專(zhuān)利名稱(chēng)：波棱素化合物及其制法和其藥物組合物與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及葫蘆科植物波棱Herpetospermumpedunculosum(Sex.)Baill.提取物和波棱素，波棱提取物和波棱素的制備方法，波棱提取物和波棱素及其衍生物的藥物組合物，波棱提取物和波棱素及其衍生物及其藥物組合物作為藥物的用途，尤其是制備抗病毒，抗肝損傷，抗腫瘤的藥物中的用途。經(jīng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，波棱素具有活性高、毒性小的優(yōu)點(diǎn)。
背景技術(shù)：
慢性病毒性肝炎是嚴(yán)重危害人民健康的常見(jiàn)傳染病。據(jù)統(tǒng)計(jì)僅乙肝患者就占世界人口的5％。在我國(guó)病毒性肝炎的發(fā)病率高居世界首位，即約80％的肝炎患者集中在中國(guó)。目前我國(guó)現(xiàn)有病毒性肝炎患者達(dá)3000萬(wàn)人之多，每年有近50萬(wàn)人死于與乙肝有關(guān)的疾病。因此，慢性病毒性肝炎特別是乙型肝炎的治療一直是世界醫(yī)藥界的難題。
由于龐大的乙肝人群亟待得到治療，因此，目前我國(guó)市場(chǎng)上慢性肝炎的治療藥物品種繁多，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，中西藥物已達(dá)700余種，但療效肯定、副作用小的藥物為數(shù)不多。盡管肝炎疫苗的推廣對(duì)肝炎防治起到巨大的推動(dòng)作用，但肝炎患者仍以每年近百萬(wàn)的速度增加。因此，研制結(jié)構(gòu)新穎，作用肯定的新型抗肝炎藥仍十分迫切。現(xiàn)有的藥物中拉米夫啶是公認(rèn)的抗肝炎病毒的藥物，但是拉米夫啶價(jià)格昂貴，要求患者長(zhǎng)期服藥，療程是無(wú)限期的，患者停藥后反跳強(qiáng)烈并有較大的肝腎毒性。現(xiàn)在還沒(méi)有既能殺肝炎病毒又能保護(hù)肝細(xì)胞的藥物。
葫蘆科植物Herpetospermum pedunculosum(Sex.)Baill.波棱是一種生長(zhǎng)在西藏的植物，未見(jiàn)對(duì)其的藥用報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服已有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明的目的在于提供葫蘆科植物Herpetospermum pedunculosum(Sex.)Baill.波棱的抗病毒，抗化學(xué)性肝損傷，抗腫瘤的用途。
本發(fā)明的另一目的在于提供葫蘆科植物Herpetospermumpedunculosum(Sex.)Baill.波棱的提取物。
本發(fā)明的又一目的在于提供葫蘆科植物Herpetospermumpedunculosum(Sex.)Baill.波棱提取物的制備方法。
本發(fā)明的又一目在于提供含有波棱提取物的藥物組合物，其包括作為活性成份的葫蘆科植物Herpetospermum pedunculosum(Sex.)Baill.波棱的提取物及制藥領(lǐng)域中常用的載體。
本發(fā)明的又一目的在于提供葫蘆科植物Herpetospermumpedunculosum(Sex.)Baill.波棱提取物和含有其的藥物組合物的抗病毒，抗化學(xué)性肝損傷，抗腫瘤的用途。
本發(fā)明的又一目的在于提供一種新的波棱素化合物。
本發(fā)明的又一目的在于提供一種新的波棱素的制備方法。
本發(fā)明的又一目的在于提供波棱素藥物組合物，其包括作為活性成份的波棱素化合物及其異構(gòu)體及制藥領(lǐng)域中常用的載體。
本發(fā)明的又一目的在于提供波棱素衍生物及其組合物作為抗病毒，抗化學(xué)性肝損傷，抗腫瘤藥物的應(yīng)用。
本發(fā)明一方面涉及如通式(I)所示的波棱素，及其相關(guān)的對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì)映異構(gòu)體、多晶形物、酯、鹽和溶劑化形式 本發(fā)明也包括通式化合物I的衍生物，它們的立體異構(gòu)體，它們的多晶形物，它們的藥學(xué)上可接受的鹽，它們的藥學(xué)上可接受的溶劑化物。
本發(fā)明涉及如通式I所示化合物藥效上可接受的衍生物或前藥，意思是如通式I所示化合物的任何可接受的鹽，酯和酯的鹽；或者本發(fā)明化合物的其它衍生物，其在給予受者時(shí)，能直接或間接的提供本發(fā)明的化合物。尤其優(yōu)選的衍生物和前藥是，當(dāng)這種化合物給予哺乳動(dòng)物時(shí)，能增加本發(fā)明化合物穩(wěn)定性的，和/或能增加本發(fā)明化合物生物利用度的(例如，使口服給藥的化合物更易于吸收入血)，和/或能增加本化合物在相關(guān)于本物種的生物隔室(例如，肝臟，腫瘤)的分布。前藥是任何和載體的通過(guò)共價(jià)鍵的相連的，當(dāng)這種前藥給予哺乳動(dòng)物患者時(shí)，其在體內(nèi)釋放如通式I活性本化合物。優(yōu)選的前藥包括，但不限定于，增加水溶性或通過(guò)生物膜的活性透過(guò)性的基團(tuán)連上如通式I的結(jié)構(gòu)而形成的衍生物。通式I化合物的前藥的制備是通過(guò)修飾在化合物中存在的取代基，用這樣的方法，這種修飾對(duì)于本化合物是能分離的，無(wú)論是用常規(guī)的方法或體內(nèi)。前藥包括通式I的化合物中羥基連上任何的取代基，當(dāng)給予哺乳動(dòng)物患者時(shí)，分離后形成自由的羥基。前藥的實(shí)施例包括，但不限定于，通式I化合物中羥基的乙?；柞；?，等。
