專利名稱：一種結(jié)核桿菌核酸疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疫苗，特別涉及一種結(jié)核桿菌核酸疫苗。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是一種人、畜共患的慢性消耗性傳染病。隨著愛滋病患者人數(shù)的增加、抗藥性菌株的產(chǎn)生等，結(jié)核病的發(fā)病率有逐年增加的趨勢(shì)。國外有關(guān)資料報(bào)導(dǎo)，目前世界上約有10-20億人口感染有結(jié)核桿菌，每年大約有3百萬人死于結(jié)核病，同時(shí)又有1000萬新病例出現(xiàn)。我國目前有上億人感染有結(jié)核分枝桿菌，結(jié)核病患者約600萬人，每年因治療不及時(shí)造成死亡的人數(shù)約25.6萬余人。如果不盡快改進(jìn)結(jié)核病的控制措施，將有2億多人發(fā)展成活動(dòng)性肺結(jié)核。牛結(jié)核是家畜的一種慢性傳染病且能傳染給人。人、畜結(jié)核病的交叉?zhèn)鞑ナ窃斐山Y(jié)核病廣泛流行的重要原因。如果奶?；加薪Y(jié)核病，不但影響泌乳量和乳的營養(yǎng)成份，而且可通過各種途徑傳染給人。
自Calmette和Guerin研究出卡介苗(BCG)之后，人類已將致弱的卡介苗用于預(yù)防結(jié)核病的感染。但卡介苗在世界許多地方使用效果不佳，尤其對(duì)成人的保護(hù)力容易喪失。對(duì)不同人群的保護(hù)效率不一致，一般為0-85％。因此，研制更全面有效的新疫苗是控制結(jié)核病的重要途徑。基因工程技術(shù)為重組亞單位疫苗以及DNA疫苗的發(fā)展提供了一條新途徑，其中DNA疫苗兼有重組亞單位疫苗的安全性和減毒活疫苗誘導(dǎo)全面免疫應(yīng)答的高效力，已成為疫苗研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)之一(Bonato V L D，Lima V M F，Tascon R E，et al.Identification and Characterization of Protective T Cellsin hsp64 DNA-Vaccinated and Mycobacterium tuberculosi-Infected Mice.Infect.Immun.1998，66169-175)。
研究表明，結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生并誘導(dǎo)CD4+和CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。在結(jié)核病感染實(shí)驗(yàn)過程中，病人淋巴細(xì)胞早期識(shí)別的主要是一些分泌性蛋白，如Ag85復(fù)合體分布于大部分分枝桿菌中，其中Ag85B具有分枝酸轉(zhuǎn)移酶的活性，與分枝桿菌細(xì)胞壁的合成有關(guān)，并與人纖維連接蛋白結(jié)合后參與致病過程，在分枝桿菌分泌蛋白中含量占居首位，在一系列純化抗原試驗(yàn)中，該抗原的抗原性最強(qiáng)。MPT-83是一個(gè)附著在細(xì)胞表面促使抗原決定基暴露的脂化糖基化的蛋白(Wiker H G，uptyuioiloii S，Hewinson R G，Russell W P，andHarboe M.Heterogenous expression of the related MPB70 and MPB83 proteinsdistinguish various substrains of Mycobacterium bovis BCG and Mycobacteriumtuberculosis H37Rv.Scand J.Immunol.1996，43374-380)。該蛋白還是一個(gè)從感染了M.bovis的牛身上發(fā)現(xiàn)的sero-dominant抗原，并且只在感染的T淋巴細(xì)胞內(nèi)可以檢測(cè)到，而在BCG免疫過的動(dòng)物細(xì)胞中檢測(cè)不到(O’Loan C J，Pollock J M，Hanna J，and Neill S D.Immunoblot analysis of humoral immune responses toMycobacterium bovis in experimentally infected cattleearly recognition ofa 26-kilodalton antigen.Clin.Diagn.Lab.Immunol.1994，1608-611；Vordermeier H M，Cockle P C，Whelan A，Rhodes S，Palmer N，Bakker D，and HewinsonR G.Development of diagnostic reagents to differentiate between Mycobacteriumbovis BCG vaccination and M.bovis infection in cattle.Clin.Diagn.Lab.Immunol.1999，6675-682)。ESAT-6是結(jié)核分枝桿菌早期分泌的一種小分子量蛋白，只存在于人型結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌中，BCG中缺少該抗原的編碼基因。最新的研究證明，ESAT-6不僅是抗結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞免疫應(yīng)答的主要配體，還是效應(yīng)性T細(xì)胞的主要靶抗原之一，可刺激感染結(jié)核病的小鼠釋放γ-干擾素。因此，編碼這些蛋白的基因已成為核酸疫苗的首選對(duì)象。
