專利名稱：豬肺表面活性物質(zhì)凍干粉及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物制劑領(lǐng)域。具體涉及豬肺表面活性物質(zhì)凍干粉及制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肺表面活性物質(zhì)(Pulmonary surfactant，PS)是維持正常肺功能不可缺少的物質(zhì)。肺表面活性物質(zhì)由多種成份組成，DPPC(Dipalmitoylphosphatidylcholine)主要提供肺泡的穩(wěn)定性，減小肺泡的表面張力，而PG(Phosphati5dylglycerol)則幫助表面活性物質(zhì)在呼氣和吸氣時在肺泡內(nèi)的重分布。在呼氣時，表面活性物質(zhì)呈二聚體，其親水區(qū)向外，疏水區(qū)相互重疊在一起，這時表面活性物質(zhì)功能下降，肺泡張力增加形成肺泡回縮力；而在吸氣時，聚集的二聚體表面活性物質(zhì)重新變成單聚體，其疏水區(qū)吸附于肺泡細胞的表面，親水區(qū)面向肺泡的氣相，以減小肺泡的表面張力，有利于肺泡表面積的增加，擴大氣體交換面積。
表面活性物質(zhì)在二型細胞的細胞漿內(nèi)合成，而蛋白質(zhì)則在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進行合成，經(jīng)高爾基體糖基化加工后，和表面活性物質(zhì)相連接，形成Lamellars氏小體，與肺泡膜融合分泌入肺泡，表面活性物質(zhì)內(nèi)的蛋白一般被巨噬細胞吸收，磷脂又可被重吸收入二型細胞形成磷脂合成的再循環(huán)。肺泡表面活性物質(zhì)平均5-10小時更新代謝一次，形成一次循環(huán)。
肺表面活性物質(zhì)中的蛋白質(zhì)有著各種不同的功能，SP-A是親水性蛋白，根據(jù)其糖基化的程度，分子量從28-30KD不等。其功能是在鈣的存在下結(jié)合DPPC，聚集成脂質(zhì)小體，同時還具有抑制二型細胞分泌Lamellar小體，增加攝入DPPC的作用。最新發(fā)現(xiàn)證明SP-A有調(diào)理素的作用，幫助巨噬細胞吞噬侵入肺泡的細菌。SP-B是疏水蛋白，有79個氨基酸組成的多肽，SP-B可由二型細胞和支氣管上皮細胞產(chǎn)生，最初產(chǎn)生的SP-B是40KD的蛋白質(zhì)，然后經(jīng)酶切修飾去除20-23個氨基酸的信號肽，N段的176個氨基酸及C端的106-107個氨基酸形成SP-B，但目前對其功能還不太清楚。SP-C是疏水性的多肽，由二型細胞產(chǎn)生，經(jīng)翻譯后修飾從21KD的前體蛋白形成4KD含23個氨基酸的多肽，其疏水性可和表面活性物質(zhì)的疏水區(qū)的脂質(zhì)相結(jié)合，將表面活性物質(zhì)連接在一起使其能在肺泡表面均相分布。SP-D和SP-A相類似，是一個糖基化的親水性蛋白，大小約43KD，可發(fā)揮調(diào)理，抗感染的作用。
早產(chǎn)新生兒由于肺泡II型細胞發(fā)育不全，肺泡表面活性物質(zhì)產(chǎn)生不足，可引起呼吸困難，危及生命，死亡率較高。成人呼吸窘迫癥往往是繼發(fā)于許多嚴重疾病后的并發(fā)癥，如嚴重感染，外傷，外科手術(shù)等，一旦發(fā)現(xiàn)病人有進行性呼吸困難，缺氧和肺水腫，檢查往往發(fā)現(xiàn)這些病人伴有表面活性物質(zhì)減少，采用減低肺表面張力的措施可改善病人的癥狀。
目前治療用的肺表面活性物質(zhì)主要有人工合成的和動物源性的表面活性物質(zhì)及從胎兒羊水中分離的表面活性物質(zhì)。在這三種表面活性物質(zhì)中，人工合成的由于不含有表面活性蛋白，其效果不理想，而且成本太高；而來自豬或牛的動物源性的表面活性物質(zhì)含有表面活性物質(zhì)蛋白SP-B和SP-C，其治療效果較好。
1980年日本人首次用牛肺PS治療新生兒呼吸窘迫綜合征(NRDS)取得成功，以后美、歐、日本等國相繼采用多種來源的PS制劑治療該病，取得肯定療效，迄今已經(jīng)超過萬例的臨床試用，使NRDS病死亡率從原來的50-70％降至10-20％。美國學者將八十年代美國新生兒死亡率的下降歸功于PS的臨床應(yīng)用。此外，成人型呼吸窘迫綜合癥(ARDS)、重型肺炎、肺出血、哮喘等急慢性肺病也有PS缺乏，用外源性PS治療也有一定療效，因此PS具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。
