專利名稱：一種防治皮膚衰老、具有保健美容功效的外用制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種防治皮膚衰老、具有保健美容功效的外用制劑，該制劑由人參與維甲酸組成，對由隨年齡增長而發(fā)生的和由日光照射所致的皮膚衰老有良好的預(yù)防和治療作用，也可用于皮膚美容，保持皮膚處于年輕狀態(tài)。
健康和長壽是生命科學(xué)永恒的主題。隨著世界人口的加速老齡化，抗衰老研究已成為迅速崛起的一門應(yīng)用科學(xué)。為開發(fā)研究抗衰老藥物，提高生命質(zhì)量，延緩機(jī)體衰老，延長健康壽命，目前抗衰老研究已進(jìn)入機(jī)體。組織，細(xì)胞，分子，基因等全方位、多層次、多因素研究的新階段。衰老是生物體在生命周期中隨年齡增長而發(fā)生的全身各組織、器官減退和穩(wěn)態(tài)功能下降的過程。皮膚是機(jī)體衰老過程中最易顯露的器官。人的皮膚衰老不僅有損于美容，且與許多皮膚病如脂溢性角化、日光性角化、角化棘皮瘤、基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生也有著病因?qū)W的關(guān)系，因此，預(yù)防和延緩皮膚衰老已成為生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。
皮膚衰老是內(nèi)源性衰老和外源性環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。雖然在某些程度上，環(huán)境因素對暴露部位的皮膚衰老起著重要作用，但內(nèi)源性生理衰老所起的作用不容忽視。環(huán)境因素是在內(nèi)源性生理衰老的基出上起加速或延緩衰老的作用。部位不同，二因素作用的側(cè)重點(diǎn)各不相同，如遮光部位的皮膚主要以內(nèi)源性生理特衰老因素為主，暴露部位則主要是環(huán)境因素?fù)p傷的結(jié)果，二者的臨床和組織病理表現(xiàn)均不相同，但就整體而言，任何部位的皮膚衰老都是二因素共同作用的結(jié)果。
近幾年來，國內(nèi)外對維甲酸預(yù)防和延緩皮膚衰老的作用進(jìn)行了廣泛的研究，已證實(shí)有比較滿意的效果。維甲酸是細(xì)胞增殖、分化、基因表達(dá)強(qiáng)有力的生物調(diào)節(jié)劑，對表皮和真皮有著顯著的影響。Kligman對光老化小鼠模型用全反式維甲酸外用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在第5周和第10周的活檢標(biāo)本中，維甲酸組膠原層的厚度是賦形劑小鼠皮膚的2倍，其厚度與維甲酸應(yīng)用的時間和劑量成正比，新形成的膠原經(jīng)組織化學(xué)和超微結(jié)構(gòu)檢查證明與正常組組膠原相同，電鏡下觀察可見膠原束與皮面平行，排成正常的“膠合板樣”，纖維母細(xì)胞眾多，具有代謝活躍的形態(tài)特征，且皮膚內(nèi)血管豐富，分枝較多，說明維甲酸提高了纖維母細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性。臨床研究也表明，局部應(yīng)用維甲酸可增加表皮角朊細(xì)胞的分化和角質(zhì)透明顆粒的形成，使角朊細(xì)胞內(nèi)聚性和黑素細(xì)胞活力降低，并抑制角質(zhì)形成，使角質(zhì)層變薄，還增加粘蛋白的合成，使胞間基質(zhì)豐富，并可改善紫外線引起的彈力纖維蛋白變性，增加新膠原蛋白的形成，使微血管再生，血流量增加，故長期外用可明顯減少光老化皮膚的臨床癥狀，使皮膚表面的細(xì)小皺紋得到改善，皮膚光滑亮澤，色斑減淡，預(yù)防和緩解老年斑、日光性角化及皮膚癌的發(fā)生。
人參是傳統(tǒng)的抗衰老中藥，已證明人參具有廣泛開的藥理作用，能提高細(xì)胞壽命，維持衰老細(xì)胞的生存能力，促進(jìn)DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成，可與體內(nèi)的自由基結(jié)合，減少脂褐素在體內(nèi)的沉積等，具有較強(qiáng)的抗自由基作用。研究表明，灌服人參后，可明顯的增加小鼠的皮膚中羥脯氨酸的含量。本實(shí)驗(yàn)用2.5％人參液外涂皮膚衰老模型小鼠的皮膚后發(fā)現(xiàn)其表皮輕度增厚，膠原合成較基質(zhì)組外用組有所增厚，但不及正常小鼠皮膚膠原厚度，而彈力纖維含量與基質(zhì)組比較無明顯差異。SOD檢測則較基質(zhì)組顯著升高，達(dá)正常組水平，MDA含量與基質(zhì)組無明顯減少，皮膚羥脯氨酸含量較基質(zhì)組無明顯增多，說明人參液外用未能呈現(xiàn)明顯的抗皮膚衰老作用。
為了解決皮膚抗衰老問題，本發(fā)明采用了人參和維甲酸組成復(fù)方外用制劑，用于實(shí)驗(yàn)研究，取得了明顯的療效，初步解決了皮膚衰老的預(yù)防和治療問題，該產(chǎn)品還具有保健美容的功效。
