專利名稱：一種治療中風(fēng)病的中藥組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥組合物，特別涉及用于治療中風(fēng)病的中藥組合物，同時涉及該組合物的制備方法和質(zhì)量控制方法。
缺血性中風(fēng)的臨床治療，中醫(yī)目前主要是應(yīng)用平肝熄風(fēng)、化痰通絡(luò)、行氣活血、開竅醒神等方藥。由于給藥途徑等方面的限制，在急性期難以發(fā)揮治療優(yōu)勢。即使有一些注射劑如脈絡(luò)寧、清開靈等，但由于其成分復(fù)雜，作用機制尚未明確，臨床應(yīng)用的目的性較差；血栓通(血塞通)注射液等活血化瘀作用較好，但對于導(dǎo)致腦絡(luò)瘀阻不通的因素影響甚微，臨床療效并未獲得顯著提高。西醫(yī)根據(jù)近年來腦缺血損傷機理研究結(jié)果創(chuàng)制的藥物與治療方案，仍有許多難以解決的問題。例如，目前認為能夠阻止局部缺血損傷過程的藥物NMDA受體拮抗劑(MK-801)、鈣離子通道拮抗劑(尼莫地平)等，能夠減少缺血性病變的范圍，但是不加區(qū)別地阻斷EAA介導(dǎo)的神經(jīng)傳遞、影響一些正常生理功能，包括修復(fù)所必須的神經(jīng)可塑性，可能為預(yù)后康復(fù)帶來了不利影響。急性期的缺血性腦水腫是中風(fēng)病一個重要病理過程。由于細胞毒性和血管源性兩類因素的混合，前者針對膜離子泵衰竭，治療應(yīng)采取逆轉(zhuǎn)能量耗竭即提供氧合血以恢復(fù)泵功能，此時，高滲劑效果有限；缺血數(shù)小時后血腦屏障崩潰產(chǎn)生的血管源性水腫，按理高滲劑應(yīng)該奏效，然而CT掃描觀察到高滲劑對腦梗塞性腫脹效果并不顯著，甘露醇有并發(fā)水腫反跳的副作用；試用地塞米松療效尚難估價，類固醇激素即使大量應(yīng)用似乎也無裨益，甚至可能對缺血神經(jīng)元有害；甘油在腦血管病幸存者中有一定效果，但導(dǎo)致糖尿病控制困難。
因此，臨床需要一種阻抑缺血級聯(lián)反應(yīng)損傷，改善腦缺血的微灌流狀態(tài)，從而有效保護神經(jīng)細胞，藥效物質(zhì)和作用機理相對清楚的現(xiàn)代中藥復(fù)方注射制劑。
按藥劑學(xué)方法，可以將上述本發(fā)明藥物組合物制備成多種臨床藥物劑型，包括口服制劑或非腸道給藥的劑型。所說的口服制劑選自于片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、混懸劑、滴丸、口服液體制劑當中的一種；所說的非腸道給藥劑型選自于注射劑、氣霧劑、栓劑或皮下給藥劑型當中的一種。
本發(fā)明藥物還可加入常規(guī)的藥物賦形劑，如溶劑、崩解劑、矯味劑、防腐劑、著色劑等。
B方案制成注射液的制備方法為取處方量的梔子，粉碎成粗粉，用7-9倍量的65-80％乙醇滲漉，收集滲漉液，回收乙醇，濃縮至55-70℃相對密度為1.00-1.20的清膏，加3-5倍量水稀釋，攪勻，0-4℃冷藏45-50小時，濾過，濾液減壓濃縮為55-70℃相對密度為1.00-1.20的清膏，上活性炭柱，先用蒸餾水洗脫，至洗脫液無色，再用9-11倍量65-80％乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收乙醇并濃縮，干燥，得梔子半成品；取梔子半成品用適量注射用水溶解，濾過；另取處方量的三七總皂苷，加適量注射用水溶解，濾過，將三七藥液與梔子藥液混勻，調(diào)節(jié)pH值至5.5-7.5，0-4℃冷藏20-30小時，0.45μm濾膜濾過，濾液加注射用水至全量，用0.22μm濾膜濾過，濾液灌裝成10ml安瓿注射液，110-120℃熱壓滅菌20-40分鐘，即得。
本組合物制成注射劑的質(zhì)量控制方法包括鑒別和/或含量測定和/或指紋圖譜。
鑒別方法包括下列方法中的一種和/或兩種a.取本品5ml，水浴蒸干，殘渣加乙醇溶解并定量轉(zhuǎn)溶于容量瓶5ml，另取梔子苷對照品，加乙醇制成每1ml含4mg的溶液，作為對照品溶液；照薄層色譜法(中國藥典2000年版附錄VIB)試驗；吸取上述兩種溶液各2μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以8-11∶6-9∶1-3∶0.3-0.6醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5％香草醛硫酸溶液，加熱；供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點；b.取本品10ml，加以水飽和的正丁醇振搖提取2-4次，每次10ml，合并正丁醇提取液，用正丁醇飽和的水液洗滌2-4次，每次100ml；取正丁醇層減壓回收至干，殘渣加甲醇0.5ml使溶解，作為供試品溶液；另取人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1及三七皂苷R1對照品，加甲醇制成每ml各含6mg的混合液，作為對照品溶液；照薄層色譜法(中國藥典2000年版一部附錄IIB)試驗，吸取上述兩種溶液各2ul，分別點于同一硅膠G薄層板上，在環(huán)境溫度15-25℃以下，以11-15∶6-9∶1-3氯仿-甲醇-水10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1→10硫酸乙醇液，于105-115℃加熱至斑點顯色清晰；供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點；含量測定方法包括下列方法中的一種和/或兩種a.梔子苷，照高效液相色譜法(《中國藥典》2000年版一部附錄VI D)測定；色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；13-17∶80-90乙腈-水為流動相；檢測波長為238nm理論塔板數(shù)按梔子苷峰計算應(yīng)不低于1500；對照品溶液的制備，精密稱取梔子苷對照品適量，加甲醇適量使溶解，制成每1ml含0.14-0.15mg的溶液，即得；供試品溶液的制備，精密吸取本品1ml，水浴蒸干，殘渣加無水乙醇溶解，乙醇液轉(zhuǎn)移至另一坩堝，水浴蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至100ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得；測定法，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀，測定，即得；本品含梔子苷(C17H24O10)每ml不得少于4.6-4.9mg；b.三七皂苷，照高效液相色譜法(《中國藥典》2000年版一部附錄VI D)測定；色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水二元梯度為流動相(見表1)；檢測波長為203nm；理論塔板數(shù)以人參皂苷Rg1峰計算應(yīng)不低于2500；對照品溶液制備，精密稱取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1適量加甲醇溶解，制成每1ml含三七皂苷R11.5mg、人參皂苷Rg12.8mg、人參皂苷Rb14.1mg的混合對照品溶液；供試品溶液制備，精密吸取樣品5ml，用水飽和正丁醇振搖提取三次，每次10ml；正丁醇層合并，用10ml正丁醇飽和水洗滌一次，棄水層，正丁醇層減壓回收，至干，殘渣用甲醇溶解至5ml，搖勻，用微孔濾膜0.45μm濾過，即得；測定法，精密吸取對照品溶液3μl，7μl、供試品溶液10μl注入高效液相色譜儀，用外標兩點法計算，即得；本品每ml含三七皂苷R1不得少于0.18-1.25mg；人參皂苷Rg1不得少于0.75-0.85mg；人參皂苷Rb1不得少于1.8-2.5mg；表1乙腈-水二元梯度洗脫表時間(min) 流速(ml/min) A(水) B(乙腈)0 1.0 8020201.0 6040本發(fā)明注射液質(zhì)量控制方法還可采用指紋圖譜的方法，該方法包括以下方法中的一種和或兩種
