專利名稱：蚌肉提取物的制備方法及含有它們的藥物組合物及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從蚌肉中制備抗腫瘤和鎮(zhèn)痛活性成分的方法以及含有蚌肉提取物的藥物組合物。
本發(fā)明還涉及蚌肉提取物在制備抗腫瘤藥物和鎮(zhèn)痛藥物中的應用。
背景技術(shù)：
由于癌癥嚴重地危害人類的生命及健康，各國均投入大量的人力物力致力于抗癌藥物的研究，目前化學合成的抗癌藥物存在較嚴重的細胞毒性，因此，從天然的動、植物中尋找高效、低毒的抗癌活性成分已成為研究的熱點。這些研究始于上世紀50年代以后，1958～1980年美國國家癌癥協(xié)會(NCI)策劃并實施了從35000種植物中篩選安全有效的抗癌藥物的計劃；日本、韓國、德國等國也進行了大量的研究工作，取得了令人鼓舞的結(jié)果。我國的傳統(tǒng)醫(yī)藥經(jīng)過幾千年的醫(yī)療實踐驗證，在世界上逐漸被更多的人們所認識和利用，正在發(fā)揮自己的優(yōu)勢。近年來在中藥抗癌有效成分及其制劑的研究方面也取得了長足的進展，如植物藥中的生物堿類、苷類、黃酮類和多糖類等；動物藥中鯊魚軟骨提取物、斑蟊素、蠶寶素、白蟻干粉及蟾酥等。這些成分目前被臨床證實具有較強的抗腫瘤作用。自20世紀60年代開始海洋藥物的研究逐漸成為研究的熱點，各國學者于20世紀70、80年代開始開展了大規(guī)模的篩選，用現(xiàn)代科學方法分離鑒定了許多結(jié)構(gòu)新穎、作用獨特的生物活性物質(zhì)，90年代隨著海洋藥物研究的日益深入，多種海洋藥物已進入臨床試驗階段，如肽類的膜海鞘素、蛤素、海兔毒肽、海扇糖蛋白；脂質(zhì)類的鯊肝醇、魚肝油酸鈉、海兔醚；及苷類、多糖類等。但這些產(chǎn)物抗癌的臨床療效仍難以令人滿意，而且很多天然物質(zhì)的來源受限，致使成本較高，臨床應用較少。
鎮(zhèn)痛藥是醫(yī)院臨床上最常用的藥物之一，目前臨床上主要使用的鎮(zhèn)痛為嗎啡、哌替啶等，這些藥物雖然鎮(zhèn)痛效果好，但有強的藥物耐受和依賴性，能嚴重損害人的身心健康。尋找安全有效、成癮性較低的鎮(zhèn)痛藥物一直是新藥研究不懈追求的目標。近年來，隨著分子生物學技術(shù)在疼痛機制和鎮(zhèn)痛藥理研究中的應用，各種與疼痛傳導相關(guān)的受體及其選擇性配體的研究取得了一定的進展。人們更加認識到疼痛是一個極其復雜的動態(tài)過程，涉及多靶標相互作用的神經(jīng)傳導/神經(jīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，從而為尋找新型鎮(zhèn)痛藥物奠定了基礎(chǔ)。以新的分子靶標為基礎(chǔ)尋找設計鎮(zhèn)痛藥物，有望擺脫傳統(tǒng)的麻醉鎮(zhèn)痛藥和NASID(阿司匹林類)的局限。
此外，近年吸毒已成為一個嚴重的社會問題，它嚴重危害人的身心健康和社會穩(wěn)定，而要戒除毒癮，其有效方法之一，是應用一種既無成癮性，而鎮(zhèn)痛效果又好的藥物。因此人們一直致力于尋找一種無成癮性的鎮(zhèn)痛及戒毒良藥。自本世紀70年代首次在動物腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性阿片肽以來，引起了人們對鎮(zhèn)痛多肽的極大興趣。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，小分子多肽絕大部分來源于動物(包括人類)，由于其含量微少，無法進行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)；尤其令人遺憾的是經(jīng)藥理和生理實驗研究發(fā)現(xiàn)，這些來源于動、植物的鎮(zhèn)痛的小分子多肽絕大部分也具有一定的藥物依賴性。
蛤(蚌)類的藥用在中醫(yī)臨床中具有悠久的歷史?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》是我國第一部系統(tǒng)的藥學專著，該書中記載“文蛤，主惡瘡，蝕五痔”，這里的“惡瘡”、“五痔”可能包括了一些惡性腫瘤如潰爛于體表的癌瘤及直腸癌等。李時珍在《本草綱目》中對蚌蛤類的藥用做了進一步的闡述，共記載蚌蛤類藥29種附方118個。“味咸、平微寒、無毒，去肋下堅滿、疬、一切瘡腫，消疝積塊，癭疾結(jié)核；化痰消積，除濕腫水嗽，明目，擦陰瘡濕瘡痛癢”，以上病癥可能包括了一些惡性腫瘤在內(nèi)。
曾有實驗室報道，利用河蚌提取的河蚌多糖(Mpa)具有一定的抗瘤和抗炎作用，但Mpa的作用強度較低，在小鼠發(fā)揮抗炎作用需5g/kg以上，使Mpa的來源和臨床應用受限。
河蚌為水生軟體動物，其肉質(zhì)柔軟，極易腐爛變質(zhì)，蚌肉一般在出水后數(shù)小時就變質(zhì)發(fā)臭。在河蚌的體內(nèi)含有多種酶類，例如，在河蚌的胃內(nèi)有一特殊的結(jié)構(gòu)“晶桿體”，它有攪拌食物和分泌糖原酶的作用，在胃的周圍還有一對褐色葡萄狀的消化腺，這是河蚌的肝臟，有肝管通到胃內(nèi)，肝臟內(nèi)含有淀粉酶和糖原酶，也起消化作用(戈賢平等，淡水珍珠養(yǎng)殖新技術(shù)，上?？茖W技術(shù)出版社，2002年8月)。這些酶類在河蚌體內(nèi)起重要作用，同時研究發(fā)現(xiàn)，這些酶類也與河蚌體內(nèi)含有的抗腫瘤和鎮(zhèn)痛活性成分的生物學活性密切相關(guān)。因此，在制備蚌肉提取物的過程中如何保持河蚌體內(nèi)各種酶類的高活性從而獲得具有較高生物學活性的提取物將十分重要。