解決這一任務(wù)的途徑是這樣實(shí)現(xiàn)的，取中藥人參和維甲酸通過下述工藝制作成霜劑用硬酯酸、十八醇、硬酯酸單甘油酯等按一定比例配90g基質(zhì)，取人參液和維甲酸溶解后，在基質(zhì)冷至50C時加入，攪拌均勻即得。
配制例一取2.5％的人參液溶解于蒸餾水10ml，維甲酸10mg加入少量無水酒精中使其溶解，滴加適量吐溫-80，然后加入2ml的蒸餾水中，磁力攪拌器攪拌成乳化液；取用硬酯酸、十八醇、硬酯酸單甘油酯等按一定比例配成的基質(zhì)80g，在50C加入上乳化液和人參液，混勻即得。
配制例二取人參皂甙2.5g溶于10ml的水中，維甲酸5mg，加入少量無水酒精中使其溶解，滴加適量吐溫-80，然后加入2ml的蒸餾水中，磁力攪拌器攪拌成乳化液；取用硬酯酸、十八醇、硬酯酸單甘油酯等按一定比例配成的基質(zhì)80g，在50C加入上乳化液和人參皂甙液，混勻即得。
研究表明，本發(fā)明的人參維甲酸霜，人參可采用吉林紅參，生曬參，花旗參，其配制濃度0.5％～10％較好，其最佳濃度為2％～5％。人參皂苷，人參莖葉皂苷也可代替人參液，其配制濃度0.1％～5％較好，其最佳濃度為0.5％～2.5％。
研究表明，本發(fā)明的人參維甲酸霜，維甲酸配制濃度1mg％～50mg％較好，其最佳濃度為2mg％～10mg％。
實(shí)施例一人參維甲酸霜對D-半乳糖加光照建立小鼠皮膚衰老模型的藥效學(xué)觀察1.材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動物及飼養(yǎng)條件選用3月齡雌性昆明種小鼠220只(廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供)，清潔級，平均體重20±2g，10只一籠飼養(yǎng)，鼠籠規(guī)格為55×35×20cm3，保證動物有足夠的活動空間，使用標(biāo)準(zhǔn)飼料(實(shí)驗(yàn)動物中心提供)，其中鈣含量為1.33％，磷含量為0.95％，所有動物自由攝食、攝水，在溫度25℃～28℃，濕度60％～80％，通風(fēng)良好的條件下飼養(yǎng)。1.2.藥物與動物分組組號 數(shù)量 方法 給藥方案正常組 20皮下注射生理鹽水基質(zhì)組 20光照+注射D-半乳糖+外用基質(zhì) 2mg/cm2.d-1維甲酸組 20光照+注射D-半乳糖+外用維甲酸霜 2mg/cm2.d-1人參皂甙組 20光照+注射D-半乳糖+外用人參霜 2mg/cm2.d-1維生素E組20光照+注射D-半乳糖+外用VitE霜 2mg/cm2.d-1維甲酸+人參組20光照+注射D-半乳糖+外用維甲酸人參霜 2mg/cm2.d-11.3實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備儀器產(chǎn)地AE-240型電子分析天平 Mettler-Toledo儀器(上海)有限公司752型紫外分光光度計(jì) 上海第三分析儀器廠熒光光度計(jì)上海精密儀器廠紫外線強(qiáng)度計(jì) 上海顧村電光儀器廠JB-2型恒溫磁力攪拌器 上海雷磁儀器廠新涇分廠SHH.W21.600三用電熱恒溫水浴箱子 天津市華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司DHG-9070型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱子 上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠HITACHT55P-72超速離心機(jī) 日本HITACHT公司半自動圖象數(shù)字化分析儀包括光鏡和熒光顯微鏡Nikon日本計(jì)算機(jī) Macintosh IICi，美國蘋果公司產(chǎn)品數(shù)字化板報(bào) SummaSketchII plusKSS Image Analysis(version2.0) KSS Scientific consultants，UT USALEICA MPS30熒光-光學(xué)顯微鏡及顯微照相機(jī) 德國LEICA公司制造WFX-ID原子吸收分光光度計(jì) 北京第二光學(xué)儀器廠生產(chǎn)JI-80-2B臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠制造華凌電冰箱 BCD-205WE廣東1.4實(shí)驗(yàn)方法1.4.1 D-半乳糖制造亞急性衰老模型的建立每日頸背皮下注射12.5％D-半乳糖0.24ml/30g，給藥標(biāo)示量為80mgkg-1.d-1，對照組注射等體積的生理鹽水連續(xù)造模42天。光老化模型制作方法如下光源紫外線燈管二只，上海第三光源廠生產(chǎn)，功率，40W，含UVC(200～290nm)和少量UVB，二只燈管平行排列；浙江華興燈具廠生產(chǎn)的金屬鹵素?zé)粢槐K，功率500W，最強(qiáng)光譜為360nm，其中UVA占70％。
