專利名稱：一種免疫預(yù)防滴鼻制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物制品領(lǐng)域，涉及一種免疫預(yù)防滴鼻制劑及其制備方法，具體涉及一種滅活呼吸道傳播病毒滴鼻劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
2003年2月下旬我國(guó)廣州發(fā)生一種新的傳染性非典型肺炎，在香港及世界各國(guó)先后亦發(fā)生同樣疾病。3月中旬意大利醫(yī)生Ubani向世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)告這一疾病，命名為SARS(Ref)。4月16日WHO在全世界十個(gè)國(guó)家協(xié)作基礎(chǔ)上確定并公布SARS病原為一特殊的新型冠狀病毒或冠狀病毒變種。(ref)目前世界范圍內(nèi)已有不同國(guó)家或地區(qū)的實(shí)驗(yàn)室分離出新型冠狀病毒(簡(jiǎn)稱SARS病毒)。通過(guò)對(duì)其全基因組測(cè)序，已確定其分類地位于已知的冠狀病毒第一和第三組之間，屬第二組。鑒于這是一種新出現(xiàn)的病毒，目前對(duì)各毒株的分離、鑒定、測(cè)序還在進(jìn)行中。
由于SARS來(lái)勢(shì)洶猛，傳播迅速，在根據(jù)常規(guī)制備滅活疫苗的同時(shí)，急需研制一種免疫預(yù)防制劑如鼻制劑，供對(duì)SARS患者密切接觸者使用。這一制劑的應(yīng)用將可為控制SARS傳播起重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種免疫預(yù)防滴鼻制劑及其制備方法，尤其是一種滅活呼吸道傳播病毒滴鼻劑及其制備方法。
本發(fā)明免疫預(yù)防滴鼻制劑含滅活新型冠狀病毒和藥用敷劑。
本發(fā)明滴鼻制劑所含的新型冠狀病毒具有序列1的結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明免疫預(yù)防滴鼻制劑通過(guò)下述步驟和方法制備。
1.分離與鑒定新型冠狀病毒，1)取SARS病人的鼻咽洗液，用傳代細(xì)胞FRhK4細(xì)胞作病毒分離，出現(xiàn)病變則繼續(xù)傳代；不出現(xiàn)病變進(jìn)行盲傳三次，同時(shí)用已知的可測(cè)定新冠狀病毒保守序列的引物，作RT-PCR檢測(cè)及測(cè)序，確定是否為新型冠狀病毒。以該病毒感染細(xì)胞制備抗原片，與臨床診斷為非典型肺炎病人雙份血清作免疫熒光檢測(cè)，病人恢復(fù)期血清與病毒抗原片的抗體效價(jià)有4倍以上升高，證明所分離病毒是非典型肺炎的主要病原體。
2)確定毒株的效價(jià)及全基因組測(cè)序?qū)⑸鲜龆局暝趥鞔?xì)胞中連續(xù)傳代，穩(wěn)定傳代。用在細(xì)胞中作半數(shù)細(xì)胞病變(TCID50)效價(jià)測(cè)定，滴度效價(jià)為107或以上，作全基因序列測(cè)定及分析，證明為新型冠狀病毒。
3)病毒滅活，收取接種細(xì)胞上清液中病毒，用37％-38％濃度的甲醛加入病毒液中，使甲醛的最終濃度達(dá)0.025％，置4℃72小時(shí)后，盲傳三代，確定無(wú)活病毒存在。
4)滅活病毒純化，用超速離心法收集培養(yǎng)液中的滅活病毒，并用氯化鈣密度梯度離心法提純滅活病毒。以透析式超離心法除去殘留的氯化鈣。
5)測(cè)定滅活病毒量，采用定量RT-PCR法測(cè)定病毒RNA拷貝數(shù)，以確定病毒含量。
6)測(cè)定滅活病毒抑制活病毒感染力，在細(xì)胞培養(yǎng)中，接種滅活病毒30分鐘后，再接種活病毒，其TCID50明顯降低，證明滅活病毒有抑制活病毒感染性的作用。
7)可加入適當(dāng)?shù)淖魟┗蚍€(wěn)定劑，以保證滅活病毒抗原的穩(wěn)定性，制備本發(fā)明免疫預(yù)防滴鼻制劑。
本發(fā)明滅活新冠狀病毒免疫預(yù)防滴鼻制劑可供對(duì)SARS患者密切接觸者使用。其具有下述優(yōu)點(diǎn)1)制備方法簡(jiǎn)便，不必按常規(guī)制備疫苗的病毒株空斑純化，檢測(cè)殘余細(xì)胞成分及作為注射制劑的需進(jìn)行急性毒性，慢性毒性，致癌，致崎等步驟。2)只需證明無(wú)害即可使用，至少是一種局部特異免疫的制劑。3)可據(jù)此制劑獲得有關(guān)新冠狀病毒滅活技術(shù)及局部免疫應(yīng)答的特點(diǎn)。4)為制備滅活新冠狀病毒疫苗奠定基礎(chǔ)。


圖1.正常細(xì)胞與接種標(biāo)本后3-4天的細(xì)胞病變(400×，F(xiàn)Rhk-4)。
圖2.用新冠狀病毒特異的引物對(duì)細(xì)胞病變陽(yáng)性的FRhk-4細(xì)胞提取的RNA作RT-PCR，電泳出現(xiàn)預(yù)期條帶。
圖3.GHGZ株的部分核苷酸序列分析，結(jié)果證明為新型冠狀病毒。
圖4.為間接免疫熒光染色片。
圖5.對(duì)GHGZ株的557個(gè)氨基酸的分析。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1分離與鑒定冠狀病毒1)自我國(guó)廣州一名SARS患者的鼻咽洗液分離新型冠狀病毒毒株。所述患者女性，發(fā)熱2天后于2003年2月17日就診于廣州醫(yī)學(xué)院第一醫(yī)院?；颊唧w溫38.5℃有輕微咳嗽，X線檢查右肺有新浸潤(rùn)性陰影，并有與SARS患者接觸史。
2)病毒分離所用細(xì)胞為FRhk-4傳代細(xì)胞系，培養(yǎng)于含10％胎牛血清的MEM(Gibco)培養(yǎng)基中。將細(xì)胞用無(wú)血清MEM洗后，接種鼻咽洗液200ul，同時(shí)加入1ug/ml胰蛋白酶(Sigma)。孵育于36.5℃60分鐘后，加入1ml不含胎牛血清的MEM(含有1ug/ml胰蛋白酶)，繼續(xù)培養(yǎng)于36.5℃二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)，每日觀察細(xì)胞病變，出現(xiàn)圓形細(xì)胞團(tuán)縮、折光度增加為細(xì)胞病變。
3)將上述細(xì)胞病變的上清液(代號(hào)為GHGZ-1)接種至另一瓶FRhk-4細(xì)胞并同時(shí)進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，所用引物為冠狀病毒的保守核苷酸序列。在檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性的細(xì)胞培養(yǎng)瓶加入1％胎牛血清MEM繼續(xù)培養(yǎng)，直至出現(xiàn)50％的細(xì)胞病變。
4)將上述陽(yáng)性的細(xì)胞培養(yǎng)接種至傳代Vero細(xì)胞(ATCC來(lái)源)，繼續(xù)擴(kuò)增病毒，或凍存于-70℃。第一代的GHGZ毒株在4天左右出現(xiàn)細(xì)胞病變局灶性細(xì)胞變圓(見圖1)，以后細(xì)胞病變?cè)?-2天擴(kuò)散至全細(xì)胞層。用新冠狀病毒特異的引物對(duì)細(xì)胞病變陽(yáng)性的FRhk-4細(xì)胞提取的RNA作RT-PCR，所述標(biāo)本的RNA先經(jīng)轉(zhuǎn)錄成cDNA后，用引物5’-TACACACCTCAGCGTTG-3’和5’-CACGAACGTGACGAAT-3’94℃8分鐘后再經(jīng)40個(gè)周期(94℃1分鐘，56℃1分鐘，72℃1分鐘)擴(kuò)增，擴(kuò)增后產(chǎn)物在2％瓊脂糖中作電泳，出現(xiàn)預(yù)期條帶(圖2)。病毒測(cè)序表明，與其他國(guó)家和香港分離的毒株為同一屬，結(jié)果證明為新型冠狀病毒(圖3)。
5)為確診所分離培養(yǎng)的病毒為該患者SARS的病原體，收集19例臨床診斷為SARS病人早期與恢復(fù)期雙份血清用間接免疫熒光法測(cè)定。結(jié)果顯示全部病人恢復(fù)期血清抗體至少64倍的效價(jià)升高(圖4)。因此可以確認(rèn)GHGZ是該SARS患者的病原。
6)經(jīng)TCID50測(cè)定，第三代后的病毒滴度為107-108，并能在Vero細(xì)胞穩(wěn)定傳代。
7)該病毒株經(jīng)全序列測(cè)定分析，對(duì)GHGZ株的557個(gè)氨基酸的分析。分析“樹根”為Okaveieo(AA下82690)。其他均為GeneBank中已登錄的其他新冠狀病毒株。橫線的長(zhǎng)短與氨基酸數(shù)差別相應(yīng)。表明該病毒株為在香港、加拿大和美國(guó)及北京分離的冠狀病毒流行株之母株(圖5)。
實(shí)施例2病毒滅活實(shí)驗(yàn)1)將接種GHGZ毒株并出現(xiàn)25％～56％細(xì)胞病變的Vero細(xì)胞，用1ml 0.01M pH7.2PBS吹打刮下，用1000rpm離心沉淀獲細(xì)胞，再用PBS洗一次后，按每玻片孔6ul滴在其中，吹干后，用-20℃丙酮固定30分鐘，作為陽(yáng)性抗原玻片對(duì)照。
2)用上述的病毒感染細(xì)胞抗原片用終濃度為0.025％、0.25％及2.5％的甲醛在4℃固定72小時(shí)后，用已知含陽(yáng)性抗體血清經(jīng)56℃30分鐘滅活后進(jìn)行間接熒光抗體染色，即分別加入1∶40抗體陽(yáng)性血清，置37℃45分鐘后，洗去血清，加入FITC-標(biāo)記抗人IgG抗體(根據(jù)試劑推薦濃度)37℃作用45分鐘后，洗去熒光抗體、加上無(wú)熒光甘油封片后觀察。
3)結(jié)果僅有濃度為0.025％甲醛處理的細(xì)胞片仍保持與陽(yáng)性抗體作用的特點(diǎn)，說(shuō)明0.025％甲醛既可滅活又可以保持新冠狀病毒的抗原性，可用于滅活冠狀病毒。
實(shí)施例3滅活病毒抑制活病毒復(fù)制實(shí)驗(yàn)1)用細(xì)胞接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待生長(zhǎng)鋪滿孔75％以上，加入已滅活的病毒(TCID50計(jì)算相當(dāng)于107/ml)，30-50后加入GHGZ毒株，分別稀釋為102103104105106107TCID50/ml。每一稀釋度做復(fù)孔或三重復(fù)孔，另有不加滅活病毒僅加稀釋液的活病毒對(duì)照及細(xì)胞對(duì)照。
2)36.5℃孵育后，觀察細(xì)胞病變，計(jì)算滅活病毒抑制活病毒的效果，結(jié)果證明活病毒的復(fù)制性下降2個(gè)10克的TCID50，由TCID50為107下降為105，或更高。