a.供試品溶液的制備精密吸取注射液5ml，用水飽和的正丁醇振搖提取兩次，第一次10ml；第二次5ml，合并正丁醇提取液；用正丁醇飽和的水10ml反洗一次，棄去水層，正丁醇提取液減壓回收至干，殘渣用甲醇溶解并定容至5ml容量瓶中，搖勻，0.45um濾膜濾過，即得；對照品溶液的制備取梔子苷對照品，用甲醇制成0.5mg/ml的溶液作為對照品溶液；測定方法檢測波長238nm，乙腈-水梯度洗脫，見表2；理論塔板數(shù)計算，應(yīng)不低30000；設(shè)定供試品溶液進樣量為101，記錄60分鐘的色譜圖，即得；以梔子苷的色譜峰(S峰)的保留時間和峰的面積為1計算相對保留時間和峰面積比值；指紋圖譜及技術(shù)參數(shù)；記錄時間為60分鐘；共有指紋峰的標定(相對保留時間)根據(jù)10批次供試品的檢測結(jié)果標定共有指紋峰如下1(0.404)2(0.462)3(0.510)4(0.589)5(0.618)6(0.666)7(0.722)8(0.798)S(1.000)9(1.085)10(1.110)11(1.197)12(1.238)13(1.277)；共有指紋峰面積的比值1∶S＝1∶(0.060-0.113)；部分峰形描述分離不好時，峰4呈峰5的肩峰；非共有峰面積供試品圖譜與對照指紋圖譜比較；非共有峰總面積不得大于峰面積的5％；儀器試劑 高效液相色譜儀Waters2695泵；Waters 2996紫外檢測器；Millcnnium32色譜工作站；Diamonsil C18柱(5μm，4.6mm×150mm)；乙腈為色譜純(美國J.T.Baker)；娃哈哈純凈水；甲醇為色譜純(北京昌化精細化工廠)；表2流動相梯度洗脫表時間(min)流速(ml/min)水％ 乙腈％00.8 95580.8 92821 0.8 881235 0.8 881240 0.8 703045 0.8 406050 0.8 0 10060 0.8 0 100
b.供試品溶液的制備精密吸取注射液10ml，用水飽和的正丁醇20ml分二次振搖提取，合并正丁醇提取液；用正丁醇飽和的水300ml分三次反洗，棄去水層，正丁醇層減壓回收至干，殘渣用甲醇溶解并定容至2ml量瓶中，搖勻，0.45um濾膜濾過，即得；照物的制備取人參皂苷Rg1對照品(購自中國藥品生物制品檢定所)，用甲醇制成2mg/ml的溶液作為對照品溶液；測定方法檢測波長210nm，靈敏度0.1AUFS乙腈-水梯度洗脫，(見表3)；理論塔板數(shù)按人參皂苷Rg1計算，應(yīng)不低30000；精密吸取供試品溶液25μl，注入高效液相色譜儀，記錄70分鐘的色譜圖，即得；以人參皂苷Rg1的色譜峰(S峰)的保留時間和峰的面積為1計算相對保留時間和峰面積比值；指紋圖譜及技術(shù)參數(shù)；記錄時間為70分鐘；共有指紋峰的標定(相對保留時間)根據(jù)10批次供試品的檢測結(jié)果標定共有指紋峰如下1(0.877)S(1.000)2(1.027)3(1.555)4(1.592)5(1.652)6(1.675)7(1.708)8(1.744)9(1.799)10(2.005)11(2.042)12(2.074)13(2.111)14(2.150)15(2.212)16(2.235)17(2.364)18(2.391)19(2.420)20(2.440)21(2.771)；共有指紋峰面積的比值S∶3∶8∶21＝1∶(0.222-0.412)∶(0.405-0.735)∶(1.428-2.380)；非共有峰面積供試品圖譜與對照指紋圖譜比較；非共有峰總面積不得大于總面積的5％；儀器試劑Waters 2695 Waters 2996紫外檢測器Millcnnium32色譜工作站SymmetryshildTMRP18(5μm，4.6mm×250mm)；Fisher乙腈(美國色譜純)Fisher甲醇(美國色譜純)娃哈哈純凈水其它為分析純表3 流動相梯度洗脫表時間(min) 流速(ml/min) A-水 B-乙腈0 1.0 83 1720 1.0 76 2440 1.0 60 4050 1.0 50 5055 1.0 0 10060 1.0 0 10070 1.0 0 100
本發(fā)明組合物制劑(通絡(luò)救腦注射液)臨床主治急性缺血性腦中風(fēng)的注射劑，具有涼血解毒、化瘀通絡(luò)之功效，通過阻抑腦中風(fēng)的缺血級聯(lián)反應(yīng)，改善腦微灌流，達到抗神經(jīng)元損害的治療目的；與通絡(luò)救腦注射液解毒功效有關(guān)的藥效學(xué)試驗研究，采用三氯化鐵致大鼠大腦中動脈血栓形成的腦缺血損傷模型，研究了通絡(luò)救腦注射液對此模型的大鼠神經(jīng)癥狀、腦含水量、梗塞腦組織形態(tài)學(xué)、腦組織SOD和MDA含量、腦梗塞灶Glu和NMDA表達、延遲整流鉀電流(IN)的作用機理；實驗結(jié)果顯示通絡(luò)救腦注射液能明顯降低MCAT大鼠腦組織MDA的含量，升高SOD含量，降低梗塞腦組織Glu和NMDA的表達，增大延遲整流鉀電流(IN)，降低大鼠手術(shù)側(cè)腦含水量，改善神經(jīng)癥狀；與通絡(luò)救腦注射液通絡(luò)功效有關(guān)的藥效學(xué)試驗研究，采用三氯化鐵致大鼠大腦中動脈血栓形成的腦缺血損傷模型，研究了通絡(luò)救腦注射液對此模型大鼠腦血流、麻醉犬腦血流、血瘀大鼠血液流變學(xué)、雞胚尿囊膜血管生成的作用；結(jié)果顯示通絡(luò)救腦注射液能促進新血管的生成、明顯降低血瘀癥大鼠全血粘度和血漿粘度，使紅細胞變形性增強，聚集性下降，改善麻醉犬、MCAT大鼠腦血流，從而實現(xiàn)其通絡(luò)功能；通絡(luò)救腦注射液的藥效作用與血栓通比較，在對MCAT大鼠腦組織含水量的測定實驗中，通絡(luò)救腦注射液小劑量組(與模型組比較P＜0.01)明顯由于血栓通組(與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)意義)；通絡(luò)救腦注射液中劑量組SOD明顯升高，與血栓通組比較P＜0.05)；通絡(luò)救腦注射液小劑量組紅細胞變性顯著增加(與模型組比較P＜0.05，P＜0.01)，血栓通對紅細胞變形無明顯作用；通絡(luò)救腦注射液大劑量組血管增生顯著(與模型組比較P＜0.05，P＜0.01)，而血栓通作用較弱；血栓通能增大延遲整流鉀電流(IN)，而通絡(luò)救腦注射液作用不明顯，目前研究證實，延遲整流鉀電流(IN)的增強可促進缺血導(dǎo)致的神經(jīng)細胞凋亡；其它藥效實驗中通絡(luò)救腦注射液的作用均優(yōu)于血栓通；通絡(luò)救腦注射液明顯具有促進麻醉犬腦血流的作用；總之，通絡(luò)救腦注射液與血栓通比較，有降低用藥劑量，從而達到減毒增效的目的；實驗結(jié)果摘要如下1.通絡(luò)救腦注射液對MCAT大鼠神經(jīng)癥狀的影響實驗采用了三氯化鐵致大腦中動脈血栓形成的大鼠腦缺血模型，造模后MCAT大鼠神經(jīng)癥狀評定的結(jié)果顯示通絡(luò)救腦注射液83.2、41.6、20.8mg/kg組(分別相當臨床人用量的20、10、5倍)的大鼠在術(shù)后12h，24h，48h其神經(jīng)癥狀均有不同程度的改善(P＜0.01，P＜0.05)；2.通絡(luò)救腦注射液對MCAT大鼠腦組織含水量的影響造模后48h，通絡(luò)救腦注射液83.2、41.6、20.8mg/kg組的大鼠手術(shù)側(cè)腦含水量明顯低于模型組，與模型組相比較差異具有顯著性(P＜0.01，p＜0.05)；3.