專利名稱：一種人血小板代用品及其制備方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領域中一種人血小板代用品及其制備方法。
背景技術(shù)：
血小板在血栓形成與止血等多種生理、病理過程中是必不可少的，而血小板膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)在這一過程中起著重要作用。
血小板膜蛋白不僅具有一些生理受體，而且還在血小板之間起到傳遞信息的作用。此外血小板膜蛋白異常還會引起一些疾病，如巨血小板綜合征、血小板型血管性假血友病、血小板無力癥、血小板第3因子缺乏癥等(阮長耿，血小板疾病研究的進展，中華血液學雜志，22767，1983)。在血小板膜表面存在多種糖蛋白，此類糖蛋白主要包含GPIb，GPIIb，GPIIIa，GPIV，GPIX(李家增，賀石林，鴻利主編，血栓病學，科學出版社1998年)等，其中糖蛋白Ib中主要的糖為唾液酸、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺和N-乙酰葡萄糖胺，而麥胚凝集素(WGA)是麥胚中一種凝集細胞的蛋白質(zhì)，能專一結(jié)合N-乙酰葡萄糖胺(GLcNAc)和唾液酸(NANA)。血小板膜蛋白的生物化學分析是進行血小板細胞生物學研究的有力手段，但實際尚存在著如血小板膜的難溶性、膜蛋白提純困難等許多分析上的問題。
各種動物的血小板膜蛋白SDS-PAGE用考馬斯亮藍(Coomassie blue，CB)和過碘酸-Schiff(PAS)染色通?？梢缘玫?-3條蛋白區(qū)帶。但不同種屬的血小板糖蛋白組成有較大差異，其中以GP I(包括Ia、Ib、Ic)的差異最大，貓科動物包括獅、豹均無GP I，具有GP I的種屬其分子量亦差別較大，豬、豚鼠還有一些次要的糖蛋白區(qū)帶(蘇州醫(yī)學院血栓形成與止血研究組血小板糖蛋白的研究(I)，不同種屬血小板的聚丙烯酰胺凝膠電泳(II)，不同種族的血小板與單克隆抗體AN51和J15的反應性，蘇醫(yī)科研資料，35期28-29，1982)。
血小板粘附于血管內(nèi)皮下組織主要涉及三個因素GPIb，vWF(von willebandfactor)及內(nèi)皮下組織。
正常情況下血小板不能與血管內(nèi)皮組織結(jié)合，血管受損后，vWF首先結(jié)合于內(nèi)皮下膠原纖維，以致vWF發(fā)生構(gòu)型改變，此時血小板GPIb即與vWF結(jié)合，發(fā)揮粘附作用，同時釋放ADP，提高胞質(zhì)中鈣離子濃度，活化鈣離子依賴的GPIIb-IIIa，暴露出纖維蛋白原受體，一個纖維蛋白原可以同時和至少兩個GPIIb-IIIa結(jié)合使血小板之間形成蛋白橋鏈，導致血小板的黏附和聚集(周光紀，馬麗 綜述 巨型血小板綜合征的分子變異 國外醫(yī)學生理病理科學與臨床分冊200020(3)248-251)，形成白色血栓(Schade et al.Cytoplasmic Truncation of glycoprotein Iba weakens itsinteraction with von willeband factor and impairs celladhesion.Biochemistry，2003；42(7)2244-2251)。血小板膜糖蛋白IIb和IIIa(GPIIb-IIIa)、血漿纖維蛋白原和細胞外的鈣離子在血小板聚集過程中起重要作用；血小板膜糖蛋白Iba是vWF、凝血酶、P-選擇素、Mac-1、XII因子和高分子量激肽原的受體，是參與粘附作用的主要粘附受體(蘇州醫(yī)學院血栓形成與止血研究組血小板糖蛋白的研究(I)，不同種屬血小板的聚丙烯酰胺凝膠電泳(II)，不同種族的血小板與單克隆抗體AN51和J15的反應性，蘇醫(yī)科研資料，35期28-29，1982)。