中國專利CN1067579C中公開了一種治療腫瘤的藥物，它是利用從淡水河蚌中提取的蚌質(zhì)素與黃芪、丹參、昆布、香菇制成的一種組合物，其中蚌質(zhì)素的制備方法是將淡水河蚌的軟體組織勻漿后，用苯甲酸溶液進行防腐處理，加入鹽酸調(diào)PH至4.0，再加入60％乙醇，體積比為1∶0.5攪拌后過濾，濾液以3000轉(zhuǎn)/分離心取沉淀物，恒溫50℃干燥后即得蚌(質(zhì))素。
中國專利CN1079238C公開一種具有鎮(zhèn)痛和抑制腫瘤作用的蚌類提取物的制備方法，其采用酸和醇處理蚌肉后，將上清液再以堿處理，取堿處理后的沉淀得到蚌類提取物，在該方法中，處理過程中加入40～75％的乙醇，將會導致大部分的蛋白沉淀，同時在該方法中，酸、醇處理的時間為1～24小時，堿處理的PH值高達PH8～13，這些條件對于天然酶活性的保持均十分不利。在該專利說明書中，還公開了另一種提取蚌類提取物的方法，其采用酸、水在加熱條件下處理蚌肉，取上清液獲得蚌肉提取物，在該種方法中，酸、水處理加熱的溫度為48～88℃，處理時間為0.5～4.5小時，在此條件下，同樣將導致大部分的蛋白變性。由于該方法采用有機溶劑提取，制備得到蚌肉提取物微溶于水或低濃度乙醇，難溶于乙醚、丙酮等有機溶劑，這使得其在制藥領(lǐng)域的應用受到了限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種蚌肉提取物的制備方法，該方法采用將蚌肉組織在常溫下酶解自溶的方法，充分保留了蚌肉中含有的各種天然酶的活性，同時通過蚌肉組織中含有的各種酶類的作用，酶解生物大分子，獲得小分子的物質(zhì)，由該方法獲得的蚌肉提取物具有較高的抗腫瘤活性和鎮(zhèn)痛活性，其在體外和動物體內(nèi)均表現(xiàn)出較高的抑制腫瘤細胞生長、抗炎及增強腹腔巨噬細胞吞噬作用的活性，同時具有較強的鎮(zhèn)痛作用，而且不具有阿片類藥物的成癮性，毒性較低。
本發(fā)明的另一目的在于提供含有本發(fā)明蚌肉提取物的藥物組合物。
本發(fā)明的再一目的在于提供蚌肉提取物在制備治療腫瘤藥物和鎮(zhèn)痛藥物中的應用。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，蚌肉提取物的原料來自于三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)和褶紋冠蚌(Cristariaplicata)，將新鮮的蚌肉組織切成小塊，加入防腐劑進行防腐處理后，調(diào)節(jié)PH至2.8～3.9進行酸化處理，將酸化后的材料在恒溫下放置一段時間，使蚌肉組織進行酶解自溶，收集自溶后的液體進行離心純化，即獲得本發(fā)明的蚌肉提取物。
在本發(fā)明的制備方法中，針對本發(fā)明特有的酶解自溶步驟需要較長時間，而蚌肉組織極易腐爛變質(zhì)的特點，使用防腐劑以防止蚌肉組織的酶解自溶的過程中腐爛變質(zhì)。使用的防腐劑可以選自苯甲酸鈉、尼泊金乙酯和氯仿，優(yōu)選為苯甲酸鈉；在酸化處理中，用于調(diào)節(jié)溶液PH值的酸可以是鹽酸、硫酸、乙酸等，優(yōu)選使用36％鹽酸調(diào)節(jié)PH值；酸化的PH值優(yōu)選為PH3.0～3.5；蚌肉組織酶解自溶的溫度為20～40℃，優(yōu)選為30～35℃；時間為30～100天，優(yōu)選為50～90天。
在本發(fā)明的制備方法中，純化的步驟包括，將自溶后的液體以5,000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，取上清液，調(diào)節(jié)PH為6.5～7.5，以10,000道爾頓超濾膜過濾，獲得濾液，將濾液進行無菌處理，凍干后可獲得本發(fā)明的蚌肉提取物原料藥。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，依照上述方法制備的蚌肉提取物在270nm附近有最大吸收，經(jīng)初步成分分析，其中含有氨基酸和蛋白質(zhì)、糖類和甾體，不含酚類和脂類，瓊脂糖凝膠電泳顯示其中無核酸存在。本發(fā)明方法制備的蚌肉提取物含有天門冬氨酸(Asp)、蘇氨酸(Thr)、絲氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、胱氨酸(Cys)、纈氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、賴氨酸(Lys)、組氨酸(His)、色氨酸(Trp)、精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)等氨基酸。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種藥物組合物，其含有治療有效量的本發(fā)明蚌肉提取物。以預定劑量的本發(fā)明的蚌肉提取物原料藥加入藥學上可接受的載體或賦形劑或其他可選的成分，制成適于口服的膠囊劑、扁囊劑或片劑，也可以制成針劑。
