專利名稱：殼聚糖納米粒－pcDNA的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，具體涉及一種殼聚糖納米粒-pcDNA3.1-hVEGF基因復(fù)合體的構(gòu)建。
背景技術(shù)：
殼聚糖是一種從蝦皮、蟹殼提取出來的天然高分子多糖，由氨基葡萄糖和N-乙酰-氨基葡萄糖以β-1.4甙鍵結(jié)合而成，其分子量一般為幾萬—幾十萬。殼聚糖高分子鍵上有許多游離氨基，在酸性條件下，這些游離氨基以發(fā)生質(zhì)子化而使殼聚糖高分子帶有正電荷。殼聚糖有生物降解性、與人體有很好的生物相容性。殼聚糖還有生物粘附性、可用作載體，殼聚糖現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，且顯示出良好的應(yīng)用前景。
納米粒技術(shù)是當(dāng)前材料學(xué)和物理學(xué)研究的熱點。納米粒制備技術(shù)大體上有物理和化學(xué)兩種方法。殼聚糖納米?；蛑苽浼夹g(shù)一般采用化學(xué)方法——凝聚法，其原理是用殼聚糖高分子在酸性條件下帶正電荷，而質(zhì)粒核酸分子在堿性條件下帶負電荷，兩者在一定條件下發(fā)生凝聚反應(yīng)，成為殼聚糖納米?；驈?fù)合體。但以往的納米粒制備技術(shù)所制備的納米粒的粒徑多在200nm以上，且制備程序繁瑣、成本高，因而應(yīng)用受到限制。
根據(jù)殼聚糖的特性，用單凝聚法制備殼聚糖納米粒。殼聚糖是一種天然的陽離子多糖，本身不溶于有機溶劑，在殼聚糖高分子鏈上因有許多游離氨基，在酸性條件下有氨基發(fā)生質(zhì)子化是殼聚糖分子帶正電荷，可用脫水劑硫酸鈉脫去殼聚糖分子表面的水化膜，導(dǎo)致溶解性下降，因而殼聚糖分子相互凝聚成粒子從其體系中析出。
組織工程的發(fā)展為組織器官缺損的生理性替代性修復(fù)提供了可能，但目前在組織工程產(chǎn)品的研究與開發(fā)中面臨著一個共同的問題，即當(dāng)構(gòu)建組織的厚度超過4mm時，中間的細胞成分就會因為血供無法到達而壞死，因此急需尋找一種新的方法來提高組織工程化組織的血管化水平。既往曾有研究將具有促進血管生成作用的細胞因子如血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)等與支架材料復(fù)合，借此提高組織工程化組織的血管化水平，但由于蛋白本身容易變性，與材料復(fù)合困難，容易失活，而且體內(nèi)容易降解，應(yīng)用效果并不理想。本發(fā)明對現(xiàn)有的殼聚糖納米粒制備技術(shù)進行了改進，并應(yīng)用改進后的技術(shù)制備了殼聚糖納-pcDNA3.1-hVEGF基因復(fù)合體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種殼聚糖納米粒-pcDNA3、1-hVEGF基因復(fù)合體的制造方法。其特征在于用殼聚糖(Sigma)、硫酸鈉為原料，先用殼聚糖與硫酸鈉化混合制成殼聚糖納米粒，再與重組質(zhì)粒pcDNA3.1-hVEGF構(gòu)建成復(fù)合體本發(fā)明構(gòu)建的納米粒-基因復(fù)合體的平均粒徑較小，在70-160nm之間，呈球形，使其在單位體積內(nèi)粒數(shù)增多，比表面積增大，從而在相同體積內(nèi)攜帶基因數(shù)量增多，適用于心肌等大塊組織的組織工程應(yīng)用。
具體實施例方式
