專利名稱：經(jīng)鼻給藥治療缺血性腦血管疾病的藥物制劑的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及中藥有效成分制劑，具體涉及含葛根有效成分的藥物制劑，以及該藥物經(jīng)鼻給藥在治療缺血性腦血管疾病中的應用。
背景技術(shù)：
腦血管疾病是人類的多發(fā)病和常見病。腦血管疾病的種類很多，常見的有腦動脈粥樣硬化，腦供血不足，短暫性腦缺血發(fā)作，腦卒中(包括蛛網(wǎng)膜下腔出血、腦出血、腦梗塞)，高血壓腦病，腦血管性癡呆等。其中腦卒中為城鄉(xiāng)居民的三大主要死亡原因之一。隨著醫(yī)學的發(fā)展，腦血管疾病的死亡率雖有所下降，但依舊是威脅人類健康的主要疾病之一。腦血管疾病的發(fā)病多與腦供血不足、腦缺血、高血壓、腦動脈粥樣硬化有關。早期治療可以減少腦組織的損傷。
目前，治療腦血管疾病藥物的給藥途徑主要是注射和口服給藥。注射給藥需要專業(yè)技術(shù)和器械，同時容易引起過敏反應，不適宜家庭用藥；口服給藥起效慢，部分藥物胃腸道吸收差，在進入體循環(huán)之前就有可能被降解，包括胃腸道降解和代謝，肝臟首過效應等，導致藥物的生物利用度降低，影響藥物療效的發(fā)揮。
經(jīng)鼻給藥在西醫(yī)臨床上耳鼻喉科應用極為廣泛，一般用來冶療各種鼻腔和鼻竇疾病，起到局部消炎、收斂和殺菌的作用。近幾十年來隨著對這一給藥途徑研究的深入，通過鼻粘模吸收發(fā)揮全身性治療作用的藥劑受到人們的重視，很有希望替代傳統(tǒng)的注射給藥途徑。1984年，美國New Jersey，New Brun-swick召開了“全身性用藥的鼻內(nèi)給藥途徑”專題研討會，認為鼻腔給藥作為全身性用藥是一個較為理想的給藥途徑。鼻粘膜表面積很大，人體鼻粘膜總吸收面積約150cm2。鼻粘膜下有豐富的毛細血管、靜脈竇、動靜脈吻合支以及淋巴網(wǎng)絡。
西藥經(jīng)鼻給藥已研究的藥物已涉的有抗生素、胰島素、干擾素、腦垂體激素、麻醉藥等。
目前已上市品種有降鈣素、催產(chǎn)素、安乃近、垂體后葉素、布托啡諾、舒馬普坦等。布托啡諾是一種有效、安全的止痛劑，用于偏頭痛的治療。Sandoz公司二氫麥角胺用于治療偏頭痛的的鼻腔給藥制劑均也已用于臨床；尼古丁經(jīng)鼻給藥替代性戒煙也取得比較好的效果。
中藥有效部位、有效成分經(jīng)鼻給藥治療腦血管疾病還未見報道。
葛根為傳統(tǒng)中藥，《神農(nóng)本草經(jīng)》首次對葛根的性味功效作了記載，謂葛根，味甘、平，主消渴、身大熱、嘔吐、諸痹、起陰氣、解諸毒?！秱摗分杏浭鎏柌』蛱栮柮骱喜。酶鸶委燀棻硰妿讕?、目痛等癥?！吨夂蠓健?、《本草綱目》有用葛根治療頭痛等諸痹的記載。這里“諸痹”、“背強幾幾”等癥可能與現(xiàn)代醫(yī)學的高血壓、腦血管疾病有關。
腦缺血等腦血管疾病的臨床治療目標是恢復供血供氧，抑制缺血部位的炎癥反應及維持神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的完整性。中藥葛根及其有效成分葛根素、大豆苷、大豆苷元等具有增加腦血流量、降低血壓、保護神經(jīng)細胞等功效。
目前含中藥葛根的制劑主要有“愈風寧心片”，為含葛根生藥粉的半浸膏片，包糖衣或薄膜衣。存在口服給藥吸收慢、口服生物利用度低，沒有突釋效應，10h左右釋藥不完全。以葛根素為指標愈風寧心膠囊在兔體內(nèi)絕對生物利用度僅為5.45％；葛根素注射液是以葛根黃酮中的一種葛根素(Puerarin)為主，純度大于98％的單一成分注射制劑。注射液需要專門的給藥器械，使用不便，且容易出現(xiàn)多種不良反應。臨床報道葛根素(普樂林)注射液的不良反應主要有致熱反應、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、溶血反應，皮疹、血紅蛋白尿、血管神經(jīng)性水腫等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種含葛根有效成分的經(jīng)鼻給藥制劑，該制劑能有效地預防和治療缺血性腦血管疾病，具有生物利用度高，腦內(nèi)藥物濃度高，無不良反應，給藥方便的特點。
