專利名稱：紫錐松果菊提取物的抗sars作用及其藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及中草藥的提取、篩選及活性研究，具體涉及紫錐松果菊抗SARS活性部位的提取、篩選及其藥物組合物。
背景技術：
紫錐松果菊(Echinacea purpurea (L)Muench，簡稱紫錐菊)是菊科松果屬植物，紫苑家簇，主要分布在北美草原地區(qū)。80年代后在新西蘭、歐洲及我國等地進行了引種栽培。紫椎花是極受歡迎的天然草藥，廣泛地用于醫(yī)療、化妝品和日常飲料中，其成分包括精油、多糖類、葡糖、多炔、甜菜堿、倍半萜烯等；此外，亦含有銅、鐵、單寧酸、蛋白質、脂肪酸，以及維生素A、C及E。紫錐花的活性成分能促使人體增加T細胞的數(shù)目，增強免疫力。除有助于預防上呼吸道的感染、感冒發(fā)燒外，紫錐花亦有助于減輕皮膚感染癥狀，例如蚊叮蟲咬、粉刺、濕疹等。大量研究證實，紫錐花能增強及刺激人體免疫系統(tǒng)，有助于消炎殺菌，抵抗病毒。對發(fā)燒、流感、過敏癥、關節(jié)炎、喉嚨發(fā)炎等病癥，紫錐花均有預防及治療效用。在眾多草藥中，紫錐花作為很有價值的免疫調(diào)節(jié)劑而倍受關注。它的藥理活性歸因于咖啡酸衍生物如紫錐菊甙(echinocoside)、菊苣酸(cichoric acid)、綠原酸(chlorogenic acid)(圖1)，以及親脂性聚乙炔類衍生物如烷基酰胺類(alkylamides)包括異丁酰胺類(isobutylamides)(圖2)以及其他水、醇提取物。
有人報道，在可見光和紫外光下，紫錐菊的提取物有體外抗I型單純皰疹病毒作用，正己烷提取物的最小抑菌濃度(MIC)＝0.12mg/mL，菊苣酸(cichoric acid)的MIC為0.045mg/mL。含紫錐的Chizukit N可使健康人血中單核細胞產(chǎn)生細胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6的量下降。紫錐菊新鮮壓榨的汁可激活免疫系統(tǒng)，0.012mg/ml即可使巨噬細胞產(chǎn)生IL-1，TNF-α、IL-6和IL-10。紫錐菊可通過增加抗原特異性免疫球蛋白的產(chǎn)生增強免疫反應。菊苣酸(cichoric acid)在體內(nèi)體外均顯示具有噬菌活性，而紫錐菊甙(echinocoside)兼有抗菌和抗病毒活性。最近的研究表明，菊苣酸具有抑制透明質酸酶的作用，保護膠原質III不形成游離基，防止其降解。紫錐菊的親脂性成分聚乙炔類烷基酰胺(如異丁酰胺)及糖蛋白和多聚糖也有免疫調(diào)節(jié)活性。當測試紫錐松果菊的地上部分和根部的醇提取物的噬菌活性時，烷基酰胺表現(xiàn)出很高的活性。大部分的烷基酰胺有抑制環(huán)氧化酶的作用，同時也抑制5-脂氧酶。這與傳統(tǒng)使用這種植物治療炎癥性疾病是一致的。
傳染性非典型肺炎稱為嚴重急性呼吸綜合征(Severe AcuteRespiratory Sydrome，SARS)。研究發(fā)現(xiàn)，其病因極可能是一種新型的冠狀病毒，在香港和加拿大的病人和死亡病人的尸體中都分離出了這種病毒，在一些SARS病人的血清中也發(fā)現(xiàn)了抗hMPV的抗體。2003年4月16日，世界衛(wèi)生組織(WHO)正式確認SARS病毒是傳染性非典型肺炎的病因。SARS病人的呼吸道切片和細胞培養(yǎng)物的電子顯微鏡照片顯示，存在冠狀病毒顆粒。這是一種新型的冠狀病毒，與冠狀病毒屬中其他已知的成員不同，該病毒可引起綠猴腎細胞(VERO-E6)發(fā)生病變效應，病毒復制能夠被SARS感染康復人的血清所抑制，可以利用感染的細胞和康復病人的血清進行免疫熒光檢測法(Immunofluorescence assays，IFA)檢測培養(yǎng)細胞中細胞感染有SARS病毒的情況，該方法表現(xiàn)出特異性的反應?