專利名稱：諾卡氏菌的生物純培養(yǎng)物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新穎的噻唑肽類抗菌素化合物諾卡沙星I，II和III及其藥用組合物和用抗菌素諾卡沙星I，II和III治療細菌感染的方法。
背景技術：
對于一些抗菌藥物如內酰胺抗菌素、β-大環(huán)內酯、喹諾酮和萬古霉素來說，耐藥菌的出現(xiàn)已成為世界健康難題。(Cohen，M.L.Antimicrobial resistanceprognosis for public health.TrendMicrobiol.1994，2，422-425)。臨床實踐中最顯著的問題是耐甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌(MRSA)菌株的發(fā)生率增加。目前，治療多種MRSA感染的最有效藥物是萬古霉素。同時，也出現(xiàn)了有關MRSA分離菌耐萬古霉素的報道。其他一些最近出現(xiàn)的與臨床相關的多藥耐藥菌是腸球菌。一種耐青霉素和其他抗菌素的公眾易感染的重要的病原體-肺炎鏈球菌也成為世界健康難題。包括美國在內的一些國家已出現(xiàn)肺炎鏈球菌多藥耐藥菌。這種醫(yī)源性的(nosocomial)和公眾易感染的耐藥病原體的出現(xiàn)和傳播大大威脅著世界范圍公眾健康。所以迫切需要發(fā)明一種治療多藥耐藥菌感染的新型藥物。本發(fā)明即致力于這種研究。
新型的噻唑肽抗菌素如下所述(在此所指的是諾卡沙星(nocathiacin)I，II和III，或是諾卡沙星抗菌素)。它在毫微摩爾水平對革蘭氏陽性菌有抑制活性。這里所述的新穎抗菌素從諾卡氏菌種ATCC-202099的液體培養(yǎng)基中分離制得。已知的噻唑肽類抗菌素有蘚霉素和諾西肽，有報道glycothiohexide-α在體外對革蘭氏陽性菌有抑制活性，但沒報道體內活性。在此披露的抗菌素對全身性金黃色葡萄球菌感染的鼠模型顯示了體內活性。
以前，J.E.Leet等(U.S.臨時申請60/093,021，1998年7月16日申請)和Sassaki，T.等，J.of Antibiotics 51，No.8，第715-721頁(1998年8月25日出版)曾描述過諾卡沙星I。本發(fā)明諾卡沙星抗菌素與諾西肽(Prange T.等，J.Am Chem Soc.99，6418(1977)；Benazet，F(xiàn).等.Experientia 36，414(1980)；Floss，H.G.等.J.Am Chem Soc.115，7557(1993)；glycothiohexides(Steinberg，D.A.等，J.Antibiot.47，887(1994)；M.D.Lee等，J.Antibiot.47，894(1994)M.D。Lee等，J.Antibiot.47，901(1994)；US 5,451,581，1995年)，及抗菌素S-54832A(U.S4,478,831，1984年)相關但又有明顯差異。

發(fā)明內容
本發(fā)明涉及新穎的噻唑肽類抗菌素化合物諾卡沙星I，II和III。本發(fā)明的抗菌素可由諾卡氏菌種(Nocardiasp.)(WW-12651，ATCC-202099株)的發(fā)酵液體培養(yǎng)基中分離和純化而獲得。
本發(fā)明也涉及了藥用組合物和用抗菌素諾卡沙星I，II和III治療細菌感染的方法，及用于生產(chǎn)抗菌素的諾卡氏菌種菌株的生物學純培養(yǎng)基。本發(fā)明包括諾卡沙星抗菌素的所有可藥用衍生物，如可藥用的鹽和其酯類。
人們希望這種在體內外抑制革蘭氏陽性菌的化合物能象其它抗菌素一樣用于哺乳動物特別是人類，標題化合物在治療細菌感染方面的利用正基于此。本發(fā)明化合物具有抗菌活性，尤其是抑制革蘭氏陽性菌。


圖1所示為諾卡沙星I的紫外吸收圖譜。
圖2所示為諾卡沙星I的紅外吸收圖譜。
圖3所示為諾卡沙星I在氘化二甲亞砜中測定的1H-NMR圖譜(500MHz)。
圖4所示為諾卡沙星I在氘化二甲亞砜中測定的13C-NMR圖譜(125MHz)。
圖5所示為諾卡沙星II的紫外吸收圖譜。
圖6所示為諾卡沙星II的紅外吸收圖譜。
圖7所示為諾卡沙星II在氘化二甲亞砜中測定的1H-NMR圖譜(500MHz)。
圖8所示為諾卡沙星II在氘化二甲亞砜中測定的13C-NMR圖譜(125MHz)。
圖9所示為諾卡沙星III的紫外吸收圖譜。
圖10所示為諾卡沙星III的紅外吸收圖譜。
圖11所示為諾卡沙星III在氘化二甲亞砜中測定的1H-NMR圖譜(500MHz)。
圖12所示為諾卡沙星III在氘化二甲亞砜中測定的13C-NMR圖譜(125MHz)。
具體實施例方式
該諾卡沙星I，II和III的抗生素化合物是在發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)的。標題所示諾卡沙星化合物從Nocardiasp.(WW-12651，ATCC-202099)的發(fā)酵液體培養(yǎng)基中分離，經(jīng)提取和色譜分離得以純化獲得到無定形固體。
微生物描述用于產(chǎn)生諾卡沙星抗菌素的微生物是從新墨西哥州采集的土壤樣品中分離的Nocardia sp。培養(yǎng)物(菌株WW-12651)1998年3月4日貯藏在Rockville，MD的美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，保藏編號為ATCC-202099。ATCC的保藏滿足所有的布達佩斯條約要求。休眠的培養(yǎng)物也保存在布里斯托爾-邁爾斯施貴寶公司的藥物研究所培養(yǎng)物保藏中心，第五Research Parkway，Wallingford，CT 06492。這里描述的特殊微生物之外，應該理解一種突變體，例如包括X-射線在內的化學或物理誘變劑導致的突變，和那些通過分子生物學技術改變遺傳組成的菌也可以培養(yǎng)產(chǎn)生諾卡沙星抗菌素。