國外有關(guān)結(jié)核分枝桿菌核酸疫苗的研究報(bào)道很多。1994年，Lowrie等人以麻風(fēng)分枝桿菌65kDa熱休克蛋白基因DNA疫苗免疫小鼠，結(jié)果表明DNA疫苗與卡介苗有相似的保護(hù)作用(Lowrie D B，Tascon R E，Colston M J，et al.Towards a DNAvaccine against tuberculosis.Vaccine，1994，121537-1540)。
1996年，Huygen等人制備了Ag85 DNA疫苗，經(jīng)Ag85 DNA疫苗免疫的鼠產(chǎn)生了體液和細(xì)胞應(yīng)答并獲得了明顯的保護(hù)(Huygen K，Content J，Denis O，et al.Immunogenicity and protective efficacy of a tuberculosis DNA vaccine.Nat.Med.1996，2893-897)。
1999年，Kamath等人將含結(jié)核分枝桿菌MPT64，Ag85B和ESAT-6基因克隆到載體pJW4303中，制備成DNA疫苗免疫鼠，結(jié)果表明Ag85B免疫效果最佳，其次為ESAT-6，MPT64為未知。3種DNA疫苗聯(lián)合免疫效果更強(qiáng)(Kamath A T，F(xiàn)eng C G，Macdonald M，et al.Differential Protective efficacy of DNA Vaccines Expressing SecretedProteins of Mycobacterium tuberculosis.Infect.Immun.1999，671702-1707)。
1999年，Zhong M等人用編碼ESAT-6，MPT-83，KatG或HBHA蛋白的DNA疫苗，實(shí)驗(yàn)證明它們均誘導(dǎo)特異性體液免疫，產(chǎn)生大量的r-干擾素并具有明顯保護(hù)應(yīng)答(ZhongM，Howard A，Kelley C，et al.Immunogenicity of DNA Vaccines ExpressingTuberculosis Proteins Fused to Tissue Plasminogen Activator Signal Sequences.Infect.Immun.1999.674780-4786)。
2000年，Morris對(duì)單價(jià)和多價(jià)結(jié)核桿菌DNA疫苗投放后的免疫應(yīng)答進(jìn)行了評(píng)價(jià)。單價(jià)DNA疫苗包括編碼MPT-63和MPT-83的DNA疫苗，多價(jià)聯(lián)合DNA疫苗包括ESAT-6，MPT-83，MPT-63，KatG，結(jié)果表明多價(jià)聯(lián)合DNA疫苗比活苗BCG誘導(dǎo)的保護(hù)更為強(qiáng)烈(Morris S，Kelley C，Howard A，et al.The immunogenicity of singleand combination DNA vaccines against tuberculosis.Vaccine.2000，182155-2163)。
2000年，Vordermeier等用分枝桿菌抗原MPT70，MPT83，Ag85-A DNA疫苗對(duì)牛進(jìn)行免疫，結(jié)果表明MPT83 DNA免疫?？烧T導(dǎo)CD4+細(xì)胞應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答(Vordermeier H M，Cockle P J，Whelan A O，et al.Effective DNA vaccinationof cattle with the mycobacterial antigens MPB83 and MPB70 does not compromisethe specificity of the comparative intradermal tuberculin skintest.Vaccine，2000，191246-1255)。
雖然國內(nèi)外對(duì)結(jié)核分枝桿菌核酸疫苗的開發(fā)做了大量的研究，但所獲得的核酸疫苗保護(hù)力還不夠高。2001年，范雄林等報(bào)道了結(jié)核分枝桿菌Ag85B分泌蛋白單基因疫苗特異性抗體滴度僅為1∶200(范雄林，徐志凱，李元，等結(jié)核分枝桿菌Ag85B分泌蛋白基因疫苗的構(gòu)建和免疫原性的研究，中華結(jié)核和呼吸雜志，2001，24548-550)。2001年，游力等報(bào)道的結(jié)核分枝桿菌Ag85B分泌蛋白單基因疫苗第三次免疫45天的特異性抗體滴度為1∶100 000(游力，趙躍然，高春義等，結(jié)核分枝桿菌Ag85B DNA疫苗的構(gòu)建及其免疫作用的研究。中華結(jié)核和呼吸雜志，2001，24736-739)。研制更全面有效的新核酸疫苗對(duì)有效控制結(jié)核病的傳播和流行具有重要的意義。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種具有較好免疫原性的結(jié)核桿菌核酸疫苗。
本發(fā)明所提供的結(jié)核桿菌核酸疫苗，是將Ag85B、MPT-83和ESAT-6基因或所述Ag85B、MPT-83和ESAT-6三個(gè)基因分別與其它核酸序列融合或缺失部分序列或部分核苷酸突變后的且可編碼與Ag85B、MPT-83和ESAT-6具有相同活性蛋白的核苷酸序列，分別克隆到真核表達(dá)載體中，將得到的至少兩種表達(dá)載體進(jìn)行聯(lián)合形成的混合物。上述疫苗中還含有佐劑DDA，MPL，Quil-A，RIBI adjuvant和/或saline或其它佐劑，如鋁佐劑，福氏佐劑。該疫苗中聯(lián)合多價(jià)結(jié)核桿菌核酸疫苗與DDA的重量份數(shù)比可為5∶6，聯(lián)合多價(jià)結(jié)核桿菌核酸疫苗在saline中的濃度可為1mg/ml。
