專利名稱：改進的包埋蛋白類藥物和疫苗的高分子微球的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種改進的包埋蛋白類藥物和疫苗的高分子微球的制備方法。尤其是胰島素、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、人絨毛膜促性腺激素、神經生長因子、破傷風桿菌疫苗等藥物微球的制備方法。
背景技術：
近十年來，藥物控釋微球在醫(yī)藥領域獲得了越來越多的應用。第一，作為各種藥物的控釋及多途徑給藥制劑，如可用作注射、口服、鼻腔吸入、眼部給藥等多途徑使用；第二，作為各種化學栓塞制劑發(fā)揮栓塞及控釋雙重功能；第三，作為激素、疫苗等藥物的載體實現一次給藥達到長時間發(fā)揮療效、引發(fā)機體免疫應答的作用。目前用于控釋微球的載體材料有多種，按來源可分為(1)天然高分子材料，如纖維素、殼聚糖、蛋白質，海藻酸鈉，這類材料大多可降解且有良好的生物相容性；(2)合成高分子材料，按生物降解特性又可分為非生物降解型高分子材料，如聚丙烯酸酯及其衍生物，聚醋酸乙烯酯；生物降解型高分子材料，如聚酯、聚酸酐、聚原酸酯、聚碳酸酯等，其中聚乳酸，聚(丙交酯-共-乙交酯)，由于其良好的生物相容性及生物降解性已被美國FDA批準作為醫(yī)用材料臨床使用。
控釋微球中生理活性物質可以是脂溶性的，也可以是水溶性的。其中載有多肽蛋白類藥物、疫苗的可降解性微球作為一類新型藥物劑型隨生物技術和基因工程的快速發(fā)展引起人們的高度重視。這種新型的緩釋劑型中，有的已經作為上市產品，如醋酸亮丙瑞林、曲譜瑞林緩釋微球劑型已用于臨床治療前列腺癌、子宮內膜異位癥及子宮平滑肌瘤等疾病；有的微球制劑正在進行臨床試驗，如用于治療激素依賴型侏儒癥和兒童期發(fā)育不全的重組人生長激素緩釋制劑正在美國進行臨床試驗；有的雖然只是初步的基礎研究，但已顯示出廣泛的應用前景，如口服胰島素制劑、載有亞單位疫苗或病毒疫苗的緩釋制劑。通過制成緩釋微球劑型，既可以避免生物活性物質受體內酶的降解和其它物質的破壞失活，又可顯著延長藥物在體內的釋放時間，達到一次給藥長期有效的目的。
水包油包水乳液-溶劑揮發(fā)法是藥物微球化的最為常用的方法。在該復乳法制備微球過程中，聚乙烯醇是最常使用的非離子型表面活性劑。許多研究表明，聚乙烯醇往往吸附在所得微球表面而難以通過洗滌徹底去除。同時，聚乙烯醇又是一種潛在的致癌物質，它在體內難以降解或代謝。Yamaoka等人的研究表明，靜注后聚乙烯醇在體內的生物半衰期隨分子量的增大而增大，而作為乳化劑使用的聚乙烯醇一般具有較高的分子量。因此，聚乙烯醇長期體內使用的安全性仍是值得懷疑的。吐溫類物質是另一類廣泛應用于醫(yī)藥工業(yè)的非離子型表面活性劑，該類乳化劑在注射劑中也常使用。以該類物質為乳化劑，用復乳法制備包埋蛋白類藥物和疫苗的高分子微球尚未見諸于報道。