方法每次照射前用15％的硫化鈉糊脫去小鼠背部毛，暴露約定俗成3*5cm2的皮膚，初次正式照射前，先測定最小紅斑量及光照射強(qiáng)度，在距皮膚40cm的高度UVC2h，然后鹵素?zé)粽丈?.5h，每次劑量UVC3.7J/cm2，UVA5.04J/cm2，每二天照射一次，共42天。1.4.2涂藥方法在光照+半乳糖造模的同時，給藥組外用藥涂抹，每次2mg，均勻涂抹于暴光部位，每日一次，共42天。1.4.3標(biāo)本取材方法各組小鼠在殺死前斷尾取血，擬測定血中的CAT、GSH-PX、SOD之用；實(shí)驗(yàn)終止時，所有動物稱重，用硫化鈉糊背部脫毛，摘眼球放血處死，收集血液離心，分離血清，擬測定SOD、MDA用；取背部正中皮膚1*1cm2大小，迅速放入10％中性福爾馬林液中固定，作組織切片進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)定量分析；2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1皮膚組織病理學(xué)形態(tài)觀察及計(jì)算機(jī)圖象定量分析1.皮膚組織病理學(xué)形態(tài)觀察表皮結(jié)構(gòu)的變化正常組表皮較薄，角質(zhì)層僅0.001mm，由3～5層細(xì)胞組成，棘細(xì)胞呈散在分布，基底細(xì)胞排列整齊，基底膜帶較平坦。(2)D-半乳糖組表皮變薄，細(xì)胞層數(shù)變少，基底細(xì)胞胞體變小。(3)光照組表皮輕度增厚，基底細(xì)胞變得不典型，極性消失，大小不等，部分細(xì)胞核變大，深染，提示代謝旺盛。(4)模型組可見表皮變得更加菲薄，細(xì)胞排列散亂，基底細(xì)胞極性消失，細(xì)胞大小不一。(5)維甲酸組表皮較正常組和模型組顯著增厚，細(xì)胞層數(shù)增多，可達(dá)7～12層，排列有序，細(xì)胞間質(zhì)豐富，基底細(xì)胞胞體增大，呈立方形，排列規(guī)整，提示維甲酸有顯著的促進(jìn)基底細(xì)胞增殖作用。(6)人參外用組表皮較模型組輕度增厚，但不及正常表皮厚度，提示外用人參皂甙有輕微的促進(jìn)表皮增殖的作用，但不顯著。(7)維生素E外用組表皮較正常組和模型組顯著增厚，提示維生素E外用可明顯促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖。(8)維甲酸人參霜較維甲酸單用更明顯地促進(jìn)表皮增厚，使表皮細(xì)胞層數(shù)增至10～12層，胞間基質(zhì)豐富，基底細(xì)胞胞體較大，排列更加規(guī)整，提示二者聯(lián)用對表皮細(xì)胞的增殖有明顯的同作用。
2.小鼠皮膚表皮厚度的計(jì)算機(jī)圖象定量分析計(jì)算機(jī)圖象定量分析小鼠表皮厚度變化變化的結(jié)果見表1表1小鼠皮膚表皮厚度計(jì)算機(jī)圖象定量分析變化(n＝20)組別 表皮厚度(μm) 變化率基礎(chǔ)組 27.9±3.6D-半乳糖(H) 16.6±4.3*40.5％光照組 29.1±5.9 4％D-半乳糖+光照組 13.7±4.6**▲△△50.8％維甲酸霜組 50.4±5.4**▲80％ 223％人參霜組 23.6±3.4▲ -15％ 51％
維生素E霜組 40.7±4.6**▲ 45％ 160％維甲酸人參霜組62.1±6 9**▲ 122％ 298％*示與基礎(chǔ)組比較*P＜0.05**P＜0.01；▲示與D-半乳糖比較；△示與光照組比較表1顯示(1)D-半乳糖組表皮厚度較正常組明顯變薄，厚度減少了40.5％，差異有顯著性(P＜0.01)。(2)光照組與正常組比較，表皮厚度稍有增加，但差別無顯著性(P＞0.05)。(3)模型組與D-半乳糖組比較，表皮厚度明顯減少，減少了17％，差異有顯著性(P＜0.05)。(4)模型組與光照組相比，厚度顯著減少，有非常顯著性差異(P＜0.001)。提示光照后加速了D-半乳糖造成的小鼠細(xì)胞代謝紊亂，使皮膚衰老進(jìn)一步加深。(5)維甲酸霜組較基礎(chǔ)組和D-半乳糖+光照組基質(zhì)組表皮厚度分別增加了80％、223％，均有顯著差別(P＜0.01)(P＜0.01)。(6)人參霜組較D-半乳糖+光照模型組稍有增厚，但不及正常組厚度，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。(7)維生素E霜組較正常組和D-半乳糖+光照組基質(zhì)組表皮厚度分別增加了45％、160％，均有顯著性差別(P＜0.01)(P＜0.01)，但不及維甲酸霜組外用的厚度。(8)維甲酸人參霜組較正常組和D-半乳糖+光照組基質(zhì)組表皮厚度分別增加了122％、298％，差別顯著，分別為(P＜0.0001)(P＜0.0001)，比維生素E霜組增厚更明顯。2.2小鼠真皮彈力纖維間苯二酚-品紅染色形態(tài)學(xué)觀察1、小鼠真皮彈力纖維間苯二酚-品紅染色形態(tài)學(xué)觀察小鼠真皮彈力纖維間苯二酚-品紅染色形態(tài)學(xué)觀察顯示(1)正常彈力纖維較細(xì)長，有輕微彎曲度，走向與皮面平行，排列稀疏，在毛囊周圍呈環(huán)形排列。(2)D-半乳糖組彈力纖維減少，乳頭層減少更明顯。(3)光照組彈力纖維顯著增粗、增多，堆積，部分卷曲，排列蓬亂不規(guī)則，附近有纖細(xì)的彈力纖維出現(xiàn)。