其中，所述表達(dá)載體含有啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子可為pJW4303帶有的巨細(xì)胞病毒(CMV)早期基因啟動(dòng)子或其它真核表達(dá)啟動(dòng)子，如老鼠看家基因的啟動(dòng)子。
上述結(jié)核桿菌核酸疫苗可為將Ag85B、MPT-83和ESAT-6基因分別克隆到真核表達(dá)載體pJW4303后并將表達(dá)產(chǎn)物聯(lián)合而成的多價(jià)結(jié)核桿菌核酸疫苗；其中，該結(jié)核桿菌核酸疫苗為相同重量份數(shù)比的Ag85B、MPT-83和ESAT-6表達(dá)載體聯(lián)合而成的多價(jià)結(jié)核桿菌核酸疫苗。
本發(fā)明的結(jié)核桿菌核酸疫苗可用于預(yù)防和/或治療動(dòng)物結(jié)核病特別是預(yù)防和/或治療人、牛、羊結(jié)核病。
三個(gè)基因的基因Bank收錄號(hào)分別為Ag85BX62398；MPT-83X94579；ESAT-6X79562。
動(dòng)物表達(dá)載體pJW4303，其物理圖譜如圖6所示，帶有巨細(xì)胞病毒(CMV)早期基因啟動(dòng)子，是保證目的基因在肌肉細(xì)胞中高效轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)啟動(dòng)子。該載體還帶有組織血纖維蛋白溶酶原激活劑的胞外分泌信號(hào)序列，定向克隆在這一信號(hào)序列下游的外源基因產(chǎn)物能被成功地分泌到胞外，增加了抗原與巨噬細(xì)胞的接觸機(jī)會(huì)，加速了依賴于蛋白酶體的內(nèi)源性合成抗原的降解，導(dǎo)致體內(nèi)誘導(dǎo)的細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答增強(qiáng)。此外，pJW4303含有11個(gè)CpG序列，在DNA疫苗誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答中起重要作用，可在無T細(xì)胞存在的情況下直接激活B細(xì)胞，刺激分泌免疫球蛋白及白細(xì)胞介素6，也可直接激活單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞，上調(diào)共刺激分子的表達(dá)，有利于產(chǎn)生多種Th1型細(xì)胞因子，提高了保護(hù)性免疫力。
本發(fā)明將編碼結(jié)核分枝桿菌Ag85B、MPT-83和ESAT-6分泌蛋白的結(jié)構(gòu)基因或包括信號(hào)肽的全基因序列定向克隆到真核表達(dá)載體pJW4303中，轉(zhuǎn)化到TOP10大腸桿菌，提取質(zhì)粒DNA經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶鑒定及序列分析證實(shí)含有正確的上述三種分泌蛋白的結(jié)構(gòu)基因(包括信號(hào)肽)全序列。用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將重組表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入COS7細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，收集表達(dá)細(xì)胞或濃縮上清液，12％或15％的SDS-PAGE電泳分離，用結(jié)核桿菌特異性抗體進(jìn)行免疫印跡雜交，證明上述三種重組質(zhì)粒能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)出特異蛋白。三種重組表達(dá)質(zhì)粒與saline或(dimethyldioctyldecyl ammoniumbromide)DDA同時(shí)肌注免疫小鼠導(dǎo)致Ag85B、MPT-83和ESAT-6的特異性IgG抗體反應(yīng)水平顯著提高。用DNA疫苗免疫過的小鼠能夠產(chǎn)生對(duì)結(jié)合桿菌有效而長(zhǎng)期的免疫性并激發(fā)顯著的Th1 cytokine反應(yīng)。免疫小鼠與三個(gè)純化抗原相應(yīng)答的脾臟T細(xì)胞來源的Th1型γ-干擾素(IFN-γ)水平與對(duì)照組相比有了顯著提高。通過測(cè)定在肺臟相對(duì)CFU數(shù)量發(fā)現(xiàn)，在saline或DDA中形成的核酸疫苗提高了小鼠抗結(jié)核桿菌H37Rv的保護(hù)效率。經(jīng)聯(lián)合DNA疫苗免疫過的小鼠對(duì)肺臟和脾臟內(nèi)結(jié)核菌的生長(zhǎng)有抑制。組織病理學(xué)分析顯示免疫小鼠大大提高了感染后肺部病理狀況。攻毒56天后計(jì)算出的DNA疫苗組存活率為100％，而對(duì)照組為0％。本發(fā)明不僅增強(qiáng)了免疫動(dòng)物的肌體體液應(yīng)答反應(yīng)，同時(shí)增強(qiáng)了細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，而后者是提高DNA疫苗效率的重要前提條件。