通絡(luò)救腦注射液對MCAT大鼠腦組織形態(tài)學(xué)的影響腦組織病理形態(tài)學(xué)HE、Nissl染色顯示，模型組大鼠腦皮質(zhì)缺血灶細胞數(shù)量明顯減少，胞體萎縮，變性，著色淺；通絡(luò)救腦注射液三個劑量組大鼠腦缺血灶細胞數(shù)量較模型組明顯增多，細胞萎縮變性較模型組明顯減輕；圖像分析表明通絡(luò)救腦注射液組陽性細胞面密度與模型組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，提示通絡(luò)救腦注射液具有減輕腦缺血所至的神經(jīng)細胞損害的作用；4.通絡(luò)救腦注射液對MCAT大鼠腦組織SOD及MDA的影響通絡(luò)救腦注射液83.2、41.6mg/kg組可明顯降低MCAT大鼠腦組織MDA的含量，升高SOD含量(P＜0.01)；提示通絡(luò)救腦注射液具有抗自由基損傷，保護腦組織的作用；5.通絡(luò)救腦注射液對MCAT大鼠梗塞腦組織Glu和NMDA表達的影響采用三氯化鐵致大腦中動脈血栓形成的大鼠腦缺血模型和免疫組織化學(xué)方法，結(jié)果顯示通絡(luò)救腦注射液能明顯降低Glu、NMDA在梗塞灶的表達；6.通絡(luò)救腦注射液對延遲整流鉀電流的影響應(yīng)用膜片鉗電生理技術(shù)，檢測了通絡(luò)救腦注射液對心肌細胞延遲整流鉀電流的影響，結(jié)果表明，通絡(luò)救腦注射液對延遲整流鉀電流(IN)的影響不明顯；7.通絡(luò)救腦注射液對MCAT大鼠腦血流量的影響MCAT大鼠腦組織血流量明顯減少，通絡(luò)救腦注射液83.2、41.6mg/kg組造模48h的腦組織血流量均明顯高于模型組(P＜0.01)，說明本藥對缺血后腦組織血流有明顯改善作用；通絡(luò)救腦注射液對急性應(yīng)激造成的大鼠血瘀癥有明顯的改善作用，小劑量的作用最為明顯；8.通絡(luò)救腦注射液對麻醉犬腦血流量的影響實驗在33只健康雜種犬進行，試驗表明通絡(luò)救腦注射液可以顯著提高麻醉犬腦血流量(P＜0.05或P＜0.01)；其作用于注射藥物后10分鐘開始起效，藥效維持到給藥后50分鐘；通絡(luò)救腦注射液83.2、41.6mg/kg組與陽性藥血栓通比較沒有顯著性差異；通絡(luò)救腦注射液低劑量組與陽性藥血栓通比較，在注射藥物后45分鐘和50分鐘有顯著性差異(P＜0.05)；9.通絡(luò)救腦注射液對急性血瘀大鼠血液流變學(xué)的影響通絡(luò)救腦注射液中劑量(41.6mg/kg)與小劑量(20.8mg/kg)可明顯降低血瘀癥大鼠全血粘度(與模型組比較P＜0.01，P＜0.001，P＜0.0001)，血漿粘度呈下降趨勢(但未見統(tǒng)計學(xué)差異)，小劑量組明顯降低紅細胞壓積(與模型組比較P＜0.0001)；小劑量組可使紅細胞變形性增強，聚集性下降(P＜0.01，P＜0.001)；10.通絡(luò)救腦注射液對雞胚尿囊膜血管生成的影響通絡(luò)救腦注射液83.2、41.6、20.8mg/kg組均具有促進雞胚尿囊膜血管生成的作用；以下對上述部分實驗進行詳述實驗例一 通絡(luò)救腦注射液對MCAT大鼠神經(jīng)癥狀的影響實驗材料1.藥品與試劑受試藥通絡(luò)救腦注射液由內(nèi)蒙古康源藥業(yè)有限公司提供，顏色外觀呈淡黃色，含量10.39mg/ml，具有涼血解毒，化瘀通絡(luò)之功能，主治急性缺血性腦中風(fēng)；批號2001042322；臨床擬用量4.16mg/kg，靜脈注射；陽性對照藥血栓通注射液由內(nèi)蒙古康源藥業(yè)有限公司提供，顏色白色，含量50mg/ml，具有活血祛瘀之功能，主治急性缺血性腦中風(fēng)；批號內(nèi)衛(wèi)藥準字(1996)第001945號；臨床擬用量10mg/kg，靜脈注射1～2次/日，1次5ml；試劑與藥品FeCl3·6H2O(A.R.)，北京化工廠產(chǎn)品，用1mol/L鹽酸配制；2.動物Wistar大鼠，雌雄兼用，體重180～200g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心繁育場提供，合格證號醫(yī)動字第01-3008號；3.儀器XTT解剖顯微鏡，北京電光科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；SHZ-22型恒溫水浴振蕩器，江蘇太倉醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；AEG-220型電子分析天平，日本島津儀器公司產(chǎn)品；方法與結(jié)果1.分組及給藥將60只大鼠隨機分為六組，即假手術(shù)組、MCAT模型組、通絡(luò)救腦注射液83.2mg/kg組、通絡(luò)救腦注射液41.6mg/kg組、通絡(luò)救腦注射液20.8mg/kg組(分別相當于臨床人用量的20、10、5倍)、血栓通50mg/Kg組(相當人用量的5倍)，每組10只；造模后尾靜脈給藥，一日劑量分兩次給予，共給藥五次；2.造模方法大鼠腹腔注射10％水合氯醛溶液(350mg/kg)麻醉；按Tamura[4]等的方法，稍加改進；大鼠右側(cè)臥位固定，在眼外眥和外耳道連線中點作一弧形切口，長約1.5cm，夾斷顳肌并切除，暴露顳骨，用牙科鉆在顴骨與顳鱗骨接合處靠近口側(cè)1mm處作一直徑2.5mm骨窗，清理殘渣，暴露大腦中動脈(位于嗅束及大腦下靜脈之間)；置一小片中空塑料薄膜保護血管周圍組織；將吸有50％氯化鐵溶液10μl的小片定量濾紙敷在此段大腦中動脈上(6)，30min后取下濾紙，用生理鹽水沖洗局部組織，逐層縫合，回籠飼養(yǎng)；假手術(shù)組，除不滴加氯化鐵溶液外，其余手術(shù)步驟同模型組；3.MCAT大鼠神經(jīng)癥狀的評定在術(shù)后不同時間(12h，24h，48h)，按Bederson等(7)的方法并加以改進，對動物進行行為評分；1.提鼠尾離開地面約一尺，觀察前肢屈曲情況；如雙前肢對稱伸向地面，記為0分；如手術(shù)對側(cè)前肢出現(xiàn)肩屈曲、肘屈曲、肩內(nèi)旋或既有腕肘的屈曲又有內(nèi)旋者，記為1、2、3和4分；2.將動物置于平滑地面上，分別推雙肩向?qū)?cè)移動，檢查阻力；如雙側(cè)阻力對等且有力者記為0分；如向手術(shù)對側(cè)推動時阻力下降者，根據(jù)下降程度不同分為輕、中、重3度，分別記為1、2、3分；3.將動物兩前肢置一金屬網(wǎng)上，觀察兩前肢的肌張力；雙側(cè)肌張力對等且有力者為0分；同樣根據(jù)手術(shù)對側(cè)前肢肌張力下降程度不同記為1、2、3分；4.提鼠尾離開地面約一尺，動物有不停地向手術(shù)對側(cè)旋轉(zhuǎn)者，記為1分；根據(jù)以上標準評分，滿分為11分，分數(shù)越高，動物的行為障礙越嚴重；對行為檢測打分值進行組間比較，t檢驗；結(jié)果見表1；表1通絡(luò)救腦注射液對MCAT大鼠神經(jīng)癥狀的影響(X±SD)精神癥狀評分組別 劑量mg/kg N12h 24h48h假手術(shù)組 - 10 0 0 0MCAT模型組- 10 5.5±0.55 4.67±0.52 4±0.63通絡(luò)救腦組83.2 10 4.33±0.82**3.83±0.41** 3.17±0.75*41.6 10 4.4±0.55** 3.83±0.75** 3.33±0.82*20.8 10 4.67±0.55 4±0.63* 3.33±1.03血栓通組 5010 3.67±0.52**4±0.63* 3.33±0.52*注各組與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；結(jié)果顯示，除假手術(shù)組未見行為異常改變，MCAT模型組大鼠在術(shù)后12h，24h，48h均出現(xiàn)偏癱樣癥狀，主要表現(xiàn)為手術(shù)對側(cè)前肢內(nèi)收，肩內(nèi)旋，前肢肌張力降低，肩抗力下降；通絡(luò)救腦注射液20.8mg/kg組在術(shù)后48h神經(jīng)癥狀改善不明顯外，通絡(luò)救腦注射液各劑量組與血栓通組的大鼠在術(shù)后12h，24h，48h其神經(jīng)癥狀均有不同程度的改善(P＜0.01，P＜0.05)；實驗例二 通絡(luò)救腦注射液對MCAT大鼠腦組織含水量的影響實驗材料1.