根據(jù)國際鏈霉菌屬項目(ISP)指南的建議，菌株WW-12651的顯微研究在ISP的形態(tài)學培養(yǎng)基(ISP2，ISP3，ISP4，ISP5和ISP7)中進行，在28℃孵育下的第7、14和21天進行鏡檢觀察。
在ISP4培養(yǎng)基上生長為奶油色的菌落，氣生菌絲體是白色分節(jié)的。在光學顯微鏡下，生長的菌絲體中可見孢于鏈，而穗網(wǎng)狀菌絲體中很少或未見孢子鏈。這種有機體的形態(tài)學分類為鏈霉菌類型。在鹽-淀粉瓊脂中(ISP4)可見淺棕橙色reverse顏色。在任何的ISP培養(yǎng)基中都沒有擴散色素的產(chǎn)生。在酪氨酸瓊脂(ISP7)中沒有形成類黑素，用改良的Arai和Mikami黑色素形成試驗也未檢測到。
細胞壁的氨基酸成分是丙氨酸，L-谷氨酸，天冬氨酸和間-二氨基庚二酸異構體，細胞壁的糖成分是半乳糖，阿拉伯糖和核糖。碳源利用研究顯示當作為單碳源結合無機鹽瓊脂(ISP9)時，葡萄糖、甘露醇、蔗糖、木糖和果糖(較差)可被利用。阿拉伯糖，肌醇，棉子糖和鼠李糖在ISP9培養(yǎng)基作為唯一碳源時，不被利用(ISP9)。基于以上性質和霉菌酸的分析，可以確定這種微生物屬于Nocardia屬。Nocardia sp.(菌株WW-12651)的發(fā)酵諾卡沙星抗菌素的生產(chǎn)可以在下述條件的合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中通過培養(yǎng)Nocardiasp.菌株WW-12651完成，優(yōu)選置于浸沒有氧條件下，直至在發(fā)酵中檢測出一定量的諾卡沙星，通過使用合適的溶劑從生長的菌絲中提取活性成分獲得，濃縮包含所需成分的溶液，然后從培養(yǎng)基的其它代謝物中色譜分離濃縮的成分。
任何益于培養(yǎng)菌生長的溫度如16℃和40℃都會影響Nocathiacin的生產(chǎn)，但優(yōu)選在22-32℃進行。液體培養(yǎng)基有必要孵育一段時間以保證Nocathiacin的生產(chǎn)充分進行，用HPLC通常監(jiān)測1-6天，生產(chǎn)中旋轉振動器轉速為50-300rpm，優(yōu)選150-200rpm。
微生物的生長可以使用適當?shù)呐囵B(yǎng)基通過普通的工藝完成。簡而言之，碳源包括葡萄糖、果糖、甘露糖、麥芽糖、半乳糖、甘露醇和甘油、其它糖和糖醇、淀粉和其他的碳水化合物，或碳水化合物的衍生物如葡聚糖、cerelose和復雜的營養(yǎng)物如燕麥粉、玉米粉、小米、谷類等。用于培養(yǎng)基中的碳源的精確數(shù)量一定程度取決于培養(yǎng)基的其它成分，同時也發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中含0.5-10％的碳水化合物是令人滿意的。這些碳源能單獨或合并用于同一個培養(yǎng)基中。一些優(yōu)選碳源將在下面闡述。
N源包括甘油、精氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸等氨基酸及銨鹽和來源復雜的酵母提取物、玉米提取物、可溶性餾出物、大豆粉、棉籽粉、魚粉等，不同N源能單獨使用在0.05-5％重量范圍的培養(yǎng)基中。
能合并用于培養(yǎng)基的營養(yǎng)無機鹽是普通的鹽類，它們能產(chǎn)生Na、K、Mg、Ca、P、S、Cl、碳酸等離子，也包括鈷、錳、鐵、鉬、鋅、鎘等的痕量金屬。
典型地說，Nocardiasp.(菌種WW-12651)生長在含100ml營養(yǎng)培養(yǎng)基的500ml燒瓶中其中每升去離子水含20g淀粉；5g葡萄糖；3g N-Z case；2g酵母提取物；5g魚肉提取物；5g碳酸鈣。培養(yǎng)物在250rpm的旋轉振蕩器中32℃孵育3天。營養(yǎng)培養(yǎng)基與一定量的每升去離子水中含100g蔗糖和200g甘油的冷凍保護液混合?；旌衔锏拿?ml一份轉移至無菌冷凍管中(5ml容量)，在干冰-丙酮浴中冷凍，得到的冷凍的營養(yǎng)培養(yǎng)基在-80℃保存。
用于生產(chǎn)諾卡沙星抗菌素產(chǎn)品的種子培養(yǎng)物通過下面過程制得。將4ml含冷凍保護液的培養(yǎng)基移至含100ml無菌營養(yǎng)培養(yǎng)物(同前述相同成分)的500ml燒瓶中。種子培養(yǎng)基在250rpm的旋轉振蕩器中28℃-32℃孵育3天。這種種子培養(yǎng)基每4ml培養(yǎng)在含100ml下列培養(yǎng)基的燒瓶中每升去離子水含HY Yest 421，10g，20g葡萄糖，10gNutrisoy，這是優(yōu)選的培養(yǎng)物。該培養(yǎng)物在180rpm-250rpm的旋轉振蕩器中24℃-32℃孵育。最佳的諾卡沙星抗菌素通常在發(fā)酵4-5天后獲得。
當用諾卡沙星I， II或III化合物用作治療細菌感染的藥學組分時，它們可以與同一種或幾種可藥用的載體結合，例如溶劑、稀釋劑等。也可以以某種形式口服，如片劑、膠囊劑、可分散的散劑、顆粒劑或含有例如約0.05-5％混懸劑的混懸液、含有例如約10-50％糖漿的糖漿劑、含有例如約20-50％乙醇的酏劑等，或以含0.05-5％混懸劑(混懸于等滲介質中)的混懸液或無菌注射液形式非胃腸道給藥。這里所說的藥用制劑可以是約0.05-90％的活性成分與載體結合，但更常見的是重量比為約5％和60％。