WWBWOR~1.TXTOrganization Applicant----------------------Street廣州市沿江路151號(hào)City廣州市State廣東省Country中國(guó)PostalCode510120PhoneNumberFaxNumberEmailAddress<110>OrganizationName廣州醫(yī)學(xué)院呼吸疾病研究所Application Project-------------------<120>Title一種免疫預(yù)防滴鼻劑及其制備方法<130>AppFileReference<140>CurrentAppNumber<141>CurrentFilingDate＿＿-＿-＿Sequence 1________<213>OrganismNameconvalescent serum<400>PreSequenceStringnnnnnnnnnn nnnnnctacc caggaaaagc caaccaacct cgatctcttg tagatctgtt 60ctctaaacga actttaaaat ctgtgtagct gtcgctcggc tgcatgccta gtgcacctac120gcagtataaa caataataaa ttttactgtc gttgacaaga aacgagtaac tcgtccctct180tctgcagact gcttacggtt tcgtccgtgt tgcagtcgat catcagcata cctaggtttc240gtccgggtgt gaccgaaagg taagatggag agccttgttc ttggtgtcaa cgagaaaaca300cacgtccaac tcagtttgcc tgtccttcag gttagagacg tgctagtgcg tggcttcggg360gactctgtgg aagaggccct atcggaggca cgtgaacacc tcaaaaatgg cacttgtggt420ctagtagagc tggaaaaagg cgtactgccc cagcttgaac agccctatgt gttcattaaa480cgttctgatg ccttaagcac caatcacggc cacaaggtcg ttgagctggt tgcagaaatg540gacggcattc agtacggtcg tagcggtata acactgggag tactcgtgcc acatgtgggc600gaaaccccaa ttgcataccg caatgttctt cttcgtaaga acggtaataa gggagccggt660ggtcatagct atggcatcga tctaaagtct tatgacttag gtgacgagct tggcactgat720cccattgaag attatgaaca aaactggaac actaagcatg gcagtggtgc actccgtgaa780ctcactcgtg agctcaatgg aggtgcagtc actcgctatg tcgacaacaa tttctgtggc840ccagatgggt accctcttga ttgcatcaaa gattttctcg cacgcgcggg caagtcaatg900tgcactcttt ccgaacaact tgattacatc gagtcgaaga gaggtgtcta ctgctgccgt960gaccatgagc atgaaattgc ctggttcact gagcgctctg ataagagcta cgagcaccag 1020acacccttcg aaattaagag tgccaagaaa tttgacactt tcaaagggga atgcccaaag 1080tttgtgtttc ctcttaactc aaaagtcaaa gtcattcaac cacgtgttga aaagaaaaag 1140actgagggtt tcatggggcg tatacgctct gtgtaccctg ttgcatctcc acaggagtgt 1200aacaatatgc acttgtctac cttgatgaaa tgtaatcatt gcgatgaagt ttcatggcag 1260
WWBWOR~1.TXTacgtgcgact ttctgaaagc cacttgtgaa cattgtggca ctgaaaattt agttattgaa1320ggacctacta catgtgggta cctacctact aatgcnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn1380nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnntgagcat agtgttgcag attatcacaa ccactcaaac1440attgaaactc gactccgcaa gggaggtagg actagatgtt ttggaggctg tgtgtttgcc1500tatgttggct gctataataa gcgtgcctac tgggttcctc gtgctagtgc tgatattggc1560tcaggccata ctggcattac tggtgacaat gtggagacct tgaatgagga tctccttgag1620atactgagtc gtgaacgtgt taacattaac attgttggcg attttcattt gaatgaagag1680gttgccatca ttttggcatc tttctctgct tctacaagtg cctttattga cactataaag1740agtcttgatt acaagtcttt caaaaccatt gttgagtcct gcggtaacta taaagttacc1800aagggaaagc ccgtaaaagg tgcttggaac attggacaac agagatcagt tttaacacca1860ctgtgtggtt ttccctcaca ggctgctggt gttatcagat caatttttgc gcgcacactt1920gatgcagcaa accactcaat tcctgatttg caaagagcag ctgtcaccat acttgatggt1980atttctgaac agtcattacg tcttgtcgac gccatggttt atacttcaga cctgctcacc2040aacagtgtca ttattatggc atatgtaact ggtggtcttg tacaacagac ttctcagtgg2100ttgtctaatc ttttgggcac tactgttgaa aaactcaggc ctatctttga atggattgag2160gcgaaactta gtgcaggagt tgaatttctc aaggatgctt gggagattct caaatttctc2220attacaggtg tttttgacat cgtcaagggt caaatacagg ttgcttcaga taacatcaag2280gattgtgtaa aatgcttcat tgatgttgtt aacaaggcac tcgaaatgtg cattgatcaa2340gtcactatcg ctggcgcaaa gttgcgatca ctcaacttag gtgaagtctt catcgctcaa2400agcaagggac tttaccgtca gtgtatacgt ggcaaggagc agctgcaact actcatgcct2460cttaaggcac caaaagaagt aacctttctt gaaggtgatt cacatgacac agtacttacc2520tctgaggagg ttgttctcaa gaacggtgaa ctcgaagcac tcgagacgcc cgttgatagc2580ttcacaaatg gagctatcgt tggcacacca gtctgtgtaa atggcctcat gctcttagag2640attaaggaca aagaacaata ctgcgcattg tctcctggtt tactggctac aaacaatgtc2700tttcgcttaa aagggggtgc accaattaaa ggtgtaacct ttggagaaga tactgtttgg2760gaagttcaag gttacaagaa tgtgagaatc acatttgagc ttgatgaacg tgttgacaaa2820gtgcttaatg aaaagtgctc tgtctacact gttgaatccg gtaccgaagt tactgagttt2880gcatgtgttg tagcagaggc tgttgtgaag actttacaac cagtttctga tctccttacc2940aacatgggta ttgatcttga tgagtggagt gtagctacat tctacttatt tgatgatgct3000ggtgaagaaa acttttcatc acgtatgtat tgttcctttt accctccaga tgaggaagaa3060gaggacgatg cagagtgtga ggaagaagaa attgatgaaa cctgtgaaca tgagtacggt3120acagaggatg attatcaagg tctccctctg gaatttggtg cctcagctga aacagttcga3180
WWBWOR~1.TXTgttgaggaag aagaagagga agactggctg gatgatacta ctgagcaatc agagattgag3240ccagaaccag aacctacacc tgaagaacca gttaatcagt ttactggtta tttaaaactt3300actgacaatg ttgccattaa atgtgttgac atcgttaagg aggcacaaag tgctaatcct3360atggtgattg taaatgctgc taacatacac ctgaaacatg gtggtggtgt agcaggtgca3420ctcaacaagg caaccaatgg tgccatgcaa aaggagagtg atgattacat taagctaaat3480ggccctctta cagtaggagg gtcttgtttg ctttctggac ataatcttgc taagaagtgt3540ctgcatgttg ttggacctaa cctaaatgca ggtnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn3600nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn3660nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn3720nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn3780nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnct3840gaggagaaat ctgtcgtaca gaagcctgtc gatgtgaagc caaaaattaa ggcctgcatt3900gatgaggtta ccacaacact ggaagaaact aagtttctta ccaataagtt actcttgttt3960gctgatatca atggtaagct ttaccatgat tctcagaaca tgcttagagg tgaagatatg4020tctttccttg agaaggatgc accttacatg gtaggtgatg ttatcactag tggtgatatc4080acttgtgttg taataccctc caaaaaggct ggtggcacta ctgagatgct ctcaagagct4140ttgaagaaag tgccagttga tgagtatata accacgtacc ctggacaagg atgtgctggt4200tatacacttg aggaagctaa gactgctctt aagaaatgca aatctgcatt ttatgtacta4260ccttcagaag cacctaatgc taaggaagag attctaggaa ctgtatcctg gaatttgaga4320gaaatgcttg ctcatgctga agagacaaga aaattaatgc ctatatgcat ggatgttaga4380gccataatgg caaccatcca acgtaagtat aaaggaatta aaattcaaga gggcatcgtt4440gactatggtg tccgattctt cttttatact agtaaagagc ctgtagcttc tattattacg4500aagctgaact ctctaaatga gccgcttgtc acaatgccaa ttggttatgt gacacatggt4560tttaatcttg aagaggctgc gcgctgtatg cgttctctta aagctcctgc cgtagtgtca4620gtatcatcac cagatgctgt tactacatat aatggatacc tcacttcgtc atcaaagaca4680tctgaggagc actttgtaga aacagtttct ttggctggct cttacagaga ttggtcctat4740tcaggacagc gtacagagtt aggtgttgaa tttcttaagc gtggtgacaa aattgtgtac4800cacactctgg agagccccgt cgagtttcat cttgacggtg aggttctttc acttgacaaa4860ctaaagagtc tcttatccct gcgggaggtt aagactataa aagtgttcac aactgtggac4920aacactaatc tccacacaca gcttgtggat atgtctatga catatggaca gcagtttggt4980ccaacatact tggatggtgc tgatgttaca aaaattaaac ctcatgtaaa tcatgagggt5040aagactttct ttgtactacc tagtgatgac acactacgta gtgaagcttt cgagtactac5100