藥品與試劑受試藥、陽性對照藥同試驗20.1；2.動物Wistar大鼠，雌雄兼用，體重180～200g，71只，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心繁育場提供，合格證號醫(yī)動字第01-3008號；3.儀器XTT解剖顯微鏡，北京電光科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；AEG-220型電子分析天平，日本島津儀器公司產(chǎn)品；Df-206型鼓風(fēng)干燥箱，北京西城醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；方法與結(jié)果分組、給藥及手術(shù)同試驗20.1；術(shù)后48小時斷頭取腦，切取大腦中間部分(前后各去除3毫米)，左右分開，用濾紙吸干表面水分，分別稱量左右腦片濕重；再置于烘箱中，105℃烘烤48小時至恒重，精確稱量干重，計算含水量[8]，與同組對照側(cè)比較，和組間比較，進行t檢驗；結(jié)果見表2； 表2通絡(luò)救腦注射液對MCAT大鼠腦組織含水量的影響(X±SD)劑量 含水量(％)組別 N(mg/kg) 左腦含水量 右腦含水量假手術(shù)組 - 1077.30±0.79 77.09±0.57△△MCAT模型組- 1077.04±0.48** 78.90±0.96通絡(luò)救腦組83.2 1076.55±1.33** 78.09±1.0341.6 1076.77±0.78** 77.96±0.9120.8 1077.51±2.16** 75.11±2.03△△血栓通組 50 1077.04±0.48** 78.90±0.96注與模型組相比△△P＜0.01；與同組對側(cè)腦組織含水量相比**P＜0.01；結(jié)果顯示，術(shù)后48h，假手術(shù)組未見左右兩側(cè)大腦含水量異常改變，模型組大鼠手術(shù)側(cè)腦組織含水量明顯增加，通絡(luò)救腦注射液各劑量組、血栓通組的大鼠手術(shù)側(cè)腦含水量明顯少于模型組，與模型組相比具有顯著差異(P＜0.01)，但各給藥組手術(shù)側(cè)腦組織含水量與左腦相比卻明顯增加(P＜0.01)；實驗例3 通絡(luò)救腦注射液對MCAT大鼠腦組織SOD及MDA的影響實驗材料1、藥品與試劑受試藥血栓通注射液、通絡(luò)救腦注射液同實驗20.1；MDA、SOD試劑合購自南京建成生物工程研究所；批號20011031；
2、動物Wistar大鼠，雄性，體重190～210g，60只，為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心繁育場提供，合格證號醫(yī)動字第01-3008號；3、儀器721型分光光度計，上海第三分析儀器廠產(chǎn)品；方法與結(jié)果分組、給藥、造模方法同實驗20.1；造模、給藥24小時斷頭取腦，去小腦、嗅球及腦干，加9倍生理鹽水制備成10％腦勻漿，備用；1、SOD的測定按SOD試劑合說明測定SOD活力，結(jié)果見表3；2、MDA的測定按MDA試劑合說明測定MDA含量，結(jié)果見表3；表3通絡(luò)救腦注射液對MCAT大鼠腦組織SOD及MDA的影響(X±SD)組別 劑量mg/kg N MDAmmol/g腦組織 SODnu/mg腦組織假手術(shù)組 - 10 0.54±0.11**144±20.20**模型組 - 10 0.87±0.21 92.17±21.5483.2 10 0.56±0.1** 127.67±20.55**通絡(luò)救腦組 41.6 10 0.59±0.12**138.33±27.27**20.8 10 0.79±0.21 98.5±29.04血栓通組 5010 0.57±0.07**114.5±21.86**注各組與模型組相比，**P＜0.01；結(jié)果顯示，大鼠經(jīng)凝閉大腦中動脈后，其超氧化歧化酶(SOD)、MDA均有明顯變化，模型組大鼠MDA含量明顯高于假手術(shù)組，SOD明顯低于假手術(shù)組，通絡(luò)救腦注射液可明顯降低MDA含量，升高SOD活力(P＜0.01)；提示本藥具有抗自由基損傷保護腦組織的作用；實驗例四 通絡(luò)救腦注射液對腦缺血大鼠腦皮質(zhì)梗塞灶Glu和NMD表達的影響實驗材料1、藥品與試劑受試藥通絡(luò)救腦注射液由內(nèi)蒙古康源藥業(yè)有限公司提供，主治急性缺血性腦中風(fēng)；陽性對照藥血栓通注射液由內(nèi)蒙古康源藥業(yè)有限公司提供，主治急性缺血性腦中風(fēng)，靜脈注射，2次/日，1次5ml；批號2000091112；試劑與藥品FeCl3·6H2O(A.R.)，北京化工廠產(chǎn)品，用1mol/L鹽酸配制；免疫組織化學(xué)試劑兔抗Glu、NMDA(1∶200，Santa cruz公司)，生物素化羊抗兔IgG和ABC復(fù)合物(1∶200，Histostatn-sp試劑盒，ZYMED公司)；2、動物Wistar大鼠，雌雄兼用，體重180～200g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心繁育場提供，合格證號醫(yī)動字第01-3008號；3、儀器POLYVAR萬能顯微鏡，美國產(chǎn)品；C8真彩病理圖像分析儀，北京航空航天大學(xué)產(chǎn)品；試驗方法1.分組及給藥將60只大鼠隨機分為六組，即假手術(shù)組、MCAT模型組、通絡(luò)救腦注射液83.2mg/kg組、通絡(luò)救腦注射液41.6mg/kg組、通絡(luò)救腦注射液20.8mg/kg組(分別相當于臨床人用量的20、10、5倍)、血栓通50mg/kg組(相當人用量的5倍)，每組10只；造模后尾靜脈給藥，一日劑量分兩次給予，共給藥五次；2.造模方法大鼠腹腔注射10％水合氯醛溶液(350mg/kg)麻醉；按Tamura[3]等的方法，稍加改進；大鼠右側(cè)臥位固定，在眼外眥和外耳道連線中點作一弧形切口，長約1.5cm，夾斷顳肌并切除，暴露顳骨，用牙科鉆在顴骨與顳鱗骨接合處靠近口側(cè)1mm處作一直徑2.5mm骨窗，清理殘渣，暴露大腦中動脈(位于嗅束及大腦下靜脈之間)；置一小片中空塑料薄膜保護血管周圍組織；將吸有50％氯化鐵溶液10μl的小片定量濾紙敷在此段大腦中動脈上(4)，30min后取下濾紙，用生理鹽水沖洗局部組織，逐層縫合，回籠飼養(yǎng)；假手術(shù)組，除不滴加氯化鐵溶液外，其余手術(shù)步驟同模型組；3.動物處理末次給藥后一小時(即術(shù)后48小時)，斷頭取腦，分別以10％中性甲醛固定，石蠟包埋，切片(取視交叉前后腦片)，作免疫組織化學(xué)染色，顯微觀測組織形態(tài)變化，并做圖像分析；4.免疫組化染色方法采用ABC法，步驟如下①.切片入1％甲醇H2O2掖，室溫30min②.蛋白酶K消化，37℃30min③.正常羊血清，室溫30min④.兔抗Glu，NMDA(1∶200，Santa cruz公司)，4℃過夜⑤.生物素化羊抗兔IgG和ABC復(fù)合物(1∶200，Histostatn-sp試劑盒，ZYMED公司)，37℃2h⑥.0.05％DAB-0.1％H2O2液顯色；在①、②、③、⑤、⑥步驟之前都用0.01MPBS洗3次，每次洗5min；陰性對照，省去一抗或用正常羊血清代替一抗；5.圖像分析及統(tǒng)計學(xué)處理對Glu、NMDA免疫組化結(jié)果，用CMIAS8真彩病理圖像分析系統(tǒng)(中國航空航天大學(xué)圖像分析中心)進行分析，統(tǒng)計每個場的面密度；組間資料統(tǒng)計用t檢驗；實驗結(jié)果1.通絡(luò)救腦注射液對腦缺血大鼠腦皮質(zhì)梗塞灶Glu表達的影響正常大鼠腦皮質(zhì)Glu表達在細胞的胞質(zhì)內(nèi)，核區(qū)呈陰性，細胞形態(tài)多呈錐體形，且?guī)в型黄?，細胞層次清楚；模型組大鼠腦皮質(zhì)梗塞灶內(nèi)Glu細胞數(shù)量比正常大鼠明顯增多，Glu表達也明顯增強，細胞形態(tài)呈萎縮變性的錐體形；陽性藥組、大劑量組、中劑量組大鼠腦內(nèi)Glu表達比模型組明顯減弱，其中中劑量組Glu表達最弱，且細胞數(shù)量最少；小劑量組Glu的表達同模型組；圖像分析統(tǒng)計結(jié)果見表4；
