專利名稱：山葡萄提取物治療炎癥疾病的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從山葡萄(Vitis amurensis)中提取的總聚芪有效部位群、低聚芪化合物山葡萄辛素(amuresin H)，毛葡萄甲素(heyneanol A)，坡壘醇(hopeaphenol)在制備抗炎癥疾病藥物中的用途。
背景技術(shù)：
炎癥性疾病如哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等是一類常見(jiàn)病、多發(fā)病，前者如哮喘，為呼吸系統(tǒng)疾病的常見(jiàn)癥狀，多見(jiàn)于支氣管哮喘和哮喘性支氣管炎，是由支氣管平滑肌痙攣和支氣管炎癥引起的分泌物增加、粘液水腫而導(dǎo)致的廣泛的可逆性氣道阻塞。目前對(duì)其發(fā)病機(jī)理還不完全清楚。支氣管哮喘大多屬于I型變態(tài)反應(yīng)，當(dāng)抗原再次吸入體內(nèi)，與肺部致敏肥大細(xì)胞上的IgE抗體結(jié)合，釋放一系列炎癥介質(zhì)，如組胺、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子和嗜中性粒細(xì)胞趨化因子、白三烯、前列腺素等，這些炎癥介質(zhì)可引起氣管平滑肌痙攣而誘發(fā)哮喘。機(jī)體在外界因素，如化學(xué)物質(zhì)、感染、抗原等作用下引起炎癥反應(yīng)，造成局部血管擴(kuò)張、毛細(xì)血管通透性增加，白細(xì)胞浸潤(rùn)，產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)，如白三烯、細(xì)胞因子等，炎癥介質(zhì)之間、炎癥介質(zhì)與炎性細(xì)胞之間以及炎性細(xì)胞之間相互作用又加劇了炎癥反應(yīng)?？寡酌庖咚帉⑼ㄟ^(guò)抑制炎癥介質(zhì)達(dá)到消除炎癥的目的。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供了山葡萄提取的總聚芪有效部位群在制備抗炎癥疾病藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種藥物組合物，其含有治療有效劑量的從山葡萄提取的總聚芪有效部位群及藥用載體。
為了完成本發(fā)明的目的，本發(fā)明涉及從山葡萄(Vitis amurensis)提取的總聚芪有效部位群，如式(I)所示的化合物山葡萄辛素(amurensin H) 如式(II)所示的化合物毛葡萄甲素(heyneanol A) 如式(III)所示的化合物坡壘醇(hopeaphenol)
(III)及其式I、II、III的化合物衍生物或藥用鹽分別在制備治療炎癥性疾病的藥物中的應(yīng)用。
LTB4為花生四烯酸5-脂氧酶代謝途徑產(chǎn)物，是一種極強(qiáng)的炎癥介質(zhì)，對(duì)多形核白細(xì)胞(PMN)和單核細(xì)胞具有極強(qiáng)的趨化聚集作用，可誘導(dǎo)PMN脫顆粒，刺激白細(xì)胞溶酶體酶釋放，刺激PMN超氧陰離子產(chǎn)生。在本發(fā)明化合物對(duì)大鼠胸腔白細(xì)胞的LTB4生成抑制作用中，本發(fā)明化合物I、II、III在10-5mol/L濃度下大鼠胸腔白細(xì)胞LTB4生成抑制率分別為83％、76％、和56％，表明三者對(duì)LTB4生成有較強(qiáng)的抑制作用，說(shuō)明本發(fā)明化合物有較強(qiáng)的抗炎作用。
LTC4是過(guò)敏性慢反應(yīng)物質(zhì)主要成分之一，可使氣管平滑肌收縮，其收縮作用強(qiáng)度為組胺的100-1000倍，增加毛細(xì)血管滲透性，刺激粘液分泌，在哮喘發(fā)病過(guò)程中起重要作用。在本發(fā)明化合物L(fēng)TC4受體拮抗作用中，化合物I、II、III對(duì)LTC4受體的抑制IC50分別為10-7、5×10-7和4×10-5mol/L，說(shuō)明本發(fā)明化合物對(duì)LTC4受體有較強(qiáng)的抑制作用，能用于治療哮喘。
IL-8為一種多源性細(xì)胞因子，對(duì)白細(xì)胞有極強(qiáng)的趨化聚集活性，可顯著誘導(dǎo)白細(xì)胞吞噬、脫顆粒、呼吸爆發(fā)、釋放溶酶體酶和產(chǎn)生超氧陰離子等，與多種疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、過(guò)敏性哮喘等密切相關(guān)。在本發(fā)明化合物對(duì)IL-8生成抑制作用實(shí)驗(yàn)中，化合物I、II、III對(duì)LPS激活的HL-60細(xì)胞IL-8生成有明顯的抑制作用，IC50分別為2×10-10、1.9×10-9、2.2×10-8mol/L，說(shuō)明本發(fā)明化合物可用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、過(guò)敏性哮喘等疾病。
