專利名稱：源于hla相匹配的供體的激活的淋巴細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于預(yù)防和治療腫瘤、感染性疾病以及自身免疫性疾病的源于HLA相匹配的供體的激活的淋巴細(xì)胞，使用所述激活的淋巴細(xì)胞的治療方法，該淋巴細(xì)胞作為主要成分的制劑，生產(chǎn)該制劑的方法，以及用于制備該制劑的試劑盒。本發(fā)明的目的是更有效地治療及預(yù)防腫瘤，例如癌癥，以及感染性疾病。
背景技術(shù)：
近年來，淋巴細(xì)胞作為一種關(guān)鍵性的生物防御措施用于支持免疫系統(tǒng)，受到了廣泛的關(guān)注。T淋巴細(xì)胞在細(xì)胞介導(dǎo)免疫中起著極其重要的作用。根據(jù)它們的單克隆抗體的反應(yīng)性，對(duì)T淋巴細(xì)胞進(jìn)行以下分類，例如，顯示能與抗CD3抗體反應(yīng)的T淋巴細(xì)胞(CD是指“分化簇”)被分類為CD3陽(yáng)性細(xì)胞。到目前為止，已經(jīng)對(duì)T淋巴細(xì)胞進(jìn)行了重要的定量和定性研究，特別是關(guān)于所顯示的抗原與其功能之間的關(guān)系。
另外，本發(fā)明的發(fā)明人之一，Sekine先生，曾在日本的未經(jīng)審查的專利申請(qǐng)NO.H0380076中報(bào)道，通過使用固相抗CD3抗體(用淋巴細(xì)胞包被)和白介素-2能夠使淋巴細(xì)胞增殖。增殖得到的自體淋巴細(xì)胞具有顯著的抗腫瘤效果。另外，還有許多研究者也報(bào)道過，源于外周血等的淋巴細(xì)胞可以通過抗CD3抗體或白介素-2而得到增殖，所得到的自體淋巴細(xì)胞顯示具有抗腫瘤的活性。
而且，供體白細(xì)胞輸入(下文中簡(jiǎn)稱為“DLT”)以及供體淋巴細(xì)胞輸入(下文中簡(jiǎn)稱為“DLI”)是兩種較為成熟的治療方法，當(dāng)經(jīng)過骨髓移植的病人中自血病復(fù)發(fā)時(shí)，通過上述兩種方法引入大量的供體骨髓中的淋巴細(xì)胞。同時(shí)，近年來HLA相匹配母親和孩子之間所顯示的免疫耐受證實(shí)了微嵌合狀態(tài)的存在。因此目前從事了大量的研究工作，其目的是利用微嵌機(jī)制迅速地在病人中誘導(dǎo)緩解狀態(tài)，從而使器管移植更加安全。眾所周知，當(dāng)同胞之間產(chǎn)生微嵌合微嵌合時(shí)，同胞之間腎移植的成功率非常高。
然而，上述對(duì)T淋巴細(xì)胞以及誘導(dǎo)微嵌合狀態(tài)的研究仍然處于實(shí)驗(yàn)階段，目前還沒有將上述研究用于實(shí)踐的應(yīng)用技術(shù)。此外，不能通過簡(jiǎn)單地對(duì)收集到的自體淋巴細(xì)胞進(jìn)行增殖而始終確保其具有有效地抗腫瘤效果，特別是在癌癥中。還必須強(qiáng)調(diào)，在實(shí)施DLT治療中其相對(duì)比較困難。
根據(jù)每個(gè)白細(xì)胞所屬的白細(xì)胞群，即HLAs(人類白細(xì)胞抗原)，將白細(xì)胞分為許多不同的“基因座”。在這些基因座中，DQ，DP，A，B，C以及DR基因座在器官移植中是必須經(jīng)過仔細(xì)檢查的關(guān)鍵因素。這些基因座每個(gè)都是由兩個(gè)基因拷貝構(gòu)成，其中一個(gè)來源于父親，另一個(gè)來源于母親(等位基因)。而且每個(gè)基因座都具有多態(tài)性。因此，從廣義上來講，輸血，包括移植(例如外周血肝細(xì)胞移植)和DLT中，供體和病人中必須至少有四對(duì)HLA基因座相匹配，8個(gè)HLA分子之間的符合率是非常關(guān)鍵的因素。
在上述情況下，病人和供體的白細(xì)胞HLA完全相配幾乎不可能的。實(shí)際上，只要主要的HLAs相匹配，則就可以采用骨髓移植或輸血。然而，某個(gè)HLA不匹配將導(dǎo)致致死性的副作用，即病人在接受骨髓移植或DLT治療后，發(fā)生的致死性的輸血后移植物抗宿主疾病(下文簡(jiǎn)稱“PT-GVHD”)另外，由于在進(jìn)行器官移植或輸血前表現(xiàn)出器官疾病和感染性疾病，即使有HLA相匹配的供體，許多病人仍然不能進(jìn)行骨髓移植或輸血。對(duì)于那些不選擇進(jìn)行骨髓移植的癌癥患者，通過給予源于供體的淋巴細(xì)胞來嘗試對(duì)其進(jìn)行治療，但是仍未證實(shí)上述嘗試是非常有效的綜上所述，當(dāng)不選擇進(jìn)行骨髓移植時(shí)，自體(源自于病人的)淋巴細(xì)胞或源于供體的淋巴細(xì)胞的抗腫瘤效果并不令人滿意，而且到目前為止，它們的抗病毒效果以及對(duì)自身免疫性疾病的效果還不清楚。另外還有一個(gè)問題是，如果不寄希望于淋巴細(xì)胞供體的話，淋巴細(xì)胞不可能被大量地制備。再者，必須與造血干細(xì)胞移植結(jié)合進(jìn)行的DLI作為一種治療選擇有很大的限制，其原因是，如果病人不能進(jìn)行造血干細(xì)胞移植的話，DLI就不能進(jìn)行，同時(shí)，由于DLI必須結(jié)合干細(xì)胞移植進(jìn)行，其需要高的HLA符合率，因此，找到HLA相匹配的供體的可能性就非常低。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的發(fā)明人在研究具有高的抗腫瘤、抗病毒、抗自身免疫性疾病效果的源于供體的淋巴細(xì)胞及其制備方法方面作了大量的研究工作，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明涉及源于HLA相匹配的供體的激活的淋巴細(xì)胞，制備所述激活的淋巴細(xì)胞的方法，以及通過給予所述激活的淋巴細(xì)胞，治療HLA相匹配的患有腫瘤、病毒感染或自身免疫性疾病的病人，上述淋巴細(xì)胞作為主要成分的制劑，該制劑的生產(chǎn)方法，用于生產(chǎn)該制劑的試劑盒。所述淋巴細(xì)胞具有高的抗中瘤、抗病毒效果，同時(shí)其在治療自身免疫性疾病方面證實(shí)非常有效。通過收集HLA相匹配的供體外周血中的細(xì)胞，或收集源于能夠與病人發(fā)生微嵌合的HLA相匹配的供體外周血中的細(xì)胞，然后，例如，使用白介素-2，抗-CD3抗體或類似物刺激這些細(xì)胞并使它們?cè)鲋?，從而得到上述淋巴?xì)胞。
下文中將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。但是總的來說，本發(fā)明的特征在于，通過收集HLA相匹配的供體外周血中的細(xì)胞，或收集表現(xiàn)出微嵌合狀態(tài)的HLA相匹配的供體外周血中的細(xì)胞，然后刺激并增殖這些細(xì)胞，從而制備出源于HLA相匹配的供體的激活的淋巴細(xì)胞。
所收集的細(xì)胞可以通過使用，例如白介素-2和抗-CD3抗體，對(duì)其進(jìn)行多克隆的激活，從而刺激這些細(xì)胞并使它們?cè)鲋场４送?，用適當(dāng)?shù)目乖鹊玫骄哂锌乖禺愋缘腡淋巴細(xì)胞等，然后用CD3抗體、CD26抗體和例如白介素2的細(xì)胞因子中的一種或者上述物質(zhì)的組合得到具有抗原特異性的激活的淋巴細(xì)胞。另外，對(duì)所收集的源于HLA相匹配的供體的淋巴細(xì)胞進(jìn)行增殖和激活后，可以通過篩選而選擇具有抗原特異性的激活的淋巴細(xì)胞，或通過使用一種合適的抗原誘導(dǎo)源于HLA相匹配的供體的淋巴細(xì)胞，從而得到抗原特異性的淋巴細(xì)胞。