表4通絡(luò)救腦注射液對MCAT大鼠大腦皮層梗塞灶Glu表達的影響(X±SD)劑量組別 N陽性細胞面密度(mg/kg)假手術(shù)組 - 90.09±0.02**MCAT模型組 - 90.13±0.02通絡(luò)救腦注射液組 83.2 90.09±0.02**41.6 90.07±0.02**20.8 90.06±0.02**血栓通組 5090.10±0.10**注與模型組相比**P＜0.012.通絡(luò)救腦注射液對腦缺血大鼠腦皮質(zhì)梗塞灶NMDA表達的影響正常大鼠腦皮質(zhì)NMDA表達在細胞的胞質(zhì)內(nèi)，核區(qū)呈陰性，細胞形態(tài)多呈錐體形和圓形，細胞層次清楚；模型大鼠腦皮質(zhì)梗塞灶內(nèi)NMDA的表達明顯比正常大鼠強，細胞形態(tài)呈腫脹和萎縮變形形態(tài)；陽性藥組和大劑量組、中劑量組、小劑量組大鼠NMDA表達比模型組減弱，其中大劑量組、中劑量組NMDA的表達最弱，大劑量組NMDA細胞呈錐體形，且萎縮變性；中劑量組NMDA陽性細胞多呈小圓形；統(tǒng)計結(jié)果見表5；表5 通絡(luò)救腦注射液對MCAT大鼠大腦皮層NMDA表達的影響(X±SD)組別 劑量(mg/kg)N 陽性細胞面密度假手術(shù)組 - 9 0.08±0.02*MCAT模型 - 9 0.11±0.02通絡(luò)救腦注射液組 83.2 9 0.09±0.02**41.6 9 0.07±0.02**20.8 9 0.05±0.01**血栓通組 50 9 0.07±0.01*注與模型組相比*P＜0.05，料P＜0.01結(jié)論通絡(luò)救腦注射液通過降低Glu、NMDA在梗塞灶的表達，逆轉(zhuǎn)細胞的腫脹、變性，從而達到治療目的；實驗例五 通絡(luò)救腦注射液對麻醉犬腦血流量的影響實驗材料
1.動物健康雜種犬33只，雌雄兼用，體重12～15kg，由北京市海淀區(qū)通利實驗動物養(yǎng)殖場提供，動物合格證編號第024-069號；2.藥物通絡(luò)救腦注射液內(nèi)蒙古康源藥業(yè)有限公司(內(nèi)蒙古甘旗卡藥廠)出品；批號2001042322；規(guī)格20ml/只；263mg人參皂甙/20ml；空白對照藥生理鹽水；血栓通注射液(陽性藥)內(nèi)蒙古康源藥業(yè)有限公司(內(nèi)蒙古甘旗卡藥廠)出品；批號2000091112；規(guī)格250mg/5ml藥物原液置于4℃冷藏保存；3.藥物配制在每次實驗開始時，根據(jù)動物體重進行藥物配制血栓通注射液0.5ml原液/kg；(25mg/kg)通絡(luò)救腦注射液低劑量組0.394ml原液/kg(5.18mg人參皂甙/kg)；通絡(luò)救腦注射液中劑量組0.788ml原液/kg(10.4mg人參皂甙/kg)；通絡(luò)救腦注射液高劑量組1.577ml原液/kg(20.7mg人參皂甙/kg)；吸取相應(yīng)毫升數(shù)的原液，與適量的生理鹽水混合成總體積為100ml的靜脈滴注用液，水浴加熱至37℃后進行靜脈滴注；4.實驗儀器和器械TA-4000多道生理記錄儀(美國GouldInc公司產(chǎn)品)，MF-27電磁流量計(日本光電公司產(chǎn)品)，動物手術(shù)器械一套；5.實驗步驟實驗動物手術(shù)動物稱重后腹腔注射5％戊巴比妥鈉30mg/kg，麻醉后背位固定，分離左側(cè)股靜脈備用；頸部切口，分離右頸總動脈，插管(肝素溶液管內(nèi)抗凝)直接記錄頸動脈血壓；分離左頸總動脈，分離結(jié)扎頸外動脈，將頸總動脈嵌入電磁流量計探頭(φ＝2mm)，垂直于頸總動脈固定，備測頸內(nèi)動脈血流量用；為防止探頭干燥，滴加生理鹽水保持濕潤；安放心電圖電極，記錄標準肢體II導(dǎo)聯(lián)心電圖；將呼吸探頭置于鼻孔處記錄呼吸頻率和呼吸深度；6.實驗動物給藥手術(shù)后穩(wěn)定30分鐘，記錄各項指標，作為給藥前對照；實驗開始時，按照前述方法進行藥液的配制；犬經(jīng)左側(cè)股靜脈勻速滴注相應(yīng)的研究藥物，記錄滴注開始時間，控制藥物在20分鐘內(nèi)勻速滴完；7.觀察指標滴注開始時立即進行測定(0分鐘)，每隔5分鐘記錄一次，每次記錄15～30秒，記錄時走紙速度為10mm/s，記錄間期走紙速度為50mm/h，多道生理記錄儀監(jiān)視器同步進行監(jiān)測；觀察記錄藥物作用至滴注開始后60分鐘結(jié)束；同步記錄以下生理指標1)頸內(nèi)動脈血流量2)動脈血壓實驗結(jié)果TA-4000多道生理記錄儀將實驗數(shù)據(jù)記錄在專用的記錄紙上，通過人工計數(shù)，將記錄的圖形轉(zhuǎn)換為數(shù)字，以表格的形式附在每次實驗記錄后面；實驗結(jié)果使用SAS統(tǒng)計軟件，就各組間的各項指標進行t檢驗以確定是否有顯著性差異；1.通絡(luò)救腦注射液對麻醉犬腦血流量的影響參見表6；表6通絡(luò)救腦注射液對麻醉犬腦血流量的影響(ml/min)給藥后時 通絡(luò)救腦 通絡(luò)救腦 通絡(luò)救腦血栓通(n＝6) 生理鹽水(n＝7)間(分)高劑量(n＝7) 中劑量(n＝7) 低劑量(n＝6)0 110.7±2.2109.1±2.6106.6±6.1110.8±3.4 111.9±2.05 117.5±6.6116.7±5.0112.0±7.3116.7±5.2 111.8±2.910 124.2±8.8**121.7±7.3**119.4±9.4*120.8±8.6*110.3±5.915 126.7±10.8**128.3±16.7**122.7±11.3**122.2±7.1**110.3±4.520 128.3±13.7**131.4±16.0**125.4±12.7**123.8±8.6**111.3±6.625 130.8±16.6**130.7±12.1**127.6±11.7**124.0±7.9**110.9±6.630 115.3±53.5 131.4±8.9**126.9±10.9**125.5±7.4**110.6±5.635 132.2±14.5**130.4±8.1**122.9±15.5 123.8±6.0**111.3±8.340 129.2±10.2**126.9±6.9**126.1±8.5**120.2±2.6 113.3±8.745 130.0±8.4**126.1±8.7**126.7±6.9**115.8±4.9△113.0±7.950 130.2±7.8**126.1±12.8**125.6±6.8**115.3±11.9△110.9±7.955 122.5±13.6 119.3±13.7 122.3±10.2 112.8±7.5**110.3±6.160 119.2±17.4 118.4±14.6 106.4±39.7 108.7±11.9 110.9±7.2