使用的藥學上可接受的載體可以是包括但不限于標準藥用載體，例如，磷酸鹽緩沖生理鹽水液、含有聚山梨醇酯80、水的油/水混懸液和各種類型的濕潤劑的磷酸鹽緩沖生理鹽水，其他載體還包括滅菌溶液、片劑、包衣片和膠囊。
使用的賦形劑包括但不限于淀粉、牛奶、糖、特種粘土、明膠、硬脂酸或鹽(包括硬脂酸鎂、鈣)，滑石粉、植物脂肪或植物油、樹膠、乙二醇或其它已知的賦形劑。
其他可選的成分包括但不限于調(diào)味品和色素或其他添加劑，含有上述成分的組合物可以按照常規(guī)方法配制。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供依照本發(fā)明方法制備的蚌肉提取物在制備治療腫瘤藥物中的應用，所述的腫瘤包括但不限于各種實體瘤、肉瘤、血液系統(tǒng)腫瘤，例如，肝癌、胃癌、肺癌、鼻咽癌、乳腺癌、白血病、骨肉瘤、結(jié)直腸癌等。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供依照本發(fā)明方法制備的蚌肉提取物在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應用。
本發(fā)明的制備方法充分保留了蚌肉中所含抗癌活性成分和鎮(zhèn)痛成分的生物學活性，蚌肉組織防腐后，經(jīng)酸化并在常溫下經(jīng)長達數(shù)月的自溶處理后，保持了蚌肉組織中含有的天然酶的活性，使生物大分子在酶的作用下充分水解，釋放出具有高效抗腫瘤和鎮(zhèn)痛活性的生物分子，經(jīng)體外細胞試驗證實，蚌肉提取物對肝癌和肺癌細胞具有較強的抑制作用，同時其還具有抗炎及增強腹腔巨噬細胞吞噬作用；動物體內(nèi)實驗結(jié)果表明，蚌肉提取物對小鼠肝癌、肺癌、艾氏腹水癌(乳腺癌)的抑瘤率均在50％以上；同時蚌肉提取物具有較強的鎮(zhèn)痛作用，沒有成癮性；而且其毒性極低，其在小鼠靜注的半數(shù)致死量LD50為4.02g/kg，對血液系統(tǒng)無明顯影響。
由于在本發(fā)明的制備方法中采用了酸水提取，未使用任何有機溶劑，因此制備的蚌肉提取物具有極好的水溶性，適于各種劑型的藥物制備。
具體實施例方式
下面，通過對本發(fā)明具體實施方式
的描述，詳細說明但不限制本發(fā)明。
實施例1蚌肉提取物的制備1、預處理捕撈新鮮三角帆蚌或褶紋冠蚌，除去鰓和排泄器官，取蚌肉組織，放入無菌容器內(nèi)，隨機檢查蚌肉各項衛(wèi)生指標，肉眼觀察外觀不正常、變質(zhì)者作不合格處理。對初選合格的蚌肉再進行細菌和病毒學指標檢驗，合格者備用。
2、切塊和防腐取檢驗合格蚌肉組織，用絞肉機切成小塊，取切塊的蚌肉放入容器內(nèi)，稱重后，加入蚌肉重量0.3％的苯甲酸鈉，攪拌均勻。
3、酸化取防腐處理后的蚌肉組織，用36％鹽酸溶液調(diào)節(jié)PH至3.5后，置于封閉容器中靜置。
4、自溶將裝有酸化后的蚌肉組織的封閉容器放置在恒溫室內(nèi)，保持容器內(nèi)溫度恒定在30～35℃，放置90天，觀察容器內(nèi)的蚌肉組織已全部自溶為液體。
5、純化取自溶后的液體，過濾，過濾后的液體于5,000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘后，取上清液，以NaOH調(diào)節(jié)PH為6.5～7.5。
以上獲得的上清液經(jīng)10000道爾頓分子量的聚偏二氟乙烯中空纖維超濾膜過濾，將該濾液過0.22μ的微孔濾膜后，將獲得的濾液凍干，即得蚌肉提取物原料藥(下稱BR01)。
獲得的BR01再溶解后，進行透析，進一步獲得分子量約為1500道爾頓的分子，蛋白電泳進一步確定其分子量范圍，凍干獲得小分子量的原料藥(下稱BR02)。
實施例2蚌肉提取物(下稱BR01)的理化性質(zhì)測定依照上述方法制備的蚌肉提取物為微黃色粉末，溶于水，微溶于乙醇，在270nm附近有最大吸收，經(jīng)初步成分分析，其中含有氨基酸和蛋白質(zhì)、糖類和甾體，不含酚類和脂類，瓊脂糖凝膠電泳顯示其中無核酸存在。
稱取凍干的樣品14.60mg，以6N HCL進行水解后蒸干，再溶解定容至50ml體積，測定水解氨基酸，采用日立835-50型氨基酸分析儀，進樣量50微升，結(jié)果如下(重量百分數(shù))氨基酸名稱 含量(W％)天門冬氨酸ASP2.76蘇氨酸THR1.24絲氨酸SER1.30谷氨酸GLU4.02甘氨酸GLY1.78丙氨酸ALA1.71胱氨酸CYS0.47纈氨酸VAL1.56蛋氨酸MET0.97異亮氨酸ILE 1.65亮氨酸LEU2.50酪氨酸TYR1.02苯丙氯酸PHE 1.35賴氨酸LYS1.96氨NH30.79組氨酸HIS0.42色氨酸TRP---精氨酸ARG2.24脯氨酸PRO1.44總量 29.18將樣品溶解后，采用日立835-50型氨基酸分析儀進行游離氨基酸測定，發(fā)現(xiàn)蚌肉提取物中含有天門冬氨酸(Asp)、蘇氨酸(Thr)、絲氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、胱氨酸(Cys)、纈氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、賴氨酸(Lys)、組氨酸(His)、色氨酸(Trp)、精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)等氨基酸。