各種誘導劑與血小板膜上的受體相互作用使血小板活化，腺苷二磷酸鈉鹽(ADP)誘導血小板聚集時必須有纖維蛋白原存在，GP IIb-IIIa為纖維蛋白原受體。vWF在血小板膜上的受體為GP I b(Yang Shen，et al.Requirement of leucine-rich repeatsof glycoprotein(GP)Ibα for shear-dependent and static binding of vonWilleband factor to the platelet membrane GP Ib-IX-V complex.Blood.200095903-910)，在體外vWF需要瑞斯托霉素(Ristocetin)作為輔助因子才能結(jié)合到血小板受體上。
血小板數(shù)量減少或血小板功能障礙會引起多種疾病，由此引起的失血過多甚至會危及生命，此類病人最有效的治療方法就是輸入供血者提供的有大量正常功能血小板的血液。然而這種治療方法會帶來一系列的血液供應和安全問題。血小板易失活需在8小時內(nèi)從新鮮血液中分離，且分離出的血小板壽命只有幾天，過期血小板就只能廢棄。一個此類病人一次輸入的血小板需十個供血者提供，因此需大量的供血者。輸入的血小板還有可能帶有肝炎病毒、艾滋病病毒等，目前的檢測手段也很難完全控制這些病毒。因此，由于血小板供應和安全問題，現(xiàn)在急需一種安全易得的血小板代用品。
豬與人在生理和結(jié)構(gòu)上很接近，所以豬的組織和臟器作為人類器官移植的供體一直是研究的熱點。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種人血小板代用品及其制備方法。
本發(fā)明所提供的人血小板代用品，是由豬血小板膜糖蛋白和脂類組成的豬血小板糖蛋白脂質(zhì)體。
其中，豬血小板膜糖蛋白與脂類的重量份數(shù)比為1∶100-1∶5，優(yōu)選為1∶10。
所述脂類可為卵磷脂、膽固醇、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油和磷脂酸等，優(yōu)選為卵磷脂和膽固醇，其重量份數(shù)比為4∶1-1∶1。
所述豬血小板膜糖蛋白是通過以下步驟得到的(1)從豬血中提取血小板溶液；(2)純化步驟(1)中得到的血小板溶液中的糖蛋白，得到豬血小板膜糖蛋白。
上述步驟(1)中，采用1％TritonX-100溶解血小板膜蛋白；步驟(2)中采用麥胚凝集素親和層析純化豬血小板糖蛋白，其中采用0.3M N-乙酰葡萄糖胺進行洗脫。
所述豬血小板糖蛋白脂質(zhì)體是所述豬血小板糖蛋白與所述脂類按下述方法進行連接得到的將4-1g卵磷脂與1g膽固醇溶于1-100mL氯仿，將0.01-1g豬血小板糖蛋白溶于PBS后加入所述卵磷脂、膽固醇氯仿溶液中，經(jīng)超聲處理后，除去有機溶媒，放置20-40分鐘，完成連接。
一種制備人血小板代用品的方法，包括以下步驟(1)從豬血中提取血小板溶液；(2)純化步驟(1)中得到的血小板溶液中的糖蛋白，得到豬血小板膜糖蛋白；(3)將步驟(2)中得到的豬血小板膜糖蛋白與脂類連接，得到豬血小板糖蛋白脂質(zhì)體即人血小板代用品。
步驟(1)中，采用1％TritonX-100溶解血小板膜蛋白。步驟(2)中采用麥胚凝集素親和層析純化豬血小板糖蛋白，其中采用0.3M N-乙酰葡萄糖胺進行洗脫。步驟(3)中，所述脂類可為卵磷脂、膽固醇、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油和磷脂酸等，優(yōu)選為卵磷脂和膽固醇，其重量份數(shù)比為4∶1-1∶1；所述豬血小板膜糖蛋白與脂類的重量份數(shù)比為1∶100-1∶5。步驟(3)中所述豬血小板糖蛋白脂質(zhì)體是所述豬血小板糖蛋白與所述脂類按下述方法進行連接得到的將4-1g卵磷脂與1g膽固醇溶于氯仿，將0.01-1g豬血小板糖蛋白溶于PBS后加入所述卵磷脂、膽固醇氯仿溶液中，經(jīng)超聲處理后，除去有機溶媒，放置20-40分鐘，完成連接。
本發(fā)明以非離子表面活性劑TritonX-100溶解血小板膜蛋白，并由麥胚凝集素親和色譜純化血小板糖蛋白得到了較純血小板糖蛋白。由于血小板膜蛋白與膜磷脂緊密結(jié)合，蛋白的疏水部分插入磷脂雙層中，必須用去垢劑使之溶解或施以外力才能由分離的血小板制成血小板溶液，本發(fā)明所用非離子表面活性劑TritonX-100能使血小板膜蛋白很好的溶解。
