專利名稱：一種銀杏內(nèi)酯針劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物制劑的制備方法，更具體地說，涉及一種銀杏內(nèi)酯B針劑的制備方法。
背景技術(shù)：
從銀杏葉中提取的多種有效成分中，銀杏內(nèi)酯類(A，B，C，等)為其重要成分；而在銀杏內(nèi)酯類中，又以銀杏內(nèi)酯B(Ginkgolide B，以下簡稱GB)生物活性最強(qiáng)，約為銀杏內(nèi)酯A的2～3倍，故倍受人關(guān)注。但由于GB在銀杏葉中含量較低及分離純化較困難等原因，故用混合內(nèi)酯(含內(nèi)酯A，B，C)做針劑的見有報(bào)道，用GB單體制備針劑的國內(nèi)尚未見報(bào)道。
在國外文獻(xiàn)中，多見對GB的藥理研究，僅見有法國Beaufour-lpsen公司用GB單體制成的針劑(代號BN52021)，治療與血小板活化因子(PAF)拮抗劑相關(guān)的某些疾病(如潰瘍、過敏、哮喘、某些炎癥、臟器移植的異體排斥等)進(jìn)行臨床試驗(yàn)的報(bào)道，但目前尚無正式產(chǎn)品問世。
銀杏內(nèi)酯B的化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有三個內(nèi)酯環(huán)，在中性或酸性條件下為閉環(huán)形式，在水中難溶解，制備針劑較困難；當(dāng)在堿性條件下，pH值在7.4～12為開環(huán)形式，隨著pH值的增加，可有一個、二個乃至三個內(nèi)酯完全開環(huán)成鹽。開環(huán)后的內(nèi)酯在水中易溶解，便于制成針劑，但化學(xué)性質(zhì)也變得對熱不大穩(wěn)定，所以須制成凍干針劑保存使用。制備較復(fù)雜需特殊設(shè)備，還有文獻(xiàn)報(bào)道認(rèn)為GB閉環(huán)結(jié)構(gòu)型式為其主要活性型式，開環(huán)后活性減弱[US Patent，No.5798342]。
“BN 52021”是部分開環(huán)形式制備的GB凍干粉針劑，這也許是其臨床效果未達(dá)到預(yù)期的原因之一[Brochet B，etalJ Neurology，Neurosurgery andPsychiatry.1995，58360-362]。國內(nèi)張平[中國專利申請?zhí)?2134223.7]、陳仲良[中國專利申請?zhí)?0115134.7]等也是用堿開環(huán)法制備銀杏混合內(nèi)酯針劑。
由銀杏葉中提取所得純品均為閉環(huán)形式，性質(zhì)穩(wěn)定，難溶于水。曾見有用丙二醇等為溶劑制備銀杏混合內(nèi)酯針劑的[中國專利申請?zhí)?7107809.2]，經(jīng)本發(fā)明人試驗(yàn)，它對GB的溶解度不夠理想。因此，尋找研制銀杏內(nèi)酯B針劑的新方法，成為當(dāng)務(wù)之急。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于彌補(bǔ)上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，而提供一種制備簡便、效果好的銀杏內(nèi)酯B針劑的制備方法。
本發(fā)明的目的是通過如下措施來實(shí)現(xiàn)。選純品GB(閉環(huán)形式)為原料藥，溶解于注射用的非水溶劑—低分子量的聚乙二醇(PEG-400或PEG-300)中，聚乙二醇可單獨(dú)使用，或與無水乙醇組成的混合溶劑使用；PEG與乙醇的比例(按體積計(jì))可在0.5∶0.5～0.9∶0.1范圍，優(yōu)選0.6∶0.4以上，即PEG所占比例較大些為好；混合溶劑中可加或不加助溶劑表面活性劑，如吐溫類(吐溫-80等)，按重量計(jì)GB∶吐溫＝1∶1～1∶3范圍為好，可使GB溶液在稀釋注射時不易析出，充分?jǐn)嚢杌虺曊鹗?，進(jìn)行后處理；所述的后處理是指過濾、灌封、滅菌、檢測，即得產(chǎn)品，使用前稀釋于適量的等滲氯化鈉注射液中，搖勻、供靜脈注射使用。
本發(fā)明的針劑相比現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)制備工藝簡便，不需凍干設(shè)備，即將GB加選用的“溶劑”溶解，經(jīng)過濾、灌封、滅菌，即得。每毫升含10-20毫克GB的滅菌溶液。臨用前稀釋于適量的等滲氯化鈉注射液中，含GB 4-40毫克/100毫升，供靜脈滴注用。