或者，具有抗原特異性的激活的淋巴細(xì)胞可以通過篩選上述的激活的淋巴細(xì)胞而選擇得到，或者，通過抗原刺激以增殖和激活淋巴細(xì)胞從而得到抗原特異性激活的淋巴細(xì)胞。在這種情況下，抗原特異性淋巴細(xì)胞可以源于CD8+細(xì)胞或CD4+細(xì)胞。除了提純的抗原外，癌細(xì)胞或病毒的提取物，癌細(xì)胞本身或病毒本身或任何與癌細(xì)胞或病毒細(xì)胞具有交叉反應(yīng)性的抗原物質(zhì)均可以用于上述目的。
在本發(fā)明的一個(gè)具體方式中，源于HLA相匹配的供體的激活的淋巴細(xì)胞用于預(yù)防或治療腫瘤，感染性疾病以及自身免疫性疾病。
此外，根據(jù)本發(fā)明，含有源于HLA相匹配的供體的激活的淋巴細(xì)胞的制劑用于預(yù)防或治療腫瘤，感染性疾病以及自身免疫性疾病。
而且，本發(fā)明提供了一種治療方法，該方法使用源于HLA相匹配的供體的激活的淋巴細(xì)胞或含有源于HLA相匹配的供體的激活的淋巴細(xì)胞的制劑，用于預(yù)防或治療腫瘤，感染性疾病以及自身免疫性疾病。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種制備試劑盒，該試劑盒用于制備激活的淋巴細(xì)胞，或一種至少將源于HLA相匹配的供體的淋巴細(xì)胞與白介素2相組合，從而激活淋巴細(xì)胞的制劑。另外，本發(fā)明提供一種制備試劑盒，該試劑盒用于制備激活的淋巴細(xì)胞，或一種至少將源于HLA相匹配的供體的淋巴細(xì)胞與抗CD3抗體相組合，從而激活淋巴細(xì)胞的制劑。
本發(fā)明提供一種方法，用于生產(chǎn)預(yù)防和治療腫瘤、感染性疾病以及自身免疫性疾病的制劑，該方法包括從含有源于HLA相匹配的供體的淋巴細(xì)胞的外周血中分離出單核細(xì)胞，在分離出的單核細(xì)胞中增殖并激活源于HLA相匹配的供體的淋巴細(xì)胞，提取增殖并激活的源于HLA相匹配的供體的淋巴細(xì)胞，并制備以所述淋巴細(xì)胞為主要成分的制劑。
具體實(shí)施例方式
以下將按步驟對(duì)本發(fā)明作出詳細(xì)地解釋(所收集的外周血類型)根據(jù)本發(fā)明，所收集的外周血必須是源于HLA相匹配的供體的外周血，較好是來源于顯示具有微嵌合狀態(tài)的HLA相匹配的供體。盡管所希望的是，所收集外周血與病人在HLA上完全相匹配以確保不發(fā)生GVHD所誘導(dǎo)的副作用，但是也可以收集與病人HLA部分相匹配的外周血。
例如，如果供體在4個(gè)A、B、C以及DR基因座中有1、2、3、或4個(gè)基因座與病人中的相應(yīng)基因座一致，則可以使用源于該供體的外周血。此外，如果供體4個(gè)基因座上的8個(gè)HLA基因中至少有兩個(gè)HLA基因與病人中相應(yīng)的基因一致，則可以使用該供體的外周血。然而，最好是8個(gè)HLA基因中有4個(gè)基因相互一致。
另外，使用源于顯示微嵌合狀態(tài)的HLA相匹配的供體的激活的淋巴細(xì)胞也同樣有效。盡管微嵌合狀態(tài)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域是熟知的概念，以下對(duì)其進(jìn)行簡(jiǎn)單的解釋，“微嵌合狀態(tài)”(源于他人的細(xì)胞以約1/1000的比例存在于體內(nèi)的狀態(tài))發(fā)生于壞孕時(shí)期，其間母親與胎兒通過胎盤相互交換少量細(xì)胞。
實(shí)際上，在妊娠婦女當(dāng)中一直能夠檢測(cè)到微嵌合狀態(tài)的發(fā)生。另外，即使在分娩以后，很多母親在一段時(shí)間內(nèi)一直有微嵌合狀態(tài)的發(fā)生。因此，其維持了對(duì)孩子的源于父親的HLAs的免疫耐受。通過該現(xiàn)象，在母親和孩子之間形成了免疫耐受三角。
因此，本發(fā)明的發(fā)明人通過研究確定，源于HLA相匹配的并具有微嵌合狀態(tài)的同胞的激活的淋巴細(xì)胞在預(yù)防和治療腫瘤，感染性疾病以及自身免疫性疾病方面是非常有效的。另外已經(jīng)證實(shí)，即使外周血的HLA基因不相匹配，只要顯示微嵌合狀態(tài)，也可以使用這樣的外周血，并且其安全性較高。
其意味著，只要有微嵌合狀態(tài)，源于沒有血源關(guān)系的陌生人的外周血，與源于父母、祖母、祖父、同胞、叔叔、阿姨、子女或?qū)O子的外周血一樣有效。應(yīng)注意的是，對(duì)于遺傳學(xué)上繼承父母HLAs的孩子，其HLA組成上的每一半與父母中的一方相一致，因此，他的HLAs有25％的可能與他的同胞是相匹配的。而與沒有任何血源關(guān)系的陌生人之間，其HLAs相配的幾率為幾百分之一至幾萬分之一，因此，在一般情況下，不能使用源于陌生人的淋巴細(xì)胞。然而，如果供體中達(dá)到微嵌合狀態(tài)，則供體的淋巴細(xì)胞可以作為制劑的原料。
此外，最好選擇與接受者的HLA組合具有排異傾向(work along a rejectivedirection)的供體。例如，當(dāng)HLA組合具有排異傾向時(shí)，供體A基因座可以包括A2和A24血清，接收激活的淋巴細(xì)胞的病人的A基因座可以包括A2和A2血清。由于病人的淋巴細(xì)胞能夠清除具有A24血清的供體的淋巴細(xì)胞，避免了嚴(yán)重的副作用，如GVHD。與A基因座一樣，B、C和DR基因座同樣能夠產(chǎn)生具有排異傾向的HLA組合。
(收集淋巴細(xì)胞)本發(fā)明的源于供體的激活的淋巴細(xì)胞，可以用供體的外周血制備。從供體臂上的靜脈中抽取血液簡(jiǎn)單易行，因此較好采用該方法。只要血液中含有淋巴細(xì)胞，對(duì)采集血液的位置沒有特別的限制。此外，也可以采用臍帶血中的淋巴細(xì)胞。只需要采集少量的外周血，其范圍在0.001毫升至500毫升之間。在實(shí)際應(yīng)用中，所采集的外周血量較好在大約10毫升至100毫升之間。
(對(duì)淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié))可以在收集的外周血中加入肝素或檸檬酸防止凝血。本發(fā)明的源于供體的激活的淋巴細(xì)胞可以如此獲得以所收集的外周血作為基礎(chǔ)材料，從外周血中得到淋巴細(xì)胞，然后通過孵育增殖并激活淋巴細(xì)胞。另外，本發(fā)明的激活的淋巴細(xì)胞也可以通過提取法或類似的方法從供體的骨髓中制得。需要注意的是，在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行解釋時(shí)，對(duì)所收集的淋巴細(xì)胞進(jìn)行“孵育”中的術(shù)語(yǔ)“孵育”是指通過將少量的細(xì)胞組織樣品放置于培養(yǎng)液中進(jìn)行人工增殖(孵育)組織細(xì)胞，培養(yǎng)液中含有細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)素。術(shù)語(yǔ)“增殖”是指在體外通過上述的孵育而人為地使組織細(xì)胞在數(shù)量上得到增長(zhǎng)。另外，術(shù)語(yǔ)“激活”是指施加的控制以激活某個(gè)靜止的功能，通過在培養(yǎng)液中加入增殖劑或激活劑從而刺激細(xì)胞，尤其是，施加的控制使細(xì)胞具有抗腫瘤、抗病毒以及抗自身免疫性疾病的特性。