本發(fā)明公開的預防和治療缺血性腦血管疾病的藥物組合物是以葛根有效成份提取物為活性組分與藥用輔料組成的各種經(jīng)鼻給藥的制劑。
本發(fā)明所述的葛根有效成份提取物是指從葛根中提取的有效部位或分離獲得的化學單體，如葛根總黃酮、葛根素、大豆苷或大豆苷元等。
本發(fā)明所述的葛根總黃酮是以野葛飲片為原料，以水為溶劑提取，再用大孔吸附樹脂純化獲得。制得的葛根總黃酮經(jīng)紫外分光光度法(UV)測定純度大于60％，高效液相色譜(HPLC法)測試表明總黃酮中含葛根素大于20％，此外還含有葛根大豆苷、大豆苷元等黃酮類成分。
本發(fā)明所述的葛根素為市售，HPLC測定純度大于97％。
本發(fā)明所述的大豆苷元為市售，HPLC測定純度大于95％。
本發(fā)明所述的大豆苷是葛根總黃酮經(jīng)氧化鋁柱層析制備所得，HPLC測定純度大于90％。
本發(fā)明所述的經(jīng)鼻給藥制劑是指醫(yī)學上可接受的各種鼻腔制劑如滴鼻劑、噴霧劑、鼻粉劑、膜劑、凝膠制劑或乳劑等，所述的各種制劑均可采用常規(guī)方法制備獲得。
本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題是公開上述制劑在制備預防和治療缺血性腦血管疾病的經(jīng)鼻給藥制劑藥物中的應用。
本發(fā)明將葛根總黃酮經(jīng)鼻給藥制劑治療缺血性腦血管疾病，藥效學研究表明可以增加腦血流、保護腦缺血、減小腦梗死體積。本發(fā)明還將葛根有效成分葛根素同位素標記后，進行了經(jīng)鼻給藥與口服、注射給藥等不同給藥途徑的生物利用度比較。結(jié)果表明，口服給藥起效慢、生物利用度低，且吸收情況受胃內(nèi)容物的影響較大。經(jīng)鼻給藥組，起效快，達峰時間15min左右，在一定程度上有望代替注射給藥。
下面對本發(fā)明的藥效和毒性試驗作進一步的描述一、葛根有效成分葛根素不同給藥途徑血藥濃度比較將葛根素用125I標記示蹤，以雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠為試驗動物。分注射、經(jīng)鼻給藥、口服禁食、口服不禁食四個試驗組，給藥后，不同時間采血，用γ-計數(shù)器測定血藥濃度。結(jié)果表明經(jīng)鼻給藥達峰時間、血藥濃度均明顯高于口服給藥組。
1.1實驗動物與試劑儀器雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(由中科院嚙齒類實驗動物中心提供)，250g～270g；γ-計數(shù)器，Beckman DP5500XING型。
1.2實驗方法將雄性SD大鼠隨機分為尾靜脈注射、經(jīng)鼻給藥、口服禁食、口服不禁食四個試驗組，每組動物3只。經(jīng)鼻給藥組每只老鼠每鼻孔給藥10μl(濃度)，靜脈、口服給藥組，給藥量為100μl(濃度)。給藥后，不同時間頸動脈采血，離心，取血漿50μl。以γ-計數(shù)器測定放射活度。
1.3實驗結(jié)果實驗結(jié)果表明，口服給藥起效慢、生物利用度低，且吸收情況受胃內(nèi)容物的影響較大。經(jīng)鼻給藥組，起效快，達峰時間15min左右，在一定程度上有望代替注射給藥。結(jié)果見表1、圖1。
表1葛根素不同給藥途血藥濃度比較(125I同位素示蹤，n＝3)

注血藥濃度以給藥量的放射活度百分比表示。
二、總黃酮經(jīng)鼻給藥的藥效學驗證用葛根總黃酮制劑多次經(jīng)鼻腔給藥治療大腦中動脈栓塞模型(MCAO)大鼠(缺血1h，再灌注24h)，監(jiān)測缺血2h內(nèi)局部腦血流的變化，檢查再灌注24h后神經(jīng)功能缺損程度并計算腦梗死體積。結(jié)果表明MCAO引起局部腦血流顯著下降，導致神經(jīng)功能嚴重缺損、產(chǎn)生較大腦梗死體積；葛根總黃酮多次鼻腔給藥可使腦血流下降幅度明顯減小、神經(jīng)功能缺損程度明顯減輕、腦梗死體積顯著縮小。因此，葛根總黃酮經(jīng)鼻腔給藥可以增加腦血流、縮小腦梗死體積，對急性腦缺血損傷具有很好的治療作用。
