專利名稱：木通皂苷d在制備防治骨病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及木通皂苷D及含木通皂苷D的木通總皂苷與含木通皂苷D的續(xù)斷總皂苷的新用途，尤其是木通皂苷D在制備防治骨病藥物中的用途。
背景技術(shù)：
木通種子為木通科植物白木通Akebia trifol iata(Thunb.)Koidz.Var.australis及三葉木通A.tri foliata(Thunb.)Koidz和木通A.quiuatu(Thunb.)Decne的種子。產(chǎn)地產(chǎn)于四川、湖北、湖南、廣西等地。主要成分木通甙(Akebin)常春藤皂苷元、齊藤果酸鉀鹽等。性狀鑒別種子多數(shù)，扁長卵形，黃棕色或紫褐色。氣微香，味苦。性味、歸經(jīng)、功用性涼、味苦。舒肝理氣，活血止痛，利尿，殺蟲。用于脘肋脹痛，痛經(jīng)閉經(jīng)，小便不利，蛇蟲咬傷。
川續(xù)斷為川續(xù)斷科植物川續(xù)斷Dipsacus asper Wall.的干燥根。產(chǎn)地主產(chǎn)于四川、湖北、云南、貴州等地。性狀鑒別呈長圓柱形，略扁或微彎曲，長5-15cm，直徑0.5-2cm。外表灰褐色或黃褐色，全體有明顯扭曲的縱皺及溝紋，可見到橫裂的皮孔及少數(shù)須根痕。質(zhì)軟，久置干燥后變硬，易折斷。斷面不平坦，皮部外緣呈褐色，內(nèi)呈黑綠色或棕色，木部黃色呈放射狀花紋。氣微香，味苦、微甜而后澀。以條粗、質(zhì)軟、斷面帶墨綠色者為佳。性味、歸經(jīng)、功用味苦、甘、辛；性微溫，補肝腎，強筋骨，續(xù)折傷。用于腰痛腳弱、遺精、崩漏、胎動欲墮、跌撲損傷、金瘡、癰疽潰瘍等癥。
骨質(zhì)疏松癥是一種以低骨量和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征，導(dǎo)致骨骼脆性增加和易發(fā)生骨折的全身性疾病。骨質(zhì)疏松的發(fā)病率在慢性病中已躍居第七位。骨質(zhì)疏松患者的三大癥狀1.臨床表現(xiàn)以疼痛最為常見多為腰背酸疼，其次為肩背、頸部或腕踝部，可因坐位、立位、臥位或翻身時疼痛，時好時壞。2.骨骼變形脊柱骨變形，彎腰、駝背、身材變矮。3.骨折常見骨折部位是脊椎骨(壓縮性、楔型)、腕部(橈骨頭)和髖骨(股骨頸)。骨折是骨質(zhì)疏松癥的并發(fā)癥，股骨頸骨折10-20％在住院的第一年死亡，余下一半生活不能自理。診斷主要依靠雙能X線骨密度測量儀，中晚期可依靠X線片診斷。目前臨床預(yù)防依靠曬太陽、運動、補鈣。治療用維生素D、二磷酸鹽、降鈣素、雌激素等。有報道骨碎補、肉蓯蓉等補腎中藥，有促進骨愈合的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是從中國傳統(tǒng)中藥中提取分離防治骨病的有效部位和/或有效成份，以便制備療效好、毒副作用小、服用方便、可長期使用的治療骨病尤其是防治骨質(zhì)疏松和/或促進骨愈合的藥物。
為解決上述問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案。
木通皂苷D及含木通皂苷D的木通總皂苷與含木通皂苷D的續(xù)斷總皂苷在制備防治骨病藥物中的用途。所述木通總皂苷含木通皂苷D≥5％；續(xù)斷總皂苷含木通皂苷D≥5％。具體為木通總皂苷含木通皂苷D 5-95％；續(xù)斷總皂苷含木通皂苷D 5-95％。
木通總皂苷除了含木通皂苷D以外，還含木通皂苷A、B等。
續(xù)斷總皂苷除了含木通皂苷D以外，還含長春藤皂苷元為母核的系列皂苷。
前述防治骨病藥物中的用途，其特征在于防治骨病是指骨質(zhì)疏松和/或促進骨損傷的愈合。所述骨損傷包括骨折、骨裂。
所述防治骨病藥物中的用途，其藥物為含治療有效量的木通皂苷D和藥學(xué)上可接受組分和/或載體；或者為含治療有效量的含木通皂苷D的木通總皂苷和藥學(xué)上可接受組分和/或載體；或者為含治療有效量的含木通皂苷D的續(xù)斷總皂苷和藥學(xué)上可接受組分和/或載體。
所述木通皂苷在制備防治骨病藥物中的用途，藥學(xué)上可接受組分為可與木通皂苷D或含木通皂苷D的木通總皂苷或者含木通皂苷D的續(xù)斷總皂苷與聯(lián)合防治骨病的化合物或組合物。
所述木通皂苷在制備防治骨病藥物中的用途，所述藥物為含治療有效量木通皂苷和藥學(xué)上可接受組分和/或載體的口服制劑、胃腸外給藥制劑或外用制劑。
可與木通皂苷或木通皂苷D混合制備各種口服制劑如片劑、硬膠囊劑、顆粒劑的輔料有崩解劑如羥丙基淀粉、羥丙纖維素、羧甲基淀粉鈉、羧甲基纖維素鈣、交聯(lián)聚維酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉等；填充劑如乳糖、蔗糖、甘露醇、微晶纖維素、糊精、淀粉、磷酸鈣、磷酸氫鈣、硫酸鈣、碳酸鈣、環(huán)糊精、微粉纖維素等；潤濕劑和粘合劑如預(yù)膠化淀粉、聚維酮、羧甲基纖維素鈉、羥丙甲纖維素；潤滑劑如滑石粉、硬脂酸、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、微粉硅膠、氫化植物油、聚乙二醇4000和6000；潤濕劑如十二烷基硫酸鈉、吐溫80；骨架材料如羥丙甲纖維素、乙基纖維素等。可與本發(fā)明木通皂苷或木通皂苷D混合制備軟膠囊的油相可以是大豆油、聚乙二醇400、棉籽油、花生油、麻油、玉米油、橄欖油等；亦可加增溶劑或潛溶劑及抗氧劑等，還可選用如下輔料溶劑如聚乙二醇400、棉籽油、花生油、麻油、玉米油、橄欖油等；增溶劑或潛溶劑如吐溫80、聚氧乙烯醚蓖麻油、苯甲酸芐酯、乳酸乙酯等；抗氧劑如沒食子酸丙酯、特丁基苯酚(BHT)、維生素E等。膠殼中明膠、甘油與水的比例可適當(dāng)調(diào)節(jié)，如明膠/甘油/水三者的比例在1∶0.3～0.4∶0.7～1.4為宜，膠殼中還可添加其他成分，如防腐劑對羥基苯甲酸甲、乙、丙、丁酯等；增塑劑如山梨醇等；穩(wěn)定劑如阿拉伯膠等；遮光劑如二氧化鈦、硫酸鋇、沉降碳酸鈣等。
圖面說明

