專利名稱：具有抗流感病毒的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及系列的人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸，特別是涉及對(duì)流感病毒引起的人流感等呼吸道感染性疾病有治療和預(yù)防作用的人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸，以及用人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸治療和預(yù)防由流感病毒引起的人流感等呼吸道感染技術(shù)方法和技術(shù)設(shè)想。
背景技術(shù)：
流感病毒是引起人流感的病原體。在1918-1919年，全世界有兩千萬人死于流感病毒的流行(Patterson，K.D.& Pyle，G.F.(1991)Bull.Hist.Med.65，4-213)。流感病毒如此猛烈和和難于控制與其本身下述特點(diǎn)密切相關(guān)(1)在空氣傳播；(2)不斷變化抗原性(antigenic drift)逃逸已形成的保護(hù)性免疫(Parvin， J.D.，Moscona，A.，(1986)J.Virol.59，377-383；Webster，R.G.，(1982)Nature 296，115-121)(3)通過不同株流感病毒RNA可在同一感染細(xì)胞內(nèi)交互重組周期性產(chǎn)生新的突變體(Webster，R.G.，(1992)Microbiol.Rev.56，152-179)。
接種疫苗和應(yīng)用抗病毒藥物是防治流感病毒的兩類主要方法(Bridges，C.B.，F(xiàn)ukuda，K.，Cox，N.J.& Singleton，J.A.(2001)Morbid.Mortal.Wkly.Rep.50，1-44)，但事實(shí)證明，這兩類方法均不能有效地控制流感的流行(Webby，R.J.& Webster，R.G.(2001)Philos.Trans.R.Soc.London 356，1817-1828)。在易感人群，接種疫苗的短期(半年)保護(hù)率約為39％(Fukuda，K.，N.J.(1999)Morbid.Mortal.Wkly.Rep.48，1-28，Castle，S.C.(2000)Clin.Infect.Dis.31，578-585)。由于流感病毒抗原[血細(xì)胞凝集素(HA)和神經(jīng)酰胺酶(NA)]性不斷變化，現(xiàn)行的疫苗幾乎每年都要重新改構(gòu)。由于副作用較大和新的抗藥流感病毒株不斷出現(xiàn)，一些獲準(zhǔn)抗流感病毒藥物的效果也不理想(Luscher-Mattli，M.(2000)Arch.Virol.145，2233-2248)。
近年來的研究表明，多種具有CpG結(jié)構(gòu)的細(xì)菌和病毒DNA對(duì)人的免疫系統(tǒng)均為危險(xiǎn)的信號(hào)，可激活多種免疫細(xì)胞啟動(dòng)機(jī)體的抗病毒機(jī)制。CpG是由胞嘧啶和鳥嘌呤通過磷酸連接成的二核苷酸，C代表胞嘧啶，G代表鳥嘌呤，p代表磷酸。進(jìn)一步的研究表明，含CpG的人工合成的脫氧核糖核酸寡核苷酸(CpG ODN)也可激活多種免疫細(xì)胞啟動(dòng)機(jī)體的抗病毒機(jī)制。
在小鼠和豚鼠陰道應(yīng)用CpG ODN可提高小鼠抵御致死量HSV-2病毒攻擊的能力(Richard B.Pyles et al.Journal of Virology，November 2002，Vol.76，No.22 p.11387-11396)。給小鼠應(yīng)用CpG ODN可減少其呼吸道合胞病毒(RSV)的荷量(Cho JY，et al.JAllergy Clin Immunol 2001 Nov；108(5)697-702)。給感染弗蘭德病毒(一種鼠類白血病病毒)的小鼠應(yīng)用CpG ODN可明顯減低小鼠血中的病毒載量(Anke R.M.Olbrich，et al.Journal ofVirology，November 2002，Vol.76，No.22 p.11397-11404)。給正常C57BL/6小鼠于病毒攻擊前2天靜脈注射CpG ODN，然后用正常致死量的單純皰疹病毒2型(HSV-2)靜脈攻擊，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CpG ODN可使小鼠陰道分泌物中病毒滴度明顯降低并刺激生殖道粘膜快速產(chǎn)生的IFN-γ、IL-12和IL-18等保護(hù)性細(xì)胞因子(Harandi AM，et al.J Virol 2003；77(2)953)。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明概述本發(fā)明的目的之一是提供系列人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸特別是對(duì)可刺激人外周血細(xì)胞產(chǎn)生抗流感病毒的人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸。它們由含一個(gè)或多個(gè)CpG的寡核苷酸單鏈DNA分子構(gòu)成，其磷酸二酯鍵可以是部分硫化的，全部硫化的，也可以是未硫化的。優(yōu)選地，本發(fā)明的人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸具有SEQ ID NO1-5所示的序列。
本發(fā)明的目的之二是提供本發(fā)明的人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸的抗流感病毒作用。