實施例3蚌肉提取物(下稱BR01)給藥量的確定以上述方法制備的蚌肉提取物BR01初步鑒定為多肽化合物，為微黃色粉末，每100mg中多肽含量為≥15mg，按照實驗動物與人用藥量轉(zhuǎn)換因子計算方法計算，以等效劑量的1、2、4倍量為小鼠低劑量、中劑量和高劑量。
BR01成人擬臨床用法用量成人每天用藥量為800mg，若成人以70kg體重計算，則成人日最大用藥量為11.43mg/kg，參考陳奇主編的《中藥藥理研究方法學》中的劑量換算法。
換算得到小鼠每日用量等效量為(800/70)×(0.06/0.11)×(70/0.02)1/3＝95mg/kg低劑量95×1＝95mg/kg中劑量95×2＝190mg/kg高劑量95×4＝380mg/kg實施例4蚌肉提取物對癌細胞的抑制作用一、蚌肉提取物BR01對離體培養(yǎng)肝癌細胞生長的抑制作用1材料與方法1.1實驗材料人肝癌細胞系7402細胞株由武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供，細胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)液(購于華美生物工程公司)，并添加含10％小牛血清及青霉素100μ/ml、鏈霉素100μ/ml、BR01按照實施例1所述的方法制備，絲裂霉素C(mitomycinC，MMC)、噻唑[3-(4，5-dimethyl-thiazol-211)-2，5-diplengl-tetnazdiumbromide，Thidzoglblue(MTT)]購于華美生物工程公司。酶聯(lián)免疫檢測儀(DG3022--II型)系華東電子管廠產(chǎn)品。
1.2MTT法檢測細胞增殖參照文獻方法進行。在96孔培養(yǎng)板中接種7402細胞5×103/100μL，同時加入各種梯度濃度的藥物，陰性對照組以等體積生理鹽水代替藥物，空白對照孔只加入培養(yǎng)液。每種藥物濃度設置3個平行復孔。細胞置于37℃，5％CO2及飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)48h，然后每孔加入不同濃度的MTT20μL，在同樣條件下繼續(xù)孵育4～6h。傾去上清液，每孔加入DMSO150μL，在混合振蕩儀上振蕩10min，用酶聯(lián)檢測儀測定570nm波長的吸光度值，計算細胞殺傷率。
2實驗結(jié)果
2.1BR01對7402細胞增殖的影響 用MTT法觀察了BR01對7402細胞的增殖的影響。當用不同濃度的BR01處理7402細胞時，可見BR01對7402細胞的增殖有明顯的抑制作用。IC50為61.93mg/L(95％可信限45.83～83.70mg/L)，與陰性對照比差異有顯著性(P＜0.01)增殖抑制作用有良好的劑量效應關(guān)系(Γ＝0.9751)。說明BR01可直接抑制肝癌細胞系7402的增殖。
表1 BR01對7402細胞增殖的抑制作用組別 濃度(mg/L) A570nm值抑制率對照 0 0.317±0.016MMC 5.0 0.282±0.017Δ11.0410.00.159±0.019ΔΔ49.8425.00.127±0.011ΔΔ59.94BR0112.50.299±0.0155.6825.00.231±0.012ΔΔ27.1350.00.183±0.018ΔΔ42.27100 0.113±0.014ΔΔ64.35n＝8，x±s.與對照組比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01。
二、BR01對人肺癌A549細胞增殖的作用1材料與方法1.1實驗材料人肺癌細胞系A(chǔ)549細胞株由武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供，細胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)液(購于華美生物工程公司)，并添加含10％小牛血清及青霉素100μ/ml、鏈霉素100μ/ml、BR01按照實施例1所述的方法制備，絲裂霉素C(mitomycinC，MMC)、噻唑[3-(4，5-dimethyl-thiazol-211)-2，5-diplengl-tetnazdiumbromide，Thidzoglblue(MTT)]購于華美生物工程公司。酶聯(lián)免疫檢測儀(DG3022--II型)系華東電子管廠產(chǎn)品。
1.2MTT法檢測細胞增殖參照文獻方法進行。在96孔培養(yǎng)板中接種A549細胞5×103/100μL，同時加入各種梯度濃度的藥物，陰性對照組以等體積生理鹽水代替藥物，空白對照孔只加入培養(yǎng)液。每種藥物濃度設置3個平行復孔。細胞置于37℃，5％CO2及飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)48h，然后每孔加入不同濃度的MTT20μL，在同樣條件下繼續(xù)孵育4～6h。傾去上清液，每孔加入DMSO150μL，在混合振蕩儀上振蕩10min，用酶聯(lián)檢測儀測定570nm波長的吸光度值，計算細胞殺傷率。
