專利名稱：一種雷蘑提取物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種真菌提取物及其應(yīng)用，特別涉及一種雷蘑提取物及其在制備治療癌癥藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，惡性腫瘤已成為人類主要的死亡原因之一。我國每年新出現(xiàn)的腫瘤患者約100萬，死亡80萬左右。特別是白血病，近年來呈上升趨勢，嚴重地危害人類的生命和健康，而且大多患者是兒童和青少年。以白血病為代表的兒童惡性腫瘤目前已經(jīng)成為我圍5-15歲兒童的第二大死亡原因，每年平均有兩萬左右十五歲以下的兒童患白血病?？茖W(xué)家至今無法摸清造成白血病的原因。因此惡性腫瘤的防治成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)亟待解決的重大課題。許多科學(xué)家和醫(yī)學(xué)工作者進行了大量研究，得到很多能夠殺死和抑制腫瘤細胞的藥物，但同時這些藥物也對正常細胞產(chǎn)生一定程度的危害性。
70年代初，人們開始研究是否可以通過誘導(dǎo)分化，使腫瘤細胞向正常細胞分化，從而達到治療惡性腫瘤地目的。腫瘤細胞的誘導(dǎo)分化療法優(yōu)于傳統(tǒng)的化療和放療，該療法不是殺傷腫瘤細胞，而是在分化誘導(dǎo)劑的作用下，誘導(dǎo)腫瘤細胞向成熟階段分化，恢復(fù)細胞的正?；蚪咏５谋硇秃凸δ?。當(dāng)前，尋找腫瘤細胞分化誘導(dǎo)劑已成為新的研究領(lǐng)域。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)十余種化合物可以作為腫瘤細胞分化誘導(dǎo)劑。其中研究最多的是維甲酸類化合物(RA)與雜極性化合物，如二甲亞砜(DMSO)、六亞甲基雙乙酰胺(HMBA)、丁酸等。據(jù)文獻報導(dǎo)二甲亞砜誘導(dǎo)率為80％，是公認最好的誘導(dǎo)劑。1986年我國首先應(yīng)用全反式維甲酸(ATRA)誘導(dǎo)分化治療急性早幼粒細胞白血病，取得了良好效果。上海第二醫(yī)科大學(xué)瑞金醫(yī)院上海血液學(xué)研究所與哈爾濱醫(yī)科大學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)可以使用As2O3治療急性早幼粒細胞白血病，其機制主要是促進急性早幼粒細胞凋亡。雖然ATRA及As2O3在治療急性早幼粒細胞白血病上取得了成功，維甲酸、HMBA已進入臨床階段，但是這些藥物都屬純化學(xué)藥劑，副作用很大，而且在適應(yīng)病情范圍、劑量依賴的毒性等方面存在著局限性，還不能廣泛應(yīng)用于臨床腫瘤治療。
我國作為一個中藥大國，利用我們的傳統(tǒng)優(yōu)勢，在中藥抗癌方面作了很多研究。發(fā)現(xiàn)很多類中草藥能夠抑制癌細胞生長，而且毒性較低。目前已開發(fā)了一些能夠治療癌癥的中草藥，如靈芝孢子粉、云芝多糖、香菇多糖以及已經(jīng)上市的天仙丸等。但是由于這些中草藥成分復(fù)雜，其有效成分及機理還未研究清楚，且療效不顯著，不適用于白血病和肝癌。
雷蘑是一種天然傘菌目白蘑科口蘑屬的口蘑，拉丁名為Leucopaxillusgiganteus；其子實體夏秋季生長在草原上，子實體菌蓋約5-30cm，常見于秋季的內(nèi)蒙古錫林郭勒草原。目前對雷蘑的應(yīng)用尚處于開發(fā)階段，對其含有的各類化學(xué)成分沒有詳細研究記載，中藥方一般用于透發(fā)小兒麻疹，治療感冒，抗肺結(jié)核桿菌等。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種能夠得到有效利用的雷蘑提取物。
一種雷蘑提取物，是通過下述方法得到的將雷蘑攪碎，加入其8-12倍體積0.6-0.8％的NaCl水溶液或水，離心，取上清或用120-200目網(wǎng)過濾，取濾液，即為雷蘑提取物。
本發(fā)明的雷蘑提取物可以從野生的雷蘑子實體也可以從人工培養(yǎng)的雷蘑菌絲體中提取。
