專利名稱：納米銅粉作為制備免疫增強藥物的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明是一種納米銅粉的新用途，特別是一種納米銅粉作為制備免疫增強藥物的應用。該藥物主要適于免疫低下人群以及腫瘤放化療患者等使用。
眾所周知，人體內(nèi)存在大量感染性微生物如病毒、細菌、癌細胞、真菌、原蟲和多細胞寄生蟲等，易感染各種疾病。而防治疾病的最好辦法就是增強免疫力，人體的免疫力越強，受感染性微生物侵害的機率就越小。增加機體抗病能力，特別是對于免疫低下人群以及腫瘤放化療患者，就顯得尤為重要。因此，長期以來對于增強人體免疫功能藥物的研發(fā)，一直是醫(yī)藥界科技人員非常重視的課題。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的該納米銅粉作為制備免疫增強藥物的應用，其技術要點是采用市售粒徑為0.1-1000nm的納米銅粉為原料，制成的藥物所用原料納米銅粉與制劑的重量比為0.002～0.04∶1。
上述納米銅粉作為制備免疫增強藥物的應用，可以制成片劑、膠囊、顆粒劑等劑型。也可加入食品、奶粉或乳制品中食用。
本發(fā)明納米銅粉作為制備免疫增強藥物的應用，可日服二次，日服量以不超過2～8mg為宜。其主要成份納米銅粉市場有售，相應的報導也公開過納米銅粉可采用激光法、化學法、物理法、低溫冷凍法等方法制備。但末見具有制備免疫增強藥物應用的報導。
通過對納米銅粉的免疫藥效學研究表明納米銅粉可使正常小鼠免疫器官的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)及外周血白細胞總數(shù)明顯增加，增強免疫功能低下的小鼠單核巨噬細胞吞噬功能，并明顯增加其血清溶血素水平，表明納米銅粉對機體的特異性免疫、非特異性免疫均有增強作用。因納米銅粉對機體的特異性、非特異性免疫具有增強作用，故其藥物可用于感染性微生物及其毒素、腫瘤、凋亡或突變細胞而引發(fā)的各種疾病等的治療，適于免疫低下人群以及腫瘤放化療患者等使用。實驗材料1、受試藥物納米銅粉，黑色粉末狀，由沈陽二十一世紀納米技術有限公司提供，純度99.99％，粒徑范圍0.1-50nm，臨用時用0.5％CMC.Na(纖維素鈉)液配成所需濃度的混懸液使用。
2.實驗動物昆明種小鼠，雌雄各半，由沈陽藥科大學實驗動物中心提供，動物合格證號遼實動合字第033號。
3.實驗儀器與試劑氫化可的松齊齊哈爾第二制藥廠批號02022001印度墨汁北京市西中化工廠批號980301綿羊紅細胞沈陽市大東區(qū)前進生物試劑廠補體取3只豚鼠新鮮血清，加入壓積紅細胞，血清∶SRBC＝5∶1(V/V)，4℃冰箱放置30min，離心，取上清血清，以生理鹽水1∶10稀釋待用。
JN-A型精密扭力天平上海第二天平儀器廠多功能電熱恒溫水浴鍋上海凱樂電子儀器廠UV-9100紫外可見分光光度計北京瑞利分析儀器廠7230可見分光光度計上海分析儀器廠FA1004上皿電子天平上海精科儀器廠XB-K-25血球計數(shù)室上海醫(yī)用光學儀器廠光學顯微鏡日本OLYMPUS光學有限公司實驗方法1、納米銅粉對正常小鼠免疫器官重量的影響昆明種小鼠40只，12-15g，雌雄各半，隨機分為4組，分別為空白對照組，納米銅粉0.8424g/kg、2.5272mg/kg、7.5816mg/kg三個劑量組。除空白對照組外，其它各組分別按設定劑量給藥，每天一次，連續(xù)7天。最后一次給藥后24小時，處死小鼠，取出胸腺及脾臟稱重，以胸腺或脾臟重量(mg)與體重(g)之比作為胸腺指數(shù)或脾臟指數(shù)。
2、納米銅粉對正常小鼠外周血白細胞數(shù)量的影響昆明種小鼠40只，12-15g，雌雄各半，隨機分為4組，分別為空白對照組，納米銅粉0.8424g/kg、2.5272mg/kg、7.5816mg/kg三個劑量組。除空白對照組外，其它各組分別按設定劑量給藥，每天一次，連續(xù)7天。最后一次給藥后24小時，眼眶后靜脈叢采血，取血液20μl注入含有0.4ml稀釋液(取冰醋酸20ml，用蒸餾水稀釋至1000ml，加入少許結晶紫，呈淡紫色，以示識別)的小試管中，搖勻，滴20μl入XB-K-25血球計數(shù)室，靜置3分鐘，在低倍鏡下計數(shù)白細胞，結果以個/mm3表示。