WWBWOR~1.TXTcatactcttg atgagagttt tcttggtagg tacatgtctg ctttaaacca cacaaagaaa5160tggaaatttc ctcaagttgg tggtttaact tcaattaaat gggctgataa caattgttat5220ttgtctagtg ttttattagc acttcaacag cttgaagtca aattcaatgc accagcactt5280caagaggctt attatagagc ccgtgctggt gatgctgcta acttttgtgc actcatactc5340gcttacagta ataaaactgt tggcgagctt ggtgatgtca gagaaactat gacccatctt5400ctacagcatg ctaatttgga atctgcaaag cgagttctta atgtggtgtg taaacattgt5460ggtcagaaaa ctactacctt aacgggtgta gaagctgtga tgtatatggg tactctatct5520tatgataatc ttaagacagg tgtttccatt ccatgtgtgt gtggtcgtga tgctacacaa5580tatctagtac aacaagagtc ttcttttgtt atgatgtctg caccacctgc tgagtataaa5640ttacagcaag gtacattctt atgtgcgaat gagtacactg gtaactatca gtgtggtcat5700tacactcata taactgctaa ggagaccctc tatcgtattg acggagctca ccttacaaag5760atgtcagagt acaaaggacc agtgactgat gttttctaca aggaaacatc ttacactaca5820accatcaagc ctgtgtcgta taaactcgat ggagttactt acacagagat tgaaccaaaa5880ttggatgggt attataaaaa ggataatgct tactatacag agcagcctat agaccttgta5940ccaactcaac cattaccaaa tgcgagtttt gataatttca aactcacatg ttctaacaca6000aaatttgctg atgatttaaa tcaaatgaca ggcttcacaa agccagcttc acgagagcta6060tctgtcacat tcttcccaga cttgaatggc gatgtagtgg ctattgacta tagacactat6120tcagcgagtt tcaagaaagg tgctaaatta ctgcataagc caattgtttg gcacattaac6180caggctacaa ccaagacaac gttcaaacca aacacttggt gtttacgttg tctttggagt6240acaaagccag tagatacttc aaattcattt gaagttctgg cagtagaaga cacacaagga6300atggacaatc ttgcttgtga aagtcaacaa cccacctctg aagaagtagt ggaaaatcct6360accatacaga aggaagtcat agagtgtgac gtgaaaacta ccgaagttgt aggcaatgtc6420atacttaaac catcagatga aggtgttaaa gtaacacaag agttaggtca tgaggatctt6480atggctgctt atgtggaaaa cacaagcatt accattaaga aacctaatga gctttcacta6540gccttaggtt taaaaacaat tgccactcat ggtattgctg caattaatag tgttccttgg6600agtaaaattt tggcttatgt caaaccattc ttaggacaag cagcaattac aacatcaaat6660tgcgctaaga gattagcaca acgtgtgttt aacaattata tgccttatgt gtttacatta6720ttgttccaat tgtgtacttt tactaaaagt accaattcta gaattagagc ttcactacct6780acaactattg ctaaaaatag tgttaagagt gttgctaaat tatgtttgga tgccggcatt6840aattatgtga agtcacccaa attttctaaa ttgttcacaa tcgctatgtg gctattgttg6900ttaagtattt gcttaggttc tctaatctgt gtaactgctg cttttggtgt actcttatct6960aattttggtg ctccttctta ttgtaatggc gttagagaat tgtatcttaa ttcgtctaac7020
WWBWOR~1.TXTgttactacta tggatttctg tgaaggttct tttccttgca gcatttgttt aagtggatta7080gactcccttg attcttatcc agctcttgaa accattcagg tgacgatttc atcgtacaag7140ctagacttga caattttagg tctggccgct gagtgggttt tggcatatat gttgttcaca7200aaattctttt atttattagg tctttcagct ataatgcagg tgttctttgg ctattttgct7260agtcatttca tcagcaattc ttggctcatg tggtttatca ttagtattgt acaaatggca7320cccgtttctg caatggttag gatgtacatc ttctttgctt ctttctacta catatggaag7380agctatgttc atatcatgga tggttgcacc tcttcgactt gcatgatgtg ctataagcgc7440aatcgtgcca cacgcgttga gtgtacaact attgttaatg gcatgaagag atctttctat7500gtctatgcaa atggaggccg tggcttctgc aagactcaca attggaattg tctcaattgt7560gacacatttt gcactggtag tacattcatt agtgatgaag ttgctcgtga tttgtcactc7620cagtttaaaa gaccaatcaa ccctactgac cagtcatcgt atattgttga tagtgttgct7680gtgaaaaatg gcgcgcttca cctctacttt gacaaggctg gtcaaaagac ctatgagaga7740catccgctct cccattttgt caatttagac aatttgagag ctaacaacac taaaggttca7800ctgcctatta atgtcatagt ttttgatggc aagtccaaat gcgacgagtc tgcttctaag7860tctgcttctg tgtactacag tcagctgatg tgccaaccta ttctgttgct tgaccaagct7920cttgtatcag acgttggaga tagtactgaa gtttccgtta agatgtttga tgcttatgtc7980gacacctttt cagcaacttt tagtgttcct atggaaaaac ttaaggcact tgttgctaca8040gctcacagcg agttagcaaa gggtgtagct ttagatggtg tcctttctac attcgtgtca8100gctgcccgac aaggtgttgt tgataccgat gttgacacaa aggatgttat tgaatgtctc8160aaactttcac atcactctga cttagaagtg acaggtgaca gttgtaacaa tttcatgctc8220acctataata aggttgaaaa catgacgccc agagatcttg gcgcatgtat tgactgtaat8280gcaaggcata tcaatgccca agtagcaaaa agtcacaatg tttcactcat ctggaatgta8340aaagactaca tgtctttatc tgaacagctg cgtaaacaaa ttcgtagtgc tgccaagaag8400aacaacatac cttttagact aacttgtgct acaactagac aggttgtcaa tgtcataact8460actaaaatct cactcaaggg tggtaagatt gttagtactt gttttaaact tatgcttaag8520gccacattat tgtgcgttct tgctgcattg gtttgttata tcgttatgcc agtacataca8580ttgtcaatcc atgatggtta cacaaatgaa atcattggtt acaaagccat tcaggatggt8640gtcactcgtg acatcatttc tactgatgat tgttttgcaa ataaacatgc tggttttgac8700gcatggttta gccagcgtgg tggttcatac aaaaatgaca aaagctgccc tgtagtagct8760gctatcatta caagagagat tggtttcata gtgcctggct taccgggtac tgtgctgaga8820gcaatcaatg gtgacttctt gcattttcta cctcgtgttt ttagtgctgt tggcaacatt8880tgctacacac cttccaaact cattgagtat agtgattttg ctacctctgc ttgcgttctt8940