圖1、兔子橈骨抗折力試驗裝置圖2、兔子橈骨彎距圖具體實施方式
藥材.預(yù)知子(木通種子)與川續(xù)斷為市售。經(jīng)檢驗分別符合藥典相關(guān)項下各項標(biāo)準(zhǔn)。
木通種子的植物來源及其學(xué)名木通種子為木通科植物白木通Akebia trifoliata(Thunb.)Koidz.Var.australis及三葉木通A.tri foliata(Thunb.)Koidz和木通A.quiuatu(Thunb.)Decne的種子。川續(xù)斷為川續(xù)斷科植物川續(xù)斷Dipsacus asper Wall.的干燥根。
實施例1木通皂苷D及含木通皂苷D的木通總皂苷的提取分離取白木通種子100g，粉碎成粗粉，以石油醚脫脂，揮干石油醚后，以用85％乙醇回流提取三次，每次2小時，每次加6倍量乙醇，提取液過濾，合并濾液，減壓回收乙醇近干，加水形成混懸液，用正丁醇萃取三次，合并正丁醇萃取液，減壓回收正丁醇至干，得正丁醇提取物，加水100ml，通過D-101大孔樹脂柱，以水洗至無糖反應(yīng)為止，再用70％的乙醇洗脫，得洗脫物即木通總皂苷(約含木通皂苷D 5％)(簡稱樣品1)。將樣品1進行硅膠柱層析，以氯仿-甲醇(1∶1)洗脫，得樣品2(約含木通皂苷D 55％)；將樣品2再次進行硅膠柱層析，以氯仿-甲醇(1∶1)洗脫，得樣品3(約含木通皂苷D 95％)，即得木通皂苷D 1克。
實施例2木通皂苷D及含木通皂苷D的續(xù)斷總皂苷的提取分離取川續(xù)斷藥材100克，粉碎成粗顆粒(黃豆大)，用85％乙醇回流提取三次，每次2小時，每次加6倍量乙醇，提取液過濾，合并濾液，減壓回收乙醇近干，加水形成混懸液，用正丁醇萃取三次，合并正丁醇萃取液，減壓回收正丁醇至干，殘渣用水溶解后，用石油醚反復(fù)脫脂，脫脂后的水溶液，濃縮，析出沉淀物，沉淀物用少許水洗滌，干燥后，得續(xù)斷總皂苷粗品，即樣品4(約含木通皂苷D 5％)；將樣品4用甲醇重結(jié)晶，得樣品5(約含木通皂苷D 55％)；將樣品5用甲醇反復(fù)重結(jié)晶，得樣品6即木通皂苷D 4克(木通皂苷D含量約為95％)。
木通皂苷D學(xué)名為3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖-常春藤皂苷元28-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖酯甙。
分子式C47H76O18，M＝952(M+Na+)理化常數(shù)mp為207-210℃(甲醇重結(jié)晶)[α]D1a+14.9℃(C 0.25，MeOH)，易溶于甲醇。
木通皂苷D白色粉末(甲醇)。mp207-210.5℃。[α]D19+14.9℃(C 0.25，MeOH)。
參見張永文，薛智 川續(xù)斷的化學(xué)成分研究 藥學(xué)學(xué)報，1991；26(9)676～681；Phytochemistry.1989；28644；楊尚軍，吳知行，等 川續(xù)斷中三萜皂苷的研究II 中國藥科大學(xué)學(xué)報，1993；24(5)276～280。
實施例3木通皂苷D及含木通皂苷D的木通總皂苷與含木通皂苷D的續(xù)斷總皂苷的藥效學(xué)研究實際上，隨著木通總皂苷中木通皂苷D的含量增加，當(dāng)其含95％木通皂苷D時，本技術(shù)領(lǐng)域一般就認為是較純的木通皂苷D。
參見王一濤、王家葵、楊奎等，木通的藥理學(xué)研究，中藥藥理與臨床，1996(3)20-23；柴本浦，湯雪明，實驗性骨折愈合的超微結(jié)構(gòu)研究，中華骨科雜志，1982，2(2)117；周銅水，劉曉東，周榮漢，骨碎補對大鼠實驗性骨損傷愈合的影響，中草藥，1994，25(5)249-250；劉毓順，周金水，林葆凱等，接骨散對家兔骨折的實驗研究，福建中醫(yī)藥，1994，25(3)19。
申請人研究了木通總皂苷(含5-95％木通皂苷D)的主要藥效作用，雖然在如下描述中僅僅選擇了含5、55和95％木通皂苷D的木通總皂苷的藥效數(shù)據(jù)，這不應(yīng)該對本發(fā)明技術(shù)方案產(chǎn)生限制。
實驗動物昆明種小鼠，體重18-22g；青紫蘭兔，體重1.8-2.5kg；SD雄性大鼠，體重170-220g，由中國藥科大學(xué)動物室提供，合格證號，蘇動質(zhì)97004。
藥物名稱木通總皂苷樣品1(含木通皂苷D 5％)，木通總皂苷樣品2(含木通皂苷D 55％)，木通總皂苷樣品3(含木通皂苷D 95％)，提供單位浙江迪耳藥業(yè)有限公司提供，批號980813骨折挫傷散中國佳木斯中藥廠出品，黑衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1982)第301173號。
依膦連云港正大天晴制藥有限公司生產(chǎn)。
丹參片上海中藥制藥三廠生產(chǎn)，ZZ-3885-滬衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1995)第042067號。
酮洛芬膠囊中國蘇中制藥廠(江蘇)生產(chǎn)，蘇衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1987)和355202號。
配制方法將木通總皂苷樣品1、樣品2、樣品3顆粒及陽性藥研成細粉，用0.5％CMC-Na配制成所需濃度的混懸液。
試劑血清無機磷測定試劑盒上?？菩郎锛夹g(shù)研究所生產(chǎn)。堿性磷酸酶試劑常州市醫(yī)科所試劑站，批號971104。維甲酸上海第六制藥廠生產(chǎn)。
儀器雙能x射線骨密測定儀，LUNAR DPX-L型 美國LUNAR公司生產(chǎn)1.木通總皂苷(含5-95％木通皂苷D)對小鼠自身皮下血腫的影響參見王楠，賈筠生，曹棣芳等，益氣化瘀法治療皮下和腦內(nèi)血腫的實驗性研究，上海中醫(yī)藥，1985，(1)45-48。
取體重18-22g雄性小鼠140只，按體重隨機分為14組，陰性對照組(給予0.5％CMC-Na0.4ml)；陽性對照組(給予丹參片0.3g/kg)；木通總皂苷樣品1高(4.4g/kg)、低(2.2g/kg)2個劑量；木通總皂苷樣品2高(0.8g/kg)、低(0.4g/kg)2個劑量；木通總皂苷樣品3高(0.46g/kg)、低(0.23g/kg)2個劑量。續(xù)斷總皂苷樣品4高(4.4g/kg)、低(2.2g/kg)2個劑量；續(xù)斷總皂苷樣品5高(0.8g/kg)、低(0.4g/kg)2個劑量；續(xù)斷總皂苷樣品6高(0.46g/kg)、低(0.23g/kg)2個劑量。給藥前造皮下血腫模型；每鼠一側(cè)眼后靜脈取血0.5ml，加入含青霉素10萬單位的0.1M的CaCl2溶液0.1ml混勻，立即注入自身頸背部皮下，造成皮下血腫。造型后按上法連續(xù)給藥7日，每天上午8:00-10:00給藥一次。給藥容積為0.4ml/20g。第8日處死，分離皮下血腫包塊，電子天平稱重，并對數(shù)據(jù)進行組間t檢驗比較，結(jié)果見表1。
表1 木通總皂苷和續(xù)斷總皂苷灌胃給藥對小鼠自身皮下血腫的影響(X±S)(n＝10)