與活的BCG疫苗和亞單位疫苗相比較，本發(fā)明的結(jié)核桿菌核酸疫苗還具有其他潛在優(yōu)點(diǎn)容易生產(chǎn)，穩(wěn)定性強(qiáng)，較安全，不引起結(jié)核菌素的敏感反應(yīng)。此外，核酸疫苗可免疫HIV免疫缺陷的病人，而BCG疫苗卻不能用于這種病人。從免疫小鼠的肺部載菌量來看，本發(fā)明的結(jié)核桿菌核酸疫苗的保護(hù)效率要高于卡介苗，表明本發(fā)明的疫苗可以取代傳統(tǒng)的卡介苗用于結(jié)核病的預(yù)防。本發(fā)明的結(jié)核桿菌核酸疫苗與現(xiàn)有的結(jié)核桿菌核酸疫苗的不同之處在于本發(fā)明的結(jié)核桿菌核酸疫苗免疫小鼠后，由于使用了含信號(hào)肽的高效表達(dá)載體，確保了抗原高效持續(xù)表達(dá)并分泌到胞外。本發(fā)明所用的佐劑DDA大大提高了疫苗的保護(hù)效率。由本發(fā)明對(duì)小鼠的免疫效果可推斷，本發(fā)明的結(jié)核桿菌核酸疫苗顯著提高了對(duì)動(dòng)物的保護(hù)效率，對(duì)大型動(dòng)物(如牛、羊等)的保護(hù)效率也必定高于以前報(bào)導(dǎo)的核酸疫苗保護(hù)效率。如果用該核酸疫苗免疫牛，必將大大減少?；冀Y(jié)核的機(jī)率，保證牛肉及牛奶的產(chǎn)量和質(zhì)量。如果用該核酸疫苗免疫人，不但能讓人體產(chǎn)生對(duì)結(jié)核桿菌的免疫力，而且不會(huì)發(fā)生結(jié)核菌素的敏感反應(yīng)，增強(qiáng)了疫苗的安全性?？傊?，本發(fā)明對(duì)提高動(dòng)物及人類對(duì)結(jié)核桿菌的免疫力，更有效地控制結(jié)核病的傳播和流行，繁榮畜牧業(yè)及增強(qiáng)人類體質(zhì)具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。


圖1為重組質(zhì)粒pJW4303-Ag85B，pJW4303-MPT-83和pJW4303-ESAT-6的酶切分析電泳2A為含pJW4303空載體和含pJW4303-Ag85B表達(dá)載體的COS7細(xì)胞表達(dá)蛋白的Western blotting分析結(jié)果圖2B為含pJW4303空載體和pJW4303-MPT-83表達(dá)載體的COS7細(xì)胞表達(dá)蛋白的Western blotting分析結(jié)果圖2C為含pJW4303空載體和pJW4303-ESAT-6表達(dá)載體的COS7細(xì)胞表達(dá)蛋白的Western blotting分析結(jié)果圖3A為用空載體DNA免疫小鼠感染結(jié)核桿菌后肺臟組織的酸法快速細(xì)菌染色結(jié)果圖3B為BCG免疫小鼠感染結(jié)核桿菌后肺臟組織的酸法快速細(xì)菌染色結(jié)果圖3C為用saline作為佐劑的多價(jià)DNA疫苗免疫小鼠感染結(jié)核桿菌后肺臟組織的酸法快速細(xì)菌染色結(jié)果圖3D為用DDA作為佐劑的多價(jià)DNA疫苗免疫小鼠感染結(jié)核桿菌后肺臟組織的酸法快速細(xì)菌染色結(jié)果圖4A為用結(jié)核桿菌H37Rv靜脈攻毒8周后的pJW4303對(duì)照免疫小鼠肺臟組織的顯微照片(×10)圖4B為用結(jié)核桿菌H37Rv靜脈攻毒8周后的pJW4303對(duì)照免疫小鼠肺臟組織的顯微照片(×40)圖4C為用結(jié)核桿菌H37Rv靜脈攻毒8周后的在saline中的多價(jià)DNA疫苗免疫小鼠肺臟組織的顯微照片(×10)圖4D為用結(jié)核桿菌H37Rv靜脈攻毒8周后的在saline中的多價(jià)DNA疫苗免疫小鼠肺臟組織的顯微照片(×40)圖4E為用結(jié)核桿菌H37Rv靜脈攻毒8周后的在DDA中的多價(jià)DNA疫苗免疫小鼠肺臟組織的顯微照片(×10)圖4F為用結(jié)核桿菌H37Rv靜脈攻毒8周后的在DDA中的多價(jià)DNA疫苗免疫小鼠肺臟組織的顯微照片(×40)圖4G為用結(jié)核桿菌H37Rv靜脈攻毒8周后的BCG組免疫小鼠肺臟組織的顯微照片(×10)圖4H為用結(jié)核桿菌H37Rv靜脈攻毒8周后的BCG組免疫小鼠肺臟組織的顯微照片(×40)圖5A為結(jié)核桿菌H37Rv靜脈攻毒8周后對(duì)在saline中的多價(jià)DNA疫苗免疫小鼠肺臟目的基因表達(dá)的檢測(cè)圖5B為結(jié)核桿菌H37Rv靜脈攻毒8周后對(duì)在DDA中的多價(jià)DNA疫苗免疫小鼠肺臟目的基因表達(dá)的檢測(cè)圖5C為結(jié)核桿菌H37Rv靜脈攻毒8周后對(duì)空載體DNA對(duì)照免疫小鼠肺臟目的基因表達(dá)的檢測(cè)圖6動(dòng)物表達(dá)載體pJW4303的物理圖譜具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、真核表達(dá)載體的構(gòu)建用PCR方法擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)的Ag85B，MPT-83和ESAT-6基因并克隆到真核表達(dá)載體pJW4303上用于在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
真核表達(dá)載體構(gòu)建的基本步驟為(1)以常規(guī)方法提取的結(jié)核桿菌基因組DNA為模板，用PCR擴(kuò)增Ag85B，MPT-83和ESAT-6基因并定向克隆到pJW4303載體上的組織血纖維蛋白溶酶原激活劑(TPA)信號(hào)序列下游，形成融合蛋白。擴(kuò)增所用的引物序列如下Ag85B5’-AAATGGGGCACAGCTAGCCATATGACAGACGTGAGCC-3’，和5’-ACTAGGATCCTAAGCAACCTTCGGTTGATCCCGTCAGC-3’；
MPT-835’-ATTGCTAGCATGATCAACGTTCAG-3’，和5’-TATGGATCCCGA ACGTTACTGT-3’；ESAT-65’-CTATGCTAGCATGACAGAGCAGCAGTG-3’，和5’-ATATGGATCCGCCCTATGCGAACATCCC-3’。5’端引物都含Nhe I位點(diǎn)，3’端引物都含有BamH I位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后按QIAquick Gel Extraction Kit說明書操作回收，得到目的基因。