*與對照組比較P＜0.05；**與對照組比較P＜0.01；△與血栓通比較P＜0.05；實驗表明通絡(luò)救腦注射液可以顯著提高麻醉犬腦血流量(P＜0.05或P＜0.01)；其作用于注射藥物后10分鐘開始起效，藥效維持到給藥后50分鐘；通絡(luò)救腦注射液高劑量組和中劑量組與陽性藥血栓通比較沒有顯著性差異；通絡(luò)救腦注射液低劑量組與陽性藥血栓通比較，在注射藥物后45分鐘和50分鐘有顯著性差異(P＜0.05)；2.通絡(luò)救腦注射液對麻醉犬血壓的影響通絡(luò)救腦注射液對麻醉犬收縮壓的影響參見表7；表7通絡(luò)救腦注射液對麻醉犬收縮壓的影響(mmHg)給藥后時間通絡(luò)救腦 通絡(luò)救腦 通絡(luò)救腦 生理鹽水血栓通(n＝6)(分) 高劑量(n＝7) 中劑量(n＝7) 低劑量(n＝6) (n＝7)0 148.3±12.5 149.6±12.5 140.6±16.8 146.8±19.6 137.2±17.05 146.3±13.6 152.1±11.8 138.0±11.7 147.9±18.9 138.0±18.410 149.8±16.7 153.0±13.3 139.0±11.7 149.3±18.1 137.4±17.315 148.7±15.2 154.7±13.5 140.0±10.8 149.3±18.8 136.9±16.620 147.7±16.5 152.7±12.6 140.6±10.7 149.3±19.5 137.1±15.925 148.2±16.0 151.0±13.1 139.1±10.9 149.5±18.3 136.7±18.330 144.3±11.2 151.9±12.4 139.1±10.4 148.8±18.6 137.9±.16.635 144.3±11.5 150.4±13.1 139.9±9.5150.3±19.3 138.1±17.640 147.2±12.6 147.6±12.6 140.0±13.7 148.2±19.1 138.4±16.645 146.7±13.8 147.4±13.0 141.7±10.7 144.6±22.3 138.7±16.350 144.0±10.4 146.7±14.7 141.4±12.2 147.3±19.9 138.8±17.055 146.7±16.9 145.4±16.3 140.6±12.9 143.5±17.2 137.8±17.060 148.2±12.1 146.8±14.9 141.1±13.2 145.4±18.6 138.2±17.1實驗表明通絡(luò)救腦注射液對麻醉犬收縮壓的影響沒有顯著性差異(P＞0.05)
通絡(luò)救腦注射液對麻醉犬舒張壓的影響參見表8；表8通絡(luò)救腦注射液對麻醉犬舒張壓的影響(mmHg)給藥后時間 通絡(luò)救腦 通絡(luò)救腦 通絡(luò)救腦 生理鹽水血栓通(n＝6)(分) 高劑量(n＝7) 中劑量(n＝7) 低劑量(n＝6) (n＝7)0116.3±10.2 121.3±10.5 112.9±14.2119.7±13.2 109.6±13.15115.0±8.6119.7±11.6 111.2±10.4120.0±12.9 110.8±14.710 119.5±14.4 120.0±10.9 112.1±10.6121.3±13.5 110.3±13.515 116.0±7.9119.4±13.9 112.4±10.0120.5±12.7 110.3±13.520 116.8±10.6 118.1±12.3 112.8±10.6119.7±13.1 109.9±13.125 117.7±9.8117.0±12.8 112.0±10.7120.8±12.4 110.7±14.130 116.0±8.0117.6±13.0 112.1±10.6119.7±13.0 110.3±14.035 115.7±8.0118.4±12.6 113.0±9.4 122.8±11.9 110.4±14.740 116.7±8.4115.6±12.8 112.1±12.1121.8±12.8 110.9±13.245 117.2±9.2117.0±12.2 113.7±10.5117.8±16.7 111.1±12.250 114.8±8.5116.0±14.9 113.0±12.1118.7±17.0 111.1±13.555 118.7±13.3 115.5±16.0 112.6±13.5117.7±15.5 110.7±13.760 117.3±10.1 117.0±13.9 112.9±13.4116.3±15.8 110.7±13.7實驗表明通絡(luò)救腦注射液高、中、低劑量組對麻醉犬舒張壓的影響沒有顯著性差異(P＞0.05)實驗例六通絡(luò)救腦注射液對雞胚尿囊膜血管生成的影響實驗材料與方法1.藥物針劑中藥血栓通、通絡(luò)救腦由牛欣教授提供，濃度為50mg三七總皂甙/ml溶液；將此藥液分為大(50mg三七總皂甙/ml)、中(25mg三七總皂甙/ml)、小(12.5mg三七總皂甙/ml)三個濃度；2.孵育新鮮白皮種蛋購自昌平種禽公司，挑選無破損裂紋、大小近似有氣室的種蛋，用75％的乙醇將其表面擦拭消毒后，大頭朝上，傾斜放入已消毒的37.8℃孵育箱中，孵育箱中放置水盤以保持箱內(nèi)一定的濕度；為防止胚胎粘連，促進羊膜運動，每天轉(zhuǎn)蛋4-5次[3]；3.開窗參照付生法等方法[4]并加以改進；種蛋孵育至第5天時取出，在照蛋器上檢查血管發(fā)育情況；挑選血管清晰、發(fā)育良好的種蛋，在胚頭的右下方兩條大血管之間畫定一1cm×1cm的窗口位置，并在氣室處也畫一標記；移入超凈臺內(nèi)，將畫好位置處種蛋外殼用75％的乙醇擦拭消毒后，先用牙科鉆在種蛋氣室處鉆一小孔以用于減壓，再用牙科鉆小心磨切畫定窗口位置的外殼，用眼科鑷輕輕揭除開窗處卵殼，露出白色殼膜，滴少許生理鹽水后再小心揭除卵殼膜暴露尿囊膜；4.加藥根據(jù)張樹成等研究結(jié)果[5]，我們采用明膠海綿作為加藥載體；將無菌明膠海綿(購自中日友好醫(yī)院)剪成5mm×2mm×2mm的小塊，加入35μl用0.22μm無菌濾器濾過的藥液后，置于窗口中央位置的尿囊膜上，用無菌透明膠帶封住窗口及氣室處的小孔后，放回孵育箱中繼續(xù)孵育48小時；并設(shè)置對照組(無菌生理鹽水，35μl/一個雞胚)、血栓通陽性組，通絡(luò)救腦注射液83.2mg/kg、41.6mg/kg、20.8mg/kg組；每組均做20個雞胚；5.取膜揭開雞胚小窗上的透明膠帶，在種蛋下部鉆一小孔，待流出1ml左右的蛋清后，向窗內(nèi)滴加固定液(甲醇∶丙酮＝1∶1)，在室溫下固定15-20min；之后，將蛋殼向兩側(cè)掰開，內(nèi)容物全部倒入一培養(yǎng)皿中，用眼科剪及眼科鑷小心地將尿囊膜取下，放入盛有清水的平皿內(nèi)展開，并敷貼在濾紙上，陰干保存；6.計數(shù)在解剖鏡下觀察尿囊膜上血管的生長情況并計數(shù)；計數(shù)范圍以給藥為中心在直徑1.5cm的范圍內(nèi)，根據(jù)血管的直徑分為大、中、小血管并進行計數(shù)；7.計學(xué)處理我們將計數(shù)結(jié)果同生理鹽水組用t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)處理；實驗結(jié)果數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果如表9所示表9通絡(luò)救腦注射液對雞胚尿囊膜血管形成的影響劑量尿囊膜血管數(shù)/胚(x±s)組別mg/kg大血管中血管 小血管對照組2.33±1.5311.00±1.0043.67±6.35通絡(luò)救腦組 83.2 2.00±0.828.86±2.27 35.43±6.6041.6 1.71±0.767.86±2.12*36.14±2.34**20.8 2.29±1.119.43±2.30 36.71±3.86*血栓通組 50 2.01±0.556.80±3.11*30.60±6.77**注n＝20， 與對照組比較*P＜0.05 **P＜0.01結(jié)果表明通絡(luò)救腦注射液各劑量組，特別是大劑量組與血栓通比較，具有促進血管新生的作用；下述實施例均能實現(xiàn)上述實驗例的效果。