本發(fā)明表明豬血小板膜糖蛋白的組成和分子量與人相似；并可以和鼠抗人GP I b單抗結(jié)合；并抑制腺苷二磷酸鈉鹽(ADP)和瑞斯托霉素(Ristocetin)誘導的人血小板的聚集作用；表明豬血小板膜糖蛋白與人血小板膜糖蛋白有相似的結(jié)構(gòu)和功能。
實驗表明，本發(fā)明的人血小板代用品具有可促進凝血等方面的作用，是一種安全可靠的人血小板代用品。


圖1為經(jīng)麥胚凝集素親和層析純化的豬血小板糖蛋白點印跡雜交2為純化的豬血小板糖蛋白SDS-PAGE電泳3為碘酸-Schiff(PAS)法鑒定豬血小板糖蛋白結(jié)果4為ADP陽性對照血小板聚集曲線圖5為純化前樣品對ADP誘導的血小板聚集的抑制曲線圖6為純化后樣品對ADP誘導的血小板聚集的抑制曲線圖7為Ristocetin陽性對照血小板聚集曲線圖8為純化前樣品對Ristocetin誘導的血小板聚集的抑制曲線圖9為純化后樣品對Ristocetin誘導的血小板聚集的抑制曲線圖10糖蛋白脂質(zhì)體溶液的聚集曲線圖11糖蛋白脂質(zhì)體溶液中加入PHN89單抗的聚集曲線圖12糖蛋白脂質(zhì)體溶液中加入vWF抗體的聚集曲線具體實施方式
材料EDTA-2Na抗凝劑(54mmol/mlEDTA-2Na，120mmol/lNaCl)，PMSF(苯甲基磺酰氟美國Sigma)，TritionX-100(美國Sigma)，SDS(十二烷基硫酸鈉)，丙烯酰胺(Fluka)，Bradford蛋白濃度測定試劑盒(碧云天)，鼠抗人GPIb單抗PHN89(《中國實驗臨床免疫學雜志》1989年第1卷第3期)，腺苷二磷酸鈉鹽，瑞斯托霉素(Ristocetin美國Sigma)，Sephorse 4B麥胚凝集素(Amersham)，其它試劑為國產(chǎn)分析純。
實施例1、人血小板代用品的制備1、血小板溶液的制備收集新鮮豬血，以10％EDTA-2Na抗凝。100g 22℃離心10min，分離出富血小板血漿(PRP)，PRP以1500g 22℃離心10min沉淀血小板，將沉淀血小板懸于bufferA(PH6.5，4.8mM葡萄糖，3mM KCl，100mM NaCl，10mM EDTA，30mM檸檬酸鈉)，洗滌，再以bufferB(PH6.5，30mM葡萄糖，120mM NaCl，10mM EDTA，5mM檸檬酸鈉)洗2次，bufferC(PH7.4，134mM NaCl，10mM EDTA，10mM Tris-HCl)洗2次，此后加入與血小板等體積的bufferD(PH7.4，124mM NaCl，20mM EDTA，2mM PMSF，2％TritonX-100，10mM Tris-HCl，2mM N-乙基-順丁烯二酰亞胺)，室溫攪拌30min，4℃ 2500g離心2小時，把上清進一步4℃ 100,000g超離心1小時。將20ml含6％蔗糖的bufferE(PH7.4，154mM NaCl，1mM EDTA，0.06％TritonX-100，10mM Tris-HCl)加入50ml離心管中加熱至35℃，小心加入20ml超離心的血小板上清液，30℃ 1000g離心10min。收集上清并加入1％TritonX-100，此上清再用含6％蔗糖的bufferE按同法離心，收集上清即為血小板溶液。
2、親和層析純化血小板溶液中的糖蛋白麥胚凝集素Sephorse4B裝柱，用binding buffer(PH7.4，20mM Tris-HCl，0.1MNaCl)平衡柱子后上樣，以binding buffer沖洗親和柱中雜蛋白及未結(jié)合上的糖蛋白，再以elution buffer(0.3M N-乙酰葡萄糖胺)洗脫結(jié)合到凝集素上的糖蛋白，用半自動電腦收集儀收集洗脫樣品，每管1ml，并以鼠抗人GPIb單抗PHN89為一抗，做點印跡，結(jié)果如圖1所示，表明0.3M N-乙酰葡萄糖胺能充分洗脫結(jié)合到凝集素上的GPIb。圖中右下角四個點為純化前的樣品。合并結(jié)果為陽性的收集液，濃縮，透析除鹽，過濾除菌，-80℃保存或凍干保存。