本發(fā)明的目的之三是提供本發(fā)明的人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸對(duì)流感病毒毒感染引起的流感等人呼吸道的傳染性疾病的治療和預(yù)防的作用。
本發(fā)明的目的之四是提供用人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸治療和預(yù)防由流感病毒感染引起的流感等人呼吸道的傳染性疾病的技術(shù)方法和設(shè)想。
另外，需要指出的是，在本申請(qǐng)的上下文的公開內(nèi)容的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的其它具有實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)的方面和創(chuàng)造性的有益效果對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是可以直接推知的。
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明的上下文中，所使用的術(shù)語除非另外說明，一般具有本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義。特別地，下列術(shù)語具有如下的含義優(yōu)選地，本發(fā)明的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸具有如下所示的序列DVAX-15’-TCgTCgggTgCgACgTCgCAgggggg-3’DVAX-35’-TCgTCgTTTCgTCgTTgggg-3’DVAX-45’-TCgACgTTCgTCgTTCgTCgTTC-3’DVAX-55′-TCggggACgATCgTCgggggg-3′DVAX-65′-ggATCgATCgATCgATgggggg-3′其中的磷酸二酯鍵可以是部分硫化的，全部硫化的，也可以是未硫化的。
本發(fā)明的CpG單鏈脫氧核苷酸可通過已知的方法生產(chǎn)，例如采用固相亞磷酰胺三酯法進(jìn)行生產(chǎn)。以下的實(shí)施例詳細(xì)地例舉了一種生產(chǎn)本發(fā)明的人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸的方法。
在預(yù)防和治療由SARS病毒感染引起的人流感等呼吸道的傳染性疾病時(shí)，這些人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸的一次用藥劑量為1-5000微克。
本發(fā)明的人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸的使用方式包括單獨(dú)應(yīng)用、兩種或兩種以上聯(lián)合應(yīng)用、與治療或預(yù)防流感病毒引發(fā)的感染性疾病的藥物或疫苗混合使用、與治療和預(yù)防由流感病毒感染病毒引起的感染性疾病的藥物或疫苗通過交聯(lián)劑共價(jià)偶聯(lián)使用。
應(yīng)用方式包括粘膜(包括呼吸道、消化道和泌尿生殖道黏膜)表面應(yīng)用，滴眼，皮下、肌肉注射應(yīng)用，胃腸應(yīng)用，腹腔應(yīng)用，靜脈注射等常用的方式應(yīng)用。
下面結(jié)合具體的制備實(shí)施例和生物學(xué)效果實(shí)施例，并參照附圖
進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例在如下實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法，例如合成采用固相亞磷酰胺三酯法。在如下實(shí)施例中，所用試劑的來源、商品名和/或有必要列出其組成成分者，均只標(biāo)明一次。在其后所用相同試劑如無特殊說明，不再贅述上述內(nèi)容。實(shí)施例1人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸的制備采用固相亞磷酰胺三酯法合成人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸。
1、試劑和材料三氯乙酸(Trichloroacetic Acid，TCA)、可控多孔玻璃(Controlled Pore Glass)、DMT(二甲氧基三苯甲基)、四氮唑活化劑、乙酸酐、N-甲基咪唑、A、T、C、G四種核苷酸單體、ABI DNA合成儀、高效液相色譜層析儀等2、方法脫保護(hù)基用三氯乙酸(Trichloroacetic Acid，TCA)脫去連結(jié)在可控多孔玻璃(Controlled Pore Glass)上的核苷酸的保護(hù)基團(tuán)二甲氧基三苯甲基(DMT)，獲得游離的5′-羥基端，以供下一步縮合反應(yīng)。
活化將亞磷酰胺保護(hù)的核苷酸單體與四氮唑活化劑混合并進(jìn)入合成柱，形成亞磷酰胺四唑活性中間體(其3′-端已被活化，但5′-端仍受DMT保護(hù))，此中間體將與可控多孔玻璃上的已脫保護(hù)基的核苷酸發(fā)生縮合反應(yīng)。
連接亞磷酰胺四唑活性中間體遇到可控多孔玻璃上已脫保護(hù)基的核苷酸時(shí)，將與其5′-羥基發(fā)生親合反應(yīng)，縮合并脫去四唑，此時(shí)合成的寡核苷酸鏈向前延長(zhǎng)一個(gè)堿基。