實施例1注射劑梔子 175g三七總皂苷5.5g取處方量的梔子，粉碎成粗粉，照流浸膏劑項下的滲漉法(《中國藥典》2000年版一部附錄IO)，用8倍量的70％乙醇滲漉，收集滲漉液，回收乙醇，濃縮至相對密度為1.10(60℃測定)的清膏，加4倍量水稀釋，攪勻，0-4℃冷藏48小時，濾過，濾液減壓濃縮為相對密度為1.10(60℃測定)的清膏，上活性炭柱，先用蒸餾水洗脫，至洗脫液無色，再用10倍量70％乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收乙醇并濃縮，干燥，得梔子半成品；取梔子半成品用適量注射用水溶解，濾過；另取處方量的三七總皂苷，加適量注射用水溶解，濾過，將三七藥液與梔子藥液混勻，調(diào)節(jié)pH值至6.0-7.0，0-4℃冷藏24小時，0.45μm濾膜濾過，濾液加注射用水至全量，用0.22μm濾膜濾過，濾液灌裝成10ml安瓿注射液，110℃熱壓滅菌30分鐘，即得。功能與主治涼血解毒、化瘀通絡(luò)。主治缺血性中風(fēng)病。用于中風(fēng)病半身不遂，偏身麻木，眩暈頭痛，舌強言蹇或不語，口舌歪斜，神志昏蒙；甚者突然仆倒，神志昏憒，鼻鼾談名痰鳴，舌質(zhì)暗紅，脈弦滑等風(fēng)火上擾、瘀阻脈絡(luò)之證。
用法與用量一日一次，一次154mg，一個療程兩周。
規(guī)格10ml/支，154mg(以梔子苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷R1含量之和計)。實施例2注射劑梔子190g三七總皂苷7g取處方量的梔子，粉碎成粗粉，用7倍量的75％乙醇滲漉，收集滲漉液，回收乙醇，濃縮至65℃相對密度為1.10的清膏，加5倍量水稀釋，攪勻，0-4℃冷藏49小時，濾過，濾液減壓濃縮為60℃相對密度為1.10的清膏，上活性炭柱，先用蒸餾水洗脫，至洗脫液無色，再用10倍量70％乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收乙醇并濃縮，干燥，得梔子半成品；取梔子半成品用適量注射用水溶解，濾過；另取處方量的三七總皂苷，加適量注射用水溶解，濾過，將三七藥液與梔子藥液混勻，調(diào)節(jié)pH值至6.0-7.0，0-4℃冷藏24小時，0.45μm濾膜濾過，濾液加注射用水至全量，用0.22μm濾膜濾過，濾液灌裝成10ml安瓿注射液，115℃熱壓滅菌30分鐘，即得注射劑。用法與用量一日一次，一次154mg，一個療程兩周。規(guī)格10ml/支，154mg(以梔子苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷R1含量之和計)。實施例3片劑梔子175g三七90g。
取處方量的梔子、三七，粉碎成粗粉，用7倍量的75％乙醇滲漉，收集滲漉液，回收乙醇，濃縮至65℃相對密度為1.10的清膏，加5倍量水稀釋，攪勻，0-4℃冷藏49小時，濾過，濾液減壓濃縮為60℃相對密度為1.10的清膏，經(jīng)常規(guī)制粒，制成顆粒100克，加入賦形劑，壓片(制粒壓片機一次完成)。每片重0.5克。實施例4膠囊劑梔子苷70g 三七總皂苷60g經(jīng)常規(guī)制成膠囊劑。實施例5本發(fā)明組合物注射劑的質(zhì)量控制方法鑒別方法a.取本品5ml，水浴蒸干，殘渣加乙醇溶解并定量轉(zhuǎn)溶于容量瓶5ml，另取梔子苷對照品，加乙醇制成每1ml含4mg的溶液，作為對照品溶液；照薄層色譜法(中國藥典2000年版附錄VIB)試驗；吸取上述兩種溶液各2μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以10∶7∶2∶0.5醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5％香草醛硫酸溶液，加熱；供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點；b.取本品10ml，加以水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次10ml，合并正丁醇提取液，用正丁醇飽和的水液洗滌3次，每次100ml；取正丁醇層減壓回收至干，殘渣加甲醇0.5ml使溶解，作為供試品溶液；另取人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1及三七皂苷R1對照品，加甲醇制成每ml各含6mg的混合液，作為對照品溶液；照薄層色譜法(中國藥典2000年版一部附錄IIB)試驗，吸取上述兩種溶液各2ul，分別點于同一硅膠G薄層板上，在環(huán)境溫度20℃以下，以13∶7∶2氯仿-甲醇-水10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1→10硫酸乙醇液，于110℃加熱至斑點顯色清晰；供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點；含量測定方法a.梔子苷，照高效液相色譜法(《中國藥典》2000年版一部附錄VI D)測定；色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；15∶85乙腈-水為流動相；檢測波長為238nm；理論塔板數(shù)按梔子苷峰計算應(yīng)不低于1500；對照品溶液的制備精密稱取梔子苷對照品適量，加甲醇適量使溶解，制成每1ml含0.144mg的溶液，即得；供試品溶液的制備，精密吸取本品1ml，水浴蒸干，殘渣加無水乙醇溶解，乙醇液轉(zhuǎn)移至另一坩堝，水浴蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至100ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得；測定法，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀，測定，即得；本品含梔子苷(C17H24O10)每ml不得少于4.7mg；b.三七皂苷，照高效液相色譜法(《中國藥典》2000年版一部附錄VI D)測定；色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水二元梯度為流動相(見表1)；檢測波長為203nm；理論塔板數(shù)以人參皂苷Rg1峰計算應(yīng)不低于2500；對照品溶液制備，精密稱取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1適量加甲醇溶解，制成每1ml含三七皂苷R11.5mg、人參皂苷Rg12.8mg、人參皂苷Rb14.1mg的混合對照品溶液；供試品溶液制備，精密吸取樣品5ml，用水飽和正丁醇振搖提取三次，每次10ml；正丁醇層合并，用10ml正丁醇飽和水洗滌一次，棄水層，正丁醇層減壓回收，至干，殘渣用甲醇溶解至5ml，搖勻，用微孔濾膜0.45μm濾過，即得；測定法，精密吸取對照品溶液3μl，7μl、供試品溶液10μl注入高效液相色譜儀，用外標兩點法計算，即得；本品每ml含三七皂苷R1不得少于0.2mg；人參皂苷Rg1不得少于0.8mg；人參皂苷Rb1不得少于2.0mg；表1乙腈-水二元梯度洗脫表時間(min) 流速(ml/min)A(水)B(乙腈)0 1.0 80 20201.0 60 40本發(fā)明注射液質(zhì)量控制方法還可采用指紋圖譜的方法a.