炎癥過(guò)程中，白細(xì)胞向炎癥部位移行、趨化、聚集，釋放炎癥介質(zhì)，IL-8和fMLP為極強(qiáng)的趨化劑，在它們的誘導(dǎo)下，加劇炎癥過(guò)程。在本發(fā)明化合物對(duì)IL-8和fMLP誘導(dǎo)的PMN趨化作用的實(shí)驗(yàn)中，化合物I、II、III使趨化的白細(xì)胞數(shù)目明顯減少，其對(duì)IL-8誘導(dǎo)PMN趨化的IC50分別為1.1×10-11、1.1×10-8、7.1×10-10mol/L，對(duì)fMLP誘導(dǎo)PMN趨化的IC50分別為4.8×10-13、4×10-10、1.6×10-8mol/L；說(shuō)明本發(fā)明化合物能緩解炎癥過(guò)程，減輕癥狀。
在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明的化合物可抑制IL-8誘導(dǎo)的小鼠體內(nèi)白細(xì)胞趨化作用，抑制率分別為52.4％、12.2％、和77％。
機(jī)體在外界因素，如化學(xué)物質(zhì)、感染、機(jī)械損傷、抗原等作用下產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，造成局部血管擴(kuò)張、毛細(xì)血管通透性增加、白細(xì)胞浸潤(rùn)，表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛。巴豆油為一強(qiáng)致炎劑，涂在小鼠耳部，可引起小鼠耳部急性炎癥。本實(shí)驗(yàn)用巴豆油誘發(fā)小鼠耳部腫脹，在本發(fā)明化合物和有效部位群(Vit)對(duì)小鼠耳部巴豆油炎癥的抑制作用中，本發(fā)明化合物和有效部位群(Vit)對(duì)小鼠耳部巴豆油炎癥抑制率分別為22.9％、22.8％、17.5％和29.4％，表明本發(fā)明化合物對(duì)炎癥有抑制作用。
在模擬急性炎癥的小鼠角叉菜膠足腫脹中，本發(fā)明化合物和有效部位群(Vit)對(duì)小鼠角叉菜膠足腫脹有明顯的抑制作用實(shí)驗(yàn)中，抑制率分別為23.8％、28.2％、17.9％和26.7％，說(shuō)明本發(fā)明化合物和有效部位群(Vit)對(duì)急性炎癥的有抑制作用。
以2，4-二硝基氟苯(DNFB)為半抗原，涂于小鼠皮膚，與皮膚蛋白結(jié)合成抗原使皮膚致敏，當(dāng)抗原(DNFB)再次攻擊后產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)，引起遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，預(yù)先給予本發(fā)明化合物和有效部位群(Vit)，則發(fā)現(xiàn)對(duì)小鼠DNFB致IV型變態(tài)反應(yīng)有較強(qiáng)的抑制作用，抑制率分別為30％、40.7％、36.5％和40.5％。
在炎癥時(shí)，肥大細(xì)胞在致敏劑作用下細(xì)胞膜破裂，釋放炎癥介質(zhì)?；衔?8/80可誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒，本發(fā)明化合物可以抑制化合物48/80誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒，化合物I，II的抑制率分別為43.1％和29.8％。
當(dāng)卵白蛋白致敏豚鼠再次以卵白蛋白攻擊時(shí)產(chǎn)生過(guò)敏性哮喘，本發(fā)明有效部位群(Vit)，可明顯延長(zhǎng)致敏豚鼠哮喘潛伏期，減輕哮喘癥狀，減少哮喘動(dòng)物數(shù)。
根據(jù)本發(fā)明還涉及藥物組合物的制備方法。用于此目的時(shí)，如果需要，可將活性成分與一種或多種固體或液體藥物賦形劑和/或輔劑結(jié)合，制成可作為人藥使用的適當(dāng)施用形式或劑量形式。
本發(fā)明的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮膚、腹膜或直腸等。
本發(fā)明的藥物組合物的給藥途徑可為注射給藥。注射包括靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、皮內(nèi)注射和穴位注射等。
給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型。如液體劑型可以是真溶液類、膠體類、微粒劑型、乳劑劑型、混懸劑型。其他劑型例如片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、栓劑、凍干粉針劑等。
本發(fā)明的組合物可以制成普通制劑、也可以是緩釋制劑、控釋制劑、靶向制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。
