. 214 200(治療后63天)20. 845 300(治療后47天)21. 2792 400(治療后45天)22. 277.2 ＜20(治療后60天)24. ＞30001000(治療后62天)25. ＜20 ＜2026. ＜20 ＜2027. 658.2 199(治療后48天)28. 537 720(治療后45天)29. ＜20 ＜2030. 219.5 108(治療后45天)31. 500.6 216(治療后60天)32. ＞35001020(治療后43天)34. 177 180(治療后45天)35. ＜20 ＜20
備注表中所列受試后數(shù)據(jù)系指注射后45天內(nèi)多次化驗(yàn)報(bào)告中甲胎蛋白(AFP)的最低值。
2.腫塊體積根據(jù)對(duì)60余例患者的觀察II期患者的腫塊縮小率為72.4％(上海中山醫(yī)院)III期患者腫塊縮小率為54.8％(上海東方肝膽外科醫(yī)院)3.生存率1).對(duì)第一批35例II期患者的臨床觀察1年生存率為44.2％，其中二步切除率為75％10年生存率為31.4％2).對(duì)第二批32例受試者進(jìn)行注射DGDK-1后的生存觀察截止于2002.11.15，上述32例受試者的平均生存期為7.6月；存活6個(gè)月以上者13例，占總數(shù)的40.6％；存活10個(gè)月以上者10例，占總數(shù)的31.3％；存活12個(gè)月以上者10例，占總數(shù)的31.3％；至今仍存活者10例，占總數(shù)的31.3％(表19)。
如按受試者受試前腫瘤有無(wú)轉(zhuǎn)移分析18例無(wú)轉(zhuǎn)移患者的受試者平均生存期為10.3月；存活6個(gè)月以上者12例，占總數(shù)的66.67％，存活10個(gè)月以上者9例，占總數(shù)的50.0％，存活12個(gè)月以上者9例，占總數(shù)的50.0％，至今仍存活者9例，占總數(shù)的50.0％。14例已有轉(zhuǎn)移患者的受試者平均生存期為4.2月，其中存活6個(gè)月以上者1例，存活12個(gè)月以上者1例，至今仍存活者1例(表19)。
如按受試者受試前的臨床分期分析15例II期患者的平均存活期為11.73月，其中存活6個(gè)月以上者12例，占總數(shù)的80.0％，存活10個(gè)月以上者9例，占總數(shù)的60.0％，存活12個(gè)月以上者9例，占總數(shù)的60.0％，至今仍存活者9例，占總數(shù)的60.0％。17例III期患者平均生存期為3.97月，其中存活6個(gè)月以上者1例，存活10個(gè)月以上者1例，存活12個(gè)月以上者1例，至今仍存活者1例(表19)。
4.對(duì)32例受試者觀察注射藥物后45天內(nèi)的一般情況。主管醫(yī)師判斷一般狀況(如食欲、精神、體力、腹脹等)明顯好轉(zhuǎn)者27例，占84.3％(表19)。
表19.臨床癥狀及生存期觀察表(生存期統(tǒng)計(jì)截止期2002.11.15)序列號(hào) 一般情況 生存期(月)1. 好轉(zhuǎn) 42. 好轉(zhuǎn) 2.53. 無(wú)明顯變化 24. 好轉(zhuǎn) 45. 好轉(zhuǎn) 26. 好轉(zhuǎn) 57. 好轉(zhuǎn) 48. 好轉(zhuǎn) 239. 好轉(zhuǎn) 22***10.好轉(zhuǎn) 5.511.好轉(zhuǎn) 612.好轉(zhuǎn) 17***13.好轉(zhuǎn) 17***14.好轉(zhuǎn) 515.好轉(zhuǎn) 16***17.無(wú)明顯變化 3.518.好轉(zhuǎn) 14***19.好轉(zhuǎn) 420.好轉(zhuǎn) 14***21.好轉(zhuǎn) 722.好轉(zhuǎn) 14***24.無(wú)明顯變化 2.525.好轉(zhuǎn) 12***26.好轉(zhuǎn) 12***27.無(wú)明顯變化 2.528.好轉(zhuǎn) 429.好轉(zhuǎn) 230.無(wú)明顯變化 231.好轉(zhuǎn) 332.好轉(zhuǎn) 234.好轉(zhuǎn) 8***35.好轉(zhuǎn) 2***為至今仍存活者，共10人應(yīng)用實(shí)施例12 DGDK-1的用藥劑量與療效間的關(guān)系表20所列各劑量組的生存統(tǒng)計(jì)(截止期2002年11月15日)，在用藥劑量1480～2960MBq(40～80mCi)/10mg抗體/劑范圍內(nèi)，初步療效較高。需說(shuō)明的是，2960～MBq(80～mCi)組平均生存月數(shù)僅5.0個(gè)月，8個(gè)月生存率僅25％；但考慮到該組8例受試者中有5例為轉(zhuǎn)移患者，3例非轉(zhuǎn)移受試者中的2例注射后生存期均高于12月，至今仍健康存活，故將此劑量包括在上述臨床劑量范圍內(nèi)。
表20各劑量組的生存統(tǒng)計(jì)(截止期2002年11月15日)劑量組例數(shù)8個(gè)月生存率(％)平均生存月數(shù)0740～MBq(20～mCi) 6 3.251480～MBq(40～mCi) 4 50 13.602220～MBq(60～mCi) 11 54.5 10.682960～MBq(80～mCi) 8 25 5.03700～MBq(100～mCi) 3 33.3 4.0