所述雷蘑一般選用干燥雷蘑，為了使雷蘑的有效成分得到充分釋放，應(yīng)將干燥雷蘑子實體粉碎機粉碎至70-90目。
所述NaCl水溶液或水的體積優(yōu)選的為雷蘑體積的10倍，所述NaCl水溶液的濃度優(yōu)選的是0.7％。
所述離心為4000轉(zhuǎn)20分鐘。
所述雷蘑提取物經(jīng)電泳及全光譜分析表明，其有效成分主要為多糖蛋白及小分子肽類，其中還含有杯傘素(Clitocybin)。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種治療癌癥的藥物。
本發(fā)明所提供的治療癌癥的藥物，它的活性成分是上述雷蘑提取物。
需要的時候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等，必要時還可以加入香味劑、甜味劑等。
本發(fā)明的藥物可以制成注射液、片劑、粉劑、粒劑、膠囊、口服液、膏劑、霜劑等多種形式，優(yōu)選為口服液。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
上述藥物的用量一般為提取物原液0.2ml/kg/day，還應(yīng)加入藥學(xué)上可接受的載體，稀釋劑、吸收促進劑、香味劑、甜味劑等。療程一般為45-60天。
本發(fā)明的雷蘑提取物含有誘導(dǎo)分化因子，在一定的濃度下能誘導(dǎo)癌細胞向正常細胞分化；經(jīng)體外細胞實驗驗證，該提取物不但能夠殺死白血病細胞而且對人體正常細胞無任何殺傷作用，無毒副作用；與目前國內(nèi)外常見同類藥物比較，本發(fā)明的誘導(dǎo)分化率均高于其他誘導(dǎo)分化劑，發(fā)明人用常規(guī)方法在同等條件下做誘導(dǎo)分化試驗比較，二甲亞砜DMSO誘導(dǎo)分化極微量，目前已上臨床試驗的維甲酸僅30％左右，而本發(fā)明的雷蘑提取物誘導(dǎo)分化率達到40％以上，且用量較少，是一種非常有開發(fā)價值的抗癌藥物。
具體實施例方式
實施例1、培養(yǎng)雷蘑菌絲體取新鮮雷蘑子實體，在無菌條件下，去凈表面雜物，用70％酒精消毒，然后用無菌解剖刀將子實體剖成兩半，割取子實體菌柄與菌蓋交接處的中間部分約黃豆大小的組織塊，接入試管培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基地配方為蔗糖20g、土豆200g、KH2PO43g、MgSO40.5g、維生素B12mg、瓊脂10g、水1000ml，pH6.1(pH6.0-6.2均可)，29℃(28℃-30℃均可)恒溫培養(yǎng)15天(10-20天均可)，在培養(yǎng)基表面生長出濃密的雷蘑原代菌絲體；再將該雷蘑原代菌絲體接入另一與上述培養(yǎng)基同組分的培養(yǎng)基上進行傳代培養(yǎng)3代(1-4代均可)，得到馴化的雷蘑菌絲體菌種；將上述轉(zhuǎn)接得到的馴化雷蘑菌絲體菌種接入經(jīng)滅菌(1.5kg/cm2高壓的條件下滅菌30分鐘)的液體培養(yǎng)基(蔗糖20g、黃豆粉10g、玉米粉10g、KH2PO43g、MgSO40.5g、維生素B12mg、酵母粉1g、CaCO31g、水1000ml)中，并在搖床上29℃(28℃-30℃均可)恒溫培養(yǎng)3天(4-5天均可)，速度為120轉(zhuǎn)/分，然后接入發(fā)酵罐培養(yǎng)，其接種量為10v％，在29℃(28℃-30℃均可)恒溫培養(yǎng)4天(3-5天均可)，并經(jīng)過濾，得到雷蘑菌絲體。
實施例2、制備雷蘑提取物將實施例1得到的雷蘑菌絲體10g(濕重)，絞碎至漿狀，加入100ml 0.7％NaCl水溶液，攪拌10分鐘，4000轉(zhuǎn)離心20分鐘，取上清，得到60ml雷蘑提取物。
實施例3、制備雷蘑提取物將實施例1得到的雷蘑菌絲體10g(濕重)，絞碎至漿狀，加入100ml純凈水，攪拌20分鐘，用200目尼龍網(wǎng)過濾，取濾液，得到60ml雷蘑提取物。
實施例4、制備雷蘑提取物將采集得到的雷蘑子實體10g，干燥，粉碎至80目，加入100ml 0.75％NaCl水溶液，攪拌30分鐘，4000轉(zhuǎn)離心20分鐘，取上清，得到80ml雷蘑提取物。