如通式I所示的化合物的各種多晶型物構(gòu)成本發(fā)明的部分并且可以通過(guò)在不同的條件下的化合物結(jié)晶制備。例如，使用不同的通常使用的溶劑或它們的混合物來(lái)結(jié)晶；在不同的溫度下結(jié)晶；各種不同的模式來(lái)冷卻；在結(jié)晶過(guò)程中，從非常快到非常慢的范圍。多晶形物可以通過(guò)加熱或熔融化合物接著漸進(jìn)的或快速的冷卻獲得。多晶形物的存在可以NMR，IR，熱差掃描，X-光粉末衍射或其它的技術(shù)來(lái)確證。
本發(fā)明的化合物可以修飾通過(guò)連上相似的功能基來(lái)增加選擇的生物性能。這種修飾在本領(lǐng)域是公知的，包括但不限定于，那些增加穿透進(jìn)入特定的生物隔室(例如肝)，增加口服或靜脈內(nèi)的生物利用度，增加溶解性允許通過(guò)注射給藥，改變代謝，改變排泄的速率，等等。
為了完成本發(fā)明目的，本發(fā)明采取如下的技術(shù)方案葫蘆科植物波棱Herpetospermum pedunculosum(Sex.)Baill.的提取物和波棱素的制備原藥材葫蘆科植物波棱Herpetospermumpedunculosum(Sex.)Baill.的根、莖、葉、種子，優(yōu)選是其種子波棱瓜子，經(jīng)干燥并適當(dāng)?shù)姆鬯?，以利增大與溶劑的接觸面積，提高效率。
原藥材的提取溶劑可使用水、醇類(lèi)、或水與醇類(lèi)的混合物。優(yōu)選的醇類(lèi)，尤其是低分子量的醇，包括甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇等，更優(yōu)選的是乙醇。提取時(shí)溶劑量為原藥重量的2-20倍。提取前可以浸泡。提取可以在靜態(tài)或動(dòng)態(tài)下，優(yōu)選在動(dòng)態(tài)條件下。為了提高提取的效率，可以使用超聲波等。提取的溫度是從室溫(例如20℃)到溶劑回流溫度的范圍內(nèi)，優(yōu)選在回流的溫度下。提取可連續(xù)或間歇進(jìn)行，間歇提取時(shí)可重復(fù)1-4次。
上步結(jié)束后，合并濾液，濾去藥渣。濾液在動(dòng)態(tài)狀態(tài)下，在常壓或減壓加熱濃縮至沒(méi)有溶劑的浸膏。
浸膏石油醚脫油后，乙酸乙酯萃取?；厥找宜嵋阴ィ酶煞?。
干粉進(jìn)行純化，進(jìn)行柱層析，可以通過(guò)大孔樹(shù)脂、離子樹(shù)脂、吸附柱層析，優(yōu)選吸附柱層析，更優(yōu)選的是硅膠柱層析，是層析得到的有效部位。洗脫系統(tǒng)可以用薄層層析來(lái)篩分，選擇使被分離組分的Rf值在0.2-0.3的溶劑系統(tǒng)。優(yōu)選用二氯甲烷∶丙酮50∶1、30∶1、10∶1、5∶1、1∶1梯度洗脫，收集10∶1、5∶1、1∶1洗脫物，得波棱素粗品。
波棱素粗品再經(jīng)HPLC制備，即可如通式I所示的化合物，純度為98％以上。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明提取物、化合物的藥物組合物，它包括藥物有效劑量的，作為活性成分的提取物、化合物及藥學(xué)上可接受的載體。
通常本發(fā)明藥物組合物含有0.1-95％重量的本發(fā)明提取物、化合物。
本發(fā)明提取物、化合物的藥物組合物可根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法制備。用于此目的時(shí)，如果需要，可將本發(fā)明提取物、化合物與一種或多種固體或液體藥物賦形劑和/或輔劑結(jié)合，制成可作為人藥或獸藥使用的適當(dāng)?shù)氖┯眯问交騽┝啃问健?br> 本發(fā)明提取物、化合物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮膚、腹膜或直腸等，優(yōu)選口服給藥。
本發(fā)明提取物、化合物或含有它的藥物組合物的給藥途徑可為注射給藥。注射包括靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、皮內(nèi)注射等。
給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型。如液體劑型可以是真溶液類(lèi)、膠體類(lèi)、微粒劑型、乳劑劑型、混懸劑型。其他劑型例如片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、栓劑、凍干粉針劑等。