2實驗結(jié)果2.1BR01對A549細胞增殖的影響用MTT法觀察了BR01對A549細胞的增殖的影響。當用不同濃度的BR01處理A549細胞時，可見BR01對A549細胞的增殖有明顯的抑制作用。IC50為56.85mg/L(95％可信限40.85～79.11mg/L)，與陰性對照比差異有顯著性(P＜0.01)，增殖抑制作用有良好的劑量效應關(guān)系(Γ＝0.9685)。說明BR01可直接抑制人肺癌細胞系A(chǔ)549的增殖。
表2 BR01對A549細胞增殖的抑制作用濃度(mg/L) A570nm值 抑制率0 0.794±0.1018 0.752±0.094 5.2816 0.661±0.046Δ16.7532 0.427±0.038ΔΔ46.2264 0.379±0.020ΔΔ52.27128 0.239±0.008ΔΔ68.90n＝8，x±s.與對照組比較，ΔP＜O.05，ΔΔP＜O.O1。
實施例5蚌肉提取物動物體內(nèi)抑癌實驗一、BR01對裸鼠荷人肝癌的抑制作用1.方法復蘇的肝癌細胞株7402進行擴大培養(yǎng)。BALB/C裸鼠60只，每只裸鼠右側(cè)頸背皮下接種1.8×106個/ml癌細胞0.4ml，稱重后完全隨機分為5組，每組12只。(1)對照組生理鹽水0.1ml/10g·d。(2)BR01高劑量組200.0mg/kg·d。(3)BR01中劑量組100.0mg/kg·d。(4)BR01低劑量組50.0mg/kg·d。(5)腹腔注射5-Fu，劑量為10mg/kg。于接種癌細胞后第10天開始給藥，連續(xù)灌胃21天，每天灌胃一次。每周稱體重一次，同時測量最大瘤徑和最小瘤徑。停藥后次日處死動物。裸鼠處死后剝瘤塊，稱重。
2.結(jié)果
2.1對腫瘤生長的影響各組裸鼠于給藥前測量一次，給藥后每隔一周測量一次瘤的最大徑和最小徑，按公式(長徑+短徑)/2求平均瘤徑。結(jié)果見表3。高中低劑量BR01均可明顯抑制腫瘤的生長。
表3 BR01對腫瘤瘤徑的影響給藥后瘤徑/cm組別 給藥前瘤徑/cm 第1周 第2周 第3周control0.18±0.04 0.89±0.24 1.36±0.45 1.92±0.515-Fu 0.18±0.05 0.85±0.21**0.97±0.37** 0.63±0.24**BR01(低) 0.19±0.06 0.87±0.25**1.247±0.43** 1.89±0.41**BR01(中) 0.17±0.05 0.74±0.31**1.01±0.34** 0.91±0.37**BR01(高) 0.18±0.06 0.69±0.33* 0.91±0.36** 0.77±0.41**x±s，n＝8，*P＜0.05，**P＜0.01，與對照組比較。
2.2對腫瘤的抑制作用裸鼠處死后稱取的瘤重，按以下公式求出抑瘤率 表4 BR01對腫瘤的抑制作用組別瘤重/mg抑瘤率(％)對照組 1310.2±424.5 ---5-Fu457.5±129.7** 65.1BR01(低)1034.9±378.4**21.0BR01(中)654.7±252.6** 48.0BR01(高)509.1±213.5** 61.1x±s，n＝8，*P＜0.01，與對照組比較。
BR01對裸鼠荷人肝癌均有明顯的抑制作用(P＜0.01)，其中，高劑量BR01組的抑瘤率比其他幾組略高。經(jīng)方差分析，各組之間的治療效果有顯著的劑量依賴性(P＜0.01)。
(二)BR01對H22(肝癌)荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用1.方法復蘇的肝癌細胞株H22進行擴大培養(yǎng)。清潔級昆明鼠60只，每只鼠右側(cè)頸背皮下接種1.8×106個/ml癌細胞0.4ml，稱重后完全隨機分為5組，每組12只。(1)對照組生理鹽水0.1ml/10g·d。(2)BR01高劑量組200.0mg/kg·d。(3)BR01中劑量組100.0mg/kg·d。(4)BR01低劑量組50.0mg/kg·d。(5)腹腔注射5-Fu，劑量為10mg/kg。于接種癌細胞護第10天開始給藥，連續(xù)灌胃21天，每天灌胃一次。每周稱體重一次，停藥后次日處死動物。小鼠處死后剝瘤塊，稱重，記錄脾臟重量，并檢驗血常規(guī)白細胞數(shù)量。
2.結(jié)果2.1對腫瘤生長的影響表5 BR01對H22荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用組別n 劑量平均瘤重腫瘤抑制率(mg/kg) (g) (％)陰性對照15 0 2.13±0.96---5-Fu10 10 0.87±0.64** 59.2BR0110 50 1.68±0.97** 21.110 100 1.35±0.81** 36.610 200 0.92±0.79** 56.8x±s，**P＜0.01，與對照組比較。
2.2對荷瘤小鼠脾臟的影響表6 BR01對H22荷瘤小鼠脾臟質(zhì)量的影響組別 n劑量 脾重指數(shù)(mg/kg) (mg/10g)control 150 63.86±16.195-Fu1010 41.36±8.12ΔΔBR011050 71.42±21.13**1010073.31±19.17**1020074.27±21.29**與陰性對照組比，ΔΔP＜0.01；**與陽性對照相比，P＜0.01.
