專利名稱：抗SARS－CoV藥物作用靶標、藥物篩選方法及抗SARS藥物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用生物信息技術和分子生物學方法篩選藥物，具體涉及用SARS冠狀病毒核衣殼蛋白(N蛋白)和人親環(huán)素A(CypA)相互作用模型作為藥物作用靶標在分子和細胞水平篩選藥物的方法。
背景技術：
傳染性非典型肺炎稱為嚴重急性呼吸綜合征(Severe Acute RespiratorySydrome，SARS)。研究發(fā)現，一種新型的冠狀病毒極可能是病因，在香港和加拿大的病人和死亡病人的尸體中都分離出了這種病毒，在一些SARS病人的血清中也發(fā)現了抗hMPV的抗體。2003年4月16日，世界衛(wèi)生組織(WHO)正式確認SARS病毒是傳染性非典型肺炎的病因。傳染性非典型肺炎病人中90％以上感染SARS病毒的人能夠自愈，致死率約為10％左右。SARS病人的呼吸道切片和細胞培養(yǎng)物的電子顯微鏡照片顯示，存在冠狀病毒顆粒。這是一種新型的冠狀病毒，與冠狀病毒屬中其他已知的成員不同，該病毒可引起綠猴腎細胞(VERO-E6)發(fā)生病變效應，病毒復制能夠被SARS感染康復人的血清所抑制，可以利用感染的細胞和康復病人的血清進行免疫熒光檢測法(Immunofluorescence assays，IFA)檢測培養(yǎng)細胞中細胞感染有SARS病毒的情況，該方法表現出特異性的反應。美國、加拿大和香港的研究表明，非SARS病人的血清不能和新冠狀病毒發(fā)生反應；傳染性腸胃炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV)、鼠肝炎病毒(Murine HepatitisVirus，MHV)、貓傳染性腹膜炎病毒(Feline Infectious Peritonitis virus，FIPV)、229E人冠狀病毒的超抗血清可以抑制培養(yǎng)的病毒生長。幾個實驗室對病毒的測序表明，新病毒和冠狀病毒屬相關，但不同于同屬的其它冠狀病毒個群，是冠狀病毒的一個新的變種。SARS冠狀病毒在種屬分類上屬于正鏈RNA病毒(ssRNA positivestrand viruses)家系的巢狀病毒(Nidovirales)族中的冠狀病毒(Coronaviridae)系。它是冠狀病毒家族中新出現的一個子類。2003年三月，科學家們發(fā)現了導致SARS的元兇SARS冠狀病毒(SARS Coronaviruses，SARS-CoV)，并且成功地完成了SARS-CoV基因組的完整測序。SARS-CoV基因組由29727個核苷酸、11個開放閱讀框(Opening Reading Frames)組成。它的基因組結構和其他的冠狀病毒非常相似。但通過比較遺傳史和序列比對表明SARS-CoV的特征和以前發(fā)現的冠狀病毒的特征并不完全相似，它不僅表現有其他冠狀病毒共有的特征，還有SARS-CoV本身特有的特征(Paul A.Rota，M.Steven Oberste，Stephan S.Monroe，W.Allan Nix，Ray Campagnoli，et al.Characterization of a novel coronavirus associated with severe acute respiratorysyndrome.Science(Sciencexpress)1 May，2003；Marco A.Marra，Steven J.M.Jones，Caroline R.Astell，Robert A.Holt，Angela Brooks-Wilson，et al.Thegenome sequence of the SARS-associated coronavirus.Science(Sciencexpress)1May，2003)。科學家同時進行了SARS相關的冠狀病毒加拿大多倫多(Tor2)分離株29751個堿基的基因組測序?；蚪M序列揭示這個冠狀病毒與已知的冠狀病毒(包括人類冠狀病毒HcoVOC43，HCoV-229E)無密切相關。預測病毒蛋白的種系分析表明，該冠狀病毒與已知的三族冠狀病毒均非密切相似?；蚪M序列將有助于人類了解SARS病毒感染的機制、潛在動物宿主的診斷檢測(使用PCR和免疫測試法)，同時也有助于發(fā)展抗病毒制劑(包括中和抗體)和找出疫苗抗原決定簇(Marco A.Marra，Steven J.M.Jones，Caroline R.Astell，Robert A.Holt，Angela Brooks-Wilson，et al.The genome sequence of the SARS-associatedcoronavirus.Science(Sciencexpress)1 May，2003)。
但迄今為止，人們對SARS-CoV病毒的感染機制研究還很不充分，為降低感染率和死亡率，臨床上對能夠預防和/或治療的SARS-CoV感染的特效藥物有著十分緊迫的需求。
因此，本發(fā)明的第一個目的是提供一種快速篩選治療和/或預防SARS病毒感染藥物的藥物作用靶標。
本發(fā)明的第二個目的是提供這種藥物作用靶標的構建方法。
本發(fā)明的第三個目的是提供用這種藥物作用靶標篩選治療和/或預防SARS病毒感染藥物的方法。
本發(fā)明的第四個目的是提供用這種藥物作用靶標篩選出的治療和/或預防SARS病毒感染的藥物。
發(fā)明概述藥物作用靶標是指疾病發(fā)生和發(fā)展過程中能夠在最關鍵病理環(huán)節(jié)上起決定作用的關鍵功能生物大分子，包括細胞膜受體、蛋白酶、激素與細胞因子、離子通道、DNA、RNA、核受體等。現代藥物研究的核心是以藥物作用靶標為基礎，篩選或設計與靶標結構互補、能夠激動或拮抗靶標介導的生物功能，具有治療作用的藥物先導物。這種基于機理和結構的新藥物發(fā)現和選擇性地阻斷疾病發(fā)生和發(fā)展過程中最關鍵的病理環(huán)節(jié)，研發(fā)出高效低毒副作用的特異性藥物。