(4)D-半乳糖+光照組模型組真皮乳頭層彈力纖維少，網(wǎng)狀層纖維數(shù)量少，但粗大，卷曲，排列不規(guī)則。(5)維甲酸霜組較正常組和模型組彈力纖維顯著增多，特別是乳頭層有眾多纖細(xì)的彈力纖維，網(wǎng)狀層彈力纖維增多、增粗，提示維甲酸霜促進(jìn)了成纖維細(xì)胞的活性，合成了新的彈力纖維。(6)人參霜組、VitE霜組較模型組稍增多，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明人參霜組、VitE霜組外用不引起彈力纖維的太大改變。(7)維甲酸人參霜組彈力纖維較維甲酸組及模型組顯著減少，提示維甲酸與人參皂甙可能同抑制了成纖維細(xì)胞合成彈力纖維，使之向合成膠原纖維轉(zhuǎn)變。
2、小鼠真皮彈力纖維計(jì)算機(jī)圖象定量分析小鼠真皮彈力纖維面積的計(jì)算機(jī)圖象定量分析結(jié)果見表2表2.小鼠真皮彈力纖維面積的計(jì)算機(jī)圖象定量分析x±s(n＝20)組別 真皮彈力纖維面積(μm2) 變化率基礎(chǔ)組 899.7±70.6D-半乳糖(H)635.4±65.4**29％光照組 1257.3±78.7*40％D-半乳糖+光照組826.4±65.3△ 33％維甲酸霜組 1024.4±85.3*▲▲ 14％ 24％人參霜組 847.0±76.2 -5％ 2％維生素E霜組836.3±35.46％ -6％ +1％維甲酸人參霜組 570.0±45.4**▲▲ -37％ -31％*示與Basal比較*P＜0.05**P＜0.01；▲示與D-galactose比較；△示與UV比較由表2可見(1)D-半乳糖組彈力纖維總面積較正常組減少，減少了29％，差異有非常顯著性(P＜0.01)。(2)光照組彈力纖維的總面積較正常組顯著增多，增加了40％，差異有顯著性(P＜0.05)，提示光照作為一種刺激因素誘導(dǎo)了成纖維細(xì)胞的活性，促進(jìn)了彈力纖維的合成。(3)模型組與光照組相比，彈力纖維顯著減少(p＜0.05)。提示D-半乳糖引起的代謝障礙引起了細(xì)胞的活性降低，抵消了光照引起的增殖作用。(4)維甲酸組較正常組和基質(zhì)組彈力纖維顯著增多，分別增多了14％、24％，差異有顯著性(P＜0.05)(P＜0.01)。(5)人參組、VitE組較基質(zhì)組無明顯改變(P＞0.05)。維甲酸加人參皂甙聯(lián)用較正常組、基質(zhì)組、維甲酸組顯著減少了37％、31％、45％，可能聯(lián)用改變了成纖維細(xì)胞合成彈力纖維的功能。2.3真皮膠原纖維染色形態(tài)學(xué)觀察及計(jì)算機(jī)圖象定量分析
1、真皮膠原纖維形態(tài)學(xué)觀察真皮膠原纖維形態(tài)學(xué)觀察可見(1)正常組膠原纖維束細(xì)長，胞體豐富，呈束狀排列，走向與皮面平行，呈波紋狀，在毛囊周圍纖維纖細(xì)且排列疏松。(2)光照組真皮淺層膠原纖維纖細(xì)，著色較淡，網(wǎng)狀層纖維束較粗大，著色深染，成纖維細(xì)胞增多，有炎細(xì)胞浸潤，提示成熟膠原纖維減少。(3)D-半乳糖組膠原束細(xì)長，走向平直。胞體小。(4)模型組真皮淺層膠原纖維染色稍淡，膠原束較細(xì)，網(wǎng)狀層纖維束粗大，炎細(xì)胞較度浸潤。(5)維甲酸霜組較正常組、基質(zhì)組的膠原層顯著增厚，膠原束排列致密，規(guī)整，與皮面平行，呈波紋狀，中間有豐富的成纖維細(xì)胞和小血管。(6)人參霜組較基質(zhì)組膠原增厚，但不及正常組膠原豐富。(7)VitE霜組較基質(zhì)組顯著增厚，超過了正常組但不及維甲酸霜組，膠原束排列不及維甲酸組整齊。(4)維甲酸人參霜組較維甲酸組膠原層更為豐富，膠原束排列更為致密、規(guī)整，中間有豐富的成纖維細(xì)胞和小血管。提示維甲酸與人參皂甙有同作用。
2、真皮膠原纖維厚度的計(jì)算機(jī)圖象定量分析真皮膠原纖維厚度的計(jì)算機(jī)圖象定量分析見表3表3真皮膠原纖維厚度的計(jì)算機(jī)圖象定量分析x±s(n＝20)Group dermis depth(μm)Change基礎(chǔ)組 842.0±64.3D-半乳糖(H)624.5±48.5**25％光照組 734.1±59.3412％D-半乳糖+光照組603.7±47.52△ 17％維甲酸組 1472.4±75.9**▲▲ +75％ +119％人參皂甙組 810.7±57.4 +3％+18％維生素E霜組1286.5±68.7**▲▲ +52％ +19％維甲酸人參霜組 1687.3±79.6**▲▲ +99％ +150％*示與Basal比較*P＜0.05**P＜0.01；▲示與D-galactose比較；△示與UV比較表3示(1)D-半乳糖組膠原厚度較正常組顯著變薄，厚度減少了25％，有非常顯著性差異(P＜0.01)，提示代謝紊亂抑制了成纖維細(xì)胞合成膠原蛋白。(2)光照組膠原厚度較正常組比較也變薄，減少了12％，差異有顯著性(P＜0.05)，提示光照使膠原合成和代謝發(fā)生了改變，膠原層變薄。