***P＜0.01與陰性對照組比較由表1可見，木通總皂苷樣品1(含木通皂苷D 5％)，木通總皂苷樣品2(含木通皂苷D 55％)，木通總皂苷樣品3(含木通皂苷D 95％)的高、低2個劑量組，續(xù)斷總皂苷樣品4(含木通皂苷D 5％)，續(xù)斷總皂苷樣品5(含木通皂苷D 55％)，續(xù)斷總皂苷樣品6(含木通皂苷D 95％)的高、低2個劑量組及丹參片組能使小鼠自身皮下血腫塊的重量明顯減輕(P＜0.01)。
2、木通總皂苷(含5～95％木通皂苷D)對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響取雄性小鼠80只，體重18-22g，按體重隨機分為8組，陰性對照組(給予0.5％CMC-Na)；陽性對照組(給予酮洛芬0.18g/kg)；其余6組分別給予木通總皂苷樣品1高(4.4g/kg)、低(2.2g/kg)2個劑量；木通總皂苷樣品2高(0.8g/kg)、低(0.4g/kg)2個劑量；木通總皂苷樣品3高(0.46g/kg)、低(0.23g/kg)2個劑量。按上述劑量連續(xù)給藥7天，結(jié)果見表2。
表2 木通總皂苷灌胃給藥對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響(X±S)(n＝10)