(增殖和激活源于外周血的淋巴細(xì)胞)源于所收集的外周血的激活的淋巴細(xì)胞可以通過現(xiàn)有技術(shù)中的任一種淋巴細(xì)胞的孵育方法進(jìn)行增殖。對(duì)于所采用的孵育方法沒有特別的限制，例如日本的未審查專利申請(qǐng)NO.H3-80076中公開，使用白介素2或抗CD3抗體或兩者的組合以孵育激活的淋巴細(xì)胞。較好地，在白介素2和抗CD3抗體同時(shí)存在的情況下對(duì)淋巴細(xì)胞進(jìn)行孵育，從而達(dá)到更好的增殖效率。
除了上述利用白介素2和抗CD3抗體的對(duì)淋巴細(xì)胞進(jìn)行多克隆增殖/激活之外，也可以通過以下方法得到具有抗原特異性的激活的淋巴細(xì)胞，如前所述，首先利用適當(dāng)?shù)目乖犬a(chǎn)生抗原特異的T淋巴細(xì)胞等，然后使用CD3抗體，CD26抗體，各種促細(xì)胞分裂劑和細(xì)胞因子，例如白介素2之一或聯(lián)合使用上述物質(zhì)。
或者，抗原特異性的激活的淋巴細(xì)胞可以從實(shí)施方案中的激活的淋巴細(xì)胞進(jìn)行篩選而得到，也可以通過使用合適的抗原而得到，也可以通過抗原刺激，然后增殖并激活淋巴細(xì)胞而得到。在這種情況下，抗原特異性淋巴細(xì)胞可以從CD8+細(xì)胞或CD4+細(xì)胞中得到。
除了精制抗原外，癌細(xì)胞或病毒的提取物，癌細(xì)胞本身或病毒本身，或任何與癌細(xì)胞或病毒細(xì)胞具有交叉反應(yīng)性的抗原物質(zhì)均可以用于上述目的。只要上述任一種物質(zhì)具有增殖和激活淋巴細(xì)胞的功能都可以用于該過程中。此外，在該過程中使用的白介素2是一種可以在市場(chǎng)買到的商品，其必須是可以溶解的，能夠在孵育培養(yǎng)液中達(dá)到1-2000U/ml的濃度。
白介素2可以溶于和用于任何廣泛用于細(xì)胞孵育的培養(yǎng)液中，例如，水，生理鹽水，杜伯科氏(Dulbecco’s)磷酸緩沖鹽溶液，RPMI-1640，MDM，AIM-V。一旦白介素2溶于培養(yǎng)液中，該溶液必須冷凍保存，以確保白介素的活性不會(huì)降低。應(yīng)當(dāng)注意的是，對(duì)用于此目的的孵育培養(yǎng)液類型并沒有特別的限制，只要該培養(yǎng)液適用于孵育淋巴細(xì)胞。例如可以使用源于生物體的培養(yǎng)液，例如，血清，或在平衡鹽水中加入氨基酸、維生素、核酸堿基等而得到的合成培養(yǎng)基。較好的孵育培養(yǎng)液包括RPMI-1640、AIM-V、DMEM、IMDM。其中，特別優(yōu)選RPMI-1640。
盡管使用含有正常人血清的孵育培養(yǎng)液能夠更好地進(jìn)行增殖，但是也可以使用在市場(chǎng)上可以購(gòu)買到的培養(yǎng)液產(chǎn)品。此外，除了人類血清之外，還可以使用源于牛胚胎的血清。另外，可以使用不含血清的培養(yǎng)液?？梢圆捎萌魏纹毡閼?yīng)用的孵育方法進(jìn)行孵育，例如，在CO2孵育箱中進(jìn)行孵育。在這種情況下，CO2濃度較好維持在1-10％的范圍內(nèi)，更好地，在3-7％范圍內(nèi)，溫度維持在30-40℃，更好地，在35-38℃。
盡管對(duì)孵育的天數(shù)沒有特別的限制，但是其前提條件是，必須孵育足夠長(zhǎng)的時(shí)間以使源于抗CD3抗體的刺激信息能夠傳遞給細(xì)胞。因此，孵育時(shí)間較好持續(xù)約2-20天，較理想地是，孵育淋巴細(xì)胞3-14天，而使刺激物信息穩(wěn)定地傳遞給細(xì)胞，同時(shí)達(dá)到更好的孵育效率。更好地是，在孵育期間，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行顯微鏡觀察，必要時(shí)對(duì)細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)，并在需要時(shí)補(bǔ)充培養(yǎng)液，從而達(dá)到更好的孵育效率。
應(yīng)注意的是，在孵育開始后的1-2天之內(nèi)，觀察不到細(xì)胞數(shù)量發(fā)生明顯地增長(zhǎng)，在第3天左右首次觀察到細(xì)胞的增殖，一旦細(xì)胞數(shù)量開始激增，培養(yǎng)液的顏色將從橙色變成黃色。此外，相對(duì)于補(bǔ)充前的培養(yǎng)液的量，應(yīng)以約10％-500％的比率補(bǔ)充培養(yǎng)液。而且，培養(yǎng)液應(yīng)每1-7天補(bǔ)充一次，更好地是，每3-5天補(bǔ)充一次，以防止培養(yǎng)液發(fā)生降解，并維持白介素2的活性水平。
而且，當(dāng)在抗CD3抗體存在的環(huán)境下進(jìn)行的孵育結(jié)束時(shí)，孵育過程可以在沒有抗CD3抗體刺激的情況下繼續(xù)進(jìn)行。也就是說，可以使用固相中不含有抗CD3抗體的設(shè)備，例如，孵育瓶，滾瓶，孵育透氣包繼續(xù)進(jìn)行孵育，直至給予淋巴細(xì)胞。
當(dāng)按照如前所述對(duì)淋巴細(xì)胞進(jìn)行繼續(xù)孵育時(shí)，其孵育條件必須與抗CD3抗體影響下的初始孵育條件一致，除了第二次孵育不需要有抗CD3抗體的刺激。為了更加容易操作，具有更好的性能價(jià)格比以及更加安全，較好地是，調(diào)節(jié)人類血清的濃度，或必要時(shí)使用不含血清的培養(yǎng)液。
將含有白介素2的孵育培養(yǎng)液和臍帶血或懸浮于其中的單核細(xì)胞放于孵育容器中時(shí)，孵育過程開始，其中孵育容器的固相中含有抗CD3抗體。在這種情況下，必要時(shí)在培養(yǎng)液中加入不同的細(xì)胞因子或促細(xì)胞分裂劑，進(jìn)一步提高增殖和激活淋巴細(xì)胞的效率。應(yīng)注意的是，盡管在動(dòng)物或細(xì)胞中使用經(jīng)提純的CD3分子能夠產(chǎn)生刺激淋巴細(xì)胞的抗CD3抗體，但是也可以使用市場(chǎng)上銷售的、具有良好穩(wěn)定性和性能價(jià)格比的OKT-3抗體(生產(chǎn)者Orthopharmaceutical)。
然而，只要能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖和激活，對(duì)于所使用的刺激淋巴細(xì)胞的抗體類型沒有任何限制。例如抗CD20抗體可以取代抗CD3抗體。此外，為了得到更好的增殖淋巴細(xì)胞的效率，同時(shí)更加容易操作，較好使用固相抗CD3抗體。抗體可以用在由玻璃、聚亞胺酯、聚烯烴或聚苯乙烯構(gòu)成的孵育容器的固相中。市售的、較易得到的、經(jīng)消毒的由塑料等構(gòu)成的細(xì)胞培養(yǎng)瓶可以用于此目的。在這種情況下，可以選擇適宜大小的培養(yǎng)瓶。
另外，通過在容器中加入抗CD3抗體的稀釋液，然后在4-37℃的溫度下，使該容器靜置2-24小時(shí)，可以將抗體導(dǎo)入固相中。較好的是，當(dāng)將抗CD3抗體處理至固相中時(shí)，抗CD3抗體應(yīng)該用生理緩沖液稀釋至濃度為0.1-30μg/ml，例如，經(jīng)消毒的Dulbecco’s磷酸緩沖鹽溶液。當(dāng)固相制成后，抗CD3抗體可貯存在冷藏室或冰箱中(4℃)直至使用。在這種情況下，在使用時(shí)取出液體，用生理緩沖液，例如Dulbecco’s磷酸緩沖鹽溶液，在室溫下進(jìn)行沖洗從而得到供使用的抗CD3抗體。