本發(fā)明者對SARS-CoV的基因表達產物進行了深入的生物信息學分析，從而識別了SARS病毒感染人體的途徑；然后用分子生物學和生物物理方法驗證這一作用途徑；根據這一作用途徑篩選化合物，并進行病毒水平的測試，確證傳染性非典型肺炎(SARS)藥物作用的靶標，用這一藥物作用靶標篩選預防和/或治療傳染性非典型肺炎藥物，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供的用于篩選治療和/或預防SARS病毒感染藥物的藥物作用靶標是在非典型肺炎冠狀病毒復制、轉錄、翻譯和組裝過程中起關鍵作用的核衣殼蛋白(SARS Nucleocapsid)、宿主(人體)作用蛋白質人親環(huán)素A(Cyclophilin A)及兩者之間的相互作用途徑，所述靶標為包含SARS病毒N蛋白和人體CypA相互作用活性位點的SARS病毒N蛋白Val235-Pro369片斷和人體CypA復合物三維結構模型，其中靶標SARS病毒N蛋白的序列特征為MSDNGPQSNQ RSAPRITFGG PTDSTDNNQN GGRNGARPKQ RRPQGLPNNT ASWFTALTQH GKEELRFPRGQGVPINTNSG PDDQIGYYRR ATRRVRGGDG KMKELSPRWY FYYLGTGPEA SLPYGANKEG IVWVATEGALNTPKDHIGTR NPNNNAATVL QLPQGTTLPK GFYAEGSRGG SQASSRSSSR SRGNSRNSTP GSSRGNSPARMASGGGETAL ALLLLDRLNQ LESKVSGKGQ QQQGQTVTKK SAAEASKKPR QKRTATKQYN VTQAFGRRGPEQTQGNFGDQ DLIRQGTDYK HWPQIAQFAP SASAFFGMSR IGMEVTPSGT WLTYHGAIKL DDKDPQFKDNVILLNKHIDA YKTFPPTEPK KDKKKKTDEA QPLPQRQKKQ PTVTLLPAAD MDDFSRQLQNSMSGASADST QA靶標人體CypA的序列特征為MVNPTVFFDI AVDGEPLGRV SFELFADKVP KTAENFRALS TGEKGFGYKGSCFHRIIPGF MCQGGDFTRH NGTGGKSIYG EKFEDENFIL KHTGPGILSMANAGPNTNGS QFFICTAKTE WLDGKHVVFG KVKEGMNIVE AMERFGSRNGKTSKKITIAD CGQLE本發(fā)明提供的藥物作用靶標中，靶標SARS病毒N蛋白功能區(qū)域序列編號為235 VSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKQYNVTQAFGRRGPEQTQGNFG289 DQDLIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYHGAIKLDDKDPQFK349 DNVILLNKHIDAYKTFPPTEP所述藥物作用靶標中，靶標人體CypA蛋白功能區(qū)域序列編號為Arg55、Ile57、Phe60、Met61、Gln63、Gly72、Thr73、Gly74、Ala101、Asn102、Ala103、Gln111、Phe113、Trp121、Leu122、Lys125、His126所述藥物作用靶標中，SARS病毒N蛋白和人體CypA相互作用活性位點包括N蛋白Trp302到Phe315殘基組成的loop，其中主要氨基酸殘基為Trp302、Pro303、Gln304、Ile305、Ala306、Aln307、Phe308、Ala309、Pro310、Ser311、Ala312、Ser313、Ala314和Phe315；人體CypAArg55、Ile57、Phe60、Met61、Gln63、Gly72、Thr73、Gly74、Ala101、Asn102、Ala103、Gln111、Phe113、Trp121、Leu122、Lys125和His126。
本發(fā)明提供的藥物作用靶標的構建方法包括以下步驟1)用生物信息學方法對SARS-CoV中的蛋白質與人體蛋白質相互作用進行網絡分析，揭示SARS-CoV N蛋白和人CypA的相互作用；2)用同源蛋白模建方法構建SARS-CoV病毒N蛋白的三維結構，用分子模擬方法計算SARS-CoV病毒N蛋白與人體CypA的相互作用，構建N蛋白與人體CypA復合物的結構，確立這兩個蛋白相互作用的區(qū)域；3)用分子生物學方法表達N蛋白與人體CypA，用表面等離子激光共振生物傳感技術研究N蛋白與人體CypA的相互作用，揭示這兩個蛋白間存在強烈的相互作用；4)針對N蛋白與人體CypA相互結合的區(qū)域，用計算機虛擬篩選方法搜尋化合物數據庫，找到阻止N蛋白與人體CypA結合的化合物，確證藥物作用靶標的建立。
本發(fā)明提供的用藥物作用靶標篩選治療和/或預防SARS病毒感染藥物的方法，包括如下步驟1)測定候選物與CypA的結合常數，選出具有較強親和力的化合物；2)將獲選化合物進行抑制SARS-CoV病毒N蛋白與人體CypA結合的測試；3)測試獲選化合物對受SARS-CoV病毒感染細胞的保護作用。


圖1顯示SARS-CoV病毒N蛋白Val235-Pro369片斷與HIV-1病毒CA蛋白Pro401-Tyr545的序列聯(lián)配。圖中“*”代表相同或保守的殘基，“.”代表保守殘基的取代，“∶”代表半保守的取代，相似性為47.8％。
圖2顯示SARS-CoV病毒N蛋白Val235-Pro369片斷(帶狀結構)與CypA(球狀表面結構)復合物三維結構模型。