活性組分的有效劑量，可以依據(jù)所采用的特殊化合物、給藥方法和所治療疾病的嚴重程度不同而不同，因此一般說來，當本發(fā)明化合物按照大約0.5-500mg/每千克動物體重的每天劑量服用，優(yōu)選一日兩至四次給予不同劑量，或用緩釋形式可以獲得滿意的療效。對于大多數(shù)大的哺乳動物，每日總劑量1-100mg，優(yōu)選從2-80mg。適宜內服的劑型含與固體或液體的藥用載體混合的0.5-500mg活性成分，這種給藥方式可以選擇提供最佳的治療效果。例如，以幾種不同的劑量每日給藥或根據(jù)治療形勢的特殊需要而成比例地減小劑量。
這些活性組分可以口服給藥及靜脈、肌內或皮下途徑給藥。固體載體包括淀粉、乳糖、磷酸二鈣、微晶纖維素、蔗糖和高嶺土，液體載體包括無菌水、聚乙二醇、非離子表面活性劑和食用油如玉米、花生和芝麻油，這些輔料與活性成分的性質和所需給藥的特殊形式相匹配。在藥用化合物制劑中通常使用的輔料是有利的，例如矯味劑、著色劑、防腐劑和抗氧劑如VE、抗壞血酸、BHT和BHA。
這些活性化合物也可以非腸道或腹膜內給藥。像游離堿和藥理學可接受的鹽。這樣的活性成分的溶液或混懸液可以通過在水中與表面活性劑如羥丙基纖維素混合來制備。膠體溶液(Dispersions)可以在甘油、液態(tài)聚乙二醇和這幾種混合油中制備。在一般的儲存和使用條件下，這些制劑含有防腐劑以防止細菌繁殖。
用于注射的藥用劑型包括無菌水溶液或膠體分散體。所有情況，這種劑型必須是無菌的和必須是一定程度上具有通針性的流體。它必須在生產(chǎn)和儲存中是穩(wěn)定的且有抗細菌、真菌污染的能力。載體可以是溶劑或分散介質，包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇)及適當?shù)幕旌衔锖椭参镉汀?br> 術語“可藥用的鹽”包括溶化物、水合物、酸加成的鹽和四價鹽。酸加成的鹽可由含堿性氮的諾卡沙星I，II或III化合物制得，可藥用的有機或無機酸包括(但不限于)鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硫酸甲烷、醋酸、枸櫞酸、丙二酸、丁二酸、反丁烯二酸、馬來酸、磺酸或酒石酸。四價鹽從堿性諾卡沙星I，II或III化合物和烷基或芳烷基鹵化物中獲得，優(yōu)選甲基或芐基溴。
人們已知的本發(fā)明諾卡沙星化合物可包括不同的立體異構體。
MREF分析方法的描述Nocardia sp.(ATCC202099)培養(yǎng)物中制得的粗提物，在高效普篩分析檢測中發(fā)現(xiàn)了諾卡沙星抗菌素化合物的生物活性。這種篩選以孵育在瓊脂生長培養(yǎng)基中的糞便腸球菌A28152的生長抑制為基礎。糞便腸球菌可以耐許多抗菌素如青霉素G、萬古霉素、環(huán)丙沙星、替考拉寧、四環(huán)素、鏈霉素、慶大霉素、紅霉素、氯林肯霉素和雷米封，但對氯霉素敏感，其次是亞胺培南。因此MREF的名字表示多藥耐藥性糞便腸球菌。
糞便腸球菌菌種A28152接種到Brain Heart Infusion Broth營養(yǎng)培養(yǎng)基中，于37℃攪拌生長至對數(shù)期。定期地取出0.2ml培養(yǎng)物并移至含96孔塑料平底盤中，在595nm下檢測光密度。當光密度在0.2-0.4時，經(jīng)1000×g離心10分鐘可得到細菌。細胞團混懸于Mueller-Hinton II生長培養(yǎng)基中，混懸液接種到含1％Difco的瓊脂的熔化Mueller-HintonII生長培養(yǎng)基中，溫度為48℃，得到一個1×107細胞/毫升的接種細胞密度。25ml的細胞混懸液傾入無菌的長方形盤中，一個特殊的與盤相配的塑料蓋子密合于盤子頂端其間培養(yǎng)基仍為熔化狀態(tài)。蓋子上有標準規(guī)格8×12排列的塑料釘。培養(yǎng)基在室溫下15分鐘凝膠，除去帶針的蓋子，小的凹形印跡留在曾與熔化培養(yǎng)基接觸過的膠化培養(yǎng)基上，這些印跡作為樣品的負載區(qū)。
待篩選檢測的樣品在100％的二甲亞砜(DMSO)中溶解濃度為300μM。每6μl體積的樣品分別加入盤上載樣區(qū)中。加樣完畢，培養(yǎng)板于37℃培養(yǎng)24小時。環(huán)繞樣品區(qū)，可看到一個透明的環(huán)狀區(qū)，這便是生長抑制環(huán)形區(qū)外，細菌不可遏制地生長，瓊脂培養(yǎng)基由于細菌生長而變得混濁。而同樣的條件下單純用DMSO不能產(chǎn)生任何可檢測到的生長抑制。氯霉素和DMSO作為陽性和陰性對照品孵育在每一盤中。
采用薄層色譜(TLC)生物圖象(biogram)確認Nocardia sp.(ATCC202099)生產(chǎn)培養(yǎng)物得到的活性物質，其材料包括用于瓊脂擴散分析的生物檢測皿(購自Nunc-Nalge International)。此皿為243×243×18mm，可提供530cm2的微生物培養(yǎng)區(qū)。把TLC盤放到生物檢測皿上，并將瓊脂覆蓋物緩慢傾入以覆蓋TLC盤和生物檢測皿底部。瓊脂覆蓋物包括用0.5％去纖維蛋白的羊血補充的200ml Mueller-Hinton II瓊脂基和濃度為1×106細胞/毫升的耐藥糞便腸球菌菌株A28152。冷卻后，TLC生物圖像于室溫下孵育約18小時。孵育后，由于這種腸球菌中α-溶血細胞活性的原因，血瓊脂變?yōu)榧t-棕色。如果化合物能抑制這種的生長，可見由于抑制了溶血而產(chǎn)生的非常明顯的紅色區(qū)。此方法考慮到了所需生物活性與適宜色譜餾分之間的相應關系，因此促進了活性成分及其分離物活性的確認。