WWBWOR~1.TXTgctgctgagt gtacaatttt taaggatgct atgggcaaac ctgtgccata ttgttatgac 9000actaatttgc tagagggttc tatttcttat agtgagcttc gtccagacac tcgttatgtg 9060cttatggatg gttccatcat acagtttcct aacatttacc tggagggttc tgttagagta 9120gtaacaactt ttgatgctga gtactgtaga catggtacat gcgaaaggtc agaagtaggt 9180atttgcctat ctaccagtgg tagatgggtt cttaataatg agcattacag agctctatca 9240ggagttttct gtggtgttga tgcgatgaat ctcatagcta acatctttac tcctcttgtg 9300caacctgtgg gtgctttaga tgtgtctgct tcagtagtgg ctggtggtat tattgccata 9360ttggtgactt gtgctgccta ctactttatg aaattcagac gtgtttttgg tgagtacaac 9420catgttgttg ctgctaatgc acttttgttt ttgatgtctt tcactatact ctgtctggta 9480ccagcttaca gctttctgcc gggagtctac tcagtctttt acttgtactt gacattctat 9540ttcaccaatg atgtttcatt cttggctcac cttcaatggt ttgccatgtt ttctcctatt 9600gtgccttttt ggataacagc aatctatgta ttctgtattt ctctgaagca ctgccattgg 9660ttctttaaca actatcttag gaaaagagtc atgtttaatg gagttacatt tagtaccttc 9720gaggaggctg ctttgtgtac ctttttgctc aacaaggaaa tgtacctaaa attgcgtagc 9780gagacactgt tgccacttac acagtataac aggtatcttg ctctatataa caagtacaag 9840tatttcagtg gagccttaga tactaccagc tatcgtgaag cagcttgctg ccacttagca 9900aaggctctaa atgactttag caactcaggt gctgatgttc tctaccaacc accacagaca 9960tcaatcactt ctgctgttct gcagagtggt tttaggaaaa tggcattccc gtcaggcaaa10020gttgaagggt gcatggtaca agtaacctgt ggaactacaa ctcttaatgg attgtggttg10080gatgacacag tatactgtcc aagacatgtc atttgcacag cagaagacat gcttaatcct10140aactatgaag atctgctcat tcgcaaatcc aaccatagct ttcttgttca ggctggcaat10200gttcaacttc gtgttattgg ccattctatg caaaattgtc tgcttaggct taaagttgat10260acttctaacc ctaagacacc caagtataaa tttgtccgta tccaacctgg tcaaacattt10320tcagttctag catgctacaa tggttcacca tctggtgttt atcagtgtgc catgagacct10380aatcatacca ttaaaggttc tttccttaat ggatcatgtg gtagtgttgg ttttaacatt10440gattatgatt gcgtgtcttt ctgctatatg catcatatgg agcttccaac aggagtacac10500gctggtactg acttagaagg taaattctat ggtccatttg ttgacagaca aactgcacag10560gctgcaggta cagacacaac cataacatta aatgttttgg catggctgta tgctgctgtt10620atcaatggtg ataggtggtt tcttaataga ttcaccacta ctttgaatga ctttaacctt10680gtggcaatga agtacaacta tgaacctttg acacaagatc atgttgacat attgggacct10740ctttctgctc aaacaggaat tgccgtctta gatatgtgtg ctgctttgaa agagctgctg10800cagaatggta tgaatggtcg tactatcctt ggtagcacta ttttagaaga tgagtttaca10860
WWBWOR~1.TXTccatttgatg ttgttagaca atgctctggt gttaccttcc aaggtaagtt caagaaaatt10920gttaagggca ctcatcattg gatgctttta actttcttga catcactatt gattcttgtt10980caaagtacac agtggtcact gtttttcttt gtttacgaga atgctttctt gccatttact11040cttggtatta tggcaattgc tgcatgtgct atgctgcttg ttaagcataa gcacgcattc11100ttgtgcttgt ttctgttacc ttctcttgca acagttgctt actttaatat ggtctacatg11160cctgctagct gggtgatgcg tatcatgaca tggcttgaat tggctgacac tagcttgtct11220ggttataggc ttaaggattg tgttatgtat gcttcagctt tagttttgct tattctcatg11280acagctcgca ctgtttatga tgatgctgct agacgtgttt ggacactgat gaatgtcatt11340acacttgttt acaaagtcta ctatggtaat gctttagatc aagctatttc catgtgggcc11400ttagttattt ctgtaacctc taactattct ggtgtcgtta cgactatcat gtttttagct11460agagctatag tgtttgtgtg tgttgagtat tacccattgt tatttattac tggcaacacc11520ttacagtgta tcatgcttgt ttattgtttc ttaggctatt gttgctgctg ctactttggc11580cttttctgtt tactcaaccg ttacttcagg cttactcttg gtgtttatga ctacttggtc11640tctacacaag aatttaggta tatgaactcc caggggcttt tgcctcctaa gagtagtatt11700gatgctttca agcttaacat taagttgttg ggtattggag gtaaaccatg tatcaaggtt11760gctactgtac agtctaaaat gtctgacgta aagtgcacat ctgtggtact gctctcggtt11820cttcaacaac ttagagtaga gtcatcttct aaattgtggg cacaatgtgt acaactccac11880aatgatattc ttcttgcaaa agacacaact gaagctttcg agaagatggt ttctcttttg11940tctgttttgc tatccatgca gggtgctgta gacattaata ggttgtgcga ggaaatgctc12000gataaccgtg ctactcttca ggctattgct tcagaattta gttctttacc atcatatgcc12060gcttatgcca ctgcccagga ggcctatgag caggctgtag ctaatggtga ttctgaagtc12120gttctcaaaa agttaaagaa atctttgaat gtggctaaat ctgagtttga ccgtgatgct12180gccatgcaac gcaagttgga aaagatggca gatcaggcta tgacccaaat gtacaaacag12240gcaagatctg aggacaagag ggcaaaagta actagtgcta tgcaaacaat gctcttcact12300atgcttagga agcttgataa tgatgcactt aacaacatta tcaacaatgc gcgtgatggt12360tgtgttccac tcaacatcat accattgact acagcagcca aactcatggt tgttgtccct12420gattatggta cctacaagaa cacttgtgat ggtaacacct ttacatatgc atctgcactc12480tgggaaatcc agcaagttgt tgatgcggat agcaagattg ttcaacttag tgaaattaac12540atggacaatt caccaaattt ggcttggcct cttattgtta cagctctaag agccaactca12600gctgttaaac tacagaataa tgaactgagt ccagtagcac tacgacagat gtcctgtgcg12660gctggtacca cacaaacagc ttgtactgat gacaatgcac ttgcctacta taacaattcg12720aagggaggta ggtttgtgct ggcattacta tcagaccacc aagatctcaa atgggctaga12780