2.3荷瘤小鼠血液系統(tǒng)的影響表7 BR01對H22荷瘤小鼠白細胞數(shù)目的影響組別n 劑量 白細胞數(shù)目(mg/kg)(×109L-1)control 15 0 10.2±2.115-Fu10 10 5.1±1.04##BR0110 50 9.87±2.33**10 10010.6±2.47**10 20012.3±2.49**與陽性對照相比，**P＜0.01；與陰性對照相比，##P＜0.001(三)BR01治療對荷Lewis肺癌小鼠的影響1、方法復蘇的肺癌細胞株Lewis肺癌細胞進行擴大培養(yǎng)。BALB/C裸鼠60只，每只裸鼠右側(cè)頸背皮下接種1.8×106個/ml癌細胞0.4ml，稱重后完全隨機分為5組，每組12只。(1)對照組生理鹽水0.1ml/10g·d。(2)BR01高劑量組200.0mg/kg·d。(3)BR01中劑量組100.0mg/kg·d。(4)BR01低劑量組50.0mg/kg·d。(5)腹腔注射環(huán)磷酰胺(Cy)，劑量為0.02mg/kg。于接種癌細胞后第10天開始給藥，連續(xù)灌胃21天，每天灌胃一次。每周稱體重一次。停藥后次日處死動物，裸鼠處死后剝瘤塊，稱重，記錄脾臟重量并檢查血液常規(guī)白細胞數(shù)量。
2、結(jié)果BR01治療給藥對Lewis肺癌小鼠生存時間的影響B(tài)ALB/C裸鼠接種Lewis肺癌瘤細胞2天后，按表8分組，ig給藥，每日一次，連續(xù)15天。觀察時間為45天。表8表明，BR01可明顯提高荷瘤小鼠生存時間和生命延長率，且與陽性對照藥環(huán)磷酰胺(Cy)相似。
表8 BR01治療對荷瘤小鼠生存時間的影響(n＝30)組別 劑量生存時間(mg/kg/d) (d)腫瘤對照 --- 22.9±4.8BR01 50 24.7±4.6100 30.1±6.0**200 35.3±6.5**Cy 0.0234.6±6.9**與腫瘤組比較，**P＜0.01表9 BR01治療7天對荷瘤小鼠瘤重的影響組別劑量 動物數(shù) 瘤重(mg/kg/d) (始/末) (g)腫瘤對照--- 30/301.66±0.48BR015030/301.56±0.52100 30/301.45±0.51200 30/301.14±0.30**Cy 0.02 30/300.79±0.28**與腫瘤組比較，**P＜0.01
表10 BR01治療15天對荷瘤小鼠瘤重的影響組別劑量 動物數(shù) 瘤重(mg/kg/d)(始/末) (g)腫瘤對照--- 30/30 3.70±0.99BR0150 30/30 3 29±0.80100 30/30 2.40±0.54200 30/30 1.82±0.53**Cy 0.02 30/30 0.99±0.31**與腫瘤組比較，**P＜0.01實施例6蚌肉提取物BR01對免疫功能的影響1、BR01可顯著增強環(huán)磷酰胺造成的免疫低下模型小鼠DTH及PFC的作用以環(huán)磷酰胺造成小鼠免疫低下模型，遲發(fā)性過敏反應(DTH)采用二硝基氟苯(DNFB)致敏小鼠耳片法；抗體水平測定采用SRBC誘導的空斑形成細胞(PFC)法，結(jié)果如表11和表12表11在Cy-抑制的小鼠中BR01對DTH反應的影響組別 劑量(mg/kg) 腫脹(R-L)(mg)對照 --- 9.54±1.53**Cy 50s.c. 5.43±1.12Cy+BR0150 7.30±0.92*Cy+BR01100 8.89±1.60**Cy+BR01200 10.58±1.17**Cy+LNT 510.24±1.50**x±s，＝8，*P＜0.05，**P＜0.01，與Cy模型組比較，R-L＝右耳重量—左耳重量表12Cy-抑制的小鼠中BR01對空斑形成細胞(PFC)應答SRBC的影響組別 劑量(mg/kg) A(×103)值(413)對照 ---21.0±10.7**Cy 50s.c. 9.8±4.9Cy+BR01 50 28.3±17.7*Cy+BR01 100112.4±12.4**Cy+BR01 200157.4±24.8**Cy+LNT 5 139.1±19.4**x±s，＝8，*P＜0.05，**P＜0.01，與Cy模型組比較結(jié)果表明，BR01可使Cy造成低下的DTH反應增強，對低下的PFC反應亦有所加強，說明BR01對免疫低下模型小鼠有較好的免疫抑制恢復作用，這提示BR01對增強機體細胞免疫能力及機體抗腫瘤能力可能有益。
2、BR01對小鼠巨噬細胞吞噬能力的影響及抗炎作用BR01對小鼠灌胃給藥，可顯著增強腹腔巨噬細胞(M)吞噬能力；對大鼠和小鼠給藥時，對二甲苯引起的小鼠耳廓腫脹具有一定的抗炎作用，結(jié)果見表13和表14表13 BR01對小鼠巨噬細胞吞噬作用的影響組別 劑量(mg/kg.d) 吞噬百分數(shù)(x±s％) 吞噬指數(shù)對照 0 13.8±3.18 0.18±0.03BR01 50×7 33.40±8.23*0.44±0.03*x±s，＝10，*P＜0.05，與對照組比較表14 BR01在小鼠中對二甲苯引起的耳廓腫脹的影響組別右耳重量左耳重量 R-L對照6.86±1.05 3.11±0.28 3.75±1.08BR014.88±1.16*3.56±0.72*1.32±0.59*x±s，＝10，*P＜0.05，與對照組比較實施例7BR01的鎮(zhèn)痛活性研究以實施例1方法制備的蚌肉提取物BR01粉末制備粉針制劑，用普通注射用水溶解后可用于肌肉或皮下注射。