這種用于MREF檢測的方法包括檢測兩種不同的對比(contrast)劑。第一種是2，3，5-三苯基-2H-四吡咯氯化物(終濃度0.003％)補充到200ml Todd Hewitt瓊脂基中。第二種方法是將0.5％的羊血補充到200ml Mueller-Hinton瓊脂基中。兩個方法均可顯示明顯的生長抑制區(qū)域，但是，用血瓊脂孵育時間越短，分辨率(resolution)越好。考察了細胞接種濃度范圍，但1×106細胞/毫升的結果最佳。
分離及結構特性采用多藥耐藥性糞便腸球菌(MREF)瓊脂擴散分析測定Nocardias p.發(fā)酵生成的諾卡沙星抗菌素的純化。用乙酸乙酯提取，再進行溶劑分配、Sephadex LH-20和/或硅膠層析。這些步驟產(chǎn)生一種能在MREF瓊脂擴散分析中顯示活性的諾卡沙星抗菌素混合物。最后，單一的諾卡沙星抗菌素的純化通過正相或反相高效液相制備層析完成，光譜數(shù)據(jù)顯示該組分屬于噻唑肽類抗菌素。在2D NMR陽離子電霧化(electrospray)HRMS研究和MS/MS數(shù)據(jù)基礎上排布了諾卡沙星I，II和III的結構(見下式)。
其中W是 和R是OH(諾卡沙星I)或R是H(諾卡沙星II)；和W是H和R是OH(諾卡沙星III)。
一般方法材料己烷，氯仿(ACS純)，和甲醇，乙腈(色譜純)購自FisherScientific公司。這些溶劑不是再純化和重蒸餾的。用于色譜層析實驗的水是指在室內(in-house)去離子水通過了一種微孔4 cartridge試劑級的水系統(tǒng)(10兆歐Milli-Q水)。Sephadex LH-20g購自Pharmacia LKB.Uppsala，Sweden。Dicalite(硅藻土)產(chǎn)自GrefcoMinerals，Torrance，CA。LiChroprep硅60，25-40μm購自EMSeparatiohs，NJ，E.Merek的美國合作伙伴，德國。
薄層色譜分析(TLC)已涂上薄層色譜的硅膠GHLF板(型號10×20cm，250微米)購自Analtech，Inc，Newark，DE。組分點樣使用2微升的微量管(帶一次性吸管)，板在已用氯仿-甲醇(9∶1 V/V)平衡的槽中展開。層析所得的組分在UV長波光下和/或用濃硫酸噴霧加熱后可顯示。
HPLC分析諾卡沙星抗菌素純化是用HPLC分析檢測的。APEX 5μODS柱，直徑4.6mm×長度15cm。(產(chǎn)于Jones Chromatography公司，Lakewood公司)。Hewlett Packard 1100型液相色譜儀分析，254nm下紫外檢測。使用乙腈和0.01M磷酸鉀緩沖液PH3.5的梯度系統(tǒng)，按照D.J.Hook等(I.Chromatogr.385，99(1987))的方法，洗脫液的泵流速為1.2ml/分鐘。
HPLC制備下列組件用于組建HPLC制備系統(tǒng)Beckman儀器公司。(SomersetNJ)，Beckman“黃金系統(tǒng)”126程序化溶劑系統(tǒng)裝置；Beckman 166程序化檢測裝置；Beckman“黃金系統(tǒng)”翻譯711 U軟件；IBMPS/255SX系統(tǒng)控制器；YMC公司(Wilmingtan，NC)HPLC制備柱(正相)PYA-硅膠5μm粒徑，孔徑120°，直徑20mm×長度150mm，配以Diol 25μ粒徑，孔徑120°，直徑10mm×長度10mm的drop-in保護柱)；流動相氯仿-甲醇梯度，流速為10ml/分鐘，290nmUV檢測。另一柱(反相)YMC公司，ODS-AQ5μ粒徑，孔徑120°，直徑20mm×長度150mm，配以ODS-A25μ粒徑，孔徑120°，直徑20mm×長度10mm的dropin保護柱)；流動相0.1M醋酸-丙酮梯度，流速為10ml/分鐘，360nmUV檢測。
分析設備用陽離子電噴霧型Finnigan SSQ 7000單四極質譜儀進行低分辨率質譜分析。MS/MS的測定，采用陽離子電噴霧型Finnigan SSQ 7000串聯(lián)四極質譜儀進行，氬碰撞氣或Finnigan LCQ離子撲獲質譜分析儀。高分辨率MS數(shù)據(jù)測定采用Finnigan MAT 900磁扇形質譜儀，陽離子電噴霧型，ppg reference。Hewlett-Packard 8452A二極管矩陣分光光度儀用于UV圖譜測定，Perkin Elmer 2000傅里葉變換光譜儀用于紅外測定。1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)用Bruker DRX-500分別與500.13和125.76MHz，使用Nalorac微探針。化學位移是相對于溶劑的數(shù)據(jù)(DMSO-d6，δH2.49；δC39.6)。圓二性色譜數(shù)據(jù)采用JascoJ-720分光偏振儀。
實施例下述實施例闡述了Nocathiacin抗菌素的制備及其生物學特性。那些合理的、本領域技術人員能預見的變化并不偏離本發(fā)明的范疇。
Nocathiacin I、II的發(fā)酵和純化發(fā)酵制備Nocathiacin I和II從冷凍的Nocardia sp.ATCC202099的營養(yǎng)培養(yǎng)基中取出4ml，接種到100ml下列種子培養(yǎng)液的500ml燒瓶中每升去離子水含20g淀粉、5g葡萄糖、3g N-C case、2g酵母提取物、5g魚肉提取物和3g碳酸鈣。培養(yǎng)物于轉速為250rpm的旋轉振動器中32℃下孵育3天。4ml生成的培養(yǎng)物，分別接種到200個含100ml下列生產(chǎn)培養(yǎng)基的500ml燒瓶中每L去離子水含20g葡萄糖、5g蛋白胨、10g紅星淀粉和5g Allophosite。生產(chǎn)培養(yǎng)物于轉速為250rpm的旋轉振動器中32℃下孵育5天，然后處理以回收Nocathiacin I和II。