復乳法制備微球時，所得微球的成球性、微球收率、藥物包埋率、微球表面形態(tài)、微球粒徑等特性受很多制備因素如內水相粘度、第一次乳化速度、聚合物種類、外水相的組成、二次乳化速度的影響。盡管這方面的研究已有很多文獻報道，但對外水相組成的專門研究報道極少。Pistel和Kissel以聚乙烯醇為乳化劑，研究了外水相添加氯化鈉對微球形態(tài)、藥物包埋率等的影響。盡管外水相中添加氯化鈉是一種得到具有較好特性的微球的簡單易行的辦法。但由于有些多肽蛋白類藥物對鹽類電解質特別敏感，往往在這些物質存在下變性失活。例如，Péan和Venier-Julience報道以復乳法制備神經生長因子/聚(丙交酯-共-乙交酯)微球，當外水相中有氯化鈉存在時會導致包入的神經生長因子失活。多元醇、糖和多糖如甘露醇、葡萄糖、乳糖等經常用作蛋白類藥物和疫苗的穩(wěn)定劑，在復乳法制備微球過程中，外水相中引入該類物質將不會存在導致活性物質失活的問題，而這方面的工作至今也未見報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種改進的包埋蛋白類藥物和疫苗的高分子微球的制備方法。
它首先將藥物溶解在水溶液或緩沖鹽溶液中得到內水相，可降解性聚合物溶解在二氯甲烷或氯仿中得到中油相，吐溫類乳化劑或吐溫類乳化劑與水溶性鹽或多元醇或糖或多糖組成的水溶液作為外水相，然后在冰浴中和以每分鐘2000-40000轉高速攪拌下或超聲波作用下乳化于中油相中形成油包水初乳，該初乳在300-3000轉/分攪拌下乳化于外水相中得到水包油包水復乳，所得復乳在室溫下電磁攪拌以揮發(fā)去除中油相的有機溶劑，待微球硬化后，離心分離，用雙蒸水洗滌，冷凍干燥。
本發(fā)明的優(yōu)點是1)使用吐溫類物質作為乳化劑，由于該類物質具有良好的水溶性，在所得的微球表面基本無乳化劑吸附；2)外水相加入水溶性鹽可明顯提高微球的收率(提高到90-100％)；
3)外水相中加入多元醇或糖或多糖，可避免有時因加入水溶性鹽而引起的蛋白類藥物和疫苗的變性，同時又可提高藥物包埋率(70-95％)和微球收率(70-95％)。
具體實施例方式
本發(fā)明使用吐溫類物質替代聚乙烯醇作為乳化劑，同時，外水相中引入水溶性鹽、多元醇、糖或多糖。為了提高蛋白的包埋率和微球的收率，本發(fā)明采取如下措施。該法內水相為溶解有藥物的水溶液或緩沖鹽溶液，其中藥物濃度為0.01-100mg/ml。中油相為溶解有聚乳酸、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚碳酸酯的二氯甲烷或氯仿溶液，其中聚合物濃度為1-200mg/ml。外水相為溶解有吐溫類乳化劑或吐溫類乳化劑與添加劑(水溶性鹽或多元醇、糖、多糖)的水溶液，其中吐溫類乳化劑的濃度為0.05-20g/100ml，添加劑的濃度為0.0-20g/100ml。在冰浴中和以每分鐘2000-40000轉高速攪拌下或超聲波作用下將內水相乳化于中油相中形成油包水初乳，該初乳在300-3000轉攪拌下乳化于外水相中得到水包油包水復乳。將所得復乳在室溫下電磁攪拌以揮發(fā)去除中油相的有機溶劑，待微球硬化后，離心分離，用雙蒸水洗滌，冷凍干燥即可。
下面結合實施例作進一步詳細說明。
實施例1內水相采用0.5ml濃度為10mg/ml的牛胰島素(Mw＝5800)的磷酸緩沖鹽溶液(0.1M，pH7.4)，中油相為5.0ml濃度為50mg/ml的聚(丙交酯-共-乙交酯)(摩爾比為75∶25，Mw＝52000)的二氯甲烷溶液，外水相為0.1％(重量/體積)吐溫80水溶液，其中含有5％氯化鈉，制備時將內水相在2000轉/分攪拌下乳化于中油相中，形成的油包水初乳，該初乳在800轉/分攪拌下乳化于外水相中得到水包油包水復乳，該復乳在10℃下電磁攪拌揮發(fā)去除中油相溶劑；微球硬化后離心分離并用雙蒸水洗滌，冷凍干燥，牛胰島素包埋率為75.0％，微球收率為100％，微球數均粒徑為40μm。