3、聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)將步驟2中的純化后糖蛋白在5％濃縮膠，10％分離膠，50V電壓下進行SDS-PAGE至示蹤染料達底端，考馬斯亮藍(Coomassie blue，CB)染色。結(jié)果如圖2所示，表明樣品血小板溶液中的糖蛋白純化后可見2條明顯蛋白區(qū)帶，其中200KDa區(qū)帶為肌動結(jié)合蛋白，約145KDa區(qū)帶為GPIbα。圖2中，1表示蛋白標準，2表示血小板溶液，3表示純化后糖蛋白。
已知蛋白區(qū)帶約200KDa為肌動結(jié)合蛋白，約145KDa為GPIbα，約90-120KDa為GPIb片段、IIb、IIIa，約45KDa為肌動蛋白和GPIbα片段。
4、測定純化后豬血小板糖蛋白溶液濃度Bradford考馬斯亮藍G250顯色法，以BSA為標準，595nm測定純化后豬血小板糖蛋白溶液。按碧云天公司的Bradford試劑盒說明書具體測定。結(jié)果表明純化后糖蛋白濃度平均為0.2mg/ml。
5、豬血小板糖蛋白定性采用過碘酸-Schiff(PAS)法(阮長耿 主編 血小板-基礎與臨床 上?？茖W技術(shù)出版社1987年)。SDS-PAGE電泳結(jié)束后，將膠置于12.5％三氯醋酸中固定，1％高碘酸3％醋酸氧化，室溫Schiff試劑染色。據(jù)報道(蘇州醫(yī)學院血栓形成與止血研究組血小板糖蛋白的研究(I)，不同種屬血小板的聚丙烯酰胺凝膠電泳(II)，不同種族的血小板與單克隆抗體AN51和J15的反應性，蘇醫(yī)科研資料，35期28-29，1982)各種動物的血小板溶液運用SDS-PAGE和PAS染色可以得到2-3條糖蛋白區(qū)帶。結(jié)果如圖3所示，表明血小板溶液糖蛋白可見2條糖蛋白區(qū)帶，約145KDa為GPIbα，約120KDa為GPIb片段、IIb、IIIa。
6、純化前后的豬血小板溶液對ADP和Ristocetin誘導的血小板凝集的抑制試驗從健康人采集全血按體積比為1∶10與3.14％的檸檬酸鈉混合，100g離心10分鐘收集富含血小板的上清(PRP)。以無血小板的血清(PPP)調(diào)節(jié)血小板濃度為300×106/ml。樣品蛋白質(zhì)(濃度為1.2mg/ml)先與PRP在室溫孵育5分鐘，后將誘導劑加入PRP。在血小板聚集儀上測定10分鐘凝集率，分析對血小板凝集的抑制作用。加入的誘導劑為ADP 30μmol，Ristocetin 1.2mol/ml。
結(jié)果如圖4-9所示，圖4-9中橫坐標表示時間(分鐘)，縱坐標表示百分率(％)，圖4-6表明ADP陽性對照血小板聚集率達74％，純化前后的樣品血小板聚集率分別為42％和3％，圖7-9表明Ristocetin陽性對照血小板聚集率高達100％，純化前后的樣品血小板聚集率分別為25％和3％，說明血小板溶液純化前后對ADP和Ristocetin誘導的血小板聚集有抑制作用，表明本方法所制備的糖蛋白具有生物學活性。
7、糖蛋白脂質(zhì)體的制備采用逆相蒸發(fā)法。
將4g卵磷脂與1g膽固醇溶于10mL氯仿，將0.05g純化的豬血小板糖蛋白溶于PBS加入上述卵磷脂、膽固醇氯仿溶液中，在浴式超聲儀中超聲處理5分鐘，減壓除去有機溶媒，得到一種稠厚的膠狀物，加10mLPBS緩沖液再繼續(xù)減壓蒸發(fā)除去微量有機溶媒，放置30分鐘，將所得的脂質(zhì)體懸液通過葡聚糖凝膠柱(SephadexG-50)，分離除去未包入的糖蛋白，得到糖蛋白脂質(zhì)體。
實施例2、糖蛋白脂質(zhì)體聚集實驗將糖蛋白脂質(zhì)體溶液調(diào)為2×1012個/ml，加入50μg/ml vWF，在室溫孵育5分鐘后將誘導劑Ristocetin(1.2mol/ml)加入。在血小板聚集儀上測定10分鐘凝集率，分析其聚集率。
同樣加入50μg/ml的抗-vWF或PHN89單抗，在室溫孵育5分鐘后將誘導劑Ristocetin(1.2mol/ml)加入。在血小板聚集儀上測定10分鐘凝集率，分析其聚集率。
結(jié)果如圖10、圖11和圖12所示，表明糖蛋白脂質(zhì)體的最大聚集率為80％，糖蛋白脂質(zhì)體加入PHN89單抗的最大聚集率為19％，糖蛋白脂質(zhì)體加入vWF抗體的最大聚集率為35％。說明加有抗-vWF或PHN89單抗的最大聚集率明顯低于糖蛋白脂質(zhì)體的聚集率，表明糖蛋白脂質(zhì)體在抗-vWF及Ristocetin誘導下能起到血小板的聚集作用。