實施例5、制備雷蘑提取物將采集得到的雷蘑子實體10g，干燥，粉碎至90目，加入100ml純凈水，攪拌30分鐘，用150目尼龍網(wǎng)過濾，得到80ml雷蘑提取物。
實施例6、急性毒性檢測實驗將體重為20克的30只小鼠分為三組第一組10只為對照組，用北京動物飼養(yǎng)中心配制的普通鼠食喂養(yǎng)；第二組10只，用含有雷蘑菌絲體的鼠食，按5g菌絲體(濕重)/d.Kg喂養(yǎng)；第三組10只，用本發(fā)明的雷蘑提取物(用0.7％NaCl或水稀釋至10wt％)，給小鼠灌胃。其它的日常飼養(yǎng)條件相同。
雷蘑提取物按5ml/d.Kg灌胃。
喂養(yǎng)、灌胃30天，稱重，第一組小鼠平均體重為31.2g，第二組小鼠平均體重為32.8g，第三組小鼠平均體重為32.9g。
飼喂雷蘑菌絲體及雷蘑提取物的小鼠的平均體重略高于對照組；且無任何不良反應(yīng)，由此結(jié)果可知，本發(fā)明制備的雷蘑提取物沒有毒性。
實施例7、本發(fā)明雷蘑提取物對肝癌細胞的抑制用中國科學(xué)院動物所提供的S180腹水癌細胞對小鼠進行接種實驗。所用的小鼠為購自北京動物飼養(yǎng)中心的昆明公鼠，體重為20克。將30只小鼠分為五組，每組5只，第一～二組喂養(yǎng)30天，第三～五組喂養(yǎng)60天。
用北京動物飼養(yǎng)中心配制的普通鼠食，或用本發(fā)明的雷蘑提取物(用0.7％NaCl或水稀釋至10wt％)，給小鼠灌胃。
第一組接種癌細胞，使用普通鼠食進行喂養(yǎng)，30天后死亡4只；第二組接種癌細胞，先用普通鼠食喂養(yǎng)被接種的小鼠，一周后小鼠產(chǎn)生腹水，腹部與對照相比明顯漲大，用手觸摸腹部有腹水感覺；此時開始每只用0.2毫升/天的雷蘑提取物灌胃，30天后全部存活，腹部變??；第三組接種癌細胞，使用普通鼠食進行喂養(yǎng)，60天后全部死亡；第四組接種癌細胞，并在接種癌細胞同時每只用0.2毫升/天的雷蘑提取物灌胃，60天后全部存活，無腹水出現(xiàn)；第五組接種癌細胞，先用普通鼠食喂養(yǎng)被接種的小鼠，一周后小鼠產(chǎn)生腹水，腹部與對照相比明顯漲大，用手觸摸腹部有腹水感覺；此時開始每只用0.1毫升/天/只的雷蘑提取物灌胃，60天后全部存活，腹部變小。
將喂藥組解剖肝部觀察，無異常，且癌細胞抑制率達95％，說明本發(fā)明制備的雷蘑提取物對癌細胞具有明顯地抑制作用，但對正常細胞無毒副作用。
將第一、二、四和五組存活的20只小鼠分為兩組，與正常小鼠一起進行體能實驗和耐缺氧實驗。體能實驗將小鼠的尾部用鐵絲捆綁5克重物，使負重的小鼠剛好可以下沉，又能不斷上浮呼吸。耐缺氧實驗把做好記號的小鼠置入密閉容器中，然后逐漸抽取空氣，使容器內(nèi)只剩少量空氣。體能實驗和耐缺氧實驗結(jié)果表明，存活的20只小鼠在體能和耐缺氧方面與正常小鼠并無差異，說明雷蘑提取物可以治愈癌癥，使小鼠恢復(fù)正常。
分組實驗結(jié)果表明，用NaCl水溶液或水從人工菌絲體和天然子實體得到的雷蘑提取物效果相同。
實施例8、本發(fā)明雷蘑提取物對白血病癌細胞的抑制作用人紅白血病細胞株K562是人造血系統(tǒng)的惡性腫瘤細胞，K562白血病細胞系源自美國ATCC。本實驗使用的K562為協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細胞生物室儲存，并用含10％小牛血清的1640培養(yǎng)基按常規(guī)培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)。
將本發(fā)明的雷蘑提取物用0.7％NaCl或無菌水稀釋成1％、0.5％、0.1％的溶液，對人紅白血病K562細胞進行抑制生長驗證。將3×104/ml K562細胞分別接種到96孔板，按8孔一組，分為12組，分別加入1％、0.5％、0.1％的雷蘑提取物200微升，培養(yǎng)1、3、5天后，分別記數(shù)細胞，并繪制生長曲線。實驗結(jié)果表明，200微升的1％，0.5％的提取物，均能100％殺死1000～5000個癌細胞，0.1％的提取物能誘導(dǎo)分化癌細胞，誘導(dǎo)率約40％以上。