本發(fā)明提取物、化合物可以制成普通制劑、也可以是緩釋制劑、控釋制劑、靶向制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。
為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等；濕潤(rùn)劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，例如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進(jìn)劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤(rùn)滑劑，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進(jìn)一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。
例如為了將給藥單元制成丸劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高嶺土、滑石粉等；粘合劑，如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。
例如為了將給藥單元制成膠囊，將有效成分本發(fā)明提取物、化合物與上述的各種載體混合，并將由此得到的混合物置于硬的明膠膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分本發(fā)明提取物、化合物制成微囊劑，混懸于水性介質(zhì)中形成混懸劑，亦可裝入硬膠囊中或制成注射劑應(yīng)用。
例如，將本發(fā)明提取物、化合物制成注射用制劑，如溶液劑、混懸劑溶液劑、乳劑、凍干粉針劑，這種制劑可以是含水或非水的，可含一種和/或多種藥效學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑、防腐劑、表面活性劑或分散劑。如稀釋劑可選自水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī)的助溶劑、緩沖劑、pH調(diào)節(jié)劑等。這些輔料是本領(lǐng)域常用的此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或其它材料。
為達(dá)到用藥目的，增強(qiáng)治療效果，本發(fā)明的藥物或藥物組合物可用任何公知的給藥方法給藥。
本發(fā)明提取物、化合物藥物組合物的給藥劑量取決于許多因素，例如所要預(yù)防或治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，患者或動(dòng)物的性別、年齡、體重、性格及個(gè)體反應(yīng)，給藥途徑、給藥次數(shù)、治療目的，因此本發(fā)明的治療劑量可以有大范圍的變化。一般來(lái)講，本發(fā)明中藥學(xué)成分的使用劑量是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明提取物、化合物組合物中最后的制劑中所含有的實(shí)際藥物數(shù)量，加以適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，以達(dá)到其治療有效量的要求，完成本發(fā)明的預(yù)防或治療目的。本發(fā)明提取物、化合物的每天的合適劑量范圍本發(fā)明的提取物的用量為0.001-100mg/Kg體重，優(yōu)選為0.01-60mg/Kg體重，更優(yōu)選為0.05-10mg/Kg體重，最優(yōu)選為0.1-1mg/Kg體重。上述劑量可以單一劑量形式或分成幾個(gè)，例如二、三或四個(gè)劑量形式給藥這受限于給藥醫(yī)生的臨床經(jīng)驗(yàn)以及包括運(yùn)用其它治療手段的給藥方案。每一種治療所需總劑量可分成多次或按一次劑量給藥。本發(fā)明的提取物或組合物可單獨(dú)服用，或與其他治療藥物或?qū)ΠY藥物合并使用并調(diào)整劑量。
本發(fā)明的波棱素有良好的抗病毒作用，尤其是抗肝炎病毒作用。實(shí)驗(yàn)表明雛鴨感染鴨乙型肝炎病毒(DHBV)后給予波棱素，波棱素0.08g/kg一天2次10天對(duì)感染鴨乙型肝炎病毒感染的鴨血清中DHBVDNA水平的抑制效果有顯著性作用，無(wú)毒性反應(yīng)；0.16g/kg組抑制作用也較強(qiáng)。和陽(yáng)性藥拉米夫啶比較，0.08g/kg組在10天時(shí)抑制作用較強(qiáng)，并且反跳慢。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明波棱素對(duì)乙肝病毒具有較強(qiáng)的抑制作用。
藥理實(shí)驗(yàn)表明波棱素加入2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)液中能明顯抑制HBsAg和HBeAg的復(fù)制和表達(dá)，說(shuō)明本發(fā)明的化合物對(duì)乙型肝炎病毒有抑制作用。