圖3顯示SARS-CoV病毒N蛋白與CypA之間的氫鍵和疏水相互作用。其中符號的意義如下 配體鍵 疏水接觸中涉及的非配體殘基 非配體鍵 疏水接觸中涉及的相應原子 氫鍵及其長度圖4顯示ARS-CoV病毒N蛋白與人體CypA相互作用動力學測試結果。所用儀器為BIACORE3000，分析軟件為Application Wizard中Kinetic Analysis。測定時CypA固定在CM5芯片上，N蛋白濃度依次為0.214nM、1.07nM、5.35nM、10.7nM、21.4nM、42.8nM、85.63nM、0.171uM、0.343uM、0.685uM和1.37uM。
圖5顯示環(huán)孢素A抑制ARS-CoY病毒N蛋白與人體CypA結合動力學測試結果。CypA固定在CM5芯片上，N蛋白的濃度為1.37μM環(huán)孢素A(CsA)的濃度依次為832、1664、2496和3328μM。
圖6顯示環(huán)孢素A對感染SARS-CoV病毒的Vreo-E6細胞的保護作用。
發(fā)明詳述本發(fā)明者運用生物信息學方法對SARS-CoV中的蛋白質與人體蛋白質相互作用的網絡進行了分析，發(fā)現SARS-CoV的核衣殼蛋白(SARS Nucleocapsid，以下簡稱N蛋白)和人體中的人親環(huán)素A(Cyclophilin A，以下簡稱CypA)有相互作用；本發(fā)明用同源蛋白模建方法構建了SARS-CoV病毒N蛋白的三維結構，用分子模擬方法計算了SARS-CoV病毒N蛋白與人體CypA的相互作用，構建了N蛋白與人體CypA復合物的結構，確立了這兩個蛋白相互作用的區(qū)域；用分子生物學方法表達了N蛋白與人體CypA，用表面等離子激光共振生物傳感(SPR)技術研究了N蛋白與人體CypA的相互作用，發(fā)現這兩個蛋白間存在強烈的相互作用；針對N蛋白與人體CypA相互結合的區(qū)域，用計算機虛擬篩選方法搜尋了化合物數據庫，發(fā)現已有免疫抑制劑環(huán)孢素A能阻止N蛋白與人體CypA的結合；用SPR技術測定了環(huán)孢素A阻止N蛋白與人體CypA的結合的活性；在病毒水平篩選了環(huán)孢素A抑制病毒感染Vero-E6細胞的活性，確證了這一SARS-CoV病毒感染人體的途徑和靶標，并建立了相應的分子水平和細胞水平的篩選方法。
1、生物信息學分析和SARS-CoV病毒N蛋白與人體CypA相互作用模擬1994年，Luban等發(fā)現CypA能與HIV-1病毒核整合，與HIV-1病毒二聚化的Gap多聚蛋白中的衣殼域作用(Luban，J.；Bossolt，K.L.；Franke，E.K.；Kalpana，G.V.；Goff，S.P.Human immunodefficiency virus type 1 Gag protein binds toCyclophilins A and B.Cell 1993，73，1067-1078；Luban，J.Absconding with thechaperoneessential Cyclophilin-Gag interaction in HIV-1 virions.Cell 1996，87，1157-1159；Franke，E.K.；Yuan，H.E.H.；Luban，J.Specific incorporation ofCyclophilin A into HIV-1 virions.Nature 1994，372，359-362；Thali，M.；Bukovsky，A.；Kondo，E.；Rosenwirth，B.；Walsh，C.T.；Sodroski，J.；Go¨ttlinger，H.G.Functional association of Cyclophilin A with HIV-1 virions.Nature 1994，372，363-365)，進而在病毒成熟過程中，多聚蛋白分解成基質蛋白、衣殼蛋白(CA蛋白)和核衣殼蛋白(N蛋白)，但這些蛋白依然結合在一起，CypA與衣殼蛋白大約以1∶10的比例結合。因此，CypA與衣殼蛋白的直接結合在HIV-1病毒的成熟、病毒的復制和新病毒顆粒的形成中起重要作用(Gitti，R.K.；Lee，B.M.；Walker，J.；Summers，M.F.；Yoo，S.；Sundquist，W.I.Structure of theamino-terminal core domain of the HIV-1 capsid protein.Science 1996，273，231-235；Gamble，T.R.；Vajdos，F.F.；Yoo，S.；Worthylake，D.K.；Houseweart，M.；Sundquist，W.I.；Hill，C.P.Crystal structure of human Cyclophilin A bound to theN-terminal domain of HIV-1 capsid.Cell 1996，87，1285-1294；Colgan，J.；Yuan，H.E.H.；Franke，E.K.；Luban，J.Binding of the human immunodefficiency virus type1 Gag polyprotein to Cyclophilin A is mediated by the central region of capsid andrequires Gag dimerizaion.J.Virol.1996，70，4299-4310；Ott，D.E.Cellularproteins in HIV virions.Rev.Med.Virol.1997，7，167-180)。蛋白—蛋白相互作用分析表明，SARS-CoV病毒的N蛋白與人體CypA有相互作用。在SARS-CoV病毒中沒有發(fā)現CA蛋白，設想同是衣殼蛋白，SARS-CoV病毒的N蛋白的功能之一是與HIV-1病毒中的CA蛋白類似，與CypA結合，對病毒的成熟、病毒的復制和新病毒顆粒的形成起重要作用。因此，本發(fā)明進行了進一步的序列比較和結構模建。