***P＜0.01與陰性對照組比較由表2可見，木通總皂苷樣品1(含木通皂苷D 5％)，木通總皂苷樣品2(含木通皂苷D 55％)，木通總皂苷樣品3(含木通皂苷D 95％)的高、低2個劑量組及酮洛芬組對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹有顯著的抑制作用(P＜0.01)。
3、木通總皂苷(含5～95％木通皂苷D)對醋酸所致小鼠疼痛的影響。
取小鼠80只，體重18-22g，按體重隨機分為8組，給藥方式及劑量同2，結(jié)果見表3。
表3 木通總皂苷灌胃給藥對醋酸所致小鼠疼痛的影響(X±S)(n＝10)

**P＜0.05***P＜0.01 與陰性對照組比較由表3可見，木通總皂苷樣品1(含木通皂苷D 5％)，木通總皂苷樣品2(含木通皂苷D 55％)，木通總皂苷樣品3(含木通皂苷D 95％)的高、低2個劑量組對醋酸所致小鼠疼痛有明顯抑制作用(P＜0.01，P＜0.05)，小鼠扭體次數(shù)及首次扭體出現(xiàn)時間與陰性對照組比較有顯著差異，酮洛芬組對此模型也有明顯的鎮(zhèn)痛作用(P＜0.01)。
4、木通總皂苷(含5～95％木通皂苷D)對家兔橈骨骨折的治療作用取體重1.8-2.5kg家兔128只，雌雄各半，實驗開始先制備骨折模型，用1.5％戊巴比妥鈉2ml/kg(30mg/kg)進行兔耳緣靜脈麻醉，在無菌條件下，于旋前圓肌止點遠端用特制鋼鋸造成雙側(cè)橈骨骨質(zhì)完全缺損3mm寬的標(biāo)準(zhǔn)性橫斷骨折，手術(shù)切口部位滴入0.1ml(4萬u)青霉素和0.1ml(120mg)鏈霉素，然后縫合皮膚。陰性對照組給予普通飼料，陽性對照組給予骨折挫傷散0.3g/kg，另外6組分別給予木通總皂苷樣品1高(2.2g/kg)、低(1.1g/kg)2個劑量；木通總皂苷樣品2高(0.2g/kg)、低(0.1g/kg)2個劑量；木通總皂苷樣品3高(0.116g/kg)、低(0.058g/kg)2個劑量。每天給藥1次，于給藥21天和35天分批放血處死動物，取血和解剖分離雙側(cè)橈骨檢測以下幾項指標(biāo)4.1 血清堿性磷酸酶的測定股靜脈插管放血測定血清堿性磷酸酶，結(jié)果見表4。
表4 木通總皂苷對骨折兔血清堿性磷酸酶的影響(X±S)(n＝8)