實施例1從搖瓶中發(fā)酵粗提取物的制備用大約8L乙酸乙酯劇烈振蕩0.5小時提取Nocardia sp.ATCC-202099(20L.)發(fā)酵培養(yǎng)基(包括菌絲體的全培養(yǎng)基)。兩相混合物預先用3L.(1Kg)預涂層混合，然后大的Coors Buchner漏斗(內徑27cm，外徑28.5cm，深9cm)真空下過濾。分離灰黃色乙酸乙酯提取物并用旋轉蒸發(fā)儀在真空下蒸發(fā)干燥，得到大約7.2g殘余物A。
液-液分配殘余物A
用含10％水的甲醇溶解殘余物A(7.2g)。轉移溶液到一分離漏斗中，用同體積的己烷提取4次。除去己烷層。加入38ml水將甲醇相稀釋為含35％水的甲醇液，用同體積的氯仿提取3次。氯仿預先用含35％水的甲醇液飽和。己烷、氯仿和甲醇提取液用旋轉蒸發(fā)儀在真空下蒸發(fā)干燥。主要在氯仿中可檢測到Nocathiacin抗菌素(1.3g殘余物B)。
Sepadex LH-20色譜分離殘余物B殘余物B(1.3g)溶于10ml1∶1氯仿-甲醇加到3×100cm的Glenco柱中，此柱用100g_Sepadex LH-20的1∶1氯仿-甲醇懸液填充。棄去前75ml，以2-3ml/分鐘的流速每8-10ml一次收集餾分。餾分固化在硅膠TLC profiles(氯仿-甲醇9∶1，長波紫外和/或硫酸高鈰噴霧)。用此方法，可在第10-15個餾分檢測到黃色熒光性Nocathiacin抗菌素混合物。合并餾分并蒸發(fā)干燥(284mg殘余物C)。
硅膠液相色譜分離殘余物C將Nocathiacin抗菌素的富集餾分(殘余物C)預吸附到2g默克LiChroprep硅膠60上，然后加到填有這種吸附劑的2.5×115cm釉化過濾漏斗中。于house真空下先用1∶1己烷-氯仿(100ml)、再用氯仿并且逐漸增加氯仿比例(例如2.5，5，7.5，10，12.5，15，和25％甲醇/氯仿溶液，每份100ml)洗脫。餾分固化在硅膠TLC profiles(氯仿-甲醇9∶1，長波紫外和/或硫酸高鈰噴霧)。用此方法，可在5-12.5％甲醇/氯仿餾分中檢測到Nocathiacin I抗菌素?？稍?5-15％甲醇/氯仿餾分中檢測到Nocathiacin II抗菌素。合并餾分并蒸發(fā)干燥(殘余物D，Nocathiacin I，230mg)，(殘余物E，NocathiacinII，49mg)分離Nocathiacin I和II用Backman黃金系統(tǒng)的制備HPLC系統(tǒng)(YMC ODS-AQ C18柱)進一步純化殘余物D和E。典型的進樣量為25-50mg/50-100μl二甲亞砜溶液。先用氯仿再經(jīng)pre-programmed concave梯度至8∶2的氯仿∶甲醇洗脫30分鐘。流速為10ml/分鐘。紫外290nm檢測。用這種方法獲得NocathiacinI(保留時間17分鐘的峰，總收率56mg)和NocathiacinII(保留時間19.5分鐘的峰，總收率6.7mg)。
純化方案下表描述了Nocathiacin抗菌素的純化方案
Nocathiacins I和II的純化(實施例1，從搖瓶中發(fā)酵)
Nocathiacin I的物理-化學特性II III形態(tài)灰黃色無定形固體分子式 C61H60N14O18S5分子量 1436質譜HR-ESIMS [M+H]+m/z 1437.285ESI-MS/MS fragmentation ionsm/z1266，1248，1221，1204，1186，1154，788紅外光譜主要波長(cm-1)3392，3108，2932，1740，1721，1694，1670，1640，1533，1478，1420，1384，1320，1250，1207，1128，1091，1037，1014，751.
紫外光譜λmax(MeOH)222，290，364nm(logε4.89，4.52，4.17)圓二色譜CDλnm(Δε)(MeOH)212(+34.1)，239(-50.5)，267(+20.8)，307(-8.7)，364(+5.5)HPLC保留時間 25.6分鐘，(C18；0.01M的pH3.5磷酸鉀緩沖液(Rt) -乙腈梯度洗脫(J Chromatogr.385，99，(1987))1H-NMR化學位移(相對于溶劑DMSO-d6，信號為δ2.49)δ10.05(1H，s)，9.07(1H，s)，8.65(1H，s)，8.57(1H，d，J＝8.0Hz)，8.51(1H，s)，8.50(1H，s)，8.24(1H，s)，
8.07(1H，s br)，7.89(1H，d，J＝11.2Hz)，7.86(2H，s)，7.70(1H，d，J＝8.4Hz)，7.61(1H，s br)，7.34(2H，m)，7.16(1H，d，J＝6.9Hz)，6.40(1H，s)，5.98(1H，d，J＝12.0Hz)，5.77(1H，s)，5.73(1H，dd，J＝10.9，4.4Hz)，5.70(1H，d，J＝8.7Hz)，5.22(1H，m)，5.02(1H，d，J＝11.4Hz)，4.94(1H，d，J＝3.7Hz)，4.75(1H，d，J＝10.2Hz)，4.51(1H，d，J＝11.0Hz)，4.29(1H，d，J＝9.6Hz)，4.19(1H，m)，4.13(1H，d，J＝10.1Hz)，4.00(1H，d，J＝95Hz)，3.88(3H，s)，3.78(1H，d br，J＝5.9Hz)，2.52(6H，s)，2.49(1H，m)，2.11(1H，s br)，1.99(3H，s)，1.95(1H，m)，1.81(1H，d，J＝13.9Hz)，1.43(3H，s)，1.21(1H，m)，1.16(3H，s，br)，0.59(3H，d，J＝6.3Hz).