序列分析表明，SARS-CoV病毒N蛋白與HIV-1病毒的CA蛋白同源性較高，但全序列比較，兩者相似性依然很低，序列相似性為37.6％、同源性為26.9％、序列間隙小于4.8％。然而，進一步分析發(fā)現，SARS-CoV病毒N蛋白的Val235-Pro369片斷與HIV-1病毒CA蛋白與CypA的結合區(qū)域Trp302-Phe315有較高的相似性，序列相似性為42.2％、同源性為24.4％、序列間隙小于4.1％。這一序列分析表明，SARS-CoV病毒N蛋白可能通過Val235-Pro369區(qū)域與CypA結合(見圖1)。
根據HIV-1病毒CA蛋白Pro401-Tyr545片斷與CypA復合物的晶體結構(蛋白質三維結構數據庫PDB編號為1AK4)，本發(fā)明模建了SARS-CoV病毒N蛋白Val235-Pro369片斷與CypA復合物三維結構模型(見圖2)。模建的結構模型顯示，SARS-CoV病毒的N蛋白上存在一段與人體CypA活性口袋作用的一段loop。
2、SARS-CoV病毒N蛋白與人體CypA相互作用活性位點由SARS-CoV病毒N蛋白Val235-Pro369片斷與CypA復合物三維結構模型(附圖2)，可以獲得SARS-CoV病毒N蛋白與人體CypA相互作用活性位點的一些信息。SARS-CoV病毒N蛋白與人體CypA結合區(qū)域為從Trp302到Phe315殘基組成的loop，組成CypA結合口袋的主要殘基為Arg55、Ile57、Phe60、Met61、Gln63、Gly72、Thr73、Gly74、Ala101、Asn102、Ala103、Gln111、Phe113、Trp121、Leu122、Lys125、His126。兩個蛋白間形成的氫鍵和疏水相互作用分別列于圖3以及表1和表2。
表1.SARS-CoV病毒N蛋白與CypA氫鍵相互作用

表2.SARS-CoV病毒N蛋白與CypA疏水相互作用


3、SARS-CoV病毒N蛋白與人體CypA的表達及相互作用測定將構建好的pQE30/SARS_N質粒轉化于大腸桿菌M15中，以IPTG(濃度0.8mM)誘導，在氨芐西林和卡那霉素為雙抗生素，溫度為30℃，表達時間為10小時條件下，表達SARS-CoV病毒N蛋白。以NTA-His柱層析法初步純化SARS-CoV病毒N蛋白，再利用FPLC-凝膠過濾進一步純化SARS-CoV病毒N蛋白。利用pET11/CyPA質粒轉化的大腸桿菌BL21(DE3)經IPTG(0.5mM)誘導表達人體CypA蛋白(表達溫度25℃)，利用50％飽和硫酸銨沉淀蛋白得到蛋白粗品，以Mono-Q和分子篩進一步提純人體CypA蛋白得到純品。
使用表面等離子激光共振(SPR)技術得到SARS-CoV病毒N蛋白與人體CypA相互作用的離解常數(KD)為7.65×10-8M，表明SARS-CoV病毒N蛋白與人體CypA相互作用有較強的結合。測定結果見圖4。
4、針對N蛋白與人體CypA相互作用的虛擬篩選確定SARS-CoV病毒N蛋白與人體CypA相互作用方式和結合區(qū)域后，本發(fā)明以CypA與SARS-CoV病毒N蛋白作用的表面結合口袋為靶標，用分子對接(Molecular Docking)虛擬篩選(Virtual Screening)方法，搜尋了MDL公司的藥物數據庫CMC、現有化合物數據庫ACD、藥物報道數據庫MDDR和中國科學院上海藥物研究所的化合物樣品庫，獲得了一批與CypA具有較強親和力的獲選化合物，包括CypA的配體環(huán)[[(E)-(2S，3R，4R)-3-羥基-4-甲基-2-甲氨基-6-八烯酰]-L-2-氨基丁酰-N-甲基甘氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-L-纈氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-L-丙氨酰-D-丙氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-N-甲基-L-纈氨酰](環(huán)孢素A，CyclosporinA)。分子模擬表明，環(huán)孢素A能阻止確定SARS-CoV病毒N蛋白與人體CypA結合。
5、環(huán)孢素阻止N蛋白與人體CypA結合研究利用表面等離子共振生物傳感技術BIACORE3000研究環(huán)孢素A阻止SARS-CoV病毒N蛋白與人體CyPA結合，實驗結果如圖5所示，結果顯示隨著環(huán)孢素A的濃度的增加，SARS-CoV病毒N蛋白與人體CyPA結合降低，表明環(huán)孢素A能夠抑制SARS-CoV病毒N蛋白與人體CypA結合。
6、環(huán)孢素A抗SARS-CoV病毒活性測試為確證上述SARS-CoV病毒N蛋白與人體CypA作用途徑與SARS-CoV病毒感染人體的相關性，本發(fā)明選擇了在分子水平能阻止SARS-CoV病毒N蛋白與人體CypA結合的環(huán)孢素A進行病毒水平的測試。
測試原理以Vero-E6細胞作為病毒宿主細胞(易感細胞)，測試樣品對病毒感染細胞的保護作用，檢測指標為細胞變性反應(CPE)以及觀察感染細胞保護率。
測試方法把Vero-E6細胞接種于96孔培養(yǎng)板，置37℃，5％CO2孵箱培養(yǎng)，加入不同稀釋濃度的SARS病毒和2.5mg/m和1250ug/ml的環(huán)孢素A，觀察CPE，并用中性紅染色測定OD值，計算樣品抗SARS病毒活性作用。