3、納米銅粉對免疫功能低下小鼠單核巨噬細胞吞噬功能的影響昆明種小鼠50只，18-22g，雌雄各半，隨機分為5組，分別為空白對照組，模型對照組，納米銅粉0.8424g/kg、2.5272mg/kg、7.5816mg/kg三個劑量組。除空白對照組外，其它各組均肌肉注射氫化可的松，每天25mg/kg，連續(xù)7天，給藥組同時按設定劑量灌胃給藥，連續(xù)7天。最后一次給藥1小時后，每鼠尾靜脈注射1∶10稀釋的印度墨汁0.1ml/10g，分別于注射后2min(t1)及12min(t2)從眼眶后靜脈叢取血20μl，立刻注入含有2ml 0.1％Na2CO3溶液的試管中搖均，在680nm處測吸光度值。隨后處死小鼠，摘取肝臟、脾臟，稱量濕重。計算吞噬指數(shù)κ及吞噬系數(shù)α。 κ＝(logA1-logA2)/(t2-t1)4、納米銅粉對免疫功能低下小鼠體內(nèi)抗體生成水平的影響昆明種小鼠50只，22-27g，雌雄各半，隨機分為5組，分別為空白對照組，模型對照組，納米銅粉0.8424g/kg、2.5272mg/kg、7.5816mg/kg三個劑量組。除空白對照組外，其它各組均肌肉注射氫化可的松，每天25mg/kg，給藥組同時按設定劑量灌胃給藥，連續(xù)7天。實驗第三天將綿羊紅細胞用生理鹽水洗滌三次后，以3∶5(V/V)用生理鹽水稀釋，每鼠腹腔注射綿羊紅細胞懸液0.2ml致敏。免疫4天后，眼眶后靜脈采血，離心分離血清，將血清稀釋500倍后加0.5ml至反應管中，加入綿羊紅細胞(10％)0.5ml和1ml補體，加畢立刻將反應管移至37℃恒溫水浴中反應10min，而后立即放入冰浴中終止反應。離心2000rpm，10min，取上清液1ml，加入3ml都氏試劑[NaHCO31.0g，KCN0.05g，K3Fe(CN)60.2g，蒸餾水加至1000ml]混均，放置10min后在540nm波長處測定吸光度值，空白管用生理鹽水代替血清樣品，計算樣品的半數(shù)溶血值HC50。
綿羊紅細胞半數(shù)溶血值測定取1∶10稀釋的綿羊紅細胞0.25ml，加都氏試劑到納米銅粉1，搖勻，放置10min，540nm處測吸光度值。 實驗結果1、對正常小鼠免疫器官重量的影響實驗結果實驗結果如表1所示，納米銅粉灌胃給藥2.5272mg/kg、7.5816mg/kg，能明顯增加幼鼠脾臟指數(shù)(P＜0.05或P＜0.01)，并且有增加胸腺指數(shù)的趨勢，但與對照組相比無顯著性差異。
表1 納米銅粉對小鼠免疫器官重量的影響(x±SD)劑量 動物數(shù)組別胸腺指數(shù)(mg/g) 脾指數(shù)(mg/g)mg/kg(只)空白對照組-- 10 4.15±0.70 5.70±0.59納米銅粉小劑量組 0.842410 4.19±0.71 6.25±0.65納米銅粉中劑量組 2.527210 4.49±1.18 7.43±2.13*納米銅粉大劑量組 7.581610 4.62±0.79 7.54±1.73**與空白對照組相比*P＜0.05**P＜0.01
2、納米銅粉對正常小鼠外周血白細胞數(shù)量的影響實驗結果實驗結果如表2所示，納米銅粉灌胃給藥2.5272mg/kg、7.5816mg/kg，能明顯增加正常小鼠外周血白細胞數(shù)量(P＜0.05)。
表2 納米銅粉對小鼠外周血白細胞數(shù)目的影響(x±SD)劑量 動物數(shù)組別 白細胞數(shù)(*105個/mm3)mg/kg (只)空白對照組 -- 10 3.23±0.77納米銅粉小劑量組0.8424 10 3.49±0.64納米銅粉中劑量組2.5272 10 3.96±0.65*納米銅粉大劑量組7.5816 10 4.36±1.27*與空白對照組相比*P＜0.05**P＜0.013、納米銅粉對免疫功能低下小鼠單核巨噬細胞吞噬功能的影響實驗結果實驗結果表明，氫化可的松模型組小鼠與正常對照組小鼠相比體重顯著降低，而納米銅粉2.5272mg/kg、7.5816mg/kg組，能明顯增加模型小鼠體重。納米銅粉對模型小鼠體重量影響的結果見