13C-NMR化學位移(相對于溶劑DMSO-d6，信號為δ39.6)δ171.8，168.1，167.7，167.4，167.0，165.2，164.0，163.1，161.5，161.1，160.5，160.3，159.1，158.6，154.6，151.9，149.7，149.6，148.8，145.8，142.5，135.3，135.0，134.5，129.9，128.1，127.0，126.3，125.5，124.0，123.1，119.8，119.4，112.7，111.2，109.7，103.7，95.1，79.3，70.6，68.4，67.5，66.1，65.1，64.5，63.3，56.1，55.5，50.2，49.8，44.4，40.0，30.5，18.0，13.1.
Nocathiacin II的物理-化學特性形態(tài) 灰黃色無定形固體分子式 C61H60N14O17S5
分子量 1420質譜HR-ESIMS[M+H]+m/z 1421.297ESI-MS/MS fragmentation ionsm/z 1250，1206，1188，1170，1156，1138，788紅外光譜主要波長(cm-1)3387，1725，1656，1534，1478，1423，1318，1249，1192，1087，1014，886，793，751.
紫外光譜λmax(MeOH)220，295，364nm(logε5.01，4.67，4.36)圓二色譜CDλnm(Δε)(MeOH)211(+41.5)，235(-56.1)，258(+21.0)，277(+13.4)，307(-10.0)，364(+5.6)HPLC保留時間 21.1分鐘，(C18；0.01M的pH3.5磷酸鉀緩沖液-(Rt) 乙腈梯度洗脫(J Chromatogr.385，99，(1987))1H-NMR化學位移(相對于溶劑DMSO-d6，信號為δ2.49)；δ9.10(1H，s)，8.59(1H，d，J＝8.5Hz)，8.51(1H，s)，8.45(1H，s)，8.22(1H，s)，8.15(1H，s)，8.05(1H，sbr)，7.69(1H，sbr)，7.66(1H，s)，7.51(1H，d，J＝8.3Hz)，7.47(1H，s)，7.30(1H，s)，7.25(1H，dd，J＝8.0，7.2Hz)，7.12(1H，d，J＝7.1Hz)，7.02(1H，d，J＝8.4Hz)，6.49(1H，s)，6.03(1H，d，J＝12.1Hz)，5.78(1H，m)，5.70(1H，d，J＝8.6Hz)，5.66(1H，s)，5.30(1H，d，J＝7.7Hz)，5.00(1H，d，J＝13.0Hz)，4.98(1H，d，
J＝10.5Hz)，4.94(1H，d，J＝4.8Hz)，4.83(1H，d，J＝11.2Hz)，4.72(1H，m)，4.37(1H，d，J＝9.6Hz)，4.23(1H，m)，4.11(1H，d，J＝9.9Hz)，4.03(1H，d，J＝7.7Hz)，3.89(3H，s)，3.75(1H，m)，2.49(6H，s)，2.14(1H，m)，2.01(3H，s)，1.94(1H，m)，1.79(1H，d，J＝14.2Hz)，1.40(3H，s)，1.23(1H，m)，1.04(3H，s，br)，0.54(3H，d，J＝6.5Hz)。
13C-NMR 化學位移(相對于溶劑DMSO-d6，信號為δ39.6)δ172.0，168.2，167.1，167.0，165.5，165.3，163.2，162.9，161.6，161.2，160.6，160.1，158.7，156.3，149.9，149.0，148.2，145.9，138.8，136.9，134.3，128.8，127.9，127.2，126.6，125.6，125.2，124.7，124.1，123.9，122.8，117.9，116.3，115.6，109.9，101.9，95.1.，79.0，70.7，68.4，67.6，66.3，66.0，64.0，62.5，56.1，55.1，51.4，50.6，44.4，40.5，30.6，18.1，18.0，13.0.