測試結果在病毒-細胞水平模型的抗SARS病毒活性實驗中，用不同有效濃度的SARS病毒感染Vero-E6細胞，當加入2.5mg/m和1250ug/ml濃度的環(huán)孢素A時有較明顯的抑制SARS病毒感染Vero-E6細胞的保護活性(結果見圖6)。表明SARS-CoV病毒N蛋白與人體CypA作用途徑與SARS-CoV病毒感染人體具有明確的相關性。
如上所述，本發(fā)明的一個方面通過生物信息分析，發(fā)現SARS-CoV病毒N蛋白與人體CypA有相互作用。序列分析表明，SARS-CoV病毒N蛋白與HIV-1病毒的CA蛋白同源性較高，但全序列比較，兩者相似性依然很低，序列相似性為37.6％、同源性為26.9％、序列間隙小于4.8％。然而，進一步分析發(fā)現，SARS-CoV病毒N蛋白的Val235-Pro369片斷與HIV-1病毒CA蛋白與CypA的結合區(qū)域Trp302-Phe315有較高的相似性，序列相似性為42.2％、同源性為24.4％、序列間隙小于4.1％。提示SARS-CoV病毒N蛋白與HIV-1病毒CA蛋白具有相似的功能，即在SARS-CoV病毒感染人體后，SARS-CoV病毒N蛋白與人體CypA的直接結合在SARS-CoV病毒的成熟、復制和新病毒顆粒的形成中起重要作用。
根據人體CypA與HIV-1病毒CA蛋白Trp302-Phe315片斷復合物的晶體結構，模建了人體CypA與SARS-CoV病毒N蛋白Val235-Pro369片斷復合物的三維結果模型。結果表明，SARS-CoV病毒N蛋白能與人體CypA的結合區(qū)為從Trp302到Phe315殘基組成的loop，其主要氫鍵相互作用和疏水相互作用分別見附圖3即附表1和附表2，CypA與SARS-CoV病毒N蛋白的結合口袋由Arg55、Ile57、Phe60、Met61、Gln63、Gly72、Thr73、Gly74、Ala101、Asn102、Ala103、Gln111、Phe113、Trp121、Leu122、Lys125和His126殘基組成。
在確定SARS-CoV病毒N蛋白與人體CypA相互作用的方式和結構模型的基礎上，本發(fā)明采用等離子表面激光共振生物傳感(SPR)研究了SARS-CoV病毒N蛋白與人體CypA相互作用的動力學行為，表明兩者有較強的結合(將附圖4)，結合常數(KD)為7.65×10-8M。
由上述結果可以初步判定，SARS-CoV病毒N蛋白與人體CypA相互作用與SARS-CoV感染人體有關，SARS-CoV病毒N蛋白、人體CypA蛋白以及它們之間的相互作用可以作為篩選抗SARS-CoV病毒藥物的方法。按一般藥物靶標確證的原則，必須根據假設的靶標篩選出活性化合物。于是，本發(fā)明針對人體CypA與SARS-CoV病毒N蛋白相互作用的結合口袋，用虛擬篩選方法篩選了MDL公司的藥物數據庫CMC、現有化合物數據庫ACD和我所自己的化合物樣品庫，獲得了一批與CypA具有較強親和力的獲選化合物，包括CypA的配體環(huán)孢素A。本發(fā)明繼而采用等離子表面激光共振生物傳感(SPR)研究了環(huán)孢素A抑制SARS-CoV病毒N蛋白與人體CypA結合的動力學行為(結果見圖5)，結果表明，環(huán)孢素A能有效地抑制SARS-CoV病毒N蛋白與人體CypA結合，隨著環(huán)孢素A濃度的增加，抑制蛋白結合的強度也增加，呈現了良好的劑量關系。
為了進一步確證本發(fā)明提出抗SARS-CoV病毒藥物作用靶標的有效性，本發(fā)明進行了環(huán)孢素A保護Vero-E6細胞受SARS-CoV病毒感染的測試。以Vero-E6細胞作為病毒宿主細胞，測試環(huán)孢素A對病毒感染細胞的保護作用，檢測指標為細胞變性反應(CPE)以及觀察感染細胞保護率。結果表明2.5mg/m和1250ug/ml濃度的環(huán)孢素A有較明顯的抑制SARS病毒感染Vero-E6細胞的保護活性(結果見附圖6)。表明SARS-CoV病毒N蛋白與人體CypA作用途徑與SARS-CoV病毒感染人體具有明確的相關性。
根據以上生物信息學分析、分子模擬、SPR蛋白—蛋白相互作用研究、虛擬篩選、化合物分子水平和病毒細胞水平的篩選，本發(fā)明確定SARS-CoV病毒N蛋白、人體CypA及其相互作用途徑是治療和/或預防SARS-CoV病毒感染的藥物作用靶標。
本發(fā)明另一方面涉及根據確定的藥物作用靶標SARS-CoV病毒N蛋白、人體CypA及其相互作用途徑，采用分子模擬方法建立了SARS-CoV病毒N蛋白功能片斷Val235-Pro369與人體CypA復合物的三維結構模型，確定SARS-CoV病毒N蛋白與人體CypA相互結合的關鍵部位和氨基酸殘基。在此基礎上，用虛擬篩選方法獲得了能阻斷SARS-CoV病毒N蛋白與人體CypA結合的候選物，經SPR分子水平的活性測試和抑制Vero-E6細胞感染病毒活性測試，篩選出靶標生物功能抑制劑。
靶標生物功能抑制劑為與靶標SARS病毒N蛋白功能區(qū)域或靶標人體CypA蛋白功能區(qū)域相互結合、并阻斷所述SARS病毒N蛋白和人體CypA功能區(qū)域結合的有機分子化合物或或多肽化合物或寡糖化合物或單克隆抗體或核苷類化合物。
本發(fā)明的另一個方面發(fā)現了具有通式I的環(huán)孢素衍生物可以特異性地與CypA結合，有效地抑制SARS-CoV病毒N蛋白與人體CypA的結合，具有較明顯的抑制SARS病毒感染Vero-E6細胞的保護活性，具有用于治療和/或預防SARS-CoV病毒感染的用途。
在臨床上，環(huán)孢素A主要用于抑制器官和組織移植后的排異反應，此外也用于自身免疫性疾病的治療，如對I型糖尿病、牛皮癬、類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等均有肯定的療效。美國專利US6270957和US5840305披露了含有通式I的化合物可以作用于T淋巴細胞、抑制HIV蛋白酶抑制細胞攝取病毒、干擾HIV-1病毒Gag蛋白與CypA相互作用、抑制CypA整合進入HIV-1病毒顆粒、阻止病毒顆粒成熟和復制；美國專利US6521595、US4885276和US19891205披露了含有通式I的化合物新的制備方法。