所得到的源于供體外周血中的激活的淋巴細(xì)胞可以加工或制備成制劑，該制劑作為一種生物防御措施在預(yù)防/治療腫瘤和感染性疾病中具有廣泛的應(yīng)用。此外，含有CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞的源于供體外周血中的激活的淋巴細(xì)胞具有更好的抗腫瘤效果。
此外，如果存在有發(fā)生GVHD等副作用的風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，所得到的源于外周血的激活的淋巴細(xì)胞可以用抗CD4抗體等進(jìn)行處理，從而得到治療中所使用的、其主要成分為CD4+細(xì)胞的細(xì)胞群。另一方面，當(dāng)副作用例如GVHD的風(fēng)險(xiǎn)很低時(shí)，或者需要更高的抗腫瘤效果時(shí)，可以在治療中直接使用含有CD8+細(xì)胞的源于外周血的激活的淋巴細(xì)胞。在后一種情況中，激活的淋巴細(xì)胞可以作為一個(gè)細(xì)胞群用于治療中，其中CD8+細(xì)胞的含量被調(diào)節(jié)到適當(dāng)?shù)乃缴稀?br> (源于外周血的激活的淋巴細(xì)胞為主要成分的制劑)從外周血獲得的源于HLA相匹配的供體的激活的淋巴細(xì)胞，其中的主要成分為增殖的外周血細(xì)胞，可以制備成制劑，例如將其懸浮于含有人白蛋白的生理鹽水中從而制備成制劑，該制劑用作輸液。所制成的制劑用于預(yù)防和治療腫瘤以及感染性疾病。應(yīng)注意的是，此處術(shù)語(yǔ)“制劑”是指以激活的淋巴細(xì)胞為主要成分的具有生物防御性功能的所有物質(zhì)。該制劑可以為任何形態(tài)，只要其含有源于HLA相匹配的供體的激活的淋巴細(xì)胞，該淋巴細(xì)胞來自于供體的外周血。
例如，該制劑的形式可以為，源于外周血的HLA相匹配的激活的淋巴細(xì)胞懸浮于適當(dāng)?shù)娜芤褐小５^好的制劑形式為上述的將源于外周血的激活的淋巴細(xì)胞懸浮于含有人白蛋白的生理鹽水中而制成，該制劑作為輸液用。但是本發(fā)明并不僅僅局限于此。此外，可以通過在試管內(nèi)直接增殖外周血來制備制劑，其中源于外周血的激活的淋巴細(xì)胞為其主要成分，或者，首先從外周血中分離出單核細(xì)胞，然后在試管內(nèi)增殖分離出的單核細(xì)胞從而得到該制劑，其中源于外周血的激活的淋巴細(xì)胞為該制劑的主要成分。
而且，可以將不同的基因引入到包含在本發(fā)明制劑中的源于外周血的激活的淋巴細(xì)胞中，或者，刪除或修飾原先存在于該激活的淋巴細(xì)胞中的任一基因。去除了其中的人類免疫缺陷病毒感染的輔助因子，該源于外周血的激活的淋巴細(xì)胞可以用于預(yù)防/治療由病毒感染所引起的人類免疫缺陷疾病，或預(yù)防/治療在免疫缺陷情況下所患有的感染性疾病，其中免疫缺陷狀態(tài)是由人類免疫缺陷病毒所引起的。
以如上面所述從外周血中收集得到的源于HLA相匹配的供體的激活的淋巴細(xì)胞為主要成分的制劑在臨床上有廣泛應(yīng)用，可用于預(yù)防和治療癌癥患者、免疫缺陷患者、自身免疫性疾病患者、患有需要輸入臍帶血的疾病的患者，例如患有變態(tài)反應(yīng)性疾病的患者，以及患有各種感染性疾病的患者。本發(fā)明中的制劑在預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)的同時(shí)，也能治療腫瘤，其也可以用于治療白血病和各種實(shí)體腫瘤。
而且，按照如上所述使用該制劑預(yù)防或治療腫瘤，還可以提高病人的生活質(zhì)量(QOL)。也就是說，例如，如果某種抗癌藥引起慢性的腎臟或肝臟疾病，或者由于手術(shù)給該病人留下了永久性的疤痕，即使該病人所患的疾病本身得到了治愈，上述治療的副作用或類似情況常常會(huì)降低病人的生活質(zhì)量。然而，通過使用本發(fā)明中的制劑對(duì)病人進(jìn)行治療，病人的生活質(zhì)量將得到顯著地改善。
本發(fā)明中的以源于HLA相匹配的供體的激活的淋巴細(xì)胞為主要成分的制劑，對(duì)于治療各種類型的癌癥和腫瘤，免疫缺陷性疾病，各種類型的感染是非常有效的。上述疾病將在下文中詳細(xì)描述。具體地說，在治療肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、直腸癌、腎癌、胰腺癌、膽囊癌、卵巢癌、子宮癌、睪丸癌、前列腺癌、白血病、肉瘤和腦瘤具有明顯的療效。同時(shí)對(duì)于治療先天性和獲得性免疫缺陷疾病方面也是非常有效的。
先天性免疫缺陷疾病包括嚴(yán)重的聯(lián)合免疫缺陷癥，Wiscott Aldrich綜合征，腺苷脫氨酶缺陷，嘌呤核苷磷酸化酶缺陷，高IgM綜合征，聯(lián)合免疫缺陷癥。本發(fā)明中的制劑可以治療上述這些疾病之外的免疫缺陷疾病。此外，獲得性免疫缺陷疾病的典型例子包括由于使用抗癌藥、免疫抑制劑或類固醇所引起的繼發(fā)性免疫缺陷，感染人類免疫缺陷病毒而導(dǎo)致的AIDS。本發(fā)明中的制劑可以用于治療這些疾病之外的免疫缺陷疾病。
另外，可以用本發(fā)明中制劑進(jìn)行治療的自身免疫性疾病的典型例子包括，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，慢性關(guān)節(jié)風(fēng)濕病，干燥綜合征，重癥肌無力，惡性貧血，橋本氏病。同時(shí)還可以治療上述以外的自身免疫性疾病。本發(fā)明中的制劑可以作為一種預(yù)防性或治療性的措施用于治療整體免疫能力較低的病人，也可以用來治療那些對(duì)某種病毒或類似物沒有免疫能力或者免疫能力較低的病人?？梢杂帽景l(fā)明中的制劑進(jìn)行治療的變態(tài)反應(yīng)性疾病包括支氣管哮喘、雪松花粉過敏、蕁麻疹，同時(shí)本發(fā)明中的制劑還可以治療其它的變態(tài)反應(yīng)性疾病。本發(fā)明中的制劑還可以用于減輕各種變態(tài)反應(yīng)性疾病的癥狀。
可以用本發(fā)明中的制劑進(jìn)行治療的感染性疾病包括病毒感染、微生物感染、真菌感染、原蟲感染、衣原體感染、支原體感染。在上述疾病中，病毒感染包括巨細(xì)胞病毒感染，愛波斯坦—巴爾(Epstein-Barr)病毒感染。此外，本發(fā)明的制劑并不局限于對(duì)這幾種病毒感染的治療，其在預(yù)防和治療其它各種病毒感染中具有廣泛的應(yīng)用，例如皰疹病毒，包括單純皰疹病毒、水痘—帶狀皰疹病毒，包括人類白血病病毒和人類免疫缺陷病毒的各種逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒以及柯薩奇病毒。
可以用本發(fā)明中的制劑進(jìn)行治療的微生物感染包括綠膿桿菌引起的感染，耐新青霉素的金黃色葡萄球菌引起的感染。本發(fā)明中的制劑也可以用于治療由對(duì)人類具有病原性的細(xì)菌所引起的感染性疾病。特別是，本發(fā)明中的制劑可以有效地預(yù)防和治療由不明病原體所引起的感染性疾病，以及由不容易確定的病原體所引起的感染性疾病，或有效地預(yù)防和治療由上述感染所導(dǎo)致的疾病。