實施例2內水相采用0.5ml濃度為10mg/ml的牛胰島素(Mw＝5800)的磷酸緩沖鹽溶液(0.1M，pH7.4)，中油相為6.0ml濃度為50mg/ml的聚(丙交酯-共-乙交酯)(摩爾比為50∶50，Mw＝50000)的氯仿烷溶液，外水相為0.25％(重量/體積)吐溫80水溶液，其中含有7.5％氯化鈉，制備時將內水相在4000轉/分攪拌下乳化于中油相中，形成的油包水初乳，該初乳在500轉/分攪拌下乳化于外水相中得到水包油包水復乳，該復乳在10℃下電磁攪拌揮發(fā)去除中油相溶劑；微球硬化后離心分離并用雙蒸水洗滌，冷凍干燥，牛胰島素包埋率為85.0％，微球收率為90.5％，微球數均粒徑為60μm。
實施例3內水相采用0.5ml濃度為5.0mg/ml的人絨毛膜促性腺激素(HCG，免疫活性為14000IU/mg)的磷酸緩沖鹽溶液(0.1M，pH7.4)，中油相為6.0ml濃度為的50mg/ml的聚(丙交酯-共-三亞甲基碳酸酯)(摩爾比為60∶40，Mw＝35000)的二氯甲烷溶液，外水相為0.1％(重量/體積)吐溫80水溶液，其中含有15％葡萄糖，其余操作同實施例1，所得微球的HCG包埋率為89.3％，微球收率為95％，微球數均粒徑為35μm。
實施例4內水相采用0.5ml濃度為50mg/ml的牛血清白蛋白(BSA，Mw＝67000)的水溶液，中油相為10.0ml濃度為的40mg/ml的聚(丙交酯-共-乙交酯)(摩爾比為50∶50，Mw＝36000)的二氯甲烷溶液，外水相為0.2％(重量/體積)吐溫80水溶液，制備時將內水相超聲波作用(200W)下乳化于中油相中，形成的油包水初乳2000轉/分勻漿乳化于外水相中得到水包油包水復乳，該復乳在15℃下電磁攪拌揮發(fā)去除中油相溶劑；微球硬化后離心分離并用雙蒸水洗滌，冷凍干燥，BSA包埋率為99.7％，微球收率為70％，微球數均粒徑為4.5μm。
實施例5內水相采用0.5ml濃度為50mg/ml的人血清白蛋白(HSA)的水溶液，中油相為10ml濃度為的40mg/ml的聚(丙交酯-共-乙交酯)(摩爾比為50∶50，Mw＝36000)的二氯甲烷溶液，外水相為0.1％(重量/體積)吐溫80水溶液，其中含有2.5％1，2-丁二醇，制備時將內水相超聲波分散(200W)于中油相中，形成的油包水初乳2800轉/分勻漿乳化于外水相中得到水包油包水復乳，該復乳在15℃下電磁攪拌蒸發(fā)去除中油相溶劑；微球硬化后離心分離并用雙蒸水洗滌，冷凍干燥，HSA包埋率為91.7％，微球收率為85％，微球數均粒徑為2.5μm。
實施例6內水相采用0.5ml濃度為0.05mg/ml的神經生長因子(NGF)的水溶液，中油相為10ml濃度為的40mg/ml的聚(丙交酯-共-乙交酯)(摩爾比為50∶50，Mw＝36000)的二氯甲烷溶液，外水相為0.2％(重量/體積)吐溫80水溶液，其中含有2.5％甘露醇，制備時將內水相超聲波作用(200W)下乳化于中油相中，形成的油包水初乳2800轉/分勻漿乳化于外水相中得到水包油包水復乳，該復乳在15℃下電磁攪拌蒸發(fā)去除中油相溶劑；微球硬化后離心分離并用雙蒸水洗滌，冷凍干燥，NGF包埋率為81.7％，微球收率為80％，微球數均粒徑為2.0μm。