實施例1重組質(zhì)粒pcDNA3.1-hVEGF的構(gòu)建質(zhì)粒pcDNA3.1是一種真核表達載體，該質(zhì)粒構(gòu)建有人巨細胞病毒啟動子，可以對插入的外源基因進行表述調(diào)控。該質(zhì)粒自身載有hVEGF的基因編碼序列，在自身表達調(diào)控元件的作用下可以表達產(chǎn)生hVEGF。質(zhì)粒多克隆位點上有17個酶切位點。用限制性內(nèi)切酶可將BamHI和KpnI區(qū)域切開，然后用T4DNA連接酶與同樣經(jīng)過BamHI和KpnI雙酶切處理的外源基因連接，使其置于人巨細胞病毒CMV啟動子控制下，這樣就構(gòu)建成外源基因的真核表達載體(見附圖)。
實施例2殼聚糖納米粒的制備將一定濃度的殼聚糖溶液用1N的HCl調(diào)成pH5.5，從中取200ul和一定濃度的Na2SO4溶液200ul，加到殼聚糖溶液中，迅速用旋渦混合器混合30秒，即得殼聚糖納米粒懸液。
形態(tài)，粒徑和粒度分布測定目的是考察各因素對制備工藝的影響。取少量納米粒混懸液滴至鋪有碳膜的銅網(wǎng)上，靜置2分鐘，用濾紙吸干混懸液，再滴加2％磷鎢酸負染2分鐘，于透射電子顯微鏡下觀察納米粒形態(tài)。并對透射電鏡照片用刻度尺測量并根據(jù)放大倍數(shù)計算出粒經(jīng)，每個樣品測量200-400粒子數(shù)，按統(tǒng)計學(xué)處理求的平均粒徑。粒度分布用跨距表示，其計算公式跨距＝(D90-D10)/D50其中D90、D50、D10分別為有90％、50％、10％的粒子數(shù)小于改制的粒徑。
影響殼聚糖的納米粒的因素殼聚糖濃度對平均粒徑的影響——隨殼聚糖濃度增大，平均粒經(jīng)增大(見表1)。硫酸鈉濃度對平均粒徑的影響——硫酸鈉濃度增大，平均粒徑線逐漸減小，當(dāng)硫酸鈉濃度大于一丁時平均粒徑又開始逐漸增大(見表2)。溫度對平均粒徑的影響——溫度增大，平均粒徑也增大，其最適溫度為45℃～65℃(見表3)。pH對平均粒徑的影響——pH增大，平均粒經(jīng)也增大，最適pH5.5(見表4)。
殼聚糖納米粒的平均粒徑為70～160nm之間，透射電鏡測定形狀比較規(guī)則，大多呈球形。
實施例3殼聚糖納米粒-pcDNA3.1-hVEGF基因復(fù)合體的構(gòu)建采用凝聚法制備(所述操作均在無菌條件下進行)先配制0.03％的殼聚糖(Sigma)溶液，用1N HCl調(diào)PH值到5.5，0.22μm濾膜過濾除菌。用75mM的Na2SO4(分析純，北京化工廠)溶液(0.22μm濾膜過濾除菌)溶解pcDNA3.1-hVEGF重組質(zhì)粒，使其終濃度為200μg/ml。取200μl 0.03％殼聚糖溶液和200μl含重組質(zhì)粒的75mM Na2SO4溶液分別置于55℃水溶液恒溫20分鐘。準確吸取200μl的Na2SO4溶液加到殼聚糖溶液中，迅速在旋渦混合器上混合30秒，制成殼聚糖納米粒-pcDNA3.1-hVEGF混懸液，低溫凍干成納米粒，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 殼聚糖濃度對平均粒徑的影響殼聚糖濃度對粒徑大小有顯著的影響，隨殼聚糖濃度增大，平均粒徑逐漸減小(見表5)。
質(zhì)?；驖舛葘ζ骄降挠绊戀|(zhì)?；驖舛葘α酱笮∮酗@著影響，隨著基因濃度增大，平均粒徑逐漸增大(見表6)。
硫酸鈉濃度對平均粒徑的影響當(dāng)硫酸鈉濃度大于10mM時，殼聚糖納米粒發(fā)生大片凝聚，而硫酸鈉濃度在5～10mM時對平均粒徑?jīng)]有影響(見表7)。
取適量重組殼聚糖納米粒懸液，加雙蒸水稀釋后用納米粒度分析儀測定其總平均粒徑、強度平均粒度、體積平均粒徑、數(shù)目平均粒徑以及多分散度。
本發(fā)明有益效果是利用該方法構(gòu)建成重組質(zhì)粒殼聚糖納米粒，其特點是，即制備的殼聚糖納米粒平均粒徑較小約在70～160nm質(zhì)監(jiān)，它明顯小于文獻報道的200nm以上的平均粒徑、納米粒數(shù)的單位體積增多、比表面積大、基因表達量高、使其所載的重組質(zhì)粒基因充分發(fā)揮作用。它對心肌及大塊組織血管生成有促進作用。
表1殼聚糖濃度對平均粒徑的影響