之前所描述的微嵌合狀態(tài)可以通過PCR(聚合酶鏈反應(yīng))分析很容易地檢測(cè)出來。例如，當(dāng)測(cè)量HLA-A基因座上A-24的微嵌合狀態(tài)時(shí)，首光用HLA-A基因座引物放大反應(yīng)，使用一個(gè)A-24引物進(jìn)行嵌套式(mested)PCR反應(yīng)，然后用適當(dāng)?shù)臋z測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)是否存在微嵌合狀態(tài)，以便確定微嵌合狀態(tài)的存在/缺乏。
(用于制備制劑的制備試劑盒，其中制劑的主要成分是源于外周血的激活的淋巴細(xì)胞)盡管本發(fā)明中源于HLA相匹配的供體的激活的淋巴細(xì)胞可以作為一種單獨(dú)的試劑，其還可以與含有白介素2的培養(yǎng)液，含有固相抗CD3抗體的燒瓶一起，制備在同一個(gè)試劑盒中。在后面一種情況下，使用該試劑盒可以非常容易地制備出本發(fā)明中的制劑。
應(yīng)注意的是，可以將適量的用于制備制劑的培養(yǎng)液事先倒入用固相抗CD3抗體包被的各個(gè)燒瓶中，然后將這些燒瓶放于冰箱中冷凍貯存。將激活的淋巴細(xì)胞以及至少兩種如上所述的試劑制備于同一試劑盒中，在需要激活的淋巴細(xì)胞時(shí)，可以很容易地通過該試劑盒而制備出本發(fā)明中的制劑。由外周血或含有上述激活的淋巴細(xì)胞的制劑所制備而成的、可用于本發(fā)明所有用途的源于HLA相匹配的供體的激活的淋巴細(xì)胞可以冷凍保存于冰箱中，這樣就可以隨時(shí)用于預(yù)防和治療各種疾病。
(劑量)盡管應(yīng)根據(jù)具體病人的狀態(tài)或具體治療目標(biāo)調(diào)整制劑的劑量，其中制劑的主要成分為從外周血制備成的源于HLA相匹配的供體的激活的淋巴細(xì)胞，在正常情況下，該制劑的標(biāo)準(zhǔn)劑量為每公斤體重1×102-1×109個(gè)淋巴細(xì)胞。此外，為了進(jìn)一步增強(qiáng)效果，劑量較好為每公斤體重1×103以上的淋巴細(xì)胞。但是，一旦劑量超過每公斤體重5×108個(gè)淋巴細(xì)胞，其效果就再也不能增加。因此，最佳的劑量范圍為每公斤體重1×103-5×108個(gè)淋巴細(xì)胞。
(給藥方式和方法)應(yīng)以液體形式給予上述制劑，即，注射或滴注。更具體地說，較好地以注射液或滴注液的形式給予如上文所述制備而成的細(xì)胞，在該注射液或滴注液中，上述細(xì)胞分散于生理鹽水中，其中生理鹽水中含有濃度為0.01-5％的人血清白蛋白。應(yīng)以靜脈滴注、靜脈注射、動(dòng)脈注射或局部注射的方式給予該制劑。應(yīng)根據(jù)給藥方法、給藥部位等對(duì)所給予的溶液量進(jìn)行調(diào)整，但是在正常情況下，較好給予1-500ml的溶液，同時(shí)，確保溶液中含有前述需要量的淋巴細(xì)胞。此外，給藥的頻率為一天一次至一月一次，所述淋巴細(xì)胞應(yīng)至少給予一次以上。
(實(shí)施例1)第一步，(采集血液和分離淋巴細(xì)胞)向注射器中添加肝素，從與急性淋巴細(xì)胞白血病患者HLA完全相匹配的供體的靜脈中采集20ml外周血，然后在無菌條件下的清潔工作臺(tái)上，從注射器上拔出針頭，換上19G×11/2″的注射針頭。事先向兩個(gè)50ml離心管(制造商Iwaki玻璃有限公司，2341-050)中分別注入15ml洗液(RPMI 1640+6)(500ml，制造商N(yùn)ikken生物醫(yī)學(xué)研究中心，GM1106)。然后，用培養(yǎng)液稀釋所收集到的血液從而將溶液量增加至三倍。緩慢地將所得到的全部混合液倒入上述兩個(gè)離心管中，從而使兩管中所倒入的混合液量恰好相等。
蓋好離心管的蓋子，翻轉(zhuǎn)并振蕩兩到三次，用10ml的吸管吸取3mlLymphocepar 1(100ml，制造商免疫生物研究中心有限公司，23010)并分別注入6個(gè)15ml的離心管中。然后，為了不破壞每個(gè)離心管中所形成的液體表面，緩慢地將10ml已經(jīng)用培養(yǎng)基稀釋的血液注入每個(gè)離心管中，并分層位于Lymphocepar 1上面。離心管在離心溫度為20℃，轉(zhuǎn)速為1800rpm的條件下離心15分鐘。
離心過程結(jié)束后，在無菌條件下，用吸出器緩慢地吸出每個(gè)離心管中的內(nèi)容物，并使液面降至淋巴細(xì)胞層上面約1cm的地方，以防止將淋巴細(xì)胞吸出。然后，用5ml的移液管吸出淋巴細(xì)胞層，而不吸出血液凝結(jié)層，然后將吸出的淋巴細(xì)胞層收集到事先已經(jīng)注入25ml洗液(RPMI 1640+6)的50ml離心管中。蓋好蓋子，反復(fù)倒置離心管，進(jìn)行輕微的振蕩和混合。再次將離心管放入離心機(jī)中，在溫度為20℃，轉(zhuǎn)速為1800rpm的條件下離心10分鐘。
離心后，將上清液去除，使細(xì)胞沉淀物完全分散開來，并進(jìn)行攪拌。測(cè)定完細(xì)胞數(shù)目之后，將細(xì)胞以0.5×106/ml的濃度懸浮于PBS中。細(xì)胞與DynabeadsCD4(進(jìn)口商/銷售商Veritas)以1∶4的細(xì)胞/珠比例相混合，并放入15ml體積的離心管中?；旌臀镌?℃下孵育30分鐘。將磁鐵(進(jìn)口商/銷售商Veritas)置于離心管的外壁上，從而收集與Dynabeads CD4結(jié)合的CD4陽(yáng)性細(xì)胞。沒有與Dynabeads CD4結(jié)合的細(xì)胞在無菌條件下用吸出器吸出。
然后將與Dynabeads CD4結(jié)合的細(xì)胞放于振蕩攪拌器中使其完全分散開來。通過反復(fù)地倒置，輕輕地將其與50ml的孵育培養(yǎng)液進(jìn)行混合。所述孵育培養(yǎng)液制備如下將1ml濃度為3500U/ml的白介素-2(制造商Cetus)以及5ml人類血清加到44ml培養(yǎng)液中(RPMI 1640+7，制造商免疫生物研究中心有限公司)，制備細(xì)胞懸浮液。
將10μl細(xì)胞懸浮液放入試管(進(jìn)口商/銷售商Assist有限公司，72.690)中，然后將懸浮液與40μl Türk溶液相混合。取10μl混合液放入血球計(jì)上(制造商Elmer公司，9731)，在顯微鏡下觀察細(xì)胞的數(shù)目。細(xì)胞的總數(shù)量為1.0×107～7.0×107。
第二步(制備用OKT3包被的燒瓶)將10ml用PBS(-)稀釋的濃度為5μg/ml的OKT3溶液(進(jìn)口商/銷售商Jansen Kyowa有限公司，制造商OrthopharmaceutialOKT3注射液)加入到基底面積為225cm2的培養(yǎng)瓶中，并使瓶底部被溶液均勻覆蓋。
第二天，用吸出器將燒瓶中的OKT3溶液吸出，然后將50ml PBS(-)注入燒瓶中。蓋好蓋子均勻搖晃燒瓶，然后打開蓋子，將其中的液體倒出。然后，在無菌狀態(tài)下，將50ml PBS(-)注入燒瓶中，蓋好蓋子均勻搖晃燒瓶，然后打開蓋子，將其中的液體倒出。留在燒瓶?jī)?nèi)部以及蓋子上的水分要用吸出器完全吸凈，這樣用OKT3包被的燒瓶就制備好了。