**P＜0.05***P＜0.01 與陰性對照組比較由表4可見，木通總皂苷樣品1(含木通皂苷D 5％)，木通總皂苷樣品2(含木通皂苷D 55％)，木通總皂苷樣品3(含木通皂苷D 95％)的高、低劑量組及骨折挫傷散組于給藥后21天和35天對骨折兔血清堿性磷酸酶濃度有明顯升高作用(P＜0.01，P＜0.05)。
4.2 骨重系數(shù)及骨灰含量的測定取左側(cè)橈骨，稱重測定骨重系數(shù)，g/100g體重表示；取左側(cè)橈骨干燥并炭化后置于800℃馬福爐中灰化8小時制成骨灰，測定骨灰含量，以g/g骨重表示，結(jié)果見表5。
表5 木通總皂苷對骨折兔橈骨骨重系數(shù)和骨灰含量的影響(X±S)(n＝8)

**P＜0.05***P＜0.01 與相應(yīng)時期陰性對照組比較由表5可見，木通總皂苷樣品1(含木通皂苷D 5％)，木通總皂苷樣品2(含木通皂苷D 55％)，木通總皂苷樣品3(含木通皂苷D 95％)的高、低劑量組和骨折挫傷散組于給藥21天和35天可使骨重系數(shù)和骨灰含量明顯升高(P＜0.01，P＜0.05)。
4.3 骨礦密度的測定取左側(cè)橈骨，用雙能X射線骨密度測定儀測量骨折部位骨礦密度，結(jié)果見表6。
表6 木通總皂苷對骨折兔橈骨骨礦密度影響(X±S)(n＝8)

**P＜0.05***P＜0.01 與相應(yīng)時期陰性對照組比較由表6可見，木通總皂苷樣品1(含木通皂苷D 5％)，木通總皂苷樣品2(含木通皂苷D 55％)，木通總皂苷樣品3(含木通皂苷D 95％)的高、低劑量組和骨折挫傷散組于給藥后21天和35天可使兔橈骨骨折部位骨礦密度明顯增加(P＜0.01，P＜0.05)。
4.4 X線片測定取左側(cè)橈骨進行X線片測定，包括3個指標(biāo)①骨折斷端邊緣模糊出現(xiàn)情況(出現(xiàn)模糊動物例數(shù))，并對結(jié)果進行X2檢驗；②骨膜反應(yīng)即測量外骨膜厚度，方法是在骨折斷端兩側(cè)外骨膜反應(yīng)最明顯處任選3點，測量其厚寬，取平均值；③骨痂密度采用3級分法，陰影淺淡模糊，勉強可辨認者為I；陰影較淺，明顯可見者為II級；陰影較深，甚至有明顯鈣化者為III級，所得結(jié)果用Riddit分析(參見柴本浦，湯雪明，實驗性骨折愈合的超微結(jié)構(gòu)研究，中華骨科雜志，1982，2(2)117)。上述三項結(jié)果分別見表7、表8和表9。
表7 木通總皂苷對兔骨折斷端邊緣模糊出現(xiàn)影響

**P＜0.05***P＜0.01與相應(yīng)時期陰性對照組比較表8 木通總皂苷對兔骨折骨骨膜厚度的影響(X±S)(n＝8)

**P＜0.05與相應(yīng)時期陰性對照組比較，△△P＜0.05，△△△P＜0.01，與同組21天比較。
**P＜0.05***P＜0.01與相應(yīng)時期陰性對照組比較表9 木通總皂苷對骨折兔骨痂密度的影響

***P＜0.01與陰性對照組比較由表7、8和9可見，木通總皂苷樣品1(含木通皂苷D 5％)，木通總皂苷樣品2(含木通皂苷D 55％)，木通總皂苷樣品3(含木通皂苷D 95％)的高、低劑量組及骨折挫散組于給藥后21天和35天時骨折斷端模糊的例數(shù)明顯多于陰性對照組(P＜0.01，P＜0.05)，給藥后21天各給藥組的骨膜厚度較陽性對照組厚，但與后者比較無顯著性差異，給藥35天各給藥組的骨膜厚度明顯薄于陰性對照組(P＜0.05)，并且木通總皂苷給藥后35天的骨膜厚度明顯薄于給藥后21天的骨膜厚度，表明給藥組骨痂已被吸收，骨折已基本修復(fù)；另外，各給藥組的骨痂密度明顯大于陰性對照組(P＜0.01)。上述X線片結(jié)果顯示，各給藥組骨折愈合速度明顯快于陰性對照組。
4.5抗折力試驗按文獻(邱桐，林維啟，王慎，“接骨一粒丹”對家兔尺骨骨折X線片表現(xiàn)的影響，甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1992，6，9(2)35-36)方法設(shè)計抗折力試驗裝置。如圖1所示，兔子橈骨做受力破壞試驗時，試驗裝置可近似著作受集中載荷的簡支架，且兔子橈骨的重量可以忽略不計。圖1為兔子橈骨抗折力試驗裝置，其中1為兔子橈骨長1；p為載荷(試驗中用掛砝碼的方法逐漸加載)；a為載荷p距兔子橈骨左端點的距離；b為載荷p距兔子橈骨右端點距離；B為載荷p作用點，也是兔子橈骨折斷處；A、C為橈骨兩端支撐點。建立坐標(biāo)，則兔子橈骨彎距如圖2。由圖2彎距圖可知，最大彎距處即兔子橈骨折斷處的變距。
Mmax=Pabι=Pa(1-aι)]]>我們分別于給藥后21天和35天進行測定，結(jié)果見表10。
表10 木通總皂苷對兔骨折骨骨抗折力的影響(X±S)(n＝8)