(2)分別用Nhe I和BamH I雙酶切經(jīng)凝膠純化的目的基因產(chǎn)物及pJW4303載體DNA，用T4DNA連接酶處理16h(16℃)，取5μl連接產(chǎn)物(總體積20μl)轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α菌株。挑取轉(zhuǎn)化菌單菌落抽提質(zhì)粒，Nhe I和BamH I雙酶切鑒定后進(jìn)行序列分析以證實(shí)插入片段序列是否正確。如圖1所示，電泳結(jié)果表明插入片段大小和酶切圖譜正確；圖1中，1為lambda DNA/Hind III+EcoR I雙酶切；2為pJW4303-ESAT-6經(jīng)Pst I單酶切；3為pJW4303-MPT-83經(jīng)Pst I單酶切；4為pJW4303-Ag85B經(jīng)Pst I酶切；5為pJW4303空載體經(jīng)Pst I單酶切；6為pJW4303-ESAT-6經(jīng)BamH I和Nhe I雙酶切；7為pJW4303-MPT-83經(jīng)BamH I和Nhe I雙酶切；8為pJW4303-Ag85B經(jīng)BamH I和Nhe I雙酶切；9為pJW4303空載體經(jīng)BamH I和Nhe I雙酶切。
分別選取3個(gè)含有不同目的基因表達(dá)載體的菌株進(jìn)行DNA序列分析，以獲取帶有正確讀碼框的表達(dá)載體。將含有正確讀碼框的重組載體轉(zhuǎn)化到TOP10大腸桿菌中，在含Amp(100μg/ml)的瓊脂中再次篩選重組菌株，用QIAGEN Plasmid Maxi Kit和MegaKit大量制備質(zhì)粒DNA，用滅菌生理鹽水稀釋成濃度為1-2μg/μl，紫外分光光度計(jì)定量。
實(shí)施例2、重組蛋白在原核與真核細(xì)胞中的表達(dá)(1)三種結(jié)核桿菌重組蛋白的制備與純化把得到的Ag85B，MPT-83和ESAT-6基因分別克隆到原核表達(dá)載體pET-22質(zhì)粒中在大腸桿菌中表達(dá)，在變性條件下用Ni親和法純化三種帶有多聚組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白。
(2)將COS7細(xì)胞生長(zhǎng)在25cm2含高濃度葡萄糖的Dulbecco’s改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)瓶中，加入10％熱滅活胎牛血清(FCS)，青霉素100U/ml，鏈霉素100μg/ml，置37℃ 5％CO2孵育箱中，待細(xì)胞培養(yǎng)瓶中細(xì)胞長(zhǎng)至80-100％匯合，吸出培養(yǎng)液，用1×PBS洗滌，加0.25％的胰酶0.25ml，置37℃ 2-3min后，傾去消化液，加入含10％的FCS的培養(yǎng)基10ml充分吹打，使細(xì)胞充分分散和懸浮，每瓶細(xì)胞分至5個(gè)35mm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)12-24h后，觀察細(xì)胞長(zhǎng)至50-60％匯合，用DMEM將質(zhì)粒稀釋至適當(dāng)濃度，將稀釋的DNA和稀釋的LipoFectin混合，混合液同細(xì)胞感染5h，將含LipoFectin培養(yǎng)基棄掉，加2ml完全培養(yǎng)基，細(xì)胞再溫育24-48h，PBS洗滌兩次，收集細(xì)胞，上清用10％三氯乙酸沉淀，用9倍量的丙酮洗滌，細(xì)胞和沉淀物懸浮在SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳載樣緩沖液中。
(3)重組蛋白表達(dá)的免疫印跡(Western blotting)分析。將凝膠上的蛋白通過電轉(zhuǎn)移裝置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(NC)膜上。電轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將NC膜放入封閉液中室溫下封閉2h，用1×PBS漂洗3次，每次10min；再將NC膜放入雜交袋內(nèi)，加入1∶25或1∶50稀釋的結(jié)核桿菌單抗血清或羊抗H37Rv菌株的菌體免疫羊的陽性血清5ml，封口后室溫下緩慢振蕩過夜，同前洗膜3次，加入1∶2000稀釋的HPR-標(biāo)記二抗，37℃溫育1h；同前洗膜3次，加入預(yù)先混合底物液，室溫顯色至適當(dāng)將NC膜轉(zhuǎn)移至蒸餾水中終止反應(yīng)。結(jié)果如圖2A-C所示，表明真核細(xì)胞COS7中能表達(dá)上述三種基因編碼的蛋白質(zhì)，SDS凝膠中出現(xiàn)了能與結(jié)核桿菌特異性抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，相對(duì)分子質(zhì)量分別為30，26和6kDa的蛋白質(zhì)，有空表達(dá)載體的菌株中沒有檢測(cè)到相應(yīng)的條帶。進(jìn)一步的分析表明，重組質(zhì)粒不僅成功地在COS7中得到表達(dá)，帶有信號(hào)肽序列的結(jié)核分枝桿菌結(jié)構(gòu)基因還能被順利地分泌到胞外培養(yǎng)液中。
實(shí)施例3、用多價(jià)DNA疫苗免疫模型動(dòng)物以檢測(cè)DNA疫苗的保護(hù)效率。