第三步(淋巴細(xì)胞的激活孵育)將50ml上述第一步(采集血液和分離淋巴細(xì)胞)中所制備的細(xì)胞懸浮液注入第二步(制備用OKT3包被的燒瓶)中所制備的用OKT3包被的燒瓶中，然后在37℃下孵育，環(huán)境中CO2氣體的濃度為5％。三天后，向燒瓶中加入50ml的孵育培養(yǎng)液，并在37℃下孵育，環(huán)境中CO2氣體的濃度為5％。四天后，向燒瓶中加入150ml的孵育培養(yǎng)液，并在37℃下孵育，環(huán)境中CO2氣體的濃度為5％。最后一次補(bǔ)充培養(yǎng)液后，在37℃下孵育兩天，環(huán)境中CO2氣體的濃度為5％。最后，得到了2.0×108～7.0×108個(gè)激活的淋巴細(xì)胞。
第四步(淋巴細(xì)胞的增殖孵育)將上述第三步(淋巴細(xì)胞的激活孵育)中所制備的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含750ml的LL-7(Nikken生物化學(xué)研究中心)培養(yǎng)液的透氣性孵育包中，然后在CO2孵育箱(CDP-300A；Hirasawa有限公司)中孵育上述經(jīng)轉(zhuǎn)移的淋巴細(xì)胞，其中溫度為37℃，CO2氣體的濃度為5％。
四天后，用一無菌接合裝置(制造商Terumo)將含有細(xì)胞的透氣性孵育包(制造商N(yùn)ipro culture bag A-1000)與另外一個(gè)包含新的培養(yǎng)液的透氣性孵育包接合起來，并使兩個(gè)透氣性孵育包中的培養(yǎng)液均勻混合。然后，切斷兩個(gè)孵育包之間的連接，并對(duì)接合部位進(jìn)行無菌性的密封。在37℃，CO2氣體濃度為5％的條件下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行孵育。
第五步(制備供給藥的制劑)三天后，將兩個(gè)透氣性孵育包中的含有細(xì)胞的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至250ml的離心管中。通過離心分離出細(xì)胞。接著，通過傾注法除去培養(yǎng)液，在細(xì)胞沉淀中加入生理鹽水使細(xì)胞重新懸浮起來，并進(jìn)行離心洗滌。隨后，用含有人類白蛋白的生理鹽水代替上述的生理鹽水進(jìn)行類似的洗滌，其中白蛋白的濃度為0.1％，這樣就對(duì)細(xì)胞沉淀進(jìn)行了調(diào)節(jié)。
接下來，向細(xì)胞沉淀中加入200ml含2％人類白蛋白的生理鹽水，從而使細(xì)胞懸浮起來。然后用100μm的不銹鋼網(wǎng)過濾該懸浮液。將得到的制劑轉(zhuǎn)移至輸血袋中以供施用。需要指出的是，轉(zhuǎn)移至輸血袋的細(xì)胞的數(shù)目為0.5～10×109。
第六步(制劑的冷凍保存)必須指出的是，必要時(shí)，上述第五步(制備供給藥的制劑)中所制備的激活的淋巴細(xì)胞可以冷凍保存在冰箱中。下面對(duì)將制劑冷凍保存在冰箱中的具體實(shí)施方案進(jìn)行解釋。對(duì)上述第五步(制備供給藥的制劑)中所制備的激活的淋巴細(xì)胞進(jìn)行離心分離，通過傾注的方法將孵育培養(yǎng)液除去，從而得到細(xì)胞沉淀。然后向細(xì)胞沉淀中加入18ml細(xì)胞保存液(將5ml人類血清和5ml二甲亞砜(制造商N(yùn)akaraitesky，在此簡(jiǎn)稱為DMSO)混合而制備得到)和40ml細(xì)胞培養(yǎng)液(RPMI 1640+7)。將細(xì)胞沉淀和保存液進(jìn)行均勻地混合，然后向5個(gè)5ml的細(xì)胞保存管(5×107個(gè)細(xì)胞/管)中分別注入3ml混合物。然后將這些保存管放于超低溫度的冰箱中，并在-80℃下保存。
另外，使用時(shí)冷凍的細(xì)胞必須解凍并使其溶解，首先將冷凍的細(xì)胞從冰箱中取出，然后用37℃的加熱塊(制造商Titek公司，TAL-IG)加熱4分鐘。在無菌條件下取出約3ml含有細(xì)胞的細(xì)胞保存液解凍，使其溶解，然后放入15ml的離心管中，加入10ml培養(yǎng)液使細(xì)胞懸浮于液體中，然后通過離心使細(xì)胞分離(速度1000rpm，溫度20℃，時(shí)間5分鐘)。隨后，通過傾注法將上清液除去，采用如上1～4所述的方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行孵育，采用上述第五步(制備供給藥的制劑)所述的方法制備供給藥的制劑。我們也可以通過用生理鹽水沖洗經(jīng)解凍和溶解的細(xì)胞，然后添加10ml含有5％人類血清的生理鹽水使細(xì)胞懸浮于液體中，從而制備上述供使用的制劑。
第七步(制劑的給藥)對(duì)于尚未進(jìn)行造血干細(xì)胞移植的急性淋巴細(xì)胞白血病患者，通過靜脈注射上述第五步(制備供給藥的制劑)中所制備的制劑或者如上述第六步(制劑的冷凍存儲(chǔ))中的保存在冰箱中的制劑。對(duì)于顯示對(duì)各種化療藥物具有耐藥性的急性白血病患者，以及通過化療并沒有達(dá)到緩解狀態(tài)的急性白血病患者，應(yīng)給藥30次。每次注射1.7×108～4.2×109個(gè)細(xì)胞，每隔幾天至每隔12天給藥一次(通常是每隔7天給藥一次)。
第八步(效果的評(píng)價(jià))當(dāng)病人在輸入源于HLA相匹配的供體的激活的淋巴細(xì)胞之前所進(jìn)行的各種化療被證實(shí)無效，而且白血病細(xì)胞數(shù)量增加的時(shí)侯，給予病人源于HLA相匹配的供體的激活的淋巴細(xì)胞之后，能觀察到以下效果(1)白血病細(xì)胞沒有明顯的增加，相反觀察到有減少的趨勢(shì)(抗腫瘤效果)；(2)在治療過程中病人沒有發(fā)生嚴(yán)重的感染，可以觀察到中性粒細(xì)胞增加(給藥后以500/μl或更高的速率增加)(抗感染性疾病的效果)；以及(3)在治療初期，病人的痛苦減少(提高了病人的生活質(zhì)量以及抗自身免疫性疾病的效果)。
因此，可以證實(shí)，源于HLA相匹配的供體的激活的淋巴細(xì)胞對(duì)于腫瘤、感染性疾病以及自身免疫性疾病來說，是一種有效的預(yù)防和治療手段，并且可以提高病人的生活質(zhì)量。另外，用源于HLA相匹配的供體的激活的淋巴細(xì)胞進(jìn)行治療幾乎沒有觀察到任何副作用，也沒有觀察到GVHD癥狀或者高燒等。
(實(shí)施例2)如實(shí)施例1制備激活的淋巴細(xì)胞，不同之處在于外周血取自顯示與急性髓細(xì)胞性白血病患者具有微嵌合狀態(tài)的血親(與病人有2個(gè)HLA基因座相匹配)。如實(shí)施例1制備供給藥的制劑，向尚沒有進(jìn)行造血干細(xì)胞移植的急性髓細(xì)胞白血病患者靜脈注射該制劑，該制劑只給藥一次。給藥后三天，觀察到病人外周血中的白血病細(xì)胞減少，七天以后，病人外周血中的白血病細(xì)胞完全消失。因此，可以證實(shí)，源于有微嵌合狀態(tài)的供體的激活的淋巴細(xì)胞具有抗腫瘤效果。
(實(shí)施例3)如實(shí)施例1制備激活的淋巴細(xì)胞，不同之處在于外周血取自顯示與腎癌患者有微嵌合狀態(tài)的血親(與病人有2個(gè)HLA基因座相匹配)。如實(shí)施例1制備供給藥的制劑，向腎癌患者靜脈注射該制劑，共給藥三次，每月一次。第一次給藥兩個(gè)星期后，觀察到腎癌部分減小，第三次給藥兩個(gè)星期后，腎癌完全消失。因此，可以證實(shí)，源于有微嵌合狀態(tài)的供體的激活的淋巴細(xì)胞有抗腫瘤效果。