Nocathiacin抗菌素的生物學評價實施例2Nocathiacin I和II的抗菌活性為證明其抗菌活性，采用常規(guī)培養(yǎng)基稀釋法(用營養(yǎng)培養(yǎng)基(Difcos)連續(xù)稀釋)測定了本發(fā)明Nocathiacin抗菌素對多種細菌的最小抑菌濃度(MIC)。結果見表1，這表明Nocathiacin抗菌素可用于治療細菌感染。
表1菌名 菌株號 MIC(ug/ml) MIC(ug/ml)Nocathiacin I Nocathiacin II肺炎鏈球菌 A95850.001 0.015肺炎鏈球菌/青霉素A27881 0.001 0.015intermediate肺炎鏈球菌/耐青霉素 A28272 0.001 0.015釀膿鏈球菌 A96040.001 0.125糞便腸球菌 A20688 0.030.5糞便腸球菌 A27519 0.030.5糞便腸球菌+50％小牛血清 A20688 0.250.5糞便腸球菌 A24885 0.0150.5糞便腸球菌/耐硫鏈絲菌SC15829 0.025 0.5肽(10ug/ml)鳥腸球菌 A27456 0.0150.5金黃色葡萄球菌 A95370.001 0.06金黃色葡萄球菌/β-青霉 A15090 0.007 0.5素酶陽性金黃色葡萄球菌+50％小牛 A15090 0.015 0.5血清金黃色葡萄球菌 A24407 0.007 0.5/QC/ATCC#29213金黃色葡萄球菌/耐異甲A27218 0.003 0.5氧苯青霉素金黃色葡萄球菌+50％小牛 A27218 0.007 0.5血清金黃色葡萄球菌/耐同甲A272230.003 0.125氧苯青霉素金黃色葡萄球菌+50％小牛 A272230.001 0.125血清細球菌luteus A9852 0.003 0.125枯草桿菌 A9506A0.001 0.125表皮葡萄球菌 A245480.003 0.125溶血葡萄球菌 A272980.03 0.25大腸桿菌 A15119＞128 ＞128大腸桿菌 A22292＞128 ＞128大腸桿菌/AcrA∷Kan A28901＞128 ＞128腸炎沙門菌 A9531 ＞128 ＞128粘膜炎莫拉氏菌/β-青霉 A223440.06 0.125素酶陽性粘膜炎莫拉氏菌/β-青霉 A254090.06 0.125素酶陽性流感嗜血桿菌/β-青霉素 A20191＞128酶陰性流感嗜血桿菌/β-青霉素 A20183＞128酶陰性流感嗜血桿菌/β-青霉素 A21515＞128酶陽性沙門菌/WTA27207＞128 ＞128沙門菌/REA27208＞128 ＞128實施例3Nocathiacin I在全身性金黃色葡萄球菌感染模型中的體內抗菌活性用雌性ICR小鼠全身性感染模型來評價Nocathiacin I的體內抗菌活性。動物用6.5×106CFU的金黃色葡萄球菌感染，該菌混懸于7％的粘蛋白中事先過夜培養(yǎng)。Nocathiacin I溶解于由10％二甲亞砜、5％吐溫80和85％水組成的待試制劑中。以100mg/kg的總劑量(于感染后1和4小時，2×50mg/kg)皮下給予該溶液。9只小鼠在實驗期間全部存活并且無中毒癥狀。測得Nocathiacin I的PD50小于6.25mg/kg。
發(fā)酵制備Nocathiacin III可在任何益于培養(yǎng)菌生長的溫度如16℃和40℃進行Nocathiacin III的生產(chǎn)，但優(yōu)選在22-26℃進行。液體培養(yǎng)基有必要孵育一段時間以保證Nocathiacin III的生產(chǎn)充分進行，用HPLC通常監(jiān)測1-5天，生產(chǎn)中旋轉振動器轉速為50-300rpm，優(yōu)選150-200rpm。
產(chǎn)物Nocathiacin III可從培養(yǎng)基中回收，方法與其他已知生物活性物質的回收相同。經(jīng)采用常規(guī)溶劑如乙酸乙酯提取培養(yǎng)基，用常規(guī)樹脂(如陰或陽離子交換樹脂、非離子吸附樹脂)和常規(guī)吸附劑(如活性炭、硅膠、纖維素和氧化鋁)處理，結晶、重結晶，和/或反相制備HPLC純化，得到Nocathiacin III。
下述實施例闡述了發(fā)酵法制備Nocathiacin III。那些合理的、本領域技術人員能預見的變化并不偏離本發(fā)明的范疇。
發(fā)酵實施例4從冷凍的Nocardia sp.ATCC202099的營養(yǎng)培養(yǎng)基中取出4ml，接種到100ml下列種子培養(yǎng)基的500ml燒瓶中每ml去離子水含20g日本可溶性淀粉、5g葡萄糖、3g N-C case、2g酵母提取物、5g魚肉提取物和3g碳酸鈣。培養(yǎng)物于轉速為250rpm的旋轉振動器中28℃下孵育3天。4ml生成的培養(yǎng)物，分別接種到10個含100ml下列生產(chǎn)培養(yǎng)基的500ml燒瓶中每ml去離子水含10g HY酵母412、20g葡萄糖和10g Nutrisoy。生產(chǎn)培養(yǎng)物于轉速為250rpm的旋轉振動器中28℃下孵育2天，然后回收Nocathiacin III。
實施例5從冷凍的Nocardia sp.ATCC202099的營養(yǎng)培養(yǎng)基中取出4ml，接種到100ml下列種子液的500ml燒瓶中每ml去離子水含20g日本可溶性淀粉、5g葡萄糖、3g N-C case、2g酵母提取物、5g魚肉提取物和3g碳酸鈣。培養(yǎng)物于轉速為250rpm的旋轉振動器中28℃下孵育3天。取4ml生成的培養(yǎng)物，分別接種到5個含100ml新鮮種子培養(yǎng)基的500ml燒瓶中，培養(yǎng)物于轉速為250rpm的旋轉振動器中28℃下孵育3天。將5個燒瓶中的培養(yǎng)基混合，然后取4ml合并培養(yǎng)物分別接種到100個含100ml下列生產(chǎn)培養(yǎng)基的500ml燒瓶中每ml去離子水含10g HY酵母412、20g葡萄糖和10g Nutrisoy。生產(chǎn)培養(yǎng)物于轉速為180rpm的旋轉振動器中24℃下孵育4天，然后回收Nocathiacin III。
實施例6NocathiacinIII的分離粗提取物的制備用大約1L乙酸乙酯劇烈振蕩提取Nocardia sp.ATCC202099發(fā)酵培養(yǎng)基(包括菌絲體)。離心分離兩相混合物。水相再用乙酸乙酯提取(0.5L)。合并灰黃色乙酸乙酯提取物并用旋轉蒸發(fā)儀在真空下蒸發(fā)干燥，得到大約198mg殘余物A。
液-液分配殘余物A用10ml 10％水/甲醇溶解殘余物A(198mg)。轉移溶液到一分離漏斗中，用同體積的己烷提取3次。除去己烷層。加入3.8ml水將甲醇相稀釋為含35％水的甲醇液，用同體積的氯仿提取3次。氯仿預先用含35％水的甲醇液飽和。己烷、氯仿和甲醇提取液用旋轉蒸發(fā)儀在真空下蒸發(fā)干燥。主要在氯仿中可檢測到Nocathiacin抗菌素，(106mg殘余物B)。
分離Nocathiacin III用Backman黃金系統(tǒng)的制備HPLC系統(tǒng)(YMC ODS-AQ C18柱)進一步純化殘余物B。典型的進樣量為50mg/250μl二甲亞砜溶液。用0.1M乙酸銨-乙腈(55∶45 v/v)線性梯度洗脫至乙腈洗脫。流速為10ml/分鐘。紫外360hm檢測。用這種方法獲得NocathiacinIII(保留時間9分鐘的峰，總收率12mg)。
Nocathiacin III的物理-化學特性形態(tài)淡黃色無定形固體分子式 C52H43N13O16S5分子量 1265質譜HR-ESIMS[M+H]+m/z 1266.162ESI-MS/MS fragmentation ions；m/z 1248，1222，1204，1186，788紅外光譜主要波長(cm-1)3382，1720，1667，1643sh，1534，1510，1477，1420，1250，1207，1126，1015，750.