本發(fā)明波棱素有較強(qiáng)的保肝降酶作用。對(duì)一次性ip四氯化碳(CCl4)所致小鼠急性肝損傷實(shí)驗(yàn)中，各給藥組大鼠血清GPT、GOT值均低于模型對(duì)照組，波棱素高、中劑量組與模型組比較有顯著性差異，說(shuō)明波棱素對(duì)CCl4所致小鼠急性肝損傷具有較好的治療作用。對(duì)一次性ip四氯化碳(CCl4)所致小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)的升高亦有較強(qiáng)的抑制作用。說(shuō)明本發(fā)明波棱素有較強(qiáng)的保肝降酶作用，尤其是對(duì)化學(xué)性物質(zhì)，特別是CCl4引起的肝損傷，波棱素具有很好的保護(hù)作用。
本發(fā)明波棱素有較強(qiáng)的抗腫瘤作用。分別以人肝癌細(xì)胞株BEL-7402、BEL-7404、及人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT為研究對(duì)象，以含不同稀釋濃度波棱素的培養(yǎng)基與細(xì)胞共同培養(yǎng)，采用MTT法檢測(cè)藥物作用對(duì)癌細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果表明波棱素對(duì)BEL-7402、BEL-7404的50％抑制率分別為1.44、1.64，對(duì)HCT的50％抑制率為2.31。說(shuō)明本發(fā)明化合物對(duì)不同癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。


葫蘆科植物Herpetospermum pedunculosum(Sex.)Baill.波棱提取物(以波棱瓜子為原藥材)和波棱素的制備工藝圖。
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)施例及藥物活性實(shí)驗(yàn)用來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但這并不意味著對(duì)本發(fā)明的任何限制。
實(shí)施例1葫蘆科植物Herpetospermum pedunculosum(Sex.)Baill.波棱提取物和波棱素的制備取藥材波棱的種子波棱瓜子5kg，粉碎，以95％乙醇(5倍量)浸泡，乙醇回流提取3次，每次1h，合并提取液，濃縮至無(wú)醇味，靜置除去油層，石油醚(一倍量)脫去殘留的油后，乙酸乙酯(一倍量、一倍量、一倍量)萃取三次。回收乙酸乙酯，得干粉。該部分經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析，依次用二氯甲烷∶丙酮50∶1、30∶1、10∶1、5∶1、1∶1梯度洗脫，收集10∶1、5∶1、1∶1洗脫物，得波棱素粗品。
波棱素粗品經(jīng)HPLC制備得波棱素(HPLC條件)純度為98％以上。具體流程見(jiàn)附圖。

C13-NMR、C13-H1cosy

藥理實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)例1波棱素的體內(nèi)抗肝炎病毒作用
1.1 試劑 拉米夫啶，英國(guó)葛蘭素威康有限公司B022306。
a-32P-dCTP(北京福瑞生物技術(shù)工程公司，批號(hào)981206)；缺口翻譯藥盒(Promega公司，批號(hào)990426)；鴨乙型肝炎病毒為鴨乙型肝炎病毒DNA(DHBV-DNA)強(qiáng)陽(yáng)性上海麻鴨血清(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)所病毒室提供，-70℃保存)1.2 動(dòng)物 1日齡北京維鴨購(gòu)自北京南苑養(yǎng)鴨場(chǎng)1.3 方法 1日齡北京鴨，經(jīng)腿脛靜脈注射上海麻鴨DHBV-DNA陽(yáng)性鴨血清，每只0.3ml，感染后7天取血，分離血清，檢測(cè)血清中DHBVDNA含量。雛鴨血清經(jīng)檢測(cè)DHBV呈陽(yáng)性后，將鴨隨機(jī)分為5組，病毒對(duì)照組、拉米夫啶組(50mg/kg)、波棱素(160、80、40mg/kg)三個(gè)劑量組，每組6只。灌胃給藥，1.5ml/只，每天2次。對(duì)照組給予同體積生理鹽水，連續(xù)給藥10天。分別于藥物治療后5天(T5)、10天(T10)和停藥后3天(P3)自鴨脛靜脈取血，分離血清，按缺口翻譯試劑盒說(shuō)明書(shū)方法，用32P標(biāo)記DHBVDNA探針，并作鴨血清斑點(diǎn)雜交，放射自顯影膜片斑點(diǎn)，酶標(biāo)儀測(cè)定OD值(濾光片為490nm)，計(jì)算血清DHBV-DNA光密度，以雜交斑點(diǎn)OD值作為標(biāo)本DHBV-DNA水平值。