如上實(shí)施例所述，激活的淋巴細(xì)胞作為腫瘤、病毒感染和自身免疫性疾病的預(yù)防和治療措施，是非常有效的。所述激活的淋巴細(xì)胞可以通過以下方法獲得，收集并激活HLA相匹配的供體的淋巴細(xì)胞，然后用白介素-2和抗-CD3抗體等來刺激并增殖。此外也明確證實(shí)，源于HLA相匹配的供體的激活的淋巴細(xì)胞對(duì)于抗腫瘤、感染性疾病以及自身免疫性疾病是有效的，同時(shí)在提高病人的生活質(zhì)量上也是有效的。源于HLA相匹配的供體的激活的淋巴細(xì)胞作為腫瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病的預(yù)防和治療措施，是非常有效的。
另外，源于HLA相匹配的供體的激活的淋巴細(xì)胞幾乎沒有任何不良的副作用，也沒有觀察到GVHD癥狀或者高燒等的發(fā)生。
另外，本發(fā)明不僅可以用于治療諸如癌癥等腫瘤以及各種感染性疾病，防止腫瘤的復(fù)發(fā)以及預(yù)防腫瘤和感染性疾病，也可以用于提高病人的生活質(zhì)量，這是通過減輕惡病質(zhì)以及改善病人的食欲而達(dá)到的。本發(fā)明的制劑可以作為一種預(yù)防性和治療性措施，用于治療白血病以及實(shí)體腫瘤。
特別是，將本發(fā)明與另外的治療方法，例如化療或放射療法，相結(jié)合，或者是將本發(fā)明與其他的免疫療法相結(jié)合，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)可以進(jìn)一步增強(qiáng)。另外，本發(fā)明也可以改善接受造血干細(xì)胞移植前病人的身體狀況。
另外，通過以下途徑可以大大地提高淋巴細(xì)胞激活的穩(wěn)定性及其效率至少用白介素2和抗-CD3抗體中的一種來激活源于HLA相匹配的供體的激活的淋巴細(xì)胞；用適當(dāng)?shù)目乖鹊玫骄哂锌乖禺愋缘腡淋巴細(xì)胞等，然后用CD3抗體、CD26抗體或例如白介素2的細(xì)胞因子之一或者上述物質(zhì)的組合得到抗原特異性的激活的淋巴細(xì)胞；或者，對(duì)用某一抗原刺激物從CD8陽(yáng)性細(xì)胞或者CD4陽(yáng)性細(xì)胞得到的抗原特異性淋巴細(xì)胞進(jìn)行增殖并激活，從而得到具有抗原特異性的激活的淋巴細(xì)胞。然后，制備用于預(yù)防和治療腫瘤、各種感染性疾病以及自身免疫性疾病的包含激活的淋巴細(xì)胞的制劑，該制劑容易制備，并且方便給藥。在該意義上，本發(fā)明對(duì)于再生醫(yī)藥領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展具有很大的貢獻(xiàn)。
以懸浮液的形式制備含有經(jīng)增殖并激活的淋巴細(xì)胞的制劑，其中所述淋巴細(xì)胞懸浮于含有人類白蛋白的生理鹽水中，則給藥時(shí)，有效激活的淋巴細(xì)胞數(shù)目減少的程度就會(huì)降低。
另外，確保供給藥的源于HLA相匹配的供體的激活的淋巴細(xì)胞中含有具有排異傾向的HLAs，發(fā)生GVHD的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)進(jìn)一步降低。
使用從存在微嵌合狀態(tài)的供體中所收集得到的淋巴細(xì)胞，可以得到更有效的用于預(yù)防和治療腫瘤、感染性疾病以及自身免疫性疾病的激活的淋巴細(xì)胞，同時(shí)，也會(huì)減少例如GVHD等副作用的發(fā)生。如果使用含有CD8和CD4陽(yáng)性細(xì)胞的激活的淋巴細(xì)胞，這些優(yōu)點(diǎn)會(huì)更加明顯。
將源于HLA相匹配的供體的激活的淋巴細(xì)胞作為一種制備試劑盒進(jìn)行銷售，該試劑盒用于制備激活的淋巴細(xì)胞，至少由HLA相匹配的淋巴細(xì)胞以及用于激活淋巴細(xì)胞的白介素2組成；該制備試劑盒或者用于制備含有源于HLA相匹配的供體的激活的淋巴細(xì)胞的制劑，則即使在很偏遠(yuǎn)的地方，也能很容易地得到本發(fā)明中的源于HLA相匹配的供體的激活的淋巴細(xì)胞。即使沒有高深的知識(shí)以及豐富的經(jīng)驗(yàn)，也可以增殖并激活源于HLA相匹配的供體的淋巴細(xì)胞，并用于預(yù)防和治療腫瘤、各種感染性疾病以及自身免疫性疾病。
生產(chǎn)用于預(yù)防和治療腫瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病的含有淋巴細(xì)胞的制劑的方法，包括以下步驟從含有源于HLA相匹配的供體的淋巴細(xì)胞的外周血中分離出單核細(xì)胞；對(duì)分離出的單核細(xì)胞中的源于HLA相匹配的供體的淋巴細(xì)胞進(jìn)行激活并增殖，例如至少使用白介素2或者抗-CD3抗體中的一種進(jìn)行激活并增殖；提取經(jīng)激活并增殖的淋巴細(xì)胞；制備成以所述激活的淋巴細(xì)胞為主要成分的制劑。因此，可以有效地生產(chǎn)出含有源于HLA相匹配的供體的淋巴細(xì)胞的制劑，同時(shí)，使防止有效淋巴細(xì)胞的活性以及數(shù)目的減低成為可能。
孵育增殖淋巴細(xì)胞的過程中，相對(duì)于3～14天的孵育周期中的孵育培養(yǎng)液的量，以10％～500％的比率補(bǔ)充培養(yǎng)液。為了防止培養(yǎng)液的降解和白介素2的活性降低，在3～14天的孵育期內(nèi)，每隔3～5天培養(yǎng)液就必須補(bǔ)充一次培養(yǎng)液。而且，在通過孵育而激活并增殖淋巴細(xì)胞的同時(shí)，加入各種細(xì)胞因子或促細(xì)胞分裂素，將進(jìn)一步增強(qiáng)激活的淋巴細(xì)胞的效果。
另外，已經(jīng)證實(shí)，被激活并增殖的含有CD4陽(yáng)性細(xì)胞和CD8陽(yáng)性細(xì)胞的源于HLA相匹配的供體的激活的淋巴細(xì)胞比僅含有CD4陽(yáng)性細(xì)胞的源于HLA相匹配的供體的激活的淋巴細(xì)胞甚至更加有效。
權(quán)利要求
1.一種用于預(yù)防和治療腫瘤、感染性疾病以及自身免疫性疾病的預(yù)防性和治療性淋巴細(xì)胞，其特征在于所述淋巴細(xì)胞通過激活源于HLA相匹配的供體的淋巴細(xì)胞來獲得。
2.如權(quán)利要求1所述的預(yù)防性和治療性淋巴細(xì)胞，其特征在于所述源于HLA相匹配的供體的淋巴細(xì)胞用白介素2來激活。
3.如權(quán)利要求1所述的預(yù)防性和治療性淋巴細(xì)胞，其特征在于所述源于HLA相匹配的供體的淋巴細(xì)胞用抗-CD3抗體來激活。
4.如權(quán)利要求1、2或3所述的預(yù)防性和治療性淋巴細(xì)胞，其特征在于所述源于HLA相匹配的供體的淋巴細(xì)胞為抗原特異性激活的淋巴細(xì)胞，它是通過先利用適當(dāng)?shù)目乖T導(dǎo)抗原特異性的淋巴細(xì)胞，然后用CD3抗體、CD26抗體和白介素2之一或者CD3抗體、CD26抗體和白介素2的組合而獲得。