供試品溶液的制備精密吸取注射液5ml，用水飽和的正丁醇振搖提取兩次，第一次10ml；第二次5nl，合并正丁醇提取液；用正丁醇飽和的水10ml反洗一次，棄去水層，正丁醇提取液減壓回收至干，殘渣用甲醇溶解并定容至5ml容量瓶中，搖勻，0.45um濾膜濾過，即得；對照品溶液的制備取梔子苷對照品，用甲醇制成0.5mg/ml的溶液作為對照品溶液；測定方法檢測波長238nm，乙腈-水梯度洗脫，見表2；理論塔板數(shù)計算，應(yīng)不低30000；設(shè)定供試品溶液進樣量為101，記錄60分鐘的色譜圖，即得；以梔子苷的色譜峰(S峰)的保留時間和峰的面積為1計算相對保留時間和峰面積比值；指紋圖譜及技術(shù)參數(shù)；記錄時間為60分鐘；共有指紋峰的標定(相對保留時間)根據(jù)10批次供試品的檢測結(jié)果標定共有指紋峰如下1(0.404)2(0.462)3(0.510)4(0.589)5(0.618)6(0.666)7(0.722)8(0.798)S(1.000)9(1.085)10(1.110)11(1.197)12(1.238)13(1.277)；共有指紋峰面積的比值1∶S＝1∶(0.060-0.113)；部分峰形描述分離不好時，峰4呈峰5的肩峰；非共有峰面積供試品圖譜與對照指紋圖譜比較；非共有峰總面積不得大于峰面積的5％；儀器試劑高效液相色譜儀Waters2695泵；Waters 2996紫外檢測器；Millcnnium32色譜工作站；Diamonsil C18柱(5μm，4.6mm×150mm)；乙腈為色譜純(美國J.T.Baker)；娃哈哈純凈水；甲醇為色譜純(北京昌化精細化工廠)；表2流動相梯度洗脫表時間(min) 流速(ml/min) 水％乙腈％0 0.895 58 0.892 8210.888 12350.888 12400.870 30450.840 60500.80 100600.80 100b.供試品溶液的制備精密吸取注射液10ml，用水飽和的正丁醇20m1分二次振搖提取，合并正丁醇提取液；用正丁醇飽和的水300ml分三次反洗，棄去水層，正丁醇層減壓回收至干，殘渣用甲醇溶解并定容至2ml量瓶中，搖勻，0.45um濾膜濾過，即得；照物的制備取人參皂苷Rg1對照品(購自中國藥品生物制品檢定所)，用甲醇制成2mg/ml的溶液作為對照品溶液；測定方法檢測波長210nm，靈敏度0.1AUFS乙腈-水梯度洗脫，見表3；理論塔板數(shù)按人參皂苷Rg1計算，應(yīng)不低30000；精密吸取供試品溶液25μl，注入高效液相色譜儀，記錄70分鐘的色譜圖，即得；以人參皂苷Rg1的色譜峰(S峰)的保留時間和峰的面積為1計算相對保留時間和峰面積比值；指紋圖譜及技術(shù)參數(shù)；記錄時間為70分鐘；共有指紋峰的標定(相對保留時間)根據(jù)10批次供試品的檢測結(jié)果標定共有指紋峰如下1(0.877)S(1.000)2(1.027)3(1.555)4(1.592)5(1.652)6(1.675)7(1.708)8(1.744)9(1.799)10(2.005)11(2.042)12(2.074)13(2.111)14(2.150)15(2.212)16(2.235)17(2.364)18(2.391)19(2.420)20(2.440)21(2.771)；共有指紋峰面積的比值S∶3∶8∶21＝1∶(0.222-0.412)∶(0.405-0.735)∶(1.428-2.380)；非共有峰面積供試品圖譜與對照指紋圖譜比較；非共有峰總面積不得大于總面積的5％；儀器試劑Waters 2695 Waters 2996紫外檢測器Millcnnium32色譜工作站SymmetryshildTMRP18(5μm，4.6mm×250mm)；Fisher 乙腈(美國色譜純)Fisher甲醇(美國色譜純)娃哈哈純凈水其它為分析純表3 流動相梯度洗脫表時間(min) 流速(ml/min) A-水 B-乙腈0 1.0 831720 1.0 762440 1.0 604050 1.0 505055 1.0 0 10060 1.0 0 10070 1.0 0 100
權(quán)利要求
1.一種治療中風(fēng)病的中藥組合物，其特征在于該中藥組合物是由下述原料藥制成的梔子150-220重量份三七70-110重量份。
2.如權(quán)利要求1所述的中藥組合物，其特征在于該中藥組合物是由下述原料藥制成的梔子170-200重量份三七80-100重量份。
3.如權(quán)利要求1所述的中藥組合物，其特征在于該中藥組合物是由下述原料藥制成的梔子150-220重量份三七總皂苷3-9重量份
4.如權(quán)利要求3所述的中藥組合物，其特征在于該中藥組合物是由下述原料藥制成的梔子170-200重量份三七總皂苷5-7重量份。
5.如權(quán)利要求4所述的中藥組合物，其特征在于該中藥組合物是由下述原料藥制成的梔子175重量份三七總皂苷5.5重量份。
6.如權(quán)利要求1所述的中藥組合物，其特征在于該中藥組合物是由下述原料藥制成的梔子苷3.8-11.5重量份三七總皂苷3-9重量份。
7.如權(quán)利要求6所述的中藥組合物，其特征在于該中藥組合物是由下述原料藥制成的梔子苷6.3-8.9重量份 三七總皂苷5-7重量份。
8.如權(quán)利要求3-5所述的中藥組合物注射劑的制備方法，其特征在于該方法為取處方量的梔子，粉碎成粗粉，用7-9倍量的65-80％乙醇滲漉，收集滲漉液，回收乙醇，濃縮至55-70℃相對密度為1.00-1.20的清膏，加3-5倍量水稀釋，攪勻，0-4℃冷藏45-50小時，濾過，濾液減壓濃縮為55-70℃相對密度為1.00-1.20的清膏，上活性炭柱，先用蒸餾水洗脫，至洗脫液無色，再用9-11倍量65-80％乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收乙醇并濃縮，干燥，得梔子半成品；取梔子半成品用適量注射用水溶解，濾過；另取處方量的三七總皂苷，加適量注射用水溶解，濾過，將三七藥液與梔子藥液混勻，調(diào)節(jié)pH值至5.5-7.5，0-4℃冷藏20-30小時，0.45μm濾膜濾過，濾液加注射用水至全量，用0.22μm濾膜濾過，濾液灌裝成10ml安瓿注射液，110-120℃熱壓滅菌20-40分鐘，即得。
9.如權(quán)利要求8所述的中藥組合物注射劑的制備方法，其特征在于該方法為取處方量的梔子，粉碎成粗粉，用8倍量的70％乙醇滲漉，收集滲漉液，回收乙醇，濃縮至60℃相對密度為1.10的清膏，加4倍量水稀釋，攪勻，0-4℃冷藏48小時，濾過，濾液減壓濃縮為60℃相對密度為1.10的清膏，上活性炭柱，先用蒸餾水洗脫，至洗脫液無色，再用10倍量70％乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收乙醇并濃縮，干燥，得梔子半成品；取梔子半成品用適量注射用水溶解，濾過；另取處方量的三七總皂苷，加適量注射用水溶解，濾過，將三七藥液與梔子藥液混勻，調(diào)節(jié)pH值至6.0-7.0，0-4℃冷藏24小時，0.45μm濾膜濾過，濾液加注射用水至全量，用0.22μm濾膜濾過，濾液灌裝成10ml安瓿注射液，110℃熱壓滅菌30分鐘，即得。
10.如權(quán)利要求1-7所述的中藥組合物在制備治療中風(fēng)病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種治療中風(fēng)病的中藥組合物及其制備方法和質(zhì)量控制方法。該組合物主要由梔子150－220重量份、三七總皂苷3－9重量份組成。該中藥組合物制備時將梔子用乙醇滲漉，濃縮至清膏，上活性炭柱，得梔子半成品；取梔子半成品用適量注射用水溶解，另取處方量的三七總皂苷，加適量注射用水溶解，濾過，將三七藥液與梔子藥液混勻，調(diào)節(jié)pH值，濾膜濾過，熱壓滅菌制得注射劑。同時本發(fā)明還提供了對該組合物進行成分鑒別、含量測定、指紋圖譜的質(zhì)量控制方法。
文檔編號A61K31/7048GK1476891SQ0314952
公開日2004年2月25日 申請日期2003年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月19日
發(fā)明者牛欣, 印永貴, 李澎濤, 尹洪林, 王玥琦, 司銀楚, 李繼東, 龐鶴, 孫建寧, 宋曉雯, 蔡大勇, 徐元景, 孫偉, 牛 欣 申請人:北京中醫(yī)藥大學(xué), 內(nèi)蒙古康源藥業(yè)有限公司