2.1實驗動物與試劑儀器雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(由中科院嚙齒類實驗動物中心提供)，250g～270g；葛根總黃酮(PIF)滴鼻劑(上海中醫(yī)藥大學中藥學院藥劑教研室提供)；激光多普勒腦血流儀(PeriFlux System5000，PERIMED，USA)；紅四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC，F(xiàn)20020401)，中國醫(yī)藥(集團)上海化學試劑公司(分析純)。
2.2實驗方法大鼠大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型及實驗分組采用Longa線栓法制作SD大鼠右側(cè)局部腦缺血模型，腦缺血1h，再灌注24h。SD大鼠用烏拉坦1g/kg腹腔麻醉，仰臥固定，頸正中切口，分離組織，結(jié)扎右頸外動脈，暫時夾閉右頸總動脈、頸內(nèi)動脈和翼額突動脈。將直徑0.18mm的4/0型尼龍線(頭端預先燙成圓球形，直徑0.22mm)由頸外動脈切口插入頸內(nèi)動脈，插線深度近20mm時有明顯的阻力，腦血流監(jiān)測可見B、C點腦血流驟然下降，MCAO模型即告成功，固定尼龍線并松夾，縫合切口。插線成功即開始記時，阻塞1h后，將尼龍線輕柔退致頸外動脈，即為再灌注開始。手術(shù)中和手術(shù)后(致動物蘇醒)保溫，肛溫37±1℃。將尼龍線僅留在頸內(nèi)動脈而不入顱為假手術(shù)組。
實驗動物分4組，即MCAO模型組8只，PIF1組8只，PIF2組8只，假手術(shù)組(sham組)4只。其中PIF 1組與2組濃度差2倍，分別為含20％、10％的生理鹽水滴鼻劑。在MCAO后0min、30min、再灌注后0min、30min、60min經(jīng)鼻腔給藥，每次10ul/鼻孔。模型組和假手術(shù)組用等劑量生理鹽水滴鼻。
(1)腦血流監(jiān)測用顱骨鉆于大鼠前囟后1.5mm水平，中線右側(cè)旁開1mm、3mm、5mm處鉆取三個直徑1mm小孔(見模式圖2)。插入激光多普勒腦血流儀光纖探頭到大腦皮層表面(3mm深度)，檢測并記錄腦血流值，每5分鐘記錄一組數(shù)據(jù)。連續(xù)監(jiān)測測讀取MCAO前(基礎值)、MCAO1h及再灌注1h內(nèi)腦血流值。
(2)神經(jīng)功能缺損評分再灌注后24h進行神經(jīng)功能缺損評分，評分標準[11]大鼠無任何不對稱活動為0分，提起尾巴時左前爪不能完全伸展為1分，在1分的基礎上左前肢活動障礙為2分，左前肢緊貼胸壁為3分，大鼠自由活動時向左側(cè)轉(zhuǎn)彎為4分，伴有明顯的前爪后推動作為5分，只能圍繞原點旋轉(zhuǎn)為6分，完全不能支撐身體重量，只能躺向左側(cè)為7分。
(3)腦梗死體積檢測再灌注24h，處死大鼠，快速取大腦，-20℃冷凍10min后，將大腦切成2mm厚腦片，浸入2％TTC-生理鹽水溶液37℃，30min。染色后將腦片浸入4％中性多聚甲醛固定保存數(shù)天，拍照，用圖象分析系統(tǒng)掃描測量腦梗死面積，換算成體積。計算出每個標本梗死體積占全腦體積的百分比。
統(tǒng)計分析采用SPSS10.0軟件，用單因素方差分析和t檢驗進行統(tǒng)計。
2.3結(jié)果(1)PIF鼻腔給藥對腦血流的影響圖3顯示模型組腦血流的變化A點在造模前后，仍維持在較高的血灌注水平，B、C點腦血流在造模后顯著降低，C點腦血流降低程度最嚴重，持續(xù)處于很低的灌注水平，即使在再灌注1h內(nèi)仍難以恢復到基礎水平的一半。PIF鼻腔給藥對腦血流的影響見圖4，圖4舉例說明PIF對A、B、C點腦血流的影響；兩PIF組均使受阻塞部位局部腦血流有明顯的升高，減小了腦血流下降的幅度。
(2)PIF腔給藥對大鼠神經(jīng)功能評分的影響神經(jīng)功能缺損評分可評估腦缺血損傷的嚴重程度。結(jié)果(見圖5)顯示，腦缺血1h，再灌注24h時模型組大鼠神經(jīng)功能缺損嚴重，平均達6級，而經(jīng)PIF鼻腔多次給藥后神經(jīng)功能得到有效的保護，平均神經(jīng)功能缺損分別僅為2和1.5級。