(1)多價(jià)DNA疫苗對(duì)模型動(dòng)物的免疫。對(duì)C57BL/6鼠進(jìn)行免疫，疫苗組合為Ag85B、MPT-83和ESAT-6三聯(lián)苗。250μg DDA(ICN Biomedicals，Aurora，美國)加熱到80℃使膠束形成，冷卻到室溫后與300μg編碼三種抗原的質(zhì)粒DNA(每種質(zhì)粒100μg)混合。300μg編碼三種抗原的質(zhì)粒DNA(每種質(zhì)粒100μg)在saline中的濃度為1mg/ml。全部疫苗被分成4個(gè)相等的部分，注射入每條后腿的tibialisanterior肌肉內(nèi)。對(duì)照小鼠用空載體pJW4303進(jìn)行免疫。小鼠連續(xù)免疫三次，每次間隔3周。
(2)酶聯(lián)免疫試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)免疫小鼠的特異性抗體。小鼠首免后21天，二免后21天和三免后21天眼球分別采血，分離血清。3只免疫小鼠的血清等量混合后，從1∶25開始2倍系列稀釋后用于檢測(cè)，ESAT-6、MPT-83和Ag85B重組抗原用包被液(0.05mol/LpH9.6碳酸鹽緩沖液)稀釋至10μg/ml，分別加入96孔酶標(biāo)板(NUNC)，100μl/每孔，4℃過夜，用洗滌液(PBS/Tween0.05％)洗滌3次。每孔加入200μl封閉液(5％脫脂奶粉PBS-Tween 0.05％)，置37℃恒溫箱封閉60min，按上法洗滌3次。加待測(cè)血清，陰性血清(正常小鼠)及稀釋液，取不同稀釋度的待測(cè)血清，陰性血清及稀釋液(PBS/Tween)各100μl加入孔中，置37℃恒溫箱2h，反復(fù)洗滌3次。加酶標(biāo)抗體HRP-抗體(1∶2000稀釋抗抗體)，每孔加100μl，置37℃溫育2h，洗滌3次，用TMB(四甲基聯(lián)苯胺二鹽酸)顯色后，測(cè)波長(zhǎng)450nm吸光度(A)。以正常鼠血清相對(duì)應(yīng)稀釋度作為陰性對(duì)照，吸光度值0.05以上、A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組或陰性組≥2.1為陽性。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。三價(jià)結(jié)核桿菌核酸疫苗第一次免疫后21天，對(duì)小鼠血清中三種結(jié)核桿菌抗原蛋白的抗體滴度進(jìn)行分析。用多價(jià)核酸疫苗免疫過的小鼠產(chǎn)生了強(qiáng)烈的抗體應(yīng)答。用DDA處理的DNA疫苗免疫小鼠，特異性IgG抗體滴度在第一、第二和第三次注射后分別上升到3200、51200和204800。而用溶于saline中的相同DNA疫苗免疫小鼠產(chǎn)生的特異性抗體應(yīng)答顯著降低，分別為400、12800和25600。而作為負(fù)對(duì)照的空載體DNA免疫組在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中未檢測(cè)到特異性抗體的產(chǎn)生。因?yàn)橄鄬?duì)的IgG1和IgG2a抗體水平是總T細(xì)胞表型的標(biāo)志，所以同時(shí)檢測(cè)了免疫小鼠血清樣品中二者的水平。與saline和與DDA組合的DNA疫苗造成了大致相同的免疫后IgG1和IgG2a滴度，提示重組DNA疫苗誘導(dǎo)了一個(gè)混合的T細(xì)胞表型。
表1.使用saline和佐劑DDA輔助的多價(jià)DNA疫苗免疫C57BL/6小鼠后誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答而產(chǎn)生的特異性抗體疫苗+ 總抗體IgG IgG1IgG2a方式1st2nd3rd3rd 3rdDNA-saline 40012800 2560012800 6400DNA-DDA 3200 51200 204800 12800 6400a.將三種小鼠經(jīng)一免，二免和三免三周后的血清進(jìn)行抗原特意性抗體產(chǎn)量分析。只有第三次免疫三周后的樣品被用于IgG1和IgG2a分析。三個(gè)抗原在兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)了相同的抗體滴度。用空載體DNA免疫的小鼠沒有產(chǎn)生特異性抗體。
(3)采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)免疫小鼠的細(xì)胞因子γ-干擾素水平。具體操作步驟如下1)細(xì)胞因子γ-干擾素的誘導(dǎo)。第三次接種DNA疫苗后的3周，宰殺免疫小鼠，無菌分離脾臟，用3只混合鼠的脾臟進(jìn)行分析。脾細(xì)胞的濃度調(diào)整在4×106/ml，細(xì)胞培養(yǎng)在圓底培養(yǎng)板中(NUNC)，培養(yǎng)液含L-谷氨酰胺，10％熱滅活胎牛血清，50μM/ml 2-巰基乙醇和100u/ml青鏈霉素制備而成的完全培養(yǎng)基RPM1-1640。在180μl的細(xì)胞懸液中加入20μl的重組純化蛋白，終濃度為5μg/ml，在5％CO2培養(yǎng)箱中37℃溫育72h，收集3個(gè)孔/每種的上清混合液于-20℃保存。
2)γ-干擾素的測(cè)定。抗γ-干擾素鼠抗體(clone R4-6A2)用包被液(0.05mol/LpH9.6碳酸鹽緩沖液)稀釋至10μg/ml，分別加入96孔酶標(biāo)板(NUNC)，每孔加100μl，加蓋置4℃過夜，用洗滌液(PBS/Tween 0.05％)洗滌3次。封閉液封閉60min，加待測(cè)的經(jīng)抗原刺激的免疫鼠的脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液(1∶2、1∶4、1∶8、1∶16等)，各100μl/每孔，置37℃恒溫箱1-2h，洗滌3次。加入生物素化的抗γ-干擾素的鼠抗體(XMG1-2)1μg/ml每孔加100μl 37℃溫育1-2h，洗滌3次。加入HRP-親合素結(jié)合體(1∶1000稀釋抗抗體)100μl/每孔，置37℃溫育1h，洗滌3次。每孔加入TMB應(yīng)用液100μl顯色、測(cè)波長(zhǎng)450nm吸光度(A)。以正常鼠血清相對(duì)應(yīng)稀釋度作為陰性對(duì)照，吸光度值0.05以上、A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組或陰性組≥2.1為陽性。然后取Log2為底的對(duì)數(shù)按公式(Log2＝1相當(dāng)于110pg/ml)換算成濃度。