A、對小鼠的鎮(zhèn)痛作用用臨床推薦有效劑量換算BR01(400mg/次)，阿斯匹林(Asp，500mg/次)的小鼠等效劑量分別為50mg/kg和60mg/kg，給藥30min后ip0.6％Hac，觀察小鼠在15min內(nèi)的扭體次數(shù)，以嗎啡(Morphine)為對照。測試結(jié)果見表15。BR01能顯著減少小鼠的扭體次數(shù)。
表15 BR01對ip 0.6％Hac誘發(fā)小鼠扭體的影響(x±s)組別 動物數(shù) 劑量(mg/kg) 扭體次數(shù)生理鹽水15 0 43.8±7.2Asp 15 60 16.7±6.3**BR0115 50 15.1±5.9**Morphine5 5 8.4±1.3**與生鹽水比較**P＜0.01B、對大鼠ip4％Nacl所致扭體抑制作用用臨床推薦有效劑量換算BR01(400mg/次)，阿斯匹林(Asp，500mg/次)的大鼠等效劑量分別為42mg/kg和35mg/kg，給藥30min后ip4％NaCl，觀察小鼠在15min內(nèi)的扭體次數(shù)，以嗎啡(Morphine)為對照。測試結(jié)果見表16。BR01能顯著減少大鼠的扭體次數(shù)。
表16 BR01對ip 4％NaCl誘發(fā)大鼠扭體的影響(x±S)組別 動物數(shù)劑量(mg/kg) 扭體次數(shù)生理鹽水 10 024.5±5.7Asp 10 35 8.9±3.6**BR01 10 42 9.7±4.2**Morphine 10 17.3±3.4**與生鹽水比較**P＜0.01由以上結(jié)果可見，BR01在小鼠和大鼠中均表現(xiàn)出明顯的鎮(zhèn)痛活性。
實施例8阿片受體拮抗劑對BR01的鎮(zhèn)痛活性影響A.預先30min給小鼠sc5mg/kg鹽酸納絡酮，觀察BR01和嗎啡(Morphine)對小鼠ip 0.6％乙酸的扭體反應，結(jié)果見表17表17納絡酮對BR01鎮(zhèn)痛的影響(x±s)組別 動物數(shù) 劑量(mg/kg) 扭體次數(shù)生理鹽水15 0 43.8±7.2BR0115 50 14.5±6.1**Morphine15 5 41.1±9.7與生鹽水比較**P＜0.01B.預先30min給大鼠sc 2mg/kg鹽酸納絡酮，觀察BR01和嗎啡(Morphine)對大鼠ip 4％NaCl的扭體反應，結(jié)果見表18表18納絡酮對BR01鎮(zhèn)痛的影響(x±s)組別 動物數(shù) 劑量(mg/kg) 扭體次數(shù)生理鹽水 10 0 25.1±5.5BR01 10 42 10.2±3.7**Morphine 10 1 22.8±4.8與生鹽水比較**P＜0.01由以上結(jié)果可見，BR01的鎮(zhèn)痛作用與阿片受體無關(guān)，因此可能不具阿片類藥物的成癮性。
實施例9蚌肉提取物BR01的毒性實驗試驗動物清潔級昆明種小鼠，體重20-22g，8周齡，粵檢證字第2001A034號，雌雄各關(guān)。清潔級SD大鼠，8周齡，體重180-220g，粵檢證字第2002A305號，雌雄各半。由第一軍醫(yī)大學實驗動物研究中心提供。
條件動物進入實驗室后，雌雄分開，大籠每放養(yǎng)5只，適應性飼養(yǎng)5天；小鼠每籠10只，適應性1天，觀察動物活動、進食、大小便均無異常后啟用。實驗動物由專人飼養(yǎng)管理。動物室光照充足，通風和空調(diào)設備良好，室溫控制在25℃，相對濕度為40-60％。動物室按常規(guī)定期消毒。
給藥途徑 灌胃，與擬推薦的臨床用藥途徑一致。
給藥體積 ig，小鼠0.4ml/10g；大鼠，ig，2.0ml/100g。
藥物BR01按照實施例1的方法制備實驗方法1、小鼠急性毒性試驗取昆明小鼠20只，雌雄各半。禁食12h(飲水不限)后，按最大濃度(30mg蛋白/ml)和最大給藥體積(0.4ml/10g)灌胃，每日給藥3次，間隔時間為6小時。給藥后小鼠自由進食飲水。藥后24h內(nèi)嚴密觀察受試動物的情況，以后每天觀察3次，連續(xù)7天，記錄動物的一般生理指標、行為活動、精神狀態(tài)及動物存活情況。于第8天將小鼠處死，解剖后肉眼觀察其心、肝、脾、腎、腦、胃、腸等主要臟器的病理學改變。
2、大鼠急性毒性試驗取SD大鼠20只，雌雄各半。禁食12h(飲水不限)后，按最大濃度30mg蛋白/ml)和最大給藥體積(2.0ml/100g)給大鼠灌服BR01溶液，一天內(nèi)給藥3次，給藥間隔時間為6小時，給藥后觀察7天，每天記錄大鼠的一般生理指標、行為活動、精神狀態(tài)及動物存活情況。于第8天將大鼠處死，解剖后肉眼觀察其心、肝、脾、腎、腦、胃、腸等主要臟器的病理學改變。
結(jié)果以最大濃度和最大給藥體積小鼠大鼠igBR01溶液，一日3次。經(jīng)7天觀察，無動物死亡。各給藥組動物均無生理異常表現(xiàn)，皮毛光滑，飲食正常，大小便正常，眼、鼻無異常分泌物，粘膜無充血。呼吸、心跳正常。處死后解剖肉眼檢查，未發(fā)現(xiàn)心、肝、脾、腎、腦、胃、腸等主要臟器有病理學改變。