5.如權(quán)利要求1至4之一所述的預(yù)防性和治療性淋巴細(xì)胞，其特征在于通過以下方式制備和使用所述源于HLA相匹配的供體的淋巴細(xì)胞，首先激活并增殖所收集的源于HLA相匹配的供體的淋巴細(xì)胞，然后通過篩選而選擇抗原特異性的激活的淋巴細(xì)胞，或者用適當(dāng)?shù)目乖瓉碚T導(dǎo)抗原特異性激活的淋巴細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求1至4之一所述的預(yù)防性和治療性淋巴細(xì)胞，其特征在于所述源于HLA相匹配的供體的淋巴細(xì)胞通過制備已經(jīng)被抗原刺激激活并增殖的抗原特異性淋巴細(xì)胞而得到。
7.如權(quán)利要求4至6之一所述的預(yù)防性和治療性淋巴細(xì)胞，其特征在于所述抗原為精制抗原，癌細(xì)胞或者病毒的提取物，癌細(xì)胞或者病毒，或者與癌細(xì)胞或病毒具有交叉反應(yīng)的抗原物質(zhì)。
8.如權(quán)利要求1至7之一所述的預(yù)防性和治療性淋巴細(xì)胞，其特征在于所述源于HLA相匹配的供體的淋巴細(xì)胞含有具有排異傾向的HLAs。
9.如權(quán)利要求1至7之一所述的預(yù)防性和治療性淋巴細(xì)胞，其特征在于所述源于HLA相匹配的供體的淋巴細(xì)胞從具有微嵌合狀態(tài)的供體中收集。
10.如權(quán)利要求1至9之一所述的預(yù)防和治療淋巴細(xì)胞，其特征在于所述淋巴細(xì)胞的正確劑量是每公斤體重1×103～5×108個(gè)細(xì)胞。
11.一種用于預(yù)防和治療腫瘤、各種感染性疾病和自身免疫性疾病的預(yù)防性和治療性制劑，其特征在于獲得源于HLA相匹配的供體的激活的淋巴細(xì)胞。
12.如權(quán)利要求11所述的預(yù)防性和治療性制劑，其特征在于通過將已經(jīng)被激活和增殖的淋巴細(xì)胞懸浮于含有人類白蛋白的輸注生理鹽水中而制備得到所述制劑。
13.如權(quán)利要求n或12所述的預(yù)防性和治療性制劑，其特征在于所述淋巴細(xì)胞的正確劑量是每公斤體重1×103～5×108個(gè)細(xì)胞。
14.一種制備制劑的試劑盒，其特征在于至少由源于HLA相匹配的供體的淋巴細(xì)胞以及用于激活所述淋巴細(xì)胞的白介素2的組合組成。
15.一種制備制劑的試劑盒，其特征在于至少由源于HLA相匹配的供體的淋巴細(xì)胞以及用于激活所述淋巴細(xì)胞的抗-CD3抗體的組合組成。
16.一種用于預(yù)防和治療腫瘤、各種感染性疾病和自身免疫性疾病的預(yù)防性和治療性制劑的生產(chǎn)方法，其特征在于包括以下步驟從含有源于HLA相匹配的供體的淋巴細(xì)胞的外周血中分離出單核細(xì)胞；激活并增殖存在于所分離出的單核細(xì)胞中的所述源于HLA相匹配的供體的淋巴細(xì)胞；將已經(jīng)被激活和增殖的所述淋巴細(xì)胞提取出來，并制備成以所述淋巴細(xì)胞為主要成分的制劑。
17.如權(quán)利要求16所述的用于預(yù)防和治療腫瘤、各種感染性疾病和自身免疫性疾病的預(yù)防性和治療性制劑的生產(chǎn)方法，其特征在于使用孵育培養(yǎng)液在3～14天的持續(xù)孵育周期內(nèi)增殖所述淋巴細(xì)胞，其中所述培養(yǎng)液組合了白介素2或抗-CD3抗體或者同時(shí)組合了這兩種物質(zhì)。
18.如權(quán)利要求16或17所述的用于預(yù)防和治療腫瘤、各種感染性疾病和自身免疫性疾病的預(yù)防性和治療性制劑的生產(chǎn)方法，其特征在于在通過孵育而增殖所述淋巴細(xì)胞時(shí)，為了避免所述孵育培養(yǎng)液降解以及白介素2活性水平的降低，相對(duì)于3～14天的孵育周期中孵育培養(yǎng)液的量，以10％～500％的比例補(bǔ)充培養(yǎng)液。
19.如權(quán)利要求18所述的用于預(yù)防和治療腫瘤、各種感染性疾病和自身免疫性疾病的預(yù)防性和治療性制劑的生產(chǎn)方法，其特征在于在3～14天的孵育期中，每隔3～5天補(bǔ)充一次所述培養(yǎng)液。
20.如權(quán)利要求16至19之一所述的用于預(yù)防和治療腫瘤、各種感染性疾病和自身免疫性疾病的預(yù)防性和治療性制劑的生產(chǎn)方法，其特征在于在通過孵育而激活和增殖所述淋巴細(xì)胞時(shí)，向培養(yǎng)液中添加各種細(xì)胞因子或促細(xì)胞分裂劑。
21.如權(quán)利要求16所述的用于預(yù)防和治療腫瘤、各種感染性疾病和自身免疫性疾病的預(yù)防性和治療性制劑的生產(chǎn)方法，其特征在于已經(jīng)被激活和增殖的所述源于HLA相匹配的供體的淋巴細(xì)胞中包括CD4陽(yáng)性細(xì)胞和CD8陽(yáng)性細(xì)胞。
22.一種用于預(yù)防和治療患有腫瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病的患者的預(yù)防和治療方法，其特征在于給予所述患者如權(quán)利要求1所述的淋巴細(xì)胞。
23.如權(quán)利要求22所述的預(yù)防和治療方法，其特征在于所述源于HLA相匹配的供體的淋巴細(xì)胞用白介素2激活。
24.如權(quán)利要求22所述的預(yù)防和治療方法，其特征在于所述源于HLA相匹配的供體的淋巴細(xì)胞用抗-CD3抗體激活。
25.如權(quán)利要求22、23或24所述的預(yù)防和治療方法，其特征在于所述源于HLA相匹配的供體的淋巴細(xì)胞為抗原特異性激活的淋巴細(xì)胞，它是通過先利用適當(dāng)?shù)目乖T導(dǎo)抗原特異性的淋巴細(xì)胞，然后用CD3抗體、CD26抗體和白介素2之一或者CD3抗體、CD26抗體和白介素2的組合而獲得。
26.如權(quán)利要求22至25之一所述的預(yù)防和治療方法，其特征在于通過以下方式制備和使用所述源于HLA相匹配的供體的淋巴細(xì)胞，首先激活并增殖所收集的源于HLA相匹配的供體的淋巴細(xì)胞，然后通過篩選而選擇抗原特異性的激活的淋巴細(xì)胞，或者用適當(dāng)?shù)目乖瓉碚T導(dǎo)抗原特異性激活的淋巴細(xì)胞。
27.如權(quán)利要求22至26之一所述的預(yù)防和治療方法，其特征在于所述淋巴細(xì)胞的正確劑量是每公斤體重1×103～5×108個(gè)細(xì)胞。
全文摘要
根據(jù)本發(fā)明，對(duì)患有腫瘤、病毒感染以及自身免疫性疾病的患者具有很高療效的源于HLA相匹配的供體的激活的淋巴細(xì)胞可以通過以下方法制備得到收集源于HLA相匹配的供體外周血中的細(xì)胞，或者收集源于HLA相匹配的、并具有微嵌合狀態(tài)的供體的外周血中的細(xì)胞；然后，用例如白介素2、抗CD3抗體等物質(zhì)激活并增殖所收集到的細(xì)胞。由此制得的源于HLA相匹配的供體的激活的淋巴細(xì)胞可以用于預(yù)防和治療HLA相匹配的患有腫瘤、病毒感染以及自身免疫性疾病的患者。
文檔編號(hào)A61K47/02GK1481901SQ0313123
公開日2004年3月17日 申請(qǐng)日期2003年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月8日
發(fā)明者黒巖保幸, 森尾友宏, 清水則夫, 關(guān)根暉彬, 夫, 宏, 巖保幸, 彬 申請(qǐng)人:淋巴細(xì)胞技術(shù)株式會(huì)社