我國目前對NRDS和ARDS尚無特效治療方法，病死率均在50-70％以上，嚴重影響我國優(yōu)生優(yōu)育工作及NRDS和ARDS的搶救，臨床醫(yī)師迫切需要肺表面活性物質(zhì)制劑。國外PS制劑價格昂貴，治療一個NRDS患兒需1000多美元，治療一個ARDS病人則需數(shù)千美元，因此靠進口PS病家無法承受。
此外目前市場上現(xiàn)有的PS制劑為混懸劑，給產(chǎn)品的儲存、運輸帶來不便，且水的存在使產(chǎn)品的穩(wěn)定性受到影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有制劑的缺陷，采用從來源豐富的豬肺中提取的表面活性物質(zhì)制成質(zhì)量穩(wěn)定、使用、儲存方便的凍干粉制劑。
本發(fā)明公開的豬肺表面活性物質(zhì)凍干粉是由下述百分比配方組成的溶液凍干后獲得的制劑配方5～10％w/v豬肺表面活性物質(zhì)2～5％v/v濃度為5％的聚山梨酯8085～93％v/v濃度為0.9％氯化鈉注射液本發(fā)明所述的豬肺表面活性物質(zhì)是采用國際上通用的磷脂經(jīng)典制備方法從豬肺中提取的一種磷脂蛋白復合物。所述制劑中總磷脂含量為56-75％，最底表面張力γmin＜10mN/m，蛋白質(zhì)含量在0.15-2.5％。
由于本發(fā)明制劑使用時需制成混懸液經(jīng)氣管插管注入肺內(nèi)，因此處方中加入少量聚山梨酯80可保持混懸液粒子均勻分散。
本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題在于提供上述豬肺表面活性物質(zhì)凍干粉制劑的制備方法。
本發(fā)明公開的豬肺表面活性物質(zhì)凍干粉制劑的制備包括下列步驟1.豬肺表面活性物質(zhì)的提取(1)原料處理取經(jīng)檢疫的新鮮豬肺，用清水沖洗，去除表面污物，切成小塊，抽樣復檢豬口蹄疫病毒(FMDV)和豬布氏桿菌，將切塊的豬肺用電動絞肉機絞碎，再用粉碎機粉碎制成勻漿。
(2)提取將豬肺勻漿加生理鹽水攪拌均勻，經(jīng)10目篩網(wǎng)過濾去除組織雜質(zhì)。濾液低溫離心10分鐘，棄去沉淀，取上清液，再在低溫條件下離心60分鐘，得肉紅色沉淀，將該沉淀用生理鹽水混懸，同法離心洗滌3次，得淺紅色沉淀，此即含磷脂蛋白的豬肺表面活性物質(zhì)；2.凍干粉制劑的制備按處方量稱取豬肺表面活性物質(zhì)，加入0.9％氯化鈉注射液，高速粉碎混懸液至乳白色，加入聚山梨酯80，攪勻，高壓滅菌后，再加0.9％氯化鈉注射液，超聲波粉碎，用氯化鈉注射液稀釋至總量，過濾，分裝，冷凍干燥，即得。
產(chǎn)品經(jīng)薄層層析與對照標準品卵磷脂比較所顯斑點一致，最低表面張力γmin＜10mN/m，蛋白質(zhì)含量在0.15-2.5％之間，總磷脂大于56.0％。
本發(fā)明所要解決的再一技術(shù)問題是公開上述豬肺表面活性物質(zhì)凍干粉制劑在制備治療新生兒及成人呼吸窘迫綜合癥藥物中的應(yīng)用，特別適用于制備治療非典型肺炎引起的呼吸窘迫綜合癥藥物中的應(yīng)用。
非典型肺炎在國際上稱為嚴重急性呼吸道綜合癥(Severe acuterespiratory syndrome，簡稱SARS)。根據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生部發(fā)表的非典型肺炎病例的臨床診斷標準(試行)，非典的癥狀與體征為“有發(fā)熱(＞38℃)和下列一項或一項以上；咳嗽，呼吸加速，氣促，呼吸窘迫綜合癥，肺部羅音，肺實變體癥”。這個標準也是符合世界衛(wèi)生組織(WHO)所發(fā)表的“非典”標準。重癥“非典”主要表現(xiàn)為呼吸窘迫癥，臨床表現(xiàn)為肺泡水腫，呼吸困難。根據(jù)我國“非典”病人的臨床特點，病毒感染后導致急性肺損傷，多數(shù)重癥病人發(fā)生急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS)，出現(xiàn)進行性呼吸困難，而導致死亡，實際上搶救“非典”病人關(guān)鍵是如何治療ARDS。如患者能渡過ARDS，病死率就會大為降低。