圖1。如表3所示，模型對照組與正常對照組相比吞噬指數(shù)κ明顯降低(P＜0.01)，吞噬系數(shù)α無顯著性差異；納米銅粉灌胃給藥2.5272mg/kg、7.5816mg/kg，能明顯增加模型小鼠的吞噬指數(shù)κ(P＜0.05)及吞噬系數(shù)α(P＜0.05或P＜0.01)。表3 納米銅粉對免疫功能低下小鼠單核巨噬細胞吞噬功能的影響(x±SD)劑量動物數(shù)組別吞噬指數(shù)κ吞噬系數(shù)αmg/kg (只)空白對照組 -- 10 0.072±0.013** 6.30±0.79模型對照組 -- 10 0.053±0.0106.36±0.68納米銅粉小劑量組0.8424 10 0.054±0.0106.60±0.76納米銅粉中劑量組2.5272 10 0.064±0.008* 7.20±0.68*納米銅粉大劑量組7.5816 10 0.068±0.014* 7.29±0.43**與模型對照組相比*P＜0.05**P＜0.014、納米銅粉對免疫功能低下小鼠體內(nèi)抗體生成水平的影響實驗結果實驗結果如表4所示，模型對照組與正常對照組相比半數(shù)溶血值HC50明顯降低(P＜0.05)，納米銅粉灌胃給藥2.5272mg/kg、7.5816mg/kg，能明顯增加模型小鼠的半數(shù)溶血值HC50(P＜0.01)。
表4 納米銅粉對小鼠血清溶血素水平的影響(x±SD)劑量 動物數(shù)組別 半數(shù)溶血值HC50mg/kg (只)空白對照組 --10183.09±61.83*模型對照組 --10109.3±59.15納米銅粉小劑量組 0.8424 10112.50±42.77納米銅粉中劑量組 2.5272 10234.81±77.25**納米銅粉大劑量組 7.5816 10252.80±72.81**與模型對照組相比*P＜0.05**P＜0.01毒理試驗昆明種小鼠，體重18-22g，雌雄各半，共50只，試驗前禁食12小時，按體重隨機分為5組，每組10只，按不同劑量組的劑量分別灌胃給藥，劑距為1∶0.8，給藥容積為0.2ml/10g小鼠體重，給藥后連續(xù)觀察14天，記錄動物的反應及死亡情況，以Bliss法計算LD50及95％可信限。實驗結果動物給藥后，高劑量小鼠出現(xiàn)行動遲緩，豎毛，呼吸急促，口鼻發(fā)青現(xiàn)象，大部分死亡發(fā)生在48小時內(nèi)，死亡小鼠尸檢未見病理性改變，未死亡小鼠逐漸恢復正常。LD50及95％可信限結果見表5。
表5 納米銅粉灌胃給藥LD50及95％可信限

綜上所述，通過免疫藥效學實驗，從特異性免疫、非特異性免疫、體液免疫和細胞免疫等方面觀察納米銅粉對正常小鼠免疫器官的胸腺及脾臟重量和氫化可的松所致免疫功能低下小鼠的免疫增強作用的影響。實驗研究結果表明，納米銅粉能夠增加幼年小鼠的胸腺、脾臟重量，并能明顯增加小鼠脾臟指數(shù)，提示納米銅粉具有增強機體免疫增強功能。實驗結果顯示，納米銅粉能夠增加正常小鼠外周血白細胞總數(shù)，提示納米銅粉可促進T細胞、B細胞和巨噬細胞的增殖。
胸腺與脾臟為體內(nèi)主要的免疫器官。胸腺為初級淋巴器官，游走的造血干細胞進入胸腺原基，在此分化增值為T淋巴細胞，與細胞免疫有關。脾臟為次級淋巴細胞，免疫活性細胞移行于此，并在此處因受免疫過程中異體抗原刺激而進一步增殖分化和成熟，脾臟中有T淋巴細胞和B淋巴細胞，還有巨噬細胞，與體液免疫、細胞免疫均有密切關系，一些免疫抑制劑如環(huán)磷酰胺、可的松等，均可使胸腺、脾臟明顯萎縮，免疫增強則使胸腺或脾臟增重，因此免疫藥效學研究實驗，常以藥物對動物的胸腺、脾臟重量的影響作為有效依據(jù)。
網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES，單核巨噬細胞系統(tǒng))是機體最重要的防御系統(tǒng)，它具有強大而迅速的吞噬廓清異體顆?；蚰承┛扇苄援愇锏哪芰?，并能迅速清除體內(nèi)自身產(chǎn)生的某些有害物質(zhì)。當靜脈注入特定大小的惰性炭粒后，它即可被RES細胞迅速吞噬而從血流中廓清，因此，可以借助測定血流中炭粒的消失速度來反映RES吞噬異物的能力。