為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等；濕潤(rùn)劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，例如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進(jìn)劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤(rùn)滑劑，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進(jìn)一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。
為了將給藥單元制成丸劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高嶺土、滑石粉等；粘合劑，如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。
為了將給藥單元制成栓劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高級(jí)醇、高級(jí)醇的酯、明膠、半合成甘油酯等。
為了將給藥單元制成膠囊，將有效成分與上述的各種載體混合，并將由此得到的混合物置于硬的明膠膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分制成微囊劑，混懸于水性介質(zhì)中形成混懸劑，亦可裝入硬膠囊中或制成注射劑應(yīng)用。
例如，將本發(fā)明的組合物制成注射用制劑，如溶液劑、混懸劑溶液劑、乳劑、凍干粉針劑，這種制劑可以是含水或非水的，可含一種和/或多種藥效學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑、防腐劑、表面活性劑或分散劑。如稀釋劑可選自水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī)的助溶劑、緩沖劑、pH調(diào)節(jié)劑等。這些輔料是本領(lǐng)域常用的此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或其它材料。
本發(fā)明藥用組合物的給藥劑量取決于許多因素，例如所要預(yù)防或治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，患者或動(dòng)物的性別、年齡、體重、性格及個(gè)體反應(yīng)，給藥途徑、給藥次數(shù)等，因此本發(fā)明的治療劑量可以有大范圍的變化。一般來(lái)講，本發(fā)明中藥學(xué)成分的使用劑量是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。可以根據(jù)本發(fā)明藥用組合物中最后的制劑中所含有的實(shí)際有效藥物數(shù)量，加以適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，以達(dá)到其治療有效量的要求，完成本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的目的。通常對(duì)體重約75公斤患者，所給化合物或有效部位的日劑量為0.001mg/kg體重～500mg/kg體重，優(yōu)選3mg/kg體重～30mg/kg體重。上述劑量可以單一劑量形式或分成幾個(gè)，例如二、三或四個(gè)劑量形式給藥，這受限于給藥醫(yī)生的臨床經(jīng)驗(yàn)以及包括運(yùn)用化療、放療手段的給藥方案。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。
Vit山葡萄中提取的有效部位群制備例1山葡萄有效部位群(Vit)制備山葡萄(Vitis amurensis)根，粉碎如黃豆粒狀，1Kg，分別以5000ml，2000ml，2000ml，90％乙醇回流提取三次每次二小時(shí)，合并提取液，減壓濃縮得浸膏130g，浸膏以1∶3石油醚二次脫脂后，再以丙酮300ml溶解，分成丙酮溶解和丙酮不溶解部分。丙酮溶解部分(60g)與聚酰胺吸附劑(120g)拌勻，室溫涼干后，填裝于已事先裝好的5倍量聚酰胺柱頂(5倍量)，首先以100％蒸餾水洗滌至近無(wú)色、再分別以20％乙醇、80％乙醇及丙酮洗脫，收集80％乙醇洗脫液，減壓濃縮至干得淺棕色粉狀物26.0g(Vit)，測(cè)定總低聚芪的含量(約50％以上)備用。聚酰胺柱子可再生反復(fù)使用。