實施例7內水相采用0.5m破傷風桿菌疫苗的水溶液(15000IU/ml)，中油相為10ml濃度為的50mg/ml的聚乳酸(重均分子量為36000)的二氯甲烷溶液，外水相為0.2％(重量/體積)吐溫80水溶液，其中含有2.5％甘露醇，制備時將內水相在2000轉/分攪拌下乳化于中油相中，形成的油包水初乳，形成的油包水初乳1000轉/分攪拌下乳化于外水相中得到水包油包水復乳，該復乳在15℃下電磁攪拌蒸發(fā)去除中油相溶劑；微球硬化后離心分離并用雙蒸水洗滌，冷凍干燥，破傷風桿菌疫苗的包埋率為75.7％，微球收率為85.6％，微球數均粒徑為42.0μm。
權利要求
1.一種改進的包埋蛋白類藥物和疫苗的高分子微球的制備方法，其特征在于首先將藥物溶解在水溶液或緩沖鹽溶液中得到內水相，可降解性聚合物溶解在二氯甲烷或氯仿中得到中油相，吐溫類乳化劑或吐溫類乳化劑與水溶性鹽或多元醇或糖或多糖組成的水溶液作為外水相，然后在冰浴中和以每分鐘2000-40000轉高速攪拌下或超聲波作用下乳化于中油相中形成油包水初乳，該初乳在300-3000轉/分攪拌下乳化于外水相中得到水包油包水復乳，所得復乳在室溫下電磁攪拌以揮發(fā)去除中油相的有機溶劑，待微球硬化后，離心分離，用雙蒸水洗滌，冷凍干燥。
2.根據權利要求1所述的一種改進的包埋蛋白類藥物和疫苗的高分子微球的制備方法，其特征在于所說的外水相為吐溫類乳化劑的水溶液，吐溫類乳化劑的濃度為0.05-20％(g/ml)。
3.根據權利要求1所述的一種改進的包埋蛋白類藥物和疫苗的高分子微球的制備方法，其特征在于所說的外水相中含有水溶性鹽或多元醇或糖或多糖添加劑，添加劑的濃度為0.0-20％(g/ml)。
4.根據權利要求1所述的一種改進的包埋蛋白類藥物和疫苗的高分子微球的制備方法，其特征在于所說的蛋白類藥物和疫苗為胰島素、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、人絨毛膜促性腺激素、神經生長因子、破傷風桿菌疫苗。
5.根據權利要求1所述的一種改進的包埋蛋白類藥物和疫苗的高分子微球的制備方法，其特征在于制備蛋白類藥物和疫苗的高分子微球所用的載體材料為聚乳酸、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚(丙交酯-共-碳酸酯)生物降解高分子材料。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種改進的包埋蛋白類藥物和疫苗的高分子微球的制備方法。該方法采用水包油包水技術，其內水相為藥物的水溶液或緩沖鹽溶液，中油相為聚合物溶液，外水相為含有或不含水溶性鹽或多元醇(或糖、多糖)的吐溫類乳化劑的水溶液。制備時將一定量的內水相乳化于中油相中得到油包水乳液，該初乳再乳化于外水相中得到水包油包水復乳液。該復乳在室溫攪拌下?lián)]發(fā)中油相溶劑，待微球硬化后，離心分離，雙蒸水洗滌，冷凍干燥。本發(fā)明使用吐溫類乳化劑，以水包油包水復乳溶劑揮發(fā)法成功制備了包埋蛋白類藥物和疫苗的高分子微球。微球收率80－100％，藥物包埋率達到60－100％。藥物在體外釋放時間超過30天，且微球粒徑可在0.5－200μm之間調控以滿足不同的使用要求。
文檔編號A61K9/14GK1460468SQ0312909
公開日2003年12月10日 申請日期2003年6月5日 優(yōu)先權日2003年6月5日
發(fā)明者朱康杰, 張建祥, 蔡啟祥 申請人:浙江大學