通式I的環(huán)孢素衍生物或其藥學上可接受的鹽或水合物中各取代基的定義如下
式中R1為H、C1-C4烷基、C1-C4取代烷基、羥基；R2為H、乙酰基、C1-C4取代烷基酰基、C1-C4取代烷基；R3為H、羥基、羥基烷氧基、羥基烷硫基、C1-C4烷基硫醚基、烷氧羰基烷基硫醚基、芳基烷基硫醚基、芳基硫基、烷基磺?；?、羥基烷基磺酰基、多烷氧基取代甲硫醚基；R4為H、C1-C4烷基、C1-C4取代烷基；R5為H、甲硫醚基、多烷基取代硫甲基；R6為H、C1-C4烷基、C1-C4取代烷基；R7為H、羥基、羥基烷基、羥基烷氧基、C1-C4烷基硫醚基；R8為H、羥基、羥基烷基、羥基烷氧基、C1-C4烷基硫醚基；R9為H、C1-C4烷基、C1-C4取代烷基。
本說明書中所述的“藥學上可接受的鹽”具體地可列舉與丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、馬來酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、等有機酸和天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸形成酯后再與無機堿形成的鹽，如鈉、鉀、鈣、鋁鹽和銨鹽，或與有機堿形成的鹽，如甲胺鹽、乙胺鹽、乙醇胺鹽等，或與賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸等堿性氨基酸形成酯后的鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等無機酸的鹽，或與甲酸、乙酸，苦味酸、甲磺酸、乙磺酸等有機酸的鹽。
本發(fā)明的實驗發(fā)現通式I的化合物或其藥學上可接受的鹽或水合物，可以有效地抑制SARS-CoV病毒N蛋白與人體CypA的結合，具有較明顯的抑制SARS-CoV病毒感染Vero-E6細胞的保護活性，因此，具有治療和/或預防SARS-CoV病毒感染的用途。
本發(fā)明方法篩選出的通式I化合物或其藥學上可接受的鹽或水合物中最優(yōu)選的化合物為環(huán)孢素A(Cyclosporin A)，環(huán)[[(E)-(2S，3R，4R)-3-羥基-4-甲基-2-甲氨基-6-八烯酰]-L-2-氨基丁酰-N-甲基甘氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-L-纈氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-L-丙氨酰-D-丙氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-N-甲基-L-纈氨酰]。
本發(fā)明的另一方面還涉及可用于預防和/或治療冠狀病毒感染引起的傳染性非典型性肺炎的藥物組合物，其包括預防和/或治療有效量的至少一種通式I化合物或者其藥學上可接受的鹽或其水合物以及至少一種藥用載體或賦形劑。
這里所述的藥用載體包括但不限于離子交換劑，氧化鋁，硬脂酸鋁，卵磷脂，血清蛋白如人血白蛋白，緩沖物質如磷酸鹽，甘油，山梨酸，山梨酸鉀，飽和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，鹽或電解質，如硫酸魚精蛋白，磷酸氫二鈉，磷酸氫鉀，氯化鈉，鋅鹽，膠態(tài)氧化硅，三硅酸鎂，聚乙烯吡咯烷酮，纖維素物質，聚乙二醇，羧甲基纖維素鈉，聚丙烯酸酯，蜂蠟，羊毛脂。
本發(fā)明還涉及這種藥物組合物在制備預防和/或治療傳染性非典型性肺炎(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)藥物上的新用途。
所述藥物組合物可以根據不同給藥途徑而制備成各種劑型。這些劑型以下面方式之一施用口服，噴霧吸入，直腸用藥，鼻腔用藥，頰部用藥，局部用藥，非腸道用藥，如皮下，靜脈、肌內、腹膜內、鞘內、心室內、胸骨內和顱內注射或輸入，或借助一種外植儲器用藥。其中預防SARS病毒感染時優(yōu)選口服或肌肉注射，治療SARS病毒感染時優(yōu)選腹膜內或靜脈內給藥方式。
另外需要指出，本發(fā)明化合物的使用劑量和使用方法取決于諸多因素，包括患者的年齡、體重、性別、自然健康狀況、營養(yǎng)狀況、化合物的活性強度、服用時間、代謝速率、病癥的嚴重程度以及診治醫(yī)師的主觀判斷。建議劑量如為開始每日5mg～10mg/kg，維持量可減至每日3mg/kg。膠囊劑0.25g/粒。注射液0.25g/5ml?？诜芤?g/50ml。
具體實施方案下面的實施例是為了對本發(fā)明進行進一步說明的具體選實施方案，但這些實施例絕不是對本發(fā)明的任何限制。
實施例1SARS-CoV病毒N蛋白序列的多重比對結果對比的序列源自美國國家生物信息中心NCBI，它們分別來自不同地區(qū)的SARS病例標本，包括NCBI登錄號為gi|30275668(BJ01)、gi|30027618(Vietnam)、gi|29836495(Tor2)、gi|30023962(CUHKW1)、gi|29837498(GZ01)、gi|30275667(BJ02)、gi|30023953(HKU-39849)、gi|30124074(Canada)、gi|30173234(BJ03)。采用ClustalX(1.8版)的方法進行多重序列比對，結果表明所有已測序的SARS-CoV病毒N蛋白序列相同。