表2硫酸鈉濃度對平均粒徑的影響

表3溫度對平均粒徑的影響

表4pH對平均粒徑的影響

表5殼聚糖濃度對平均粒徑的影響

表6質(zhì)?；驖舛葘ζ骄降挠绊?

表7硫酸鈉濃度對平均粒徑的影響



附圖pcDNA3.1hVEGF重組質(zhì)粒
權(quán)利要求
1一種殼聚糖納米粒-pcDNA3.1-hVEGF基因復(fù)合體的制造方法。其特征是將人血管內(nèi)皮細胞生長因子(hVEGF)基因插入到pcDNA3.1真核表達載體中，采用凝聚法制造殼聚糖納米粒-pcDNA3.1-hVEGF基因復(fù)合體。
2權(quán)利要求1所述的hVEGF基因，其特征是編碼區(qū)基因，含起始密碼子和終止密碼子。
3權(quán)利要求1所述的hVEGF基因，其特征是采用RT-PCR的方法從人血管組織獲得，兩端分別設(shè)計不同的酶切位點。產(chǎn)物先克隆入PGEM-T載體，進行測序，以確保序列正確。
4權(quán)利要求1所述的hVEGF基因，其功能是能促進血管內(nèi)皮細胞增生，形成新生血管。
5權(quán)利要求1所述的pcDNA3.1-hVEGF重組表達載體，其構(gòu)建方法是將hVEGF編碼區(qū)序列插入到pcDNA3.1載體的多克隆位點。
6權(quán)利要求1中所述的凝聚法，其特征是將0.03％殼聚糖溶液(PH5.5)和濃度200μg/ml的pcDNA3.1-hVEGF重組質(zhì)粒(含75mM的Na2SO4)分別置于55℃水溶液恒溫20分鐘，然后分別取等量的溶液迅速混合，并劇烈振蕩。
7權(quán)利要求1中所述的殼聚糖納米粒-pcDNA3.1-hVEGF基因復(fù)合體，其特征是平均粒徑在70-160nm之間，粒徑較小，比表面積大，單位體積的粒數(shù)較多。因而在體內(nèi)基因表達量也會增多，為本發(fā)明的特點。
8權(quán)利要求1所述的殼聚糖納米粒-pcDNA3.1-hVEGF基因復(fù)合體，其特征是在體內(nèi)質(zhì)粒從復(fù)合體中緩慢釋放，轉(zhuǎn)染周圍細胞，產(chǎn)生hVEGF，促進血管增生，可以應(yīng)用于心肌等大塊軟組織的組織工程，也可以應(yīng)用于其他涉及需要改善局部血供的治療，以提高組織的血管化程度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種殼聚糖納米粒－pcDNA
文檔編號A61P9/00GK1566343SQ03148550
公開日2005年1月19日 申請日期2003年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月3日
發(fā)明者王常勇, 齊子榮, 郭希民, 段翠密, 孫志杰 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所