***P＜0.01與相應(yīng)時期陰性對照組比較，△△△P＜0.05，△△△IP＜0.01，與同組21天比較。
由表10可見，給藥21天時木通總皂苷樣品1(含木通皂苷D 5％)，木通總皂苷樣品2(含木通皂苷D 55％)，木通總皂苷樣品3(含木通皂苷D 95％)的高、低劑量組及骨折挫傷散組的骨折骨最大彎距明顯大于陰性對照組(P＜0.01)。給藥35天時各給藥組骨折骨的最大彎距明顯大于陰性對照組(P＜0.01)。另外，給藥35天的各給藥組的骨折骨抗折力作用顯著強于同組21天(P＜0.01，P＜0.05)。
4.6 骨鈣、骨磷的測定按6-4.2方法制成骨灰，取定量骨灰用島津AA-670火焰原子吸收光譜測定骨鈣含量；另將一定量骨灰溶于6NHCL，用血清無機磷測定試驗盒測定骨磷。將所得結(jié)果折算成每克骨重含多少毫克骨鈣或骨磷，然后對其進行組間t檢驗，結(jié)果見表11。
表11 木通總皂苷對骨折兔骨鈣和骨磷的影響(X±S)(n＝8)

**P＜0.05***P＜0.01與相應(yīng)時期陰性對照組比較由表11可見，木通總皂苷樣品1(含木通皂苷D 5％)，木通總皂苷樣品2(含木通皂苷D 55％)，木通總皂苷樣品3(含木通皂苷D 95％)的高、低劑量組及骨折挫傷散于給藥后21天和35天對骨折骨骨磷含量具有顯著升高作用(P＜0.01，P＜0.05)；本品高劑量組和骨折挫傷散組可使給藥后21天和35天的骨折骨骨鈣明顯升高(P＜0.01)，低劑量組對其也有升高作用，但與陰性對照組比無顯著差異。
4.7 橈骨骨折部位病理組織學(xué)檢查耳右側(cè)橈骨標(biāo)本經(jīng)10％甲醛溶液固定，脫鈣，右蠟切片，HE染色，觀察各組橈骨骨折部位病理組織改變。結(jié)果見表12。
表12 木通總皂苷對兔骨折部位骨小梁寬度的影響(X±S)(n＝8)


**P＜0.05，***P＜0.01，與相應(yīng)時期陰性對照組比較由表12可見，木通總皂苷樣品1(含木通皂苷D 5％)，木通總皂苷樣品2(含木通皂苷D 55％)，木通總皂苷樣品3(含木通皂苷D 95％)的高劑量組及骨折挫傷散組于給藥后21天可使骨折部位骨小梁寬度顯著增加(P＜0.01，P＜0.05)；高劑量組于給藥后35天也可使骨折部位骨小梁明顯加寬(P＜0.05)，各給藥組的骨小梁周圍骨細胞增生活躍，并可見較多的成骨細胞，尤以高劑量組最為明顯。病理檢驗報告表明，后者骨小梁不僅增寬而且排列的很密集。
5.木通總皂苷(含5～95％木通皂苷D)對維甲酸所致大鼠骨質(zhì)疏松的影響取大鼠210只，按體重隨機分為21組，一組作為正常對照組，給予0.5％CMC-Na，其余20組大鼠均給予維甲酸70mg/kg，以制備骨質(zhì)疏松模型，在這20組大鼠中，1組作為模型對照組給予0.5％CMC-Na，1組給予依膦作為陽性對照組(40mg/kg)，其余18組分別給予木通總皂苷樣品1高(2.2g/kg)、中(1.1g/kg)、低(0.55g/kg)3個劑量；木通總皂苷樣品2高(0.4g/kg)、中(0.2g/kg)、低(0.1g/kg)3個劑量；木通總皂苷樣品3高(0.23g/kg)、中(0.115g/kg)、低(0.058g/kg)3個劑量和續(xù)斷總皂苷樣品4高(2.2g/kg)、中(1.1g/kg)、低(0.55g/kg)3個劑量；續(xù)斷總皂苷樣品5高(0.4g/kg)、中(0.2g/kg)、低(0.1g/kg)3個劑量；續(xù)斷總皂苷樣品6高(0.23g/kg)、中(0.115g/kg)、低(0.058g/kg)3個劑量。動物同時灌胃維甲酸及藥物2周后，停服維甲酸，繼續(xù)給藥2周，于停藥后第二天將大鼠處死，解剖雙側(cè)股骨，左側(cè)股骨用于測定骨重系數(shù)、骨礦密度、骨灰含量和骨鈣、骨磷，右側(cè)股骨用于作病理組織學(xué)檢測。各項指標(biāo)測定方法同4，結(jié)果見表13-16。
表13 木通總皂苷和續(xù)斷總皂苷對骨質(zhì)疏松大鼠骨重系數(shù)和骨灰含量的影響(X±S)(n＝10)