(3)葛根總黃酮鼻腔給藥對MCAO大鼠腦梗死體積的影響局部腦缺血的最終直接結(jié)果是腦梗死。腦組織缺血梗死體積的大小可以用TTC染色精確地反映(正常組織染成紅色，梗死組織蒼白)。圖6分別顯示了腦缺血1h、再灌注24后模型組、PIF鼻腔給藥(鼻1組和鼻2組)和假手術(shù)組腦梗死面積的大小。圖7為各組平均腦梗死體積百分比。模型組梗死體積平均為29.4％，PIF鼻腔多次給藥兩組的腦梗死體積均明顯減小，分別平均為14.8％和12.2％。給藥組與模型組梗死體積有顯著性差異(t檢驗，P＜0.01)。
實驗結(jié)果表明，在缺血再灌注的早期經(jīng)鼻腔給予葛根總黃酮滴鼻劑能明顯增加缺血局部腦血流。由于在腦缺血發(fā)生的早期及時增加腦血流，從而使腦組織避免嚴重和持續(xù)供血不足所導致的嚴重后果，有效地保護腦組織。腦梗死體積的檢測和神經(jīng)功能缺損記錄的結(jié)果也說明早期采取的治療措施由于增加了局部腦血流，最終使腦梗死體積顯著縮小，神經(jīng)功能得到有效保存。
三、毒性試驗3.1溶血試驗取家兔1只，心臟取血約20ml，置三角瓶中。用竹簽攪拌去除纖維蛋白，然后將血移入刻度離心管內(nèi)，加入生理鹽水5～10ml，混勻后離心5分鐘(2000～2500r/分鐘)，去除上清液。再加生理鹽水，混勻離心，反復3～4次，至上清液無色透明為止。將所得紅細胞按容積，用生理鹽水稀釋成2％的混懸液。
取使館試管7支，編號排列于試管架上，按下表加入各種溶液。第6管不加供試品溶液，作為空白對照。第7管，用蒸餾水代替生理鹽水作為陽性對照，將各管輕輕搖勻，在37℃水浴中保溫1小時。將配制葛根總黃酮滴鼻劑作為供試品溶液，結(jié)果高濃度組(20％)、低濃度組(10％)均不產(chǎn)生溶血反應，即試管中紅細胞全部下降、上層液無色透明。說明葛根總黃酮對鼻黏膜細胞膜基本無毒性作用。
3.2鼻纖毛毒性試驗取中華大蟾蜍，體重30～40g，雌雄皆有。將蟾蜍仰臥固定于蛙板上，用止血鉗牽拉，使口腔張開，于上腭粘膜處滴加藥液0.5ml，使完全浸沒上腭，接觸30min后，分離上腭粘膜，用生理鹽水洗盡血塊、雜物及藥物，粘膜面向上平鋪于載玻片上，輕輕蓋上蓋玻片，于50倍生物顯微鏡下觀察粘膜纖毛的運動情況，隨后擱置于盛有少量生理鹽水的培養(yǎng)皿中，密閉，使水氣近飽和狀態(tài)，環(huán)境溫度20～25℃，此后每隔適當時間取出標本，顯微鏡觀察，如纖毛繼續(xù)運動，則將標本放回培養(yǎng)皿中，直至纖毛運動停止后，記錄從給藥開始至纖毛運動停止所持續(xù)的時間。以給藥組的纖毛持續(xù)運動時間除以生理鹽水對照組的時間，得纖毛持續(xù)運動時間的相對百分率，百分率越高，表示藥物對纖毛運動的影響越小。
結(jié)果生理鹽水組鼻纖毛擺動時間為738.0±50.6；葛根總黃酮滴鼻劑高濃度組(20％)，鼻纖毛擺動時間為698±32.7；葛根總黃酮低濃度組(10％)，鼻纖毛擺動時間為715±26.2。給藥組與生理鹽水組無顯著性差異(t檢驗，P＞0.01)。說明葛根總黃酮對鼻纖毛基本無毒性作用。
本發(fā)明將葛根有效部位、有效成分以經(jīng)鼻給藥制劑的方式給藥可大大減少患者的痛苦及醫(yī)生的工作量。與口服給藥相比，可以提高生物利用度，解決一些中藥有效成分在胃腸道吸收較差，生物利用度低的問題；與注射劑相比，給藥方便，可以提高腦內(nèi)藥物濃度，避免不良反應。
本發(fā)明以中藥葛根為實例進行了研究，但不限于此味中藥。具有增加腦血流量、保護腦缺血功效的中藥有效部位、有效部位均可作為藥物組合并制成相應的經(jīng)鼻給藥制劑。如中燈盞細辛中的燈盞花素、三七中的三七總皂苷等。


圖1、不同給藥途徑血藥濃度比較圖2、腦血流監(jiān)測部位模式圖其中1為前囟，2為后囟圖3、模型大鼠局部血流變化圖4、葛根總黃酮鼻腔給藥對MCAO大鼠局部腦血流的影響圖5、PIF鼻腔給藥對MCAO大鼠神經(jīng)功能缺損評分圖6、TTC染色顯示模型、PIF1、PIF2和sham組腦梗死體積圖7、鼻腔給藥對MCAO大鼠腦梗死體積的影響