權(quán)利要求
1.一種人血小板代用品，是由豬血小板膜糖蛋白和脂類組成的豬血小板糖蛋白脂質(zhì)體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人血小板代用品，其特征在于所述豬血小板膜糖蛋白與脂類的重量份數(shù)比為1∶100-1∶5。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人血小板代用品，其特征在于所述豬血小板膜糖蛋白與脂類的重量份數(shù)比為1∶10。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的人血小板代用品，其特征在于所述脂類為卵磷脂和膽固醇，卵磷脂和膽固醇的重量份數(shù)比為4∶1-1∶1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人血小板代用品，其特征在于所述豬血小板膜糖蛋白是通過以下步驟得到的(1)從豬血中提取血小板溶液；(2)純化步驟(1)中得到的血小板溶液中的糖蛋白，得到豬血小板膜糖蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的人血小板代用品，其特征在于步驟(1)中，采用1％TritonX-100溶解血小板膜蛋白；步驟(2)中采用麥胚凝集素親和層析純化豬血小板糖蛋白，其中采用0.3M N-乙酰葡萄糖胺進行洗脫。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人血小板代用品，其特征在于所述豬血小板糖蛋白脂質(zhì)體是所述豬血小板糖蛋白與所述脂類按下述方法進行連接得到的將4-1g卵磷脂與1g膽固醇溶于氯仿，將0.01-1g豬血小板糖蛋白溶于PBS后加入所述卵磷脂、膽固醇氯仿溶液中，經(jīng)超聲處理后，除去有機溶媒，放置20-40分鐘，完成連接。
8.一種制備人血小板代用品的方法，包括以下步驟(1)從豬血中提取血小板溶液；(2)純化步驟(1)中得到的血小板溶液中的糖蛋白，得到豬血小板膜糖蛋白；(3)將步驟(2)中得到的豬血小板膜糖蛋白與脂類連接，得到豬血小板糖蛋白脂質(zhì)體即人血小板代用品。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于步驟(1)中，采用1％TritonX-100溶解血小板膜蛋白；步驟(2)中采用麥胚凝集素親和層析純化豬血小板糖蛋白，其中采用0.3M N-乙酰葡萄糖胺進行洗脫；步驟(3)中，所述脂類為卵磷脂和膽固醇，卵磷脂和膽固醇的重量比為4∶1-1∶1。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于步驟(3)中的豬血小板糖蛋白與所述脂類按照下述方法進行連接將4-1g卵磷脂與1g膽固醇溶于氯仿，將0.01-1g豬血小板糖蛋白溶于PBS后加入所述卵磷脂、膽固醇氯仿溶液中，經(jīng)超聲處理后，除去有機溶媒，放置20-40分鐘，完成連接。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人血小板代用品及其制備方法。本發(fā)明所提供的人血小板代用品，是由豬血小板膜糖蛋白和脂類組成的豬血小板糖蛋白脂質(zhì)體。制備人血小板代用品的方法，包括以下步驟(1)從豬血中提取血小板溶液；(2)純化步驟(1)中得到的血小板溶液中的糖蛋白，得到豬血小板膜糖蛋白；(3)將步驟(2)中得到的豬血小板膜糖蛋白與脂類連接，得到豬血小板糖蛋白脂質(zhì)體即人血小板代用品。實驗表明，本發(fā)明的人血小板代用品具有可促進凝血等方面的作用，是一種安全可靠的人血小板代用品。
文檔編號A61P7/02GK1596910SQ0315719
公開日2005年3月23日 申請日期2003年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月18日
發(fā)明者王字玲, 張玉華, 王波, 蘇麗, 王廣義 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院野戰(zhàn)輸血研究所