SEQUENCELISTING<110>上海中科生龍達(dá)生物技術(shù)(集團(tuán))有限公司神農(nóng)氏醫(yī)藥股份有限公司<120>抗細(xì)胞膜糖蛋白KD-43的單克隆抗體GDK-1及其131碘化物DGDK-1和應(yīng)用<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1464<212>DNA<213>抗細(xì)胞膜糖蛋白KD-43的單克隆抗體GDK-1可變區(qū)蛋白<400>1atggactgga cctggaggat cttcttcttg gtggcagcag caacaggtgc ccacttccca60gggtcaactg gtgcagtctg gacctgaaag tgaaaaggcc tggggcctca gtgaaggtct120cttgcaaggc ctctggtttc tacttttcac taatgaataa tagatattgg ggtatacatt180gggtgcgaca ggcccctgga caagggcttg agtggatggg tgtgatttgg aacagtggtg240gacagggcca ccacagacta taatgcggca ggttcaatgg tcgtatccag agtcaccagg300
accacagaca cctctacgag tactgcctac atggaactga gaagcctgac atctgacgac360acggccgtgt tctactgtgc gagaaatgat actaacccct attttgagga tggttacgac420ggggggccct ttccttactg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcttc agcctccacc480aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg ggacacagcg540gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca600ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac660tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacgaagac ctacacctgc720aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagtagagcc caaatcttgt780gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc840ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca900tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac960ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac1020cgggtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag1080tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa1140gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag1200aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag1260
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1.一種抗細(xì)胞膜糖蛋白KD-43的單克隆抗體GDK-1，其特征在于編碼其可變區(qū)蛋白的核苷酸序列為序列表中的<210>1和<210>2。
2.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體GDK-1，其特征在于其為鼠源的或人鼠嵌合的。
3.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體GDK-1，其特征在于其為整分子IgG或IgG的Fab片段。
4.一種抗細(xì)胞膜糖蛋白KD-43的131-碘化單克隆抗體DGDK-1，其特征在于編碼其可變區(qū)蛋白的核苷酸序列為序列表中的<210>1和<210>2。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的131-碘化單克隆抗體DGDK-1，其特征在于其為鼠源的或人鼠嵌合的。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的131-碘化單克隆抗體DGDK-1，其特征在于其為整分子IgG或IgG的Fab片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求4、5或6所述的131-碘化單克隆抗體DGDK-1在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于該肝癌為巨塊型肝癌或彌漫型肝癌。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于其放射劑量范圍在20-100mCi之間。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于該131-碘化單克隆抗體DGDK-1為液體，使用方法為與生理鹽水配制后兩周內(nèi)1-5次注射。
全文摘要
本發(fā)明提供一種抗細(xì)胞膜糖蛋白KD－43的單克隆抗體GDK－1，編碼其可變區(qū)蛋白的核苷酸序列為序列表中的<210>1和<210>2；還提供了一種抗細(xì)胞膜糖蛋白KD－43的
文檔編號(hào)A61K39/395GK1523039SQ03115490
公開(kāi)日2004年8月25日 申請(qǐng)日期2003年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月21日
發(fā)明者謝弘, 王根鳳, 姚鑫, 陳瑞銘, 來(lái)文, 謝雍, 王放, 陳中健, 褚云芳, 李雋吉, 朱海穎, 戴慧敏, 強(qiáng)家模, 謝 弘 申請(qǐng)人:上海中科生龍達(dá)生物技術(shù)(集團(tuán))有限公司, 神農(nóng)氏醫(yī)藥股份有限公司, 上海中科生龍達(dá)生物技術(shù)(集團(tuán))有限