RES因能迅速清除多種致病性物質(zhì)，如病原微生物及其毒素、死亡或突變細胞、前凝血物質(zhì)及凝血與纖溶產(chǎn)物、補體碎片及抗原抗體復合物等，而在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展或愈后中起重要作用，即RES是機體保持內(nèi)環(huán)境衡定的一個最重要的系統(tǒng)。
本實驗研究中納米銅粉既可增強吞噬指數(shù)κ所反映的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能亦可增強吞噬系數(shù)α所反映的單個單核-巨噬細胞的吞噬能力，表明納米銅粉可提高機體非特異性抵抗力作用。
綿羊紅血球免疫小鼠可使其淋巴細胞產(chǎn)生特異性抗SRBC抗體，并釋放至外周血。分出致敏動物血清，與綿羊紅血球一起孵育，在補體參與下，可產(chǎn)生溶血現(xiàn)象。致敏動物血清中溶血素的含量可以通過溶血過程中釋放的血紅蛋白量來測出，從而反映藥物對體液免疫的影響。
本實驗研究中納米銅粉可明顯增加血清(SRBC)誘導的特異性體液免疫，即增強B細胞產(chǎn)生SRBC抗體的能力，進一步增強特異性體液免疫的功能。
由此可見，納米銅粉可使正常小鼠免疫器官的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)及外周血白細胞總數(shù)明顯增加，增強免疫功能低下的小鼠單核巨噬細胞吞噬功能，并明顯增加其血清溶血素水平，表明納米銅粉對機體的特異性免疫、非特異性免疫均有增強作用。其藥物可用于感染性微生物及其毒素、腫瘤、凋亡或突變細胞而引發(fā)的各種疾病等的治療，適于免疫低下的人群以及腫瘤放化療患者等使用。能有效克服現(xiàn)有技術存在的毒副作用問題，用于制備免疫增強的藥物，其療效確切，服用方便、安全。
圖1是納米銅粉對模型小鼠體重量影響的結果圖。
用法用量口服，一次一片，每日二次。
實施方式二 制備膠囊采用如下步驟取納米銅粉，加淀粉混合均勻，分裝于硬膠囊中，制得膠囊，每粒膠囊含納米銅粉為2mg。
用法用量口服，一次一粒，每日二次。
實施方式三 制備顆粒劑采用如下步驟取納米銅粉，加入賦型劑糖粉、淀粉，制成軟材，造粒，低溫干燥，整粒，分裝成袋，即得顆粒劑，每袋含納米銅粉為2mg。用法用量溫開水沖服，一次一袋，每日二次。
上述納米銅粉也可直接食用，如加入食品、奶粉或乳制品中，其每日食用納米銅粉總量以不超過2～8mg為宜。
權利要求
1.一種納米銅粉作為制備免疫增強藥物的應用，其特征在于采用市售粒徑為0.1-1000nm的納米銅粉為原料制成藥物，納米銅粉與制劑的重量比為0.002～0.04∶1。
2.根據(jù)權利要求1所述的納米銅粉作為免疫增強藥物的應用，其特征在于采用如下步驟制成片劑取納米銅粉采用常規(guī)制片工藝，加入淀粉、微晶纖維素和潤滑劑硬脂酸鎂，混合均勻，直接壓制成片，包衣，即得片劑，使每片含納米銅粉為2mg。
3.根據(jù)權利要求1所述的納米銅粉作為免疫增強藥物的應用，其特征在于采用如下步驟制成膠囊取納米銅粉加淀粉混合均勻，制粒，干燥，分裝于硬膠囊中，制得膠囊，每粒膠囊含納米銅粉為2mg。
4.根據(jù)權利要求1所述的納米銅粉作為免疫增強藥物的應用，其特征在于采用如下步驟制成顆粒劑取納米銅粉加入賦型劑糖粉、淀粉制成軟材，造粒，低溫干燥，整粒，分裝成袋，即得顆粒劑，每袋含納米銅粉為2mg。
全文摘要
一種納米銅粉作為制備免疫增強藥物的應用，其技術要點是采用市售粒徑為0.1－1000nm的納米銅粉為原料，制成的藥物所用原料納米銅粉與制劑的重量比為0.002～0.04∶1。納米銅粉對機體的特異性免疫、非特異性免疫具有增強作用，其藥物可用于感染性微生物及其毒素、腫瘤、凋亡或突變細胞而引發(fā)的各種疾病等的治療，適于免疫低下的人群以及腫瘤放化療患者等使用。能有效克服現(xiàn)有技術存在的毒副作用問題，用于制備免疫增強的藥物，其療效確切，服用方便、安全。
文檔編號A61P37/04GK1476843SQ0313389
公開日2004年2月25日 申請日期2003年7月11日 優(yōu)先權日2003年7月11日
發(fā)明者馬駟, 李艷, 馬 駟 申請人:馬駟, 李艷, 馬 駟