制備例2化合物I的提取制備山葡萄(Vitis amurensis)的根20 Kg，粉碎后用1∶5、1∶4、1∶4的95％乙醇回流提取三次，每次2小時(shí)，合并提取液，減壓濃縮得浸膏2.2Kg。將提取浸膏以1∶1硅膠(40-60目)拌勻，室溫涼干后，置索氏提取器中，以氯仿(A)、乙酸乙酯(B)、丙酮(C)、甲醇(D)分別回流洗脫。分得A、B、C和D四個(gè)部分。取部分B(640g)用硅膠(硅膠H，140-180目)柱層析，氯仿-甲醇梯度洗脫分份收集，薄層檢測(cè)，將具有相同斑點(diǎn)的部分歸并成六個(gè)部分，分別為B1(27.5g)，B2(30g)，B3(25g)，B4(230g)，B5(70g)，B6(140g)。B2部分繼續(xù)以硅膠柱層析，己烷-丙酮(2∶1)洗脫，然后經(jīng)過(guò)二次反相柱Rp-18，分離，以甲醇-水(7∶3，5.5-4.5)洗脫，分得化合物I(30mg)。
化合物I淺黃色無(wú)定型粉末，254nm熒光燈下顯亮蘭色熒光。高分辨質(zhì)譜HR-EIMS，m/z 452.1246[M]+，計(jì)算值452.1260，分子式C28H20O6；IR(KBr)vmax3350，1697，1606，1512，1439，1238，1153，839cm-1；UV(MeOH)λmax(logε)228(log 4.67，sh)，310(4.49)；1H-NMR與13C-NMR，見(jiàn)表11。
制備例3化合物I的合成制備ε-Viniferin制備取白藜蘆醇(從虎杖中提得，純度＞95％)23g(0.1M)溶于甲醇200ml常溫下逐步加入FeCl3·6H2O水液[25g(0.15M)溶于250ml水中]，攪拌反應(yīng)48小時(shí)，反應(yīng)物蒸去甲醇，剩余物用水稀釋后用乙酸乙酯提取，分出乙酸乙酯層濃縮干燥得萃取物20g，將萃取物以硅膠柱層析，以環(huán)己烷-丙酮(3∶1-5∶1)洗脫，分去白藜蘆醇及雜質(zhì)，所得反式ε-Viniferin與順式ε-Viniferin共4.5g(A)。
五-乙?；?ε-Viniferin制備取(A)4.85g，加吡啶和冰醋酸各100ml攪拌室溫放置一夜，產(chǎn)物混合物加水300ml，用乙酸乙酯提取，濃縮乙酸乙酯得濃縮物，攪拌下加水200ml，過(guò)濾得沉淀4.24g為五-乙?；?ε-Viniferin(B)備用。
脫氫反應(yīng)取(B)4.24g(0.93mmol)，加入5g DDQ(0.02M)，溶于無(wú)水二氧六環(huán)，加熱回流48小時(shí)，減壓蒸去二氧六環(huán)，反應(yīng)物經(jīng)硅膠柱層析，以環(huán)己烷-丙酮(2∶1)洗脫得2，3-脫氫-五-乙酰基-ε-Viniferin(C)3.5g。
脫乙酰基反應(yīng)取(C)3.5g加150ml甲醇和0.75g K2CO3(固體)室溫?cái)嚢?小時(shí)，產(chǎn)物過(guò)硅膠柱，以環(huán)己烷-丙酮(2∶1)洗脫，得化合物1A，200mg(純度＞98％)?；衔颕A所有的光譜數(shù)據(jù)與化合物I一致。(見(jiàn)表11)制備例4化合物II的提取制備取制備例2中的B3部分(25g)，分別于硅膠H與反相Rp-18柱層析，洗脫劑為環(huán)己烷-丙酮(2∶1)與甲醇-水(5.5∶4.5)分得化合物II(10g)。
化合物II類白色無(wú)定型粉末，[α]D28-83.5°(c 0.079，MeOH)；FAB-MS，m/z 907[M+1]+；分子式C56H42O12；UV(MeOH)λmax(logε)282，326nm；IR(KBr)vmax3367，1697，1612，1601，1516，1446，1336，1236，1122，1001，835cm-1；1H-NMR與13C-NMR，見(jiàn)表1-1。
表1-1化合物I，II的1H-，13C-NMR數(shù)據(jù)，括號(hào)內(nèi)J值在CD3COCD3，用500MHz NMR測(cè)定1H NMR，125MHz NMR測(cè)定13C NMR
IIIIINo.
No.
1H13C1H13C1H13C1a123.3 133.61c 131.62a 7.43 d(8.7)128.27.26 d(8.6)127.72c 6.85 d(2.0) 125.63a 6.74 d(8.7)116.06.93 d(8.6)116.03c 132.54a158.1 158.24c 159.65a 6.74 d(8.7)116.06.93 d(8.6) 5c 6.79 d(8.6) 110.66a 7.43 d(8.7)128.27.26 d(8.6) 6c 7.20 dd(8.6，2.0)126.27a149.95.44 d(5.1)94.0 7c 6.79 d(16) 130.08a117.04.54 d(5.1)57.0 8c 6.67 d(16) 123.79a138.0 147.19c 136.110a6.43 d(2.1)109.76.13 d(2.2)106.810c 119.611a 160.3 159.911c 162.312a6.53 t(2.1)102.96.24 t(2.2)101.912c6.35 d(2.0) 96.713a 160.3 159.913c 159.614a6.43 d(2.1)109.76.13 d(2.2)106.814c6.69 d(2.0) 