△△△P＜0.01，與正常對照組比較，***P＜0.01，與模型對照組比較表14 木通總皂苷和續(xù)斷總皂苷對骨質(zhì)疏松大鼠股骨密度的影響(X±S)(n＝10)


**P＜0.05，***P＜0.01 與模型對照組比較；△△△P＜0.01，與正常對照組比較#注1-股骨頭部；2-大轉(zhuǎn)子部；3-股骨頸部；4-轉(zhuǎn)子間部表15 木通總皂苷和續(xù)斷總皂苷對骨質(zhì)疏松大鼠骨鈣、骨磷的影響(X±S)(n＝10)


△△△P＜0.01，與正常對照組比較，***P＜0.01，與模型對照組比較表16 木通總皂苷和續(xù)斷總皂苷對骨質(zhì)疏松大鼠股骨頭的骨小梁寬度的影響(X±S)(n＝10)

***P＜0.05，***P＜0.01與模型對照組比較，△△△P＜0.01，與正常對照組比較由表13-16可見，木通總皂苷樣品1(含木通皂苷D 5％)，木通總皂苷樣品2(含木通皂苷D 55％)，木通總皂苷樣品3(含木通皂苷D 95％)的高、中、低劑量組，續(xù)斷總皂苷樣品4(含木通皂苷D 5％)，續(xù)斷總皂苷樣品5(含木通皂苷D 55％)，續(xù)斷總皂苷樣品6(含木通皂苷D 95％)的高、中、低劑量組及依膦組可使骨質(zhì)疏松大鼠的骨重系數(shù)、骨灰含量、骨礦密度、骨小梁寬度、骨磷含量顯著增加(P＜0.01，P＜0.05)，本品高、中、低劑量組及依膦組可使骨鈣含量顯著升高(P＜0.01)。各給藥組均能使股骨內(nèi)骨細胞及破壞細胞增生活躍。木通總皂苷(含5～95％木通皂苷D)對家兔雙側(cè)橈骨骨折有較強的促愈合作用，并可明顯減輕維甲酸所致大鼠骨質(zhì)疏松的病變程度。
6、木通皂苷D單體(從川續(xù)斷中提得)對體外骨細胞生長的影響實驗表17、藥物對成骨細胞分化和增殖的影響作用結(jié)果