表1波棱素治療組與病毒感染對(duì)照組鴨血清DHBV-DNA水平抑制比較藥物劑量 動(dòng)物數(shù)抑制率(％)g/kg(只) T5T10P3病毒對(duì)照6 -0.81 15.65 -8.56組波棱素 0.04 6 18.24*34.88* 23.060.08 6 24.99*62.48**45.85**
0.16 621.66*58.45** 37.68**拉米夫啶 0.05 645.27** 56.92** 27.35*統(tǒng)計(jì)處理給藥治療組HBV-DNA抑制率與病毒對(duì)照組同時(shí)間的DHBV-DNA抑制率比較(成組t檢驗(yàn))。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，波棱素0.08g/kg一天2次10天對(duì)感染鴨乙型肝炎病毒感染的鴨血清中DHBVDNA水平的抑制效果有顯著性作用，無(wú)毒性反應(yīng)；0.16g/kg組抑制作用也較強(qiáng)，與0.08g/kg組無(wú)顯著性差異。與陽(yáng)性藥拉米夫啶口服對(duì)DHBVDNA的抑制作用比較，0.08g/kg組在10天時(shí)抑制作用較強(qiáng)，且反跳慢，但統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著差異。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明波棱素對(duì)鴨乙型肝炎病毒感染鴨具有很好的治療作用，并優(yōu)于陽(yáng)性藥拉米夫啶。
實(shí)驗(yàn)例2波棱素的抗肝炎病毒作用2.1 試劑DMEM(美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品)；胎牛血清(美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品)；G-418(美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品)；HBeAg，HBsAg固定相放射免疫測(cè)定盒(中國(guó)同位素公司北方免疫試劑研究所產(chǎn)品)；2.2.2.2.15細(xì)胞 為轉(zhuǎn)染了HBV(Aayw亞基)全基因組，能分泌HBsAg、HBeAg、HBV-DNA顆粒的人肝母瘤細(xì)胞系，美國(guó)Mount sinai醫(yī)學(xué)中心構(gòu)建，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)所病毒室傳代培養(yǎng))2.3 方法 以每毫升10萬(wàn)個(gè)2.2.15細(xì)胞接種24孔培養(yǎng)板，每孔1ml，37℃ 5％CO2培養(yǎng)24小時(shí)，加無(wú)毒濃度以下2倍稀釋試驗(yàn)藥液，5個(gè)稀釋度分別為4、2、1、0.5、0.25mg/ml，每濃度3孔，37℃ 5％CO2培養(yǎng)，收集第8天含藥培養(yǎng)液，-20℃冰凍保存。參照固相放射免疫測(cè)定盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定，用γ計(jì)數(shù)儀測(cè)定每孔cpm值。實(shí)驗(yàn)設(shè)HBsAg、HBeAg陽(yáng)性和陰性對(duì)照。
表2波棱素在2.2.15細(xì)胞中對(duì)HBsAg的影響藥物濃度 cpm(x±s)抑制率mg/ml ％0.006 2158±17663.02**0.003 1774±63 69.60**0.0015 3206±21644.15*細(xì)胞 7069±245對(duì)照與細(xì)胞對(duì)照比較，**p＜0.01 *p＜0.05表3波棱素在2.2.15細(xì)胞中對(duì)HBeAg的影響藥物濃度 cpm(x±s) 抑制率mg/ml％0.006 1073±21361.040.003 1224±12055.530.0015 1507±18545.26細(xì)胞 2753±123對(duì)照與細(xì)胞對(duì)照比較，**p＜0.01 *p＜0.05
實(shí)驗(yàn)表明波棱素加入2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)8天，明顯抑制HBsAg和HBeAg的分泌，能抑制2.2.15細(xì)胞HBsAg、HBeAg的復(fù)制和表達(dá)。本發(fā)明化合物對(duì)2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對(duì)乙型肝炎病毒有抑制作用，說(shuō)明其對(duì)乙肝病毒具有較強(qiáng)的抑制作用。