用本法制備的GB針劑化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，加熱滅菌后用高效液相色譜法檢測，質(zhì)量合格未見有明顯的分解產(chǎn)物，穩(wěn)定性試驗(yàn)證明性質(zhì)穩(wěn)定。經(jīng)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，對大鼠MCAT模型最低有效劑量為4-8mg/kg/日，證明對心腦血管病有治療作用。
具體實(shí)施方法下面列舉5個實(shí)施例，結(jié)合實(shí)施例及主要藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1GB 20,000mgPEG-400(或PEG-300)加至 1000ml配制稱取GB置容器中，加入溶劑PEG，攪拌或超聲震蕩溶解，加溶劑至全量，混合均勻；經(jīng)過濾、灌封、滅菌，即得。
臨用前稀釋于適量的等滲氯化鈉注射液中(4-40毫克/100毫升)，靜脈滴注。
實(shí)施例2GB 10,000mgPEG-400(或PEG-300)加至 1000ml配制方法同實(shí)施例1。
實(shí)施例3GB 20,000mgPEG-400(或PEG-300)加至 1000ml(注PEG-400∶乙醇＝0.5∶0.5～0.9∶0.1；PEG-300代替PEG-400)配制取GB置容器中，加入事先按預(yù)定比例混合好的混合溶劑，然后按實(shí)施例1的方法制得本發(fā)明產(chǎn)品。
實(shí)施例4GB 10,000mg混合溶劑(PEG-400-乙醇)加至 1000ml(注PEG-400∶乙醇＝0.9∶0.1；PEG-400可用PEG-300代替)配制方法同實(shí)施例3。
實(shí)施例5GB15,000mg吐溫-80 20,000mg混合溶劑(PEG-400-乙醇)加至1000ml(注PEG-400∶乙醇＝0.5∶0.5)配制稱取GB置容器中，將吐溫-80加入事先按預(yù)定比例混合好的混合溶劑中，再將三者混好的混合溶劑加入GB中，攪拌或于超聲波震蕩器中超聲使溶解，加混合溶劑至全量，混勻。經(jīng)過濾、灌封、滅菌，即得。
臨用前稀釋于適量的等滲氯化鈉注射液中(4-40毫克/毫升)，靜滴。
銀杏內(nèi)酯B注射液兩種溶媒對MCAT大鼠腦梗塞范圍的影響地點(diǎn)北京中醫(yī)藥大學(xué)藥理系[試驗(yàn)材料]一、藥物與試劑受試藥銀杏內(nèi)酯B注射液(1)解放軍總醫(yī)院開發(fā)部提供，每支5ml，每毫升含銀杏內(nèi)酯B10mg，溶媒為溶媒1(不含吐溫-80)，大鼠用量16、8、4mg/kg/日。
受試藥銀杏內(nèi)酯B注射液(2)解放軍總醫(yī)院開發(fā)部提供，每支5ml，每毫升含銀杏內(nèi)酯B10mg，溶媒為溶媒2(含吐溫-80)，大鼠用量16、8、4mg/kg/日。
金納多注射液德國威瑪舒培博士藥廠產(chǎn)品，每支5ml，每毫升含黃酮苷0.84mg，批號1060602，人用量為20-40ml/人/日，大鼠用量6.7ml/kg/日。
化學(xué)試劑FeCl3·6H2O(A.R.)，北京化工廠生產(chǎn)，用1mol/L鹽酸配制；紅四氮唑(TTC)，北京化工廠生產(chǎn)，批號950221。
二、動物SD大鼠，雌雄兼用，體重190～210g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，合格證號SCXK 11-00-0008。
三、儀器XTT實(shí)體顯微鏡，北京電光科學(xué)儀器廠生產(chǎn)；恒溫水浴振蕩器SHZ-22型，江蘇大倉醫(yī)療器械廠生產(chǎn)；電子分析天平，AEG-220型，日本島津產(chǎn)。
一、銀杏內(nèi)酯B注射液對大腦中動脈血栓模型(Middle Cerebral ArteryThrombosis MCAT)大鼠神經(jīng)癥狀的影響(一)分組及給藥實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為十一組，即MCAT模型組、溶媒1組、溶媒2組、銀杏內(nèi)酯B注射液(1)16、8、4mg/kg組、銀杏內(nèi)酯B注射液(2)16、8、4mg/kg組、金納多注射液6.7ml/kg組、假手術(shù)組。造模前預(yù)防給藥兩天(ip)，每天一次；造模后即刻舌下靜脈給藥一次，第四次給藥(ip)后一小時取材。給藥組給予相應(yīng)的藥物；溶媒1組和溶媒2組分別給予相應(yīng)的溶媒1.6ml/kg體重；MCAT模型組、假手術(shù)組給予生理鹽水1.6ml/kg體重。