WWBWOR~1.TXTttccctaaga gtgatggtac aggtacaatt tacacagaac tggaaccacc ttgtaggttt12840gttacagaca caccaaaagg gcctaaagtg aaatacttgt acttcatcaa aggcttaaac12900aacctaaata gaggtatggt gctgggcagt ttagctgcta cagtacgtct tcaggctgga12960aatgctacag aagtacctgc caattcaact gtgctttcct tctgtgcttt tgcagtagac13020cctgctaaag catataagga ttacctagca agtggaggac aaccaatcac caactgtgtg13080aagatgttgt gtacacacac tggtacagga caggcaatta ctgtaacacc agaagctaac13140atggaccaag agtcctttgg tggtgcttca tgttgtctgt attgtagatg ccacattgac13200catccaaatc ctaaaggatt ctgtgacttg aaaggtaagt acgtccaaat acctaccact13260tgtgctaatg acccagtggg ttttacactt agaaacacag tctgtaccgt ctgcggaatg13320tggaaaggtt atggctgtag ttgtgaccaa ctccgcgaac ccttgatgca gtctgcggat13380gcatcaacgt ttttaaacgg gtttgcggtg taagtgcagc ccgtcttaca ccgtgcggca13440caggcactag tactgatgtc gtctacaggg cttttgatat ttacaacgaa aaagttgctg13500gttttgcaaa gttcctaaaa actaattgct gtcgcttcca ggagaaggat gaggaaggca13560atttattaga ctcttacttt gtagttaaga ggcatactat gtctaactac caacatgaag13620agactattta taacttggtt aaagattgtc cagcggttgc tgtccatgac tttttcaagt13680ttagagtaga tggtgacatg gtaccacata tatcacgtca gcgtctaact aaatacacaa13740tggctgattt agtctatgct ctacgtcatt ttgatgaggg taattgtgat acattaaaag13800aaatactcgt cacatacaat tgctgtgatg atgattattt caataagaag gattggtatg13860acttcgtaga gaatcctgac atcttacgcg tatatgctaa cttaggtgag cgtgtacgcc13920aatcattatt aaagactgta caattctgcg atgctatgcg tgatgcaggc attgtaggcg13980tactgacatt agataatcag gatcttaatg ggaactggta cgatttcggt gatttcgtac14040aagtagcacc aggctgcgga gttcctattg tggattcata ttactcattg ctgatgccca14100tcctcacttt gactagggca ttggctgctg agtcccatat ggatgctgat ctcgcaaaac14160cacttattaa gtgggatttg ctgaaatatg attttacgga agagagactt tgtctcttcg14220accgttattt taaatattgg gaccagacat accatcccaa ttgtattaac tgtttggatg14280ataggtgtat ccttcattgt gcaaacttta atgtgttatt ttctactgtg tttccaccta14340caagttttgg accactagta agaaaaatat ttgtagatgg tgttcctttt gttgtttcaa14400ctggatacca ttttcgtgag ttaggagtcg tacataatca ggatgtaaac ttacatagct14460cgcgtctcag tttcaaggaa cttttagtgt atgctgctga tccagctatg catgcagctt14520ctggcaattt attgctagat aaacgcacta catgcttttc agtagctgca ctaacaaaca14580atgttgcttt tcaaactgtc aaacccggta attttaataa agacttttat gactttgctg14640tgtctaaagg tttctttaag gaaggaagtt ctgttgaact aaaacacttc ttctttgctc14700
WWBWOR~1.TXTaggatggcaa cgctgctatc agtgattatg actattatcg ttataatctg ccaacaatgt14760gtgatatcag acaactccta ttcgtagttg aagttgttga taaatacttt gattgttacg14820atggtggctg tattaatgcc aaccaagtaa tcgttaacaa tctggataaa tcagctggtt14880tcccatttaa taaatggggt aaggctagac tttattatga ctcaatgagt tatgaggatc14940aagatgcact tttcgcgtat actaagcgta atgtcatccc tactataact caaatgaatc15000ttaagtatgc cattagtgca aagaatagag ctcgcaccgt agctggtgtc tctatctgta15060gtactatgac aaatagacag tttcatcaga aattattgaa gtcaatagcc gccactagag15120gagctactgt ggtaattgga acaagcaagt tttacggtgg ctggcataat atgttaaaaa15180ctgtttacag tgatgtagaa actccacacc ttatgggttg ggattatcca aaatgtgaca15240gagccatgcc taacatgctt aggataatgg cctctcttgt tcttgctcgc aaacataaca15300cttgctgtaa cttatcacac cgtttctaca ggttagctaa cgagtgtgcg caagtattaa15360gtgagatggt catgtgtggc ggctcactat atgttaaacc aggtggaaca tcatccggtg15420atgctacaac tgcttatgct aatagtgtct ttaacatttg tcaagctgtt acagccaatg15480taaatgcact tctttcaact gatggtaata agatagctga caagtatgtc cgcaatctac15540aacacaggct ctatgagtgt ctctatagaa atagggatgt tgatcatgaa ttcgtggatg15600agttttacgc ttacctgcgt aaacatttct ccatgatgat tctttctgat gatgccgttg15660tgtgctataa cagtaactat gcggctcaag gtttagtagc tagcattaag aactttaagg15720cagttcttta ttatcaaaat aatgtgttca tgtctgaggc aaaatgttgg actgagactg15780accttactaa aggacctcac gaattttgct cacagcatac aatgctagtt aaacaaggag15840atgattacgt gtacctgcct tacccagatc catcaagaat attaggcgca ggctgttttg15900tcgatgatat tgtcaaaaca gatggtacac ttatgattga aaggttcgtg tcactggcta15960ttgatgctta cccacttaca aaacatccta atcaggagta tgctgatgtc tttcacttgt16020atttacaata cattagaaag ttacatgatg agcttactgg ccacatgttg gacatgtatt16080ccgtaatgct aactaatgat aacacctcac ggtactggga acctgagttt tatgaggcta16140tgtacacacc acatacagtc ttgcaggctg taggtgcttg tgtattgtgc aattcacaga16200cttcacttcg ttgcggtgcc tgtattagga gaccattcct atgttgcaag tgctgctatg16260accatgtcat ttcaacatca cacaaattag tgttgtctgt taatccctat gtttgcaatg16320ccccaggttg tgatgtcact gatgtgacac aactgtatct aggaggtatg agctattatt16380gcaagtcaca taagcctccc attagttttc cattatgtgc taatggtcag gtttttggtt16440tatacaaaaa cacatgtgta ggcagtgaca atgtcactga cttcaatgcg atagcaacat16500gtgattggac taatgctggc gattacatac ttgccaacac ttgtactgag agactcaagc16560ttttcgcagc agaaacgctc aaagccactg aggaaacatt taagctgtca tatggtattg16620
WWBWOR~1.TXTccactgtacg cgaagtactc tctgacagag aattgcatct ttcatgggag gttggaaaac16680ctagaccacc attgaacaga aactatgtct ttactggtta ccgtgtaact aaaaatagta16740aagtacagat tggagagtac acctttgaaa aaggtgacta tggtgatgct gttgtgtaca16800gaggtactac gacatacaag ttgaatgttg gtgattactt tgtgttgaca tctcacactg16860taatgccact tagtgcacct actctagtgc cacaagagca ctatgtgaga attactggct16920tgtacccaac actcaacatc tcagatgagt tttctagcaa tgttgcaaat tatcaaaagg16980tcggcatgca aaagtactct acactccaag gaccacctgg tactggtaag agtcattttg17040ccatcggact tgctctctat tacccatctg ctcgcatagt gtatacggca tgctctcatg17100cagctgttga tgccctatgt gaaaaggcat taaaatattt gcccatagat aaatgtagta17160gaatcatacc tgcgcgtgcg cgcgtagagt gttttgataa attcaaagtg aattcaacac17220tagaacagta tgttttctgc actgtaaatg cattgccaga aacaactgct gacattgtag17280tctttgatga aatctctatg gctactaatt atgacttgag tgttgtcaat gctagacttc17340gtgcaaaaca ctacgtctat attggcgatc ctgctcaatt accagccccc cgcacattgc17400tgactaaagg cacactagaa tcagaatatt ttaattcagt gtgcagactt atgaaaacaa17460taggtccaga catgttcctt ggaacttgtc gccgttgtcc tgctgaaatt gttgacactg17520tgagtgcttt agtttatgac aataagctaa aagcacacaa ggagaagtca gctcaatgct17580tcaaaatgtt ctacaaaggt gttattacac atgatgtttc atctgcaatc aacagacctc17640aaataggcgt tgtaagagaa tttcttacac gcaatcctgc ttggagaaaa gctgttttta17700tctcacctta taattcacag aacgctgtag cttcaaaaat cttaggattg cctacgcaga17760ctgttgattc atcacagggt tctgaatatg actatgtcat