紫外光譜λmax(MeOH)nm 224，290，364(logε4.85，4.52，4.11).
圓二色譜CDλnm(Δε)(MeOH)212(+38.7)，238(-47.6)，266(+21.2)，305(-11.4)，362(+5.1).
HPLC保留時間 19.3分鐘，(C18；0.01M的pH3.5磷酸鉀緩沖液-(Rt) 乙腈梯度洗脫(J Chromatogr.385，99，(1987))1H-NMR 化學位移(相對于溶劑DMSO-d6，信號為δ2.49)δ10.05(1H，s)，8.93(1H，s)，8.59(1H，s)，8.51(1H，s)，8.46(1H，s)，8.37(1H，d，J＝8.9Hz)，8.20(1H，s)，8.05(1H，s)，7.91(1H，d，J＝10.9 Hz)，7.77(1H，s br)，7.74(1H，s br)，7.69(1H，d，J＝8.4Hz)，7.60(1H，s)，7.38(1H，d，J＝7.5Hz)，7.34(1H，dd，J＝8.2，7.2Hz)，7.18(1H，d，J＝7.0Hz)，6.37(1H，s)，6.07(1H，d，J＝7.1Hz)，5.92(1H，d，J＝12.2Hz)，5.89(1H，d，J＝10.3Hz)，5.74(1H，dd，)＝10.8，4.8H2)，5.72(1H，s)，5.24(1H，m)，5.02(1H，d，J＝12.5Hz)，4.71(1H，d，J＝10.4Hz)，4.54(1H， d，J＝11.2Hz)，4.50(1H，m)，4.20(1H，m)，4.13(1H，d，J＝10.4Hz)，4.02(1H，dd，J＝9.4，7.2Hz)，3.87(3H，s)，3.73(1H，d，J＝9.6Hz)，1.97(3H，s)，1.15(3H，s br).
13C-NMR化學位移(相對于溶劑DMSO-d6，信號為δ39.6)δ174.5，172.2，168.1，167.8，166.6，165.3，164.4，163.0，161.2，160.4，159.3，158.8，154.7，152.9，149.6，148.8，146.0，141.6，135.7，135.0，134.5，12.9.9，128.6，127.1，126.4，126.3，125.6，125.3，124.2，123.1，119.7，119.5，112.5，111.3，109.8，103.7，81.4，67.9，67.3，65.3，64.5，63.5，56.2，55.7，49.7，49.5，18.0，13.2.
實施例7Nocathiacin的抗菌活性為證明其抗菌活性，采用常規(guī)培養(yǎng)基稀釋法(用營養(yǎng)培養(yǎng)基(Difcos)連續(xù)稀釋)測定了Nocathiacin III抗菌素對多種細菌的最小抑菌濃度(MIC)。結果見表2，這表明Nocathiacin III抗菌素可用于治療細菌感染。
表2菌名 菌株號 MIC(ug/ml)NocathiacinIII肺炎鏈球菌 A9585≤0.002肺炎鏈球菌/青霉素intermediateA27881 ≤0.002肺炎鏈球菌/耐青霉素 A28272 ≤0.002糞便腸球菌 A20688 0.03糞便腸球菌 A27519 0.03糞便腸球菌+50％小牛血清 A20688 0.25糞便腸球菌 A24885 0.03鳥腸球菌 A27456 0.03金黃色葡萄球菌/β-青霉素酶陽 A15090 0.007性金黃色葡萄球菌+50％小牛血清 A15090 0.03金黃色葡萄球菌/QC/ATCC#29213 A24407 0.007金黃色葡萄球菌/耐同甲氧苯青霉A27223 0.007素金黃色葡萄球菌+50％小牛血清 A27223 0.007表皮葡萄球菌 A24548 0.007葡萄球菌haemolyticus A27298 0.007粘膜炎莫拉氏菌/β-青霉素酶陽 A22344 0.06性粘膜炎莫拉氏菌/β-青霉素酶陽 A25409 0.06性流感嗜血桿菌/β-青霉素酶陰性 A20191 ＞64流感嗜血桿菌/β青霉素酶陰性 A20183 ＞64流感嗜血桿菌/β-青霉素酶陽性 A21515 ＞6權利要求
1.保藏號為ATCC-202099的微生物諾卡氏菌種的一種生物純的培養(yǎng)物。
全文摘要
本發(fā)明公開了新穎的微生物ATCC－202099的生物純培養(yǎng)物。
文檔編號A61P31/04GK1515674SQ0314879
公開日2004年7月28日 申請日期1999年7月13日 優(yōu)先權日1998年7月16日
發(fā)明者J·E·萊特, H·A·阿克斯, D·R·古斯塔夫森, D·M·布朗, L·圖爾納, K·布朗, 李文瑩, K·S·林, J E 萊特, 古斯塔夫森, 布朗, 林, 阿克斯 申請人:布里斯托爾-邁爾斯斯奎布公司