以上實驗結(jié)果表有小鼠一日3次ig給藥BR01的最大耐受量為3.6g蛋白/kg；大鼠灌胃的最大耐受量為1.8g蛋白/kg。分別為臨床擬用量(0.8g蛋白/70kg)的315倍、157.5倍。
結(jié)論大、小鼠一天3次以最大約藥體積和最大濃度給藥后，無動物死亡，亦未見任何毒性反應。測得小鼠ig的最大耐受量為3.6g蛋白/kg，相當于成人臨床擬用藥量的315倍。大鼠一天3次灌胃給藥的最在耐受量為1.8g蛋白/kg，相當于成人臨床擬用藥量的157.5倍。結(jié)果表明，BR01對大、小鼠未見明顯的急性毒性作用。
由以上結(jié)果可見，BR01具有明顯的抑制腫瘤細胞生長的作用，并且可增強免疫系統(tǒng)的功能，而且毒副作用很低。
BR01具有較強的鎮(zhèn)痛活性，而且無成癮性，此外，值得注意的是，由BR01中進一步分離的分子量在1500道爾頓以下的成分(BR02)在動物試驗中表現(xiàn)出較強的鎮(zhèn)痛活性，因此提示河蚌及蚌肉提取物中發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的是小分子多肽。
以上對本發(fā)明的詳細描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變和變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應屬于本發(fā)明的權(quán)利要求所定義的范圍。
權(quán)利要求
1.蚌肉提取物的制備方法，包括以下步驟1)取新鮮蚌類，去除鰓和排泄器官，取蚌肉組織；2)將蚌肉組織切塊，加入防腐劑進行防腐處理；3)在經(jīng)防腐處理后的蚌肉組織中加入酸，調(diào)節(jié)PH值至2.8～3.9進行酸化；4)將酸化后的蚌肉組織置于恒溫下一段時間直至蚌肉組織自溶；5)收集自溶后的液體，獲得所述蚌肉提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述蚌類為三角帆蚌或褶紋冠蚌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟2)所述防腐劑選自苯甲酸鈉、尼泊金乙酯和氯仿。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述防腐劑為苯甲酸鈉。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟3)所述酸為36％鹽酸，所述酸化的PH值為3.0～3.5。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟4)所述自溶的溫度為20～40℃，時間為30～100天。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中步驟4)所述自溶的溫度為30～35℃，時間為50～90天。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中進一步包括下述分離純化步驟6)將蚌肉提取物以5000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，取上清液；7)調(diào)節(jié)上清液PH為6.5～7.5，以10000道爾頓超濾膜過濾，獲得濾液，將濾液進行無菌處理，凍干后可獲得蚌肉提取物原料藥。
9.一種由權(quán)利要求1所述方法制備的蚌肉提取物。
10.一種藥物組合物，其特征在于，它含有治療有效量的蚌肉提取物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，其中進一步包括藥學上可接受的載體和賦形劑。
12.權(quán)利要求1方法制備的蚌肉提取物在制備治療腫瘤藥物中的應用。
13.權(quán)利要求1方法制備的蚌肉提取物在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從蚌肉中制備抗腫瘤和鎮(zhèn)痛活性成分方法以及含有蚌肉提取物的藥物組合物，本發(fā)明還涉及蚌肉提取物在制備抗腫瘤藥物和鎮(zhèn)痛藥物中的應用。將新鮮的蚌肉組織切成小塊，加入防腐劑進行防腐處理后，調(diào)節(jié)pH至2.8～3.9進行酸化處理，將酸化后的材料在恒溫下放置一段時間，使蚌肉組織進行酶解自溶，收集自溶后的液體進行離心純化，即獲得本發(fā)明的蚌肉提取物。由該方法獲得的蚌肉提取物具有較高的抗腫瘤和鎮(zhèn)痛活性，其在體外和動物體內(nèi)均表現(xiàn)出較高的抑制腫瘤細胞生長、抗炎及增強腹腔巨噬細胞吞噬作用的活性，具有較好的鎮(zhèn)痛作用，沒有成癮性，而且毒性較低。
文檔編號A61P35/00GK1517099SQ0315017
公開日2004年8月4日 申請日期2003年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月8日
發(fā)明者李文新, 王在民 申請人:李文新, 王在民