結(jié)果如表2所示，表明用DDA溶解的DNA疫苗免疫小鼠后的脾臟細(xì)胞被誘導(dǎo)的γ-干擾素水平從18410到20610pg/ml，比空載體對(duì)照組的水平高出100倍還多。而用saline溶解的DNA疫苗免疫的小鼠γ-干擾素水平是從2570到9970pg/ml，用BCG免疫的小鼠γ-干擾素水平是2350pg/ml。
表2.不同DNA疫苗、BCG及空載體DNA處理后C57BL/6小鼠中IFN-γ干擾素水平分析疫苗+IFN-γ干擾素水平(pg/ml)a方式 Ag85B ESAT-6 MPT-83多價(jià)DNA疫苗9970±330 2570±10 6280±150-saline多價(jià)DNA疫苗18410±200 20220±520 20610±370-DDABCG 2350±370(PPDb)空載體對(duì)照-saline ≤125 ≤125≤125a.用不同的DNA疫苗、BCG或空載體DNA三免后第21天，三只小鼠的脾臟混合并用ELISA方法測(cè)定細(xì)胞中的抗原特異性IFN-γ。
b.來源于BCG免疫小鼠脾臟的培養(yǎng)物經(jīng)PPD-B刺激后進(jìn)行IFN-γ測(cè)定。
(4)結(jié)核桿菌攻毒實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DNA疫苗對(duì)小鼠的保護(hù)效率。
1)結(jié)核桿菌攻毒實(shí)驗(yàn)。在最后一次注射DNA疫苗的8周后，用106CFU的結(jié)核桿菌H37Rv從側(cè)尾靜脈對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒。在8周后殺死小鼠，勻漿后的肺臟組織經(jīng)過10倍系列梯度稀釋后涂板到Lowenstein-Jensen培養(yǎng)基上培養(yǎng)。4周后對(duì)克隆進(jìn)行計(jì)數(shù)。用1×107CFU的BCG免疫過的小鼠同樣接受攻毒用于比較。
結(jié)果如表3所示，表明與空載體對(duì)照組相比較，三個(gè)免疫組在肺臟中的細(xì)菌克隆數(shù)減少了1-2個(gè)數(shù)量級(jí)。表中數(shù)據(jù)清楚地表明用DDA溶解的聯(lián)合DNA疫苗具有比其它疫苗更好的保護(hù)效果。
表3.不同疫苗及空載體DNA對(duì)靜脈攻毒后實(shí)驗(yàn)小鼠肺臟的保護(hù)效率分析(以存活細(xì)菌數(shù)為指標(biāo))疫苗CFU±SD/organa對(duì)照DNA (3.39±1.84)×108M.bovis BCG (5.89±2.00)×107多價(jià)DNA疫苗-saline (2.63±0.72)×107*b多價(jià)DNA疫苗-DDA (1.26±1.05)×106**a.用106CFU的結(jié)核桿菌H37Rv經(jīng)尾部側(cè)靜脈攻毒后8周的小鼠肺臟和脾臟內(nèi)結(jié)核菌數(shù)量。小鼠(n＝5-7)是在DNA疫苗三免8周后進(jìn)行攻毒。
b.統(tǒng)計(jì)顯著性*P＜0.05；**，P＜0.01.
2)組織病理學(xué)分析。肺臟組織灌注并用10％的多聚甲醛(PBS配制)固定后包埋在石蠟中切片。組織切片用蘇木精和曙紅試劑染色，或用Ziehl-Neelsen acid-fast染色(甲醇固定，熱carbol-fuchsin處理10分鐘，3％HCl在95％中處理30s，再于1％的亞甲基藍(lán)中30s)，光學(xué)顯微鏡下觀測(cè)分析。每組取5只小鼠分析。
結(jié)果如圖3A-C(×100)所示，表明被免疫了空載體DNA的小鼠肺部分布有許多的acid-fast細(xì)菌顆粒，而受到疫苗免疫的動(dòng)物肺部acid-fast染色顆粒大大減少。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，肺部病理學(xué)程度與呈現(xiàn)在組織中的細(xì)菌數(shù)量有很好的相關(guān)性。與BCG免疫組相比，與DDA組合或與saline組合的核酸疫苗所免疫的動(dòng)物肺部切片都顯示出更少的acid-fast染色顆粒。
為了研究免疫小鼠和對(duì)照小鼠在攻毒后肺部病理學(xué)的情況，把用于檢測(cè)CFU細(xì)菌的組織切片經(jīng)過處理進(jìn)行H&E染色。結(jié)果如圖4A-H所示。圖4A和B表明，作為對(duì)照的空載體DNA組中，50％以上的肺部軟組織都受到損害，并且肉芽瘤產(chǎn)生中心干酪樣病變及分散的淋巴細(xì)胞滲透與上皮樣巨噬細(xì)胞混合(epithelioid macrophages)，從而表明肺的功能已經(jīng)被大大削弱。圖4C和D表明，接種了溶于saline的聯(lián)合核酸疫苗的免疫動(dòng)物，齒槽組織(alveolar tissue)看上去是完整的，并可見輕微的齒槽炎。廣泛的淋巴細(xì)胞滲透現(xiàn)象在高倍鏡下可以見到。圖4E和F表明，當(dāng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被接種上DDA輔佐的聯(lián)合核酸疫苗，可以觀察到最少量的固化組織和大量的淋巴細(xì)胞。圖4G表明，在BCG免疫組，沒有觀察到干酪樣病變，齒槽組織正常，只有一小部分的肺部軟組織固化。圖4H表明，在高倍鏡下觀察到一個(gè)多核巨細(xì)胞。因此，數(shù)據(jù)顯示，與接種空載體的對(duì)照相比，接種溶于DDA的聯(lián)合核酸疫苗的小鼠能更有效地在感染部位補(bǔ)充淋巴細(xì)胞。