attcacacaa actactgaaa17820cagcacactc ttgtaatgtc aaccgcttca atgtggctat cacaagggca aaaattggca17880ttttgtgcat aatgtctgat agagatcttt atgacaaact gcaatttaca agtctagaaa17940taccacgtcg caatgtggct acattacaag cagaaaatgt aactggactt tttaaggact18000gtagtaagat cattactggt cttcatccta cacaggcacc tacacacctc agcgttgata18060taaagttcaa gactgaagga ttatgtgttg acataccagg cataccaaag gacatgacct18120accgtagact catctctatg atgggtttca aaatgaatta ccaagtcaat ggttacccta18180atatgtttat cacccgcgaa gaagctattc gtcacgttcg tgcgtggatt ggctttgatg18240tagagggctg tcatgcaact agagatgctg tgggtactaa cctacctctc cagctaggat18300tttctacagg tgttaactta gtagctgtac cgactggtta tgttgacact gaaaataaca18360cagaattcac cagagttaat gcaaaacctc caccaggtga ccagtttaaa catcttatac18420cactcatgta taaaggcttg ccctggaatg tagtgcgtat taagatagta caaatgctca18480gtgatacact gaaaggattg tcagacagag tcgtgttcgt cctttgggcg catggctttg18540
WWBWOR~1.TXTagcttacatc aatgaagtac tttgtcaaga ttggacctga aagaacgtgt tgtctgtgtg18600acaaacgtgc aacttgcttt tctacttcat cagatactta tgcctgctgg aatcattctg18660tgggttttga ctatgtctat aacccattta tgattgatgt tcagcagtgg ggctttacgg18720gtaaccttca gagtaaccat gaccaacatt gccaggtaca tggaaatgca catgtggcta18780gttgtgatgc tatcatgact agatgtttag cagtccatga gtgctttgtt aagcgcgttg18840attggtctgt tgaataccct attataggag atgaactgag ggttaattct gcttgcagaa18900aagtacaaca catggttgtg aagtctgcat tgcttgctga taagtttcca gttcttcatg18960acattggaaa tccaaaggct atcaagtgtg tgcctcaggc tgaagtagaa tggaagttct19020acgatgctca gccatgtagt gacaaagctt acaaaataga ggaactcttc tattcttatg19080ctacacatca cgataaattc actgatggtg tttgtttgtt ttggaattgt aacgttgatc19140gttacccagc caatgcaatt gtgtgtaggt ttgacacaag agtcttgtca aacttgaact19200taccaggctg tgatggtggt agtttgtatg tgaataagca tgcattccac actccagctt19260tcgataaaag tgcatttact aatttaaagc aattgccttt cttttactat tctgatagtc19320cttgtgagtc tcatggcaaa caagtagtgt cggatattga ttatgttcca ctcaaatctg19380ctacgtgtat tacacgatgc aatttaggtg gtgctgtttg cagacaccat gcaaatgagt19440accgacagta cttggatgca tataatatga tgatttctgc tggatttagc ctatggattt19500acaaacaatt tgatacttat aacctgtgga atacatttac caggttacag agtttagaaa19560atgtggctta taatgttgtt aataaaggac actttgatgg acacgccggc gaagcacctg19620tttccatcat taataatgct gtttacacaa aggtagatgg tattgatgtg gagatctttg19680aaaataagac aacacttcct gttaatgttg catttgagct ttgggctaag cgtaacatta19740aaccagtgcc agagattaag atactcaata atttgggtgt tgatatcgct gctaatactg19800taatctggga ctacaaaaga gaagccccag cacatgtatc tacaataggt gtctgcacaa19860tgactgacat tgccaagaaa cctactgaga gtgcttgttc ttcacttact gtcttgtttg19920atggtagagt ggaaggacag gtagaccttt ttagaaacgc ccgtaatggt gttttaataa19980cagaaggttc agtcaaaggt ctaacacctt caaagggacc agcacaagct agcgtcaatg20040gagtcacatt aattggagaa tcagtaaaaa cacagtttaa ctactttaag aaagtagacg20100gcattattca acagttgcct gaaacctact ttactcagag cagagactta gaggatttta20160agcccagatc acaaatggaa actgactttc tcgagctcgc tatggatgaa ttcatacagc20220gatataagct cgagggctat gccttcgaac acatcgttta tggagatttc agtcatggac20280aacttggcgg tcttcattta atgataggct tagccaagcg ctcacaagat tcaccactta20340aattagagga ttttatccct atggacagca cagtgaaaaa ttacttcata acagatgcgc20400aaacaggttc atcaaaatgt gtgtgttctg tgattgatct tttacttgat gactttgtcg20460
WWBWOR~1.TXTagataataaa gtcacaagat ttgtcagtga tttcaaaagt ggtcaaggtt acaattgact20520atgctgaaat ttcattcatg ctttggtgta aggatggaca tgttgaaacc ttctacccaa20580aactacaagc aagtcaagcg tggcaaccag gtgttgcgat gcctaacttg tacaagatgc20640aaagaatgct tcttgaaaag tgtgaccttc agaattatgg tgaaaatgct gttataccaa20700aaggaataat gatgaatgtc gcaaagtata ctcaactgtg tcaatactta aatacactta20760ctttagctgt accctacaac atgagagtta ttcactttgg tgctggctct gataaaggag20820ttgcaccagg tacagctgtg ctcagacaat ggttgccaac tggcacacta cttgtcgatt20880cagatcttaa tgacttcgtc tccgacgcag attctacttt aattggagac tgtgcaacag20940tacatacggc taataaatgg gaccttatta ttagcgatat gtatgaccct aggaccaaac21000atgtgacaaa agagaatgac tctaaagaag ggtttttcac ttatctgtgt ggatttataa21060agcaaaaact agccctgggt ggttctatag ctgtaaagat aacagagcat tcttggaatg21120ctgaccttta caagcttatg ggccatttct catggtggac agcttttgtt acaaatgtaa21180atgcatcatc atcggaagca tttttaattg gggctaacta tcttggcaag ccgaaggaac21240aaattgatgg ctataccatg catgctaact acattttctg gaggaacaca aatcctatcc21300agttgtcttc ctattcactc tttgacatga gcaaatttcc tcttaaatta agaggaactg21360ctgtaatgtc tcttaaggag aatcaaatca atgatatgat ttattctctt ctggaaaaag21420gtaggcttat cattagagaa aacaacagag ttgtggtttc aagtgatatt cttgttaaca21480actaaacgaa catgtttatt ttcttattat ttcttactct cactagtggt agtgaccttg21540accggtgcac cacttttgat gatgttcaag ctcctaatta cactcaacat acttcatcta21600tgaggggggt ttactatcct gatgaaattt ttagattaga cactctttat ttaactcagg21660atttatttct tccattttat tctaatgtta cagggtttca tactattaat catacgtttg21720acaaccctgt catacctttt aaggatggta tttattttgc tgccacagag aaatcaaatg21780ttgtccgtgg ttgggttttt ggttctacca tgaacaacaa gtcacagtcg gtgattatta21840ttaacaattc tactaatgtt gttatacgag catgtaactt tgaattgtgt gacaaccctt21900tctttgctgt ttctaaaccc atgggtacac agacacatac tatgatattc gataatgcat21960ttaattgcac tttcgagtac atatctgatg ccttttcgct tgatgtttca gaaaagtcag22020gtaattttaa acacttacga gagtttgtgt ttaaaaataa agatgggttt ctctatgttt22080ataagggcta tcaacctata gatgtagttc gtgatctacc ttctggtttt aacactttga22140aacctatttt taagttgcct cttggtatta acattacaaa ttttagagcc attcttacag22200ccttttcacc tgctcaagac acttggggca cgtcagctgc agcctatttt gttggctatt22260taaagccaac tacatttatg ctcaagtatg atgaaaatgg tacaatcaca gatgctgttg22320attgttctca aaatccactt gctgaactca aatgctctgt taagagcttt gagattgaca22380