(二)實(shí)施造模手術(shù)大鼠腹腔注射12％水合氯醛溶液(350mg/kg)麻醉。按Tamura等的方法[Tamura A，Graham DI，McCulloch J et al.Focal Cerebral ischemia inthe rat.1.Description Of technique and early neuropathological consequences followingmiddle Cerebral artery occlusion.J Cereb Blood Flow Metab，1981；153]，稍加修改。大鼠右側(cè)臥位固定，在眼外眥和外耳道連線中點(diǎn)作一弧形切口，長約1.5cm，夾斷顳肌并切去，暴露顳骨，用牙科鉆在顴骨與顳鱗骨接合處向口側(cè)1mm處作一直徑2.5mm骨窗，清理殘?jiān)?，暴露大腦中動脈(位于嗅束及大腦下靜脈之間)。將吸有50％氯化鐵溶液(1mol/L鹽酸)10μl的小片定量濾紙敷在此段大腦中動脈上[劉小光，徐理納一種能評價(jià)溶栓藥和抗拴藥的大鼠大腦中動脈血栓模型。藥學(xué)學(xué)報(bào)1995，30662]，約30min待血管顏色變黑后取下濾紙，用生理鹽水沖洗局部組織，逐層縫合，回籠飼養(yǎng)。
(三)行為檢測在術(shù)后不同時間(6h，24h)，按Bederson等[Lundy EF.SolikBS，F(xiàn)rank RS et al Morphometric evaluation of brain infarcts in rats and gerbils.JPharamacol Method，1986，16201]的方法并加以改進(jìn)，對動物進(jìn)行行為評分。1.提鼠尾離開地面約一尺，觀察前肢屈曲情況。如雙前肢對稱伸向地面，記為0分；如手術(shù)對側(cè)前肢出現(xiàn)肩屈曲、肘屈曲、肩內(nèi)旋或既有腕肘的屈曲又有內(nèi)旋者，記為1分。2.將動物置于平滑地面上，分別推雙肩向?qū)?cè)移動，檢查阻力。如雙側(cè)阻力對等且有力記為0分；如向手術(shù)對側(cè)推動時阻力下降者，記為1分。3.將動物兩前肢置一金屬網(wǎng)上，觀察兩前肢的肌張力。雙側(cè)肌張力對等且有力者為0分；手術(shù)對側(cè)前肢肌張力下降記為1分。4.提鼠尾離開地面約一尺，動物有不停地向手術(shù)對側(cè)旋轉(zhuǎn)者，記為1分。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)評分，滿分為4分，分?jǐn)?shù)越高，動物的行為障礙越嚴(yán)重。
(四)結(jié)果分析對行為檢測打分值進(jìn)行組間比較，t檢驗(yàn)。
結(jié)果顯示，假手術(shù)組未見行為異常改變，MCAT模型組、溶媒1、2組大鼠在術(shù)后6h，24h均出現(xiàn)偏癱樣癥狀，主要表現(xiàn)為手術(shù)對側(cè)前肢內(nèi)收，肩內(nèi)旋，前肢肌張力降低，肩抗力下降。銀杏內(nèi)酯B注射液(1)各劑量組的大鼠在術(shù)后24h，其神經(jīng)癥狀均有不同程度的改善，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，差異顯著(P＜0.05)。
二、銀杏內(nèi)酯B注射液對MCAT大鼠腦梗塞范圍的影響動物經(jīng)末次行為評分后即大鼠造模24小時，斷頭取腦。去掉嗅球、小腦和低位腦干，剩余部份在4℃以下冠狀切成5片。迅速將腦片置于TTC染液中(每5ml染液中含4％TTC 1.5ml，1M K2HPO40.1ml)，37℃避光溫孵30分鐘，再取出，置于10％甲醛液中避光保存。經(jīng)染色后非缺血區(qū)為玫瑰紅色，梗塞區(qū)為白色[見Lundy EF]。將白色組織仔細(xì)挖下稱重，以梗塞組織重量占總腦重量的百分比作為腦梗塞范圍。結(jié)果進(jìn)行組間比較，t檢驗(yàn)。結(jié)果見表1，2，3。