(3)模型組較光照組膠原厚度變薄，降低了17％，結(jié)果有顯著性差異(P＜0.05)提示光照加D-半乳糖加劇了皮膚細(xì)胞的損傷。(4)維甲酸組較基質(zhì)組、正常組膠原厚度顯著增多，分別增加了75％、119％，有顯著性差異(P＜0.05)。(5)人參組較基質(zhì)組膠原增加了18％，但差異無顯著性，提示人參外用促進(jìn)皮膚膠原合成的作用不明顯。(6)VitE組較正常組和基質(zhì)組顯著增加52％、91％(P＜0.01)，提示外用VitE有顯著的促進(jìn)膠原合成的作用。(7)維甲酸與人參聯(lián)用膠原厚度較維甲酸組明顯增加，有顯著性差異(P＜0.05)，提示維甲酸與人參聯(lián)用更加促進(jìn)了膠原合成，二者有明顯的協(xié)同作用。3.討論3.1 UVC加金屬鹵素?zé)粽丈淠芸於钊氲脑斐尚∈笃つw的光損傷目前光老化研究中常用的光源是中波UVB(290～320nm)，長期照射可使無毛小鼠產(chǎn)生類似于人皮膚光老化的改變。Kligman等應(yīng)用UVB+IR長期照射豚鼠可使真皮彈力纖維增生，膠原發(fā)生改變；方家磷用氙燈加金屬鹵素?zé)糸L期照射豚鼠均可導(dǎo)致類似人光老化的皮膚特征表皮輕度增厚，真皮彈力纖維增生，成熟佼原纖維下降，網(wǎng)狀纖維增多，新生佼原合成增多，炎癥反應(yīng)增強(qiáng)等表現(xiàn)。
光線為一連續(xù)的電磁輻射波，波長越短，能量越大，UVC的能量在紫外線中最強(qiáng)，但穿透力不強(qiáng)，僅0.01mm，一般不能透過大氣層到達(dá)地面，日光光中能穿透大氣層到達(dá)地面的是UVB、UVA和可見光，紅外線，引去人光老化的主要是UVA、UVB，故人們常用此作人工光源建立光老化模型進(jìn)行研究。
考慮到UVC能量大，對生命細(xì)胞的殺傷力最強(qiáng)，造成組織光損傷快而明顯，本實(shí)驗(yàn)采用UVC燈作光源，由于UVC穿透力差，只能作用于表皮和真皮淺層，故在用UVC照射后，又用金屬鹵素?zé)?UVA占70％)加強(qiáng)光損傷的深度，這樣聯(lián)合照射能快速而深入地造成小鼠皮膚光損傷。又因?yàn)樾∈蟊砥し浅１?，僅0.01mm，黑素細(xì)胞后少，用硫化鈉糊脫去毛及部分角質(zhì)層后，更有利于光線和藥物的透入，使皮膚對光線更敏感，這在本實(shí)驗(yàn)中也得到了證實(shí)。照射5個紅斑量后，皮膚紅斑水腫明顯，10天后皮膚明顯干燥、粗糙、脫屑、生素沉著，照射42天后組織切片觀察表皮輕度增厚，真皮彈力纖維增多粗大，成熟膠原纖維明顯減少，新生的膠原纖維增多，炎癥細(xì)胞浸潤明顯，小鼠耳部外觀及組織切片上亦有同樣表現(xiàn)，見圖。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)UVC+UVA可快速而深入地造成小鼠皮膚的光損傷。3.2. D-半乳糖造成小鼠皮膚細(xì)胞的衰老本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，D-半乳糖組表皮較正常組變薄，細(xì)胞層數(shù)減少，細(xì)胞變小；膠原層厚度變薄，膠原束增粗老化，排列疏松；彈力纖維減少，成纖維細(xì)胞減少，無炎細(xì)胞浸潤，說明基底細(xì)胞和成纖維細(xì)胞活性降低，合成功能下降，細(xì)胞處于一種“萎縮”狀態(tài)?？顾ダ仙笜?biāo)也顯示，模型組皮膚中SOD活力下降％，MDA含量升高％，羥脯氨酸顯著下降，表明皮膚細(xì)胞出現(xiàn)了衰老。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，D-半乳糖造成小鼠的亞急性衰老，是由于胞內(nèi)半乳糖濃度增高，在醛糖還原酶催化下，還原成半乳糖醇，該物質(zhì)不能在細(xì)胞進(jìn)一步代謝而堆積在細(xì)胞內(nèi)，影響細(xì)胞正常滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂所致，同樣，也造成了皮膚細(xì)胞的代謝障礙，使皮膚細(xì)胞呈現(xiàn)衰老表現(xiàn)。Vlassara也報(bào)告了一種解釋衰老與糖尿病及多種并發(fā)癥的相關(guān)機(jī)制，認(rèn)為糖尿病與衰老有共同的機(jī)制即非酶蛋白的高度糖基化，他發(fā)現(xiàn)蛋白高度糖基化形成的不可逆終產(chǎn)物(ACT)可在膠原蛋白、基底膜蛋白中不斷積累，導(dǎo)致多系統(tǒng)的衰老變化，如皮膚等，此機(jī)理在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中也得到了證實(shí)。
3.3光照加D-半乳糖可明顯加劇小鼠皮膚老化的進(jìn)程由于年輕動物組織細(xì)胞有強(qiáng)大的修復(fù)功能，用之制作光老化模型需時長，照射強(qiáng)度大，用作抗衰老藥物研究不能良好的反應(yīng)藥物的效果，若用老年鼠又因個體差異大，所受影響因素多，體質(zhì)差，不易獲得，故本實(shí)驗(yàn)采用D-半乳糖造成皮膚細(xì)胞的衰老狀態(tài)，又用光照造成皮膚細(xì)胞的光損傷，進(jìn)一步加劇了皮膚的衰老。