實施例2SARS-CoV病毒N蛋白與人體CypA復合物構建序列分析表明全長SARS-CoV病毒N蛋白與HIV-1的CA蛋白序列的同源性并不高，相似性不到30％；但SARS-CoV病毒N蛋白上的一段序列(Val235-Pro369)與HIV-1病毒CA蛋白與CypA的結合區(qū)域(Pro401-Tyr545)的同源性很高，相似性高達47.8％(圖1)。這一序列分析表明，SARS-CoV病毒N蛋白可能通過Val235-Pro369區(qū)域與CypA結合。
根據HIV-1病毒CA蛋白Pro401-Tyr545片斷與CypA復合物的晶體結構(蛋白質三維結構數據庫PDB編號為1AK4)，模建了SARS-CoV病毒N蛋白Val235-Pro369片斷與CypA復合物三維結構模型(見圖2)。模建的結果模型顯示，SARS-CoV病毒的N蛋白上存在一段與人體CypA活性口袋作用的一段loop。SARS-CoV病毒N蛋白Val235-Pro369片斷三維結構模建采用InsightII的MODELLER軟件，并用3D-Profile和Prostat軟件評價結構模型的質量。Loop搜尋發(fā)現SARS-CoV病毒N蛋白的Trp302-Phe315區(qū)域與HIV-1病毒CA蛋白與CypA結合區(qū)域相似，于是將SARS-CoV病毒N蛋白loop區(qū)Trp302-Phe315對接到CypA結合口袋中，獲得復合物的初始結構，再用分子力學進行優(yōu)化，采用的力場參數到Amber力場和Kollman-all-atom電荷。復合物結構如圖2所示。
實施例3SARS-CoV病毒N蛋白與人體CypA相互作用的SPR實驗測定將CypA固定在CM5芯片上，N蛋白為流動相。用BIACORE3000測定N蛋白與CypA的動力學行為，N蛋白的濃度以此為N蛋白濃度依次為0.214nM、1.07nM、5.35nM、10.7nM、21.4nM、42.8nM、85.63nM、0.171uM、0.343uM、0.685uM和1.37uM。用Application Wizard/Kinetic Analysis軟件分析數據(圖4)。獲得上述兩蛋白見的結合常數(KD)為7.65×10-8M。
實施例4阻止SARS-CoV病毒N蛋白與人體CypA相互作用化合物的虛擬篩選用分子對接方法DOCK程序對MDL公司的藥物數據庫CMC、現有化合物數據庫ACD、藥物報道數據庫MDDR和國家新藥篩選中心樣品庫進行了虛擬篩選，篩選時所用的靶標模型是人體CypA與SARS-CoV病毒N蛋白作用的結合口袋。分子對接時考慮了小分子化合物的柔性，根據打分的高低從上述數據庫中先挑選1000個候選物，用AutoDock的打分函數和Cscore打分函數對候選物進行進一步的評價，最后挑選了300個化合物進行分子水平的篩選。分子水平篩選方法是先測定候選物與CypA的結合常數，獲得活性化合物。
實施例5環(huán)孢素A阻止SARS-CoV病毒N蛋白與人體CypA結合測試通過虛擬篩選和分子水平測試，獲得活性化合物進行抑制SARS-CoV病毒N蛋白與人體CypA結合的測試。本實施例以環(huán)孢素A來說明測試過程，動力學測試方法同實施例4。測試SARS-CoV病毒N蛋白與人體CypA結合動力學行為時，加入不同濃度的環(huán)孢素A。本發(fā)明所用環(huán)孢素A的濃度為832、1664、2496和3328μM，測試結果見圖5。
實施例6環(huán)孢素A抑制SARS-CoV病毒測試以Vero-E6細胞作為病毒宿主細胞(易感細胞)，測試樣品對病毒感染細胞的保護作用，檢測指標為細胞變性反應(CPE)以及感染細胞保護率。
把Vero-E6細胞接種于96孔培養(yǎng)板，置37℃，5％CO2孵箱培養(yǎng)，分別加入SARS病毒和不同稀釋濃度的環(huán)孢素A，設病毒對照、細胞對照和樣品對照。每日鏡下觀察結果，記錄CPE，并用中性紅染色測定OD值，參照對照進行樣品抗SARS病毒活性作用的計算和評價。測試結果見圖6。
權利要求
1.一種用于篩選治療和/或預防SARS病毒感染藥物的藥物作用靶標，所述靶標為包含SARS病毒N蛋白和人體CypA相互作用活性位點的SARS病毒N蛋白Val235-Pro369片斷和人體CypA復合物三維結構模型，其中靶標SARS病毒N蛋白的序列特征為MSDNGPQSNQ RSAPRITFGG PTDSTDNNQN GGRNGARPKQ RRPQGLPNNT ASWFTALTQH GKEELRFPRGQGVPINTNSG PDDQIGYYRR ATRRVRGGDG KMKELSPRWY FYYLGTGPEA SLPYGANKEG IVWVATEGALNTPKDHIGTR NPNNNAATVL QLPQGTTLPK GFYAEGSRGG SQASSRSSSR SRGNSRNSTP GSSRGNSPARMASGGGETAL ALLLLDRLNQ LESKVSGKGQ QQQGQTVTKK SAAEASKKPR QKRTATKQYN VTQAFGRRGPEQTQGNFGDQ DLIRQGTDYK HWPQIAQFAP SASAFFGMSR IGMEVTPSGT WLTYHGAIKL DDKDPQFKDNVILLNKHIDA YKTFPPTEPK KDKKKKTDEAQPLPQRQKKQ PTVTLLPAAD MDDFSRQLQNSMSGASADST QA靶標人體CypA的序列特征為MVNPTVFFDI AVDGEPLGRV SFELFADKVP KTAENFRALS TGEKGFGYKGSCFHRIIPGF MCQGGDFTRH NGTGGKSIYG EKFEDENFIL KHTGPGILSMANAGPNTNGS QFFICTAKTE WLDGKHVVFG KVKEGMNIVE AMERFGSRNGKTSKKITIAD CGQLE