實(shí)驗(yàn)例3 波棱素的保肝降酶作用3.1陽(yáng)性對(duì)照藥99J15043L01聯(lián)苯雙酯，北京協(xié)和藥廠，批號(hào)010309；3.2試劑谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)測(cè)定試劑盒，為北京北化康泰臨床試劑有限公司產(chǎn)品Eagles MEM干粉、G-418(Geneticin)、酵母t-RNA、蛋白酶K，美國(guó)GIBCO公司產(chǎn)品；3.3動(dòng)物昆明種小鼠，體重18-22g，均雌雄各半，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)分別為軍醫(yī)動(dòng)字第BDW98012和軍醫(yī)動(dòng)字第BDW95001號(hào)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)條件貳級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，合格證號(hào)軍醫(yī)動(dòng)字第B98006。
3.4儀器BS-224型生化分析測(cè)定儀，北京生化儀器廠。
3.5方法取健康小鼠60只隨機(jī)分為六組，即正常對(duì)照組、CCl4(0.02ml/kg)模型組、聯(lián)苯雙酯組0.029g/kg、波棱素(0.0166、0.0083、0.0042g/kg)三個(gè)劑量組，每組10只。每日ig給藥2次，對(duì)照組及模型組給與相同容積的蒸餾水，連續(xù)給藥7次藥后，除正常對(duì)照組外，小鼠ip 0.1％CCl4(橄欖油為溶劑)0.02ml/g，造模后40小時(shí)，小鼠眶靜脈采血，測(cè)血清GPT、GOT值，見(jiàn)表4。
表4.波棱素對(duì)CCl4致小鼠急性肝損傷的影響組別 劑量 動(dòng)物數(shù) GPTGOT(g/kg) (只)(U·L-1) (U·L-1)對(duì)照組 10 10.90±0.8549.59±5.731模型組 10 152.31±20.34##162.92±9.08##聯(lián)苯雙酯0.02910 30.71±2.28**70.14±8.06*波棱素 0.0166 10 34.20±10.12**72.43±9.11*0.0083 10 36.22±10.03**69.12±8.97*0.0042 10 62.75±8.21*86.28±10.23*與正常對(duì)照組比較，#p＜0.05 ##p＜0.01與模型組比較，*p＜0.05 **p＜0.01結(jié)果表明，各給藥組大鼠血清GPT、GOT值均低于模型對(duì)照組，波棱素高、中劑量組與模型組比較有顯著性差異，說(shuō)明波棱素對(duì)CCl4所致小鼠急性肝損傷具有較好的治療作用。
實(shí)驗(yàn)例4抗腫瘤作用4.1 方法分別以人肝癌細(xì)胞株BEL-7402、BEL-7404、及人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT為研究對(duì)象，以含不同稀釋濃度波棱素的培養(yǎng)基與細(xì)胞共同培養(yǎng)，采用MTT法檢測(cè)藥物作用對(duì)癌細(xì)胞的抑制作用。據(jù)文獻(xiàn)方法略加修改[1]，靶細(xì)胞以完全培養(yǎng)液調(diào)為1×105/mL，分別接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL，然后分別加入100μL不同含藥血清及空白血清，總體積200μL，每組設(shè)7個(gè)平行孔，在37℃、5％CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)48h后，每孔加入5mL MTT 10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后進(jìn)行顯色反應(yīng)，加20％二甲基亞砜100μL終止反應(yīng)，震蕩10min，在DG3022-A型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，波長(zhǎng)570nm測(cè)吸光度(A)值。細(xì)胞毒活性計(jì)算公式為 結(jié)果見(jiàn)表5。
表5.波棱素對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率(％)細(xì)胞株 濃度 (μg/ml)1.25 2.50 5.00 10.0020.00IC50BEL-7402 34.90 41.90100.00 98.80100.00 1.44BEL-7404 12.30 60.00100.00 98.50100.00 1.64HCT 32.00 18.0072.00 100.00 100.00 2.31結(jié)果表明波棱素對(duì)BEL-7402、BEL-7404的50％抑制率分別為1.44、1.64，對(duì)HCT的50％抑制率為2.31。說(shuō)明本發(fā)明的化合物對(duì)不同癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。
權(quán)利要求