“非典”的冠狀病毒就是肺部急性感染的一種，它可降低肺泡細胞表面活性物質(zhì)，引起肺泡間質(zhì)水腫和呼吸困難，導致血氧水平降低，肺的呼吸功能喪失等一系列的嚴重后果。
現(xiàn)在的臨床研究表明，“非典”死亡的原因主要是發(fā)生呼吸窘迫綜合癥引起的呼吸功能衰竭。病毒損傷了肺胞細胞和其產(chǎn)生表面活性物質(zhì)的功能，肺泡內(nèi)充滿了水分，肺泡不再有呼吸功能。肺表面活性物質(zhì)的替代療法可以適用于非典型肺炎的治療。在衛(wèi)生部所發(fā)表的非典型肺炎病例或疑似病例的推薦治療方案和出院診斷參考標準(試行)中，對重癥病人的處理和治療目前所采取的方法主要是使用呼吸機幫助患者呼吸。在國外有臨床研究表明，使用肺表面活性物質(zhì)可使肺泡氧分壓升高，肺泡和動脈血氧分壓增加，減輕二氧化碳的儲留，及減低需氧量和不再使用輔助通氣裝置。由于不使用輔助通氣裝置，減少了由輔助通氣裝置引起的繼發(fā)性肺損失，如呼吸道出血，氣胸等疾病。因此，將肺表面活性物質(zhì)物替代療法應(yīng)用于“非典”的治療不僅可改善病人的呼吸功能，降低死亡率，還可以減少由于病人使用呼吸機而出現(xiàn)的多種“非典”病毒交叉感染，同時又可為國家節(jié)約購買進口呼吸機的外匯。
用本發(fā)明豬肺表面活性物質(zhì)凍干粉制劑進行急性毒性試驗及藥效試驗1.急性毒性試驗小鼠口服灌胃豬肺表面活性物質(zhì)，LD50大于5g/kg，小鼠經(jīng)腹腔注射，LD50大于3g/kg。
2.藥效學試驗以胎齡27天早產(chǎn)兔作NRDS模型。用豬肺表面活性物質(zhì)經(jīng)氣管插管注入肺內(nèi)，150mg/kg，給藥一次，結(jié)果治療組存活時間延長。用生理鹽水給成年兔肺灌洗，經(jīng)7次灌洗，使肺內(nèi)PS減少86.7％，致使成年兔發(fā)生ARDS表現(xiàn)，然后用豬肺表面活性物質(zhì)治療，經(jīng)氣管插管注入肺內(nèi)，分3個劑量組100、150和200mg/kg，觀察8小時，結(jié)果治療組呼吸困難改善，PaO2升高，PaCO2下降，酸中毒糾正，動態(tài)肺順應(yīng)性和肺病理變化均明顯改善。
上述結(jié)果表明，本發(fā)明制劑安全，毒性低，對早產(chǎn)兔NRDS模型能顯著延長存活時間，改善肺靜態(tài)順應(yīng)性；對成年兔ARDS模型顯示能快速而顯著地改善缺氧、高碳酸血癥和酸中毒，改善肺動態(tài)順應(yīng)性兩個模型均顯示能減輕肺病理變化，結(jié)果與文獻報道一致。
用本發(fā)明豬肺表面活性物質(zhì)凍干粉制劑進行穩(wěn)定性試驗，按不同貯存條件進行考察。
一、影響因素試驗1.高溫試驗40℃恒溫箱中取本品，置40℃恒溫箱中，放置5天、10天后，取樣分析測定，結(jié)果如下

2.高濕度試驗溫度25℃，相對濕度75％取本品置相對濕度為75％的密閉器皿中，溫度25℃的條件下，放置5天、10天后，取樣分析測定，結(jié)果如下

3.強光照射試驗取本品，置以4200Lux光照度下于5天、10天后，取樣分析測定，結(jié)果如下

二、加速試驗溫度25℃，相對濕度60％取本品三個批號，置相對濕度為60％的密閉器皿中，溫度25℃的條件下，放置1、2、3、6個月后，取樣分析測定，結(jié)果如下

三、長期試驗(2-8℃)取本品三個批號，置于2-8℃冰箱中，放置3、6、9、12、24個月后，取樣分析測定，結(jié)果如下


上述穩(wěn)定性試驗顯示，本發(fā)明產(chǎn)品對熱不穩(wěn)定除高溫試驗40℃外觀顏色加深外，未見有其它變化。本品在2-8℃條件下保存，二年內(nèi)使用穩(wěn)定。
本發(fā)明采用冷凍干燥法制成的豬肺表面活性物質(zhì)凍干制劑較現(xiàn)有的混懸劑有下述優(yōu)點1.產(chǎn)品中含有大量磷脂蛋白，因無水可避免環(huán)境溫度的變化而受熱分解變質(zhì)。
2.產(chǎn)品質(zhì)地疏松加水后迅速溶解恢復藥液原有的特性。
3.本品不易氧化，有利于長期儲存。