眾多研究表明，UVB照射皮膚早期，表皮細(xì)胞受到UV的刺激，基底細(xì)胞增殖、分化活躍，表皮層增厚，真皮淺層彈力纖維隨膠原纖維減少而產(chǎn)生，提示輕度受損的成纖維細(xì)胞由生成腋原蛋白轉(zhuǎn)入合成彈力蛋白；中后期，彈力纖維進(jìn)一步增生，變粗，同時伴有網(wǎng)狀纖維增生，示UV造成真皮損傷過程中膠原合成增加，這可能是成纖維細(xì)胞受UV照射后改變其因表型的結(jié)果；晚期呈萎縮狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)光照組也出現(xiàn)了類似的組織學(xué)變化，其作用機(jī)理可能是光照作為一種損傷刺激最早損害部位可能是調(diào)節(jié)SOD和CAT基因，使二者合成減少，致使自由基積聚，誘導(dǎo)DNA的氧化破壞和交聯(lián)，造成DNA復(fù)制錯誤，核苷酸輔酶破壞，含巰基酶失活，繼而引起mRNA轉(zhuǎn)錄的改變，照射早期由合成膠原纖維轉(zhuǎn)而合成彈力纖維，中期網(wǎng)狀纖維增生，新合成膠原纖維增多，又因UV引起炎癥浸潤，浸潤的Mo、中性粒細(xì)胞釋放蛋白水解酶，使成熟膠原進(jìn)一步減少，整體膠原即由I型向III型膠原轉(zhuǎn)變；另外真皮彈力纖維因吸收UV而產(chǎn)生彈力蛋白變性，纖維增粗，聚集成團(tuán)，呈現(xiàn)光老化的增生表現(xiàn)，晚期則呈現(xiàn)“萎縮”狀態(tài)。
本實(shí)驗(yàn)用D-半乳糖造成小鼠皮膚衰老又用光照造成皮膚的光損傷，可見表皮顯著變薄，較D-半乳糖組和光照組表皮更菲薄，表皮細(xì)胞層數(shù)減少，基底細(xì)胞大小不均，排列疏松紊亂，極性消失；真皮厚度變薄，膠原層纖維減少，著色較深，說明新生膠原不多；彈力纖維增粗，堆積，排列不規(guī)則，但新生彈力纖維不多；炎癥浸潤不明顯?？顾ダ现笜?biāo)顯示皮膚SOD活性較D-半乳糖組和光照組均顯著降低，MDA顯著增加，皮膚羥脯氨酸含量較D-半乳糖組和光照組均顯著減少(羥脯氨酸也是檢測皮膚衰老程度的一個敏感指標(biāo))，這些指標(biāo)說明D-半乳糖加光照顯著地加速了皮膚衰老，比單用光照或單用D-半乳糖更快而明顯地加劇了皮膚的衰老?？赡艿臋C(jī)制是光照損害了調(diào)節(jié)SOD和CAT基因，使二者合成減少，致使皮膚中的SOD、CAT等抗氧化酶類進(jìn)一步減少，皮膚中自由基濃度增高，加劇了細(xì)胞的老化，又由于皮膚細(xì)胞處于代謝紊亂，即“老化”狀態(tài)，不能對光線的刺激產(chǎn)生過強(qiáng)的反應(yīng)，故皮膚不表現(xiàn)光老化的“增生”狀態(tài)而呈現(xiàn)更為衰老的表現(xiàn)。
本實(shí)驗(yàn)采用UVC+UVA+D-半乳糖聯(lián)合應(yīng)用制造皮膚衰老模型還屬國內(nèi)外首創(chuàng)，該模型組織切片觀測可使表皮變薄，真皮老化變薄，膠原減少，排列疏松，彈力纖維增粗、變性、堆積；計(jì)算機(jī)圖象分析系統(tǒng)測定表皮厚度、膠原厚度、彈力纖維含量均較單用D-半乳糖造成的亞急性衰老模型和單純光照所引起的光損傷均顯示更為嚴(yán)重的皮膚衰老表現(xiàn)。皮膚衰老生化指標(biāo)也充分證明了這個結(jié)論。因此，該模型為研究皮膚衰老及相關(guān)疾病的發(fā)生機(jī)制，進(jìn)行藥物篩選，評價(jià)藥物療效及作用機(jī)制提供了一個快速、簡單易行、方法可靠的工具。
3.4.人參皂甙、維甲酸、VitE外用抗皮膚衰老研究為檢測該皮膚衰老模型的可靠性，我們選擇了人參皂甙、維甲酸、VitE外用進(jìn)行抗皮膚衰老的研究。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了人參外用組、維甲酸外用組、VitE外用組、人參維甲酸聯(lián)用組及單純基質(zhì)組，通過皮膚組織切片圖象分析和皮膚各生化指標(biāo)的測定來觀察這些藥物的抗皮膚衰老效果。3.4.1維甲酸外用有顯著的抗皮膚衰老作用近幾年來，國內(nèi)外對維甲酸預(yù)防和延緩皮膚衰老的作用進(jìn)行了廣泛的研究，已證實(shí)有比較滿意的效果。維甲酸是細(xì)胞增殖、分化、基因表達(dá)強(qiáng)有力的生物調(diào)節(jié)劑，對表皮和真皮有著顯著的影響。Kligman對光老化小鼠模型用全反式維甲酸外用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在第5周和第10周的活檢標(biāo)本中，維甲酸組膠原層的厚度是賦形劑小鼠皮膚的2倍，其厚度與維甲酸應(yīng)用的時間和劑量成正比，新形成的膠原經(jīng)組織化學(xué)和超微結(jié)構(gòu)檢查證明與正常組膠原相同，電鏡下觀察可見膠原束與皮面平行，排成正常的“膠合板樣”，纖維母細(xì)胞眾多，具有代謝活躍的形態(tài)特征，且皮膚內(nèi)血管豐富，分枝較多，說明維甲酸提高了纖維母細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性。臨床研究也表明，局部應(yīng)用維甲酸可增加表皮角角朊細(xì)胞的分化和角質(zhì)透明顆粒的形成，使角朊細(xì)胞內(nèi)聚性和黑素細(xì)胞活力降低，并抑制角質(zhì)形成，使角質(zhì)層變薄，還增加粘蛋白的合成，使胞間基質(zhì)豐富，并可改善紫外線引起的彈力纖維蛋白變性，增加新膠原蛋白的形成，使微血管再生，血流量增加，故長期外用可明顯減少光老化皮膚的臨床癥狀，使皮膚表面的細(xì)小皺紋得到改善，皮膚光滑亮澤，色斑減淡，預(yù)防和緩解老年斑、日光性角化及皮膚癌的發(fā)生。