實施例9、本發(fā)明雷蘑提取物對免疫器官胸腺、脾臟重量的影響胸腺與脾臟是體內(nèi)的主要免疫器官。胸腺為初級淋巴器官，游走的造血干細胞進入胸腺原基，在此分化增殖成T淋巴細胞(T細胞)，與細胞免疫有關(guān)。脾臟為次級淋巴細胞，免疫活性細胞移行于此，并在此處因受免疫過程中異體抗原刺激而進一步增殖分化和成熟，脾臟中有T淋巴細胞和B淋巴細胞(B細胞)，還有巨噬細胞，與體液免疫、細胞免疫均有密切關(guān)系，一些免疫抑制劑如環(huán)磷酰胺、可的松等，均可使胸腺、脾臟明顯萎縮，免疫增強劑如一些免疫多糖則使胸腺或脾臟增重。
本發(fā)明的雷蘑提取物用0.7％NaCl稀釋成1％，給小鼠灌胃，幼鼠體重11-15g，成年鼠體重18-22g，給藥量幼鼠為0.1g/kg/d，成年鼠為0.5g/kg/d，灌胃給藥7天，每天1次，于末次給藥后24小時后，處死，摘出胸腺及脾臟稱重，以胸腺或脾臟重量(mg)與體重(g)之比作為胸腺或脾指數(shù)。結(jié)果如表1所示表1、提取物對小鼠免疫器官重量的影響

從表1的數(shù)據(jù)可以看出，用本發(fā)明的提取物給小鼠灌胃，可明顯增加小鼠胸腺、脾臟重量。因此推斷本發(fā)明的提取物對動物的免疫功能有增強作用。
權(quán)利要求
1.一種雷蘑提取物，是通過下述方法得到的將雷蘑攪碎，加入其8-12倍體積0.6-0.8％的NaCl水溶液或水，離心，取上清或用120-200目網(wǎng)過濾，取濾液，即為雷蘑提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雷蘑提取物，其特征在于所述雷蘑為干燥雷蘑，并粉碎至70-90目。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雷蘑提取物，其特征在于所述NaCl水溶液或水的體積為雷蘑體積的10倍。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雷蘑提取物，其特征在于所述離心為4000轉(zhuǎn)/分，離心20分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的雷蘑提取物，其特征在于所述NaCl水溶液的濃度為0.7％。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的雷蘑提取物，其特征在于所述雷蘑提取物的有效成分為多糖蛋白、小分子肽類及杯傘素(Clitocybin)。
7.一種治療癌癥的藥物，它的活性成分為雷蘑提取物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的治療癌癥的藥物，其特征在于所述藥物的劑型是任何一種藥劑學(xué)上可接受的劑型。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的治療癌癥的藥物，其特征在于所述藥劑是口服液。
10.根據(jù)權(quán)利要求7或8或9所述的治療癌癥的藥物，其特征在于所述藥物中還添加有藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雷蘑提取物及其應(yīng)用，目的是提供一種雷蘑提取物及以其為活性成分治療癌癥的藥物。一種雷蘑提取物，是通過下述方法得到的將雷蘑攪碎，加入其8－12倍體積0.6－0.8％的NaCl水溶液或水，離心，取上清或用120－200目網(wǎng)過濾，取濾液，即為雷蘑提取物。本發(fā)明還提供了一種以上述雷蘑提取物為活性成分治療癌癥的藥物。本發(fā)明的藥物療效顯著。
文檔編號A61K38/16GK1552417SQ0314085
公開日2004年12月8日 申請日期2003年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月2日
發(fā)明者關(guān)秀清 申請人:中國科學(xué)院植物研究所