104.21b130.0 131.91d 133.52b6.89 d(8.7) 128.66.61 d(8.6)127.42d 7.21 d(8.6) 127.83b6.69 d(8.7) 116.16.65 d(8.6)115.83d 6.69 d(8.6) 116.24b157.9 158.04d 157.45b6.69 d(8.7) 116.16.65 d(8.6)115.85d 6.69 d(8.6) 116.26b6.89 d(8.7) 128.66.61 d(8.6)127.46d 7.21 d(8.6) 127.87b6.89 d(16.8)129.05.58 d(5.1)91.2 7d 5.42 d(5.5) 93.88b6.98 d(16.8)122.74.34 d(5.1)51.9 8d 4.46 d(5.5) 56.89b132.8 141.79d 147.210b 122.0 119.810d6.23 d(2.0) 106.711b 155.8 162.211d 159.712b5.72 d(2.1)97.2 6.35 d(2.0)96.3 12d6.24 d(2.0) 102.213b 156.4 159.413d 159.714b5.15 d(2.1)107.36.26 d(2.0)106.914d 106.7
制備例5化合物III的制備取例2中的B5部分(70g)，經(jīng)二次反相Rp-18柱層析，以MeOH-水(4∶6)洗脫，得化合物III(60mg)。
化合物III類白色無(wú)定型粉末，[α]D28+366.3°(c 0.104，MeOH)；FAB-MS m/z 907[M+H]+；分子式C56H42O12；UV(MeOH)λmax(logε)284nm；IR(KBr)vmax3350，1695，1612，1597，1512，1442，1340，1232，1173，1132，1088，1011，995，835cm-1，1H-NMR與13C-NMR，見(jiàn)表1-2。
表1-2化合物III的1H-，13C-NMR數(shù)據(jù)，括號(hào)內(nèi)為J值，在CD3COCD3中測(cè)定，1H NMR(500MHz)、13C NMR(125MHz)，化合物3的結(jié)構(gòu)組成左右對(duì)稱，故1H，13C數(shù)據(jù)只表現(xiàn)左邊或右邊的數(shù)據(jù)IIIIIINo.
No.
1H13C1H13C1a 131.11b 135.22a 7.12 d(8.6) 130.22b6.89 d(8.6)129.33a 6.78 d(8.6) 115.23b6.55 d(8.6)115.94a 158.44b 155.55a 6.78 d(8.6) 115.25b6.55 d(8.6)115.96a 7.12 d(8.6) 130.26b6.89 d(8.6)129.37a 5.74 d(11.4) 88.2 7b5.78(br，s)41.38a 4.22 d(11.4) 49.8 8b3.93(br，s)48.39a 142.59b 140.510a 121.110b 118.611a 158.711b 159.312a6.53 t(1.5) 101.112b 5.72 d(2.1)95.213a 157.213b 157.114a6.28 d(1.5) 106.314b 5.15 d(2.1)111.2
藥理實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1化合物I、II、III對(duì)大鼠胸腔白細(xì)胞LTB4生成抑制作用LTB4為花生四烯酸5-脂氧酶代謝途徑產(chǎn)物，是一種極強(qiáng)的炎癥介質(zhì)，對(duì)多形核白細(xì)胞(PMN)和單核細(xì)胞具有極強(qiáng)的趨化聚集作用，可誘導(dǎo)PMN脫顆粒，刺激白細(xì)胞溶酶體酶釋放，刺激PMN超氧陰離子產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟诳疾旎衔锘衔颕、II、III對(duì)LTB4生成抑制作用。
方法大鼠胸腔以角叉菜膠致炎，4小時(shí)后取炎性滲出液，白細(xì)胞計(jì)數(shù)，并調(diào)其濃度為107細(xì)胞/ml，取白細(xì)胞1ml分別加入化合物1，化合物2，化合物3、A23187、花生四烯酸，反應(yīng)5分鐘，以乙醇中止反應(yīng)，C18小柱分離LTB4，行RP-HPLC，流動(dòng)相甲醇∶水∶乙酸＝70∶20∶0.1，流速0.8ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，對(duì)LTB4定量，與對(duì)照組比較，計(jì)算LTB4生成抑制率(％)。
結(jié)果化合物I、II、III在10-5mol/L濃度下大鼠胸腔白細(xì)胞LTB4生成抑制率分別為83％、76％、和56％，表明三者對(duì)LTB4生成有較強(qiáng)的抑制作用，見(jiàn)表1。