對維甲酸的作用機(jī)理，Gilchrest進(jìn)行了比較深入的研究，結(jié)果顯示，維甲酸經(jīng)皮吸收后到達(dá)靶器官，通過與特定的膜受體結(jié)合或細(xì)胞的攝粒作用穿過胞膜，在胞質(zhì)內(nèi)與細(xì)胞的維甲酸受體結(jié)合蛋白(CRABP)結(jié)合，CRABP的作用可能有二方面即可將維甲酸運(yùn)送到胞核，觸發(fā)維甲酸對細(xì)胞活動的系列作用，同時，又控制游離的維甲酸進(jìn)入胞核的水平，從而限制了維甲酸對細(xì)胞活動的影響，維甲酸進(jìn)入細(xì)胞核后，與一種維甲酸受體結(jié)合，形成復(fù)合物，與DNA上特定的RA應(yīng)答因子結(jié)合，并調(diào)節(jié)特定基因的轉(zhuǎn)錄，表達(dá)各種相關(guān)產(chǎn)物。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，維甲酸可明顯增加表皮和膠原層的厚度，使細(xì)胞層數(shù)增多，細(xì)胞排列規(guī)整，胞間基質(zhì)豐富，膠原層顯著增厚，排列致密有序，與皮面平行，呈波紋狀，其間成纖維細(xì)胞豐富，血管增多，新生纖細(xì)的彈力纖維明顯增多。抗衰老生化指標(biāo)檢測，維甲酸外用可明顯升高SOD活性，降低MDA含量，顯著增加皮膚羥脯氨酸的含量，說明維甲酸外用確能使衰老皮膚呈現(xiàn)年輕化的表現(xiàn)，與前人的報(bào)導(dǎo)相同。維甲酸改善D-半乳糖加光照所致的皮膚衰老狀態(tài)，可能是維甲酸激活了D-半乳糖造成的衰老細(xì)胞的活性，促進(jìn)了基底細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的分裂、增殖，修復(fù)了光損傷而呈現(xiàn)出年青化的表現(xiàn)。致于這種刺激細(xì)胞的增殖活性是否具有持久的抗衰老作用，還有待進(jìn)一步研究。3.4.2 人參霜外用抗皮膚衰老作用不明顯人參是傳統(tǒng)的抗衰老中藥，已證明人參具有廣泛開的藥理作用，能提高細(xì)胞壽命，維持衰老細(xì)胞的生存能力，促進(jìn)DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成，可與體內(nèi)的自由基結(jié)合，減少脂褐素在體內(nèi)的沉積等，具有較強(qiáng)的抗自由基作用。研究表明，灌服人參后，可明顯的增加小鼠的皮膚中羥脯氨酸的含量，但對人參皂甙外用未見報(bào)導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)用2.5％人參霜外涂皮膚衰老模型小鼠的皮膚后發(fā)現(xiàn)其表皮輕度增厚，膠原合成較基質(zhì)組外用組有所增厚，但不及正常小鼠皮膚膠原厚度，而彈力纖維含量與基質(zhì)組比較無明顯差異。SOD檢測則較基質(zhì)組顯著升高，達(dá)正常組水平，MDA含量與基質(zhì)組無明顯減少，皮膚羥脯氨酸含量較基質(zhì)組無明顯增多，說明人參皂甙外用未能呈現(xiàn)明顯的抗皮膚衰老作用，可能與人參皂甙分子量較大，透皮量較少有關(guān)，致于透皮量。透皮機(jī)理如何，還有待進(jìn)一步研究。3.4.3維生素E外用有抗皮膚衰老作用維生素E是公認(rèn)的抗氧化劑，可抑制生物膜中脂質(zhì)過氧化過程，有一定的抗衰老作用，大劑量可抑制膠原酶的活性，并能改善結(jié)締組織的代謝，改善微循環(huán)等作用。研究表明，活性氧基和氧自由基在皮膚光損傷、光老化及光致癌中起重要作用，紫外線照射后皮膚酶和非酶性抗氧化劑明顯降低，采用自由基清除劑的抗氧化劑補(bǔ)充治療可以防止皮膚氧化性損傷。