***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05 vs 對照木通皂苷D單體(從川續(xù)斷中提得)對體外骨細胞生長的具有顯著的促進作用。
木通總皂苷(含5～95％木通皂苷D)和續(xù)斷總皂苷(含5～95％木通皂苷D)的藥效實驗我們分為6個給藥組進行，分別稱為樣品1、樣品2、樣品3、樣品4、樣品5、樣品6。
各樣品中的木通皂苷D含量樣品1和樣品4、樣品2和樣品5、樣品3和樣品6中的木通皂苷D含量分別5％、55％、95％。
各樣品不同動物的給藥劑量家兔的給藥劑量分別為樣品1和樣品4高(2.2g/kg)、低(1.1g/kg)2個劑量；樣品2和樣品5高(0.2g/kg)、低(0.1g/kg)2個劑量；樣品3和樣品6高(0.116g/kg)、低(0.058g/kg)2個劑量；大鼠的給藥劑量為樣品1和樣品4高(4.4g/kg)、中(2.2g/kg)、低(1.1g/kg)3個劑量；樣品2和樣品5高(0.4g/kg)、中(0.2g/kg)、低(0.1g/kg)3個劑量；樣品3和樣品6高(0.23g/kg)、中(0.115g/kg)、低(0.058g/kg)3個劑量；小鼠的給藥劑量為樣品1和樣品4高(4.4g/kg)、低(2.2g/kg)2個劑量；樣品2和樣品5高(0.8g/kg)、低(0.4g/kg)2個劑量；樣品3和樣品6高(0.46g/kg)、低(0.23g/kg)2個劑量。
各給藥組的計量按樣品中木通皂苷D的含量計算后表示如下家兔的給藥劑量樣品1和樣品4高(0.11g/kg)、低(0.055g/kg)2個劑量；樣品2和樣品5高(0.11g/kg)、低(0.055g/kg)2個劑量；樣品3和樣品6高(0.1102g/kg)、低(0.0551g/kg)2個劑量。
大鼠的給藥劑量樣品1和樣品4高(0.22g/kg)、中(0.11g/kg)、低(0.055g/kg)3個劑量；樣品2和樣品5高(0.22g/kg)、中(0.11g/kg)、低(0.055g/kg)3個劑量；樣品3和樣品6高(0.2185g/kg)、(0.1093g/kg)、低(0.0551g/kg)3個劑量。
小鼠的給藥劑量樣品1和樣品4高(0.22g/kg)、低(0.11g/kg)2個劑量；樣品2和樣品5高(0.44g/kg)、低(0.22g/kg)2個劑量；樣品3和樣品6高(0.437g/kg)、低(0.2185g/kg)2個劑量。
上述實驗結(jié)果(5種實驗?zāi)Ｐ停?6項實驗檢測指標(biāo))顯示不同木通總皂苷樣品和不同續(xù)斷總皂苷樣品(含木通皂苷D的百分量不同)藥效實驗結(jié)果與總皂苷量沒有相關(guān)性，而與總皂苷樣品中的木通皂苷D的含量具有量效相關(guān)性。木通皂苷D單體(從川續(xù)斷中提得)對體外骨細胞生長的具有顯著的促進作用。藥效與木通皂苷D的含量具有量效相關(guān)性這一實驗結(jié)果顯示治療骨折和骨質(zhì)疏松癥的活性成分是木通皂苷D。
權(quán)利要求
1.木通皂苷D及含木通皂苷D的木通總皂苷與含木通皂苷D的續(xù)斷總皂苷在制備防治骨病藥物中的用途。
2.權(quán)利要求1所述防治骨病藥物中的用途，其特征在于木通總皂苷含木通皂苷D≥5％；續(xù)斷總皂苷含木通皂苷D≥5％。
3.權(quán)利要求2所述防治骨病藥物中的用途，其特征在于木通總皂苷含木通皂苷D5-95％；續(xù)斷總皂苷含木通皂苷D 5-95％。
4.權(quán)利要求1所述防治骨病藥物中的用途，其特征在于防治骨病是指骨質(zhì)疏松和/或促進骨損傷的愈合。
5.權(quán)利要求4所述治療骨病藥物中的用途，其特征在于所述骨損傷包括骨折、骨裂。
6.權(quán)利要求1所述防治骨病藥物中的用途，其特征在于所述藥物為含治療有效量的木通皂苷D和藥學(xué)上可接受組分和/或載體。
7.權(quán)利要求1所述防治骨病藥物中的用途，其特征在于所述藥物為含治療有效量的含木通皂苷D的木通總皂苷和藥學(xué)上可接受組分和/或載體。
8.權(quán)利要求1所述防治骨病藥物中的用途，其特征在于所述藥物為含治療有效量的含木通皂苷D的續(xù)斷總皂苷和藥學(xué)上可接受組分和/或載體。
9.權(quán)利要求6所述防治骨病藥物中的用途，其特征在于藥學(xué)上可接受組分為可與木通皂苷D或含木通皂苷D的木通總皂苷或者含木通皂苷D的續(xù)斷總皂苷與聯(lián)合防治骨病的化合物或組合物。
10.權(quán)利要求6所述木通皂苷在制備防治骨病藥物中的用途，其特征在于所述藥物為含木通皂苷D或含木通皂苷D的木通總皂苷或者含木通皂苷D的續(xù)斷總皂苷，和藥學(xué)上可接受組分和/或載體的口服制劑、胃腸外給藥制劑或外用制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了含木通皂苷D及含木通皂苷D的木通總皂苷與含木通皂苷D的續(xù)斷總皂苷在制備防治骨質(zhì)疏松和/或促進骨愈合藥物中的用途，與對照組比可明顯消炎、消腫、鎮(zhèn)痛，可使骨折兔血清堿性磷酸酶、橈骨骨重系數(shù)、骨灰含量、骨磷含量、骨礦密度顯著增加，可使維甲酸所致骨質(zhì)疏松大鼠骨重系數(shù)、骨灰含量、骨礦密度、骨小梁寬度及骨磷含量明顯增加。
文檔編號A61K31/704GK1493299SQ0315823
公開日2004年5月5日 申請日期2003年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月16日
發(fā)明者楊中林 申請人:浙江迪耳藥業(yè)有限公司