表1化合物I、II、III對(duì)LTB4生成抑制作用受試物 濃度 LTB4生成量 對(duì)LTB4生成抑制率(mol/L)(％)空白對(duì)照- -2479±423化合物I 10-581±11 83化合物II10-584±576化合物III 10-582±556實(shí)施例2化合物I、II、III對(duì)致敏豚鼠回腸縱肌LTC4受體拮抗作用LTC4是過(guò)敏性慢反應(yīng)物質(zhì)主要成分之一，可使氣管平滑肌收縮，其收縮作用強(qiáng)度為組胺的100-1000倍，增加毛細(xì)血管滲透性，刺激粘液分泌，在哮喘發(fā)病過(guò)程中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)旨在試驗(yàn)化合物1，2，3對(duì)LTC4受體拮抗作用。
方法取卵白蛋白致敏豚鼠回腸縱肌，加入阿托品和氯并吡胺，以LTC4引發(fā)回腸收縮，作為收縮最大值，再分別加入化合物I、II、III，濃度、測(cè)量值、測(cè)量回腸縱肌收縮幅度，計(jì)算收縮抑制率，評(píng)價(jià)其對(duì)LTC4受體拮抗作用。
結(jié)果化合物I、II、III對(duì)LTC4受體有較強(qiáng)的抑制作用，其IC50分別為10-7、5×10-7和4×10-5mol/L。結(jié)果見(jiàn)表2。
表2化合物I、II、III對(duì)LTC4受體拮抗作用對(duì)LTC4受體拮抗作用化合物(IC50，mol/L)I 1×10-7II 5×10-5III 4×10-5實(shí)施例3化合物I、II、III對(duì)IL-8生成抑制作用IL-8為一種多源性細(xì)胞因子，對(duì)白細(xì)胞有極強(qiáng)的趨化聚集活性，可顯著誘導(dǎo)白細(xì)胞吞噬、脫顆粒、呼吸爆發(fā)、釋放溶酶體酶和產(chǎn)生超氧陰離子等，與多種疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、過(guò)敏性哮喘等密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟诳疾旎衔颕、II、III對(duì)IL-8生成抑制作用。
方法以LPS刺激HL-60細(xì)胞，分別加入不同濃度化合物I、II、III，37℃培養(yǎng)24小時(shí)，收集上清液用ELISA法測(cè)定IL-8水平，比較對(duì)IL-8生成抑制率(％)。
結(jié)果化合物I、II、III對(duì)LPS激活HL-60細(xì)胞IL-8生成有明顯的抑制作用，IC50分別為2×10-10、1.9×10-9、2.2×10-8mol/L。結(jié)果見(jiàn)表3。
表3化合物1，2，3對(duì)IL-8生成抑制作用對(duì)IL-8生成抑制作用化合物(IC50，mol/L)I 2×10-10II 1.9×10-9III 2.2×10-8實(shí)施例4化合物I、II、III對(duì)IL-8和fMLP誘導(dǎo)PMN趨化的抑制作用炎癥過(guò)程中，白細(xì)胞向炎癥部位移行、趨化、聚集，釋放炎癥介質(zhì)，IL-8和fMLP為極強(qiáng)的趨化劑，在它們的誘導(dǎo)下，加劇炎癥過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谟^察化合物I、II、III對(duì)抗fMLP、IL-8誘導(dǎo)白細(xì)胞趨化作用。
方法制備大鼠外周血中性粒細(xì)胞，濃度為2.5×106細(xì)胞/ml，利用Boyden趨化小室進(jìn)行試驗(yàn)，分別加入IL-8(1μg/ml)或fMLP(10-9mol/L)，及被測(cè)樣品，37℃，3小時(shí)，鏡下計(jì)數(shù)趨化的白細(xì)胞數(shù)。
結(jié)果化合物I、II、III可抑制對(duì)IL-8誘導(dǎo)PMN趨化作用，IC50分別為1.1×10-11、1.1×10-8、7.1×10-10mol/L，對(duì)fMLP誘導(dǎo)PMN趨化的IC50分別為4.8×10-13、4×10-10、1.6×10-8mol/L。結(jié)果見(jiàn)表4。
表4化合物I、II、II對(duì)不同刺激劑誘導(dǎo)中性細(xì)胞趨化的抑制作用對(duì)不同刺激劑誘導(dǎo)中性細(xì)胞趨化的抑制作用(IC50，mol/L)化合物IL-8 fMLPI 1.1×10-114.8×10-13II 1.1×10-84×10-10III7.1×10-101.6×10-10實(shí)施例5化合物I、II、III對(duì)IL-8抑制小鼠體內(nèi)白細(xì)胞趨化作用方法小鼠背部造成氣囊后，分別皮下注射化合物I、II、III各50mg/Kg，30分鐘后，氣囊內(nèi)注射IL-81μg/0.5ml，4小時(shí)后處死小鼠，計(jì)數(shù)小鼠氣囊內(nèi)白細(xì)胞聚集數(shù)，并與對(duì)照組比較，計(jì)算抑制率(％)。