；蚪M測序和生物信息學分析表明，SARS-CoV病毒主要含有以下功能蛋白聚合酶、穿刺(Spike，S)糖蛋白、小信封(E)蛋白、基質(M)蛋白、核衣殼(N)蛋白以及類3C(3CL)蛋白酶。本申請人在另一項專利申請CN03129067.1中公開了通過分子模擬獲得的SARS-CoV病毒3CL蛋白酶的三維結構，并以此為藥物作用靶標用虛擬篩選方法篩選了現(xiàn)有藥物數(shù)據(jù)庫。通過將紫錐松果菊提取物進行分子和病毒水平測試，發(fā)現(xiàn)其具有抑制SARS-CoV病毒3CL蛋白酶和抗SARS-CoV病毒活性，并用計算機模擬了其中主要成分和SARS-CoV病毒3CL蛋白酶的作用方式，從而促進了本發(fā)明的進行。
本發(fā)明的一個目的是提供紫錐松果菊提取物抗SARS-CoV病毒的新用途。
本發(fā)明的另一個目的是提供含紫錐松果菊提取物的抗SARS藥物組合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個方面是提供紫錐松果菊提取物抗SARS-CoV病毒的新用途。
1.計算機模擬紫錐松果菊提取物的主要成分和SARS-CoV病毒3CL蛋白酶的作用方式選擇3CLpro蛋白催化活性殘基H41和C145周圍6范圍內(nèi)的殘基組成底物結合口袋作為虛擬篩選的模型，結合口袋的表面圖見圖3。用分子對接(Molecular Docking)虛擬篩選(Virtual Screening)方法，將紫錐松果菊提取物中的咖啡酸衍生物如紫錐菊甙(echinocoside)、菊苣酸(cichoric acid)、菜薊菊(cynarin)對接到3CLpro蛋白的結合口袋。紫錐菊甙(echinocoside)、菊苣酸(cichoric acid)、菜薊菊(cynarin)與3CLpro蛋白結合方式見圖3。
2.紫錐松果菊粗提物的提取方法將植物紫錐松果菊的地上部分和根部用95％乙醇滲濾，回收乙醇。濃縮液用水混懸后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取。
3.病毒細胞水平的篩選以Vero-E6細胞作為病毒宿主細胞(易感細胞)，測試紫錐松果菊粗提物對病毒感染細胞的保護作用，檢測指標為細胞變性反應(CPE)以及觀察感染細胞保護率。結果表明紫錐松果菊粗提物有較明顯的抑制SARS-CoV病毒感染Vero-E6細胞的作用。
本發(fā)明的另一個方面是提供抗SARS藥物組合物，所述藥物組合物包含有效量的紫錐松果菊提取物和一種或幾種藥學上可接受的載體或賦形劑。
本發(fā)明的藥物組合物還可包含維生素C，其中紫錐松果菊提取物與維生素C的重量比為10∶1-1∶10。
本發(fā)明的藥物組合物可制成不同的劑型，例如口服劑型，如片劑、膠囊、乳劑、溶液等，也可制成制成固體分散片、脂質體制劑、靶向制劑和控釋制劑等?？诜┬椭械牡湫退幬镙d體或賦形劑包括乳糖；淀粉及其衍生物，如玉米淀粉、羧甲基淀粉鈉等；纖維素衍生物，諸如甲基和乙基纖維素；明膠；無機類化合物如輕質氧化鎂、滑石粉等；油，諸如植物油、芝麻油等；包合劑如β-環(huán)糊精；以及二元醇類如聚乙二醇。
在片劑中，本發(fā)明的藥物組合物可與碳酸氫鈉和酒石酸或枸櫞酸混合組成的崩解劑一起制成泡騰片，當遇水時產(chǎn)生二氧化碳氣體使片劑迅速崩解。
本發(fā)明的藥物組合物還可制成注射劑，所述注射劑中的典型藥物載體或賦形劑包括等滲鹽水、5％葡萄糖水溶液、注射用水、茶油、大豆油、麻油、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、苯甲酸芐酯、吐溫80、卵磷脂、脫氧膽酸鈉、蛋黃磷脂、聚乙烯吡咯烷酮、醋酸、醋酸鈉、枸櫞酸及鈉鹽、乳酸、酒石酸及鈉鹽、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、碳酸氫鈉和碳酸鈉、明膠、羧甲基纖維素鈉、果膠、山梨醇溶液、肌酐、甘氨酸、亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、焦亞磷酸鈉、硫代硫酸鈉、苯甲醇、對羥基苯甲酸丁酯及乙酯酚、三氯叔丁醇、腦磷脂、大豆磷脂等。注射制劑的典型形式為粉針劑、混懸型注射劑等。