Bisseett等人證明用抗氧化劑生育酚局部外用可防止紫外線誘導(dǎo)的皮膚急慢性光損傷，其機(jī)理可能是抗氧化劑能有效地抑制光損傷的脂質(zhì)過氧化作用和聚酰胺的產(chǎn)生及表皮鳥氨酸羥羧酶的合成從而改善了皮膚光損傷細(xì)胞的功能，減緩了皮膚細(xì)胞衰老的發(fā)生發(fā)展，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也佐證了這個論點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)在皮膚衰老模型的基礎(chǔ)上，用2.5％維生素E霜外用與基質(zhì)組(單純霜劑)相比，維生素E組表皮厚度明顯增厚，細(xì)胞層數(shù)增多，基底細(xì)胞數(shù)排列規(guī)整，胞體豐滿，膠原層較基質(zhì)組明顯增厚，且有較多的成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管，彈力纖維與基質(zhì)組相當(dāng)，說明成纖維細(xì)胞以合成膠原蛋白為主，皮膚SOD檢測較基質(zhì)組明顯升高，MDA降低明顯，羥脯氨酸含量較基質(zhì)組顯著升高，達(dá)正常皮膚水平，說明VitE確有抗皮膚衰老作用，但效果不及維甲酸外用組。3.4.4人參維甲酸霜對抗皮膚衰老具有良好的作用上述人參霜外用抗皮膚衰老作用不明顯，但與維甲酸聯(lián)用后則表現(xiàn)為明顯的協(xié)同作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，人參維甲酸霜較維甲酸組表皮厚度及膠原層明顯增厚，表皮細(xì)胞層數(shù)更多，細(xì)胞間基質(zhì)更豐富，膠原束排列更規(guī)整，彈力纖維卻明顯減少，SOD活性在各實(shí)驗(yàn)組中最高，而MDA含量則較低，皮膚羥脯氨酸含量最高，說明人參維甲酸霜較單用具有更好的抗皮膚衰老，機(jī)理可能是維甲酸是一種角質(zhì)剝脫劑，可抑制張力原纖維的合成，減少角化細(xì)胞間的接觸，從而使角質(zhì)層細(xì)胞易溶解，間隙變寬，減少了屏障作用，從而促進(jìn)了人參的透皮吸收量而發(fā)揮人參的抗衰老作用，其協(xié)同作用機(jī)制還需進(jìn)一步探討。
權(quán)利要求
1.一種具有防治皮膚衰老、具有保健美容功效的外用制劑人參維甲酸霜，其特征是該復(fù)方制劑是由中藥人參與維甲酸組成。
2.如權(quán)利要求1所述的一種具有防治皮膚衰老、具有保健美容功效的復(fù)方制劑人參維甲酸霜，該復(fù)方制劑中的中藥人參是指人參的提取物，其配制濃度0.5％～10％較好，其最佳濃度為2％～5％。
3.如權(quán)利要求1所述的一種具有防治皮膚衰老、具有保健美容功效的復(fù)方制劑人參維甲酸霜，該復(fù)方制劑中的維甲酸配制濃度為1mg％～50mg％較好，其最佳濃度為2mg％～10mg％。
4.如權(quán)利要求1所述的一種具有防治皮膚衰老、具有保健美容功效的復(fù)方制劑人參維甲酸霜，該復(fù)方制劑中的中藥人參是指人參皂苷，人參莖葉皂苷，其配制濃度0.1％～5％較好，其最佳濃度為0.5％～2.5％。
5.如權(quán)利要求1所述的一種具有防治皮膚衰老、具有保健美容功效的復(fù)方制劑人參維甲酸霜，該霜劑的制備工藝是取2.5％的人參液溶解于蒸餾水10ml，維甲酸10mg加入少量無水酒精中使其溶解，滴加適量吐溫-80，然后加入2ml的蒸餾水中，磁力攪拌器攪拌成乳化液；取用硬酯酸、十八醇、硬酯酸單甘油酯等按一定比例配成的基質(zhì)80g，在50C加入上乳化液和人參液，混勻即得。
6.如權(quán)利要求1所述的一種具有防治皮膚衰老、具有保健美容功效的復(fù)方制劑人參維甲酸霜，該霜劑的制備工藝是取人參皂甙2.5g溶于10ml的水中，維甲酸5mg，加入少量無水酒精中使其溶解，滴加適量吐溫-80，然后加入2ml的蒸餾水中，磁力攪拌器攪拌成乳化液；取用硬酯酸、十八醇、硬酯酸單甘油酯等按一定比例配成的基質(zhì)80g，在50C加入上乳化液和人參皂甙液，混勻即得。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種防治皮膚衰老、具有保健美容功效的外用制劑人參維甲酸霜，該制劑由人參與維甲酸組成，對由隨年齡增長而發(fā)生和由日光照射所致的皮膚衰老有良好的預(yù)防和治療作用，也可用于皮膚美容，保持皮膚處于年輕狀態(tài)。衰老是生物體在生命周期中隨年齡增長而發(fā)生的全身各組織、器官減退和穩(wěn)態(tài)功能下降的過程。皮膚是機(jī)體衰老過程中最易顯露的器官。人的皮膚衰老不僅有損于美容，且與許多皮膚病如脂溢性角化、日光性角化、角化棘皮瘤、基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生也有著病因?qū)W的關(guān)系，因此，預(yù)防和延緩皮膚衰老已成為生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。為了解決皮膚抗衰老問題，本發(fā)明采用了人參和維甲酸組成復(fù)方外用制劑，用于實(shí)驗(yàn)研究，取得了明顯的療效，初步解決了皮膚衰老的預(yù)防和治療問題，該產(chǎn)品還具有保健美容的功效，可用于皮膚美容，保持皮膚處于年輕狀態(tài)。
文檔編號A61K31/19GK1480133SQ0314557
公開日2004年3月10日 申請日期2003年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月7日
發(fā)明者吳鐵, 王紅麗, 吳 鐵 申請人:廣東醫(yī)學(xué)院