具體實施例方式實施例1滴鼻劑取葛根總黃酮20g(純度大于60％)，加入30ml丙二醇、50ml生理鹽水使溶解。濾過，自濾器上加生理鹽水至100ml，分裝，即得。
實施例2噴霧劑取葛根素20g，加入50ml丙二醇，150ml生理鹽水使溶解。濾過，自濾器上加生理鹽水至200ml，分裝至鼻腔給藥噴霧瓶中，即得。
實施例3鼻粉劑將葛根素，粉碎，過篩。取粒徑40～60μm的葛根素細粉8g，加入微晶纖維素2g，混勻，即得。共制得鼻粉劑10g。
實施例4鼻粉劑將大豆苷元，粉碎，過篩。取粒徑40～60μm的大豆苷元細粉8g，加入微晶纖維素2g，混勻，即得。共制得鼻粉劑10g。
實施例5鼻粉劑將大豆苷，粉碎，過篩。取粒徑40～60μm的大豆苷細粉4g，加入微晶纖維素1g，混勻，即得。共制得鼻粉劑5g。
權(quán)利要求
1.一種含葛根有效成分的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物是以葛根有效成分提取物為活性組分與藥用輔料組成的各種經(jīng)鼻給藥的制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含葛根有效成份的藥物組合物，其特征在于其中所述的葛根有效成分提取物為從葛根中提取的有效部位或分離獲得的化學單體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的含葛根有效成份的藥物組合物，其特征在于其中所述的從葛根中提取的有效部位葛根總黃酮或分離獲得的化學單體葛根素、大豆苷或大豆苷元。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的含葛根有效成份的藥物組合物，其特征在于其中所述的葛根總黃酮是以野葛飲片為原料，以水為溶劑提取，再用大孔吸附樹脂純化獲得，含葛根總黃酮大于60％，含葛根素大于20％，此外還含有葛根大豆苷、大豆苷元等黃酮類成分。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的含葛根有效成份的藥物組合物，其特征在于其中所述的葛根素為市售，純度大于97％。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的含葛根有效成份的藥物組合物，其特征在于其中所述的大豆苷元為市售，純度大于95％。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的含葛根有效成份的藥物組合物，其特征在于其中所述的大豆苷是葛根總黃酮經(jīng)氧化鋁柱層析制備所得，純度大于90％。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含葛根有效成份的藥物組合物，其特征在于其中所述的經(jīng)鼻給藥制劑是指醫(yī)學上可接受的各種鼻腔制劑如滴鼻劑、噴霧劑、鼻粉劑、膜劑、凝膠制劑或乳劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含葛根有效成分的藥物組合物在制備預防和治療缺血性腦血管疾病的經(jīng)鼻給藥制劑藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及含葛根有效成分的藥物制劑，以及該藥物經(jīng)鼻給藥在治療缺血性腦血管疾病中的應用。本發(fā)明公開的藥物組合物是由葛根有效成分提取物為活性組分與藥用輔料組成的各種經(jīng)鼻給藥的制劑如滴鼻劑、噴霧劑、鼻粉劑、膜劑、凝膠制劑或乳劑等。該制劑能有效地預防和治療缺血性腦血管疾病，具有生物利用度高，腦內(nèi)藥物濃度高，無不良反應，給藥方便的特點。
文檔編號A61K31/7042GK1524533SQ03115539
公開日2004年9月1日 申請日期2003年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月27日
發(fā)明者張彤, 徐蓮英, 周飛, 陶建生, 蔡貞貞, 陳長勛, 徐培康, 張 彤 申請人:上海中醫(yī)藥大學