本發(fā)明的藥物組合物也可制成氣霧劑，例如采用聚氯乙烯糊狀樹脂苯二甲酸二丁酯、苯二甲酸二辛酯、硬脂酸鈣、硬脂酸鋅等配制而成氣霧劑。
本發(fā)明藥物組合物的使用劑量和使用方法取決于諸多因素，包括患者的年齡、體重、性別、自然健康狀況、營養(yǎng)狀況、病癥的嚴重程度、服藥時間等。


圖1示出了紫錐松果菊提取物的親水性成分。式(1)為菊苣酸，式(2)為綠原酸，式(3)為紫錐菊甙。
圖2示出了紫錐松果菊提取物的親脂性成分。式(4)為十一碳-2E，4Z-二烯-8，10-二炔酸異丁酰胺，式(5)為十一碳-2Z，4E-二烯-8，10-二炔酸異丁酰胺，式(6)為十二碳-2E，4Z-二烯-8，10-二炔酸異丁酰胺，式(7)為十三碳-2Z，7Z-二烯-10，12-二炔酸異丁酰胺，式(8)為十二碳-2E，4Z-二烯-8，10-二炔酸甲基丁酰胺，式(9)為十二碳-2E，4E，8Z，10E-四烯酸異丁酰胺，式(10)為十二碳-2E，4E，8Z，10Z-四烯酸異丁酰胺，式(11)為十二碳-2E，4E，8Z-三烯酸異丁酰胺，式(12)為十一碳-2Z-烯-8，10-二炔酸異丁酰胺，式(13)為十一碳-2E-烯-8，10-二炔酸異丁酰胺。
圖3為計算機模擬紫錐松果菊提取物的主要成分與SARS-CoV病毒3CL蛋白酶的作用方式示意圖。(A)示出了CLpro蛋白和底物的結合模式；(B)-(D)分別示出紫錐菊甙(echinocoside)、菜薊菊(cynarin)和菊苣酸(cichoric acid)(CPK模型表示)契合在結合口袋中。
具體實施方案下面的實施例是對本發(fā)明進行說明的優(yōu)選實施方案，這些實施例絕不是對本發(fā)明的任何限制。
實施例1紫錐松果菊粗提物的提取方法將植物紫錐松果菊地上部分和根部用95％乙醇滲濾，回收乙醇。濃縮液用水混懸后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。
多糖的提取將植物紫錐松果菊地上部分和根部與0.1％-50％乙醇(w/w)混合，在20℃-80℃提取48小時-14天。將提取液液減壓濃縮，然后加入95％乙醇沉淀，過濾沉淀，真空干燥，得多糖粗提物。
富含烷基酰胺類化合物部位的提取將植物紫錐松果菊地上部分和根部與50％-90％乙醇(w/w)混合在4℃-85℃提取24小時-7天。將提取物減壓濃縮至干，加入20-30％乙醇攪勻，放置，析出葉綠素，過濾。減壓濃縮濾液，除去乙醇，用乙酸乙酯萃取水液，得富含烷基酰胺類化合物的部位。
富含菊苣酸等咖啡酸衍生物部位的提取將乙醇提取液減壓濃縮，除去乙醇，依次用氯仿和正丁醇萃取剩余水液，減壓濃縮正丁醇萃取液，得富含菊苣酸等咖啡酸衍生物的部位。
實施例2 紫錐松果菊提取物保護Veto-E6感染SARS-CoV病毒測試以Vero-E6細胞作為病毒宿主細胞(易感細胞)，測試樣品對病毒感染細胞的保護作用，檢測指標為細胞變性反應(CPE)以及感染細胞保護率。
把Vero-E6細胞接種于96孔培養(yǎng)板，置37℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)，分別加入SARS病毒和不同稀釋濃度的紫錐松果菊提取物，設病毒對照、細胞對照和樣品對照。每日鏡下觀察結果，記錄CPE，并用中性紅染色測定OD值，參照對照進行樣品抗SARS病毒活性作用的計算和評價。測試結果見表1。
表1.不同濃度紫錐松果菊粗提物對防止Vero-E6細胞感染SARS-CoV病毒的保護率濃度(μg/ml)CPE 感染細胞保護率100 + 2.2520 ++ 1.704 ++++ 0.85細胞病變法(CPE)以加號表示細胞病變程度，＜25％+，25％~50％++，50％~75+++，＞75％++++。