2.如權利要求1所述的藥物作用靶標，其中靶標SARS病毒N蛋白功能區(qū)域序列編號為235 VSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKQYNVTQAFGRRGPEQTQGNFG289 DQDLIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYHGAIKLDDKDPQFK349 DNVILLNKHIDAYKTFPPTEP
3.如權利要求1所述的藥物作用靶標，其中靶標人體CypA蛋白功能區(qū)域序列編號為Arg55、Ile57、Phe60、Met61、Gln63、Gly72、Thr73、Gly74、Ala101、Asn102、Ala103、Gln111、Phe113、Trp121、Leu122、Lys125、His126
4.如權利要求1所述的藥物作用靶標，其中所述SARS病毒N蛋白和人體CypA相互作用活性位點包括N蛋白Trp302到Phe315殘基組成的loop，其中主要氨基酸殘基為Trp302、Pro303、Gln304、Ile305、Ala306、Aln307、Phe308、Ala309、Pro310、Ser311、Ala312、Ser313、Ala314和Phe315；人體CypAArg55、Ile57、Phe60、Met61、Gln63、Gly72、Thr73、Gly74、Ala101、Asn102、Ala103、Gln111、Phe113、Trp121、Leu122、Lys125和His126。
5.權利要求1所述藥物作用靶標的構建方法，包括以下步驟1)用生物信息學方法對SARS-CoV中的蛋白質與人體蛋白質相互作用進行網絡分析，揭示SARS-CoV N蛋白和人CypA的相互作用；2)用同源蛋白模建方法構建SARS-CoV病毒N蛋白的三維結構，用分子模擬方法計算SARS-CoV病毒N蛋白與人體CypA的相互作用，構建N蛋白與人體CypA復合物的結構，確立這兩個蛋白相互作用的區(qū)域；3)用分子生物學方法表達N蛋白與人體CypA，用表面等離子激光共振生物傳感技術研究N蛋白與人體CypA的相互作用，揭示這兩個蛋白間存在強烈的相互作用；4)對N蛋白與人體CypA相互結合的區(qū)域，用計算機虛擬篩選方法搜尋化合物數據庫，找到阻止N蛋白與人體CypA結合的化合物，確證藥物作用靶標的建立。
6.用權利要求1所述藥物作用靶標篩選治療和/或預防SARS病毒感染藥物的方法，包括如下步驟1)測定候選物與CypA的結合常數，選出具有較強親和力的化合物；2)將獲選化合物進行抑制SARS-CoV病毒N蛋白與人體CypA結合的測試；3)測試獲選化合物對受SARS-CoV病毒感染細胞的保護作用。
7.一種靶標生物功能抑制劑，為與靶標SARS病毒N蛋白功能區(qū)域或靶標人體CypA蛋白功能區(qū)域互補、并阻斷所述SARS病毒N蛋白和人體CypA功能區(qū)域結合的有機分子化合物或或多肽化合物或寡糖化合物或單克隆抗體或核苷類化合物。
8.如權利要求7所述的靶標生物功能抑制劑，所述生物功能抑制劑為有機分子化合物或多肽化合物。
9.權利要求7或8所述抑制劑在制備治療和/或預防SARS病毒感染的藥物上的用途。
10.通式I所示環(huán)孢素衍生物或其藥學上可接受的鹽或水合物在制備治療和/或預防SARS病毒感染的藥物上的用途 式中R1為H、C1-C4烷基、C1-C4取代烷基、羥基；R2為H、乙?；?、C1-C4取代烷基酰基、C1-C4取代烷基；R3為H、羥基、羥基烷氧基、羥基烷硫基、C1-C4烷基硫醚基、烷氧羰基烷基硫醚基、芳基烷基硫醚基、芳基硫基、烷基磺?；?、羥基烷基磺?；?、多烷氧基取代甲硫醚基；R4為H、C1-C4烷基、C1-C4取代烷基；R5為H、甲硫醚基、多烷基取代硫甲基；R6為H、C1-C4烷基、C1-C4取代烷基；R7為H、羥基、羥基烷基、羥基烷氧基、C1-C4烷基硫醚基；R8為H、羥基、羥基烷基、羥基烷氧基、C1-C4烷基硫醚基；R9為H、C1-C4烷基、C1-C4取代烷基。
11.如權利要求10所述的用途，其中所述化合物為cyclosporin A，環(huán)[[(E)-(2S，3R，4R)-3-羥基-4-甲基-2-甲氨基-6-八烯酰]-L-2-氨基丁酰-N-甲基甘氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-L-纈氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-L-丙氨酰-D-丙氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-N-甲基-L-纈氨酰]。
12.用于治療和/或預防SARS病毒感染的藥物組合物，其中包括治療和/或預防有效量的權利要求10或11所述的化合物和至少一種藥學上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于篩選治療和/或預防SARS病毒感染藥物的藥物作用靶標，所述靶標為包含SARS病毒N蛋白和人體CypA相互作用活性位點的SARS病毒N蛋白Val235－Pro369片斷和人體CypA復合物三維結構模型。本發(fā)明還提供所述藥物作用靶標的構建方法，用所述藥物作用靶標篩選治療和/或預防SARS病毒感染藥物的方法，及通過篩選確認環(huán)孢素衍生物在治療和/或預防SARS病毒感染上的新用途。
文檔編號A61K38/12GK1472332SQ0312906
公開日2004年2月4日 申請日期2003年6月3日 優(yōu)先權日2003年6月3日
發(fā)明者蔣華良, 沈旭, 左建平, 莊賢韓, 裴剛, 李亦學, 沈建華, 羅小民, 陳凱先, 沈競康, 柳紅, 陳靜, 陳莉莉, 楊一鳴, 石鐵流 申請人:中國科學院上海藥物研究所, 上海先導藥業(yè)有限公司, 中國科學院上海生命科學研究院