WWBWOR~1.TXTaaggaattta ccagacctct aatttcaggg ttgttccctc aggagatgtt gtgagattcc22440ctaatattac aaacttgtgt ccttttggag aggtttttaa tgctactaaa ttcccttctg22500tctatgcatg ggagagaaaa aaaatttcta attgtgttgc tgattactct gtgctctaca22560actcaacatt tttttcaacc tttaagtgct atggcgtttc tgccactaag ttgaatgatc22620tttgcttctc caatgtctat gcagattctt ttgtagtcaa gggagatgat gtaagacaaa22680tagcgccagg acaaactggt gttattgctg attataatta taaattgcca gatgatttca22740tgggttgtgt ccttgcttgg aatactagga acattgatgc tacttcaact ggtaattata22800attataaata taggtatctt agacatggca agcttaggcc ctttgagaga gacatatcta22860atgtgccttt ctcccctgat ggcaaacctt gcaccccacc tgctcttaat tgttattggc22920cattaaatga ttatggtttt tacaccacta ctggcattgg ctaccaacct tacagagttg22980tagtactttc ttttgaactt ttaaatgcac cggccacggt ttgtggacca aaattatcca23040ctgaccttat taagaaccag tgtgtcaatt ttaattttaa tggactcact ggtactggtg23100tgttaactcc ttcttcaaag agatttcaac catttcaaca atttggccgt gatgtttctg23160atttcactga ttccgttcga gatcctaaaa catctgaaat attagacatt tcaccttgct23220cttttggggg tgtaagtgta attacacctg gaacaaatgc ttcatctgaa gttgctgttc23280tatatcaaga tgttaactgc actgatgttt ctacagcaat tcatgcagat caactcacac23340cagcttggcg catatattct actggaaaca atgtattcca gactcaagca ggctgtctta23400taggagctga gcatgtcgac acttcttatg agtgcgacat tcctattgga gctggcattt23460gtgctagtta ccatacagtt tctttattac gtagtactag ccaaaaatct attgtggctt23520atactatgtc tttaggtgct gatagttcaa ttgcttactc taataacacc attgctatac23580ctactaactt ttcaattagc attactacag aagtaatgcc tgtttctatg gctaaaacct23640ccgtagattg taatatgtac atctgcggag attctactga atgtgctaat ttgcttctcc23700aatatggtag cttttgcaca caactaaatc gtgcactctc aggtattgct gctgaacagg23760atcgcaacac acgtgaagtg ttcgctcaag tcaaacaaat gtacaaaacc ccaactttga23820aagattttgg tggttttaat ttttcacaaa tattacctga ccctctaaag ccaactaaga23880ggtcttttat tgaggacttg ctctttaata aggtgacact cgctgatgct ggcttcatga23940agcaatatgg cgaatgccta ggtgatatta atgctagaga tctcatttgt gcgcagaagt24000tcaatggact tacagtgttg ccacctctgc tcactgatga tatgattgct gcctacactg24060ctgctctagt tagtggtact gccactgctg gatggacatt tggtgctggc gctgctcttc24120aaataccttt tgctatgcaa atggcatata ggttcaatgg cattggagtt acccaaaatg24180ttctctatga gaaccaaaaa caaatcgcca accaatttaa caaggcgatt agtcaaattc24240aagaatcact tacaacaaca tcaactgcat tgggcaagct gcaagacgtt gttaaccaga24300
WWBWOR~1.TXTatgctcaagc attaaacaca cttgttaaac aacttagctc taattttggt gcaatttcaa24360gtgtgctaaa tgatatcctt tcgcgacttg ataaagtcga ggcggaggta caaattgaca24420ggttaattac aggcagactt caaagccttc aaacctatgt aacacaacaa ctaatcaggg24480ctgctgaaat cagggcttct gctaatcttg ctgctactaa aatgtctgag tgtgttcttg24540gacaatcaaa aagagttgac ttttgtggaa agggctacca ccttatgtcc ttcccacaag24600cagccccgca tggtgttgtc ttcctacatg tcacgtatgt gccatcccag gagaggaact24660tcaccacagc gccagcaatt tgtcatgaag gcaaagcata cttccctcgt gaaggtgttt24720ttgtgtttaa tggcacttct tggtttatta cacagaggaa cttcttttct ccacaaataa24780ttactacaga caatacattt gtctcaggaa attgtgatgt cgttattggc atcattaaca24840acacagttta tgatcctctg caacctgagc ttgactcatt caaagaagag ctggacaagt24900acttcaaaaa tcatacatca ccagatgttg atcttggcga catttcaggc attaacgctt24960ctgtcgtcaa cattcaaaaa gaaattgacc gcctcaatga ggtcgctaaa aatttaaatg25020aatcactcat tgaccttcaa gaattgggaa aatatgagca atatattaaa tggccttggt25080atgtttggct cggcttcatt gctggactaa ttgccatcgt catggttaca atcttgcttt25140gttgcatgac tagttgttgc agttgcctca agggtgcatg ctcttgtggt tcttgctgca25200agtttgatga ggatgactct gagccagttc tcaagggtgt caaattacat tacacataaa25260cgaacttatg gatttgttta tgagattttt tactcttgga tcaattactg cacagccagt25320aaaaattgac aatgcttctc ctgcaagtac tgttcatgct acagcaacga taccgctaca25380agcctcactc cctttcggat ggcttgttat tggcgttgca tttcttgctg tttttcagag25440cgctaccaaa ataattgcgc tcaataaaag atggcagcta gccctttata agggcttcca25500gttcatttgc aatttactgc agctatttgt taccatctat tcacatcttt tgcttgtcgc25560tgcaggtatg gaggcgcaat ttttgtacct ctatgccttg atatattttc tacaatgcat25620caacgcatgt agaattatta tgagatgttg gctttgttgg aagtgcaaat ccaagaaccc25680attactttat gatgccaact actttgtttg ctggcacaca cataactatg actactgtat25740accatataac agtgtcacag atacaattgt cgttactgaa ggtgacggca tttcaacacc25800aaaactcaaa gaagactacc aaattggtgg ttattctgag gataggcact caggtgttaa25860agactatgtc gttgtacatg gctatttcac cgaagtttac taccagcttg agtctacaca25920aattactaca gacactggta ttgaaaatgc tacattcttc atctttaaca agcttgttaa25980agacccaccg aatgtgcaaa tacacacaat cgacggctct tcaggagttg ctaatccagc26040aatggatcca atttatgatg agccgacgac gactactagc gtgcctttgt aagcacaaga26100aagtgagtac gaacttatgt actcattcgt ttcggaagaa acaggtacgt taatagttaa26160tagcgtactt ctttttcttg ctttcgtggt attcttgcta gtcacactag ccatccttac26220