1.葫蘆科植物波棱Herpe tospermum pedunculosum(Sex.)Baill.在制備抗病毒，抗肝損傷，抗腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其特征在于，所述的病毒是肝炎病毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的應(yīng)用，其特征在于，所述的肝炎病毒是乙型肝炎病毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其特征在于，所述的肝損傷是化學(xué)肝損傷。
5.葫蘆科植物Herpetospermum pedunculosum(Sex.)Baill.波棱的提取物，其特征在于，是原藥材葫蘆科植物波棱Herpetospermum pedunculosum(Sex.)Baill用溶劑提取，合并提取液，濃縮，再經(jīng)純化所得。
6.葫蘆科植物Herpetospermum pedunculosum(Sex.)Baill.波棱提取物的制備方法，其特征在于，葫蘆科植物Herpetospermum pedunculosum(Sex.)Baill.波棱用溶劑提取，合并提取液，濃縮，石油醚脫油，乙酸乙酯萃取，濃縮得干粉，干粉經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析，依次用二氯甲烷∶丙酮50∶1、30∶1、10∶1、5∶1、1∶1梯度洗脫，收集10∶1、5∶1、1∶1洗脫物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的制備方法，其特征在于，所述的溶劑是乙醇。
8.一種葫蘆科植物Herpetospermum pedunculosum(Sex.)Baill.波棱提取物的藥物組合物，其特征在于，包括作為活性成份的葫蘆科植物Herpetospermum pedunculosum(Sex.)Baill.波棱的提取物及制藥領(lǐng)域中常用的載體。
9.如權(quán)利要求7的葫蘆科植物Herpetospermumpedunculosum(Sex.)Baill.波棱提取物在制備抗病毒，抗化學(xué)性肝損傷，抗腫瘤的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其特征在于，所述的病毒是肝炎病毒。
11.根據(jù)權(quán)利要求2的應(yīng)用，其特征在于，所述的肝炎病毒是乙型肝炎病毒。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其特征在于，所述的肝損傷是化學(xué)肝損傷。
13.如通式(I)所示的波棱素及其相關(guān)的對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì)映異構(gòu)體、多晶形物、酯、鹽和溶劑化形式。
14.權(quán)利要求13的波棱素的制備方法，其特征在于，葫蘆科植物Herpetospermum pedunculosum(Sex.)Baill.波棱用溶劑提取，合并提取液，濃縮，石油醚脫油，乙酸乙酯萃取，濃縮得干粉，干粉經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析，依次用二氯甲烷∶丙酮50∶1、30∶1、10∶1、5∶1、1∶1梯度洗脫，收集10∶1、5∶1、1∶1洗脫物，得波棱素粗品，波棱素粗品經(jīng)HPLC制備得。
15.波棱素藥物組合物，其特征在于，包括作為活性成份的權(quán)利要求13的化合物及制藥領(lǐng)域中常用的載體。
16.如權(quán)利要求13的化合物制備抗病毒，抗肝損傷，抗腫瘤藥物的應(yīng)用。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的應(yīng)用，其特征在于，所述的病毒是肝炎病毒。
18.根據(jù)權(quán)利要求16的應(yīng)用，其特征在于，所述的肝炎病毒是乙型肝炎病毒。
19.根據(jù)權(quán)利要求16的應(yīng)用，其特征在于，所述的肝損傷是化學(xué)肝損傷。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了葫蘆科植物波棱Herpetospermum pedunculo-sum(Sex.)Baill.提取物和波棱素，波棱提取物和波棱素的制備方法，波棱提取物和波棱素及其衍生物的藥物組合物，波棱提取物和波棱素及其衍生物及其藥物組合物作為藥物的用途，尤其是制備抗病毒，抗肝損傷，抗腫瘤的藥物中的用途。經(jīng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，波棱素具有活性高、毒性小的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61K31/343GK1486691SQ0312396
公開(kāi)日2004年4月7日 申請(qǐng)日期2003年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月29日
發(fā)明者袁海龍, 李仙義 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三○二醫(yī)院