3)免疫組化染色。將組織切片在3％內(nèi)源過氧化物酶阻斷劑中處理10分鐘。PBS潤洗后，在含有1.5％正常封閉血清并用PBS按1∶10稀釋過的抗結(jié)核桿菌H37Rv的羊多克隆抗體溶液中4℃溫育2h。用PBS洗滌5min，重復(fù)3次。然后將切片在生物素化的(biotinylated)兔抗羊IgG(DakoCytomation，Glostrup，Denmark)中30min。用PBS洗滌5min，重復(fù)3次，加入底物DAB(3，3’-Diaminobenzidine，Sigma-Aldrich，St.Louis，USA)直到顯現(xiàn)滿意的染色效果(30秒到幾分鐘)。
結(jié)果如圖5A-C(目鏡放大倍率都為×100)所示。圖5A-B表明，肺部巨噬細(xì)胞的胞質(zhì)中有明顯的藍(lán)色信號(hào)。這些結(jié)果顯示重組DNA至少在最后一次免疫后的16周內(nèi)已經(jīng)表達(dá)。圖5C表明免疫了pJW4303 DNA的對(duì)照小鼠沒有觀察到顏色反應(yīng)，這與在這些小鼠中沒有免疫反應(yīng)的結(jié)果相一致。
4)統(tǒng)計(jì)分析。用Graph Pad InStat程序?qū)Y(jié)核桿菌數(shù)量、cytokinedeterminations和所有生存數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和評(píng)價(jià)。
如表4所示，在56天的觀察過程中，無論組合了DDA還是saline的聯(lián)合核酸疫苗，都有效地控制了感染，使得小鼠存活率達(dá)到100％。相反，免疫了空載體的對(duì)照小鼠56天后的存活率僅為14.3％(1/7)(平均23天后死亡)。BCG疫苗所免疫的小鼠56天后成活率為80％。
表4.免疫小鼠經(jīng)結(jié)核桿菌攻毒后的存活率。

a.半致死時(shí)間。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)核桿菌核酸疫苗，是將Ag85B、MPT-83和ESAT-6基因或所述Ag85B、MPT-83和ESAT-6三個(gè)基因分別與其它核酸序列融合或缺失部分序列或部分核苷酸突變后的且可編碼與Ag85B、MPT-83和ESAT-6具有相同活性蛋白的核苷酸序列，分別克隆到真核表達(dá)載體中，將得到的至少兩種表達(dá)載體進(jìn)行聯(lián)合形成的混合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)核桿菌核酸疫苗，其特征在于所述疫苗中還含有佐劑DDA和/或saline。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的結(jié)核桿菌核酸疫苗，其特征在于所述結(jié)核桿菌核酸疫苗中聯(lián)合多價(jià)結(jié)核桿菌核酸疫苗與DDA的重量份數(shù)比為5∶6。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的結(jié)核桿菌核酸疫苗，所述結(jié)核桿菌核酸疫苗中聯(lián)合多價(jià)結(jié)核桿菌核酸疫苗在saline中的濃度為1mg/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)核桿菌核酸疫苗，其特征在于所述表達(dá)載體含有啟動(dòng)子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的結(jié)核桿菌核酸疫苗，其特征在于所述啟動(dòng)子為pJW4303帶有的巨細(xì)胞病毒(CMV)早期基因啟動(dòng)子。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)核桿菌核酸疫苗，其特征在于所述結(jié)核桿菌核酸疫苗為將Ag85B、MPT-83和ESAT-6基因分別克隆到真核表達(dá)載體pJW4303后并將表達(dá)產(chǎn)物聯(lián)合而成的多價(jià)結(jié)核桿菌核酸疫苗。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的結(jié)核桿菌核酸疫苗，其特征在于所述結(jié)核桿菌核酸疫苗為相同重量份數(shù)比的Ag85B、MPT-83和ESAT-6的表達(dá)載體聯(lián)合而成的多價(jià)結(jié)核桿菌核酸疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種結(jié)核桿菌核酸疫苗，其目的是提供一種具有較好免疫原性的結(jié)核桿菌核酸疫苗。本發(fā)明所提供的結(jié)核桿菌核酸疫苗，是將Ag85B、MPT－83和ESAT－6基因或所述Ag85B、MPT－83和ESAT－6三個(gè)基因分別與其它核酸序列融合或缺失部分序列或部分核苷酸突變后的且可編碼與Ag85B、MPT－83和ESAT－6具有相同活性蛋白的核苷酸序列，分別克隆到真核表達(dá)載體中，將得到的至少兩種表達(dá)載體進(jìn)行聯(lián)合形成的混合物。本發(fā)明所提供的結(jié)核桿菌核酸疫苗可用于預(yù)防和/或治療動(dòng)物結(jié)核病特別是預(yù)防和/或治療人、牛、羊結(jié)核病。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1579550SQ0315321
公開日2005年2月16日 申請(qǐng)日期2003年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月8日
發(fā)明者朱玉賢, 蔡宏 申請(qǐng)人:北京大學(xué)