封閉縮合反應(yīng)后為了防止連在可控多孔玻璃上的未參與反應(yīng)的5′-羥基在隨后的循環(huán)反應(yīng)中被延伸，常通過乙酰化來封閉此端羥基，一般乙酰化試劑是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的。
氧化縮合反應(yīng)時(shí)核苷酸單體是通過亞磷酯鍵與連在可控多孔玻璃上的寡核苷酸連接，而亞磷酯鍵不穩(wěn)定，易被酸、堿水解，此時(shí)常用碘的四氫呋喃溶液將亞磷酰轉(zhuǎn)化為磷酸三酯，得到穩(wěn)定的寡核苷酸。
經(jīng)過以上五個(gè)步驟后，一個(gè)脫氧核苷酸就被連到可控多孔玻璃的核苷酸上，同樣再用三氯乙酸脫去新連上的脫氧核苷酸5′-羥基上的保護(hù)基團(tuán)DMT后，重復(fù)以上的活化、連接、封閉、氧化過程即可得到一DNA片段粗品。最后對(duì)其進(jìn)行切割、脫保護(hù)基(一般對(duì)A、C堿基采用苯甲?；Ｗo(hù)；G堿基用異丁?；Ｗo(hù)；T堿基不必保護(hù)；亞磷酸用腈乙基保護(hù))、純化(常用的有HAP，PAGE，HPLC，C18，OPC等方法)、定量等合成后處理即可得到符合實(shí)驗(yàn)要求的寡核苷酸片段。
未硫化的CpG單鏈脫氧寡核苷酸在ABI 3900 DNA合成儀上合成；全硫化及部分硫化CpG單鏈脫氧寡核苷酸的合成采用置換法，在ABI 394 DNA合成儀上合成。
實(shí)施例2、人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸的抗流感病毒作用1、人外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離儀器設(shè)備和器材低溫冰箱、二氧化碳孵箱、超凈工作臺(tái)、倒置顯微鏡、液氮罐、蒸餾水器、真空泵、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、濾菌器、濾過瓶、各種規(guī)格的吸管、加樣器、滴管、血球計(jì)數(shù)板、水平式離心機(jī)等。
試劑和材料肝素抗凝的人全血來自兩個(gè)正常獻(xiàn)血員。
長(zhǎng)春市中心血站。
聚蔗糖-泛影葡胺比重1.077±0.001，北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。
IMDM培養(yǎng)液1000ml含慶大霉素10萬單位。0.22微米的濾膜抽濾除菌、分裝。方法用聚蔗糖-泛影葡胺淋巴細(xì)胞分層液分離人外周血的單個(gè)核細(xì)胞。分層液與肝素抗凝外周血的體積比約為2∶1。水平離心(1,000xg，20min)。用吸管吸取含單個(gè)核細(xì)胞的液帶，置入另離心管中。加入等體積的無血清培養(yǎng)基。1,000g離心15min，棄上清。重復(fù)洗滌兩次。棄上清，用2ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。計(jì)細(xì)胞數(shù)。
2、人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸抗流感病毒作用的測(cè)定用含10％胎牛血清的IMDM培養(yǎng)液調(diào)人外周血單個(gè)核細(xì)胞的終濃度為3×106個(gè)/毫升。加此細(xì)胞懸液于12孔培養(yǎng)板，每孔2ml。加人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸(6.25μg/ml)。
設(shè)DVAX-1對(duì)照加人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸(5’-TgCTTgggTggCAgCTgCCAgggggg-3’)；培養(yǎng)液對(duì)照不加人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸。37℃，5％二氧化碳孵箱培養(yǎng)48小時(shí)，收集上清，檢測(cè)其抗流感病毒的活性。
用5％胎牛血清IMDM調(diào)節(jié)生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Vero細(xì)胞(ATCC)濃度至3×105個(gè)/ml。將細(xì)胞接種于96孔平底培養(yǎng)板，每孔100μl。將含CpG單鏈脫氧寡核苷酸CpG刺激上清用5％胎牛血清IMDM稀釋10倍后，加樣，每孔加入100μl(此時(shí)，每孔體積200μl，即100μl細(xì)胞懸液+100μl稀釋后的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸CpG刺激人上清上清或?qū)φ丈锨?。設(shè)干擾素對(duì)照，流感病毒對(duì)照和正常Vero細(xì)胞對(duì)照。37℃ 5％CO2孵箱培養(yǎng)24小時(shí)。吸棄上清，每孔加入2％FBS IMDM稀釋的流感病毒液(長(zhǎng)春生物制品研究所)200μl，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)。待病毒對(duì)照孔細(xì)胞80-100％發(fā)生病變，而細(xì)胞對(duì)照孔細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)，終止培養(yǎng)，用結(jié)晶紫染色的方法判定細(xì)胞病變的程度。吸棄培養(yǎng)液。每孔加200μl 0.5％結(jié)晶紫染液，37℃，15分鐘。流水沖掉結(jié)晶紫染液。0.5％結(jié)晶紫染液結(jié)晶紫0.5克，NaCl 0.85克，溶于50毫升無水乙醚。加3毫升甲醛，47毫升蒸餾水。照相記錄結(jié)果。按圖-1所示加樣，結(jié)晶紫染色后的結(jié)果見圖2。