感染細胞保護率通過比較病毒對照、細胞對照和樣品對照的OD值，計算樣品對病毒感染細胞的保護活性，保護率＞1.5倍率，初步被認為樣品對病毒感染細胞具有一定的保護活性。
*樣品細胞毒性如果樣品的細胞毒性與細胞對照比＞50％時，不做CPE評價和保護率計算。
實施例3 計算機模擬紫錐松果菊提取物的主要成分和SARS-CoV病毒3CL蛋白酶的作用方式三維結構模建采用InsightII的MODELLER軟件，并用3D-Profile和Prostat軟件評價結構模型的質量。獲得復合物的初始結構，再用分子力學進行優(yōu)化，采用的力場參數(shù)到Amber力場和Kollman-all-atom電荷。用分子對接(Molecular Docking)虛擬篩選(Virtual Screening)方法，將紫錐松果菊的提取物中的咖啡酸衍生物如紫錐菊甙(echinocoside)、菊苣酸(cichoricacid)、菜薊菊(cynarin)對接到3CLpro蛋白的結合口袋(見圖3)。
實施例4 含紫錐松果菊提取物的藥物組合物制劑例例一紫錐松果菊提取物400克維生素C 400克羥丙基纖維素20克微粉硅膠60克預膠化淀粉 120克硬脂酸鎂 適量制成1000粒將紫錐松果菊提取物、維生素C、羥丙基纖維素和微粉硅膠混合均勻，用10％預膠化淀粉漿作為粘合劑，濕法制粒，烘干，加入適量硬脂酸鎂混合，壓制成片劑。
例二紫錐松果菊提取物 80克維生素C 720克羥丙基纖維素 20克微粉硅膠 48克乙醇 適量硬脂酸鎂 適量制成 900個將紫錐松果菊提取物、維生素C、羥丙基纖維素和微粉硅膠混合，用適量70％乙醇做濕潤劑，濕法制粒，過40目篩選成顆粒，烘干，加入硬脂酸鎂，混合，裝入硬膠囊。
例三紫錐松果菊提取物800克維生素C 400克蔗糖40克防腐劑 適量蒸餾水 適量制成20000ml
取蒸餾水適量，加入紫錐松果菊提取物，邊加熱邊攪拌使溶解，過濾，再加入維生素C。另將蔗糖和防腐劑用蒸餾水加熱溶解，在攪拌下緩緩加入上述溶液中，加蒸餾水至全量，混合，冷藏，過濾，灌封，滅菌，得口服液。
例四紫錐松果菊提取物2400克維生素C 400克吐溫80 適量注射用水適量制成45000ml取適量注射用水，加入紫錐松果菊提取物，加熱，攪拌使充分溶解，加入4％吐溫80，充分攪勻，過濾，加鹽酸調(diào)pH至6.8，再加入維生素C，加注射用水至足量，中空纖維超濾，精濾，灌封，滅菌，得注射液。
權利要求
1.紫錐松果菊提取物在制備抗SARS-CoV病毒感染的藥物上的用途。
2.抗SARS藥物組合物，包含有效量的紫錐松果菊提取物和一種或幾種藥學上可接受的載體或賦形劑。
3.如權利要求2所述的藥物組合物，其中還包含維生素C，紫錐松果菊提取物與維生素C的重量比為10∶1-1∶10。
4.如權利要求2或3所述的藥物組合物，所述藥物組合物是片劑、膠囊劑、口服液或注射劑。
全文摘要
本發(fā)明進行分子模擬紫錐松果菊提取物的主要成分和SARS－CoV病毒3CL蛋白酶的作用方式，測試紫錐松果菊提取物防止Vero－E6細胞受SARS－CoV感染的作用，揭示了紫錐松果菊提取物在制備抗SARS－CoV病毒感染的藥物上的新用途。本發(fā)明還提供抗SARS藥物組合物，所述藥物組合物包含有效量的紫錐松果菊提取物和一種或幾種藥學上可接受的載體或賦形劑，較佳地還包含維生素C，紫錐松果菊提取物與維生素C的重量比為10∶1－1∶10。
文檔編號A61P31/00GK1476836SQ0312924
公開日2004年2月25日 申請日期2003年6月10日 優(yōu)先權日2003年6月10日
發(fā)明者柳紅, 蔣華良, 趙維民, 左建平, 莊賢韓, 沈旭, 沈建華, 羅小民, 楊以阜, 陳凱先, 沈競康, 楊一鳴, 柳 紅 申請人:中國科學院上海藥物研究所, 上海先導藥業(yè)有限公司