表-1 銀杏內(nèi)酯B注射液對MCAT大鼠腦組織梗塞范圍的影響劑量 例 梗塞組織重量占總腦組別抑制率(％)(mg/kg) 數(shù) 重量的百分比(％)溶媒1組- 106.98±1.91銀杏內(nèi)酯B注射液(1)組 16 105.11±1.51* 26.798 104.94±1.76* 29.234 104.86±1.40* 30.37金納多注射液組 6.7ml 9 4.42±2.18* 36.68假手術(shù)組 NS 110±0** 100注與溶媒1組相比*P＜0.05，**P＜0.01。
表-2 銀杏內(nèi)酯B注射液對MCAT大鼠腦組織梗塞范圍的影響劑量 例 梗塞組織重量占總腦組別抑制率(％)(mg/kg) 數(shù) 重量的百分比(％)溶媒2組 - 10 5.53±1.95銀杏內(nèi)酯B注射液(2)組 16 9 3.75±1.52** 32.198 10 4.64±0.8516.094 10 4.07±1.65* 26.40金納多注射液組6.7ml 9 4.42±2.1820.07假手術(shù)組 NS 11 0±0**100注與溶媒2組相比*P＜0.05，**P＜0.01。
表-3 銀杏內(nèi)酯B注射液對MCAT大鼠腦組織梗塞范圍的影響劑量 例梗塞組織重量占總腦組別(mg/kg) 數(shù)重量的百分比(％)MCAT模型組NS 6 6.04±1.97溶媒1組 1.6 10 6.98±1.91溶媒2組 1.6 10 5.53±1.95金納多注射液組6.7 9 4.42±2.18假手術(shù)組 NS 11 0±0**注與MCAT模型組相比**P＜0.01。
結(jié)果顯示，術(shù)后24h，除假手術(shù)組未見異常改變外，MCAT模型組、溶媒1、2組大鼠、各給藥組的大鼠均有不同程度梗塞灶、銀杏內(nèi)酯B注射液(1)可明顯減少梗塞程度，與溶媒1組相比具有顯著差異(P＜0.05)。銀杏內(nèi)酯B注射液(1)4mg/kg可明顯減少梗塞程度，與溶媒2組相比具有顯著差異(P＜0.05)。
本發(fā)明表明，銀杏內(nèi)酯B注射液可顯著減少大鼠局灶性腦缺血的梗塞范圍。兩種溶媒作用顯示，溶媒2對MCAT模型的梗塞范圍有一定抑制作用，故銀杏內(nèi)酯B注射液(2)各劑量組與溶媒2比較統(tǒng)計(jì)學(xué)意義不明顯，但從梗塞范圍大小來看銀杏內(nèi)酯B注射液(2)對大鼠局灶性腦缺血的梗塞范圍的抑制作用更強(qiáng)一些。
權(quán)利要求
1.一種銀杏內(nèi)酯B針劑的制備方法，其特征在于包括以下順序步驟將銀杏內(nèi)酯B原料溶解于注射用非水溶劑聚乙二醇中，聚乙二醇可單獨(dú)使用或與無水乙醇配成混合溶劑，按體積計(jì)，聚乙二醇∶乙醇＝0.5∶0.5～0.9∶0.1，可加或不加表面活性劑，充分?jǐn)嚢杌虺曊鹗?，進(jìn)行后處理。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的注射用非水溶劑，是低分子量聚乙二醇PEG-400或PEG-300。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于表面活性劑，是吐溫類的吐溫-80，按重量計(jì)，GB∶吐溫-80＝1∶1～1∶3。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種銀杏內(nèi)酯針劑的制備方法，該方法是把銀杏內(nèi)酯B溶于注射用非水溶劑，如聚乙二醇，加或不加無水乙醇成混合溶劑，加或不加表面活性劑，經(jīng)攪拌或超聲震蕩，及后處理即得產(chǎn)品，詳細(xì)步驟和配方見說明書。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)是制備簡便，不需凍干設(shè)備，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，方便貯運(yùn)，藥效好。本發(fā)明產(chǎn)品主要用于治療心腦血管病。
文檔編號A61K31/365GK1513449SQ03137720
公開日2004年7月21日 申請日期2003年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月20日
發(fā)明者梅世昌, 陶忠華, 廖杰, 周春喜 申請人:梅世昌, 陶忠華, 廖杰