結(jié)果化合物I、II、III在50mg/Kg劑量下皮下注射，可抑制IL-8誘導(dǎo)的小鼠體內(nèi)白細(xì)胞趨化作用，抑制率分別為52.4％、12.2％、和77％。結(jié)果見(jiàn)表5。
表5化合物I、II、III對(duì)小鼠體內(nèi)白細(xì)胞趨化抑制作用劑量 對(duì)小鼠體內(nèi)白細(xì)胞趨化抑制率化合物(mg/Kg) (％)I 5052.3II 5012.2III5077.0實(shí)施例6化合物I、II、III和Vit對(duì)小鼠耳部巴豆油炎癥抑制作用機(jī)體在外界因素，如化學(xué)物質(zhì)、感染、機(jī)械損傷、抗原等作用下產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，造成局部血管擴(kuò)張、毛細(xì)血管通透性增加、白細(xì)胞浸潤(rùn)，表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛。巴豆油為一強(qiáng)致炎劑，涂在小鼠耳部，可引起小鼠耳部急性炎癥。本實(shí)驗(yàn)用巴豆油誘發(fā)小鼠耳部腫脹，觀察化合物I、II、III和Vit對(duì)小鼠耳部巴豆油炎癥的抑制作用。
方法小鼠皮下分別注射化合物I、II、III各50mg/Kg，Vit 100mg/Kg，30分鐘后左耳涂2％巴豆油液50μl，4小時(shí)后處死動(dòng)物，剪下左右耳片，用不銹鋼銃子沖下左右耳片，稱重，左右耳片重量差表示耳腫脹度，與對(duì)照組比較計(jì)算腫脹抑制率(％)。
結(jié)果化合物I、II、III和Vit對(duì)小鼠耳部巴豆油炎癥抑制率分別為22.9％、22.8％、17.5％和29.4％。表明四者有一定的抗炎作用，結(jié)果見(jiàn)表6。
表6化合物1，2，3和Vit對(duì)小鼠耳部巴豆油炎癥抑制作用劑量 耳部腫脹抑制率化合物(mg/Kg)(％)I50 22.9II 50 22.8III 50 17.5Vit 10029.4實(shí)施例7化合物I、II、III和Vit對(duì)小鼠角叉菜膠足腫脹抑制作用小鼠足跖注射角叉菜膠，引起踝關(guān)節(jié)腫脹，形成急性炎癥。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谠囼?yàn)化合物I、II、III和Vit對(duì)急性炎癥的抑制作用。
方法小鼠分別皮下注射化合物I、II、III各50mg/Kg，Vit 100mg/Kg，30分鐘后，右后足跖皮內(nèi)注射1％角叉菜膠，4小時(shí)后沿足關(guān)節(jié)剪下左右足，稱重，以兩者重量差為腫脹度，計(jì)算腫脹抑制率(％)。
結(jié)果化合物I、II、III和Vit可抑制小鼠角叉菜膠性足腫脹，抑制率分別為23.8％、28.2％、17.9％和26.7％。結(jié)果見(jiàn)表7。
表7化合物1，2，3和Vit對(duì)小鼠角叉菜膠足腫脹的抑制作用劑量 足腫脹抑制率化合物(mg/Kg) (％)I 50 23.8II 50 28.2
III50 17.9Vit10026.7實(shí)施例8化合物I、II、III和Vit對(duì)小鼠2，4-二硝基氟苯(DNFB)致IV型變態(tài)反應(yīng)的抑制作用小鼠以DNFB為半抗原，涂于皮膚，與皮膚蛋白結(jié)合成抗原使皮膚致敏，當(dāng)抗原再次攻擊后產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)，引起遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谟^察化合物I、II、III和Vit對(duì)小鼠IV型變態(tài)反應(yīng)的抑制作用。
方法小鼠腹部脫毛，致敏前2天分別皮下注射化合物I、II、III和Vit，連續(xù)7天。以1％DNFB致敏，5天后再以1％DNFB攻擊小鼠左耳，24小時(shí)后處死動(dòng)物，剪下左右耳廓，用直徑8mm不銹鋼銃子沖下左右耳片，稱重，以左右耳片重量差表示腫脹度，計(jì)算腫脹抑制率(％)。
結(jié)果化合物I、II、III和Vit對(duì)小鼠DNFB致IV型變態(tài)反應(yīng)有較強(qiáng)的抑制作用，抑制率分別為30％、40.7％、36.5％和40.5％。見(jiàn)表8。
表8化合物1，2，3和Vit對(duì)小鼠IV型變態(tài)反應(yīng)的抑制作用劑量對(duì)IV型變態(tài)反應(yīng)耳腫脹抑制率化合物(mg/kg) (％)I 50 30.9II 50 40.7III50 36.5Vit100 40.5實(shí)施例9化合物I、II對(duì)化合物48/80誘導(dǎo)的大鼠腹腔肥大細(xì)胞脫顆粒的抑制作用在炎癥時(shí)，肥大細(xì)胞在致敏劑作用下細(xì)胞膜破裂，釋放炎癥介質(zhì)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谟^察化合物I、II對(duì)抗肥大細(xì)胞脫顆粒作用。