4.用冷凍干燥法制成的產(chǎn)品中微粒物質(zhì)比用其他方法生產(chǎn)少，污染機會相對減少。
具體實施例方式
實施例11.豬肺表面活性物質(zhì)的提取(1)原料處理取經(jīng)檢疫的新鮮豬肺100kg，用清水沖洗，去除表面污物，切成小塊，抽樣復檢豬口蹄疫病毒(FMDV)和豬布氏桿菌，將切塊的豬肺用電動絞肉機絞碎，再用粉碎機粉碎制成勻漿。
(2)提取將豬肺勻漿加生理鹽水1000ml/kg攪拌均勻，經(jīng)10目篩網(wǎng)過濾去除組織雜質(zhì)。濾液4℃離心10分鐘，棄去沉淀，取上清液，再在4℃條件下，離心60分鐘，得肉紅色沉淀，將該沉淀用生理鹽水混懸，同法離心洗滌3次，得淺紅色沉淀，此即含磷脂蛋白的豬肺表面活性物質(zhì)。
2.凍干粉制劑的制備稱取豬肺表面活性物質(zhì)75g，加入0.9％氯化鈉注射液500ml，高速粉碎混懸液至乳白色，加入聚山梨酯8036ml，攪勻，高壓滅菌后，再加0.9％氯化鈉注射液，超聲波粉碎，用氯化鈉注射液稀釋至1000ml，過濾，分裝，冷凍干燥，即得500瓶，每瓶2g，總磷脂含量≥56.0％，最底表面張力＜10mN/m，蛋白質(zhì)含量在0.15-2.5％。
實施例2 凍干粉制劑的制備配方豬肺表面活性物質(zhì) 80g濃度為5％的聚山梨酯80 39ml濃度為0.9％氯化鈉注射液1000ml制備方法同實施例1。
權(quán)利要求
1.一種豬肺表面活性物質(zhì)凍干粉制劑，其特征在于該制劑是由下述百分比配方組成的溶液凍干后獲得的制劑配方5～10％w/v豬肺表面活性物質(zhì)2～5％v/v濃度為5％的聚山梨酯8085～93％v/v濃度為0.9％氯化鈉注射液
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬肺表面活性物質(zhì)凍干粉制劑，其特征在于所述的制劑總磷脂含量為56-75％，蛋白質(zhì)含量在0.15-2.5％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬肺表面活性物質(zhì)凍干粉制劑的制備方法，其特征在于所述的凍干粉制劑的制備包括下列步驟1)豬肺表面活性物質(zhì)的提取(1)原料處理取經(jīng)檢疫的新鮮豬肺，用清水沖洗，去除表面污物，切成小塊，抽樣復檢豬口蹄疫病毒和豬布氏桿菌，將切塊的豬肺用電動絞肉機絞碎，再用粉碎機粉碎制成勻漿；(2)提取將豬肺勻漿加生理鹽水攪拌均勻，經(jīng)10目篩網(wǎng)過濾去除組織雜質(zhì)。濾液低溫離心10分鐘，棄去沉淀，取上清液，再在低溫條件下離心60分鐘，得肉紅色沉淀，將該沉淀用生理鹽水混懸，同法離心洗滌3次，得淺紅色沉淀，此即含磷脂蛋白的豬肺表面活性物質(zhì)；2)凍干粉制劑的制備按處方量稱取豬肺表面活性物質(zhì)，加入0.9％氯化鈉注射液，高速粉碎混懸液至乳白色，加入聚山梨酯80，攪勻，高壓滅菌后，再加0.9％氯化鈉注射液，超聲波粉碎，用氯化鈉注射液稀釋至總量，過濾，分裝，冷凍干燥，即得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬肺表面活性物質(zhì)凍干粉制劑在制備治療新生兒及成人呼吸窘迫癥藥物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于其中所述的藥物可用于非典型肺炎引起的呼吸窘迫綜合癥的治療。
全文摘要
本發(fā)明涉及豬肺表面活性物質(zhì)凍干粉及制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明公開的豬肺表面活性物質(zhì)凍干粉是由5～10％豬肺表面活性物質(zhì)、2～5％聚山梨酯80和85～93％氯化鈉注射液組成的溶液凍干后獲得的制劑。該制劑原料來源豐富，質(zhì)量穩(wěn)定，使用、儲存方便。適用于新生兒及成人呼吸窘迫綜合癥，特別適用于非典型肺炎引起的呼吸窘迫綜合癥。
文檔編號A61K35/42GK1579421SQ0314206
公開日2005年2月16日 申請日期2003年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月5日
發(fā)明者嚴偉民, 朱澤龍, 劉德林, 戴振, 張菊紅 申請人:上海復旦復華藥業(yè)有限公司