圖-1、96孔板加樣表注釋DVAX-1對(duì)照人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸，其序列為5’-TgCTTgggTggCAgCTgCCAgggggg-3’培養(yǎng)液對(duì)照未加人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸的培養(yǎng)上清正常Vero細(xì)胞未加流感病毒流感病毒未加細(xì)胞培養(yǎng)上清，加流感病毒DVAX1，3，4，5，6分別代表加代號(hào)為DVAX1，3，4，5，62，3人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸IFN干擾素α，長(zhǎng)春生物制品研究所C，D，E 1-10；F，G，H3-4為一獻(xiàn)血員的外周血單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)上清。
C，D，E 11-12；F，G，H5-12為另一獻(xiàn)血員的外周血單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)上清。
圖-2、人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸刺激人外周血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)流感病毒攻擊Vero細(xì)胞的保護(hù)作用結(jié)果表明，人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸DVAX-1，DVAX-3，DVAX-4，DVAX-5和DVAX-6(SEQ ID NO1-5)具有刺激人外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生抗流感病毒物質(zhì)的作用，這些物質(zhì)對(duì)流感病毒攻擊Vero細(xì)胞具有明確的的保護(hù)作用；人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸DVAX-1，DVAX-3，DVAX-4，DVAX-5和DVAX-6(SEQ ID NO1-5)對(duì)流感病毒毒感染引起的流感等人呼吸道的傳染性疾病的治療和預(yù)防的作用。
SEQUENCE LISTING<110>長(zhǎng)春華普生物技術(shù)有限公司<120>具有抗流感病毒的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸<160>6<210>1<211>26<212>DNA<213>artigicial<220>
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<400>1TcgTCgggTgCgACgTCgCAgggggg 26<210>2<211>20<212>DNA<213>artigicial<220>
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<221>
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<400>6ggATCgATCgATCgATgggggg 2權(quán)利要求
1.人工合成的含CpG單鏈脫氧核苷酸，它們由含一個(gè)或多個(gè)CpG的寡核苷酸單鏈DNA分子構(gòu)成。
2.按照權(quán)利要求1所述的單鏈脫氧核苷酸，它們的磷酸二酯鍵可以是非硫化的，部分硫化的，也可以是完全硫化的。
3.按照權(quán)利要求1所述的含CpG單鏈脫氧核苷酸，它們具有SEQ ID NO1-5任一所示的序列。
4.按照權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的含CpG單鏈脫氧核苷酸用于誘生細(xì)胞產(chǎn)生抗流感病毒物質(zhì)的用途。
5.按照權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的含CpG單鏈脫氧核苷酸用于流感病毒引起的人流感等呼吸道感染性疾病。
6.用人工合成的含CpG單鏈脫氧核苷酸治療和預(yù)防由流感病毒引起的人流感等呼吸道感染性疾病的技術(shù)方法和設(shè)想。
全文摘要
本發(fā)明提供了系列的人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸，它們由含一個(gè)或多個(gè)CpG的脫氧寡核苷酸單鏈DNA分子構(gòu)成，能夠刺激人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)產(chǎn)生抗流感病毒的物質(zhì)，這些物質(zhì)可作用于細(xì)胞使其抵抗流感病毒的攻擊；提供了人工合成的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸的抗流感病毒作用和對(duì)流感病毒引起的人流感等呼吸道感染治療和預(yù)防作用。
文檔編號(hào)A61K31/7088GK1569881SQ0314615
公開日2005年1月26日 申請(qǐng)日期2003年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月25日
發(fā)明者王麗穎, 包木勝, 于永利 申請(qǐng)人:長(zhǎng)春華普生物技術(shù)有限公司