方法取大鼠腹腔肥大細(xì)胞，并調(diào)節(jié)其濃度為104細(xì)胞/10ml，分別加入化合物I、II與化合物48/80(終濃度30μg/ml)，37℃培育3分鐘，滴加在預(yù)先涂有中性紅的玻片上，鏡下計(jì)數(shù)，計(jì)算肥大細(xì)胞脫顆粒百分?jǐn)?shù)及待測(cè)物對(duì)肥大細(xì)胞脫顆粒抑制作用。
結(jié)果化合物I、II在10-4mol/L濃度下，對(duì)化合物48/80誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒有一定的抑制作用，抑制率分別為43.1％和29.8％。見(jiàn)表9。
表9化合物I、II對(duì)肥大細(xì)胞脫顆粒的抑制作用濃度 肥大細(xì)胞脫顆粒的抑制率化合物(mol/L) (％)I 10-443.1II10-429.8實(shí)施例10Vit在體內(nèi)抗致敏豚鼠哮喘作用當(dāng)卵白蛋白致敏豚鼠再次以卵白蛋白攻擊時(shí)產(chǎn)生過(guò)敏性哮喘，實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谟^察山葡萄總聚芪有效部位群對(duì)抗致敏豚鼠體內(nèi)哮喘的作用。
方法豚鼠以卵白蛋白致敏，8天后豚鼠皮下注射Vit 200mg/Kg，連續(xù)給藥6天，每天一次，致敏14天后以卵白蛋白攻擊，觀察豚鼠哮喘發(fā)作潛伏期及哮喘動(dòng)物數(shù)。
結(jié)果Vit 200mg/Kg，皮下注射給藥，可明顯延長(zhǎng)致敏豚鼠哮喘潛伏期，減輕哮喘癥狀，減少哮喘動(dòng)物數(shù)。見(jiàn)表10。
表10 Vit在體內(nèi)抗致敏豚鼠的哮喘作用劑量 哮喘潛伏期組別發(fā)生哮喘動(dòng)物數(shù)(mg/Kg)(秒)Vit20010.4 3/5，哮喘動(dòng)物哮喘癥狀輕，僅見(jiàn)腹式呼吸。
5/5，哮喘動(dòng)物哮喘癥狀重，可見(jiàn)點(diǎn)頭呼吸、對(duì)照 / 0咳嗽、紫紺，其中1/5動(dòng)物抽搐死亡。
劑型制備制備例1化合物1，2，3(任選一種)50g，加入糊精247.5g，硬脂酸鎂2.5g，按膠囊制備法制成1000粒，填裝于250mg膠囊，每粒含化合物50mg。
制備例2山葡萄有效部位群(Vit)100g，加入糊精147.5g，硬脂酸鎂2.5g，充分拌均勻后，按膠囊制備法制成1000粒，填裝于250mg膠囊，每粒含Vit 100mg，其總聚芪含量不低于50％。
權(quán)利要求
1.山葡萄提取的總聚茋有效部位群在制備抗炎癥疾病藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的有效部位群中含有如通式(I)所示的山葡萄辛素、如通式(II)所示的毛葡萄甲素、如通式(III)所示的坡壘醇中至少一種。
2.如式(I)所示化合物的山葡萄辛素在制備抗炎癥疾病藥物中的應(yīng)用。
3.如式(II)所示化合物的毛葡萄甲素在制備抗炎癥疾病藥物中的應(yīng)用。
4.如式(III)所示化合物的坡壘醇在制備抗炎癥疾病藥物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4的應(yīng)用，其特征在于，所述的炎癥疾病包括過(guò)敏性哮喘病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬。
6.一種藥物組合物，其特征在于，含有治療有效劑量的從山葡萄提取的總聚茋有效部位群及藥用載體。
7.一種藥物組合物，其特征在于，含有治療有效劑量的如式(I)所示化合物的山葡萄辛素及藥用載體。
8.一種藥物組合物，其特征在于，含有治療有效劑量的如式(II)所示化合物的毛葡萄甲素及藥用載體。。
9.一種藥物組合物，其特征在于，含有治療有效劑量的式(III)所示化合物的坡壘醇及藥用載體。
10.根據(jù)權(quán)利要求5的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物包括片劑、膠囊、丸劑、注射劑、緩釋制劑、控釋制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了從山葡萄中提取的總聚茋有效部位群、低聚茋化合物山葡萄辛素，毛葡萄甲素，坡壘醇在制備抗炎癥疾病藥物中的用途。
文檔編號(hào)A61P17/06GK1600304SQ0313464
公開(kāi)日2005年3月30日 申請(qǐng)日期2003年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月23日
發(fā)明者程桂芳, 林茂, 侯琦, 黃開(kāi)勝, 李娜, 白金葉 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所