WWBWOR~1.TXTtgcgcttcga ttgtgtgcgt actgctgcaa tattgttaac gtgagtttag taaaaccaac26280ggtttacgtc tactcgcgtg ttaaaaatct gaactcttct gaaggagttc ctgatcttct26340ggtctaaacg aactaactat tattattatt ctgtttggaa ctttaacatt gcttatcatg26400gcagacaacg gtactattac cgttgaggag cttaaacaac tcctggaaca atggaaccta26460gtaataggtt tcctattcct agcctggatt atgttactac aatttgccta ttctaatcgg26520aacaggtttt tgtacataat aaagcttgtt ttcctctggc tcttgtggcc agtaacactt26580gcttgttttg tgcttgctgc tgtctacaga attaattggg tgactggcgg gattgcgatt26640gcaatggctt gtattgtagg cttgatgtgg cttagctact tcgttgcttc cttcaggctg26700tttgctcgta cccgctcaat gtggtcattc aacccagaaa caaacattct tctcaatgtg26760cctctccggg ggacaattgt gaccagaccg ctcatggaaa gtgaacttgt cattggtgct26820gtgatcattc gtggtcactt gcgaatggcc ggacactccc tagggcgctg tgacattaag26880gacctgccaa aagagatcac tgtggctaca tcacgaacgc tttcttatta caaattagga26940gcgtcgcagc gtgtaggcac tgattcaggt tttgctgcat acaaccgcta ccgtattgga27000aactataaat taaatacaga ccacgccggt agcaacgaca atattgcttt gctagtacag27060taagtgacaa cagatgtttc atcttgttga cttccaggtt acaatagcag agatattgat27120tatcattatg aggactttca ggattgctat ttggaatctt gacgttataa taagttcaat27180agtgagacaa ttatttaagc ctctaactaa gaagaattat tcggagttag atgatgaaga27240acctatggag ttagattatc cataaaacga acatgaaaat tattctcttc ctgacattga27300ttgtatttac atcttgcgag ctatatcact atcaggagtg tgttagaggt acgactgtac27360tactaaaaga accttgccca tcaggaacat acgagggcaa ttcaccattt caccctcttg27420ctgacaataa atttgcacta acttgcacta gcacacactt tgcttttgct tgtgctgacg27480gtactcgaca tacctatcag ctgcgtgcaa gatcagtttc accaaaactt ttcatcagac27540aagaggaggt tcaacaagag ctctactcgc cactttttct cattgttgct gctctagtat27600ttttaatact ttgcttcacc attaagagaa agacagaatg aatgagctca ctttaattga27660cttctatttg tgctttttag cctttctgct attccttgtt ttaataatgc ttattatatt27720ttggttttca ctcgaaatcc aggatctaga agaaccttgt accaaagtct aaacgaacat27780gaaacttctc attgttttga cttgtatttc tctatgcagt tgcatacgca ctgtagtaca27840gcgctgtgca tctaataaac ctcatgtgct tgaagatcct tgtaaggtac aacactaggg27900gtaatactta tagcactgct tggctttgtg ctctaggaaa ggttttacct tttcatagat27960ggcacactat ggttcaaaca tgcacaccta atgttactat caactgtcaa gatccagctg28020gtggtgcgct tatagctagg tgttggtacc ttcatgaagg tcaccaaact gctgcattta28080gagacgtact tgttgtttta aataaacgaa caaattaaaa tgtctgataa tggaccccaa28140
WWBWOR~1.TXTtcaaaccaac gtagtgcccc ccgcattaca tttggtggac ccacagattc aactgacaat28200aaccagaatg gaggacgcaa tggggcaagg ccaaaacagc gccgacccca aggtttaccc28260aataatactg cgtcttggtt cacagctctc actcagcatg gcaaggagga acttagattc28320cctcgaggcc agggcgttcc aatcaacacc aatagtggtc cagatgacca aattggctac28380taccgaagag ctacccgacg agttcgtggt ggtgacggca aaatgaaaga gctcagcccc28440agatggtact tctattacct aggaactggc ccagaagctt cacttcccta cggcgctaac28500aaagaaggca tcgtatgggt tgcaactgag ggagccttga atacacccaa agaccacatt28560ggcacccgca atcctaataa caatgctgcc accgtgctac aacttcctca aggaacaaca28620ttgccaaaag gcttctacgc agagggaagc agaggcggca gtcaagcctc ttctcgctcc28680tcatcacgta gtcgcggtaa ttcaagaaat tcaactcctg gcagcagtag gggaaattct28740cctgctcgaa tggctagcgg aggtggtgaa actgccctcg cgctattgct gctagacaga28800ttgaaccagc ttgagagcaa agtttctggt aaaggccaac aacaacaagg ccaaactgtc28860actaagaaat ctgctgctga ggcatctaaa aagcctcgcc aaaaacgtac tgccacaaaa28920cagtacaacg tcactcaagc atttgggaga cgtggtccag aacaaaccca aggaaatttc28980ggggaccaag acctaatcag acaaggaact gattacaaac attggccgca aattgcacaa29040tttgctccaa gtgcctctgc attctttgga atgtcacgca ttggcatgga agtcacacct29100tcgggaacat ggctgactta tcatggagcc attaaattgg atgacaaaga tccacaattc29160aaagacaacg tcatactgct gaacaagcac attgacgcat acaaaacatt cccaccaaca29220gagcctaaaa aggacaaaaa gaaaaagact gatgaagctc agcctttgcc gcagagacaa29280aagaagcagc ccactgtgac tcttcttcct gcggctgaca tggatgattt ctccagacaa29340cttcaaaatt ccatgagtgg agcttctgct gattcaactc aggcataaac actcatgatg29400accacacaag gcagatgggc tatgtaaacg ttttcgcaat tccgtttacg atacatagtc29460tactcttgtg cagaatgaat tctcgtaact aaacagcaca agtaggttta gttaacttta29520atctcacata gcaatcttta atcaatgtgt aacattaggg aggacttgaa agagccacca29580cattttcatc gaggccacgc ggagtacgat cgagggtaca gtgaataatg ctagggagag29640ctgcctatat ggaagagccc taatgtgtaa aattaatttt agtagtgcta tccccatgtg29700attttaatag cttcttagga gaatcacaaa aaaaaaaaaa 29740<212>TypeDNA<211>Length29740SequenceName冠狀病毒SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence Name冠狀病毒
權(quán)利要求
1.一種免疫預(yù)防滴鼻制劑，其特征是含滅活新型冠狀病毒和藥用敷劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫預(yù)防滴鼻制劑，其特征是所述新型冠狀病毒具有序列1的結(jié)構(gòu)。
3.一種權(quán)利要求1和2的免疫預(yù)防滴鼻制劑的制備方法，包括下述步驟和方法，1)分離與鑒定新型冠狀病毒，2)病毒株滴定，3)甲醛滅活接種細(xì)胞上清液中病毒，4)滅活病毒制劑細(xì)胞傳代，證實(shí)無(wú)活病毒存在，5)純化滅活后病毒懸液，6)收集純化滅活病毒，測(cè)定病毒RNA拷貝數(shù)，確定病毒含量。7)以抗體陽(yáng)性血清間接免疫熒光抗體染色病毒感染細(xì)胞，證實(shí)滅活后病毒抗原性。8)滅活病毒干擾試驗(yàn)測(cè)定其對(duì)活病毒感染力的抑制作用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中新型冠狀病毒為GHGZ毒株。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中甲醛滅活上清中病毒的終濃度為0.025％、0.25％及2.5％。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中甲醛滅活冠狀病毒的終濃度為0.025％。
7.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中用免疫熒光法鑒定滅活新冠狀病毒滴鼻劑的抗原性及毒株與不同地區(qū)間抗血清交叉的技術(shù)。
8.滅活新型冠狀病毒在制備免疫預(yù)防滴鼻藥物制劑中的應(yīng)用
9.滅活新型冠狀病毒在制備免疫預(yù)防呼吸道傳播病毒滴鼻藥物制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬生物制品領(lǐng)域，涉及一種滅活呼吸道傳播病毒滴鼻劑及其制備方法。本發(fā)明含滅活新型冠狀病毒和藥用敷劑。本發(fā)明采用早期“非典”患者鼻咽吸取液分離的新冠狀病毒株，接種Vero傳代細(xì)胞，經(jīng)甲醛滅活病毒，滅活后盲傳三代，證實(shí)無(wú)活病毒存在，用免疫熒光染色證明病毒保留抗原性，調(diào)整濃度及pH，可供滴鼻作為預(yù)防SARS的制劑。本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)便，只需證明無(wú)害即可使用，為制備滅活新冠狀病毒疫苗奠定基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1502367SQ0311694
公開日2004年6月9日 申請(qǐng)日期2003年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月15日
發(fā)明者鐘南山, 管軼, 鄭伯鍵, 聞?dòng)衩?申請(qǐng)人:廣州呼吸疾病研究所, 香港大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 復(fù)旦大學(xué)